Рост и развитие углеводородкисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования

Александров, Алексей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рост и развитие углеводородкисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Рост и развитие углеводородкисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВ Алексей Юрьевич

Рост и развитие углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

00461-33490

Ставрополь - 2010

004603490

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный технический университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Самыгин Виктор Михайлович.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Мануйлов Игорь Михайлович;

доктор биологических наук, профессор Майский Виктор Григорьевич.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный

технологический университет»

Защита диссертации состоится «ч7 » ¿{^Р/^Я 2010 г. в "{7 часов на заседании диссертационного совета при ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан « %Оу> 2010 г.

Ученый секретарь I

диссертационного совета х) Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нефть является одним из самых распространённых загрязнителей окружающей среды. Её разливы вызывают гибель организмов, изменение свойств экосистем и их деградацию. Проблема нефтяного загрязнения приобрела глобальные масштабы в конце XX века. Это связано с тем, что нефть стала самым используемым источником энергии. Потери при современных объёмах добычи нефти исчисляются десятками миллионов тонн в год (Миркин Б.М., Наумова Л.Г., 2001). Процесс самовосстановления биоценозов в регионах, которые подверглись нефтяному загрязнению, занимает весьма продолжительное время и протекает порой в течение 10-25 лет. (Давыдова C.JL, Тагасов В.И, 2004; Киреева H.A., 2007).

Из многочисленных методов, которые позволяют уменьшить концентрацию нефти в окружающей среде, наиболее перспективными считаются биологические методы, основанные на естественных процессах разложения нефти в природе, участие в которых принимают углеводородокисляющие микроорганизмы: бактерии, микроскопические грибы и дрожжи (Киреева H.A., 1994; Коронелли Т.В., 1996; Арене В.Ж. и др., 1999).

Одним из основных направлений биологической очистки от нефтяного загрязнения является стимуляция аборигенной микрофлоры на месте загрязнения (Бельков В.В., 1995). В этом случае большое значение имеют факторы окружающей среды, оказывающие влияния на углеводородокисляющую активность: температура, условия аэрации, обеспеченность элементами питания и кислотность среды (Vidali М., 2001; Миронов О.Г., 2002; Войно Л.И., 2006). Наряду с оптимизацией процессов роста и развития углеводородокисляющих микроорганизмов, применяется внесение активных углеводородокисляющих микроорганизмов в среду, чаще всего в виде промышленных биопрепаратов. В настоящее время существует большой рынок коммерческих препаратов, но, несмотря на это, продолжается поиск новых штаммов-нефтедеструкторов, обладающих высокой окислительной способностью по отношению к широкому спектру углеводородов нефти. Кроме того, некоторые из углеводородокисляющих микроорганизмов относятся к условно-патогенным видам, поэтому необходимо соблюдение условий безопасности при получении и применении биопрепаратов (Соловьев В.И. и др., 2001). Поэтому пополнение микробной коллекции свежевыделенных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), изучение условий их культивирования и получение биомассы для последующего применения в процессах ликвидации разливов нефти является актуальным.

Целью диссертационной работы являлось изучение особенностей роста и размножения углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях глубинного аппаратного культивирования в синтетических средах на основе нефти.

Основные задачи исследования.

1. Идентифицировать штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенные из нефтезагрязнённой почвы.

2. Экспериментально определить основные параметры роста выделенных штаммов микроорганизмов, а также влияние физико-химических факторов и состава питательной среды на развитие бактериальной популяции.

3. Определить углеводородокисляющую активность отобранных штаммов и остаточную фитотоксичность почвы в процессах биоремедиации нефтезагряз-нённых объектов.

4. Сконструировать установку для культивирования микроорганизмов, обеспечивающую биологическую и экологическую безопасность процессов их выращивания.

Научная новизна. Впервые:

- идентифицированы выделенные из нефтезагрязнённой почвы два активных штамма-нефтедеструктора, относящиеся к родам Pseudomonas и Bacillus и обладающие различной углеводородокисляющей способностью и детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность;

- определены закономерности и основные параметры роста выделенных бактерий Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22, установлено влияние состава питательной среды и физико-химических факторов на развитие микробной популяций в условиях глубинного аппаратного культивирования;

- показано, что метод молярности этаноловых капель может быть успешно применён для оценки углеводородокисляющей способности штаммов в загрязнённых нефтью природных объектов;

- сконструирована установка, обеспечивающая биологическую и экологическую безопасность процессов глубинного выращивания микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологии получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22. Данные о благоприятном влиянии мелассы, солей молибдена, перфторированных соединений углерода в питательной среде могут быть использованы в биотехнологии для эффективного получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов. Для оценки углеводородокисляющей активности микроорганизмов и определения концентрации нефти в почве пригоден использованный в работе метод молярности этаноловых капель. По материалам диссертационной работы опубликованы методические указания «Изучение скорости потребления кислорода при глубинном культивировании микроорганизмов» (в соавторстве с В.М. Самыгиным, И.В. Владимцевой и Т.В. Хохловой), которые используются студентами химико-технологического факультета и факультета технологий пищевых производств Волгоградского государственного технического университета на лабораторных занятиях по курсу «Основы биотехнологии». Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиолог ии и биотехнологии и написании дипломных работ в Волгоградском государственном техническом университете. Разработанная с участием автора установка для культивирования микроорганизмов нашла отражение в методических указаниях МУ 1.3.2411-08 «Биологическая

безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов III групп патогенности», утверждённых Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.07.2008 г.

Положения, выносимые на защиту.

1. Идентифицированные как Pseudomonas sp.ТУЮ и Bacillus sp.TYll штаммы микроорганизмов потребляют в качестве источника углерода углеводороды нефти и могут быть использованы для очистки природных объектов, загрязнённых нефтью и её продуктами.

2. Использование метода молярности этаноловых капель и теста на фитотоксичность является эффективным средством для оценки углеводородокисляющей и детоксицирующей способностью бактерий в загрязнённых нефтью объектах окружающей среды.

3. Штаммы Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 обладают различной активностью в процессах биоремедиации. На их рост и размножение оказывают влияние состав питательной среды и физико-химические факторы, которые обеспечивают различную скорость развития бактериальных популяций в условиях глубинного культивирования.

4. Сконструированная лабораторная установка создаёт возможности проведения процессов глубинного культивирования в условиях биологической и экологической безопасности.

Апробация. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены: на 11-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология- наука XXI века» (Пущино, 2007); XII и XIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2007, 2008); 45-й и 46-й научных конференциях Волгоградского государственного технического университета (Волгоград, 2008, 2009); Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий» (Тула, 2008); Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (II Ржавитинские чтения) (Саранск, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); Tenth International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium (Балтимор, США, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

использованной литературы, включающего 214 наименований, из них 51 иностранных. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись два активных штамма-нефтедеструктора, выделенные из нефтезагрязнённой почвы в г. Волгограде.

Идентификацию штаммов проводили по общепринятым методикам на основании изучения культуральных, морфологических и биохимических свойств (Теппер и др., 1993; Определитель бактерий Берджи, 1997).

При изучении влияния температуры на рост углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) использовали питательный бульон фирмы «Difco». Кислотно-щелочной баланс питательной среды устанавливали с помощью фосфатного буфера. Из фторированных органических соединений использовали перфтортрибутиламин - (C4F9)N3 - в количестве 5% (об). Молибден добавляли в виде аммониевой соли (ЫНд^МоуОзг^ЬО. Осмотическое равновесие в среде на основе мелассы поддерживали за счёт 0,9% раствора NaCl.

Эксперименты по определению влияния физико-химических факторов (температуры, величины рН, условий аэрации) на рост штаммов УОМ, а также изучение роста ассоциированных культур штаммов проводили в условиях глубинного аппаратного культивирования. Для этого использовали лабораторный ферментёр «LKB-I607 Polyferm» (Швеция), с рабочим объёмом культурального сосуда 400 мл.

Для определения концентрации биомассы использовали стандартный образец мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича, а концентрацию живых клеток определяли методом высева на плотные питательные среды.

Параметры роста - удельную скорость роста (р), время генерации (td), степень размножения (п), максимальную концентрацию (М) - рассчитывали на определённом этапе развития бульонной культуры общепринятыми методами (Перт, 1978).

Для определения эффективности исследуемых штаммов в процессах биоремедиации и оценки степени биодеструкции нефти в почве был использован molarity of ethanol droplet (MED) метод или метод молярности этаноловых капель (King, 1981).

Фитотоксичность нефтезагрязнённых почв оценивали методом проростков, для чего была использована тест-культура редиса Raphanus sativus L. var. sativus сорта «Красный с белым кончиком» (Биккинина и др., 2006; Никитина и др., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Идентификация штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов

При посеве штамма №22 на питательный агар Difco в чашках Петри через 16-24 ч формировались среднего размера (d=2-9 мм) матовые, неправильной или круглой формы, плоские, с зубчатыми краями, морщинистой

поверхностью, белого цвета, однородной структуры и сухой консистенции колонии. При выращивании в пробирках с мясопептонным бульоном (Difco) наблюдалось образование плотной слизистой плёнки белого цвета, при этом среда оставалась прозрачной. При микроскопии мазков наблюдались отдельно или цепочками расположенные прямые палочки, которые положительно окрашивались по Граму. При окраске по Пешкову и Шефферу-Фултону обнаружены эндоспоры сферической формы центрального типа спорообразования. При нанесении на поверхность колоний 3% перекиси водорода наблюдалось образование пузырьков, что указывало на каталазную активность микроорганизма. В полужидком агаре отмечен диффузный рост, что свидетельствовало об активной подвижности изучаемого штамма. На основании полученных данных штамм был отнесён к роду Bacillus и в дальнейшем получил название Bacillus sp. ТУ22.

При идентификации штамма №10 было установлено, что клетки представляют собой палочки, которые отрицательно окрашивались по Граму. При окраске клеток методом Шеффера-Фултона споровых форм не обнаружено. При посеве на мясопептонный агар Difco формировались выпуклые, гладкие, блестящие, сероватого цвета, диаметром 10-25 мм колонии. В пробирках с мясопептонным бульоном Difco плёнка не образовывалась, наблюдался плотный осадок белого цвета, через 24 ч среда мутнела. В полужидком агаре наблюдался диффузный рост, что указывает на активную подвижность штамма. Результаты исследования наличия оксидазы указанного штамма при помощи СИБ показали отрицательный результат. Штамм обладал каталазной активностью, а на среде Хью-Лейфсона окислял, но не ферментировал глюкозу. Результаты экспериментов по декарбоксилированию аминокислот обнаружили положительную реакцию на аргининдигидролазу и отрицательную на лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу.

Полученные результаты исследований позволили отнести данный штамм к роду Pseudomonas и обозначить как Pseudomonas sp. ТУЮ.

Влияние физико-химических факторов на рост и углеводородокисляющую активность микроорганизмов

Нами проведена сравнительная оценка нескольких синтетических сред с целью выяснения, какая из них является пригодной длЯ'развития штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22. Конкретно, в Наших экспериментах были использованы три среды, содержащие углеводороды нефти: Гафарова, Рахимовой и 8Е.

Для того, чтобы выяснить, насколько присутствие углеводородов нефти оказывает влияние на рост штаммов УОМ, в контрольные флаконы со средами нефть не добавляли. Штаммы засевали в количестве 108 кл/мл, выращивали при температуре 37° С в течение 7 суток, делая высевы на чашки Петри с питательным агаром.

При культивировании Bacillus sp. ТУ22 в синтетических средах, не содержащих нефти, во всех вариантах наблюдалось уменьшение по сравнению с начальной концентрации клеток. В средах с добавлением нефти рост

отмечался только в среде Гафарова, причем наиболее заметно это проявлялось на 2 сутки культивирования, когда концентрация увеличивалась до 1,2-108 КОЕ/мл (рис.1).

Сутки:

Гафарова Рахимовой Варианты питательных сред

8Е Гафарова рахимовой

Варианты питательных сред

Рисунок 1 - Кинетика роста штамма Bacillus sp. ТУ22 в различных синтетических средах: а-среды без добавления нефти, б - среды с добавлением нефти (1 % об.)

При культивировании Pseudomonas sp. ТУЮ как в средах с добавлением нефти, так и без неё, максимальный рост выявлен в среде Рахимовой. При этом максимальная концентрация биомассы псевдомонад в среде Рахимовой с добавлением нефти, во-первых, достигалась быстрее, чем в среде без нефти: на 1-ые и 5-ые сутки культивирования соответственно, и, во-вторых, была выше в 1,5 раза, чем концентрация клеток в среде без добавления нефти (1,6 против 1,l-10s КОЕ/мл) (рис.2).

Гафарова Рахимовой Варианты питательных сред

S 1.0Е+09

8Е Гафарова Рахимсесй

Варианты питательных сред

Рисунок 2 - Кинетика роста штамма Pseudomonas sp. ТУЮ в различных синтетических средах: а - среды без добавления нефти, б - среды с добавлением нефти (1% об.)

Таким образом, из исследованных синтетических сред оптимальной для роста Bacillus sp. ТУ22 оказалась минимальная среда Гафарова, а для Pseudomonas sp. ТУ 10 - среда Рахимовой.

Температура является одним из важнейших факторов, влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Прежде всего, была определена возможность развития штаммов при температуре 10° С и 42° С. Оказалось, что у обоих штаммов в этих условиях активного роста и не наблюдалось.

В последующем динамика роста обоих штаммов при глубинном аппаратном культивировании была исследована в течение 48 часов в более узком диапазоне температур: 20° С, 30° С и 37° С. Установлено, что при 30° С штамм Bacillus sp. ТУ22 практически сразу же начинал активно развиваться, и максимальная концентрация биомассы превышала посевную дозу почти в 30 раз. В условиях выращивания при 20° и 37° С активный рост бактерий начинался через 3-9 часов, а урожайность биомассы превышала исходную концентрацию клеток в 18,3 и 6,6 раза соответственно. Размножение клеток Pseudomonas sp. ТУЮ происходило после непродолжительной (2-6 ч) лаг-фазы в течение 6-10 часов. Стационарная фаза начиналась через 9 часов, если бактерии выращивали при 30° либо 37 0 С, или через 48 ч при инкубации при 20° С. В зависимости от температуры культивирования концентрация биомассы в стационарной фазе, по сравнению с начальной, увеличивалась соответственно в 34, 20,2 и 4,83 раза. Таким образом, для эффективного размножения Bacillus sp. ТУ22 оптимальной является температура 30° С, а для Pseudomonas sp. ТУ 10 - 37° С. Полученные данные по влиянию температуры на рост двух штаммов легли в основу дальнейшей исследовательской работы при глубинном аппаратном культивировании.

Как и температура, кислотность среды является лимитирующим фактором для развития микроорганизмов. В соответствии с этим исследовано влияние слабокислой (рН=6,8±0,1) и слабощелочной (рН=7,2±0,1) реакции среды на штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов.

В процессе опытов установлено, что при рН=6,8±0,1 фаза экспоненциального роста у Bacillus sp. ТУ22 начиналась через 3-4 часа после посева материала и продолжалась 6-8 часов. Концентрация биомассы в стационарной фазе по сравнению с посевной дозой увеличивалась в 2,23 раза. Удельная скорость роста равнялась ц=0,08 ч"', время удвоение биомассы составляло td=8,66 ч, а степень размножения п=0,93.

В слабощелочной среде (рН=7,2±0,1) у Bacillus sp. ТУ22 лаг-фаза продолжалась в течение 0,5-1,5 часа, после чего наступала фаза логарифмического роста, которая длилась от 4 до 6 часов. В этих случаях максимальная концентрация клеток достигала 1,78-109 КОЕ/мл и превышала начальную в 17,8 раза. Параметры роста в экспоненциальной фазе составили: ^=0,72 ч"1, td=0,96 ч, п=4,15.

При культивировании Pseudomonas sp. ТУЮ в среде со слабокислой реакцией размножение клеток происходило незначительно, и концентрация изменялась в пределах (5Т07)-{2Т08) кл/мл. Лаг-фаза длилась 5-7 часов, после чего наступала непродолжительная фаза экспоненциального роста. Макси-

мальная концентрация микробной биомассы превышала начальную в 1,67 раза. Определенный рост Pseudomonas sp. ТУ 10 наблюдался в слабощелочной среде (рН=7,2±0,1). В этих случаях максимум концентрации микроорганизмов в жидкой среде был выше начального значения в 5,87 раза. Это происходило через 12 часов после начала культивирования.

Таким образом, для размножения штамма Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУЮ слабощелочная среда (рН=7,2±0,1) оказалась более благоприятной по сравнению со слабокислой (рН=6,8±0,1).

При глубинном культивировании для нормального роста УОМ необходим кислород. Было изучено влияние различных условий аэрации на размножение бактериальных клеток: в одном случае аэрация жидкой питательной среды осуществлялась за счет искусственно нагнетаемого со скоростью 0,5 л/мин воздуха и перемешивания среды с помощью магнитной мешалки, в другом -воздух в культуральный сосуд не подавали. В третьем варианте в аэрируемую среду добавляли перфтортрибутиламин, препарат который обладает аномально высокой способностью к растворению газов при обычном барометрическом давлении.

При культивировании штамма Bacillus sp. 'ГУ22 в трёх вариантах отмечалось снижение концентрации бактерий в первые 4-6 часов после начала эксперимента. Затем в случаях, когда в среду искусственно нагнетали воздух, происходило размножение клеток, и после 5-6 часового роста культура достигала стационарной фазы, продолжавшейся в течение 26-31 ч. Максимальная концентрация бактерий была выше начальной в 2,23 раза. Во втором варианте клетки постепенно отмирали, их концентрация на всем протяжении опыта была ниже, чем в момент посева. Добавление ПФОС не оказывало на рост штамма стимулирующего воздействия, а, наоборот, наблюдалось снижение числа бактериальных клеток (рис.3).

0 10 20 30 40 50 60

Время культивирования, ч

Рисунок 3 - Кинетика роста Bacillus sp. ТУ22 в различных условиях аэрации

При выращивании Pseudomonas sp. ТУЮ лаг-фаза во всех трёх вариантах длилась от 2 до 5 часов. Фаза экспоненциального роста в условиях принудительной аэрации была непродолжительной и длилась 4-6 часов. Добавление в среду ПФОС увеличивало экспоненциальную фазу до 22-25 часов, при этом концентрация биомассы псевдомонад через 36 ч после начала культивирования была наиболее высокой и составляла 6,39-Ю9 КОЕ/мл. Отсутствие принудительной аэрации оказывало отрицательный эффект на рост микробной популяции, и концентрация бактерий на вторые сутки снижалась до (1-3)-105 КОЕ/мл (рис. 4).

1,00Е+10

| I.00E+09

I 1,00Е+08

>о

I 1.00E+Ö7

0 '

s 1,00Е+06

| 1,00Е+()5

1 «

'■А

1,00Е+04

-аэрация •ütl

аэрации

-аэрацияс ПФОС

—Г——» I

10 20 30 40 50 Время культивирования, ч

Рисунок 4 - Кинетика роста Pseudomonas sp. ТУЮ в различных условиях аэрации

Таким образом, рост двух штаммов в условиях искусственной аэрации был интенсивнее, чем в случаях, когда подача воздуха и перемешивание среды не проводились. Добавление в питательную среду ПФОС оказывало различный эффект на рост изучаемых штаммов. Эти соединения не оказывали благоприятного эффекта на рост штамма Bacillus sp. ТУ22, но позитивно влияли на развитие Pseudomonas sp. ТУЮ.

Нижневолжский регион, в который входит Волгоградская область, омывается водами Каспийского моря. В связи с этим исследована способность роста двух штаммов в среде с высоким содержанием морских солей и нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Эксперименты проводились в средах с различной концентрацией морской соли «Marbelle»: 5%о, 10%о, 35%, 50%>.

Наименее выраженное ингибирующее действие на рост бактерий наблюдалось при содержании морской соли в среде в количестве 5%о. В этих случаях через 24 часа после начала экспериментов происходило снижение

концентрации клеток Bacillus sp. ТУ22 до 3,33-107 КОЕ/мл. Увеличение концентрации соли и продолжительности процесса выращивания приводило к дальнейшей гибели клеток исследуемого микроорганизма. В целом концентрация клеток Bacillus sp. ТУ22 в течение эксперимента во всех вариантах была ниже начальной концентрации. При культивировании Pseudomonas sp. ТУЮ в среде с 5%о морской соли через 24 и 48 часов после начала эксперимента концентрация микробной биомассы составила соответственно 1,57-108 и 1,58-108 КОЕ/мл. Эти значения превышали посевную дозу и были максимальными во всех вариантах эксперимента.

Таким образом, из двух микроорганизмов лишь штамм Pseudomonas sp. ТУЮ проявлял определенные галофильные свойства, обладал способностью размножаться в содержащей морскую соль среде. Наиболее заметное размножение клеток наблюдалось в среде, содержащей морскую соль в количестве 5%о, хотя процессы развития микробных популяций происходили и при более высоких концентрациях (10%о).

На рост и развитие микроорганизмов оказывают значительное влияние микроэлементы. Одним из таких микроэлементов является молибден. У факультативных анаэробов, среди которых встречаются представители двух изучаемых родов, молибден входит в состав нитратредуктазы - фермента, регулирующего процессы биологического окисления, при которых нитраты могут быть использованы в качестве альтернативных акцепторов электронов. Было исследовано влияние на рост УОМ этого микроэлемент, который вносили в среду в виде молибденовокислого аммония в концентрациях 5, 50 и 500 мг/л. В контрольном среде молибдат аммония отсутствовал.

При культивировании штамма Pseudomonas sp. ТУЮ в среде с молибденовокислым аммонием в количестве 5 мг/л концентрация микробной биомассы через 48 часов превышала начальную в 10,2 раза, а при его содержании 50 мг/л - в 11,2 раза. Показатели концентрации составили соответственно 1,02-109 и 1,12-10Ч КОЕ/мл. Увеличение молибдата аммония в среде до 500 мг/л приводило к замедлению роста культуры и уменьшению биомассы по сравнению с посевной дозой в 2 раза.

Через 24 часа роста Bacillus sp. ТУ22 концентрация биомассы штамма в среде с содержанием молибдата аммония 500 мг/л была выше начальной в 43,3 раза, а через 48 часов - в 10,9 раза. В остальных вариантах столь интенсивного роста не наблюдалось, хотя максимальная концентрация превышала начальную в 7-9 раз.

Таким образом, наиболее эффективное действие на рост Pseudomonas .ф. ТУЮ молибдат аммония оказывал при содержании в среде в количестве 50 мг/л, а для роста Bacillus sp. ТУ22 наиболее эффективной установлена концентрация в 500 мг/л.

Микробиологические процессы, в том числе и окисление нефти, зачастую осуществляются ассоциациями микроорганизмов. В связи с этим исследован рост штаммов Pseudomonas sp. ТУ 10 и Bacillus sp. ТУ 22 в виде двухкомпонент-ной культуры, а также взаимоотношения штаммов внутри микробной ассоциации, возможность их совместного использования для биоремедиации.

Эксперименты по изучению роста проводили при температуре 3 0°С, на среде Рахимовой глубинным методом в трёх вариантах, которые различались в соотношениях посевной дозы. В первом варианте концентрация двух микроорганизмов при посеве была одинаковой - 108 кл/мл, т.е. соотношение составило 1:1. Во втором и третьем вариантах концентрации клеток Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 было 10:1 и 1:10. Оказалось, что во всех вариантах происходит ингибирование роста штамма Bacillus sp. ТУ22 и уменьшение концентрации бактерий по сравнению с начальной в 500-1000 раз. На фоне этого наблюдалось размножение клеток Pseudomonas sp. ТУЮ. Причем наиболее высокая урожайность псевдомонад отмечена при равных посевных дозах. В этом случае концентрация достигала 2,73-Ю8 КОЕ/мл через 12 часов после начала эксперимента. В других вариантах концентрация биомассы Pseudomonas sp. ТУЮ в течение всего эксперимента не превышала начальную.

Таким образом, использование штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 в виде ассоциированной культуры для биоремедиации нефтезагрязненных объектов представляется малоперспективным.

Было исследовано развитие штаммов в среде с содержанием мелассы 0,1%, 0,5%, 1%, 2,5%, 5%. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Концентрация микробной биомассы в среде с различным содержанием мелассы

Концентрация мслассы (%) Концентрация микробной биомассы, КОЕ/мл

Pseudomonas sp. ТУЮ Bacillus sp. ТУ22

24 часа 48 часов 24 часа 48 часов

0,1 1,4-10х 2.3-10" 6,3-10' 5,5-104

0.5 8,5-10* 1.3-Ю10 2,0-10* 1,1 10й'

1 1.2-108 8.2-10" 5.3-10' 3,3-10У

2,5 3,3-10' 2,0-10' 0 0

5 0 0 0 0

Из таблицы видно, что рост обоих микроорганизмов наблюдался при концентрации мелассы в среде в пределах от 0,1% до 1%. Наиболее эффективной урожайность микробной биомассы оказалась при концентрации мелассы 0,5% и продолжительности выращивания в течение 48 часов. Повышение содержания мелассы до 2,5% приводило к снижению урожайности псевдомонад, тогда как рост Bacillus sp. ТУ22 в этих случаях вовсе

прекращался. Дальнейшее увеличение мелассы в среде (до 5%) пагубно сказывалось и на развитие Pseudomonas sp. ТУ 10.

В последующих экспериментах при глубинном культивировании в ферментёре в среде с мелассой установлено, что Pseudomonas sp. ТУЮ после некоторой лаг-фазы (9 ч.) начинал интенсивно размножаться, и логарифмический рост продолжался с 9 до 24 ч после начала эксперимента. Максимальная концентрация к началу стационарной фазы составила 1,67-1010 КОЕ/мл, [i=0,68 ч"1, td=l,02 ч, п=11,82. У штамма Bacillus sp. ТУ22 лаг-фаза продолжалась 12 часов, а экспоненциальная фаза - до 24 часов от начала опыта. Максимальная концентрация биомассы бацилл достигала 5, 8-Ю10 КОЕ/мл, ц=0,19 ч1, td=3,74 ч, п=4,29.

Изучение способности штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов к биоремедиации нефтезагрязнённых почв

Способность двух штаммов к окислению нефти в почве изучали в условиях искусственной модели экосистемы. Для этого использован метод молярности этаноловых капель, который применяется для изучения гидрофобных свойств почвы и определения общего содержания углеводородов нефти в почве.

Для установления зависимости между молярностью этаноловых капель, проникающих в почву, и общим содержанием в ней углеводородов нефти использовали чашки Петри, в которые помещали почвенные образцы и вносили нефть из расчета 5, 10, 15, 20 и 25 мг/г. Чашки закрывали и оставляли при комнатной температуре в течение 72 часов. Затем на поверхность почвы в чашках наносили капли этилового спирта различной молярности и наблюдали за скоростью впитывания капли в почву в течение 10 секунд. На основании полученных данных построен калибровочный график.

В экспериментах по определению степени биодеструкции нефти исследуемыми штаммами по 20 г почвы вносились в 10 чашек Петри и стерилизовали при 165-170° С в течение 2 часов. Затем в чашки с почвой вносили нефть в тех же концентрациях нефти на 1 грамм почвы и засевали штаммами УОМ Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУ 10. Чашки засевали из расчёта 108 кл/г почвы и с открытыми крышками помещали в термостат при температуре 30°С. Контроль за степенью разложения нефти проводили в течение 70 суток после начала эксперимента.

Результаты опытов показали, что биодеструкция наблюдалась при концентрациях нефти меньше 15 мг/г. При содержании нефти в почве 5 мг/г штамм Pseudomonas sp. ТУ 10 наиболее активно окислял углеводороды нефти, и на 63 сутки эксперимента их концентрация снижалась до значений, которые не удавалось обнаруживать данным методом. Bacillus sp. ТУ22 при содержании нефти 5 мг/г обладал несколько меньшей углеводородокисляющей активностью. При более высоких концентрациях данным методом деградацию нефти зарегистрировать не удалось (табл.2).

Нефть оказывает токсическое воздействие на почву и вызывает негативные последствия для организмов, которые обитают в почве, в том числе и для растений.

Таблица 2 - Степень биодеструкции нефти в почве штаммами УОМ

Начальная концентрация нефти в почве, мг/г Степень биодеструкции нефти в почве, в % от начальной концентрации

Pseudomonas sp.T У10 Bacillus sp. ТУ22 ■ :

5 100 92

10 58 61

15 21 27 '

Одним из методов определения фитотоксичности почв является метод проростков, который основан на реакции тест-культур на содержание в почве различных загрязнителей (в том числе и нефти) и позволяет выявить токсичное (ингибирующее) действие поллютанта на проростки тест-культур.

Выращивание растений в нефтезагрязнённой почве проводили с использованием контейнеров с почвой. Для этого в опытные контейнеры вносили нефть в концентрации 5 мг/г почвы. Затем добавляли суспензию штаммов УОМ как в отдельности, так и в виде ассоциации в концентрациях ЗТО7 - 108 кл/мл. В качестве контроля использовалась почва без нефти и штаммов-нефтедестукторов. Все варианты опыта и контроля продолжались в течение 21 дня при комнатной температуре и влажности грунта 50-60%, после чего в контейнеры были внесены семена редиса. Наблюдения за проростками проводили в течение двух недель. Об остаточной фитотоксичности судили по всхожести семян редиса.

Анализ всхожести семян редиса показал, что лучше всего семена прорастали в опытах, где в качестве нефтедеструктора использовался штамм Bacillus sp. ТУ22. В случаях, где в контейнеры с нефтезагрязнённой почвой был внесён только штамм Pseudomonas sp. ТУ 10, всхожести семян не наблюдалось. В контейнерах, куда добавляли в почву микробную ассоциацию из штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 всхожесть семян была невысокой -25%.

Таким образом, методом биотестирования на остаточную фитотоксичность удалось установить, что штамм Bacillus sp. ТУ22 эффективно снижает токсическое воздействие содержащейся в почве нефти, тогда как у Pseudomonas sp. ТУЮ подобного действия не отмечено.

Конструирование установки для глубинного культивирования микроорганизмов

При получении микробной биомассы и продуктов микробного синтеза используются различные установки для культивирования микроорганизмов. Однако известные промышленные и лабораторные установки не всегда обеспечивает надёжную защиту окружающей среды от бактериальных аэрозолей, непременно образующихся в результате искусственной аэрации, необходимой для насыщения питательной среды кислородом. Особое значение проблема биологической защиты приобретает при выращивании условно патогенных

микроорганизмов, среди которых встречаются углеводородокисляющие виды. В связи с этим, в процессе настоящей работы сконструирована установка, оснащённая вакуумным насосом, подключённым к патрубкам отвода воздуха и отбора проб, системой очистки отработанного воздуха, состоящей из ёмкостей с дезинфицирубщими растворами, при этом указанные патрубки и патрубок для подачи инокулята снабжены клапанами. Установка предотвращает попадание бактериальных аэрозолей в окружающую среду и обеспечивает высокую степень экологической и биологической безопасности. Разработанная установка утверждена Федеральной службой но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и рекомендована для проведения процессов глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности.

ВЫВОДЫ

1. Изучены выделенные из нефтешлама углеводородокисляющие микроорганизмы, которые на основании тинкториальных, морфологических, культуральных и биохимических свойств идентифицированы как Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУЮ.

2. Показано, что на развитие идентифицированных штаммов благоприятно влияла принудительная аэрация и слабощелочная реакция питательной среды. Добавление в среду перфторированных органических соединений углерода в условиях аэрации обеспечивало наиболее высокую концентрацию биомассы псевдомонад, тогда как в отношении бацилл эти соединения стимулирующим действием не обладали. Оптимальной для развития штамма Bacillus sp. ТУ22 оказалась температура 30° С, а для Pseudomonas л/л ТУ 10 37° С.

3. Определена способность штаммов расти в среде, содержащей морскую соль и нефть в качестве единственного источника углерода и энергии. Выявлено, что из двух изучаемых микроорганизмов галофильным оказался лишь Pseudomonas sp. ТУЮ. Штамм размножался в среде с содержанием соли до 5-10 °/оо, тогда как на другой микроорганизм такие концентрации оказывали ингибирующее действие. Показано позитивное влияние соединений молибдена на рост и развитие изучаемых штаммов. Эффективной для роста Pseudomonas •?/?.ТУ10 оказалась концентрация молибденовокислого аммония 50 мг/л, а для Bacillus sp. ТУ22 - 500 мг/л. Экспериментально обоснована возможность использования и определена оптимальная концентрация (0,5%) мелассы как основы питательной среды для получения биомассы УОМ.

4. Обнаружено, что при росте микробной ассоциации, состоящей из штаммов двух микроорганизмов, Pseudomonas sp. ТУЮ имеет конкурентное преимущество по отношению к Bacillus sp. ТУ22.

5. На основе искусственной модели с использованием метода молярности этаноловых капель определена эффективность бактерий в процессах биореме-диации нефтезагрязненпой почвы. Наиболее эффективно окисление нефти происходило при её концентрации 5 мг/г. Pseudomonas sp. ТУЮ практически полностью разлагал углеводороды нефти в течение 63 суток, а при использовании Bacillus sp. ТУ22 уровень содержания углеводородов снижался

на 92% после 70 суток инокуляции. Однако последний микроорганизм обладал более выраженным детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность.

6. Для эффективного получения биомассы и продуктов микробного синтеза сконструирована установка, обеспечивающая высокую степень экологической и биологической безопасности процессов глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Самыгин, В.М. Конструктивные особенности установки для глубинного культивирования патогенных микроорганизмов / В.М. Самыгин, Т.А. Тришкина, Л.К. Жога, А.Ю. Александров, С.Э. Лекарева // Материалы IX съезда Всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2007. - Т.2. - С.310-311.

2. Александров, А.Ю. Некоторые характеристики штаммов углеводородокис-ляющих микроорганизмов, выделенных из нефтешлама / А.Ю. Александров, И.В. Соколова // Биология - наука XXI века: 11-ая Пущинская школа конференция молодых учёных: сборник тезисов. - Пущино, 2007. - С. 28.

3. Александров, А.Ю. Исследование штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов / А.Ю. Александров // XII Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области, Направление 16 «Архитектура, градостроительство, строительство и экологические проблемы»: тезисы докладов. - Волгоград: ВолгГАСУ, 2008. - С. 22-24.

4. Александров, А.Ю. Углеводородокисляющий штамм бактерий рода Bacillus / А.Ю. Александров, В.М. Самыгин // Приоритетные направления развития науки и технологий: доклады всероссийской научн.-техн. конф. - Тула: Изд-во ТулГУ, 2008. - С. 59.

5. Самыгин, В.М. Конструкция установки для глубинного культивирования аэробных патогенов / В.М. Самыгин, И.В. Владимцева, Т.А. Гришкина, А.Ю. Александров, C.B. Редкозубов // Биотехнология. - 2008. - №2. - С.65-68.

6. Александров, А.Ю. Штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов: идентификация и свойства / А.Ю. Александров // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы междунар. науч. конф. -Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2008. - С.335-337.

7. Александров, А.Ю. Рост углеводородокисляющих микроорганизмов в среде на основе мелассы / А.Ю. Александров, Т.Н.М. Нгуен И XIII Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области, Направление 11 «Биология и география»: сб.науч. материалов. - Волгоград: Изд-во ВГПУ «Перемена», 2009. - С.7-9.

8. Александров, А.Ю. Оценка степени биодеструкции нефти в почве методом молярности этаноловых капель / А.Ю. Александров // Экологические проблемы промышленных городов: сб. науч. трудов. - Саратов, 2009. - 4.1. - С.124-127.

9. Александров, А.Ю. Влияние состава среды и условий культивирования на рост углеводородокисляющих микроорганизмов / А.Ю. Александров // Ло-

моносов-2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология»: тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс, 2009. - С. 155-156.

10. Александров, А.Ю. Характеристика штаммов микроорганизмов, участвующих в процессах биоремедиации / А.Ю. Александров // Вестник Волгоградского государственного университета, Сер. 3 «Экономика. Экология». - 2009. ~ №1 (14).-С. 231-237.

Подписано в печать 29.04.2010 г. Заказ N»229 .Тираж 100 экз. Печ.л. 1,0 Формат 60 х 84 1/6. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Типография ИУНЛ Волгоградского государственного технического университета. 400131, г. Волгоград, ул. Советская, 35

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Александров, Алексей Юрьевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные свойства углеводородов нефти, их воздействие на окружающую среду и методы ликвидации нефтяных загрязнений.

1.2. Углеводородокисляющие микроорганизмы и их роль в процессах биоремедиации.

1.3. Технологические особенности процессов получения микробной биомассы.

Собственные исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Методы идентификации.

2.3. Методы и средства культивирования микроорганизмов.

2.4. Определение концентрации биомассы и параметров роста.

2.5. Определение углеводородокисляющей способности бактерий в природных объектах.

2.6. Методы оценки фитотоксичности загрязненных нефтепродуктами почв.

Глава 3. Идентификация штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов.

Глава 4. Влияние физико-химических факторов на рост и углеводород окисляющую активность микроорганизмов.

4.1. Потребности микроорганизмов в питательных веществах.

4.2. Температура.

4.3. Кислотно-щелочная реакция среды.

4.4. Аэрация.

4.5. Неорганические соли.

4.6. Соединения молибдена.

4.7. Ассоциированные культуры.

4.8. Меласса как субстрат для получения микробной биомассы.

Глава 5. Изучение способности штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов к биоремедиации нефтезагрязненных почв.

5.1. Оценка степени биодеструкции нефтяных загрязнений.

5.2. Определение детоксицирующей эффективности штаммов.

Глава 6. Конструирование установки для глубинного культивирования микроорганизмов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рост и развитие углеводородкисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования"

Актуальность темы. Нефть является одним из самых распространённых загрязнителей окружающей среды. Её разливы вызывают гибель организмов, изменение свойств экосистем и их деградацию. Проблема нефтяного загрязнения приобрела глобальные масштабы в конце XX века. Это связано с тем, что нефть стала самым используемым источником энергии. Потери при современных объёмах добычи нефти исчисляются десятками миллионов тонн в год (Миркин Б.М., Наумова Л.Г., 2001). Процесс самовосстановления биоценозов в регионах, которые подверглись нефтяному загрязнению, занимает весьма продолжительное время и протекает порой в течение 10-25 лет. (Давыдова С.Л., Тагасов В.И., 2004; Киреева Н.А., 2007) .

Из многочисленных методов, которые позволяют уменьшить концентрацию нефти в окружающей среде, наиболее перспективными считаются биологические методы, основанные на естественных процессах разложения нефти в природе, участие в которых принимают углеводородокисляющие микроорганизмы: бактерии, микроскопические грибы и дрожжи (Киреева Н.А., 1994; Коронелли Т.В., 1996; Арене В.Ж. и др., 1999).

Одним из основных направлений биологической очистки от нефтяного загрязнения является стимуляция аборигенной микрофлоры на месте загрязнения (Бельков В.В., 1995). В этом случае большое значение имеют факторы окружающей среды, оказывающие влияния на углеводородокисляющую активность: температура, условия аэрации, обеспеченность элементами питания и кислотность среды (Vidali М., 2001; Миронов О.Г., 2002; Войно Л.И., 2006). Наряду с оптимизацией процессов роста и развития углеводородокис-ляющих микроорганизмов, применяется внесение активных углеводородо-кисляющих микроорганизмов в среду, чаще всего в виде промышленных биопрепаратов. В настоящее время существует большой рынок коммерческих препаратов, но, несмотря на это, продолжается поиск новых штаммов-нефтедеструкторов, обладающих высокой окислительной способностью по отношению к широкому спектру углеводородов нефти. Кроме того, некоторые из углеводородокисляющих микроорганизмов относятся к условно-патогенным видам, поэтому необходимо соблюдение условий безопасности при получении и применении биопрепаратов (Соловьев В.И. и др., 2001). Поэтому пополнение микробной коллекции свежевыделенных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), изучение условий их культивирования и получение биомассы для последующего применения в процессах ликвидации разливов нефти является актуальным.

Основные задачи исследования.

1. Идентифицировать штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенные из нефтезагрязнённой почвы.

3. Определить углеводородокисляющую активность отобранных штаммов и остаточную фитотоксичность почвы в процессах биоремедиации. нефтезагрязнённых объектов.

Научная новизна. Впервые: - идентифицированы выделенные из нефтезагрязнённой почвы два активных штамма-нефтедеструктора, относящиеся к родам Pseudomonas и Bacillus и обладающие различной углеводородокисляющей способностью и детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность; определены закономерности и основные параметры роста выделенных бактерий Psendomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22, установлено влияние состава питательной среды и физико-химических факторов на развитие микробной популяций в условиях глубинного аппаратного культивирования; показано, что метод молярности этаноловых капель может быть успешно применён для оценки углеводородокисляющей способности штаммов в загрязнённых нефтью природных объектов; сконструирована установка, обеспечивающая биологическую и экологическую безопасность процессов глубинного выращивания микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологии получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22. Данные о благоприятном влиянии мелассы, солей молибдена, перфторированных соединений углерода в питательной среде могут быть использованы в биотехнологии для эффективного получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов. Для оценки углеводородокисляющей активности микроорганизмов и определения концентрации нефти в почве пригоден использованный в работе метод молярности этаноловых капель. По материалам диссертационной работы опубликованы методические указания «Изучение скорости потребления кислорода при глубинном культивировании микроорганизмов» (в соавторстве с В.М. Самы-гиным, И.В. Владимцевой и Т.В. Хохловой), которые используются студентами химико-технологического факультета и факультета технологий пищевых производств Волгоградского государственного технического университета на лабораторных занятиях по курсу «Основы биотехнологии». Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии и написании дипломных работ в Волгоградском государственном техническом университете. Разработанная с участием автора установка для культивирования микроорганизмов нашла отражение в методических указаниях МУ 1.3.2411-08 «Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности», утверждённых Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко, 28.07.2008 г.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выделенные из нефтезагрязнённой почвы и идентифицированные как Pseudomonas sp. ТУ 10 и Bacillus sp.TY22 штаммы микроорганизмов потребляют в качестве источника углерода углеводороды нефти и могут быть использованы для очистки природных объектов, загрязнённых нефтью и её продуктами.

2. Использование метода молярности этаноловых капель и теста на фитотоксичность является эффективным средством для оценки углеводоро-докисляющей и детоксицирующей способностью бактерий в загрязнённых нефтью объектах окружающей среды.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных экспериментальных исследований, а также заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 214 наименований, из них 51 иностранных. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Александров, Алексей Юрьевич

104 ВЫВОДЫ

3. Определена способность штаммов расти в среде, содержащей морскую соль и нефть в качестве единственного источника углерода и энергии. Выявлено, что из двух изучаемых микроорганизмов галофильным оказался лишь Pseudomonas sp. ТУЮ. Штамм размножался в среде с содержанием соли до 5-10 %о, тогда как на другой микроорганизм такие концентрации оказывали ингибирующее действие. Показано позитивное влияние соединений молибдена на рост и развитие изучаемых штаммов. Эффективной для роста Pseudomonas sp. ТУЮ оказалась концентрация молибденовокислого аммония 50 мг/л, а для Bacillus sp. ТУ22 - 500 мг/л. Экспериментально обоснована возможность использования и определена оптимальная концентрация (0,5%) мелассы как основы питательной среды для получения биомассы УОМ.

5. На основе искусственной модели с использованием метода моляр-ности этаноловых капель определена эффективность бактерий в процессах биоремедиации нефтезагрязненной почвы. Наиболее эффективно окисление нефти происходило при её концентрации 5 мг/г. Pseudomonas sp. ТУЮ практически полностью разлагал углеводороды нефти в течение 63 суток, а при использовании Bacillus sp. ТУ22 уровень содержания углеводородов снижался на 92% после 70 суток инокуляции. Однако последний микроорганизм обладал более выраженным детоксицирующим действием в тестах на фитотоксичность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нефтяное загрязнение окружающей среды является одной из острейших экологических проблем современности. Это связано с тем, что в конце XX века нефть стала основным энергетическим ресурсом для человечества. Разливы нефти происходят при добыче, транспортировке и переработке и приводят к загрязнению почв и природных вод.

Методы ликвидации нефтяных розливов чрезвычайно разнообразны и отличаются друг от друга в зависимости от среды, в которую попала нефть, от средств, которые применяются при очистке. Выделяют следующие методы ликвидации нефтяных загрязнений окружающей среды: механические, физико-химические и биологические. Они могут применяться как по отдельности, так и в комплексе. Механические методы в настоящее время часто используются на первичном этапе ликвидации розливов нефти, особенно при загрязнении водного бассейна. Недостатком этих методов является довольно высокая остаточная концентрация нефти. Физико-химические методы очень разнообразны и включают в себя и сжигание, и использование сорбентов и диспергентов, а также различных загустителей и гелеобразователей. Однако в этих случаях побочные продукты, образующиеся при очистке, зачастую более токсичны, чем сама нефть, и возникают трудности в сборе и утилизации применяемых нефтеочищающих агентов.

Биологические методы основаны на естественных процессах разложения нефти в природе и поэтому являются из всех самыми экологичными. Живые организмы, а в основном это бактерии, микроскопические грибы, дрожжи, а также растения и некоторые животные, способны окислять углеводороды нефти в процессе своей жизнедеятельности. Биологические методы ликвидации загрязнений часто объединяют под термином «биоремедиация».

В зависимости от того, применяются ли технологии непосредственно в месте загрязнения или вне его все методы биоремедиации делят на методы in situ и ex situ [23]. Метод in situ более распространён и делится, в свою очередь, на биостимуляцию и биоаугментацию.

Микроорганизмы-деструкторы нефти являются естественными обитателями биоценозов различных сред: почвы и других грунтов, пресных и морских вод, донных отложений.

В настоящее время известны около 70 родов микроорганизмов, которые способны к окислению углеводородов нефти: 28 родов бактерий, 19 родов дрожжей, 20 родов актиномицетов и микроскопических грибов [22,56].

Биодеградация нефти в окружающей среде зависит от множества факторов, которые оказывают влияние на рост и развитие УОМ. Основными природными факторами, оказывающими влияние на активность УОМ, являются температура, обеспеченность элементами минерального питания, условия аэрации и водородный показатель среды (рН).

Для очистки от нефтяного загрязнения в настоящее время широкое применение нашли микробные биопрепараты, которые представляют собой выращенные на питательных средах в ферментёрах в условиях глубинного культивирования высокоактивные штаммы чистых или смешанных культур УОМ. С учетом различной способности окислять углеводороды нефти круг этих микроорганизмов и изучение их биологических свойств продолжает постоянно расширяться.

Первым этапом исследований стала идентификация двух из 25 находящихся в коллекции ВолгГТУ штаммов УОМ, которые в предварительных опытах проявили наибольшую углеводородокисляющую активность. Определение таксономического положения микроорганизмов проводили на основе изучения тинкториальных, культуральных, морфологических и биохимических свойств.

При бактериоскопии мазков одного из штаммов наблюдались отдельно или цепочками расположенные палочки, которые положительно окрашивались по Граму. На плотных питательных средах микроорганизм формировал плоские, мелкоморщинистые, матовые, шероховатые колонии белого цвета. В жидких питательных средах образовывалась слабая мутность, а на поверхности появлялась плотная плёнка. Изучаемый микроорганизм обладал ката-лазной активностью и способностью образовывать споры в неблагоприятных условиях окружающей среды. Штамм был отнесён к роду Bacillus и в дальнейших исследованиях он был обозначен как Bacillus sp. ТУ22.

Другой микроорганизм представлял собой грамотрицательные палочки, на плотных средах формировал выпуклые, гладкие, блестящие колонии белого цвета. В жидких питательных средах через 24-48 ч наступало равномерное помутнение, образовывался осадок, а на поверхности тонкая сероватого цвета пленка. Микроорганизм обладал подвижностью, оксидазной, каталазной, уреазной и аргининдигидролазной активностью, окислял, но не ферментировал глюкозу, образовывал индол, тесты на лизин и орнитинде-карбоксилазу были отрицательны. На основании перечисленных признаков штамм был отнесен к роду Pseudomonas и в дальнейшем получил название Pseudomonas sp. ТУЮ.

Следующим этапом исследований было изучение влияния состава среды и условий культивирования на рост штаммов УОМ.

Существует значительное количество различных питательных сред для культивирования УОМ, большинство из которых являются синтетическими средами, состоящими из солей и содержащими нефть или нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии. Нами было исследовано несколько синтетических сред, содержащих в качестве субстратов углеводороды нефти, с целью выяснения их пригодности для культивирования штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22. Испытаны три варианта: среда Гафарова(состав г/л: ((NH4)2S04 - 1,0; MgS04 - 1,0; NaCl - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,05), среда Рахимовой (состав г/л: NH4CI — 0,5; КН2Р04 - 1,5) и среда 8Е (состав г/л: (NH4)2HP04 - 1,5; КН2Р04 - 0,7; MgS04-7H20 - 0,8; NaCl — 0,5). Из трех вариантов наиболее подходящей для изучения физиологии

Bacillus sp. ТУ22 оказалась среда Гафарова, в которой концентрация бактеft —— рий через 2 суток составляла 1,2-10 КОЕ/мл. Для Pseudomonas sp. ТУЮ предпочтительнее была среда Рахимовой, в которой через сутки вырастало о до 1,6-10 КОЕ/мл. Среда 8Е не обеспечивала надежного роста обоих микроорганизмов, поэтому в дальнейших опытах по исследованию роста и размножения штаммов УОМ были использованы первые две среды.

Дальнейшие исследования были направлены на определение влияния физико-химических факторов на рост и углеводородокисляющую активность двух микроорганизмов.

При изучении влияние температуры на развитие бактерий было установлено, что экстремально низкая (Ю°С) и высокая (42°С) температуря угнетают рост обоих штаммов. Оптимальной температурой для культивирования штамма Pseudomonas sp. ТУЮ оказалась 37°С, а для штамма Bacillus sp. ТУ22 - 30°С.

Влияние величины рН на рост штаммов УОМ изучали при слабокислой (рН=6,8±0,1) и слабощелочной (рН=7,2±0,1) реакциях среды. Выяснилось, что максимальная концентрация биомассы штамма Bacillus sp. ТУ22 при выращивании в среде с рН=7,2±0,1 была выше в 8 раз, а у штамма Pseudomonas sp. ТУЮ в 3,5 раза, чем в среде с рН=6,8±0,1. Таким образом, оба штамма при слабощелочной реакции среды росли интенсивнее, чем в среде со слабокислой реакцией.

Для бактерий, выращиваемых в жидких средах, кислород может быстро стать лимитирующим фактором, если не принимаются специальные меры, обеспечивающие его постоянную подачу и растворение в среде во время роста бактерий. Вместе с тем хорошо известно, что некоторые химические соединения обладают способностью растворять аномально высокие концентрации газов при обычном барометрическом давлении, что благотворно влияет на рост микроорганизмов, а также на разрушение микроорганизмами ксенобиотиков [5]. Среди таких соединений особое место занимают перфторированные углероды. В связи с этим были проведены исследования роста в различных условиях аэрации: в одном случае аэрация жидкой питательной среды осуществлялась за счет искусственно нагнетаемого воздуха и перемешивания среды с помощью магнитной мешалки, в другом - воздух в культуральный сосуд не подавали. В третьем варианте в аэрируемую среду добавляли перфтортрибутиламин как представитель перфторированных органических соединений углерода (ПФОС). Результаты опытов показали, что при культивировании Bacillus sp. ТУ22 наибольший прирост биомассы наблюдался в условиях аэрации. Добавление в среду ПФОС не оказывало на рост штамма стимулирующего воздействия, скорее наоборот, наблюдалось угнетение роста изучаемой культуры. Наибольшая концентрация биомассы Pseudomonas sp. ТУЮ наблюдалась в условиях аэрации с добавлением пер-фторуглерода, хотя некоторые из показателей роста этого штамма были более высокими в опытах без добавления ПФОС.

Как известно, аварийные ситуации, связанные с розливом нефти нередко происходят при транспортировке на морских танкерах, в результате чего нефть загрязняет окружающую среду. С учетом этого обстоятельства была изучена способность роста двух штаммов в среде с высоким содержанием морских солей и нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Эксперименты проводились в средах с различной концентрацией морской соли: 5%о, 10%о, 35%о, 50%о. Из двух микроорганизмов лишь Pseudomonas sp. ТУЮ проявлял некоторые галофильные свойства и обладал способностью размножаться в содержащей морскую соль среде. Наиболее заметное размножение клеток наблюдалось в среде, содержащей морскую соль в количестве 5%о, хотя процессы развития микробных популяций происходили и при более высоких концентрациях (10%о). У штамма Bacillus sp. ТУ22 в этих условиях, наоборот, происходило постепенное отмирание клеток. Поэтому для биоремедиации нефтезагрязнённых морских вод Северного Каспия возможно применение штамма Pseudomonas sp. ТУЮ, тогда как использование другого штамма малоперспективно.

Помимо солей, содержащихся в морской воде, на рост и размножение УОМ было исследовано влияние неорганической соли молибдена - микроэлемента, который усиливает синтез аминокислот и улучшает накопление азота, необходим для синтеза и передвижения углеводов, использования фосфора [78]. Кроме того, у факультативных анаэробов, среди которых встречаются представители двух изучаемых родов, молибден входит в состав нитратредуктазы - фермента, регулирующего процессы нитрат-нитритного дыхания, при котором нитраты могут быть использованы в качестве альтернативных акцепторов электронов [43].

В экспериментах по изучению влияния молибдена на рост штаммов УОМ препарат добавляли в питательную среду в виде молибденовокислого аммония в концентрациях: 5,50 и 500 мг/л. Наиболее эффективной для роста Pseudomonas sp. ТУЮ оказалась концентрация молибдата аммония 50 мг/л, а для Bacillus sp. ТУ22 - 500 мг/л.

Использование микробных ассоциаций, по сравнению с отдельными штаммами, позволяет более интенсивно и полно утилизировать нефть и нефтепродукты, и поэтому они широко применяются для биоремедиации нефте-загрязненных объектов. В серии опытов выращивание двухкомпонентной культуры проводили в ферментёре в трёх вариантах, которые различались соотношениями посевных доз бактерий. В первом варианте концентрация о микроорганизмов в посевной дозе была одинаковой — по 10 кл/мл, во втором и третьем вариантах посевная доза одного микроорганизма по отношению к другому была в 10 раз больше. Оказалось, что во всех случаях происходило ингибирование роста Bacillus sp. ТУ22 и уменьшение концентрации бактерий к концу опытов в 500-1000 раз. Вместе с тем, в двухкомпонентной культуре наблюдалось размножение Pseudomonas sp. ТУЮ. Причем наиболее высокая урожайность биомассы псевдомонад отмечена при равном соотношении двух видов бактерий в посевной дозе. В этом случае концентрация достигала о

2,73-10° КОЕ/мл и наблюдалась через 12 часов после начала эксперимента. В других вариантах биомасса Pseudomonas sp. ТУЮ в течение всего эксперимента не превышала начальную концентрацию. Следовательно, использование штаммов Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 в виде ассоциированной культуры для биоремедиации нефтезагрязненных объектов представляется малоперспективным.

Для получения микробной биомассы в лабораторных и промышленных условиях необходимо, прежде всего, обеспечить клетки необходимыми элементами питания. С экономической точки зрения наиболее выгодно использовать для этих целей различные отходы пищевой промышленности, богатые углеводами, в том числе мелассу, представляющую собой побочный продукт сахарной промышленности, который состоит из 40-55% сахарозы и 8-13% зольных веществ [41]. В настоящей работе исследована возможность использования мелассы в качестве субстрата и её оптимальная концентрация в питательной среде для получения биомассы УОМ. Экспериментальные исследования показали, что штаммы Pseudomonas sp. ТУЮ и Bacillus sp. ТУ22 способны расти и эффективно размножаться в питательной среде на основе мелассы. Оба микроорганизма активно размножались при содержании мелассы в среде 0,1-1%, а наиболее активный рост наблюдался при её содержании 0,5%. В условиях глубинного аппаратного культивирования максимальная концентрация микробной биомассы превышала посевную дозу для Pseudomonas sp. ТУЮ — в 167 раз, а для Bacillus sp. ТУ22 — в 580 раз. Таким образом, следует считать, что меласса является подходящей основой питательной среды, которая обеспечивает интенсивный рост глубинной культуры с целью эффективного получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов.

В последующих опытах предстояло определить, насколько эффективны штаммы Bacillus sp. ТУ22 и Pseudomonas sp. ТУЮ в процессах биоремедиации нефтезагрязнённых объектов. Для этого изучили способность двух штаммов к окислению нефти в почве в условиях искусственной модели экосистемы, используя molarity of ethanol droplet (MED) метод или метод моляр-ности этаноловых капель [196]. Метод основан на проникновении в почву капель этанола различной молярности в зависимости от концентрации в ней углеводородов нефти и используется для определения общего содержания углеводородов нефти в почве [189]. Было установлено, что биодеструкция нефти происходит при содержании углеводородов не более 15 мг в 1 г почвы. Однако наиболее эффективно окисление нефти микроорганизмами наблюдалось при её концентрации 5 мг в 1 г почвенного образца. Причем штамм Pseudomonas sp. ТУЮ практически полностью разлагал углеводороды нефти на 63 сутки. С увеличением концентрации нефти в почве окисляющая активность штаммов падала: при содержании нефти в количестве 10 мг/г примерно в 1,5 раза, а при 15 мг/г - в 4-4,5 раза.

Экологическая безопасность при загрязнении природных объектов нефтью и её продуктами во многом сопряжена с токсическими свойствами углеводородов, их влиянием на окружающую флору и фауну. Для оценки фитотоксичности почв существуют различные методы, среди которых часто используют метод проростков, который основан на реакции тест-культур на содержание в почве химических загрязнений и позволяет выявить токсичное действие поллютанта на проростки тест-культур [91]. В настоящей работе исследована детоксицирующая способность штаммов УОМ. В качестве тест-культуры были отобраны семена редиса Raphanus sativus L. var. sativus сорта «Красный с белым кончиком», т.к. по сравнению с другими объектами он обладает наиболее высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры [50]. Степень фитотоксичности нефтезагрязнённой почвы оценивали по всхожести семян редиса. С помощью метода биотестирования на остаточную фитотоксичность удалось установить, что шт. Bacillus sp. ТУ22 эффективнее всего снижает токсическое воздействие содержащейся в почве нефти, тогда как у Pseudomonas sp. ТУЮ подобного действия не отмечено.

Среди углеводородокисляющих микроорганизмов часто встречаются штаммы, обладающие различной степенью патогенности, поэтому при получении их биомассы необходимо соблюдать меры биологической безопасности. Это обстоятельство предопределило необходимость разработки конструкции ферментера, обеспечивающего биологическую безопасность при проведении процессов глубинного культивирования. Известные к настоящему времени установки для глубинного культивирования предусматривают главным образом эффективное получение целевого продукта при соблюдении соответствующих правил асептики на различных этапах биотехнологического цикла. Нами была сконструирована установка, предотвращающая попадание в окружающую среду бактериальных аэрозолей. Суть разработки заключается в том, что в предлагаемой конструкции весь процесс выращивания, начиная с внесения инокулята и заканчивая отбором проб бульонной культуры, осуществляется в условиях разрежения воздуха, создаваемого при помощи вакуумного насоса. Кроме того, установка оснащена двухкаскадной системой очистки воздуха от бактериальных аэрозолей в виде емкостей с дезинфицирующими растворами, а основные узлы помещены в бокс биологической безопасности. Установка проверена в соответствующих испытаниях и может быть использована для глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александров, Алексей Юрьевич, Волгоград

1. Азотно-фосфорное удобрение для стимуляции биодеградации нефтяных углеводородов в морской среде / В.В. Ильинский и др. // Вестник МГУ. Сер. 16. Биология. 1991. - № 2. - С. 63-67.

2. Аиба, Ш. Биохимическая технология и аппаратура / Ш. Аиба, А. Хемфри, Н. Миллис. М.: Пищ. пром-ть, 1975. - 287 с.

3. Артемов, А.В. Современные технологии очистки нефтяных загрязнений /А.В. Артёмов. // Нефть. Газ. Промышленность. — 2004. №4. - С. 17.

4. Аушева, Х.А. Разработка технологии рекультивации нефтезагрязнённых объектов с использованием комплекса микробиологических препаратов: дис. .канд. техн. наук: 03.00.23 / Х.А. Аушева. — М., 2007. — 164 с.

5. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03: Введ. 25.06.2003. М: Минздрав России, 2003. - 152 с.

6. Бекер, М.Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Бекер. М.: Пищ. пром-ть,1978.-231 с.

7. Белоусова, Н.И. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах / Н.И. Белоусова, А.Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40.-№3.-С. 312-316.

8. Биккинина А.Г. Разработка технологии рекультивации нефтезагрязненных объектов с использованием комплекса микробиологических препаратов: дис. .канд. биол наук: 03.00.23 / А.Г. Биккинина. — Уфа, 2007. — 113 с.

9. Биогеохимические основы экологического нормирования / отв. ред. М.В.Иванов, В.Н.Башкин, В.В.Снакин. -М.: Наука, 1993. 304 с.

10. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде / JI.M. Барышникова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т.37. -№5. - С. 542-548.

11. Биоремедиация отходов нефтехимического производства с использованием компостирования / Е.В. Никитина и др. // Биотехнология. 2006. -№1. —С. 53-61.

12. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука, 1985. - 293 с.

13. Богдашкина, В.И. Экологические аспекты загрязнения водной среды нефтяными углеводородами, пестицидами и фенолами / В.И. Богдашкина // Экологическая химия водной среды / В.И. Богдашкина, B.C. Петросян. — М.: Институт химфизики АН СССР, 1988. С. 62-72.

14. Бойко, Е.В. Химия нефти и топлив / Е. В. Бойко. Ульяновск: УлГТУ, 2007.- 60 с.

15. Болгова, И.В. Таблица Менделеева в живых организмах / И.В. Болгова, И.А. Шапошникова, Р.А. Фандо // Биология. 2008. -№10. - С.6-7.

16. Большаков. Г.Ф. Сераорганические соединения нефти / Г.Ф. Большаков. -Новосибирск: Наука, 1986. 243 с.

17. Большаков, Г.Ф. Азоторганические соединения нефти / Г.Ф. Большаков. -Новосибирск: Наука, 1988. -215 с.

18. Брылёв В.А. География Волгоградской области / В.А. Брылёв, Ф.И. Жбанов, Ю.П. Самборский. Волгоград: Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1989. - 128 с.

19. Бурдынь, Т.А. Химия нефти, газа и пластовых вод / Т.А. Бурдынь, Ю.Б. Закс-М.: Недра, 1978. 278 с.

20. Вельков, В.В. Биоремедиация: принипы, проблемы, подходы / В.В. Бельков // Биотехнология. -1995. №3-4. - С. 20-27.

21. Вельков, В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации / В.В. Вельков // Биотехнология. — 2001. — №2. С. 70-76.

22. Вербина, Н.М. Микробиология пищевых производств / Н.М. Вербина, Ю.В. Каптерева. -М.: Агропромиздат, 1988. 256 с.

23. Виестур, У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур, М.Ж. Критапсонс, Е.С. Былинкина. М.: Пищ. пром-ть, 1980. - 232 с.

24. Винаров, А.Ю. Лабораторные и промышленные ферментёры / А.Ю. Ви-наров, А.А. Кухаренко, В.И. Панфилов. М.: РХТУ им Д.И. Менделеева, 2004.-97 с.

25. Влияние закачки аэрированных растворов минеральных солей на микрофлору воды призабойных зон нагнетательных скважин нефтяных месторождений / А.З. Гарейшина и др. // Микробиология. — 1991. Т. 60. — № 4.-С. 741 -745.

26. Войно Л.И. Биодеградация нефтезагрязнений почв и акваторий / Л.И. Войно // Фундаментальные исследования. — 2006. №5. - С. 68-70

27. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. — 252 с.

28. Володина, Г.Б., Якунина И.В. Общая экология: лабораторный практикум / Г.Б. Володина, И.В. Якунина. Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2005. -104 с.

29. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти / И.А. Пырченкова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т.42. - №3. - С.298-305.

30. Высоцкий, В.И. Мировые ресурсы нефти и газа и их освоение / В.И. Высоцкий, А.Н. Дмитриевский // Российский химический журнал. 2008. — Т. 52.-№6.-С. 18-25.

31. Габбасова, И.М. Деградация и рекультивация почв Южного Приуралья: автореф. дис. .докт. биол. наук: 03.00.27 / И.А. Габбасова.— М., 2001. — 45 с.

32. Габбасова, И.М. Использование биогенных добавок совместно с препаратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв / И.М. Габбасова, P.P. Сулейманов, Т.Ф. Бойко // Биотехнология. 2002.— №2. - С. 57 - 65.

33. Горохова, А.А. Методы рекультивации нефтезагрязнения / А.А. Горохова // Экология и безопасность в техносфере: материалы Всероссийской научно-технической интернет конференции, ОрелГТУ. Орел: ОрелГТУ, 2009. - С. 26-28.

34. Гриневич, А.Г. Техническая микробиология / А.Г. Гриневич, A.M. Босен-ко. Мн.: Выш.шк., 1986. - 168 с.

35. Голубовская, Э.К. Биологические очистки сточных вод. / Э.К. Голубов-ская. — М.: Высшая школа, 1978. — 186 с.

36. Готтшлак, Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшлак. М.: Мир, 1982. — 310 с.

37. Губкин, И.М. Учение о нефти / И.М. Губкин. М.: Наука, 1975. - 384 с.

38. Гусев, М.В. Нефтяное загрязнение и микрофлора морских экосистем / М.В. Гусев, Т.В. Коронелли, В.В. Ильинский // Человек и биосфера. -1980.-Вып. 5.-С. 36-52.

39. Гусев, М.В. Микробиология: учебник для студ. биол. спец. вузов / М.В. Гусев, JI.A. Минеева. М.: «Академия», 2003 - 464 с.

40. Давыдова, C.JI. Нефть как топливный ресурс и загрязнитель окружающей среды / C.JI. Давыдова, В.И. Тагасов. М.: Изд-во Рос. ун-та дружбы народов, 2004.-131 с.

41. Демьяненко, А.Ф Микробиологическая очистка грунтов от нефтепродуктов в закрытых реакторах изотермического типа / А.Ф. Демьяненко, Н.С. Мизгирев // Вестник ВНИИЖТ. 2005. - № 5. - С. 30-32.

42. Домарадский, И.В. Очерки микологии для экологов / И.В. Домарадский, Н.Б. Градова. М.: Истоки, 2007 - 86с.

43. Дубинин, Н.П. Мутагенез и окружающая среда / Н.П. Дубинин, Ю.В. Па-шин. -М.: Наука, 1978. 128 с.

44. Егоров, H.C. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов / Н.С. Егоров, Н.С. Ландау // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. - Т.18. - № 6. - С. 835-849.

45. Жуков Д.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Д.В. Жуков, В.П. Мурыгина, С.В. Калюжный // Успехи современной биологии, 2006.— Т. 126. — №3. С. 285-296.

46. Жукова, А.Э. Новые подходы к решению экологических проблем утилизации и дезактивации органических веществ / А.Э. Жукова // Учёные записки Таврического национального университета; Серия: География. -2001.-Т. 14. -№1. — С.51-54.

47. Изгорева, Т.И. Интенсивность расщепления нефти и нефтепродуктов микроорганизмами Баренцева моря / Т.И. Изгорева, Ю.Р. Налбандов // Биология шельфа. Владивосток, 1975. - С. 64.

48. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов ароматических соединений в нефтешламах в процессе их обезвреживания в проточном биореакторе / А.Б. Гафаров и др. // Прикладная биохимия и микробиология 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 180-186.

49. Изменчивость популяционных параметров: адаптация к токсическим факторам среды / B.C. Безель и др. // Экология. 2001. - Т.36. - С. 447453.

50. Изучение микробиологического окисления дизельного топлива методом полного факторного эксперимента / М.В. Гусев и др. // Микробиология. -1980.-Т. 49.-Вып. 1.-С. 25-30.

51. Изучение скорости потребления кислорода при глубинном культивировании микроорганизмов / В.М. Самыгин и др. Волгоград: Изд-во ВолгГ-ТУ , 2008. - 12 с.

52. Ильина, Е.Г. Разработка технологии биоочистки нефтяных и буровых отходов: дис. . .канд. техн. наук: 03.00.23 / Е.Г. Ильина Уфа, 2002. - 145 с.

53. Илюхин, В.И. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei / Илюхин В.И. , Замараев B.C., Каплиев

54. B.И. // Мелиоидоз: сб. науч. тр. — Волгоград: Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1995. С. 8-26.

55. Инструкция по эксплуатации к аппарату фирмы New Brunswick «Bioflo, model С 30». США, 1973.—28 с.

56. Интенсификация роста нефтеокисляющие микроорганизмов / И.В. Соколова и др. // Известия ТулГУ. Серия Экология и рациональное природопользование 2006. - Вып. 2. - С. 37-43.

57. Исмаилов, Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов в почве, иноку-лированной дрожжами / Н.М. Исмаилов // Микробиология.—1985.—Т. 54. -Вып. 5.—С. 835-841.

58. Исмаилов, Н.М. Биодинамика загрязненных нефтью почв / Н.М. Исмаилов, Ю.И. Пиковский. // Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах. JL, 1985. - С. 43-54.

59. Исмаилов, Н.М. Микробиологическая и ферментативная активность в нефтезагрязненных почвах / Н.М. Исмаилов. // Восстановление нефтезаг-рязненных почвенных экосистем / Под ред. Глазовской М.А. — М.: Наука, 1988.-С. 42-56.

60. Использование микроорганизмов в биотехнологии повышения нефтеизв-лечения / С.С. Беляев и др. // Микробиология. 2004. - Т. 73. - № 5. - С. 687-697.

61. Калюжный, С.В. Биотехнология защиты окружающей среды: единство биокаталитических и инженерных подходов /С.В. Калюжный // Известия Академии наук. Серия химическая. 2001. - №10. - С. 1735-1742.

62. Каменщиков, Ф.А. Нефтяные сорбенты / Ф.А. Каменщиков, Е.М. Богомольный. — Москва-Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2005.-268 с.

63. Камьянов, В.Ф. Гетероатомные компоненты нефтей / В.Ф. Камьянов, Р.С. Аксенов, В.И. Титов. Новосибирск: Наука, 1983. — 237 с.

64. Кабиров, P.P. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для оценки токсичности почвенного покрова городской территории/ P.P. Кабиров, А.Р. Сагитова, Н.В. Суханова // Экология.—1997.— № 6.— С. 408-411.

65. Кафаров, В.В. Моделирование биохимических реакторов / В.В. Кафаров, А.Ю. Винаров, JI.C. Гордеев. — М.: Лесная промышленность, 1979. 344 с.

66. Квасников, Е.К. Микроорганизмы — деструкторы нефти в водных бассейнах / Е.К. Квасников, Т.М. Клюшникова. — Киев: Наук, думка, 1981. 132 с.

67. Киреева, Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах / Н.А. Киреева. Уфа, 1994. - 171 с.

68. Киреева, Н.А. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве / Н.А. Киреева // Биотехнология. 1995. - №5-6. - С. 32-35.

69. Киреева, Н.А. Комплексное биотестирование нефтезагрязненных почв / Н.А. Киреева, Т.Р. Кабирова, И.Е. Дубовик // Теоретическая и прикладная экология. 2007. - №1. - С. 25-28.

70. Киреева, Н.А. Изучение возможностей ускорения деструкции нефти в почвах / Н.А. Киреева, И.Е. Дубовик, З.Н. Сайфуллина // Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде: тезисы докл. всес. совещ. — Уфа, 1985.-С. 85-88.

71. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем. М.: Мир, 2000. - 469 с.

72. Коронелли, Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов / Т.В. Коронелли // Успехи микробиологии. 1980. - №15. — С. 99-111.

73. Коронелли, Т.В. Роль эмульгирования в процессе поглощения углеводородов клетками Pseudomonas aerugenosa / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, А.В. Игнатенко // Микробиология. 1983. - Т.52, №1. - С.94-97.

74. Коронелли, Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов / Т.В. Коронелли. -М.: Изд-во МГУ, 1984. 160 с.

75. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т.32. - №6. — С.579-585.

76. Красильников, Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов / Н.А. Кра-сильников. -М.: Академия наук СССР, 1949. 829 с.

77. Красильников, Н.А. Усвоение н-алканов и сырой нефти морскими бактериями / Н.А. Красильников, А.В. Цыбань, Т.В. Коронелли // Океанология. -1973.- № 5. С.37-46.

78. Красильников, Н.А. Парафиноокисляющие микобактерии / Н.А. Красильников, Т.В. Коронелли // Жизнь растений: в 6 т. Под ред. АЛ. Тахтаджяна.- М.: Просвещение, 1982. Т.1. - С. 135-141.

79. Кураков, Л. И. Современные ландшафты и хозяйственная деятельность / Л. И. Кураков. -М.: Просвещение, 1983. 159 с.

80. Кушелев, В.П. Охрана труда в нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности / В.П.Кушелев, Г.Г. Орлов, Ю.Г. Сорокин. М.: Химия, 1983.-472 с.

81. Литвиненко, С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов / С.Н.Литвиненко -М.: Химии, 1977. 144 с.

82. Лозановская, И.Н. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении / И.Н. Лозановская, Д.С. Орлов, Л.К. Садовникова. М.: Высшая школа, 1998.-287 с.

83. Медицинские аспекты и санитарно-гигиеническая оценка бактериальных препаратов, применяемых для борьбы с нефтяным загрязнением водоемов / В.И. Соловьев и др. // Вода и здоровье —2001: сб. науч. статей. Одесса: ОЦНТЭИ, 2001. - С. 195 - 200.

84. Мероприятия по защите береговой полосы на учениях "Калининград 2004" Электронный ресурс. // Nordragmet: технологии и средства ликвидации разливов нефти и нефтепродуктов. URL: http://www.nordragmet.ru/article3.html (дата обращения: 27.04.2009).

85. Микробиология — в помощь микробиологу Электронный ресурс. URL: http://microbiologu.ru (дата обращения: 26.05.2009)

86. Микроорганизмы и охрана почв / под. ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1989.-206 с.

87. Миркин, Б.М. Экология России / Б.М. Миркин, Л.Г. Наумова. М.: Устойчивый мир, 2001. - 272 с.

88. Миронов, О.Г. Нефтеокисляющие микроорганизмы в море / О.Г. Миронов. Киев: Изд-во Наукова думка, 1971. - 234 с.

89. Миронов, О.Г. Бактериальная трансформация нефтяных углеводородов в прибрежной зоне моря / О.Г. Миронов // Морской экологический журнал. -2002.-№1.-С. 56-66.

90. Молотков, И.В. Фиторемедиация / И.В. Молотков, В.А. Касьяненко. // Нефть. Газ. Промышленность. — 2005. — №1. С. 17-18.

91. Морозов, Н.В. Влияние условий среды на развитие нефтеразлагающих микроорганизмов / Н.В. Морозов, В.Н. Николаев // Гидробиологический журнал. — 1978. — Т. 14. №4. — С. 55-61.

92. Мурзаков, Г.Б. Биотехнология очистки нефтезагрязненных территорий / Г.Б. Мурзаков, М.Б. Битеева, Г.Н. Морщакова // Защита окружающей среды, утилизация отходов, очистка сточных вод и выбросов. М.: ВНИИСЭНТИ, 1992.—Вып. 3.—36 с.

93. Мурыгина, В.П. Микробы против нефтяных пятен / В.П. Мурыгина // Химия и жизнь. 2007. - №6. - С. 10-15.

94. Нетрусов, А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. Заведений / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. М.: Издательский центр «Академия», 2006.-352 с.

95. Новиков, Ю.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти / Ю.В. Новиков, Н.В. Комзолова // Водное хозяйство. — 1992. — № 2. С. 121-123.

96. Определитель бактерий Берджи. Т. 1. В 2-х т.: Пер с англ. / Под ред. Дж. Хоулта и др.. М.: Мир, 1997. - 432 с.

97. Оценка эффективности нового биопрепарата Ленойл для ремедиации нефтезагрязненных почв / О.Н. Логинов и др.. // Биотехнология. 2004. -№1. - С. 77-82.

98. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений / В.Ж. Арене и др. М.: Интербук, 1999. - 371 с.

99. Роза Карамовна. № 93029534/13; заявл. 15.06.1993; опубл 20.04.1997, Бюл. № 11.-8 с.

100. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт. М.: Мир, 1978. - 331 с.

101. Петров, А.А. Углеводороды нефти / А.А. Петров. М.: Наука, 1984. -264 с.

102. Пиковский, Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде / Ю.И. Пиковский. М.: Изд-во Московского ун-та, 1993.-208 с.

103. Плешакова, Е.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры / Е.В. Плешакова, Н.Н. Позднякова, О.В. Турковская // Прикладная биохимия и микробиология 2005. - Т. 41. - № 6. - С. 634-639.

104. Плешакова Е.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры / Е.В. Плешакова, Е.В.Дубровская, О.В. Турковская // Биотехнология. 2005. - № 1. - С. 42-50.

105. Повышение эффективности процесса биоремедиации отработанной отбеливающей земли, загрязнённой углеводородами, при совместном использовании комплекса биопрепаратов Ленойл и Азолен / А.Г. Биккинина и др. // Биотехнология. 2006 - №5. - С. 57-62.

106. Промышленная микробиология / под ред. Н. С. Егорова. М.: Высшая школа, 1989.-688 с.

107. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды / И.С. Андреева и др. // Биотехнология. — 2006. — №1. С.43-52.

108. Разработка и испытания биосорбента «Экосорб» на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий для очистки нефтезагрязнённых почв / В.А. Чугунов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т.36. - №6. - С. 661-665.

109. Рахимова, Э.Р. Очистка почвы от нефтяного загрязнения с использованием денитрифицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов / Э.Р. Рахимова, А.Л. Осипова, С.К. Зарипова // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40. - №6. - С. 649-653.

110. Рекомендации по использованию биопрепарата «Деворойл» для очистки объектов железнодорожного транспорта от загрязнения нефтепродуктами. -М.: МИИТ; ВНИИЖТ, 1999. 8 с.

111. Розанова, Е.П. Микрофлора нефтяных месторождений / Е.П. Розанова, С.И Кузнецов. М.: Наука, 1974. - 198 с.

112. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология // Под. ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. — М.: Издательство БИНОМ, 2008.- 1080 с.

113. Руэце, К. Борьба с загрязнением почвы/ К. Руэце, С. Кырстя; пер. с румын. К.И.Станькова.-М.: ВО Агропромиздат, 1986.-221 с.

114. Рябов, В.Д. Химия нефти и газа / В.Д. Рябов. М.: Издательство «Техника», 2004. - 288 с.

115. Сваровская, Л.И. Активность почвенной микрофлоры в условиях нефтяных загрязнений / Л.И. Сваровская, Л.К. Алтунина // Биотехнология. -2004. -№3.- С. 63-70.

116. Соколов, В.Н. Аппаратура микробиологической промышленности / В.Н. Соколов, М.А. Яблокова. Л.: Машиностроение, Ленингр. отд-ние, 1988. -278 с.

117. Солнцева, Н.П. Добыча нефти и геохимия природных ландшафтов / Н.П. Солнцева. -М.: Изд-во Моск. гос.ун-та, 1998. 376 с.

118. Сопрунова, О.Б. Использование цианобактериальных комплексов для ремедиации нефтезагрязнённых сред / О.Б. Сопрунова // Биотехнология. — 2006. №5. - С.52-56.

119. Способ восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов / М.Д. На-зарько и др. // Мониторинг окружающей среды: Материалы IV Между-нар. науч. конф./ Фундаментальные исследования. Римини, 2006. - № 8. -С. 32-33.

120. Степанов, В.Н. Мировой океан / В.Н. Степанов. М.: Знание, 1974. - 255 с.

121. Степаньян, О.В. Влияние нефти и нефтепродуктов на морфофункцио-нальные особенности морских макроводрослей / О.В. Степаньян, Г.М. Воскобойников // Биология моря. 2006. - Т.32. - №4. - С. 241-248.

122. Сулейманов, P.P. Изменение свойств нефтезагрязненных серых лесных почв при биологической рекультивации: дисс. канд. с-х. н.: 06.01.03 / P.P. Сулейманов. Уфа: БГАУ, 1999. - 155 с.

123. Таранова, J1.B. Микробиологическое окисление нефти в присутствии бакпрепарата «Путидойл» / JI. В. Таранова, Т. Н. Морозова // Нефть и газ Западной Сибири : тез. докл. Межд. науч.-техн. конф. Тюмень, 1996. - Т. 2.-С. 125.

124. Таскаев, А.И. Опыт биологической рекультивации земель в условиях Крайнего Севера / А.И. Таскаев, А.П. Боровинских, И.А. Архипченко // Экология и промышленность России. 2004. - №9. - С. 27-31

125. Теоретические основы пищевой биотехнологии / О.В. Зюзина и др. -Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2006.-26 с.

126. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильни-кова, Г.И. Переверзева. — М.: Колос, 1993. — 175 с.

127. Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. -М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2001. 185 с.

128. Турковская О.В., Дмитриева Т.В., Муратова А.Ю. Деградация минеральных масел селекционированной микробной ассоциацией/ О.В. Турковская, Т.В. Дмитриева, А.Ю. Муратова // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, № 2. - С. 80-85.

129. Учебно-методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу биотехнологии / Д.А. Васильев и др. — Ульяновск, 2006. 85 с.

130. Уэбб, Ф. Биохимическая технология и микробиологический синтез / Ф. Уэбб. М.: Медицина, 1969. - 560 с.

131. Физико-химические характеристики окружающей среды при техногенных катастрофах (разлив нефти)/ Г.П. Лапина и др. // Химическая и биологическая безопасность. 2007. — №1. - С. 24-32.

132. Филатов, Д.А. Биодеградация углеводородов нефти в почве с применением светокорректирующих полимерных пленок: автореф. дисс. . канд. биол. наук.: 03.00.16 / Филатов Д.А. Томск, 2009 - 23 с.

133. Халимов, Э.М. Эколого-микробиологические основы рекультивации почв, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами: дис. .канд. биол. наук.: 03.00.07 / Халимов Э.М. М.,1996. - 161 с.

134. Хант, Д. Геохимия и геология нефти и газа / Д. Хант. — М.: Мир, 1982. -704 с.

135. Химия / В. Шретер и др. М.: Химия, 2000. - 648 с.

136. Химия нефти / И.Ю. Батуева и др. Л.: Химия, 1984. — 360 с.

137. Химия нефти и газа / под ред. В.А. Проскурякова, А.Е. Драбкина. Л.: Химия, 1995.-448 с.

138. Химия окружающей среды / Под ред. Дж. О. М. Бокриса; пер с англ. под ред. А.П. Цыганкова. — М.: Химия, 1982. -672 с.

139. Хомякова, Д.В. Выделение психроактивных углеводородокисляющих бактерий из нефтезагрязненных почв / Д.В. Хомякова, И.В. Ботвинко, А.И. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробиология. 2003- Т.39. - №6. -С.581-584.

140. Чурсин, В.Ф. Аварийные разливы нефти: средства локализации и методы ликвидации /В.Ф. Чурсин, С.В. Горбунов, Т.В. Федотова // Каталог «Пожарная безопасность». 2004. - С. 254-258.

141. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель; пер с нем. под ред. Е.Н. Кондратьевой М.:Мир,1987. - 576 с.

142. Ягафарова, Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности / Г.Г. Ягафарова. — Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001. 214 с.

143. Aquatic zooremediation: deploying animals to remediate contaminated aquatic environments / S. Gifford et al. // Trends in Biotechnology. — 2007. — Vol. 25. — N. 2. — P.60-65.

144. Atlas, R.M. Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons: an Environmental Perspective / R.M. Atlas // Microbiological reviews. — 1981. — Vol. 45. -N. l.-P. 180-209.

145. Atlas, R.M. Fate and effects of oil pollution in the marine environment / R.M. Atlas, R. Bartha // Residue Review. 1973. - Vol. 49. - P.49-85.

146. Atlas, R.M. Microbial degradation of petroleum in the Arctic / R.M. Atlas, M. Busdosh // Proceedings of the 3rd International Biodegradation Symposium — London: Applied Science Publishers Ltd., 1976. P. 79-86.

147. Ashley, J. Growth of soil algae on top soil and processed oil shale from the Uintah Basin Utah USA / J. Ashley, S.R. Rushforth // Reclam Reveg Res. -1984. Vol. 3.-P.49-63.

148. Bacterial biodegradation of petroleum hydrocarbons in groundwater: in situ augmented bioreclamation with enrichment isolates in California / RJ. von Wedel et al. // Water Science and Technology. 1988. - Vol. 20. - P. 501503.

149. Banat, I.M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review / I.M. Banat // Bio-resource Technology. 1995.-Vol. 51.-P. 1-12.

150. Biodegradation of aromatic hydrocarbons by aquifer microorganisms under denitrilying conditions / S.R. Hutchins et al. // Environ. Sci. Technol. — 1991. -N. 25.-P. 68-76.

151. Biodegradation of hydrocarbon residuals by biological activators in the presence of INIPOL EAP 22 / J. R. Bergueiro-Lopez et al. // Spill Science & Technology Bulletin. 1996 -Vol. 3. - N. 4. - P. 273-276.

152. Bioremediation Assessment of Hydrocarbon-Contaminated Soils from the High Arctic / L.G. Whyte et al. // Bioremediation Journal. -1999. Vol. 3. -N. l.-P. 69-80.

153. Blakebrough, N. Interactions of oil and microorganisms in soil / N. Blake-brough // The Crude Oil Industry and Microbial Ecosystems. London: Hey-don and Son Ltd.,1978. - P. 28-40.

154. Bossert, I. The fate of petroleum in soil ecosystems / I. Bossert, R. Bartha // Petroleum microbiology. New York: Macmillan Publishing Co., 1984. - P. 434-476.

155. Brown, L.R. Oil-degradating microorganisms / L.R. Brown // Chem. Eng. Prog. 1987. - October. - P. 35-40.

156. Colwell, R.R. Ecological aspects of microbial degradation of petroleum in the marine environment / R.R. Colwell, J.D. Walker // Crit. Rev. Microbiol. — 1977. -Vol. 5-P.423-445.

157. Cooney, J.J. The fate of petroleum pollutants in freshwater ecosystems / J J. Cooney // Petroleum microbiology. New York: Macmillan Publishing Co., 1984.-P. 399-434.

158. Cunningham, C.J. Comparison of bioaugmentation and biostimulationin ex situ treatment of diesel contaminated soil / C.J. Cunningham, J.C. Philip. -Edinburgh: Land Contamination and Reclamation, 2000. 129 p.

159. Dibble, J.T. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil sludge / Dibble, J.T., R. Bartha // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - Vol.37. -P.729-739.

160. Fedorak, P.M. Microbial degradation of aromatics and saturates in Prudhoe Bay crude oil as determined by glass capillary gas chromatography / P.M. Fedorak, D.W. Westlake // Canadian journal of microbiology. 1981. - Vol. 27. -N. 4. — P.432-443.

161. Feitkenhauer, H. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and long chain alkanes at 60-70°C by Thermus and Bacillus spp / H.Feitkenhauer, R.Muller and H.Mauml // Biodegradation. 2003. - Vol. 14. - N. 6. - P. 367372.

162. Floodgate, G. The fate of petroleum in marine ecosystems / G. Foodgate // Petroleum microbiology. — New York: Macmillan Publishing Co., 1984. P. 355-398.

163. Fusey, P. Recherches sur telminations des hydrocarbures par voic biologique / P. Fusey, M.F. Lampin, J. Oudot // Mater, a. Org. 1989. - Vol.10. - №2. - P. 109-147.

164. Gudimov, A.V. Zooremediation, a new biotechnology solution for shoreline protection and cleanup / A.V. Gudimov // Proceedings of the 25th Arctic and Marine Oilspill Program, 2002. P. 401-412.

165. Gudin, C. Biological aspects of land rehabilitation following hydrocarbon contamination / C. Gudin, W. J. Syratt // Environmental Pollution. -1975. — Vol. 8.-P. 107-112.

166. Gupta, A.K. Bioremediation: Ecotechnology for the Present Century / A.K. Gupta, M. Yunus, P.K. Pandey // EnviroNews. -2003. -Vol. 9, N. 2. P. 5-9.

167. Huesemann, M. H. Predictive model for estimating the extent of petroleum hydrocarbon biodegradation in contaminated soils / M. H. Huesemann // Environ. Sci. Technol. 1995. -N. 29. - P. 7-18.

168. Iizuka, H. Production of arachidonic acid by hydrocarbon-utilizing strain of Penicillium cyaneurn / H. Iizuka, T. Ohtomo, K. Yoshida // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1979. -N. 7. -P.173-180.

169. Jamison, V.M. Biodegradation of high-octane gasoline in groundwater / V.M. Jamison, R.L. Raymond, J.O. Hudson, Jr // Developments in industrial microbiology. 1975.-Vol. 16.-P. 305-312.

170. Jobson, A. Microbial utilization of crude oil / A. Jobson, F.D. Cook, D.W.S. Westlake //Appl. Microbiol. 1972.- N. 23.-P. 1082-1089.

171. Jorgensen, K.S. Bioremediation of petroleum hydrocarbon-contaminated soil by composting in biopiles /K.S. Jorgensen, J. Puustinen , A.M. Suortti // Environ Pollut. 2000. - Vol. 107. - N. 2. - P. 245-254.

172. King, P.M. Comparison of methods for measuring severity of water repel-lence of sandy soils and assessment of some factors that affect its measurement / P. M. King // Australian Journal of Soil Research. 1981. - Vol.19. - N. 3. -P. 275-285.

173. Klug, M.J. Thermophilic bacteria isolated on n-tetradecane / M. J. Klug, A. J. Markovetz//Nature. 1967.-Vol. 215.-P. 1082-1083.

174. Lee, E. Bioventing for in situ remediation / E. Lee, M. Swindoll // Hidrol. Sci. J. 1993.-Vol. 24.-P. 113-125.

175. Leahy, J.G. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment / J.G. Leahy, R.R. Colwell // Microbiological Reviews. 1990. - Vol. 54. - N. 3. -P. 305-315.

176. Mateles, R.L Growth of a thermophilic bacteria on hydrocarbons: a new source of single cell protein / R.I. Mateles, J.N. Baruah, S.R. Tannenbaum // Science. 1967.-Vol. 157.-P.1322-1323.

177. Microbial ecology of the Metula spill in the Straits of Magellan / R.R. Col-well et al. // J. Fish. Res. Board Can. 1978. - Vol. 35. - P. 573-580.

178. Perry, J.J. Microbial Degradation of Cycloparaffinic Hydrocarbons via Co-metabolism and Commensalism / JJ. Perry // Journal of General Microbiology. 1974. - Vol. 87 - P. 163-169.

179. Perry, J.J. Microbial cooxidations involving hydrocarbons / J.J. Perry // Microbiol. Rev. 1979. - Vol. 43. - P. 59-72.

180. Roy, J.L. Assessing soil water repellency using the molarity of ethanol droplet (MED) test / J.L. Roy, W.B. McGill // Soil science. 2002. - Vol. 167. - N. 2. -P. 83-97.

181. Shiaris, M.P. Seasonal biotransformation of naphthalene, phenanthrene, and benzoa.pyrene in surficial estuarine sediments / M.P. Shiaris //Appl. Environ. Microbiol. 1989. - Vol. 55. - P. 1391-1399.

182. Schacht, O. Soil Bioremediation: In-Situ vs. Ex-situ. Costs, Benefits, and Effects / O. Schacht, K. Ajibo. Goteborg: WSP and Goteborg Energi, 2002. - 771. P

183. Soli, J. Bacteria which attack petroleum hydrocarbons in salino medium / J. Soli, E.M. Benz // Biotechnol. And Bioeng. 1972. - Vol. 4. - N. 3. - P. 319.

184. Schwarz, J.R. Deep-sea bacteria: growth and utilization of hydrocarbons at ambient and in situ pressure / J.R. Schwarz, J.D. Walker, R.R. Colwell // Appl. Microbiol. 1974. - Vol. 28. - P. 982-986.

185. The Prokaryotes / Ed. M.P. Starr et al. Springer Verlag etc., 1981. - 22841. P

186. The properties of persistent oils at sea / S.A. Berridge et al. // Scientific aspects of pollution of the sea by oil. London: Institute of Petroleum, 1968. - P. 35-59.

187. Van der Berg R. In situ biorestoration of an oil contaminated subsoil / R. Van der Berg, J.H.A.M. Verheul, D.H. Eikelborn // Water sci. and technol. 1988. -Vol.20. -N. 3. - P. 255-256.0/

188. Vidali, M. Bioremediation. An overview / M. Vidali // Pure Appl. Chem. — 2001.-Vol. 73.-N. 7.-P. 1163-1172.

189. Walker, J.D. Microbial degradation of model petroleum at low temperatures / J.D. Walker, R.R. Colwell // Microb. Ecol. 1974. - N. 1. - P.63-95.

190. Ward, D.M. Hydrocarbon biodegradation in hypersaline environments / D.M. Ward, T.D. Brock // Appl. Environ. Microbiol. 1978. -N. 35. - P. 353-359.

Информация о работе

Александров, Алексей Юрьевич
кандидата биологических наук
Волгоград, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Рост и развитие углеводородкисляющих микроорганизмов в условиях глубинного культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы