Разработка технологии бактериального биопрепарата экологического назначения

Капотина, Лидия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии бактериального биопрепарата экологического назначения
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии бактериального биопрепарата экологического назначения"

На правах рукописи

Капотинз Лидия Николаевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ (в настоящее время ГУП "ГосНИИсинтезбелок")

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор О.В. Кислухина кандидат биологических наук Г.Н. Морщакова

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор В.А. Галынкин кандидат технических наук Р.Л. Филиппова

Ведущая организация : Институт биотехнологии.

:» тЛ в ¡0

исшного совета К.063.51.04. Моек

Защита состоится на заседании диссертацисЙшого совета К.063.51.04. Московского Государственного Университета пищевых производств по адресу : 125080 , Москва, Волоколамское ш., 11.

Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, по выше указанному адресу.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП.

Автореферат разослан/^ 199/^

Учёный секретарь диссертационного совета,

доц., к.т.н. О.И. Тихомирова

Общая характеристика работы.

Актуальность темы.

Проблема борьбы с загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами приобретает все более важное значение во всем мире.

Одним из наиболее современных, перспективных, экологически чистых путей является использование для этой цели микроорганизмов.

Создание и практическое применение иммобилизованных культур, специальных биоценозов микроорганизмов — деструкторов определенных классов органических загрязнений — главные направления, по которым идет развитие научных и практических разработок.

Нами проведена работа по изучению бактерий рода АЫпе1оЬас1ег, развивающихся на углеводородах широкого спектра от Св до С3э , с целью получения биопрепаратов для ликвидации нефтяных загрязнений.

Способность данных микроорганизмов утилизировать различные виды органических загрязнений в экстремальных условиях свидетельствует об актуальности выбранного направления исследований.

Цель работы — разработка технологии бактериальных препаратов экологического назначения на основе углеводородокисляющих бактерий. 8 задачи исследований входило:

— изучение физиолого-биохимических, технологических, генетических свойств бактерий, активно усваивающих Н-алканы широкого спектра, сырую нефть, дизельное топливо, ароматические соединения, маслд различного происхождения;

— отбор штаммов с наибольшей скоростью накопления биомассы и глубиной окисления нефтепродуктов;

— изучение влияния условий культивирования на накопление биомассы при периодическом выращивании;

— установление закономерностей роста углеводородокисляющих штаммов бактерий в условиях непрерывного культивирования;

'Увтор приносит глубокую благодарность д.б.н. Б.Г.Мурзакову за интерес и внимание < работе, помощь в организации исследований.

— проведение эколого-биологических исследований;

— разработка технологического регламента, ТУ на промышленный выпус биопрепарата;

— разработка технологии применения биопрепарата в лабораторных и полевь условиях.

Научная новизна. Исследована способность к усвоению Н-алканов, сырой нефт! дизельного топлива, мазута, различных масел в качестве единственного источни* углерода у 95 коллекционных и вновь выделенных из почв загряэненнь нефтепродуктами, микроорганизмов.

Из их числа отобраны наиболее активные штаммы бактерий, утилизирующ! широкий спектр углеводородного сырья при различных температурах и рН среды. Изучены морфологические, физиолого-биохимические, таксономические генетические свойства отобранных микроорганизмов и проведена i идентификация. Отобранные штаммы отнесены к роду Arthrobacter globiform Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium parafortuitum, Acinetobacter oleovorum выделен, и описан новый вид рода Acinetobacter — valentis. Установлено, что штаммы Acinetubactei oieuvoium Н - 1 и Acinetobacter valentis G -обладают наиболее важными промышпенно-ценными свойствами (скорость рос спектр утилизации УГВ, диапазон условий культивирования, состав биомассы). Изучена динамика в микробной сукцессии внесенных штаммовых популяций / oleovorum Н - 1 и Ac. valentis G -1 в почвах, загрязненных нефтепродуктами. Практическая значимость- Разработана технология культивирования бактер рода Acinetobacter в периодических и непрерывных условиях.

— Наработана опытная партия биопрепарата "Валентно" и проведены меди биологические и экологические испытания биопрепарата в лабораторных и попев условиях.

— Предложена схема микробиологического контроля, позволяющая учитыв; более 90% клеток микроорганизмов.

— Разработан технологический регламент и ТУ на биопрепарат "Валентис".

— Разработана инструкция по применению биопрепарата "Валентис" для очис почв, емкостей и сточных вод от нефтепродуктов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференции "П эффективного использования достижений биотехнологии в агропромышлен! комплексе" ( г. Черновцы, 1991г. ); на Всесоюзном симпозиуме "Микробиолс

охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия (г. Оренбург, октябрь 1991г. ); конференции "Методы технической документации паспортизации и переработки отходов" (г. Пенза, 1994г. ); Международной конференции Техника и технология экологически чистых химических производств" ( г. Москва, май 1998г. ); Московской региональной конференции "Инженерная экология" ( г. Москва, апрель 1998г.).

Публикации : результаты исследований отражены в опубликованных 12 печатных работах. Получено 3 патента РФ на способ очистки почвы, емкостей от нефтяных загрязнений,одно положительное решение на выдачу патента РФ. Структура и объем диссертации : диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на <54 страницах, включает таблиц и <0 рисунков. Список литературы включает 227 источников.

1. Обзор литературы.

В литературном обзоре представлена характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов. Показаны перспективы применения микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, емкостей, сточных вод от нефтяных загрязнений.

2. Экспериментальная часть.

Исследования проводились в институте ГосНИИсинтезбелок:

2.1. Материалы и методы исследований.

В работе использованы штаммы бактерий родов Arthrobacter, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, выделенные из почв, пропитанных нефтепродуктами, а также полученные из коллекций музея ГосНИИсинтезбелок и биологического факультета МГУ им. Ломоносова. Отбор питательных потребностей бактерий, усваивающих Н-алканы от С8 до Сэз, осуществлялся на минеральных средах.

Исследования проводили в лабораторных, камеральных и опытных условиях с использованием комплекса микробиологических, химико-аналитических, биохимических методов, принятых в микробиологической промышленности. Идентификацию бактерий проводили совместно с сотрудниками РАН института микробиологии А.М Лысенко на основе опубликованных работ: Шендеров, Серкова, 1979г., Шендеров, Зубков, 1979г.; Лысенко с соавт. 1983, 1986гг.; Морщакова с соавт. 1994г.; Bergeys Manual, 1984, 1989.; Gilardi et a!., 1978; Baumann et. at., 1968.; Stenzel et. al„ 1963 г.; Nishimura et. al., 1979, 1987: Pinter a. Bende. 1967, 1968.; Foster, 1962.; Lukins, 1963 ; Johnson et. al., 1970.; Kariyama et. at., 1979.; Boiiwet a. Grlmont, 1986.; Jantzen et. al , 1975.

Содержание гуанина и цитозина ( Г/Ц ) в ДНК определяли по температуре плавления ДНК ( Мендель и Мармур, 1970г. ).

Микробиологический состав образцов до и после очистки от нефтепродуктов проводили согласно ГОСТ 26213-84.

Определение коэффициента олиготрофности рассчитывали по формуле : (Аристовская, 1965г. )

К0.,„ = кол-во м/ов на МПА ( 1 : 10 ) ; кол-во м/ов на МПА

Определение коэффициента минерализации рассчитывали по формуле : (Мишустин. 1975г.) К„.,м = кол-во м/ов на КАА ;

кол-во м/ов на МПА

Экспериментальные данные обрабатывались общепринятыми методами математической статистики.

2.2. Результаты исследований и их анализ.

Исследована способность выделенных штаммов бактерий к активному накоплению биомассы на Н-алканах.

Способность потреблять Н-апканы как углеродный субстрат оказалась различной у отдельных представителей микроорганизмов. Из 95 исследованных культур было отобрано 7 штаммов, активно развивающихся на Н-алканах ( табл. 1).

Таблица 1

Накопление биомассы при выращивании отобранных микроорганизмов на минеральной среде с Н-алканами

Штаммы микроорганизмов Температура выращивания Биомасса, Г АСВ/Л

Бактерии

1. Н-1 40-44 6,8

2. 0-1 40-42 7,0

3. С -2 40-42 6,2

4. А-1 30-37 5,0

5. И - 1 20-30 4,8

6. М - 1 34 - 37 4,5

Дрожжи

7 К - 1 38-40 5,6

Другие культуры по причине недостаточного накопления биомассы на Н-алканах были исключены из дальнейших исследований.

Наибольший интерес представляли термотолерантные штаммы бактерий Н -1 и О -1 имеющие высокую скорость роста в широком диапазоне рН среды. С этими культурами проводили дальнейшие исследования.

Идентификация бактериальных культур : особенности роста бактерий на минеральных средах с Н-алканами.

Клетки выделенных культур Н - 1 и в - 1 представляют собой кокки, диплококки, и коккобациллы размером 0,7 х 0,7; 0,8 х 0,8; 0,8 х 1,2 Мкм.

Физиологические свойства : строгие аэробы, оксидаза отсутствует, клетки не способны катаболизировать глюкозу и лактозу, устойчивы к ряду антибиотиков, негемолитические, непатогенные, окисляют широкий спектр углеводородного сырья ( нефть, мазут, дизельное топливо, парафины различного фракционного состава, этиловый спирт, ароматические соединения и масла различного происхождения ). На основании ряда полученных признаков выделенные штаммы бактерий отнесены к роду Астек>Ьас1ег. Содержание Г + Ц в ДНК бактерий находится в пределах 39,3 — 40,6%. (табл. 2).

Данные по ДНК-ДНК гибридизации, проведенные с реперными штаммами Ас. са1соасеНсиз 6915 ССМ и Ас. о!еоуогипт ВСБ-568, указывают на следующее:

штамм Н - 1 близок по Г + Ц к реперному штамму Ас. о!еоуогит ВСБ-568, процент гомологии между ними составил 91%, а штамм в - 1 имел всего 50% гомологии со штаммом Ас. о!ео7. ВСБ-568 и 35% со штаммом Н -1.

По отношению к реперному штамму Ас. са1соасейсиэ 6915 ССМ процент гомологии составил со штаммам Н - 1 — 47%, а со штаммом в - 1 — 42%. Полученные данные по гомологии свидетельствуют о генетической неоднородности рода Ас1пе(оЬас(ег, что дало нам возможность предположить о существовании нового вида, названного "Уа1епйз". ( табл. 2 ).

Таблица 2

ДНК-ДНК гибридизация штаммов Н -1 и О -1 со штаммами Ас. са1соасеМсш 6915 ССМ и Ас. о!еоуогит ВСБ-568

Штаммы Ас. спК '3915 ССМ ГЦ, моль % Гомология, % к репернои ДНК

Ас. о1еоу. ВСБ-568 Ас. са! 6915ССМ в - 1

40,5 39,0 100 —

Ас. о!еоу. ВСБ-568 40,2 100 — —

С - 1 39,3 50,0 42,0 100

Н - 1 ) 40,6 ...! . ...... 91,0 47,0 35,0

Анализ сложных пипидов, экстрагированных из бактерий с помощью хроматографии и масс-спектромегрии, позволяет с высокой точностью проводить родовую и видовую дифференциацию микроорганизмов (Коронелли, 1985г.). Нами показана возможность использования жирношслотного состава клеток для таксономического анализа при проведении родовой и видовой дифференциации штаммов Н - 1 и в - 1. При рассеве на индикаторную среду штаммы Н - 1 и в - 1 образуют характерную окраску колоний в отличие от сопутствующей микрофлоры, что особенно важно для микробиологического контроля.

Технологические и физиологические параметры выращивания штаммов Ас. о^оуогшп Н -1 и Ас. уа1епи$ 0-1.

Изучено влияние физико-химических факторов на рост штаммов Н -1 и в -1. Оптимальная температура выращивания 42°, скорость роста изменяется незначительно в пределах температуры 40 - 44°. Максимальная удельная скорость роста у штаммов Н - 1 и в • 1 наблюдалась при рН = 6,8 - 7,0 и составила 0,703 и 0,66 ч-' соответственно.

Выявлена способность штаммов Н-1 и в-1 расти на средах с широким интервалом рН среды от 6,0 до 8,5. Наиболее активный рост исследуемых штаммов бактерий наблюдался в интервале значений среды 6,0 • 7,5. При снижении рН до 5,0 - 5,5 или повышении рН до 8,5 выявлена тенденция к уменьшению накопления биомассы бактерий и увеличению расходного коэффициента по парафину (табл. 3).

Таблица 3

Потребление парафина и экономический коэффициент после воздействия экстремальных значений рН среды, при 1=42°

Микроорганизмы Биомасса, Исходный Остаточ- Потреб- Расходный

Г/АСВл парафин ные ленный коэффициент,

Эо , г/л УГВ, парафин, кт/ кг

г/л г/л

Н - 1 при рН =7,0 7,2 7,6 0,8 6,8 1,05

в - 1 при рН = 7,0 7,0 7,6 0,9 6,7 1,08

Н - 1 прирН = 5,0-5,5 1,25 7,6 5,5 2,1 6,08

в -1 при рН=5,0 - 5,5 1,27 7,6 5,3 2,3 5,98

Н-1 при рН= 8,0 - 8,5 4,25 7,6 1,5 6,1 1,78

в-1 при рН= 8,0 -8,5 4,73 7,6 2,0 5,6 1,61

Влияние аэрации на развитие штаммов Н -1 и в -1 изучали в аппарате "Биостат". Отклонение от оптимального значения аэрации ( 1,5 - 1, 8 л / л. мин. ) сопровождается снижением выхода биомассы и увеличением содержания углеводородов, а также пенообразованием (при аэрации 5 л / л. мин.) ( табл. 4 ).

Влияние степени аэрации на концентрацию биомассы а непрерывных условиях культивирования при скорости протока 0,28 ч-\ температуре 42° и концентрации парафина 2% об.

Показатели Степень аэрации, л 1 л. мин.

Ас. о!еоуогит Н-1 Ас. уа1епМз О -1

0,9 1,5 1,8 2,0 2,5 5,0 0,9 1,5 1,8 2,0 2,5 5,0

Концентрация биомассы, гАСВ/л 7,4 13,0 15,0 12,0 8,0 4,0 6,0 13,8 15,8 12,8 7,8 1,75

Остаточные УГВ г/л 1,5 0,4 0,3 0,5 1.2 1,6 1.6 0,2 0,1 0,2 1,1 2,5

С целью подбора оптимальной питательной среды для роста бактерий Н-1 и в -1 было проверено несколько известных сред, характеризующихся различным соотношением азота и фосфора (талб. 5). Оптимальной минеральной средой оказалась среда № 10 М , разработанная нами для бактерий рода Ас1пе!оЬас1ег. В качестве источника азота было отдано предпочтение сульфату аммония - 3 г/л, в качестве источника фосфора рекомендуется дигидрофосфат калия в концентрации 6,5 г/л.

Таблица 5

Влияние концентрации азота на активность роста штаммов бактерий Н -1 и О -1

Концентрация азота мг/ГАСВ 30 Концентрация (ЫН4)2 Э04 , г/л 3,0 Остаточный азот,мг/л Биомасса, ед. ОП

шт. Н-1 ......100 - 130 шт. О -1 шт. Н -1 шт. в - 1

150 - 200 10,0 9,5

90 3,4 150 -200 200 - 220 8,5 8,5

100 3,7 380 -490 400 -500 7.0 7,2

110 4,04 1000 - 1200 900 - 1000 6,5 6,6

Изучены свойства штаммов Н - 1 и в - 1 на способность утилизировать различные виды углеводородного сырья ( табл. 6, рис. 1,2).

Выращивание штаммов Ас. о1еоуогит Н -1 и Ас. уа1епН« 0-1 на различных видах углеводородного сырья в периодических условиях при температуре 42°.

Штаммы Биомасса, ед. ОП

Нефть Мазут- Диз. Отра- Парафин Растите- Сливоч- Марга-

2% 100 топливо ботан. Киришского льное ное рин

0,5% 10% масло, НПЗ масло, масло, 0,5 г

0,5% 1% 0,5% 0,5 г

Ас.о!еоу.

Н - 1 8,9 4,5 16,0 5,2 10,0 4,6 3,4 4,0

Ас. уа1.

в -1 10,0 4,Г 18,2 5,1 9,5 5,0 4,0 4,4

я. I -

¿у1 ¡у : ,•)í .........

Рис.1 Утилизация Н-апканоз в сырой нефти ( 1 ), мазута-100 ( 2 ) и Ново-Куйбышевского парафина ( 3 ) штаммом Н-1 в динамике, при МО - 42а на среде № 10 М

\Ч «

г^-Ч-Ч. л

Ц&с

- . -72-

Рис.2 Утилизация Н апканов в сырой нефти ( 1 ), мазута-100 ( 2 ) и Ново-Куйбышевского парафина ( 3 ) штаммом в-1 в динамике, при МО - 42° на среде № 10 М

Утилизация широкого спектра углеводородов углеводородокисляющими штаммами Н-1 и в-1 - важное свойство при биологической очистки объектов окружающей среды.

В непрерывных условиях рассмотрено влияние скорости разбавления, аэрации, рН среды, температуры выращивания. Установлено, что при изменении скорости разбавления среды от 0,25 до 0,33 ч-' штаммы Н - 1 и С -1 активно утилизируют Н-алканы. Концентрация биомассы в среднем для двух штаммов составила 15,0 - 18,5 г АСВ/л, производительность — от 4.3 ад 6,1 кг/м\час ( табл. 7 ).

Таблица 7

Основные технологические показатели выращивания термотолерантных штаммов бактерий Ас. о1еоуотит Н • 1 и Ас. уа1епЫх О -1 в опытных условиях

№ 1 Показатели о Ея. 1 изм. "з Штамм Ас. о1еоуогит Н-1 Штамм Ас. уа1еп115 в-1

4 5 6 7 8 9

_ 1. Скорость протока среды 1 час- 0,25 0,29 0,33 0,25 0,29 0,33

2. Время выращивания час 4,0 3,5 3,0 4,0 3,5 3,0

3. Концентрация сырья % вес 2,28 1,31 1,9 2,28 1,31 1.9

4 Концентрация биомассы г АСВ/л 17,1 15,0 17,6 17,2 16,8 18,5

5. Выход от заданного сырья "/„ 75,0 114,5 92,6 75,4 128,3 94,7

6. Производительность кг/м" час 4,3 4,4 5,8 4,3 4,8 6,1

7. Ост. УГВ г / л 1,4 0,9 1,2 1,3 0,89 1,2

8. Титр готового проекта кл / мл 10" 10" ю" 10" 10м 10"

Технологическая схема получения биопрепарата "Валентис" для очистки от нефтезагрязнений.

На основании проведенных исследований предлагается технологическая схема наработки биопрепарата "Валентис* (Рис.3). Схема использована при разработке ТУ и технологического регламента на получение опытной партии биопрепарата на Башкирском БХЗ для очистки объектов окружающей среды от НП.

1 - аппарат для приготовления чистой культуры; 2 - ферментер; 3 - сепаратор I и !! ступени; 4 - сборники бактериальной суспензии; 5 - сушильная камера; 6 - циклонная группа; 7 - аппарат мокрой очистки; 8 - газоочистные установки; 9 • циклон разгрузитель; 10 - бункер - накопитель; 11 - упаковочная машина.

Разработка технологии применения биопрепарата "Валентис" для очистки объектов окружающей среды в лабораторных условиях.

Цикличность применения биопрепарата определяется степенью нефтезагрязнений объекта и климатическими условиями.

В лабораторных условиях установлено, что для утилизации 1г нефтепродуктов необходимо внести раствор минеральных солей, содержащих 0,076 г азота и 0,175 г фосфора, и 200 - 300 мг биопрепарата.

Дня оценки применения биопрепарата "Валентис" для деструкции НП в лабораторных условиях была взята дерново-подзолистая почва, пропитанная мазутом, с содержанием УГВ — 8,4%.

Данные рис. 4.5 показывают, что использование биопрепарата "Валентис" позволяет значительно ускороть процесс деструкции НП по сравнению с контролем ( почва, загрязненная НП без применения биопрепарата "Валентис"). Как оптимальный следует выбрать вариант с использованием биопрепарата с адсорбентом (20 — 25% ), где происходило наибольшее увеличение потребления углеводородов. Степень утилизации общих и ароматических УГВ составила за б месяцев 91,1% и 82,Го соответственно.

л Утилизация УГВ,

¡1/

Время, месяцы

Рис.4 Утилизация углеводородов нефти в почее, пропитанной мазутом с применением биопрепарата "Валентис" за 6 месяцев: 1 - почва + соли ЫРК+ПАВ 2 - почва + соли + ПАВ + биопрепарат: 3 - почва + соли + ПАВ + биопрепарат + 20% наполнителей; 4 - почва + соли + ПАВ + биопрепарат + 25% наполнителей.

'I.

■160

¡о а>

го <>_

Утилизация ароматических УГВ, %

. ч

- 3

- V -

-лк-

Время, месяцы

Рис.5 Утилизация ароматических углеводородов нефти в почве, пропитанной мазутом с применением биопрепарата "Валентис" за 6 месяцев: 1 - почва + соли ЫРК+ПАВ; 2 - почза + сопи + ПАВ + биопрепарат; 3 - почва + соли + ПАВ + биопрепарат + 20% наполнителей; 4 - почва + соли + ПАВ 4- биопрепарат + 25% наполнителей.

На основании лабораторных данных по очистке проб с различными видами нефтепродуктов с помощью биопрепарата "Валентис" разработана инструкция по его применению в полевых условиях.

Утилизация УГВ, %

■ко

(О

АО

V V

V V V

V Ч

V_V

V V

— V

_ V V

— •/ /

— г

— V /

_ я

керосин

ДИ1/ТОПЛИВО

Время, 2 месяца

Рис. 6. Деструкция керосина и дизельного топлива биопрепаратом "Валентис" в полевых условиях. 1). 3 кг/м;; 2). 15 кг/ м'; 3). 30 кг/м'\ Изучение действия биопрепарата "Валентис" для очистки почвы (в полевых

условиях), загрязненной нефтепродуктами, ( дизельное топливо и керосин )

проводилось на делянках общей площадью 20 м2, при концентрации нефтезагрязнений ( 3 кг/м2,15 кг/м2 и 30 кг/м2). Через 2 месяца степень общих УГВ в пробах, загрязненных керосином, составила 82,3 — 50%, ароматических УГВ - 85 — 50%, в пробах загрязненных дизельным топливом, соответственно 94,5 — 75,0% и 96,6 —50% (рис. 6 ).

Предложенный метод биоиндикации с использованием посева тест — растений после очистки почвы от нефтепродуктов с использованием биопрепарата "Валентис". показал увеличение концентрации биомассы растений в 1,5 — 2,0 раза. Таким образом, результаты проведенных исследований показывают перспективность использования биопрепарата "Валентис" для рекультивации земель, загрязненных нефтепродуктами.

Испытания по биопрепарату "Валентис" осуществлялись сотрудниками фирмы АО "Эколби", "Ситеко-М", НПК "Новация", АООТ "Удмуртнефть", АОЗТ "Севергазсервис" в различных регионах России и СНГ.

Динамика в микробной сукцессии при внесении штаммов Ас. о!еоуогит Н -1 и Ас. уа!епНя О -1.

С целью полного учета микроорганизмов в почве, загрязненной НП, предложена схема, позволяющая обеспечить более полный учет микроорганизмов в почве, более 90% клеток ( Рис. 7 ).

Схема основана на многоступенчатом извлечении микроорганизмов из загрязненной почвы с применением ПАВ, с последующим высевом суспензии микроорганизмов на элективные среды. Учет штаммов-деструкторов осуществляется на специально разработанной нами индикаторной среде.

При биологической санации экосистемы изучена динамика в микробной сукцессии внесенных популяций Н -1 и в -1 при деструкции нефтепродуктов. Установлено, что внесенная популяция штаммов Н • 1 и б - 1 не влияла да динамику общего числа бактерий в почве.

Выделенные нами штаммы микроорганизмов М-1,М-2,М-3,М-4из почв, пропитанный НП, согласно классификации Звягинцева ( 48 ] были отнесены к К-стратегам и имели низкую удельную скорость роста тогда как штаммы Н-1 и С-отнесены были к г-стратегам( рис. 8 ).

По мере деструкции НП внесенной популяции штаммов бактерий Н - 1 и в - 1 увеличивается степень утилизации УГВ.

Микробиологическая характеристика образцов почвы, пропитанной мазутом, подвергнутых действию биопрепарата "Валентис" в лабораторных условиях. Температура 18 — 25°, продолжительность обработки 6 месяцев.

N2/ № Образцы Трофические группы м/ов, кл / мл, выделенные на средах Коэффициенты

- с /А МПА МПА 1:10 КАА олиго-трофно сти минерализации

1. Исходная почва, пропитанная мазутом (контроль) 10' 5 х 10' 3 х 10' — 6 х 10 "7 —

2. Почва + соли N. Р, К + 0,1% ПАВ 103 2 х 109 2 х 104 3 х 101 1,0 хЮ " 1,5x107

3. Почва + соли N. Р, К + 0,1% ПАВ+ биопрепарат "Валентис" (б/п) 103 2 х 10® 2 х 108 2 х 105 1 х 10 1 1 х 104

4. Почва + соли N. Р, К + 0,1% ПАВ + б/п + 15% наполнителей 107 8 х 10э 2 х Ю1" 2 х 108 2,5 3 х ю'

5. Почва + соли N1, Р, К + 0,1% ПАВ + б/п + 20% наполнителей 104 9 х 10'° 2x10" 3 х 10'° 2,2 Зх 101

6. Почва + соли + 0.1%ПА8+ б/п + 20% наполнителей при 1= 18° 103 9 X 10е 4х 108 3 х 10е 0,44 3 х 10 3

7. Почва + соли N. Р, К + 0,1% растительного масла + 15% наполн. + б/п ю2 7 x10е 1 х 10е 6 X 105 0,2 8,5х10'4

8. Почва + солиЫ,Р,К+25% наполнителей +0,1%ПАВ+ б/п ю1 2x10'° 5 х 10'° 4 х 109 2,5 0,2

исходная почва, загрязненная НП, 1 г растирание образ-ца,увлажненного до пастообразно-состояния

Посев на элективные и инд. * среду

Посев на элективные и инд. среды

— индикаторную среду

Рис.7. Схема предварительной подготовки почвенного образца, пропитанного нефтепродуктами на определение численности микроорганизмов чашечпм методом.

Стабилизация популяции штаммов Н - 1 иб - 1 осуществляется на определенном уровне — 109 - 4010 кп/мл., в то время как имеющийся пул почвенных микроорганизмов увеличивался с 5 х 10г до 2 х 10е кл/мл, то есть происходит увеличение числа автохтонных, олиготрофных, олигонитрофильных и других групп микроорганизмов.

Биомасса, ед. ОП

Рис.8 Рост сопутствующей микрофлоры, выделенной из почвы, пропитанной мазутом штаммов бактерий ( 1, 2, 3, 4 ); исследуемых штаммов Н-1, 0-1 и смеси всех штаммов ( 5 ) на минеральной среде N0 ЮИс добавлением 0,5% мазута в колбах на качалке при 25°.

Коэффициент минерализации после применения биопрепарата "Валентас" составил 0,3 — 0,2 при 20 — 25% наполнителей, в начале опыта он соответствовал значению 10-г ( табл. 8 ).

Содержание подвижных форм органических соединений по мере протекания деструкции НП постепенно увеличивалось, индекс олиготрофности составил 2,2 — 2,5 ( табл. 8 ). Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что интродукцированныс штаммы бактерий Ас/. о1ео№гит Н - 1 и Ас. уа!еп8з вИ, входящие в биопрепарат "Валентно* не влияли на динамику общего числа почвенных бактерий. |

По мере деструкции НП в почве происходило образование насыщенной "зрелой ! системы", где уже невозможна активная жизнедеятельность штаммов Н -1 и в -1. I

Представленый экспериментальный популяционный подход может быть основные инструментом для решения задач по управлению конкретными микроорганизмами е природе для решения экологических проблем.

Выводы

1. Исследовано 95 штаммов микроорганизмов по способности утилизировать углеводороды. Установлено, что бактерии p.p. Arthrobacter, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, окисляют различные виды углезодородсодержащегс сырья. Отобраны 7 штаммов, развивающихся в широком диапазоне температур, в том числе два термотолерантных Н -1 и G - 1, которые способны культивироваться при скорости протока 0,25 — 0,33 ч-1.

2. На основании морфологических физиолого-биохимических признаков, жирно-кислотного состава клеточных стенок и ДНК-ДНК-гибридации штамм Н - 1 идентифицирован как Acinetobacter oleovorum, а штамм G - 1 выделен как новый вид — Acinetobacter valentis.

3. Оптимизированы условия культивирования бактерий p. Acinetobacter в периодическом и непрерывном процессе. Бактерии способны развиваться в широком диапазоне температур 20 — 50°, рН среды ( 5,5 — 8,5 ), на средах с углеводородами, как единственным источником углерода.

Рекомендуется осуществлять периодический процесс при аэрации 0,4 г02/лч, непрерывный 1,5 — 1,8 л.л/мин. Время генерации составляет 43 — 44 мин. при максимальной скорости роста 0,6 — 0,7 ч-\ что позволяет проводить интенсивное непрерывное культивирование.

4. Бактерии A. oleovorum и A. valentis утилизируют Н - алканы Сд — Сзз , степень потребления повышается с увеличением длины цепи. Активно развиваются на средах с сырой нефтью, нефтяными дистиллятами, мазутовыми фракциями, дизельным топливом, различными маслами и ароматическими соединениями, что позволяет широко применять эти бактерии в экологических целях.

5. Разработана технология промышленного культивирования бактерий р. Acinetobacter и наработана опытная партия сухого препарата биомассы Ас. oleovorum и Ac. valentis на Башкирском БХЗ.

6. Разработана технология очистки почвы от нефтезагрязнений с помощью биопрепарата "Валентис". Подобран ы наполнители, качественный и количественный состав, способствующие иммобилизации бактерий Н - 1 и G - 1 в

почве и ускорению деструкции нефтепродуктов. Интродукция биопрепарате позволяет утилизировать более 90% н-алканов в почве за 6 месяцев, тогда как при оптимизации деятельности автохтонной микрофлоры утилизация не превышает 17,8% за тот же период.

7. Предложена схема микробиологического контроля, позволяющая учитывать около 90% микробиоты почвы и интродукцировзнных бактерий p. Acinetobacter в почвах, загрязненных нефтепродуктами.

8. Изучен процесс в микробной сукцессии при внесении биопрепарата "Валентис" в почву, загрязненную нефтепродуктами.

Показано, что микроорганизмы биопрепарата имеют короткую лаг-фазу и существенно более высокую скорость роста, чем собственно почвенные микроорганизмы, но не проявляют антагонизма к последним.

По мере исчерпания органического вещества в почве происходит увеличение численности собственно почвенных видов, а также коэффициентов минерализации, олиготрофности и олигонитрофильности.

9. Показано положительное влияние биопрепарата "Валентис" на восстановление эколого-трофических групп микроорганизмов в почвах, загрязненных нефтепродуктами, на процесс минерализации, что реализуется в повышении урожайности растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации :

1. М. Bitteeva, L. Kozlova, L. Kapotina, G. Morschakova, O. Kisluhina, B. Mursakov. Candida type yeast against, petroleum poilutien. II 15 th. Internationa! Specialized Symposium onyests, Riga, 1991.

2. Биттеева М.Б., Мурзаков Б.Г., Морщакова Г.Н., Хамроев О.Ж., Капотина Л.Н. и др. Способ очистки воды и почвы от нефтепродуктов. Патент Российской Федерации N 2014286. //Б.И. — 1994. — N 11.

3. Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Бирюков В.В., Капотина Л.Н. Способ очистки воды и почв от нефтепродуктов. Патент Российской Федерации N 2038333. II Б.И. — 1995.— N18.

4. Капотина Л Н., Морщакова Г.Н. др. Способ очистки объектов окружающей среды от углеводородов нефти и масел. R.U. Заявка N 97102054/13. Положительное решение от 17.02.97.

5. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н.. Биологическая деструкция нефти v нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду. II Ж. Биотехнология. — 1S98. — N 1. — С. 85 - 94.

6. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биодеградация отходов нефтяной v нефтеперерабатывающей промышленности. II Тезисы доклада международного симпозиума конференции "Техника и технология экологически чистых химических производств". — М. — 1998. — С. 42 - 43.

7. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция мазута биопрепаратом "Валентис". II Тезисы доклада Московской региональной конференции" Инженерная экология". — М. — 1998. — С. 21.

8. Морщакова Г.Н., Биттеева М.Б., Капотина Л.Н., Мурзаков Б.Г. Оптимальная питательная среда для углеводородокисляющих бактерий рода Acinetobacter. // Ж. Биотехнология. — М., 1991. —N 6. —С/ 67 -69.

9. Морщакова Г.Н., Биттеева М.Б.. Тюрин B.C.. Капотина Л.Н. и др. Аэробные коккобацилы, выделенные из почв нефтеносных районов. II Ж. Микробиология. — 1994. —N 1, —С. 90-100.

10. Мурзаков Б.Г., Биттеева М.Б., Морщакова Г.Н., Капотина Л.Н., Хамроез О.Ж., Кислухина О.В. // Бактерии - деструкторы нефтепродуктов. Тезисы докладов симпозиума "Микробиология охраны биосферы в регионах" Урала и Северного Прикаспия. — Москва, — 1991,—С. 20.

11. Мурзаков Б.Г., Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биодеградация отходов нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. // Тезисы доклада на конференции "Методы технической документации, паспортизации и переработки отходов". — Пенза, —1994. — С. 20.

12. Мурзаков Б.Г., Морщакова Г.Н., Капотина Л.Н. Способ очистки воды, почвы, сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Патент Российской Федерации N 2053204. II Б.И. — 1996. — N 3.

A new technoloque for an ecologiily oriented microbial blo-agent wich wos obtainend on the basis for natural hydrocarbon oxidate Acinetobacter bacteria was designed.A new kind Acinetobacter wos identified and described.The biopreparation 'Valentis' devoted to the purification of oil polluted soil has beeh tested in laboratory and field conditions.The biopreparation which contained a microbial component-oil degrading strains,various adsorbents and surfactants caused a high degree of hydrocarbons distruction and saved its degrading activity in environment and at uitimate temperatures.

SUMMARY

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Капотина, Лидия Николаевна, Москва

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОСИНТЕЗА

БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

КАПОТИНА ЛИДИЯ НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

( Специальность 03.00.23 — Биотехнология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научные руководители: доктор технических наук, профессор О.В. Кислухина

кандидат биологических наук, Г.Н.Морщакова

Москва 1998

& ~

Содержание

Стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Распространенность в природе бактерий, потребляющих Р- /У углеводорода, и их использование для ликвидации нефтяных загрязнений

1.2. Факторы, определяющие активность микробиологической утилизации углеводородов /о- Л &

1.2.1. Оптимизация питательной среды для роста углеводородокисляющих микроорганизмов - /6

1.2.2. Солевой режим выращивания нефтеокисляющих микроорганизмов /^

1.2.3. Влияние температуры на рост и физиологическую активность углеводородокисляющих микроорганизмов ^

1.2.4. Влияние рН на рост и физиологическую активность углеводородокисляющих микроорганизмов 20-2 / 1.2 .5. Влияние аэрации на рост углеводородокисляющих микроорганизмов ¿я ¿3 1.2.6. Зависимость интенсивности биодеструкции углеводородов от их химической структуры

1.3. Исследования по систематике нефтеокисляющих бактерий рода АситеЬэ-Ьас1ег

Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1. Объекты исследований >//-

2.2. Методы идентификации углеводородокисляющих бактерий У/ -

2.3. Культивирование микроорганизмов н Ч _ щ

2.4. Наблюдение за микробной сукцессией в почве У У //у

2.5. Исследование нефтеокисляющей активности биопрепарата "Валентна' УГ-У^'

Глава 3. Идентификация штаммов микроорганизмов, обитающих в н.фт.„гря,н.нных почвах

Глава 4. Технологические и физиологические параметры выращивания бактерий рода Ас1пе1оЬас1ег

4.1. Физиологические свойства бактерий рода АйпеЬэЬа^ег при различных условиях выращивания е ь

4.1.1. Влияние температуры бб~-б,

4.1.2. Влияние рН среды

4.1.3. Влияние аэрации у / -

4.1.4.Влияние источников азотного питания на накопление биомассы бактерий рода Ас1пе1:оЬас1ег ~

Глава 5. Получение бактериальной биомассы в качестве основы биопрепарата "Валентис"

5.1. Компоненты нефти как источники углерода для накопления биомассы бактерий рода Асте1оЬас1ег 6

5.2. Утилизация сырой нефти, мазута, различных масел и ароматических соединений ■

5.3. Непрерывное культивирование бактерий р. Ас1пе1оЬас1ег на Н- алканах различного фракционного состава З 'Ч

5.4. Наработка опытной партии биопрепарата "Валентис" и ее испытания в лабораторных условиях 3 к -

5.5. Дифференционально-диагностическая среда для контроля доминирования штаммов - деструкторов нефтепродуктов Н -1 и О -1 при нестерильном процессе ферментации в камеральных и опытных условиях 3 6" - 9Я

Глава 6. Оптимизация условий применения биопрепарата "Валентис"

6.1. Очистка нефтезафязненных вод

6.2. Очистка нефтезафязненных почв - /

Глава 7. Динамика микробных популяций в процессе очистки почв от нефтяных загрязнений

7.1. Методические аспекты у/з

7.2. Изучение конкурентноспособности бактерий рода Аше1оЬас1ег Мб - ¡/к

7.3. Динамика почвенной микрофлоры под действием штаммов бактерий Н -1

и О -1

7.4. Микробиологические характеристики зафязненной почвы, керосином и

дизельным топливом, подвергнутой очистке с помощью биопрепарата "Вален-

//?£ - П

тис в реальных производственных условиях 7.5. Биоиндикация, кг ния нефтепродуктами

7.5. Биоиндикация, как фактор оценки восстановления почвы после загрязне-

/3 / - /3

Выводы

Литература

Приложение

/з.-? - /з К

-о -

Общая характеристика работы. Актуальность темы.

Одним из наиболее современных перспективных, экологически чистых путей является использование для этой цели микроорганизмов.

Нами проведена работа по изучению бактерий рода Ас1пеЬэЬас1ег, развивающихся на углеводородах широкого спектра от Сд до С33 , с целью получения биопрепаратов для ликвидации нефтяных загрязнений.

Цепь работы — разработка технологии бактериальных препаратов экологического назначения на основе углеводородокисляющих бактерий. В задачи исследований входило:

— отбор штаммов с наибольшей скоростью накопления биомассы и глубиной окисления нефтепродуктов;

— изучение влияния условий культивирования на накопление биомассы при периодическом выращивании;

— проведение эколого-биологических исследований;

— разработка технологического регламента, ТУ на промышленный выпуск биопрепарата;

— разработка технологии применения биопрепарата в лабораторных и полевых

условиях.

Научная новизна. Исследована способность к усвоению Н-алканов, сырой нефти, дизельного топлива, мазута, различных масел в качестве единственного источника углерода у 95 коллекционных и вновь выделенных из почв загрязненных нефтепродуктами, микроорганизмов.

Из их числа отобраны наиболее активные штаммы бактерий, утилизирующие широкий спектр углеводородного сырья при различных температурах и рН среды. Изучены морфологические, физиолого-биохимические, таксономические и генетические свойства отобранных микроорганизмов и проведена их идентификация. Отобранные штаммы отнесены к роду Arthrobacter globiformis, Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium parafortuitum, Acinetobacter oleovorum и выделен, и описан новый вид рода Acinetobacter — valentis.

Установлено, что штаммы Acinetobacter oleovorum Н - 1 и Acinetobacter valentis G - 1 обладают наиболее важными промышленно-ценными свойствами (скорость роста, спектр утилизации УГВ, диапазон условий культивирования, состав биомассы). Изучена динамика в микробной сукцессии внесенных штаммовых популяций Ас. oleovorum Н - 1 и Ac. valentis G - 1 в почвах, загрязненных нефтепродуктами. Практическая значимость. Разработана технология культивирования бактерий рода Acinetobacter в периодических и непрерывных условиях.

— Наработана опытная партия биопрепарата 'Валентис" и проведены медико-биологические и экологические испытания биопрепарата в лабораторных и полевых условиях.

— Предложена схема микробиологического контроля, позволяющая учитывать более 90% клеток микроорганизмов.

— Разработан технологический регламент и ТУ на биопрепарат "Валентис".

— Разработана инструкция по применению биопрепарата "Валентис" для очистки почв, емкостей и сточных вод от нефтепродуктов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференции "Пути эффективного использования достижений биотехнологии в агропромышленном комплексе" ( г. Черновцы, 1991г. ); на Всесоюзном симпозиуме 'Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия ( г. Оренбург, октябрь 1991г. ); конференции "'Методы технической документации паспортизации и переработки отходов" ( г. Пенза, 1994г. ); Международной конференции "Техника и

технология экологически чистых химических производств" ( г. Москва, май 1998г. ); Московской региональной конференции "Инженерная экология" ( г. Москва, апрель 1998г.).

Работа изложена на 1*4 страницах, включает 5" 9 таблиц и ¡О рисунков. Список литературы включает 227 источников.

Автор приносит глубокую благодарность доктору биологических наук Мурзакову Б.Г. за интерес и внимание к работе, помощь в организации исследований.

— о--

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Распространенность в природе бактерий, потребляющих углеводороды, и их использование для ликвидации нефтяных загрязнений.

Проблема биологического окисления углеводородов бактериями давно привлекает внимание исследователей.

Многочисленные литературные данные говорят о том что бактерии, окисляющие углеводороды, широко распространены в природе. Они были выделены:

— из нефтяных скважин и пластовых вод [ 19 ];

— из вечной мерзлоты [ 197, 14Q, 50, 171];

— из различных почв, особенно районов нефтяных месторождений [ 181, 162, 2, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 57, 58, 59, 92, 94, 95, 96, 115, 87, 105, 106 ];

— из морской воды [ 172, 84, 103, 149, 199 ];

— из сточных вод нефтеносных районов [ 54, 72 ].

Среди микроорганизмов, усваивающих углеводороды нефти, наряду с дрожжами рода Candida, Debaryomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Endomycopsis, Hansenula, выявлены бактерии, принадлежащие к родам Pseudomonas, Micrococcus, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Nocardia, Mycobacterium [ 10, 12, 64, 176 ]. Углеводородокисляющие бактерии Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Brevibacterium, представители родов Arthrobacter, Nocardia и другие бактерии, обнаружены в маломинерализованных водах источников типа "Нафтуся" Трускавецкого месторождения [ 62 ].

Из воды и донных отложений залива Чесапик (США) было выделено и идентифицировано методом нумерической таксономии 99 штаммов бактерий, окисляющих углеводороды нефти [ 143 ].

Эти группы идентифицированы как представители родов Corynebacterium, Klebsiella, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Sphaerotiius.

Углеводородокисляющие представители рода Pseudomonas являются, как правило, типичными мезофипьными бактериями с температурным оптимумом роста 30°. Однако встречаются и термоустойчивые представители р. Pseudomonas, окисляющие газообразные углеводороды [ 201 ], например, выделили Pseudomonas aeruginosa 14, который хорошо рос на минеральной среде с Н-

_ у -

алканами (Сю - С17) при 25-42°. Бактерии рода Pseudomonas (Ps. aeruginosa и Ps. /luorescens) потребляли парафин Мангышлакской нефти как при совместном, так и при последовательном культивировании с дрожжами рода Candida (С. tropicalis, С. intermedia, С. lipolytica и С. sp.), причем бактерии обеспечивали более полное окисление парафинов по сравнению с монокультурой дрожжей [ 16 ]. Термотолерантные бактерии Pseudomonas aeruginosa — штамм 178, активно растущие на среде с жидким парафином (смесь Н-алканов из С12 - С24), были выделены из водного источника Киргизской ССР [ 109 ].

Активные углеводородокисляющие бактерии родов Pseudomonas, Bacterium, Pseudobacterium и Bacillus, выделенные из вод Новороссийской бухты, рекомендованы для разработки гидробиологических методов борьбы с нефтью в море [ 127 ].

Из нефтеносных скважин западноукраинских месторождений выделена новая группа факультативных анаэробных бактерий Clostridium polymyxa. которые способны усваивать в анаэробных условиях Н-алканы в качестве единственного источника углерода [ 64 ].

Aeckersberg et. al. [ 136 ], выделили из нефтяного поля близ Гамбурга сульфатредуцирующую бактерию нового типа Нх d3, растущую на предельных углеводородах.

Из проб морской воды загрязненных нефтью, участка "Bisan Seto", выделена 81 культура бактерий и исследована их способность расщеплять углеводороды тяжелой нефти.

Способность бактерий расщеплять Н-алканы возрастала с уменьшением длины углеродной цепи от С32 до Ci6. Наиболее активна при усвоении Н-гексадекана была культура Moraxella sp. [ 198 ].

Кузнецов и другие [ 74 ], описали новый вид Streptomyces albiaxiles sp. nov BKM A-691, разлагающий углеводороды в присутствии 30% NaCI.

На северо-западном и южном побережьях Кубы из проб вод выделены чистые культуры микроорганизмов, способные к деградации сырой нефти; среди них представители родов Pseudomonas, Achromobacter, Arthrobacter, Mycobacterium, Candida, Aspergillus, Penicillium [ 192 ].

Видовой состав углеводородокисляющих бактерий акваторий Урала и Западной Сибири представлен бактериями Rhodococcus erythropolis. Повсеместное

- tu ~

распространение и высокий титр Rhodococcus erythropolis в нефтезагрязненных акваториях дают основание считать его индикаторным видом {18 ]. Изучена роль энтеробактерий в разрушении углеводородов. В качестве субстрата использован мазут. Пробы отбирали через 5, 7, 9, и 11 недель и анализировали на газо-жидкостном хроматографе (ГЖХ). Установлено, что в присутствии микроорганизмов происходило значительное снижение количества парафинов (Ci2 -С22) и низкомолекулярных изопренов [ 211 ].

Среди термотолерантных нефтеокисляющих бактерий известны бактерии рода Bacillus [ 204 ], имеющие оптимум роста при 55-60°, они выделены из парового конденсата асфальтовой эмульсии, сточной воды нефтеперерабатывающего завода, смеси нефть-вода, дождевой воды, температура которых варьировала от 8 до 90°. Микроорганизмы способны расти на Н-парафинах с длиной цепи от С12 до С20. Термофильные углеводородокисляющие микроорганизмы Brevibacterium A 25R растут на газойлях при 40-50° [ 218 ], а бактерии рода Mycobacterium при 52° [ 64 ]. Культуры рода Nocardia выделены не только из почв, пропитанных нефтью, но и из южных почв, не загрязненных нефтью. Тем не менее они обладали способностью окислять углеводороды. Микрофлора нефтяных месторождений представлена в основном родами Pseudomonas, Mycobacterium, Vibrio, реже встречаются Bacterium, Micrococcus, Nocardia, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, еще реже дрожжи родов Candida, Torulopsis, Rhodotoruia и грибы - Pénicillium, Aspergillus [97 ]. Таким образом, независимо от присутствия в окружающей среде углеводородов, бактерии, способные их усваивать, широко распространены в природе. Преобладающими среди них являются бактерии родов Pseudomonas, Mycobacterium, Arthrobacter.

Микробные сообщества почв обычно включают в свой состав значительное количество углеводородокисляющих бактерий, которые существенно увеличивают свою численность в присутствии нефтяных загрязнений. В песчаной почве 82% нефти разрушается бактериями и лишь 13% грибами.

Основными компонентами ценозов, подвергающих деструкции нефтяные загрязнения (до 95%), являются бактерии родов Pseudomonas, Micrococcus, Nocardia представители семейства Enterobacteriaceae, актиномицеты, коринеформы. Из морской воды выделены Aerobasidium, Candida, Rhodotoruia, Sporobolomyces, а из почвы — Trichoderma и Mertierella; Aspergillus и Pénicillium выделены как из морской воды, так и из почвы.

Добавление к почве углеводородокисляющих микроорганизмов иногда не приводит к резкому повышению интенсивности биодеструкции, поскольку они не всегда выдерживают конкуренцию с местной микрофлорой. Другими возможными причинами являются химический состав веществ почвы, присутствие ингибирующих веществ, влияние микробов-хищников и т.д. [ 97 ]. Brown Lewis R. [ 154 ] отмечает, что среди физико-химических методов борьбы с нефтяными разливами наиболее популярны: сжигание, осаждение, адсорбция и деспергирование. Однако отмечено, что микроорганизмы являются одним из наиболее эффективных природных средств удаления нефти из окружающей среды [ 25, 56, 57, 58, 59, 90, 92, 94, 95, 97]. Нефть разлагается природной микрофлорой, но скорость деградации низкая. Добавление солей азота и фосфора значительно увеличивают скорость расщепления нефти (с 4,2 до 50% за 8 суток при t = 20°) [ 217 ]; железо в форме цитрата стимулировало рост микроорганизмов, разлагающих нефть [ 225 ]. Для биологического восстановления загрязненных угольной смолой почв в Филадельфии, путем уменьшения содержания полициклических ароматических углеводородов, применяли как дополнительный источник энергии для микробной деградации загрязнения — соевое масло и ПАВ. За 4 месяца содержание углеводородов уменьшилось на 80% [ 222 ].

Foght J. et. al. [168 ] считает , что биокоррекция нефтезагрязнений может быть двух видов; первая — использование деградирующей способности местной микрофлоры, которую усиливают добавлением питательных веществ или ПАВ; второе — внедрение в окружающую среду соответствующих природных штаммов микроорганизмов, вместе со стимуляторами и другими добавками. При исчерпании избыточных количеств нефтяного загрязнителя все компоненты биосистемы восстанавливаются в динамике на уровне нативных биоценозов. Отмершая избыточная биомасса микроорганизмов — деструкторов является исходным источником для накопления в почве гумусовых веществ, обеспечивающих почвенное плодородие.

В последние годы успешно развивается новая область современной науки — экологическая биотехнология [97 ], основанная на применении активных биологических препаратов, включающих в свой состав те или иные активные штаммы микроорганизмов. Так, для ликвидации нефтяных загрязнителей применяются биопрепараты, изготовленные из нефтеокисляющих микроорганизмов,

в основном бактерий и дрожжей. Преимуществом биологическ

Информация о работе

Капотина, Лидия Николаевна
кандидата технических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии бактериального биопрепарата экологического назначения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы