Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря"

На правах рукописи УДК 574.635:579.222.2

СРЕБНЯК Екатерина Анатольевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННЫХ АКВАТОРИЙ НА ПРИМЕРЕ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ

03.00.16 - Экология 03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 2 ДЕИ 2000

Москва-2008

003457759

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Винокуров Владимир Арнольдович

Научный консультант: кандидат биологических наук

Ботвинко Ирина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Мкртычан Владимир Рубенович

кандидат биологических наук, доцент Бабусенко Блена Сергеевна

Ведущая организация:

Центральный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт морского флота (ЗАО «ЦНИИМФ»)

Защита диссертации состоится декабря 2008 г. в часов в аудитории 20& на заседании диссертационного совета Д 212.200.12 при Российском государственном университете нефти и газа имени И. М. Губкина по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д. 65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина.

Автореферат разослан » ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат техн. наук

Л. В. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В Мировом океане по разным данным ежегодно разливается от 10 до 16 млн. тонн транспортируемой нефти, в том числе, только в Балтийском море эти разливы достигают нескольких тысяч тонн в год. На основании статистических данных можно с большой вероятностью прогнозировать, что общие объёмы разливов нефти будут возрастать.

При загрязнении акватории нефтью и нефтепродуктами происходит отравление и/или гибель большого количества организмов. Разрываются пищевые цепи, в результате чего прерываются связи в экосистеме и разрушается её живая составляющая. Поэтому даже при восстановлении жизни на данном участке возможны очень сильные преобразования в доминантах экологических ниш, что проявляется в уменьшении разнообразия живого мира. Это в свою очередь может привести к другим крупным негативным изменениям экосистемы.

Современные технологии, применяемые при ликвидациях разливов нефти, несовершенны, так как не исключают опасность проникновения и накопления углеводородов в пищевых цепях. Кроме того, недостатками существующих технологий являются их высокая стоимость и недостаточная эффективность очистки морской акватории. Поэтому необходимы эффективные способы восстановления морской среды от разливов нефти.

Нефтяное загрязнение представляет меньшую опасность для микроскопических обитателей акваторий - бактериопланктона. Это связано с тем, что бактерии являются единственным компонентом экосистемы, способным разрушать нефтяное загрязнения до простых соединений в процессе жизнедеятельности. Поэтому перспективным способом восстановления нефтезагрязнённых акваторий является микробиологический. Однако использованию микробиологического способа препятствуют следующие проблемы.

• Большинство существующих биопрепаратов разработаны для очистки почв и не пригодны для использования в акваториях.

• Низкая эффективность таких биопрепаратов обусловлена конкурентным вытеснением, вымыванием, долгой адаптацией вносимых бактерий.

Таким образом, целью диссертационной работы являлась разработка нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря.

Задачи исследования:

1. Выделение и исследование природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий (ПАУОБ) из Балтийского моря.

2. Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти.

3. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий разработанным биопрепаратом.

Научная новизна. Впервые предложено использовать в качестве активного начала биопрепарата ПАУОБ в виде накопительной культуры, что позволило сохранить всё биоразнообразие углеводородокисляющих бактерий (УОБ) и их спутников - бактерий-соокислителей, способствующих полноте деструкции нефти. Предложено использовать микромицеты Fusarium и Trichoderma в качестве носителя и подкормки для УОБ, а также как сорбент для нефти. Сформированы принципы конструирования биопрепаратов, на основе которых разработан 3-х уровневый биопрепарат «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий.

Для оценки эффективности очистки морской воды от нефти применён метод биотестирования на гидробионтах, что позволило получить целостный комплексный ответ. Впервые показано, что биотестирование на гидробионтах является не только адекватным и эффективным методом для определения качества очистки воды, но и тонким экологическим приёмом определения влияния нефтяного загрязнения и действия биопрепарата в пищевой цепи.

Практическая ценность. Предложена новая оригинальная конструкция биопрепарата, состоящая в том, что в нём нефть и бактерии локализуются в пространстве в плавучей кассете, адсорбируясь на селективных носителях и

4

сорбентах. Степень очистки от нефти на лабораторной модели биопрепаратом составила за 7 суток более 70%. Биотестированием продемонстрировано отсутствие острой токсичности очищенной морской воды для микроводорослей Dunaliella salirta и Chlorella minutissima и стимулирование их развития в очищенной воде и в накопительных культурах метаболитами ПАУОБ, а также безвредность для ракообразных Artemia salina очищенной морской воды и ПАУОБ в естественных экологических концентрациях. Подтверждена адекватность использования биотестирования для оценки качества очистки биопрепаратом морской воды и ПАУОБ. Предполагаемая рыночная стоимость биопрепарата на порядок меньше существующих. Способ получения биопрепарата защищен патентом на изобретение Российской Федерации.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и зарубежных научных конференциях, выставках и конкурсах: Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), Международная научная конференция «Инновации в науке и образовании-2004» (Калининград, 2004), Конференция «Нефть и газ - 2004» (Москва, 2004), 28—й Технический семинар по Арктическим морским нефтяным загрязнениям в Канаде (28Л АМОР Technical Seminar, Treatment of Oil Spilled Pollutions, Calgary, Canada, 2005), Всероссийская конференция аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005), Федеральная школа-конференция для победителей конкурса инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетным направлениям науки и техники (Москва, 2005), Конкурс русских экологических инноваций (Москва, 2006), Конкурс русских инноваций (Москва, 2006), Всероссийская выставка научно-технического творчества молодёжи НТТМ-2007, (Москва, 2007), НТТМ-2008 (Москва, 2008), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов -2008» (Москва, 2008).

Работа награждена дипломами МГУ имени М. В. Ломоносова, Всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование», компаний РУСАЛ, Shell,

5

Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, Аналитического центра и Инновационного бюро журнала «Эксперт», НТТМ- 2007, НТТМ - 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК, глава в справочнике и патент на изобретение Российской Федерации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах и включает 23 рисунка и 21 таблицу. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, приложений, списка литературы, включающего 137 наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектами исследований служили ПАУОБ, выделенные из прибрежной

зоны Балтийского моря в районе городов Светлогорск и Балтийск

Калининградской области. Для определения анионного состава пробы воды

Балтийского моря исследовали на ионном хроматографе DIONEX 1С S-2000

RFIC, США. В качестве источника углерода использовали малопарафинистую

маловязкую лёгкую Западно-Сибирскую нефть. Количественный учёт

углеводородокисляющих бактерий в морской воде и в накопительной культуре

(титр клеток) производили по методу Коха. Накопительные культуры

ПАУОБ получали, добавляя к морской воде минеральные компоненты среды

Чапека, а также нефть (0,1-2,5 % по объёму) или нефть с глюкозой (1 г/л).

Состав среды Чапека (минеральный фон), г/л: NaN03 - 2,0; К2НР04 - 1,0;

MgS04 -7Н20 - 0,5; КС1 - 0,5; FeS04 -7Н20 - 0,1; вода водопроводная или

морская; рН 6,7-7,2. Выделение чистых культур и идентификацию УОБ

проводили на плотной среде «rich». Состав среды «rich», г/л: пептон - 2,

дрожжевой экстракт - 1, гидролизат казеина - 1, глюкоза - 1, глицерин - 10

мл/л, мел - 2, агар - 17, вода водопроводная или морская, рН 6,7-7,2.

Идентификацию УОБ проводили по культуральным, морфологическим и

физиолого-биохимическим признакам [Берджи, 1997; Добровольская, Лысак,

1990]. Ключевыми признаками при определении родовой принадлежности

бактерий являлись: особенности жизненного цикла, подвижность,

6

характеристики колоний бактерий, грам-принадлсжность (тест с 3 % раствором КОН), наличие оксидазы и каталазы. Форму и подвижность клеток определяли микроскопированием препаратов живых бактерий. Морфологические особенности выявляли на фиксированных препаратах, окрашенных фуксином или метиленовой синью. Для поддержания УОБ и ПАУОБ в лабораторных условиях использовали периодические персссвы на свежие питательные среды с нанесённой на поверхность нефтью. Для длительного хранения чистых культур УОБ их выращивали на скошенной плотной среде в пробирках и заливали стерильным вазелиновым маслом.

Содержание тяжёлых металлов в биопрепарате определяли методом масс-спсктрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Agilent ICP-MS 7500а. В качестве объектов исследования для биотестирования использовали микроводоросли D. salina и С. minutissima и ракообразных А. salina. В исследуемую морскую воду, как загрязнённую нефтью, так и очищенную от нефти ПАУОБ, добавляли суспензии, содержащие клетки микроводорослей или особей A. salina. Перед проведением биотестирования биопрепарат «Морской снег» измельчали, заливали морской водой, перемешивали, после чего суспензию пропускали через обеззоленные фильтры «белая лента». Учёт микроводорослей D. salina и С. minutissima производили, используя камеру Горяева, ракообразных A. salina подсчитывали визуально.

Для культивирования D. salina использовали среду Гольдберга в модификации Кабановой (1961), С. minutissima - среду Тамия. A. salina выращивали в воде с различными разведениями тестируемых бактериальных объектов на фильтрованной водопроводной или морской воде. Состав среды Гольдберга, масса солей на 100 мл дистиллированной воды: раствор №1 -KN03 - 10,1 г; раствор №2 - Na2HP04 - 1,421 г; раствор №3 - FeCl3 -6Н20 -27,03 мг, MgCl2 4 Н20 мг - 19,79 мг; СоС12 6Н20 - 23,79 мг, рН 6,7-7,2. Питательную среду готовили на воде Балтийского моря, фильтровали через слой ваты и фильтровальной бумаги. Воду трижды пастеризовали (1 раз в день), нагревая до температуры 70 — 75 °С, которую поддерживали в течение 20 мин., затем охлаждали до комнатной температуры. В подготовленную таким

7

образом морскую воду добавляли растворы в мл: №1 - 2, №2 - 1, №3 - 1, перед посевом. Состав среды Тамия, г/л: KN03 - 5,00; КБ2РО4ЗН2О - 1,25; MgS04-7H20 - 2,50; FeS04-7H20 - 0,003; микроэлементы - 1 мл, вода морская, подготовленная так же, как для среды Гольдберга, pH 6,7-7,2. Стерильную питательную среду разливали в колбы по 100 мл и добавляли 1-5 мл суспензии водорослей. При выращивании в люминостате 2-3 раза в день встряхивали питательный раствор с водорослями. Водоросли выращивали при освещении 2000-3000 люкс и температуре 18-20 °С.

Для конструирования биопрепарата использовали природные цеолиты, микромицеты Fusarium и Trichoderma, ивовые прутья или стебли водных растений, хлопковую ткань. Микромицеты получали биотехнологическим методом на питательной среде, обогащённой глюкозой и минеральными веществами, следующего состава, г/л: КН2Р04 - 2,5; NH4NO3 - 5,0; MgS04-7H20 -1,0; глюкоза - 10; вода водопроводная, pH 6,7-7,2.

Эффективность очистки морской воды от нефти ПАУОБ проверяли двумя методами: 1) по изменению содержания н-алканов методом ГХ-МС в соответствии с ПНДФ 16.1:2.2.22-98 - Анализ нефтезагрязнённой почвы; в этом опыте модельный уровень нефтезагрязнения соответствовал 1 %; 2) по изменению группового состава нефти методом жидкостной хроматографии; уровень нефтезагрязнения соответствовал 2 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и наращивание ПАУОБ из Балтийского моря

ПАУОБ были выделены из образцов воды Балтийского моря, отобранных из прибрежной зоны в районе городов Светлогорск и Балтийск. Солёность воды Балтийского моря составила 12,30 г/л. pH морской воды - 7,74. Анионный состав воды Балтийского моря представлен в таблице 1.

Таблица 1

Анионный состав воды Балтийского моря

Морская вода Анионы, мг/л

Г сг Вг" NO," SO/-

Проба 1 (14.04.2007 г.) 31,8 2423,1 8,5 35,2 510,7

Проба 2 (07.05.2007 г.) 12,1 2391,7 8,9 24,4 718,1

Данные, представленные в таблице 1, согласуются с данными других исследователей.

Количество УОБ в морской воде иллюстрируется таблицей 2.

Таблица 2

Количество УОБ в воде Батгийского моря в районе побережья Калининградской области

УОБ Количество УОБ в пробе воды, КОЕ/мл

район г. Балтийска район г. Светлогорска

Использующие нефть 6,0- 10J 2,5-10''

Использующие дизельное топливо 2,6-10J 1,010J

При загрязнении нефтью локальная концентрация УОБ в воде повышается до 107-109 КОЕ/мл.

ПАУОБ представляют собой стратегический ресурс моря и являются единственным компонентом, способным очистить акваторию от нефтяного загрязнения.

Для получения накопительных культур ПАУОБ в морскую воду добавляли нефть и активно перемешивали, таким образом, способствуя аэрации, повышая массообмен и моделируя биотехнологически естественный природный процесс. Титр бактерий в накопительных культурах, выращенных на нефтезагрязнённой морской воде с глюкозой и без нее, составил 0,81-Ю8 КОЕ/мл и 1,27-108 КОЕ/мл, соответственно. Качественный состав УОБ в этих двух вариантах накопительных культур различается, так как добавление глюкозы не только влияет на спектр бактерий, но и способствует дополнительному развитию экзополимерного матрикса.

Из накопительных культур выделяли ПАУОБ, затем из них выделяли чистые культуры УОБ селекцией на среде Чапека с нефтью и определяли их родовую принадлежность (таблица 3). По результатам исследования составлена коллекция УОБ и их ассоциаций (ПАУОБ), выделенных из Балтийского моря. ПАУОБ служили основой и активным началом разрабатываемого биопрепарата.

Выявленный спектр УОБ Балтийского моря существенно шире

представленного в других исследованиях. Так, Ильинским и Коронелли

приведены данные о Rhodococcus, Pseudomonas и Arthrobacter [Коронелли и

9

др., 1987]. Необходимо подчеркнуть, что, помимо УОБ важную роль в окислении нефти играют их спутники - бактерии-соокислители. Полная биодеструкция нефти, включая смолы и асфальтены, может осуществляться только в условиях соокисления, при которых частично окисленные УОБ углеводороды служат ростовым субстратом для других бактерий, потребляющих более легкодоступные органические вещества.

Таблица 3

Родовая принадлежность УОБ, выделенных из Балтийского моря

Грамположительные Грамотрицательные

АпЬгоЬаает Лкеготопая

ВасШш Cytophaga

СогупеЬаЫегшт Мухососсш

Мгсгососсиз Рзеи^топая

ЫосагЛа ЗртПит

Шюйососсиз

Поэтому в биопрепарате используется накопительная культура ПАУОБ, что позволяет сохранить весь углеводородокисляющий ресурс акватории, а именно УОБ и бактерий-соокислителей, способствующий полноте биодеструкции нефти.

2. Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти

Принципы конструирования биопрепарата заключаются в следующем.

1. Реализация экологически этичного подхода по отношению к природе, что выражается в использовании только природных материалов в компонентах биопрепарата и аборигенных для данной акватории целостных ПАУОБ.

2. Использование нескольких видов носителей бактерий для создания внутри биопрепарата условий, способствующих адгезии на них УОБ с разными свойствами клеток и увеличению площади поверхности.

3. Использование нескольких видов сорбентов для нефти, что обеспечивает эффективную сорбцию нефти и селективное и

дозированное поступление углеводородов к клеткам УОБ.

10

4. Использование подкормки для УОБ, включающей минеральные и органические вещества, микро- и макроэлементы в доступных для УОБ формах, локализованные в биопрепарате.

5. Использование плавучего элемента, обеспечивающего нахождение биопрепарата на поверхности воды, где наиболее активно происходит биодеструкция нефтяного загрязнения.

6. Разработка и использование универсального метода очистки, сочетающего в себе микробиологический, биохимический и физико-химический способы очистки и учитывающего разные ногодно-климатические условия.

Структура и характеристики разработанного биопрепарата представлены в таблице 4.

Таблица 4

Структура и характеристики разработанного биопрепарата

Уровень Состав биопрепарата Носитель-подкормка Сорбция нефти Плавучесть Срок хранения

1 ПАУОБ или УОБ Отсутствует Отсутствует Положительная 7 суток

2 Биопрепарат 1 уровня, носитель-подкормка (цеолит) Присутствует Присутствует Отрицательная Более 1 года

3 Биопрепарат 2 уровня, природный носитель-подкормка (микромицеты), сорбент для нефти (хлопок, микромицеты), каркас дня придания плавучести (ивовые прутья или стебли водных растений) Присутствует Присутствует Положительная Более 1 года

Традиционно существующие биопрепараты относятся к 1 или 2 уровням. Разработанный биопрепарат относится к 3 уровню. Биопрепарат 3 уровня является плавучей станцией (концентрированным ресурсом), обеспечивающей сорбцию нефти на хлопковой капсуле, цеолитах и микромицетах, и сё биодеструкцию активным компонентом биопрепарата (ПАУОБ), а также эмиссию активных УОБ из биопрепарата в акваторию. Установлено, что эмиссия клеток в акваторию не превышает 103 кл/мл, что соответствует

естественной экологической концентрации УОБ. Хлопковая капсула, сорбируя нефть, предотвращает её оседание на дно, а также является дополнительным носителем ПАУОБ, которые могут развиваться на внутренней стороне капсулы.

Биопрепарат представляет собой кассету диаметром 0,25 м из бязи (хлопковая капсула), неплотно натянутой на каркас в виде кольца из ивовых прутьев или стеблей водных растений с положительной плавучестью с помещёнными внутрь ПАУОБ иммобилизированными на природных носителях-подкормках - цеолитах и микромицетах Fusarium и Trichoderma (рис. 1).

Рис. 1. Конструкция разработанного биопрепарата «Морской снег» для восстановления нефтезагрязнённых акваторий

1 - ПАУОБ, иммобилизованные на носителе цеолите, 2-микромицет-носитель ПА УОБ, иммобилизованных на цеолите, а также сорбент нефти, 3 - хлопковая капсула, 4 -

плавучий каркас

Носители бактерий в биопрепаратах 2 и 3 уровней, которые одновременно являются питательным субстратом для УОБ, содержат минеральные и органические вещества, необходимые для развития УОБ. Цеолиты являются источником микроэлементов (Na, AI, Si, Mn, Mg, Fe, В, Co и др.) для ПАУОБ. Микромицеты Fusarium и Trichoderma, которые впервые использованы в качестве носителя-подкормки для УОБ, являются источником макро- и микроэлементов, Сахаров и факторов роста (соединений азота, фосфора, калия), выделяемых в процессе автолиза биомассы микромицетов.

Хлопковая капсула, цеолиты и микромицеты являются также и сорбентами для нефти. Цеолиты поглощают нефти в 3-6 раз больше своей массы, микромицеты - в 5-6, хлопок - в 5-10. Они действуют как селективный барьер, обеспечивающий дозированное поступление нефти внутрь биопрепарата. Расход биопрепарата - 0,2 кг (одна кассета диаметром 0,25 м) на

1 м2 загрязнённой акватории. Внесение биопрепарата осуществляется с помощью авиации и плавсредств.

В конструкции биопрепарата 3 уровня обеспечивается единство процессов адгезии ПЛУОБ, сорбции нефти, эмульгирования нефти биоПЛВами, выделяемыми УОБ, и биодеструкции нефти. В основе биопрепарата - взаимодополняемость гармоничной пары Rhodococcus и Pseudomonas. Высокогидрофобные клетки Rhodococcus обладают высокой эмульгирующей способностью, а клетки Pseudomonas выделяют в среду ПАВы. На клетках Rhodococcus {Arthrobacter) нефть адсорбируется, с помощью клеток Pseudomonas - эмульгируется. Rhodococcus (Arthrobacter) синтезируют и выделяют в среду коллоидный экзополимерный матрикс, на котором адгезируются бактерии-спутники - соокислители нефтяных углеводородов.

Разработанный биопрепарат предназначен для первичной очистки нефтезагрязнённых акваторий от нефтяных пятен, толщиной 0,04-15 мкм, сорбции толстой (до 8 мм) и тонкой (до 15 мкм) поверхностных плёнок. В связи с этим в моделируемых лабораторных экспериментах исследовали уровень нефтяного загрязнения от 0,1 до 2,5 % с толщиной плёнок в колбе 2-15 мкм. Разработанный биопрепарат имеет высокие конкурентные преимущества перед существующими биопрепаратами для акваторий по универсальности, эффективности применения и стоимости.

Для предотвращения нанесения вреда гидробионтам внесением биопрепарата и ухудшения экологической обстановки в акватории было исследовано содержание тяжёлых металлов и других элементов в биопрепарате «Морской снег» (таблица 5).

Таблица 5

Результаты определения тяжёлых металлов и других элементов в биопрепарате «Морской снег»

Показатель ПДК, мг/кг Массовая доля химических элементов, мг/кг

1 2 3

Свинец (РЬ) 30,0 15,2

Кадмий (Cd) 5,0 (10,0 для морских водоёмов) 0,1

Никель (Ni) 85,0 3,5

1 2 3

Медь (Си) 55,0 12,7

Цинк (2г\) 100,0 67,9

Мышьяк (Аб) 2,0 0,9

Марганец (Мп) 1500,0 583,8

Ванадий (V) 150,0 1,9

Хром (Сг) 6,0 2,6

Кобальт (Со) 5,0 0,4

Стронций (Бг) 300,0 (ОДК) 34,6

Молибден 10,0 0,2

Сурьма (БЬ) 4,5 0,04

Ртуть (ВД 2,1 0,2

Таким образом, содержание тяжёлых металлов и других элементов в биопрепарате находится в пределах ПДК, то есть он не токсичен и может вноситься в природную среду.

3. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий от нефти разработанным биопрепаратом

Хроматограммы н-алканов в морской воде до и после её очистки показаны на рис. 2. Уровень нефтезагрязнения в этом опыте соответствовал 1 %.

В Г

Рис. 2. Хроматограммы н-алканов в нефтезагрязнённой и очищенной ПАОУБморской воде

А -морская вода, 0 суток; Б-морская вода с нефтью, 0 суток; В -морская вода, очищенная от нефти ПАУОБ, 10 суток; Г-морская вода, очищенная от нефти ПАУОБс добавлением глюкозы, 10 суток

Рис. 2 свидетельствует, что в процессе развития ПАУОБ количество н-алкаиов снижается. Абсолютные значения н-алканов в этом опыте представлены в таблице 6.

Таблица б

Количество н-алканов в исследуемых пробах морской воды, очищенной ПАУОБ от нефтяного загрязнения

Количество н-алканов в морской воде, мкг/мл

Морская вода, Морская вода,

н-Алкан Морская Морская вода с очищенная от очищенная от нефти

вода нефтью нефти культурой культурой ПАУОБ с

ПАУОБ добавлением глюкозы

1 2 3 4 5

С,6 0,051 min 0,132 0,069 min 0,081

С,7 min0,029 0,347 min-0,07 0,105

с,g 0,034 0,615 0,064 0,205

С19 0,095 0,973 0,147 0,349

С20 0,229 1,14 0,4 0,604

С21 0,273 1,14 0,42 0,5

С22 0,363 шах 1,222 0,633 0,57

С23 0,456 1,051 0,928 0,685

См 0,482 1,042 1,04 0,689

С25 0,538 0,84 0,996 0,679

Ci6 0,542 1,008 шах 1,072 max 0,697

С27 0,449 0,871 0,889 0,578

с28 max0,473 0,719 0,722 0,542

С29 0,303 0,676 0,357 0,298

Сзо 0,255 0(64 0,372 0,279

Сз, 0,225 0,506 0,28 0,232

С32 0,293 0,367 0,306 0,209

Сзз 0,062 0,257 0,202 0,127

Всего 5,152 13,546 8,967 7,429

Таблица 6 показывает, что эффективность очистки морской воды от н-алканов составляет 54,5 % в варианте без глюкозы и 72,9 % - в варианте с глюкозой. Таким образом, добавление глюкозы способствует более эффективной очистке воды от н-алканов, причём ПАУОБ лучше потребляют С16-С21 н-алканы при окислении нефти, а С22-С33 н-алканы - в условиях соокисления нефти с глюкозой. Определение эффективности биодеградации по н-алканам является общепринятым стандартным методом. Однако, не н-алканы являются наиболее токсичным компонентом нефти, то есть этот общепринятый метод определения качества очистки от нефтезагрязнения не даёт полного ответа на вопрос о глубине нефтедеструкции.

В таблице 7 представлены данные изменения группового состава углеводородов в исследуемых пробах морской воды, очищенной ПАУОБ от нефтяного загрязнения в сравнении с исходной нефтью. Эффективность биодеструкции нефти за 7 суток в лабораторных условиях составила 75 % в варианте без глюкозы и 71 % - в варианте с глюкозой.

Таблица 7

Групповой состав углеводородов в исследуемых пробах морской воды, очищенной ПАУОБ от нефтяного загрязнения, и в исходной нефти

Группа углеводородов Исходная нефть, % Групповой состав нефти в морской воде очищенной ПАУОБ, %

вариант без добавления глюкозы вариант с добавлением глюкозы

11арафино-нафтены 68,0 72,3 67,7

Моноциклические ароматические 5,5 5,9 8,0

Бициклические ароматические 8,6 10,6 12,5

Полициклические ароматические 8,6 5,7 5,6

Смолы 6,2 3,6 3,9

Асфальтены 3,1 1,9 2,3

Общее содержание нефти, % 100,0 25,0 29,0

Таблица 7 свидетельствует о том, что все группы углеводородов нефти, определяемые в эксперименте, включая смолы и асфальтены, были подвержены ПАУОБ биодеструкции. Общая степень биодеструкции в варианте с добавлением глюкозы, изменяющей спектр УОБ в очищаемой воде, и в варианте без глюкозы была практически одинаковой.

Химические методы анализа дают сведения о количественном и качественном изменении нефти в процессе биодеградации. Однако они не дают экологическую оценку эффективности этого процесса. Биотестирование даёт комплексный экологически полноценный результат качества работы биопрепарата. Живые организмы являются наиболее чувствительным и адекватным индикатором нефтезагрязнения экосистемы.

Тестировали биопрепарат 1 и 3 уровней, а также очищенную ПАУОБ морскую воду. Данные, представленные на рис. 3, свидетельствуют о том, что морская вода, очищенная от нефтяного загрязнения ПАУОБ, безвредна для микроводорослсй D. salina, а нефть вызывает ингибирование роста. Данные,

полученные при биотестировании на С. minutissima, аналогичны результатам эксперимента с D. salina.

Рис. 3. Изменение количества клеток микроводорослей D. salina при росте в нефтезагрязнепной и очищенной морской воде

1 - морская вода, 2-морская вода с нефтью (0,25 %), 3 - морская вода, очищенная от нефтиПАУОБ, 4 - морская вода, очищенная от нефти ПАУОБ в условиях соокисления с

глюкозой

Накопительные культуры ПАУОБ были безвредны для микроводорослей D. salina (рис. 4). Данные, полученные в эксперименте с С. minutissima, иллюстрируют ту же закономерность. Наблюдается эффект стимулирования развития популяции D. salina и С. minutissima в присутствии УОБ и продуктов их жизнедеятельности.

Время, сутки

Рис. 4. Изменение количества клеток микроводорослей D. salina в культурах ПАУОБ

1 - морская вода, 2 - морская вода с нефтью (0,1 %), 3 - культура ПА УОБ, выделенная на нефти после 3 суток культивирования, 4 — культура ПА УОБ, выделенная на нефти с глюкозой, после 3 суток культивирования

По результатам биотестов было установлено не только отсутствие острой токсичности культур бактерий и очищенной ими морской воды для зелёных микроводорослсй, но и их рост-стимулирующий эффект.

На рис. 5 и 6 представлены- результаты подсчета ракообразных A. salina при тестировании нефтезагрязненной воды, очищенной ПАУОБ. Была отмечена 100 %-ная гибель представителей зоопланктона от нефтяного загрязнения (0,25 %) уже через 24 часа, то есть нефть даже в малых концентрациях обладает острой токсичностью для A. salina.

1«

-4---3 ■Х--4 •*-■ 5

Время, час

\2 -V-

—«—I

--«—2 -1---3

5

<8

Брем1,час

А Б

Pite. 5. Изменение количества особей ракообразных A. salina в нефтезагрязненной и очищенной ПА УОБ воде (А: фильтрованная водопроводная вода, Б: вода Балтийского моря)

1 - вода; 2 - вода с нефтью (0,25 %); 3,4, 5- вода, очищенная от нефти с разведениями 1:1,1:100,1:1000, соответственно

Очищенная ПАУОБ нефтезагрязнённая морская вода при разведении водой Балтийского моря была безвредна для A. salina (рис. 5Б). JIK5o очищенной воды при разбавлении ее фильтрованной водопроводной водой соответствовала разведению 1:1; близкий токсический эффект оказывала вода в разведении 1:100 (рис. 5А). Очищенная вода в разведении 1:1000 была безвредна в этом варианте опыта.

Очищенная нефтезагрязнённая морская вода в условиях соокисления с глюкозой была безвредна для A. salina в разведении 1:100 и проявляла незначительный токсический эффект в разведении 1:1 (рис. 6Б) в случае разбавления водой Балтийского моря. JlKso очищенной воды при разбавлении ее фильтрованной водопроводной водой соответствовала разведению 1:100 (рис. 6А). Очищенная вода в разведении 1:1000 была безвредна в этом

варианте опыта. По-видимому, морская вода обладает буферным действием, смягчающим токсический эффект продуктов микробной трансформации.

—•—i

з

V

Рис. 6. Изменение количества особей ракообразных Л. salina в нефтезагрязнённой и очищенной ПА У ОБ морской воде в условиях соокисления с глюкозой (А: фильтрованная водопроводная вода, Б: вода Балтийского моря)

1 - вода, 2 - вода с нефтью (0,25 %), 3,4,5- вода, очищенная от нефти с разведениями 1:1, 1:100 и 1:1000, соответственно

По изменению количества особей ракообразных A. salina в культурах ПАУОБ установлено, что ПАУОБ с титром 103 кл/мл, соответствующим естественной экологической концентрации УОБ, определяемой в Балтийском море, токсическое действие на A. salina не проявляли.

Результаты оценки экотоксичности биопрепарата с использованием A. salina и С. minutissima представлены на рис. 7.

А Б

Рис. 7. Изменение количества особей ракообразных A. salina (А) и клеток микроводорослей С. minutissima (Б) при определении экотоксичности биопрепарата «Морской снег»

1 - морская вода, 2-экстракт из биопрепарата «Морской снег» в морской воде Подсчёт особей A. salina (рис. 7А) в экстракте биопрепарата показал, что биопрепарат не токсичен для тест-культуры. Подсчёт клеток С. minutissima при определении экотоксичности биопрепарата (рис. 7Б) показал увеличение их

количества в экстракте биопрепарата на 13 % по сравнению с контролем, что свидетельствовало о нетоксичности биопрепарата для тест-культуры. По результатам биотестирования биопрепарат отнесён к 4 классу опасности. Получен экологический сертификат соответствия разработанного биопрепарата «Морской снег» экологическим требованиям (№1081 от 02.06.2007 г.).

Таким образом, ПАУОБ - активный компонент биопрепарата, который эффективно очищает морскую воду от нефти и в естественных экологических концентрациях не оказывает негативного воздействия на представителей фито-и зоопланктона,- Результаты свидетельствуют о том, что способ восстановления загрязнённых нефтью и нефтепродуктами морских акваторий с помощью биопрепарата на основе аборигенных ПАУОБ, является эффективным и не наносящим вред экосистеме.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены и исследованы ПАУОБ Балтийского моря. Создана коллекция УОБ, включающая бактерии следующих родов: грамположительные Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Nocardia, Rhodococcus и грамотрицатсльные Alteromonas, Cytophaga, Myxococcus, Pseudomonas, Spirillum.

2. Впервые предложено использовать в качестве активного начала биопрепарата аборигенный-для данной акватории ПАУОБ, что позволило сохранить всё биоразнообразие УОБ и их спутников -бактерий-соокислителей, способствующее полноте биодеструкции нефти.

3. Впервые предложено использовать микромицеты Fusarium и Trichoderma в качестве носителя и подкормки для УОБ, а также как сорбент для нефти.

4. Установлено, что эффективность очистки морской воды от нефти

в лабораторных условиях составила за 7 суток более 70 %. При

этом все определяемые группы углеводородов нефти,

включающие парафино-нафтеновые углеводороды,

20

моноциклические ароматические, бициклические ароматические, полициклические ароматические углеводороды, смолы и асфальтены, были подвержены ПАУОБ биодеструкции.

5. Сформированы принципы конструирования биопрепаратов, на основе которых разработан трёхуровневый биопрепарат «Морской снег». Предполагаемая рыночная стоимость биопрепарата «Морской снег» на порядок меньше существующих аналогов.

6. Показано, что тестирование биопрепарата на гидробионтах является наиболее адекватным и эффективным методом определения качества очистки воды и определения влияния нефтяного загрязнения и действия биопрепарата в пищевой цепи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых ВАК Российской Федерации

1. Сребняк Е.А., Терехова В. А., Федосеева Е. В., Ботвинко И. В., Винокуров В. А. Биопрепарат «Морской снег» для восстановления акваторий, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, и его экотоксикологическая оценка / Экология и промышленность России, сентябрь, 2008, с. 42-44.

2. Сребняк Е. А., Ботвинко И. В., Малахова Д. В., Винокуров В. А. Способ получения биопрепарата для восстановления водоёмов, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами / Патент на изобретение/Ws 2327649 от 23.05.2006 г., бюл. 18 от 27.06.2008 г.

Прочие публикации

1. Сребняк Е.А., Винокуров В. А., Хомякова Д. В. Разработка микробиологических средств и технологий доочистки морских акваторий от разливов нефти и нефтепродуктов. Издательство «Нефть и газ» РГУ нефти и газа имени И. М. Губкина. Тезисы докладов конференции «Нефть и газ-2004», М., 2004, с. 36.

2. Сребняк Е. А., Винокуров В. А., Хомякова Д. В. Использование микробиологических методов для очистки морских акваторий от нефти и нефтепродуктов. Тезисы докладов Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2004». Калининград, 2004, с. 112.

3. Сребняк Е.А., Винокуров В. А., Хомякова Д. В., Нетрусов А. И. Разработка биопрепарата для очистки морских акваторий от нефти и нефтепродуктов. Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов» (с международным участием), МГУ имени И. М. Ломоносова. Тезисы докладов М.: МАКС Пресс, 2004, с. 83.

4. Сребняк Б. А., Хомякова Д. В., Ботвиико И. В., Винокуров В. А. Технология биоремедиации Балтийского моря, загрязненного нефтью и нефтепродуктами, с помощью многоуровневых биопрепаратов на основе природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий. Материалы Всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование», Яросл. гос. ун-т. -Ярославль: ЯрГУ, 2005, с. 189-193.

5. Сребняк Е.А., Винокуров В. А., Хомякова Д. В., Ботвинко И. В. Разработка технологии биоремедиации Балтийского моря, загрязнённого нефтью и нефтепродуктами, многоуровневыми биопрепаратами. Материалы конференции Инновации в экологии. Аналитический центр и Инновационное бюро Эксперт. М, 2006, с. 130-131.

6. Винокуров В. А., Ботвинко И. В., Сребняк Е.А. Microbial Degradation of Oil (Микробная деградация нефти). Аналитический обзор / Отчёт по НИР. Per. 0120.0 805559. М.: РГУ нефти и газа имени И. М. Губкина. 2007.99 с.

7. Сребняк Е.А., Винокуров В.А., Ботвинко И.В., Коканина A.B. Исследование компонентов, необходимых для получения биопрепарата для биоремедиации Балтийского моря, загрязнённого нефтью и нефтепродуктами, и создание модели биопрепарата / Отчёт по НИР. Per. №02.2.00704341. М.: ООО «Океан Биосистсма». 2007.125 с.

8. Terekhova V., Bandolina E., Menshenina A., Patsayeva S., Srebnyak E., Semenova T., Yuzhakov V. Non-destructive optical characterization of several pure cultures of microscopic fungi and algae grown in different ecological conditions /In: EARSeL Workshops in the framework of the 27th EARSeL Symposium. Workshop Programme Abstracts Book. 7-9 June 2007, Bolzano, Italy, p.89.

9. Srebnyak E. A., Fedoseeva E. V., Ibatullina I. S., Patsaeva S. V., Botvinko I. V., Terekhova V. A. Biotesting Ecological toxicity of oil - oxidating bacteria from the Baltic Sea In: Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers, and reservoirs /Abstracts of the 2"d Baikal Symposium on Micribiology, Irkutsk, September 10-15,2007, pp. 213-214.

10. Винокуров В. А., Мерициди И. А., Ботвинко И. В., Сребняк Е.А. Handling of oil spill in ice infested waters (Управление нефтяными разливами в водах со льдом). Аналитический обзор / Отчёт по НИР. Per. 0120.0 805558. M.: РГУ нефти и газа имени И. М. Губкина. 2007.142 с.

11. Сребняк Е.А. Исследование воздействия нефтяного загрязнения на представителей бактерио-, фито- и зоопланктона экосистем Балтийского моря. Ломоносов-2008: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; Секция «Биология»; 8-11 апреля 2008 г.; Москва, МГУ имени М. В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов / Сост.: О. Ф. Женавчук, А. Н. Серков. - М.: МАКС Пресс, 2008, с. 141.

12. Terekhova V., Botvinko I., Vinokurov V., Srebnyak E. The biotesting of oil-oxidizing bacteria and fungi associations for the certification of new bioabsorbents and water remediation control /The Third International Meeting on Environmental Biotechnology and Engineering (3IMEBE) Palma de Mallorca September 21 -25,2008 (in press).

13. Ботвинко И.В., Сребняк Е.А. Биологический метод ликвидации разливов // Техника и технологии локализации и ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов: Справ. / И. А. Мерициди, В.Н. Ивановский, А. Н. Прохоров и др.; Под ред. И. А. Мерициди. - СПб.: НПО «Профессионал», 2008. - Гл. 4., с. 446-472.

Сребняк Екатерина Анатольевна

Разработка технологии получения нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря

Подписано в печать 19.11.2008. Формат 60x84 1/16. Печать трафаретная. Уч.-изд. л. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 972. Отпечатано в типографии «11-Й ФОРМАТ» 115230, г. Москва, Варшавское ш., д. 36.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Сребняк, Екатерина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Анализ методов исследования и особенностей природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий (ПАУОБ).

1.1.1. Выделение и исследование ПАУОБ.

1.1.2. Качественный состав ПАУОБ.

1.1.3. Физиологические и биохимические свойства углеводородокисляющих бактерий (УОБ).

1.1.3.1. Поверхностно-активные свойства У ОБ.

1.1.3.2. Бактериальный матрикс.

1.1.3.3. Биохимические пути окисления углеводородов бактериями.

1.2. Способы очистки нефтезагрязнённых акваторий.

1.2.1. Биовосстановление нефтезагрязнённых акваторий.

1.2.2. Биопрепараты.

1.3. Методы определения эффективности бактериальной очистки нефтезагрязнённых акваторий.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.1. Определение анионного состава воды.

2.1.2. Получение накопительных культур.

2.1.3. Количественный учёт.

2.1.4. Выделение чистых культур и идентификация УОБ.

2.1.5. Экспресс-метод определения полианионной природы межклеточного матрикса УОБ с цетавлоном.

2.1.6. Получение поверхностной плёнки микромицета.

2.1.7. Конструирование биопрепарата.

2.1.8. Определение тяжёлых металлов и других токсичных химических элементов в биопрепарате.

2.1.9. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённой морской воды.

2.1.9.1. Определение общего содержания углеводородов нефти методом ИК-спектроскопии.

2.1.9.2. Определение содержания н-алканов методом ГХ—МС

2.1.9.3. Определение группового состава нефти методом жидкостной хроматографии.

2.1.10. Экотоксикологическая оценка очищенной воды от нефти, культур ПАУОБ и разработанного биопрепарата методом биотестирования.

2.1.11. Определение фотосинтетической активности микроводорослей спектральным методом.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

2.2.1. Выделение и исследование ПАУОБ Балтийского моря.

2.2.1.1. Анионный состав воды Балтийского моря.

2.2.1.2. Количество УОБ в морской воде.

2.2.1.3. Культивирование ПАУОБ.

2.2.2. Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти.

2.2.2.1. Конструкция разработанного биопрепарата «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий.

2.2.2.2. Микромицеты, используемые в качестве носителей-подкормок ПАУОБ / УОБ и сорбента для нефти.

2.2.2.3. Результаты количественного химического анализа биопрепарата «Морской снег».

2.2.3. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий разработанным биопрепаратом.

2.2.3.1. Определение общего содержания нефти методом ИК-спектроскопии.

2.2.3.2. Хроматограммы изменения н-алканов и их количество в нефтезагрязнённой и очищенной ПАУОБ морской воде.

2.2.3.3. Изменение группового состава углеводородов в морской воде, очищенной ПАУОБ от нефтяного загрязнения.

2.2.3.4. Результаты биотестирования очищенной морской воды на микроводорослях Dunaliella salina и Chlorella minutissima.

2.2.3.5. Результаты биотестирования культур ПАУОБ на микроводорослях D. salina и С. minutissima.

2.2.3.6. Результаты биотестирования очищенной морской воды на ракообразных Artemia salina.

2.2.3.7. Результаты биотестирования культур ПАУОБ на ракообразных A. salina.

2.2.3.8. Результаты биотестирования биопрепарата «Морской снег» на микроводорослях С. minutissima и ракообразных A. salina.

2.2.3.9. Определение фотосинтетической активности микроводорослей спектральным методом.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря"

В Мировом океане по разным данным ежегодно разливается от 10 до 16 млн. тонн транспортируемой нефти, в том числе, только в Балтийском море эти разливы достигают нескольких тысяч тонн в год. На основании статистических данных можно с большой вероятностью прогнозировать, что общие объёмы разливов нефти будут возрастать.

При загрязнении акватории нефтью и нефтепродуктами происходит отравление и/или гибель большого количества организмов. Разрываются пищевые цепи, в результате чего прерываются связи в экосистеме и разрушается её живая составляющая. Поэтому даже при восстановлении жизни на данном участке возможны очень сильные преобразования в доминантах экологических ниш, что проявляется в уменьшении разнообразия живого мира. Это в свою очередь может привести к другим крупным негативным изменениям экосистемы.

Современные технологии, применяемые при ликвидациях разливов нефти, несовершенны, так как не исключают опасность проникновения и накопления углеводородов в пищевых цепях. Кроме того, недостатками существующих технологий являются их высокая стоимость и недостаточная эффективность очистки морской акватории. Поэтому необходимы эффективные способы восстановления морской среды от разливов нефти.

Нефтяное загрязнение представляет меньшую опасность для микроскопических обитателей акваторий - бактериопланктона. Это связано с тем, что бактерии являются единственным компонентом экосистемы, способным разрушать нефтяное загрязнения до простых соединений в процессе жизнедеятельности. Поэтому перспективным способом восстановления нефтезагрязнённых акваторий является микробиологический. Однако использованию микробиологического способа препятствуют следующие проблемы.

• Известные биопрепараты разработаны для очистки почв и не пригодны для использования в акваториях.

• Низкая эффективность таких биопрепаратов обусловлена конкурентным вытеснением, вымыванием, долгой адаптацией вносимых бактерий.

• Таким образом, целью диссертационной работы являлась разработка нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря.

Задачи исследования:

1. Выделение и исследование природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий (ПАУОБ) из Балтийского моря.

2. Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти.

3. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий разработанным биопрепаратом.

Научная новизна. Впервые предложено использовать в качестве активного начала биопрепарата ПАУОБ в виде накопительной культуры, что позволило сохранить всё биоразнообразие углеводородокисляющих бактерий (УОБ) и их спутников - бактерий-соокислителей, способствующих полноте деструкции нефти. Предложено использовать микромицеты Fusarium и Trichoderma в качестве носителя и подкормки для УОБ, а также как сорбент для нефти. Сформированы принципы конструирования биопрепаратов, на основе которых разработан 3-х уровневый биопрепарат «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий.

Для оценки эффективности очистки морской воды от нефти применён метод биотестирования на гидробионтах, что позволило получить целостный комплексный ответ. Впервые показано, что биотестирование на гидробионтах является не только адекватным и эффективным методом для определения качества очистки воды, но и тонким экологическим приёмом определения влияния нефтяного загрязнения и действия биопрепарата в пищевой цепи.

Практическая ценность. Предложена новая оригинальная конструкция биопрепарата, состоящая в том, что в нём нефть и бактерии локализуются в пространстве в плавучей кассете, адсорбируясь на селективных носителях и сорбентах. Степень очистки от нефти на лабораторной модели биопрепаратом составила за 7 суток более 70 %. Биотестированием продемонстрировано отсутствие острой токсичности очищенной морской воды для микроводорослей Dunaliella salina и Chlorella mimitissima и стимулирование их развития в очищенной воде и в накопительных культурах метаболитами ПАУОБ, а также безвредность для ракообразных Artemia salina очищенной морской воды и ПАУОБ в естественных экологических концентрациях. Подтверждена адекватность использования биотестирования для оценки качества очистки биопрепаратом морской воды и ПАУОБ. Предполагаемая рыночная стоимость биопрепарата на порядок меньше существующих. Способ получения биопрепарата защищён патентом на изобретение Российской Федерации №2327649 от 27.06.2008 г. «Способ получения биопрепарата для восстановления водоёмов, загрязнённых нефтью или нефтепродуктами».

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Сребняк, Екатерина Анатольевна

выводы

1. Впервые выделены и исследованы ПАУОБ Балтийского моря. Создана коллекция УОБ, включающая бактерии следующих родов: грамположительные Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Nocardia, Rhodococcus и грамотрицательные Alteromonas, Cytophaga, Myxococcus, Pseudomonas, Spirillum.

2. Впервые предложено использовать в качестве активного начала биопрепарата аборигенные для данной акватории ПАУОБ, что позволило сохранить всё биоразнообразие УОБ и их спутников -бактерий-соокислителей, способствующее полноте биодеструкции нефти.

3. Впервые предложено использовать микромицеты Fusarium и Trichoderma в качестве носителя и подкормки для УОБ, а также как сорбент для нефти.

4. Установлено, что эффективность очистки морской воды от нефти в лабораторных условиях составила за 7 суток более 70 %. При этом все определяемые группы углеводородов нефти, включающие парафино-нафтеновые углеводороды, моноциклические ароматические, бициклические ароматические, полициклические ароматические углеводороды, смолы и асфальтены, были подвержены ПАУОБ биодеструкции.

5. Сформированы принципы конструирования биопрепаратов, на основе которых разработан трёхуровневый биопрепарат «Морской снег». Предполагаемая рыночная стоимость биопрепарата «Морской снег» на порядок меньше существующих аналогов,

6. Показано, что тестирование биопрепарата на гидробионтах является наиболее адекватным и эффективным методом определения качества очистки воды и определения влияния нефтяного загрязнения и действия биопрепарата в пищевой цепи.

БЛАГОДАРНОСТИ

За консультирование при выполнении работы и помощь выражаю благодарность:

- заведующему кафедрой физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина профессору, д. х. н. Винокурову В. А.;

- научному сотруднику кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова к. б. н. Ботвинко И. В.;

- преподавателям, сотрудникам и магистрантам кафедры физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина;

- преподавателям Калининградского государственного технического университета;

- профессору кафедры ихтиологии и экологии Калининградского государственного технического университета к. г. н. Берниковой Т. А.;

- научному сотруднику кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова к. б. н. Малаховой Д. В.;

- магистрам техники и технологии Стексовой Елене и Коканиной Анастасии;

- сотруднику кафедры экотоксикологии почв почвенного факультета МГУ имени М. В. Ломоносова д. б. н. Тереховой В. А.;

- заведующему кафедрой микробиологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова профессору, д. б. н. Нетрусову А. И.;

-заслуженному изобретателю Российской Федерации профессору, д. т. н. Попову В. В.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Сребняк, Екатерина Анатольевна, Москва

1. Аушева X. А., 2007. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок: Автореферат дис. . канд. техн. наук: 03.00.23. Москва: Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева.

2. Бакаева М. Д., 2004. Комплексы микромицетов нефтезагрязнённых и рекультивируемых почв: Автореферат дис. . канд. биол. наук. Уфа: Президиум АН РБ. 22 с.

3. Берджи, 1997а, 1997. Определитель бактерий. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир. 368 с.

4. Берджи, 1997b, 1997. Определитель бактерий. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир. 432 с.

5. Бирштехер Э., 1957. Нефтяная микробиология. Введение в микробиологию нефтяной промышленности. Ленинград, «Гостоптехиздат». 266 с.

6. Ботвинко И. В., 1984. Экзополисахариды сапротрофных микобактерий и условия их биосинтеза: Диссертация . кандидата биологических наук: 03.00.07. Москва. 146 е.: ил.

7. Ботвинко И. В., 1985. Экзополисахариды бактерий // Успехи микробиол. Т. 20. С. 79-122.

8. Ботвинко И. В., Гречушкина Н. Н., Егоров Н. С., 1978. Биосинтез экзогликанов сапротрофными Mycobacteria. М.: Вестник Моск. Универс., Сер. Биология, №2, с. 39-43.

9. Винокуров В. А., Мерициди И. А., Ботвинко И. В. и др., 2007. Управление нефтяными разливами в водах со льдом.

10. Аналитический обзор / Отчёт по НИР. Per. 0120.0 805558. М.: РГУ нефти и газа имени И. М. Губкина. 142 с.

11. Гусев М. В., Сенцова О. Ю., Коронелли Т. В. и др., 1977. Функционирование микроорганизмов в водных экосистемах. I. Микробиологическое разрушение нефтепродуктов в Северном Ледовитом океане // Научн. докл. высш. шк. Биол. науки. №8. С. 110-119.

12. Давыдов А. И., Козлова В. Н., 1982. Нефтепродукты, нефть, детергенты. Загрязнение водоёмов и токсическое воздействие на гидробионтов: Учебное пособие. Ярославль. 59 с.

13. Данилова И. В., Ботвинко И. В., Егоров Н. С., 1993. Реологические свойства и функции экзополисахаридов Azotobacter beijerinckii и Mycobacterium lacticolum. М.: Микробиология. Т. 62, № 4, с. 415-419.

14. Добровольская Т. Г., Скворцова И. Н., Лысак Л. В. Методы определения и идентификации почвенных бактерий. 1990. М.: МГУ. 72 с.

15. Другов Ю. С., Зенкевич И. Г., Родин А. А., 2005. Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды, почвы и биосред: Практ. рук-во. М.: БИНОМ. Лаб. знаний. 752 с.

16. Заварзин Г. А., Колотилова Н. Н., 2001. Введение в природоведческую микробиологию. М.: Издательский дом «Университет». 255 с.

17. Заикин В. Г., Микая А. И., 1987. Химические методы в масс-спектрометрии органических соединений. М.: Наука, 200 с.

18. Ильинский В. В., 1979. Экран для стерильного отбора проб из поверхностного микрослоя воды // Вестник МГУ. Сер. биол., почвоведение. № 3. С. 64-66.

19. Ильинский В. В., 1981. Силикагелевые среды для выделения и учета углеводородокисляющих бактерий // Вестник МГУ. Сер. биол., почвовед. № 2. С. 53-55.

20. Ильинский В. В., 1995. Бактериопланктон поверхностных вод Центральной Арктики в период календарной весны // Микробиология. Т. 64. № 5. С. 696-704

21. Ильинский В. В., 2000. Гетеротрофный бактериопланктон: экология и роль в процессах естественного очищения среды от нефтяных загрязнений: автореферат дис. . доктора биологических наук: 03.00.18. Москва: / МГУ имени М.В. Ломоносова. 53 с.

22. Калюжин В. А., Васильцов Д. В., 2003. Влияние минеральных добавок на скорость деструкции нефти специализированным биопрепаратом «Ре1то1ап» // Науч. сессия ТУСУР 2003. Материалы регионал. науч.—техн. конф., Томск, 13-15 мая. С. 200-202.

23. Клышко Д. Н., Фадеев В. В., 1978. Дистанционное определение концентрации примеси методом лазерной спектроскопии по комбинационному рассеянию // ДАН СССР. Т. 238. С. 320-323.

24. Коронелли Т. В., 1996. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 32. №6. С. 579585.

25. Коронелли Т. В., Голимбет В. Е., Ушакова Н. А. и др., 1978. Водные нефтеокисляющие артробактерии. // Микробиология, 47, с. 501-504.

26. Коронелли Т. В., Дермичева С. Г., Ильинский В. В. и др., 1994. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. Т. 63. Вып. 5. С. 917-923.

27. Коронелли Т. В., Дермичева С. Г., Семененко М. Н., 1988. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 24. № 2. С. 203-206.

28. Коронелли Т. В., Ильинский В. В., Янушка В. А. и др., 1987. Углеводородокисляющая микрофлора акваторий Балтийского моря и Куршского залива, пострадавших при разливе мазута // Микробиология. Т. 56. Вып. 3. С. 472-478.

29. Коронелли Т. В., Ильинский В. В., 1984. Об учёте численности углеводородокисляющих бактерий в морской воде методом предельных разведений // Вестник Московского университета. Сер. 16. Биология. №3. С. 58-62.

30. Коронелли Т. В., Комарова Т.Н., Юферова С. Г. и др., 1993. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий // Микробиология. Т. 62. Вып. 2. С. 231-237.

31. Коронелли Т. В., Стоева С., Ушакова H.A. и др., 1977. Липидный состав углеводородокисляющей микобактерии, выделенной из вод Арктики. // Микробиология, 46, №6, с. 1070— 1073.

32. Коронелли Т. В., Юферова С. Г., 1990. Поверхностно-активные свойства некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий //Вестник МГУ. Сер. 16. №1, с. 14-18.

33. Кочеткова Н. К., 1967. Методы химии углеводов. М.: Мир. 512 с.

34. Красильников Н. А., Коронелли Т. В., Калюжная Т. В., 1972. Окрашенные парафинокисляющие микобактерии // Микробиология. Т. 41. №3. С. 513-516.

35. Крисс А. Е., 1976. Микробиологическая океанография. М.: Наука. 269 с.

36. Куликова И. Ю., Дзержинская И. С., 2008. Микробиологические способы ликвидации последствий аварийных разливов нефти в море // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, №5. С. 24-27.

37. Кураков А. В., Ильинский В. В., Котелевцев С. В. и др., 2006. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. М.: Изд-во Графикон. 336 с.

38. Лебедев А. Т., 2003. Масс-спектрометрия в органической^химии / А.Т. Лебедев. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 493 е., ил.

39. Левченко А. Б., Румянцев В. А., 2005. Перспективы применения биосорбентов для борьбы с нефтяными загрязнениями в северных широтах // Материалы Международной конференции Эколог, и охрана природной среды севера. Архангельск. С.47-56.

40. Маторин Д. Н., Венедиктов П. С., 1990. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // Итоги науки и техники. Биофизика. Т.40. М.: ВИНИТИ.

41. Межерис Р., 1987. Лазерное дистанционное зондирование. М.: Мир.

42. Методика определения токсичности высокоминерализованных поверхностных и сточных вод, почв и отходов по выживаемости солоноватоводных рачков Artemia salina, 2006. L.: ФР 1.39.2006.02505. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 26 с.

43. Милько Е. С., Егоров Н. С., 1994. Гидрофильно-гидрофобные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubropertinetus II Микробиология. Т. 63. Вып. 2. С. 382-384.

44. Миронов О. Г., 1971. Нефтеокисляющие организмы в море. -Киев: Наукова думка.

45. Миронов О. Г., 1972. Биологические ресурсы моря и нефтяное загрязнение. М.: Пищевая промышленность.

46. Миронов О. Г., 1976. Загрязнение нефтью. // Итоги науки и техники. Серия: Общая биология. Биоценология. Гидробиология. Т. 3. М.: ВИНИТИ.

47. Михайлов В. В., Кузнецова Т. А., Еляков Г. Б., 1999. Морские микроорганизмы и их вторичные биологически активные метаболиты. Владивосток: Дальнаука. 132 с.

48. Михайлов В. И., 1978. О концентрации некоторых антропогенных веществ в поверхностном микрослое (Северная Атлантика). М.: Океанолог. Т. 18, №5, с. 841-845.

49. Мурзаков Б. Г., 2005. Экологическая биотехнология для нефтегазового комплекса (теория и практика). М.: Изд-во МГУ. 198 с.

50. Нельсон-Смит А., 1977. Нефть и экология моря. М.: «Прогресс». 304 с.

51. Нунупаров С. М., 1985. Предотвращение загрязнения моря с судов. Учеб. пособие для вузов. М.: Транспорт. 288 с.

52. Олескин А. В., Ботвинко И. В., Цавкелова Е. А., 2000. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов //Микробиология. Т. 69. №3. С. 309-327.

53. Патент РФ на изобретение №2033975. Способ получения бактериального препарата ждя очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами. / Г. А. Кожанова. №4946060/13; Заявлено 28.06.1991; Опубл. 30.04.1995, Бюл. №18.

54. Патент РФ на изобретение №2313498. Микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений. / Ф. М. Хабибуллина, В. А. Терехова, И. Б. Арчегова и др. -№2005125503/13; Заявлено 10.08.2005; Опубл. 27.12.2007, Бюл. №18.

55. Петров С. И., 2001. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды: метод, указания / РГУ нефти и газа имени И. М. Губкина; Каф. промышленной экологии. М. 46 е.: ил.

56. Петухов В. Н., Фомченков В. М., Чугунов В. А. и др., 2000. Биотестирование почвы и воды, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикладная биохимия и микробиология. Т.36. №6. С. 652-655.

57. ПНД Ф 16.1.38-2002 Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почвы методом капиллярной газо-жидкостной хроматографии.

58. Практикум по микробиологии, 2005. Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. И. Нетрусов, М. А. Егорова, JT. М. Захарчук и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия». 608 с.

59. Практическое руководство по ликвидации разливов нефти, 2005. ExxonMobil Research and Engineering Company, USA. 362 c.

60. Руководство по ликвидации разливов нефти на морях, озёрах и реках, 2002. Серия «Судовладельцам и капитанам». Вып. 22. СПб.: ЗАО «ЦНИИМФ». 344 с.

61. Самуилов В. Д., Олескин A.B., 1994. Технологическая биоэнергетика. М.: Издательство МГУ. С. 129-131.

62. Сафронова И. Ю., Ботвинко И. В., 1998. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции // Микробиология. Т. 67. №1. С. 50-60.

63. Семёнова Е. В., Гречушкина H.H., 1986. Внеклеточные полисахариды микроорганизмов, условия их биосинтеза и физиологическая роль. В кн.: Экологическая роль микробных метаболитов. М.: Изд-во МГУ. С. 121-130.

64. Современная микробиология, 2005. Прокариоты: В 2-х томах. Т.1. Пер. с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир. 656 с.

65. Терехова В. А., 2007. Микромицеты в экологической оценке водных и наземных экосистем / В. А. Терехова; Ин-т проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН, Ин-т экологического почвоведения МГУ. М.: Наука. 215 с.

66. Терехова В. А., Семёнова Т. А., 2005. Структура сообществ микромицетов и их синэкологические взаимодействия с базидиальными грибами в ходе разложения растительных остатков //Микробиология. Т. 74, №1. С. 91-97.

67. Техника и технологии локализации и ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов, 2008. Справочник / И. А. Мерициди, В. Н. Ивановский, А. Н. Прохоров и др.; Под ред. И. А. Мерициди. СПб.: НПО «Профессионал». С. 446-472.

68. Феклистов В. Н., Михайлова JI. В., 2000. Экологические аспекты применения пенных сорбентов для очистки акваторий от нефтяного загрязнения. Вод. ресурсы. 27, №5. С. 623-628.

69. Фомченков В. М., Ирхина И. А., Новиков И. А. и др., 2000. Исследование интегральной токсичности водной среды, загрязнённой нефтью и нефтепродуктами, с использованием бактериальных тестов // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 36. №6. С. 656-660.

70. Хмельницкий Р. А., Бродский Е. С., 1990. Масс-спектрометрия загрязнений окружающей среды. -М.: Химия. 182 с.

71. Хомякова Д. В., 2003. Состав углеводородокисляющих микроорганизмов нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми: Диссертация . кандидата биологических наук: 03.00.07. Москва. 114 с.

72. Хомякова Д. В., Ботвинко И. В., Нетрусов А. И., 2002. Углеводородокисляющая микробиота нефтезагрязнённых почврайона Крайнего Севера // Биоразнообразие восстанавливаемых территорий / Под ред. Капелькиной JI. П. СПб.: Наука. 15 с.

73. Цыбань А. В., 1970. Бактериопланктон и бактерионейстон шельфовой области Чёрного моря. Киев.

74. Яшнов В. А., 1969. Практикум по гидробиологии. М. С. 103.

75. A guide to contingency planning for oil spills on water, 2000. International Petroleum Industry Environmental Conservation Association (IPIECA), United Kingdom, 32 p.

76. Aaronson S., 1970. Experimental microbial ecology. Academic Press, New York. 236 pp.

77. Akagi Y., 1980. Growth responses of oligotrophic and heterotrophic marine bacteria in various substrate concentration, and taxonomic studies on them. Canad. J, Microbiol., 26, №7, 800-806.

78. Bodour A., Drees K. P., and Maier R. M., 2003. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid southwestern soils. Appl. Environ. Microbiol., v. 69, № 6, pp. 3280-3287.

79. Colwell R. R., and Walker J. D., 1977. Ecological aspects of microbial degradation of petroleum in the marine environment. Crit. Rev. Microbiol. 5:423-445.

80. Colwell R. R., Mills A. L., Walker J. D., et al., 1978. Microbial ecology of the Metula spill in the Straits of Magellan. J. Fish. Res. Board Can. 35:537-580. D.C.

81. Crapp G. В., 1970. The biological effects of marine oil pollution and shore cleansing, Annu. Rep. Oil Pollut. Res. Unit, p. 27-42.

82. Dispersants and their role in oil spill response, 2001. International Petroleum Industry Environmental Conservation Association (IPIECA), United Kingdom, 38 pp.

83. Dorobantu L. S., Yeung A. K. C., Foght J. M., et al., 2004. Stabilization of oil-water emulsions by hydrophobic bacteria. Appl. Environ. Microbiol., p. 6333-6336.

84. Fuchs G., 1999. Oxidation of organic compounds. In: Biology of the Prokaryotes (Ed. by J. W. Lengelar, G. Drews, H. G. Schlegel), Stuttgart: Georg Verlag, pp. 187-233.

85. Garret A. D., 1965. Collection of slick-forming materials from the surface. Limnol. Oceanogr., v. 10, № 4, 602-605.

86. Guenette C. C., Sergy G. A., Owens E. H., et al., 2003. Experimental design of the Svalbard shoreline field trials. Spill Science & Technology Bulletin, v. 8, №. 3, pp. 245-256.

87. Harayama S., Kasai Y., and Hara A., 2004. Microbial communities in oil-contaminated seawater. Current Opinion Biotechnol., v. 15, pp. 205-214.

88. Harvey C. W., and Burzell L. A., 1973. Simple microlayers method for small samplers. Limnol. Oceanogr., v. 17, №2, pp. 156-157.

89. Hatcher R. F., and Parker B. C., 1974. Microbiological and chemical enrichment of freshwater microlayers relative to the bulk-subsurface water. Canad. J. Microbiol, v. 20, №7, pp. 1051-1057.

90. Hewald S., Josephs K., and Bolker M., 2005. Genetic analysis of biosurfactant production in Ustilago maydis, Appl. Environ. Microbiol., v. 71, № 6, pp. 3033-3040.

91. Hommel R. K., 1990. Formation and physiological role of biosurfactants produced by hydrocarbon-utilizing microorganisms, J. Biodegrad., Publisher Springer Netherlands, pp. 305-307.102. http://biochemistry.vov.ru103. http://slovari.yandex.ru/dict/bse

92. Kaltenbock E., and Herndl G. J., 1992. Ecology of amorphous aggregations (marine snow) in the northern Adriatic Sea. 4. Dissolved nutrients and the autotrophic community associated with marine snow. Mar. Ecol. Prog. Ser., v. 87, pp. 147-159.

93. ICaranth N. G. K., Deo P. G., and Veena Nadig N. K., 1999. Microbial production of biosurfactants and their importance. Curr. Sci. 77(1): 116-126.

94. Leahy J. G., and Colwell R. R., 1990. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment Microbiological reviews, American Society for Microbiology, p. 305-315.

95. Lee K., and Levy E. M., 1992. Microbial degradation of petroleum in an intertidal beach environment in situ sediment enclosure studies. In Marine ecosystem enclosed experiments. Proceedings of a Symposium, p. 140-155.

96. Maki H., Hirayama N., Hiwatari T., et al, 2003. Crude oil bioremediation field experiment in the Sea of Japan. Marine Pollut. Bull, v. 47, pp. 74-77.

97. Margesin R., and Schinner F., 1999. Biodégradation of organic pollutants at low temperatures. In: Biotechnological applications of cold-adapted organisms, Springer—Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 271-275.

98. Margesin R., and Schinner F., 2001. Biodégradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments. MiniReview. Appl. Microb. Biotechn., v. 56, pp. 650-663.

99. Mills M. A., 1978. Enumeration of petroleum degrading marine and estuarine microorganisms by the most probable number method. Canad. J, Microbiol., 24, №5, 552.

100. Mills M. A., Bonner J. S., McDonald T. J., et al., 2003. Intrinsic bioremediation of a petroleum-impacted wetland. Marine Pollut. Bull., v. 46, pp. 887-899.

101. Nemirovskaya I., and Novigatsky A., 2005. Organic compounds and suspended matter in the marine ice of the eastern Antarctic. Proc. 28th Arctic and Marine Oilspill Program (AMOP) Technical Seminar, June 7-9, Calgary (Alberta), Canada, pp. 1021-1029.

102. Pelletiera E., Delilleb D., and Delille B., 2004. Crude oil bioremediation in sub-Antarctic intertidal sediments: chemistry and toxicity of oiled residues. Marine Environ. Research, v. 57, pp. 311327.

103. Report on shipping accidents in the Baltic Sea area for the year, 2006. Baltic marine environment protection commission (HELCOM). 27 p. http://www.helcom.fi.

104. Ron E. Z., and Rosenberg E., 2001. Natural roles of biosurfactants. Minireview. Environ. Microbiol., v. 3(4), pp. 229-236.

105. Santa Anna L., Sebastian G., Menezes E., et al., 2002. Production of Biosurfactants from Pseudomonas aeruginosa PA1 Isolated in Oil Environments. Braz. J. Chem. Eng., v.19, №.2, pp. 301-307.

106. Shabtai Y., and Gutnick D. L., 1985. Tolerance of Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 to the Cationic Surfactant Cetyltrimethylammonium Bromide: Role of the Bioemulsifier Emulsan. Appl. Environ. Microbiol., p. 192-197.

107. Sieburth J., 1965. Bacteriological samplers for air-water and-water-sediment interfaces. In: Ocean science and ocean engineering. Proc. of Trans. MTS. ASLO Conf. Washington, v. 2, pp. 1064-1068.

108. Suni S., Kosunen A.-L., Hautala M., et al., 2004. Use of a byproduct of peat excavation, cotton grass fibre, as a sorbent for oil-spills. Marine Pollut. Bull., v. 49, pp. 916-921.

109. Swannell R. P. J., 1993. Bioremediation of petroleum hydrocarbons in aquatic environments. Microb. Cleanup 1:2—4.

110. Swannell R. P. J., Lee K., and McDonagh, 1996. Field evaluations of marine oil spill bioremediation. Microbiological Reviews, June, p. 342-365.

111. Tabak H. H., Haines J. R., Venosa A. D., et al., 1991. Enhancement of biodégradation of Alaskan weathered crude oil components by indigenous microbiota with the use of fertilizers and nutrients, p. 583-590.

112. Takeru I., Akio T., Yasuyoshi S., et al., 2003. Wax ester production by bacteria. Current Opinion in Microbiol., v. 6, pp. 244-250.

113. Terekhova V. A., 2005. Biotesting as the method of determination of dangerous waste class. Moscow, 12 p.

114. Thaniyavarn J., Roongsavang N., Kaneyama T., et al., 2003. Production and Characterization of Bio surfactants from Bacillus licheniformis F2.2. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 67(6), pp. 12391244.

115. The encyclopedia of oceanography, 1966. Edited by Rhodes W.F. Reinhold Publishing Corporation, New York, 632 p.

116. Varo I., Serrano R., Navarro J. C., et al., 1998. Acute lethal .toxicity of the organophosphorous pesticide chlorpyrifos to different species and strains of Artemia. Bull. Environ. Contam. and Toxicol, 61, 6, p. 778-785.

117. Venosa A. D., and Zhu X., 2003. Biodégradation of crude oil contaminating marine shorelines and freshwater wetlands. Spill Science & Techn. Bull., v. 8, № 2, pp. 163-178.

118. Walker J. D., and Colwell R. R., 1976. Enumeration of petroleum-degrading microorganisms. Appl. And Envir. Microbiol., v. 31, №2, pp. 198-207.

119. ZoBell C. E., 1946a. Action of microorganisms on hydrocarbons. Bacteriol. Rev., v. 10, pp. 1-49.

120. ZoBell C. E., 1946b. Marine microbiology. A monograph on hydrobacteriology. Waltham, Mass: Chronica Botanica Company.