Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические закономерности промышленного производства бактерийных препаратов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические закономерности промышленного производства бактерийных препаратов"
На правах рукописи
Меньшенин Владимир Викторович
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ
(НА МОДЕЛИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ)
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
13 ПАР 2014
О1
Щелково-2013 г.
005546036
Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный консультант:
академик РАСХН, академик НААН Украины, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ,
Заслуженный деятель науки РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко
Официальные оппоненты:
Вера Ивановна Балышева - доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ, ведущий научный сотрудник ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии.
Владимир Андреевич Гаврилов - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».
Валентин Бабкенович Акопян - доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом ОАО «ГосНИИсинтезбелок».
Ведущая организация:
ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» РАСХН
Защита состоится « ^y>^tyt)i£JL2Ql4 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail: vni-tibp@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности» Россельхозакадемии.
Автореферат разослан • 2014 г.
Автореферат 27.11.2013 г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии www.vnitibp.^H на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических ' Фролов Юрий Дмитриевич
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Исследования по разработке и обеспечению продовольствием и биологической защиты людей и животных в стране является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные изыскания, направленные на решение этих проблем.
Одним из путей решения задач развития АПК поставленных перед наукой является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, вакцин способных обеспечить нормальное развитие животных, что способствует получению от них качественной продукции.
Этим требованиям соответствуют новые экобиотехнологические препараты, такие как пробиотики, вакцины, диагностикумы и другие иммунобиологические препараты, которые применяют как в здравоохранении, так и в ветеринарии. Такие лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного животноводства.
В общей номенклатуре выпускаемых препаратов значительную долю занимают средства специфической профилактики инфекционных болезней животных, вызываемых патогенными бактериями.
Благодаря достижениям современной науки при промышленном производстве биопрепаратов достаточно широко используются реакторные способы выращивания бактерий в жидких питательных средах, физико-химические методы обработки культур и стабилизации микроорганизмов. Однако большинство технологических процессов промышленного производства ветеринарных биопрепаратов базируется на эмпирических данных и требует обстоятельного научного обоснования.
Технология изготовления бактериальных вакцин — многоаспектная проблема, ключевым направлением которой является разработка современных процессов культивирования микроорганизмов, позволяющих интенсифицировать производство и получать высококачественные препараты. Процессы культивирования позволяют не только разрабатывать прогрессивные технологии производства биопрепаратов, но и более глубоко изучать закономерности жизнедеятельности бактериальных популяций.
Под моделированием понимают исследования круга проблем, связанных с применением к промышленному оборудованию данных, полученных в лабораториях и на опытных установках. В случае хорошо поставленного технологического моделирования процесса повышается выход конечного продукта на промышленном оборудовании, сокращении затрат и уменьшении себестоимости готовой продукции.
В фундаментальных работах, посвященных культивированию непатогенных микроорганизмов, приводятся материалы исследований по общим вопросам микробиологического синтеза, закономерности и факторы, оказывающие влияние на рост и развитие продуцентов, а также по разработке научных основ оптимизации выращивания микроорганизмов с применением современного технологического и аппаратурного оформления процессов.
Общие теоретические и прикладные аспекты проблемы культивирования отдельных патогенных микроорганизмов достаточно глубоко рассматриваются рядом исследователей.
Работы по изучению процессов культивирования вакцинных штаммов бактерий, используемых для изготовления препаратов для ветеринарной медицины, за редким исключением, представляют собой материалы исследований, либо констатирующих принципиальную возможность глубинного выращивания микроорганизмов, как правило, без учета их метаболизма и комплекса физико-химических параметров роста, либо характеризующих динамику развития бактерий и не содержащих количественных характеристик и физиологических показателей роста культур. Это не позволяет хотя бы в общих чертах судить о жизнедеятельности микроорганизмов при их культивировании. Однако исследования, направленные на познание закономерностей, присущих популяциям микроорганизмов в искусственно создаваемых условиях, экспериментальное обоснование методов и режимов культивирования бактерий, обеспечивающих воспроизводимое их получение в оптимальных условиях, имеют большое теоретическое и практическое значение, так как результаты изучения закономерностей микробных популяций являются научной основой разработки любой технологии производства биопрепаратов.
Таким образом, современное вакцинное производство немыслимо без научно обоснованных технологий изготовления биопрепаратов, обеспечивающих интенсификацию отдельных стадий, составляющих целостные технологические процессы и получение стандартной и высококачественной продукции. Анализ тенденций разработки и совершенствования технологий промышленного изготовления бактериальных вакцин показывает, что резервы повышения эффективности их производства и качества состоят, в основном, из оптимизации условий и разработки процессов культивирования микроорганизмов с учетом их метаболизма и физиологического состояния, изыскания эффективных средств защиты, обеспечивающих надежную стабилизацию биологической активности препаратов.
Биологической промышленностью выпускается более 40 бактериальных вакцин, в том числе 20 живых препаратов. Из числа живых вакцин 4 жидких и 16 сухих. Практически все используемые в отечественной биологической промышленности технологии изготовления препаратов не совершенны. В качестве питательных сред для выращивания производственных штаммов микроорганизмов используется нестандартное пищевое сырье, процессы культивирования малопроизводительны, не контролируются и не регулируются по большинству значимых физико-химических параметров и осуществляются без учета физиологического состояния культур.
Элементы несовершенства технологических приемов и низкой стабильности наиболее характерны для большинства бактериальных вакцин, что позволило выделить их из общего числа живых препаратов в качестве основных объектов для более детального рассмотрения при разработке технологий изготовления этих препаратов в направлении интенсификации производства и повышения стабильности биологической активности.
Наряду с этим для более углубленного изучения закономерности технологических процессов культивирования и стабилизации микроорганизмов, апробирования их на родственных моделях п определения возможных обобщений, распространяющихся на вакцины против сальмонеллеза животных, в качестве дополнительных объектов представлялось целесообразным избрать, например, вакцину из штамма Ра5[еигс11а тиИсхпёа, которая отличается методами и условиями культивирования.
Выбор указанных объектов исследований обусловлен также и рядом следующих обстоятельств, в частности:
- актуальностью проблемы специфической профилактики сальмонеллеза;
- необходимостью замены устаревших технологий изготовления вакцин на более производительный и эффективный метод глубинного периодического культивирования.
Вакцинные штаммы, избранные модельными, являются представителями достаточно хорошо изученных микроорганизмов, что дает возможность углубленного исследования проблем биологической активности и физиологического состояния бактериальных культур при управляемом выращивании, познание закономерностей, присущих микробным популяциям и расшифровки механизмов, определяющих стабильность биологических свойств в целостном технологическом процессе изготовления вакцинных препаратов для ветеринарной медицины.
Свиноводство в нашей стране является одним из основных источников производства мяса и жира животного происхождения. На фоне специфических условий характерных для отрасли и, в частности, в связи с концентрацией большого количества свиней на ограниченных производственных площадях возрастает роль организации профилактических мероприятий по предупреждению опасных с эпизоотической точки зрения таких инфекций бактериальной этиологии, как сальмо-неллез, рожа, некробактериоз, гемофилез, пастереллез и другие.
В условиях крупных свиноводческих хозяйств каждая вспышка заболевания свинопоголовья кишечными инфекциями (к таким, в первую очередь, относится сальмонеллез) ведет к ощутимым потерям экономического и социального характера.
Сальмонеллезной инфекции наиболее ощутимо подвержен молодняк свиней. В меньшей степени от сальмонеллеза страдает взрослое свинопоголовье. Однако, являясь бактерионосителями сальмонеллезной инфекции, они подвергают постоянной опасности инфицирования большого числа свиней.
В нашей стране накоплен значительный опыт по иммунопрофилактике сальмонеллезов сельскохозяйственных животных живыми вакцинами.
В этой связи очевидна необходимость разработки вакцинных препаратов для иммунизации; а) отдельно - для маточного поголовья, как основы для создания ко-лостралыгого иммунитета нарождающегося молодняка свиней, и б) отдельно - для иммунизации поросят послеотъемного периода. В дальнейшем у взрослого поголовья, сальмонеллоносительство не представляет сколько-Ешбудь значительной опасности.
Для иммунопрофилактики сальмонеллезов эффективны живые вакцины, изготовленные из аттенуированных (авирулентных) штаммов сальмонелл. Последние получают при пассировании вирулентных культур микроорганизмов на искус-
ственных питательных средах и невосприимчивых животных, а также под влиянием физических, химических и биологических факторов.
Одной из основных причин медленного внедрения в практику живых вакцин является возможность реверсии сальмонелл вакцинных штаммов в исходное состояние. При указанных методах аттенуации сальмонеллезных штаммов специфический механизм действия выбранного мутагена на совершенно определенные дискретности генетического аппарата особи не ясен, то есть отсутствуют генетические метки, позволяющие отличать их от естественных прототипов.
1.1. Актуальность темы. В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.
Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере, В.В. Бирюкова, И.М. Грачевой, Ю.П. Грачева (1979 -1990г.г.). Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.
Исследования по разработке управляемых режимов культивирования вакцинных штаммов микроорганизмов и режимов сублимационного высушивания проводили Б.А. Никаноров, А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан, A.A. Раевский, М.Я. Ярцев, Э.Ф. Токарик, A.A. Нежута и др. Технология промышленного производства вакцин для ветеринарии с использованием глубинного культивирования микроорганизмов была разработана Н.Д. Скичко, А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельником, B.C. Павленко (1980 - 1990гг.).
В настоящее время в области разработки новых и усовершенствования существующих промышленных технологий производства сухих живых бактериальных препаратов не существует единого методологического подхода, основанного на использовании методов системного анализа.
Традиционные технологии разработаны на основе эмпирических подходов и зачастую не удовлетворяют современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам производства и обеспечивающим надлежащее качество продукции. Поэтому остается много нерешенных технических и технологических проблем совершенствования существующих и создания новых технологий промышленного производства бактерийных препаратов.
Одним из самых сложных объектов с точки зрения технологии изготовления является вакцина против сальмонеллеза. Актуальность производства и применения этой вакцины обусловлена тем, что сальмонеллез являются широко распространенным инфекционным заболеванием, наносящим значительный ущерб животно-
водству и представляющим серьезную угрозу здоровью людей. Важное место в борьбе с сальмонеллезом занимает специфическая профилактика с помощью инак-тивированных и живых вакцин. С этой целью наиболее эффективны живые вакцины, изготовленные из авирулентных штаммов бактерий.
Семейство энтеробактерий объединяет обширную группу грамотрицатель-ных бактерий, к которым относятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella и др. Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, наиболее часто сальмонеллезы регистрируют у свиней и птиц. Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Возбудителями, в основном, являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. voldagsen.
Сальмонеллёз свиней вызывают сальмонеллы разных серотипов, набоилее часто S.cholraesuis u S.typhimurium, в ряде случаев с преобладанием S.typhimurium.
Первая вакцина против сальмонеллеза поросят в нашей стране была изготовлена М.М. Ивановым (1948), против сальмонеллеза телят - А.Г. Малявиным и И.И. Архангельским (1950-1960), усовершенствованием технологии производства вакцин во ВНИИТИБП и на Щелковском биокомбинате занимались Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, А. А. Раевский, Е.Э. Школьников и др.
В связи с вышеизложенным, научно обоснованное решение проблемы совершенствования технологии промышленного производства вакцины и до настоящего времени является актуальной задачей, имеющей практическую ценность.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы - изучение биотехнологических закономерностей промышленного производства бактерийных препаратов на разработанной модели производства вакцины против сальмонеллеза свиней.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- научно обосновать и разработать биотехнологическую модель промышленной технологии изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней;
- выбор вакцинных штаммов сальмонелл;
- изучить культуральные, морфологические, ферментативные, вирулентные и антигенные свойства культур сальмонелл отобранных штаммов для изготовления вакцины;
- оптимизировать состав питательной среды на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования бактерий;
- разработка управляемого процесса глубинного культивирования штаммов Salmonellae typhimurium № 415 и Salmonellae choleraesuis № 370;
- оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении вакцины против сальмонеллеза свиней;
- отработка оптимальной схемы применения вакцины в опытах на лабораторных животных (доза, кратность, интервал);
- испытание на безвредность, реактогенную и антигенную активность экспериментальных серий вакцины на супоросных свиноматках и поросятах послеоть-емного периода в условиях свиноводческих хозяйств.
- изготовить опытно-промышленные серии вакцины;
- определить эффективность ее применения в животноводстве;
1.3. Научная новизна. Разработан единый подход к изучению биотехнологических закономерностей промышленного производства бактерийных препаратов на разработанной модели производства вакцины против сальмонеллеза свиней. Научно обоснованы разработка и совершенствование промышленной биотехнологии производства бактериальных препаратов ветеринарного назначения. Эффективность их использования экспериментально подтверждена на сложной биотехнологической модели. Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления сальмонелл, значения концентраций компонентов питательных сред и параметры управляемого режима культивирования бактерий, оптимизировать состав защитных сред для сублимационного высушивания. С использованием разработанного подхода усовершенствована технология промышленного производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Разработаны дозы и кратность применения сухой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Изготовлены опытно-промышленные серии сухой вакцины против сальмонеллеза свиней разных возрастных групп, проведены испытания препаратов в хозяйствах.
1.4. Практическая ценность работы. Применение разработанных технологий производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней дает большой иммунологический, экономический и социальный эффект.
Использование предложенного подхода позволяет разрабатывать и совершенствовать технологию промышленного производства и других бактерийных препаратов. Использование его в научных экспериментах и практике позволяет снизить количество опытов, затрат на эксперименты, что ведет к снижению стоимости разработки технологических процессов и технологии в целом.
По разработанной технологии изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против сальмонеллеза свиней на Сумской и Ставропольской биофабриках. Вакцина успешно прошла испытания в свиноводческих хозяйствах Костромской области и Краснодарского края. В течение 6 месяцев случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений не зафиксировано.
Использование разработанных технологий производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней способствует сокращению времени культивирования и повышения накоплению жизнеспособных клеток сальмонелл, стабильности по биологическим свойствам и лучшую сохраняемость в процессе длительного хранения и использования.
По разработанной технологии изготовлены промышленные серии вакцины. В производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В хозяйствах проведены научно-производственные опыты и производственные испытаний на супоросных свиноматках и поросятах послеотьемного периода. Результаты испытаний включены в Методическое положение «Опытно-промышленный регламент производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней», 2011 г., Методическое положение «Инструкция по применению сухой
живой вакцины», 2011 г., утвержденные на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 2011 г.
Промышленный выпуск вакцины против сальмонеллеза на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 - 2012 гг. составил - 15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат - 5 млн. 440 тыс. доз.
Результаты исследований включены в 2 методических положения, утвержденных на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком-секретарем A.M. Смирновым.
Результаты исследования и методология может быть использована разработчиками и производителями лекарственных средств для ветеринарии, а так же в качестве учебного пособия студентов - биотехнологов.
Результаты работы легли в основу разработанной во ВНИТИБП «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации» и одобренной Президиумом Россельхозакадемии, протокол №4 от 21.04.2011г.
1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту
1. Разработка биотехнологической модели промышленного производства вакцины против сальмонеллеза свиней.
2. Оптимизированный состав питательных сред для глубинного управляемого процесса культивирования сальмонелл.
3. Оптимизированный управляемый процесс глубинного культивирования сальмонелл.
4. Оптимизированные защитные среды высушивания, используемые при изготовлении вакцин против сальмонеллеза.
5. Разработанная дозировка и кратность применения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней.
6. Определение иммунологической эффективности применения разработанной сухой живой вакцины для свиней разных возрастных групп.
1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:
- в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ГНУ ВНИТИБП РАСХН (1992 - 2012 гг.);
- на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2009-2012 гг.);
- на Международных конгрессах («Биотехнология-2010, 2011», Москва, 2010, 2011 гг.);
- на Всероссийских и Международных конференциях, проводившихся в Москве, Санкт-Петербурге, Омске, Краснодаре, Курске, Сергиевом Посаде, Покрове, Тюмени, Щелково, Харькове, Ялте, Минске, Витебске, Алматы (1992 - 2012 гг.).
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 60 научных работах, в том числе в 18 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 3 Патента РФ.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах компьютерного текста и состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований; обсуждения результатов; выводов; практических предложений; списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 28 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 327 источников, из которых 253 отечественных и 74 зарубежных авторов. В приложении представлены таблицы расчетов коэффициентов уравнений, копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимал личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.
1.10 Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ГНУ ВНИТИБП, академику Россельхозакадемии, академику НААН Украины Самуйленко А.Я. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Школьников Е.Э., Раевский A.A., Соловьев Л.Б., Анисимова JI.B., Коротеева JI.A., Скичко Н.Д., Нежута A.A. - за что выражаю им сердечную благодарность.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в отделе противобактерийных препаратов и отделе технологии сушки биопрепаратов ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии, согласно планам НИР и ОКР института. Опытно-промышленные серии препаратов, изготовленные на Ставропольской биофабрике, испытывали в животноводческих хозяйствах Ставропольского, Краснодарского края, Ульяновской, Костромской областей.
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.1. Объекты исследований. При исследовании и разработке технологических процессов промышленного производства сухих живых вакцин сальмонел-леза использовали производственные штаммы 8.сЬо1егае8шя штаммы ТС-177 и 370, в.сШЫт 160 и ЗдурЫшипит № 415.
Культивирование сальмонелл проводили на питательных средах, основой которых являлись ФГМС, перевар Хоттингера и аминопептид.
2.1.2. Технологическое оборудование. Культуру сальмонелл выращивали в пробирках и флаконах на шутгель-аппарате, а также в ферментере АНКУМ-2М емкостью 3 и 10 дм3, который оснащен системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, рОг, еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии).
Для пеногашения при интенсивном росте в ферментере сальмонелл применяли пеногаситель пропинол Б - 400.
рН в культуральной жидкости определяли потенциометрически, уровень растворенного кислорода рОг - датчиками изготовленными в СКБ БП (г. Пущино), еН - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО-01.
Оптическую плотность культур сальмонелл измеряли на фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 и блоке оптической плотности аппарата АНКУМ -2М.
Концентрирование бакмассы сальмонелл осуществляли с помощью лабораторных центрифуг К-70Д, 8-60 и установки «Сартокон-мини» («Владисарт», г. Владимир).
Замораживание готовых препаратов проводили в холодильных установках ЛСШ-28, с последующим высушиванием в сублиматоре ТГ-50.5.
2.1.3. Методы доклинических испытаний. Морфологию бактериальных культур определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства - путем высева их на МПА и МПБ. Жизнеспособность определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопептонным агаром. Длительность фаз роста, максимальной удельной скорости, минимального времени удвоения культур определяли графическим методом.
2.1.4. Клинические испытания. Образцы сухой живой вакцины против сальмонеллеза испытывали на безвредность и иммуногенность на морских свинках и кроликах. Вакцина не должна вызывать гибель животных в течение 10 сут. наблюдения.
2.1.5. Статистическая обработка результатов. Для оптимизации технологических этапов производства вакцины, приготовления питательных сред для глубинного культивирования и приготовления защитных сред высушивания, использовали методы математического планирования: метод Гаусса — Зайделя, полный факторный эксперимент (ДФЭ или ПФЭ) типа 2" и метод «крутого» восхождения, где п - число факторов.
Для оптимизации технологического процесса культивирования использовали метод математического планирования Гаусса - Зайделя. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем — с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.
Обработку результатов зоотехнических экспериментов (с числом повторов >3) проводили статистическим методом анализа и обработки данных - методом определения грубых ошибок («промахов»), а для определения эффективных доз вакцины в свиноводстве использовали метод математического планирования эксперимента Гаусса-Зайделя.
Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.
Этапы разработки
Научная гипотеза и поисковые исследования
Исследования
Форма завершения
Лпалнз традиционных технологий промышленного производства сухих бактерийных препаратов
Разработка алгоритма усовершенствования промышленных технологии производства сухих бактерийных препаратов
Алгоритм усовершенствования промышленных технологии производства сухих бактерийных препаратов
схемы производства сухнх бактериальных препаратов
Разработка или усовершенствование технологических этапов производства сухнх бактериальных препаратов
т Методические положения
Разработка технологической схемы производства сухнх бактериальиых препаратов /
У -------^
' г
С Усовершенствованная технология промышленного производства бактериальных препаратов
Рис.1. Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка модели промышленной технологии производства вакцины против сальмонеллеза свиней
Для производства бактерийных препаратов необходимы культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и концентрирования, сушка микроорганизмов и проведение вспомогательных операций, средств контроля и управления. Для объединения их в биотехнологическую модель, способную эффективно функционировать, нужен алгоритм производства бактериальных препаратов. Технологические процессы, базирующиеся на микробном синтезе, можно представить в виде определенной последовательности стадий, причем большинство из них общие для любого микробиологического производства.
В настоящее время значительно расширился объем научно-исследовательских, опытно-конструкторских и проектных работ по разработке новых микробиологических процессов с применением высокопродуктивных штаммов продуцентов и технологического оборудования нового поколения, по поиску наиболее рациональных режимов технологических этапов производств. Интенсификация промышленной технологии производства биопрепаратов - многоаспектная проблема, ключевым направлением которой на современном этапе наряду со снижением материало - и энергоемкости технологии, с использованием современного оборудования и другими приемами является разработка новых или совершенствование традиционных технологий с переходом на современное оборудование с использованием управляемых процессов биосинтеза при применении компьютерных программ средств измерения, контроля и регулирования технологических параметров и потоков веществ.
Решение поставленных задач по изучению биотехнологических закономерностей бактерийного производства требует использования математических методов планирования эксперимента при оптимизации технологических процессов. Использование математических моделей при разработке промышленных технологий ведет к сокращению числа дорогостоящих опытов II ускоряет создание оптимальных по составу компонентов питательных и защитных сред высушивания, а также обеспечению оптимизации технологических этапов производства и достижению максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе данных, полученных на пилотной установке, что сокращает затраты и уменьшает себестоимость готовой продукции.
Современный подход к изучению закономерностей промышленной технологии получения бактериальных препаратов заключается в оптимизации параметров критических этапов производства, требует применения математических методов планирования эксперимента в качестве инструмента для создания полного цикла технологии, определения соответствия традиционных технологий требованиям вМР, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам производств и оборудованию.
На рисунке 2 представлен алгоритм для разработки биотехнологической модели промышленной технологии производства бактериальных препаратов.
Разработка проекта ТТХ производства бактериальных препаратов
Разработка технологической и аннаратурно-тсхнологнчсской схемы производства бактериальных препаратов
Технологические этапы производства бактериальных препаратов
Технологические стадии или процессы производства препаратов
—э
Математические
методы
планирования
эксперимента
Оптимизированные стадии, процессы производства
Усовершенствованная технология промышленного производства оактернальных
препаратов
Разработка ГЩ на опытно - промышленное производство
Апробация технологии на бнонредпрнятнях и испытание препаратов в хозяйствах
Разработка и утверждение НД
X
Технология промышленного производства бактериальных препаратов
Рис. 2. Алгоритм для разработки биотехнологической модели промышленной технологии получения бактериальных препаратов.
3.2. Разработка технологической схемы производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней
Одной из задач разработки технологии промышленного производства является возможность выпуска различных биопрепаратов на одной технологической линии.
Модель промышленного производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней состоит из следующих стадий: очистка и стерилизация воздуха и других газов; водоподготовка; приготовление питательных и защитных сред; приготовление посевного материала; культивирование микроорганизмов; концентрирование; ресуспендирование; фасовка (розлив) препарата; глубокое замораживание; сублимационное (лиофильное) высушивание препарата; укупорка и закатка флаконов с препаратом; этикетировка; контроль на стадиях производства и готового препарата; упаковка готовой продукции; хранение препарата.
На рисунке 3 представлена унифицированная технологическая схема производства сухих живых вакцин против сальмонеллеза.
Рис. 3. Унифицированная технологическая схема производства сухих живых вакцин против сальмонеллеза.
3.3. Разработка унифицированной аппаратурно-технологической схемы производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней
На рисунке 4 представлена унифицированная аппаратурно-технологическая схема производства сухих вакцин против сальмонеллеза.
Рис. 4. Унифицированная аппаратурно-технологическая схема промышленного производства сухих вакцин против сальмонеллеза.
1-реактор-гидролизатор; 2-реактор для хранения осветленного гидролизата; 3-реактор для приготовления питательной среды; 4-мембранный фильтр; 5-реактор для стерилизации питательной среды; 6-биореактор (ферментер) для культивиро-
вания; 7-центрифуга; 8-установка для ультрафильтрации; 9-ампула с лиофильно высушенным штаммом; 10-штамм выращенный на скошенном агаре; 11-штамм выращенный в жидкой питательной среде; 12-штамм засеянный во флаконы 450мл; 13-выращиванис штамма во флаконах 450 мл на шуттель-аппарате в термо-статируеммом помещении; 14-лабораторный ферментер для инокулята; 15-емкость для смешивания биомассы с защитной средой высушивания; 16-емкость для приготовления защитной среды высушивания; 17-установка для фасовки и предварительной укупорки флаконов; 18-низкотемпературный холодильник; 19-сублимационная установка; 20-полуавтоматнческая линия укупорки, закатки флаконов, этикетировки; 21-упаковочная линия в коробки и этикетировки коробок; 22-упаковочная линия в гофротару.
При разработке унифицированной аппаратурно-технологической схемы производства учтены следующие технико-технологические варианты: 1) предприятие готовит основы питательных сред само (оборудование 1 и 2); 2) закупает перевар Хоттингера (тогда исключается оборудование 1 и 2); 3) использует лабораторный ферментер (14) для приготовления инокулята или засевает из флаконов после выращивания на шуттель-аппарате; 4) использует для концентрирования центрифугу (7) или установку для ультрафильтрации (8) типа «Владисарт», получая в комплексе с ферментером мембранный биореактор); 5) использует сублимационное оборудование с низкотемпературным холодильником (18) или новые сублимационные установки с встроенным низкотемпературным холодильником.
3.4. Разработка биотехнологической модели промышленной технологии производства вакцины против еальмонеллеза свиней
Биотехнологическая модель промышленной технологии производства вакцины против еальмонеллеза свиней проводили на основе разработанного алгоритма и состоит из трех технологических моделей, которые являются критическими этапами для качества продукции:
- оптимизация состава жидкой питательной среды;
- оптимизация технологических параметров культивирования сальмонелл;
- оптимизация защитной среды высушивания;
- клинические испытания вакцины, изготовленной по разработанной технологии, в животноводческих хозяйствах.
3.5 Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования сальмонелл
Из литературных данных известны различные питательные среды для культивирования сальмонелл (на основе перевара Хоттингера, ФГМС и аминопепти-да).
Перед нами стояла задача разработать питательную среду для выращивания сальмонелл с лучшими ростовыми качествами.
Результаты показали, что рост сальмонелл в питательной среде на основе перевара Хоттингера выше, чем на других средах рисунок 5.
о
ПсГ
со
О
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Время, нас
—Ф—ФГМС —■—перевар Хоттингера аминопептид
Рис. 5. Рост сальмонелл на питательных средах с различной основой сред.
Предварительно работу по оптимизации питательной среды для выращивания сальмонелл проводили в пробирках с перемешиванием на шутгель-аппарате. Результаты показали, что рост сальмонелл в питательной среде на основе перевара Хоттингера выше, чем на других средах.
Дальнейшую работу по проверке питательной среды для выращивания сальмонелл на основе перевара Хоттингера осуществляли в ферментере АНКУМ -2М.
В таблице 1 представлены данные по культивированию сальмонелл различных штаммов в питательной среде на основе перевара Хоттингера.
Таблица 1
Накопление жизнеспособных сальмонелл различных штаммов в питательной среде на основе перевара Хоттингера
№ п/п Время культивирования, ч Накопление сальмонелл, млрд/см3
8.сЬо1егае5Ш8 штамм ТС-177 З.с1ю1сгае81ш штамм 370 ЗдурЫтигшт штамм 415 8.с1иЬНп 160
1 0 0,25 0,08 0,02 0,15
2 2 0,5 0,25 0,06 0,8
3 4 1,6 1,55 1.1 1,3
4 6 2,7 2,75 2,0 1,4
5 8 3,5 4,77 2,4 1,6
6 10 3,8 4,8 2,9 1,7
7 12 5,2 4,9 4,6 1,7
Из результатов опытов (табл. 1) следует, что необходимо оптимизировать питательную среду, на основе перевара Хоттингера, для глубинного культивирования сальмонелл.
Для оптимизации состава питательной среды использовали методы математического планирования эксперимента, типа ПФЭ 23, где п - число факторов.
На начальном этапе разработки питательной среды для культивирования сальмонелл была выбрана за математическую модель инструктивная среда для промышленного культивирования сальмонелл на основе перевара Хоттингера.
Жидкую питательную среду (математическая модель) на основе перевара Хоттингера, приготовили по следующей прописи, масс.%: перевар Хоттингера -20,0; пептон - 1,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,8; хлористый натрий - 0,8; вода дистиллированная - до 100.
Критерием оптимизации (У) служило накопление жизнеспособных сальмонелл в культуральной жидкости, так как для изготовления вакцины используются только живые клетки. В качестве основных факторов по оптимизации питательной среды исследовали следующие компоненты: Х1 -концентрация пептона, Х2 - концентрация фосфорнокислого двузамещенного натрия и Х3 - концентрация дрожжевого экстракта.
В таблице 2 представлен план ДФЭ 23 в кодированной и натуральной размерностях.
Таблица 2
План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях
№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление сальмонелл (Уср), млрд/см'
X, х2 Х3 Концентрация пептона, % Концентрация натрия фосфорнокислого дву-замещенного, % Концентрация дрожжевого экстракта, %
1 - - - 0,5 0,45 2,0 19,8
2 + - - 1,5 0,45 2,0 21,6
3 - + - 0,5 1,15 5,0 23,2
4 + + - 1,5 1,15 5,0 28,3
5 - - + 0,5 0,45 2,0 25,4
6 + - + 1,5 0,45 2,0 31,4
7 - + + 0.5 1,15 5,0 30,4
8 + + + 1,5 1,15 5.0 39,6
Xoi 1,0 0,8 3,5
ДХ, 0,5 0,35 1,5
В таблице 3 представлены экспериментальные данные по накоплению сальмонелл по плану ПФЭ 23.
Таблица 3
Накопление сальмонелл в различных питательных средах согласно плану
ПФЭ 23
№ опыта Количество жизнеспособных сальмонелл, млрд./см''
Накопление (У) сальмонелл в повторностях опытов Уср
1 20,00 20.00 19,00 18.50 19,30 19,10 19,32
2 23,00 21,00 21.00 20,70 22,40 21,50 21.60
3 25,00 24,00 22,00 23.60 23.90 22,40 23,48
4 30,00 27,00 28,00 29,10 27,50 27,90 28,25
5 27,00 25,00 25.00 24,10 23.90 26.20 25,20
6 33,00 31.00 30,00 31,30 32,40 32,90 31.77
7 30,00 29,00 32.00 31,20 32,30 29.80 30.72
8 41.00 40,00 42.00 38,80 37.20 38.60 39.60
После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных получили уравнение регрессии (1), связывающее накопление жизнеспособных сальмонелл в культуралыюй жидкости и концентрацию
основных компонентов питательной среды, которое адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас = 3,73 < Ргеор. = 4,10).
У=27.49+3,02Х,+2.8 1Х2+4,ЗЗХз+0,6Х|Х2+0,32Х|ХЗ+1 ,05Х2Х3 (1)
Таким образом, значимыми для выращивания сальмонелл являются следующие компоненты: X, - концентрация пептона, Х2 - концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного и Х3 - концентрация дрожжевого экстракта.
На основании уравнения (1) с вероятностью я = 0,9 можно сделать вывод, что в указанных интервалах варьирования факторов накопление сальмонелл повышается как при увеличении концентрации пептона, так и при повышении концентраций натрия фосфорнокислого двузамещенного и концентрация дрожжевого экстракта, потому что Хь Х2 и Х3 в уравнении (1) имеют положительные коэффициенты.
Для дальнейшего поиска оптимального состава питательной среды использовали метод «крутого» восхождения.
На рисунке 6 представлены данные зависимости накопления сальмонелл от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и «крутого» восхождения.
с40-
2
|35-2
>30 ■
ф
I 25 ■
С
I 20 •
X
15 ■
4 5 6 7 8
номер питательной среды
Рис. 6. Зависимость накопления сальмонелл от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и «крутого» восхождения.
По опытам 9 - 11 рисунка 6 видно, что дальнейшее движение по градиенту малоэффективно, так как достигнутое в опытах 9-11 накопление жизнеспособных сальмонелл (39,6 - 40,3 млрд/см3) равно или незначительно больше накопления в опыте № 8 (39,6 млрд/см3) - лучшего в матрице планирования ПФЭ (таблица 2).
По результатам ПФЭ и «крутого» восхождения принято решение об окончании процесса поиска оптимальных концентраций основных компонентов питательной среды для культивирования сальмонелл.
Исследования питательной среды для культивирования сальмонелл по накоплению бактериальной массы и концентрации жизнеспособных клеток показали, что разработанная питательная среда имеет высокие ростовые свойства, накопление жизнеспособных сальмонелл в разработанной питательной среде составило 32,6 - 39.6 млрд/см3 по сравнению с контрольной, в которой накопление - не более 5,2 млрд/см".
Разработанная с помощью математических методов планирования эксперимента питательная среда для культивирования сальмонелл на основе перевара Хоттингера. имеет следующий состав, мас,%:
- перевар Хоттингера 18.0 - 22.0;
- пептон 0.4 - 0.6;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный 0.3 - 0.6;
- хлористый натрий 0,7 - 0.9;
- дрожжевой экстракт 3.5 - 5.0;
- вода дистиллированная до 100.0.
Содержит 160 - 180 мг % аминного азота и имеет рН 7,6-7,8.
Во вссх исследованных образцах полученных на оптимизированной питательной среде, морфология, культуральные и биохимические свойства сальмонелл были типичными для этой культуры, выращенного как во флаконах, так и ферментерах - лабораторных и промышленных.
3.6 Оптимизация глубинного управляемого процесса культивирования
сальмонелл
Задача разработки управляемого процесса культивирования заключается в следующем: в подборе оптимальных условий, использовании метода математического планирования Гаусса - Зайделя. обеспечивающих достижение максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе данных, полученных на пилотной установке.
На первом этапе разработки управляемого периодического процесса культивирования сальмонелл провели анализ традиционного способа выращивания бактерий, заложенного в инструкцию по изготовлению этого препарата.
Культивирование сальмонелл для анализа традиционного способа выращивания в питательной среде на основе перевара Хоттингера согласно инструкции осуществляли в лабораторной установке АНКУМ - 2М при температуре 36,0 - 37,0 °С, рН среды 7,4 - 7.5 ед., без перемешивания и аэрации в течение двух часов после засева. Засевная доза 16-18 часовой культуры сальмонелл составляла 8-10% к объёму питательной среды. Перед засевом в питательную среду добавляли 0,2% глюкозы, в пересчете на сухое вещество, в виде 40% -го раствора. Затем культивирование проводили в течение 10-12 часов при постоянной аэрации при расходе воздуха 2-3 об/об в мин. Через 2. 4. 6, 10, 12 часов роста определяли рН, концен-
трацию бактерий в культуральной жидкости и через 5 часов роста добавляли 0,2 % глюкозы.
Динамика основных параметров (р02, рН, еН, температура и концентрация сальмонелл) при культивировании в лабораторной установке АНКУМ - 2М по традиционной технологии представлена на рисунке 7.
Перед засевом инокулята р02 в культуральной жидкости составило почти сто процентов, затем наблюдалось снижение р02 до 4 % в течение двух часов, так как процесс шёл без аэрации. Рост сальмонелл незначителен, еН может снизиться примерно на 10 - 20 мВ от первоначального значения.
I I
рН, ' ед. р" еН.' м В ед. о/н ч
100 - 50 -
7,6 200 - ____о/и
811 7.2 1 00 4 0
611 - 30 - \ / Р"
6,« 0 _
40 6,4 -100 20
20 6.0 -200 10 У -----рО: 1 1_1 , _1_1_1-1-1-1-1-1-
0 2 4 6 8 11) 12 время,час
Рис. 7. Динамика основных параметров периодического культивирования сальмонелл в инструктивном режиме.
р02 - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно - восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; I - время культивирования; 4 - подача глюкозы.
Через два часа выращивания начинали аэрацию культуры сальмонелл воздухом. По мере увеличения концентрации бактерий в культуральной жидкости
скорость потребления кислорода увеличивалась и примерно через 4-5 часов после начала процесса уровень р02 уменьшался до 4 - 8 % от насыщенного и ниже. На этом уровне рСЬ оставался до конца процесса культивирования (12 часов).
Исходный уровень рН, равный 7,45 ед., незначительно уменьшался в течение первых двух часов до 7,4 ед. рН. К четвертому часу культивирования рН падал до 6,4 ед. После подачи глюкозы, через пять часов культивирования, рН падал до 6,1 ед. К двенадцатому часу - рН поднимался до 7,0 ед.
Начальное значение еН составляло 190 мВ. Ко второму часу культивирования падало до 120 мВ, а потом до седьмого часа медленно падало до 10 мВ. Потом происходило резкое падение еН до минус 90 мВ к девятому часу процесса и к двенадцатому часу достигало значения минус 150 мВ.
В процессе выращивания сальмонелл один раз подавалась глюкоза (пятый час культивирования) в концентрации 0,2 %. В фазе экспоненциального роста, особенно, в первые 7 часов, наблюдалось интенсивное потребление глюкозы. На стационарной фазе роста заметного потребления глюкозы не отмечалось.
Как показали результаты экспериментов - продолжительность фазы приспособления составила 0,5 часа, а лог-фаза - 1,4 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции сальмонелл составила 0,65 час"', а время удвоения - 1,07 часа.
Анализ традиционного процесса выращивания сальмонелл позволил сделать заключение о том, что он неуправляем, продолжительность цикла большая (10 - 12 часов), а накопление бактериальной массы незначительно (3,5 - 5,6 млрд/см3).
В таблице 4 представлены экспериментальные результаты накопления жизнеспособных сальмонелл штамма S.choleraesuis 370 в процессе культивирования по инструктивному режиму.
Таким образом, результаты анализа традиционного процесса культивирования сальмонелл (таблица 4) свидетельствуют о необходимости разработки управляемого процесса периодического культивирования по основным параметрам их роста.
Таблица 4
Накопления жизнеспособных сальмонелл штамма S.choleraesuis 370 в процессе культивирования по инструктивному режиму на разных питательных средах
№ п/п Время культивирования, час Накопление жизнеспособных сальмонелл, млрд. м.к.
БХ ОБХ
1 0 0,25 0,1
2 2 0,5 1,0
3 4 1,6 6,3
4 6 2,7 7,0
5 8 3,5 7,5
6 10 3,8 7,7
7 12 5,2 7,6
Исходя из анализа традиционного процесса культивирования, литературных данных и собственных исследований определили факторы, влияющие на накопле-
ние сальмонелл в процессе культивирования: рН, рСЬ, еН и концентрация глюкозы в питательной среде.
Для определения оптимального значения р02 провели однофакторный эксперимент. Выращивание сальмонелл производили в аппарате АНКУМ - 2М. В таблице 5 представлены данные зависимости максимальной удельной скорости роста сальмонелл от парциального давления растворенного в культуралыюй жидкости кислорода.
Таблица 5
Зависимость максимальной удельной скорости роста сальмонелл от рСЬ
рО,, % 5,0 10,0 15.0 20,0 25,0 30,0 35,0
^таи 0,65 0,84 1,16 1,21 1.11 0,92 0,89
час
Из таблицы 5 следует, что оптимальным значением р02 для скорости роста сальмонелл является 20 % от насыщения среды кислородом воздуха.
Из литературных данных известно, что оптимальный уровень рН в процессе выращивания сальмонелл находится в пределах 7,6 - 7,8 ед. рН.
В некоторых опытах по выращиванию сальмонелл наблюдали задержку роста бактерий. Анализ этих процессов показал, что одной из причин этого является повышенное значение окислительно-восстановительного потенциала (еН) исходной питательной среды. Для начала роста сальмонелл необходим оптимальный уровень еН. Сальмонеллы начинают расти когда еН падает и достигает значения -минус 90 - минус 120 мВ (см. рис. 4), в зависимости от первоначального еН питательной среды.
Для начала роста сальмонелл необходим определенный оптимальный уровень еН, который достигается путем снижение еН самими бактериями, которое происходит за счет их редуцирующих свойств по «подгонке» внешних условий среды под свои потребности, но для этого требуется перестройка метаболизма бактерий на выделение редуцирующих веществ и время для изменения внешних условий, а также дополнительный расход субстрата.
После постановки экспериментов по определению значении основных параметров процесса выращивания сальмонелл, получили следующий алгоритм управляемого культивирования: питательную среду засевали 16-18 часовой культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Засевная доза составляла 8-10 % к объёму питательной среды. Сальмонеллы культивировали при 36,5 - 37,5°С в течение 8 часов. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижали до минус 90 - минус 120 мВ путём выдерживания культуры без подачи воздуха на аэрацию и включения мешалки (от 0,5 до 1,5 часов), после чего до конца процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха и скорости вращения мешалки поддерживали парциальное давление растворённого кислорода на уровне 15 - 25% от насыщения кислородом воздуха. рН культуральной жидкости регулировали на уровне 7,65-7,75 ед. с помощью 10 %-ного раствора N3011. Дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,15 - 0,25% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующимися резким повышением р02 при
неизменном расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращении снижения рН культуральной жидкости.
Динамика основных параметров управляемого культивирования сальмонелл приведена на рисунке 8.
Рис. 8. Динамика основных параметров управляемого культивирования сальмонелл в экспериментальном режиме.
рСЬ - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно - восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; I - время культивирования; | - подача глюкозы.
В разработанном управляемом режиме культивирования снижение еН до необходимого уровня минус 90 мВ достигали путём выдержки культуры сальмонелл в течение получаса без подачи воздуха на аэрацию и при выключенной мешалке. Затем в процессе культивирования уровень еН ко второму часу понижался
до минус 120 мВ и потом плавно повышался до значения минус 100 мВ в четвертому часу культивирования и держался на этом уровне до седьмого часа и потом плавно повышался до значения минус 70 мВ и оставался таким до конца культивирования.
Перед засевом посевной культуры в питательную среду снизили рН с помощью 10 % -го раствора №ОН до оптимального (7,7 ед.) значения и на этом уровне держали до конца процесса.
Аэрация сальмонелл в разработанном процессе проводилась следующим образом: в течение первых двух часов (для снижения еН) не производили подачу воздуха и перемешивание, а затем, после снижения еН с помощью изменения расхода воздуха и скорости вращения мешалки рСЬ поддерживали на уровне 20 % от насыщения кислородом воздуха.
Дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,20% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующегося резким повышением рОг. при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки, и прекращением закисления культуралы-гой жидкости.
Как показали результаты опытов, накопление жизнеспособных сальмонелл составило до 40,0 млрд м.к./см3 через 9 часов культивирования. При этом фаза приспособления продолжалась 0,15 часа, а лог-фаза - 4,5 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции сальмонелл составила 1,21 час"1, а время удвоения - 0,57 часа.
В таблице 6 представлены результаты накопления жизнеспособных сальмонелл, разных штаммов, в процессе культивирования по экспериментальному режиму.
Таблица 6
Накопление жизнеспособных сальмонелл в процессе культивирования по экспериментальному режиму
№ п/п Время культивирования, час Накопление жизнеспособных сальмонелл, млрд. м.к.
S.choleraesuis штамм ТС-177 S.choleraesuis штамм 370 S.typhi murium штамм 415 S. abortus ovis-17NS
1 0 0.07 0.035 0,02 0,06
2 ! 0.3 0.9 0,19 0,1
3 2 0,7 1.7 1,6 0,9
4 3 1,3 2,0 2,2 1,65
5 4 1,9 2,3 2.3 2,9
6 5 17.9 5,6 4.9 4,1
7 б 23.6 17.7 11.2 6,0
8 7 39.6 20.0 19,8 15.4
9 8 32.6 24,3 20.1 27,5
10 9 31,9 24.1 18,7 27,1
На рисунке 9 представлены данные зависимости накопления жизнеспособных сальмонелл разных штаммов в процессе культивирования по экспериментальному режиму. 45
5 6 7 8 9
Время, час
—^S.choieraesuis шт. ТС-177 S. choleraesuis шт. 370
-*-S.typhimurïum 415 -^-S.dublîn 160
Рисунок 9. Зависимость накопления жизнеспособных сальмонелл разных штаммов в процессе культивирования по экспериментальному режиму.
Разработанный управляемый режим культивирования сальмонелл с использованием традиционной питательной среды позволил уменьшить продолжительность фазы приспособления с 0,5 часа до 0.15 часа, увеличить продолжительность логарифмической фазы с 1,4 часа до 4,5 часов, увеличить максимальное накопление бактерий с 5,5 млрд м.к./см3 до 20.0 - 40,0 млрд м.к./см" и сократить время культивирования с 12 часов до 6 - 8 часов.
3.7 Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при производстве вакцины против сальмонеллеза
Эффективность защитной среды при высушивании бактерийных препаратов зависит не только от состава среды, но и от соотношения концентраций стабилизаторов. Если раньше подбор защитной среды являлся полностью эмпирическим, то в настоящее время для подобных целей широко используют математические методы планирования эксперимента.
Одной из задач исследований была разработка и оптимизация защитной среды высушивания с целью сохранения максимального количества живых микроорганизмов после лиофильного высушивания в процессе хранения.
Для решения задачи по оптимизации защитной среды для сальмонелл использовали план полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 24.
Критерием оптимизации «У,» для нахождения оптимальной защитной среды в процессе длительного хранения выбрали концентрацию живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации сальмонелл после сушки, принятой за 100 %, где \ - месяц хранения. Критерий оптимизации выбрали в относительных единицах для того, чтобы результаты не зависели от начальной концентрации сальмонелл в препарате после сублимационной сушки.
По данным предварительных опытов выбраны следующие факторы защитной среды для сублимационной сушки сальмонелл: Х| - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Х3 - концентрация тиомочевины; Х4 - вода или калий-фосфатный буфер (КФБ). В таблице 7 представлен план ПФЭ 24 в кодированной и натуральной размерностях.
Таблица 7
План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях
№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов
X, Х2 Х3 Хд Желатин, % Сахароза, % Тиомочеви- на, % Вода или калий-фосфатный буфер
I - - - - 0,2 8,0 0,2 Вода
2 - + - - 0,2 12,0 0.2 Вода
3 + - - - 0,6 8,0 0,2 Вода
4 + + - - 0,6 12,0 0,2 Вода
5 - - + - 0,2 8,0 0,6 Вода
6 - + + - 0,4 12,0 0,6 Вода
7 + - + - 0.6 8,0 0.6 Вода
8 + + + - 0,6 12,0 0,6 Вода
9 - - - + 0,2 8,0 0,2 КФБ
10 - + - + 0,2 12,0 0,2 КФБ
11 + - - + 0,6 8,0 0,2 КФБ
12 + + - + 0,6 12,0 0,2 КФБ
13 - - + + 0,2 8,0 0.6 КФБ
14 - + + + 0,2 12,0 0,6 КФБ
15 + - + + 0,6 8,0 0,6 КФБ
16 + + + + 0.6 12,0 0.6 КФБ
х01 0,4 10,0 0,4 КФБ
дх, 0.2 2,0 0,2 ВодаЖФБ
зо
После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных, получили уравнения регрессии (2), показывающие зависимость сохраняемости сальмонелл от концентрации основных компонентов защитной среды в процессе сушки.
У=66,87+7,16Х]+9,47X2+7,69Хз-4,07Х4+5,89Х|Х2-5,37X1X4-2,81Х2Х3-2.01X2X4-3,66X3X4-5,07X1X2X3+4,24Х|Х2Х4-2,74Х1Х3Х4-5,86X3X3X4 (2)
Уравнение (2) описывает сохраняемость жизнеспособных сальмонелл в процессе сушкн.
На основании полученных данных с вероятностью я = 0,9 можно сделать вывод, что уравнение (2) адекватно описывает экспериментальные данные (1:гмс. = 2,11 < Р|ч.ор. = 2,18). Это значит, что в указанных интервалах варьирования выживаемость сальмонелл в процессе сушки зависит от концентрации основных компонентов защитной среды: Х1 - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Хз - концентрация тиомочевины; Х4 - дистиллированная вода.
В таблице 8 представлены экспериментальные данные по сохраняемости жизнесособных сальмонелл па разных защитных средах по плану ПФЭ 24 в процессе сушки.
Таблица 8
Сохраняемость жизнеспособных сальмонелл на различных защитных средах с 1 по 12 месяц хранения
№ п/п Уср., до сушки млрд м.к./см3 Усро, млрд м.к./см3 жизнеспособность сальмонелл по месяцам хранения
Усрь млрд М.К./ см3 Усрз, млрд м.к./см3 УсРб, млрд м.к./см3 Уср9, млрд м.к./см3 Уср 12, млрд м.к./см3
1 15,33 7,33 6,48 5,27 4,47 3,67 2,90
2 16,17 8,07 7,60 6,85 5,40 4,83 3,83
3 17,07 9,30 7,05 6,00 5,17 4,17 3,33
4 20,12 17,33 16,35 14,97 13,10 12,20 10,53
5 16,73 8,25 8,00 6,98 6,58 6,17 5,50
6 24,00 20,78 19,92 18,07 17,43 16,35 15,78
7 25,37 21,87 20,32 18,65 18,37 17,48 16,95
8 26,00 27,83 27,18 26,47 26,00 25,37 23,97
9 14,77 7,63 5,95 4,50 3,50 3,00 2,67
10 19,42 10,67 8,38 7,82 7,08 6,50 5,83
11 24,02 8,07 7,75 7,33 7,15 6,83 6,33
12 18,9 17,93 16,63 16,13 15,20 14,83 14,32
13 25,02 18,93 17,30 16,92 16,05 15,45 14,80
14 25,53 15,77 15,13 14,23 13,63 12,33 11,48
15 19,37 11,70 11,23 10,22 9,50 9,00 7,33
16 20,15 14,00 12,93 11,85 10,00 8,92 8,00
Выживаемость сальмонелл повышается как при увеличении концентрации желатина, сахарозы так и при увеличении концентрации тиомочивины, и при
31
использовании в качестве растворителя воды вместо калий-фосфатного буфера, так как Хь Х2 и Х3 в уравнение (2) имеют положительные коэффициенты. При использование в качестве растворителя калий-фосфатного буфера, вместо воды,
выживаемость сальмонелл уменьшается, потому что Хд в уравнении имеет знак «-».
Анализируя полученные данные эксперимента по оптимизации состава защитной среды для процесса сушки сальмонелл можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 8, табл. 8).
Далее проводили эксперименты по оптимизации защитной среды в процессе длительного хранения согласно плану ПФЭ 24 (таблицы 7).
Количество жизнеспособных сальмонелл в процессе длительного хранения определяли через I, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения и рассчитывали уравнения регрессии для каждого месяца хранения соответственно.
После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных, получили уравнения регрессии (3 - 6), показывающие зависимость сохраняемости сальмонелл от концентрации основных компонентов защитной среды после 1, 3, 6, 9, 12 месяцев хранения, соответственно.
У,= 91,08 + 1,16X1+ 1,64Х2+3,81Хз-0,94Х4 + 0,42Х1Х2- 1,31Х1Х3+З,ОХ,Хд
-1,06Х2Х3-1,85X2X4-0,7X1X3X3-1,92Х,Х2Х4-2,59X1X3X4+1,51 Х2Х,Х4 (3)
У3=82,77+2,74X1+3,66X2+5,18X3-4,43X1X3X4 (4)
У6=75,6 + 3,72X1 + 3,01Х2 + 7,62Хз - 4,33X1X3 - 2,ЗЗХ2Х3 - 1,94Х2Х, -2,74X3X4-3,45Х,Х2Х4-5,63Х|ХзХ4 (5)
У9=69,86 + 4,43Х, + 3,35X2 + 8,26Х3 - 4,63Х]Х3 - 3,54Х2Х3 - 2,97Х2Х4 -4,16X3X4-3,52X1X2X4-6,17X1X3X4 (6)
У,2=63,04+4,26Х,+3,81X2+9,09X3+1,8X4-5,53X1X3-2,94X2X3-2,54X2X4-6,23X3X4-2,18X1X2X4-6,96X1X3X4 (7)
Уравнения регрессии (3 - 6) описывают сохраняемость сальмонелл в процессе длительного хранения через 1, 3, 6, 9,12 месяцев, соответственно.
На основании полученных данных с вероятностью я = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (3 - 6) адекватно описывают экспериментальные данные (Бра,. = 2,09; 1,89; 1,53; 1,37; 1,68 < Ртеор. = 2,15).
В уравнениях (3 - 6) наряду с линейными значимыми являются эффекты межфакторного взаимодействия. Это означает, что опыты ПФЭ были поставлены в области факторного пространства с высокой кривизной поверхности отклика, т. е. вблизи оптимума.
Окончанием эксперимента по оптимизации состава защитной среды можно считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 8, таблицы 7).
Наилучшей защитной средой высушивания является среда (№ 8), в которой концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 0,6%; сахароза - 12,0%; тиомочевина - 0,6%. В качестве растворителя -дистиллированная вода.
Оптимизированная защитная среда высушивания позволила увеличить сохраняемость жизнеспособных сальмонелл в вакцине в процессе длительного хра-
нения на 45±10%, для разных штаммов сальмонелл, по сравнению с использованием традиционной защитной среды высушивания.
3.8 Исследование антигенных и иммуногенных свойств сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней
3.8.1 Изучение антигенной активности сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней
На кроликах. Трем кроликам (первая группа) ввели по 6 млрд.м.к. моновакцины из штамма 8. с1к>1егаеншч 370, трем кроликам (вторая группа) ввели по 6 млрд.м.к. моновакцины из штамма Б. 1урЫшигшт 415.
Перед введением антигенов, а затем через каждые 7 дней после иммунизации у кроликов брали кровь и в сыворотках определяли титры агглютининов в РА с корпускулярным антигеном каждого штамма.
Установлено, что через 7 дней после иммунизации титры агглютининов в сыворотках крови кроликов первой группы (Б. 370) достигли 7,32 -
7,82 ±0,1 лог, в сыворотках крови кроликов второй группы (8. 1урЫтипит 415) достигли 8,82 ±0,62 - 9,32 ±0,01 лог; разница показателей ( в 0,5 лог) между группами несущественна (Р < 0,05).
В последующие дни количество агглютининов увеличивалось и достигло максимума к 21-му дню - титры агглютинина составляли к Б. сЬо1егаек1^ 370 10,32+0,01 - 10,82+0,62 лог, а к 8. СурЫтипит 415 10,32±0,01 - 10,82+0,62 лог. Такой уровень титров агглютининов удерживался до 28-го дня, после чего наметилась тенденция к снижению и к 49-му дню титры не превышали 6-7 лог.
3.8.2 Определение оптимальной дозы препарата
Для проведения исследований препарат вводили однократно кроликами внутримышечно в дозах: 3, 6. 12, 24 и 48 млрд.м.к. (по 4 кролика на дозу). После иммунизации у опытных кроликов не наблюдалось каких-либо клинических изменений, даже при введении наибольшей дозы (48 млрд.м.к.), что свидетельствует о безвредности препарата.
От иммунизированных кроликов через каждые 7 дней брали кровь и определяли количество агглютининов в РА. Установлено, что через 7 дней после иммунизации титров агглютининов повысились до 7,32 +0,1 - 8,32 +0,01 лог. Нарастание уровня агглютининов в сыворотки крови кроликов продолжалось до 28-го дня и составило в среднем 10,32 +0,01 лог, после чего наметилась тенденция к снижению до 5-6 лог. Таким образом оптимальной иммунизирующей дозы для кроликов массой 2-2,5 кг является доза 3 млрд.м.к. Увеличение дозы более 3 млрд.м.к. не приводит к адекватному увеличению титров агглютининов в крови опытных кроликов.
3.8.3 Влияние интервала иммунизации на антителогенез кроликов
Три группы кроликов (по 4 животных) иммунизировали двукратно внутримышечно в дозе 3 млрд.м.к. с различными интервалами: первая группа - с интервалом 7 дней; вторая - с интервалом 14 дней; третья - с интервалом 21 день. Перед
зз
введением препарата, а также через каждые 7 дней в сыворотках крови определяли титры агглютинина в РА.
Исследования показали, что через 7 дней после первой иммунизации титры агглютининов составляли 7,32+0,01 - 8,32 ±0,01 лог.
У кроликов, ревакцинированных через 7 дней, титры агглютитинов к 7-му дню после реиммунизации (14 дней с начала опыта), достоверно повысились на 23 лог и составили в среднем 10,32 ±0,01 лог. В дальнейшем повышение титров было незначительным (на 0,5-1 лог), а с 35-го дня началось снижение и к 42-му дню титры составляли 9,32±0,01 - 10,32+0,01 лог.
У кроликов, ревакцинированных через 14 дней, через неделю после реваци-нации титры агглютининов достоверно повысились на 2-3 лог, далее до 35-го дня они оставались на уровне 11,32 +0,01 лог, после чего началось снижение.
Ревакцинация кроликов через 21 день практически не стимулировала интенсивность антителогенеза.
Таким образом, установлено, что оптимальным интервалом между первой и второй иммунизацией следует считать 7-14 дней, т.к. в этих интервалах вторичный иммунный ответ более четкий.
3.8.4 Определение оптимальных доз препарата при двукратной иммунизации
Кроликов, массой 2-2,5 кг (по 4 кролика в группе), иммунизировали внутримышечно двукратно с интервалом 10 дней разными дозами препарата. Кроликам первой группы ввели препарат в дозе 300 млн.м.к. и 3 млрд.м.к.; второй группы - 3 млрд.м.к. и 300 млн.м.к.; третьей группы - 3 млрд.м.к. и 3 млрд.м.к.; четверной группы - 3 млрд.м.к. и 6 млрд.м.к.
Содержание агглютининов определяли на 7, 14, 21 и 28-й дни. Установлено, что титры агглютининов кроликов первой группы к 10-му дню были на 1-2 лог ниже (6,32±0,01 - 7,32 +0,01) лог, чем у кроликов других групп (7,82+0,62 -8,82+0,62) лог (Р < 0,05).
Таким образом, установлено, что более интенсивно антителообразование достигается при равных дозах (3 млрд.м.к. и 3 млрд.м.к) вакцины.
3.8.5 Изучение нммуногенностн вакцины на белых мышах
Две группы мышей (по 40 голов) иммунизировали однократно подкожно в область спины в дозе 150 млрд.м.к. на одну мышь. На 20-й день после имммуни-зации первой группы опытных и второй группе контрольных мышей ввели культуру S. choleraesuis 370 в дозах 10, 100, 1000 и 10000 м.к. внутрибрюшинно. На каждую дозу в опыте и контроле по 10 мышей.
Третью опытную группу (40 голов) и четвертую (контрольную) группу (40 голов) заразили живой культурой S. typhimurium 415 в тех же дозах как первые две группы.
Наблюдение за зараженными мышами вели в течение 14 дней, отмечая количество павших на каждую дозу заражения. Результаты обрабатывали по методу Рида - Менча, рассчитывали для иммунизированных и контрольных мышей. Разница между показателями принимали за показатель иммуногеяности препарата.
Было установлено, что иммунизированные мыши выдерживали дозы заражения, превышающие 1-051| для неиммунпзированных животных в 10 раз (Б. с1ю1егае51Ш 370) и в 63 раза (5. 1урЫтигшт 415), что свидетельствует о высоких иммуноген-ных свойств вакцины.
3.8.6 Изучение безвредности, реактогенностн и нммуногенностл вакцины проводили на свиноматках и поросятах свинокомплекса племзавода «Гульке-вичский» Краснодарского края.
Изучение безвредности вакцины. 5 свиноматок за 15-17 дней до опороса иммунизировали вакциной в дозе по 45 млрд.м.к., что составило 3 прививочные дозе. Десяти поросятам послеотъемного периода ввели вакцину по 30 млрд.м.к., что составило так же 3 прививочные дозы. Ни у свиноматок, ни у поросят не отмечено каких-либо отклонений в состоянии здоровья.
Все взятые для исследования свиноматки опоросились в срок, от них получено по 8-10 деловых поросят. Таким образом установлено, что трехкратные дозы вакцины - 45 млрд.м.к для свиноматок и 30 млрд.м.к. для поросят были безвредными
3.9 Клинические испытания сухой вакцины против сальмонеллеза свиней
Сухую живую вакцину против сальмонеллеза свиней из штаммов 8.с1ю!егае81ш 370, БдурЫшипит 415 применяют с профилактической целью в неблагополучных по сальмонеллезу свиней хозяйствах, в которых бактериологически установлен возбудитель 5. сЬокгаевшэ или 5. [урЬнтп шт.
Свиноматки подлежат вакцинации во второй половине супоросности за 18 -20 дней до ожидаемого онороса в дозе 15 млрд. м.к. на голову.
Поросят послеотъемного периода вакцинируют двукратно с интервалом 10 -15 дней подкожно в дозе по 3 млрд. м.к.
Иммунитет после вакцинации наступает через 10-14 дней и сохраняется в течение 6-8 мес.
По разработанной технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных на Ставропольской биофабрике были изготовлены промышленные серии препарата.
В хозяйствах Костромской области и Краснодарского края, ранее неблагополучных по сальмонеллезу, была комиссионно проведена вакцинация свиноматок и поросят вакциной против сальмонеллеза (паратифа) поросят. Случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений, не наблюдалось в течение 6 месяцев.
Промышленный выпуск вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 - 2012 гг. составил - 15848360 доз.
4. ВЫВОДЫ
1. Разработан алгоритм промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов и на его основе усовершенствована промышленная технология производства бактерийных препаратов из вакцинных штаммов сальмонелл, что способствовало повышению эффективности производства, а в итоге улучшению эпизоотологической ситуации по проблеме сальмонеллезной инфекции свиней.
2. Разработанная технология промышленного производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней позволила:
- повысить накопление сальмонелл за счет лучших ростовых качеств разработанной питательной среды в 2,5 раза и сократить время культивирования с 16 -18 часов до 7 - 9 часов но сравнению с традиционной;
- улучшить условия сохраняемости жизнеспособных сальмонелл в вакцине в процессе длительного хранения с использованием оптимизированной защитной среды высушивания на 30 ± 10 % для разных штаммов по сравнению с традиционной защитной средой.
3. Применение усовершенствованной технологии промышленного производстве вакцины против сальмонеллеза свиней позволило:
- увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл на оптимизированной питательной до 32,6 - 39,6 млрд/см3 по сравнению с контрольной - не более 5,2 млрд/см3;
- уменьшить продолжительность фазы приспособления с 0,5 часа до 0,15 часа, увеличить продолжительность логарифмической фазы с 1,4 часа до 4,5 часов и сократить время культивирования с 12-ти до 6 - 8 часов.
- улучшить условия сохраняемости жизнеспособных сальмонелл в вакцине в процессе длительного хранения с использованием оптимизированной защитной среды высушивания на 45 ± 10%. для разных штаммов сальмонелл, по сравнению с традиционной защитной средой.
- установлено, что превышение времени подачи бактериальной культуры на центрифугирование больше чем на 1,5 часа ведет к снижению концентрации жизнеспособных сальмонелл в процессе длительного хранения в 1,6 - 2,9 раза
4. Разработанная сухая живая вакцина является ареактогенной и безвредной для лабораторных животных, супоросных свиноматок и поросят послеотъемного периода. Она обладает высокой антигенной активностью для указанных животных, выраженными иммуногенными свойствами, что проявляется образованием достаточно большого количества агглютининов. Оптимальная иммунизирующая доза для супоросных - 15 млрд.м.к. /гол.; для поросят послеотъемного периода - 3 млрд.м.к. /гол.
5. Приготовленная вакцина вызывает наиболее выраженный специфический иммунный ответ при ее двукратном применении в равных дозах с интервалом между инъекциями 7-14 дней.
Однократная вакцинация супоросных свиноматок за 18-21 дней до ожидаемого опороса обеспечивает образование и накопление агглютининов в сыворотке крови и молозиве в высоких титрах, обуславливая колостральный иммунитет у полученных от этих свиноматок поросят. Колостральный иммунитет у поросят со-
храняется до 30-35-ти дневного возраста. Поэтому вакцинацию поросят целесообразно проводить в возрасте 30-35 дней, что в итоге обеспечивает защиту поросят послеотъемного периода до 110-120-ти дневного возраста.
6. Экспериментальные серии сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней, примененных в оптимальных дозах в условиях неблагополучного хозяйства, позволили обеспечить сохранность молодняка свиней на 29,4 % по сравнению с контролем.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Разработанная сухая живая вакцина против сальмонеллеза свиней и технология ее производства позволяет использовать ее в качестве средства специфической профилактики сальмонеллеза у супоросных свиноматок и поросят послеотъемного периода, а также коррекции первичного иммунодефицита молодняка свиней.
Для практического использования предложено:
- «Инструкция по изготовлению сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней», утверждена директором ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии 26.10.2012 г.
- «Опытно-промышленный регламент производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней» утвержден директором ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии 20.10.2012 г.
- Стандарт организации (СТО) ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии «Вакцина сухая живая против сальмонеллеза свиней», утвержден директором ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии 26.10.2012 г.
- «Инструкция по применению сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней», утверждена директором ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии 20.10.2012 г.
Методические положения: «Методическое положение «Опытно-промышленный регламент производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней» ,2011 г., «Методическое положение «Инструкция по применению сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней», 2011 г. и заслушаны на секции «Ветеринарная биотехнология», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым.
6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
6.1. Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ
1. Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., Анисимова JI.B., Раевский А.А., Коро-теева JI.A. Оптимизация условий культивирования сальмонелл с использованием питательных сред на основе перевара Хоттингера. «Ветеринария и кормление», 2010, 5, С.8-9.
2. Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., Анисимова JI.B., Раевский А.А., Ко-ротеева JI.A. Культивирование вакцинных штаммов сальмонелл с использованием питательных сред из нетрадиционных источников сырья. «Достижения науки и техники АПК», 2010, 8, С.65-66.
3. Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., Раевский А.А., Скородумов Д.И., Иванов А. А. Разработка вакцины против сальмонеллеза свиней на основе лизат-антигенов. «Ветеринарный врач», 2010, 4, С. 14-15.
4. Самуйленко А .Я., Раевский А.А., Меньшенин В.В., Егоров И.А., Андрианова Е.Н. Эффективность применения симбиотического лизинсинтезирующе-го препарата при выращивании цыплят-бройлеров. «Достижения науки и техники АПК», 2010, 7, С.38-39.
5. Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., Раевский А.А., Нежута А.А., Павленко И.В. Вакцинопрофилактика сальмонеллеза молодняка свиней. «Свиноводство», 2011, 1, С. 48-49.
6. Эрнст JI., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Меньшенин В.В., Павленко И., Раевский А., Рахманина Е., Егоров, И., Андрианова Е., Салеева И. Ли-зинсинтезирующий препарат Пролизэр при выращивании бройлеров. «Птицеводство», 2011, 4, С. 35-36.
7. Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Павленко И.В., Анисимова JI.B., Меньшенин В.В. Перспективные направления в технологии культивирования бактерий при производстве вакцин для ветеринарной медицины. «Ветеринария и кормление», 2011, 4 , С. 8-9.
8. Раевский А.А., Павленко И.В., Меньшенин В.В., Нежута А.А. Технология изготовления сухой живой вакцины против листериоза животных из штамма АУФ. «Ветеринария», 2012, 1, С. 55-56.
9. Меньшенин В.В. Актуальность разработок технологии производства про-биотиков ветеринарного назначения. «Ветеринарный врач», 2012, 4, С. 2-4.
Ю.Меньшеннн В.В. Культивирование сальмонелл в питательных средах на основе гидролизата сухого белкового концентрата.// Труды Кубанского гос. аграрного университета, 2012, 4(37), С.124-125.
11.Меньшенин В.В. Применение биоферментеров нового поколения для глубинного культивирования бактерий. // Труды Кубанского гос. аграрного университета, 2012, 4(37), С. 163.
12. Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Раевский А.А., Павленко И.В., Меньшенин В.В. Эффективность применения симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-613 при доращивании поросят послеоть-емного периода. «Свиноводство», 2012, 1, С. 42-43.
13.Павленко И., Гринь А., Меньшенин В., Егоров И., Салеева И., Иванов А., Ефимов Д. Применение лизина в бройлерном птицеводстве. «Птицеводство», 2012, 6, С. 19-22.
14.Павленко И.В., Раевский A.A., Меньшенин В.В. Культивирование в мембранном биологическом реакторе сальмонелл и листерий. «Ветеринарный врач», 2012, 2, С.17-18.
15.Павленко И.В., Меньшенин В.В., Нежута A.A., Гринь A.B., Лузан Н.С. Разработка технологии изготовления сухой живой бивалентной вакцины против листериоза животных из штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52. «Ветеринарный врач», 2012, 5, С.14-16.
16. Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Меньшенин В.В. Технология получения вакцины против геморрагической септицемии рыб. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, 2012, 6, С. 49.
17. Павленко И.В., Меньшенин В.В., Гринь A.B. Технология изготовления вакцины против сальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin № 160 . «Ветеринария», 2012, 11, С.28-30.
18.Павленко И.В., Меньшенин В.В., Егоров И.А., Салеева И.П., Ефимов Д.Н., Иванов A.B. Использование симбиотического препарата в кормлении цыплят-бройлеров. «Птица и птицепродукты», 2013, 1, С. 45.
6.2. Список патентов
19. Меньшенин В.В. «Способ получения вакцины против некробактериоза сельскохозяйственных животных». Патент №1828593.
20. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Лукьянова Е.М., Самуйленко А.Я., Меныненнн В.В., Галенский А.Г., Шеин В.В. Способ получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней. Авт.свид. № 216982 от 18.02.99.
21. Скичко Ы.Д., Гуславский А.И., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Красуткин С.Н., Чипиус Ю.Г., Висящая Т.Ф., Гринь С.А., Крыжановская Е.В., Меньшенин В.В. Способ увеличения выхода культуры клеток из перепелиных эмбрионов. Заявка на Патент РФ № 2007142025 от 15.11.07.
6.3. Список научных публикаций в других изданиях
22.Коротеева Л.А., Маслак A.A., Емельянов Н.И., Фоменко A.C., Меньшенин
B.В. Изучение влияния компонентов питательной среды на рост сальмонелл //Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов». М., 1991,
C.144-145.
23. Меньшенин В.В., Яковлев Т.Е., Самуйленко А.Я., Шкварук Т.Я., Быкова Н.Н, Тюрина H.H. Получение антивидового конъюгата анти-IgG утки, меченного ферментом пероксидазой, для использования в иммунофермептном
анализе (ИФА)//Тезиеы докладов IV Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов». М., 1991, С.141-142.
24. Фоменко A.C., Коротеева Л.А., Дубинина Г.П., Меныненнн В.В., Емельянов Н.И., Артюхин В.И., Вопияшин О.Я. Изучение возможности использования рыбных гидролизатов при культивировании сальмонелл и пастерелл //Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов», М., 1991, С.172-173.
25.Меньшенин В.В., Ярцев М.Я., Коротеева Л.А., Блехерман Б.Е. Культивирование сальмонелл в жидких питательных средах.// Сб. научи, тр. «Разработка технологических процессов изготовления биопрепаратов для профилактики и диагностики болезней сельскохозяйственных животных». М., 1991, С. 17-20.
26.Меньшенин В.В., Яковлев Е.Т., Самуйленко А.Я, Шкварук Т.Я., Быкова Н.Н, Тюрина H.H. Получение антивидового конъюгата анти-IgG утки. «Ветеринария», 1991, С.34-36.
27.Меньшенин В.В., Солодков B.C., Голенский А.Г., Школьников Е.Э., Ко-ломнина Г.Ф. Освоение промышленной технологии производства лечебной сыворотки против энтерококковых заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. Тез.докл. V Всерос. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 1996, С. 187.
28. Школьников Е.Э., Меньшенин В.В. Концентрирование лечебных сывороток методом ультрафильтрации. // Тез.докл. V Всерос. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 1996, С. 213.
29.Школьников Е.Э., Меньшенин В.В., Солодков B.C., Алейников В.П. К вопросу получения концентрированных лечебных сывороток. //Тез. докл. на-уч.-произв. конф. «100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России». Курск, 1996, С. 361-362.
30. Меньшенин В.В., Лавченко Е.Г., Соломаха О.И., Бондаренко Е.И. Питательные среды для промышленного культивирования F.necrophorum. «Ветеринария», 1997, 3, С.27-28.
31.Соломаха О.И., Кириллов Л.В., Меньшенин В.В., Лавченко Е.Г., Жиров
B.А. Профилактика некробактериоза животных. «Ветеринария», 1997, 5, С. 15-17.
32.Першин В.А., Школьников Е.Э., Меньшенин В.В., Клинский Ю.Д., Беляков
C.П. Производственные испытания гонадотопина сывороточного. «Вестник РАСХН». 1998, 5, С. 68-70.
33.Школьников Е.Э., Меньшенин В.В., Голенский А.Г., Солодков B.C., Мишустина Е.Б. Изготовление антигена для получения сыворотки против рожи свиней. // Тез.докл. Всесоюзн. научн-практ. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов» (24 декабря 1998 г.). Щелково, С. 7-8.
34.Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф. Усовершенствование технологии изготовления сыворотки против рожи свиней.// Мат. межд. на-учно-практич. конф. «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных». Минск, 2000, С. 191-197.
35.Першин В.А., Школьников Е.Э., Меньшенин B.B., Коломнина Г.Ф., Клин-ский Ю.Д. Использование гонадотопина сывороточного для вызывания суперовуляции при трансплантации зародышей.// Мат. междунар. научно-практич. конф. «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных». Минск, 2000, С.544-545.
36. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Меньшенин B.B., Галенский А.Г. Культивирование бактерий рожи для получения антигена при изготовлении сыворотки против рожи свиней. //Тез. докл Всерос. научно-практ. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000, С. 180-181.
37. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Меньшенин B.B., Лукьянова Е.М. Антиген для иммунизации животных-продуцентов при производстве сыворотки против рожи свиней. // Тез. докл. Всерос. научно-практической конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково, 2000, С. 181 -182.
38.Школышков Е.Э., Коломнина Г.Ф., Меньшенин B.B., Шеин В.В., Мишустина Е.Б. Сравнительная оценка активности инактивированного и живого рожистого антигена для получения сыворотки. // Тез. докл. Всерос. научно-практической конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000, С. 183-184.
39. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Меньшенин В.В., Галенский А.Г., Шеин В.В. Разработка схемы гипериммунизации волов продуцентов для изготовления сыворотки против рожи свиней. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».// Тез. докл. Всерос. научно-практической конф., Щелково, 2000, С. 184-185.
40.Школьников Е.Э., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Моисеева H.A., Меньшенин В.В. Усовершенствование питательной среды и условий культивирования бактерий рожи свиней.// Сб. ст. межд. научно-практ. конф. «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооан-тропонозными болезнями животных». Покров, 2000, С.251-252.
41. Евдокимов A.A., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Еремец В.И., Мень-шенин В.В., Токарик Э.Ф., Люлькова Л.С., Ямникова С.С. Разработка методики и техники получения хламидийной сыворотки от овец-доноров.// Сб. докл. междунар. конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2001, С. 151-154.
42. Школьников Е.Э., Самуйленко А.Я., Меньшенин В.В., Гнездилов И.Д. Разработка методики и технологии получения лечебной сыворотки против пневмонии свиней// Науковий висник Нацюналыюго аграрного унивесите-ту. Киев, 2001, №36, С.266-268.
43.Школьников Е.Э., Моисеева H.A., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Меньшенин В.В. Оптимизация процесса культивирования бактерий рожи для получения антигена при производстве сыворотки против рожи свиней// Тез. докл. Всерос. научн. конф. «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов». М., 2001, С. 59-60.
44. Школьников Е.Э., Самуйленко А.Я., Моисеева H.A., Меньшенин В.В. Получение противорожистой сыворотки от волов-продуцентов с использованием живого и инактивированного антигена// Тез. докл. Всерос. научн. конф. «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», М., 2001, С.60-61.
45.Караваев Ю.Д., Мелышк Н.В., Рубан Е.А., Меньшенин В.В. Современное состояние проблемы борьбы с некробактериозом северных оленей.// Мат. междунар. конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2003, С. 150-152.
46.Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Скородумов Д.И., Шегидевич Э.А., Меньшенин В.В., Галенский А.Г., Шеин В.В. Получение сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней.//Мат. междунар. конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2003, С. 129-132.
47. Школьников Е.Э., Меньшенин В.В. , Коломнина Г.Ф. Изучение профилактического и лечебного эффекта сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней// Мат. межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2003, С.133-134.
48.Меньшенин В.В. Получение антигена для иммунизации продуцентов противорожистой сыворотки. //Мат. межд. научно-практ. конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». Щелково, 2004, С. 177-178.
49. Меньшенин В.В., Школьников Е.Э. Оценка активности рожистого антигена в зависимости от способа его получения. //Мат. межд. научно-практ. конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». Щелково, 2004, С. 178-180.
50.Коротеева JI.А., Анисимова J1.B. Раевский А.А, Меньшенин В.В.,Фролов И.Ю. Культивирование сальмонелл в питательных средах на основе сухого белкового гидролизата // Мат.межд.науч.-практ.конф. «Научные основы производства ветерин. биологических препаратов». Щелково, 2005, С.329-333.
51.Гринь СЛ., Школьников Е.Э., Коломшша Г.Ф., Меньшенин В.В., Крыжа-новская Е.В., Чулков А.К., Скородумов Д.И., Ставцева Л.Я., Малик Е.В. Получение гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза на свиньях-продуцентах. Мат. межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2007, С.250-253.
52.Скичко Н.Д., Школьников Е.Э., Гуславский А.И., Меньшенин В.В., Крыжановская Е.В. Кормовая добавка для выращивания бройлерных цыплят. //Мат. межд. научно-практ.конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2007, С. 292-295.
53. Школьников Е.Э., Самуйленко А.Я., Меньшенин В.В., Гринь С.А., Еремец Н.К., Фролов Ю.Д., Юхименко JI.H. Специфическая профилактика бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза рыб). // Труды Кубанского гос. аграрн. университета. Ветеринарные науки. 2009, 1,1, С.93-95.
54. Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Раевский А.А, Анисимова J1.B., Соловьев Л.Б., Еремец В.И., Меньшенин В.В., Нежута A.A. Технология изготовления бивалентной вакцины против листериоза животных из штаммов УСХИ - 19 и УСХИ - 52.// Ветеринарная медицина 95. Международный тематический научный сборник. Харьков, 2011, С. 181-182.
55.Школьников Е.Э., Раевский A.A., Меньшенин В.В., Нежута A.A., Павленко И.В., Егоров И.А., Андрианова E.H. Применение симбиотического препарата на основе E.coli VL-613 в бройлерном птицеводстве // Материалы Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации», Покров, 2011, С. 265-269.
56.Эрнст Л., Самуйленко А., Школьников Е., Меньшенин В.В., Павленко И., Раевский А., Рахманина Е., Егоров И., Андрианова Е., Салеева И. Лизин-синтезирующий препарат Пролизэр при выращивании бройлеров. «Птицеводство», 2011,4, С. 35-36.
57.Павленко И.В., Меньшенин В.В., Бобровская И.В., Анисимова Л.В., Нежута A.A. Усовершенствование технологии изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin № 160. // Экология и животный мир. Минск, 2012, 1, С. 46-47.
58. Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Павленко И.В., Меньшенин В.В., Бобровская И.В. Технология изготовления сухой живой вакцины против сальмо-
неллеза телят из штамма Salmonella Dublin № 160. // Ученые записки. Витебск, 2012, Т. 48, выпуск 2, часть 1, С. 138-140.
59. Павленко И.В., Школьников Е.Э., Еремец В.И., Меныыенин В.В., Гринь A.B. Эффективность применения добавки «Пролизэр - БиоР» при доращи-вании поросят послеотьемышей// Мат. межд. научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки и практики в эффективном развитии животноводства», Алматы, 2012, С. 408-412.
60. Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Раевский A.A., Еремец В.И., Бобровская И.В., Меньшенин В.В., Самуйленко А.Я. Культивирование сальмонелл и эшерихий в мембранном биологическом реакторе // Мат. межд. научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки и практики в эффективном развитии животноводства», Алматы, 2012, С. 457-460.
ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АНКУМ - 2М - аппаратура непрерывного культивирования микроорганизмов
ДИ - доклинические испытания
Ж/С - жизнеспособные микроорганизмы
ЗС - защитная среда высушивания
КЛ - клинические испытания
КФБ - калий-фосфатный буфер
КОЕ - колониеобразующие единицы
МПА - мясо-пептонный агар
МПБ - мясо-пептонный бульон
НТД - нормативно - техническая документация
ПС - питательная среда
ДФЭ - дробный факторный эксперимент
ПФЭ - полный факторный эксперимент
СЖС - сахарозо-желатиновая среда
СТО - стандарт организации
ТП - основные технологические процессы
ТТХ - технико-технологические характеристики
ТУ - технические условия
ФР - физиологический раствор
-ная летальная доза ХГц - координаты центра эксперимента; ДХ; - интервал варьирования.
р02 - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно - восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; I - время культивирования; | - подача глюкозы.
Подписано в печать 18.12.2013 г.
Усл.п.л. - 2.5 Заказ №18178 Тираж: 110 экз
Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Меньшенин, Владимир Викторович, Щёлково
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРОМЫШЛЕННОСТИ
На правах рукописи
052014516Э.1
МЕНЫНЕНИН Владимир Викторович
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ (НА МОДЕЛИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ)
03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАСХН и НААН Украины
А.Я. Самуйленко
Щелково - 2013
ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АНКУМ - 2М - аппаратура непрерывного культивирования микроорганизмов
ДИ - доклинические испытания
Ж/С - жизнеспособные микроорганизмы
ЗС - защитная среда высушивания
КЛ - клинические испытания
КФБ - калий-фосфатный буфер
КОЕ - колониеобразующие единицы
МПА - мясо-пептонный агар
МПБ - мясо-пептонный бульон
НТД - нормативно - техническая документация
ПС - питательная среда
ДФЭ - дробный факторный эксперимент
ПФЭ - полный факторный эксперимент
СЖС - сахарозо-желатиновая среда
СТО - стандарт организации
ТП - основные технологические процессы
ТТХ - технико-технологические характеристики
ТУ - технические условия
ФР - физиологический раствор
1Л}5о/см - 50%-ная летальная доза
Х(н - координаты центра эксперимента;
АХ; - интервал варьирования.
рОг - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно - восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; I - время культивирования;
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Состояние отечественного свиноводства 12
1.2. Род Salmonella 25
1.2.1. Распространенность сальмонелл в природе 29
1.2.2. Средства и методы специфической профилактики сальмонеллеза 36
1.3. Культивирование сальмонелл 3 7
1.3.1. Питательные потребности сальмонелл 3 7
1.3.2. Принципы составления и подбора питательных сред 42
1.3.3. Приготовление посевного материала 43
1.3.4. Процессы культивирования микроорганизмов 45
1.3.4.1. Классификация методов культивирования 47
1.3.4.2. Культивирование микроорганизмов 50
1.3.4.3. Физиологическое состояние микроорганизмов в процессе рос- 54 та и развития при периодическом культивировании
1.3.4.4. Изменения биологических свойств микроорганизмов при пе- 60 риодическом культивировании
1.3.5. Способы концентрирования бактериальных культур 62
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 2.1 .Материалы и методы 65
2.2. Результаты исследований 79
2.2.1. Разработка модели промышленной технологии производства 79 вакцины против сальмонеллеза свиней
2.2.2. Разработка технологии получения вакцины против сальмонелле- 82 за свиней
2.3. Разработка питательной среды для глубинного управляемого про- 86 цесса культивирования сальмонелл штаммов S.typhimurium № 415 и
S.choleraesuis № 370
2.4. Разработка глубинного управляемого процесса культивирования 93 вакцинных штаммов S.typhimurium № 415 и S.choleraesuis № 370
2.5. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при 103 изготовлении сухой вакцины против сальмонеллеза
2.6. Вирулентность штаммов сальмонелл 113
2.7. Приготовление антигенных препаратов 115
2.8. Влияние интервала реиммунизации на антителогенез 117
2.9. Определение оптимальных доз препарата на антителообразование 118 при двукратной иммунизации
2.9.1. Изучение иммуногенности двухкомпонентного препарата на бе- 119 лых мышах
2.9.2. Изучение реактогенности и безвредности двухкомпонентного 121 препарата на свиноматках и поросятах
2.9.3. Изучение иммуногенности препарата на свиноматках и порося- 122 тах
2.10. Клинические испытания сухой вакцины против сальмонеллеза 128 свиней
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 129
4. ВЫВОДЫ 138
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 140
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 141
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 172
7.1. Таблицы расчетов коэффициентов уравнений 173
7.2.Паспорта штаммов и СТО на посевной материал 199
7.3.Нормативная документация 208
7.4.Акты испытаний 213
7.5.Патенты 228
7.6.Методические положения 233
ВВЕДЕНИЕ
Работы по разработке и обеспечению продовольствием и биологической защиты людей и животных в стране является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные разработки, направленные на решение этих проблем [202].
Одним из путей решения задач развития АПК, поставленных перед наукой, является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, способных обеспечить нормальное развитие животных [57, 61, 76, 97, 132, 162, 165, 170, 183, 187, 191, 201, 207, 209, 238, 302, 308, 319, 322].
Этим требованиям соответствуют новые экобиотехноологические препараты, такие как пробиотики, вакцины, диагностикумы и другие иммунобиологические препараты [4, 21, 30, 39, 44, 50, 59, 61, 76, 82, 95, 131, 132, 134, 148, 155, 156, 162, 168, 173, 187, 190, 191, 195, 204, 208, 211, 212, 214, 245, 274], которые применяют как в здравоохранении, так и в ветеринарии. Такие лечебно-профилактические экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного животноводства, занимающего передовые позиции в АПК [3, 25].
В общей номенклатуре выпускаемых препаратов значительную долю занимают средства специфической профилактики инфекционных болезней животных и птиц, вызываемых патогенными бактериями.
Благодаря достижениям современной науки при промышленном производстве биопрепаратов достаточно широко используются реакторные способы выращивания бактерий в жидких питательных средах, физико-химические методы обработки культур и стабилизации микроорганизмов. Однако большинство технологических процессов промышленного производства ветеринарных биопрепаратов базируется на эмпирических данных и требует обстоятельного научного обоснования [120, 135, 141, 151, 153, 160, 185, 205, 214, 268].
Технология изготовления бактериальных вакцин - многоаспектная проблема, ключевым направлением которой является разработка современных процессов культивирования микроорганизмов, позволяющих интенсифицировать производство и получать высококачественные препараты. Процессы культивирования позволяют не только разрабатывать прогрессивные технологии производства биопрепаратов, но и более глубоко изучать закономерности жизнедеятельности бактериальных популяций.
В фундаментальных работах, посвященных культивированию непатогенных микроорганизмов [25, 44, 56, 67, 136, 141, 149, 162, 171, 180, 187, 198, 275, 307], приводятся материалы исследований по общим вопросам микробиологического синтеза, закономерности и факторы, оказывающие влияние на рост и развитие продуцентов, а также по разработке научных основ оптимизации выращивания микроорганизмов с применением современного технологического и аппаратурного оформления процессов.
Общие теоретические и прикладные аспекты проблемы культивирования отдельных патогенных микроорганизмов достаточно глубоко рассматриваются рядом исследователей [12, 16, 22, 25, 44, 53, 91, 96, 103, 104, 207, 214, 261].
Работы по изучению процессов культивирования вакцинных штаммов бактерий, используемых для изготовления препаратов для ветеринарной медицины, за редким исключением, представляют собой материалы исследований, либо констатирующих принципиальную возможность глубинного выращивания микроорганизмов, как правило, без учета их метаболизма и комплекса физико-химических параметров роста [134, 141, 147, 301], либо характеризующих динамику развития бактерий и не содержащих количественных характеристик и физиологических показателей роста культур [117, 236, 247, 253]. Это не позволяет хотя бы в общих чертах судить о жизнедеятельности микроорганизмов при их культивировании. Однако исследования, направленные на познание закономерностей, присущих популяциям микроорганизмов в искусственно создаваемых условиях, экспериментальное обоснование методов и режимов культивирования бактерий, обеспечивающих воспроизводимое их получение в оптимальных условиях, имеют боль-
шое теоретическое и практическое значение, так как результаты изучения закономерностей микробных популяций являются научной основой разработки любой технологии производства биопрепаратов.
Таким образом, современное вакцинное производство немыслимо без научно обоснованных технологий изготовления биопрепаратов, обеспечивающих интенсификацию отдельных стадий, составляющих целостные технологические процессы, и получение стандартной и высококачественной продукции [70, 208]. Анализ тенденций разработки и совершенствования технологий промышленного изготовления бактериальных вакцин показывает, что резервы повышения эффективности их производства и качества состоят, в основном, из оптимизации условий и разработки процессов культивирования микроорганизмов с учетом их метаболизма и физиологического состояния, изыскания эффективных средств защиты, обеспечивающих надежную стабилизацию биологической активности препаратов.
Обоснование выбора объектов исследования.
Биологической промышленностью выпускается более 40 бактериальных вакцин, в том числе 20 живых препаратов. Из числа живых вакцин 4 жидких и 16 сухих. Практически все используемые в отечественной биологической промышленности технологии изготовления препаратов не совершенны. В качестве питательных сред для выращивания производственных штаммов микроорганизмов используется нестандартное пищевое сырье, процессы культивирования малопроизводительны, не контролируются и не регулируются по большинству значимых физико-химических параметров и осуществляются без учета физиологического состояния культур.
Элементы несовершенства технологических приемов и низкой стабильности наиболее характерны для большинства бактериальных вакцин, что позволило выделить их из общего числа живых препаратов в качестве основных объектов для более детального рассмотрения при разработке технологий изготовления этих препаратов в направлении интенсификации производства и повышения стабильности биологической активности.
Наряду с этим для более углубленного изучения закономерности технологических процессов культивирования и стабилизации микроорганизмов, апробирования их на родственных моделях и определения возможных обобщений, распространяющихся на вакцины против сальмонеллеза животных, в качестве дополнительных объектов представлялось целесообразным избрать вакцину из штамма Раз1еиге11а тиЬоаёа, которая отличается методами и условиями культивирования.
Выбор указанных объектов исследований обусловлен также и рядом следующих обстоятельств, в частности:
- актуальностью проблемы специфической профилактики сальмонеллеза, рожи свиней и др.;
- необходимостью замены устаревших технологий изготовления вакцин на более производительный и эффективный метод глубинного периодического культивирования.
Вакцинные штаммы, избранные модельными, являются представителями достаточно хорошо изученных микроорганизмов, что дает возможность углубленного исследования проблем биологической активности и физиологического состояния бактериальных культур при управляемом выращивании, познание закономерностей, присущих микробным популяциям и расшифровки механизмов, определяющих стабильность биологических свойств в целостном технологическом процессе изготовления вакцинных препаратов для ветеринарной медицины.
Свиноводство в нашей стране является одним из основных источников производства мяса и жира животного происхождения. На фоне специфических условий характерных для отрасли и, в частности, в связи с концентрацией большого количества свиней на ограниченных производственных площадях возрастает роль организации профилактических мероприятий по предупреждению опасных с эпизоотической точки зрения таких инфекций бактериальной этиологии, как сальмо-неллез, рожа, колибактериоз, пастереллез и другие.
В условиях крупных свиноводческих хозяйств каждая вспышка заболевания свинопоголовья кишечными инфекциями (к таким, в первую очередь, относится
сальмонеллез) ведет к ощутимым потерям экономического и социального характера.
Сальмонеллезной инфекции наиболее ощутимо подвержен молодняк свиней. В меньшей степени от сальмонеллеза страдает взрослое свинопоголовье. Однако, являясь бактерионосителями сальмонеллезной инфекции, они подвергают постоянной опасности инфицирования большого числа свиней.
В этой связи очевидна необходимость разработки вакцинных препаратов для иммунизации; а) отдельно - для маточного поголовья как основы для создания колострального иммунитета нарождающегося молодняка свиней и б) отдельно -для иммунизации поросят послеотъемного периода. В дальнейшем у взрослого поголовья, сальмонеллоносительство не представляет сколько-нибудь значительной опасности.
Цель и задачи исследований. Цель работы - разработать технологию производства сухой живой вакцины на основе штаммов 8а1топе11ае сЬо1егае8ШБ № 370 и 8а1топе11ае 1урЫтипит № 415.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- выбор вакцинных штаммов сальмонелл;
- оптимизация состава питательной среды для выращивания сальмонеллез-ных штаммов;
- изучить культуральные, морфологические, ферментативные, вирулентные и антигенные свойства сальмонелл отобранных штаммов для изготовления вакцин;
- разработка управляемого процесса глубинного культивирования штаммов 8а1топе11ае 1урЫтипит № 415 и 8а1топе11ае сЬокгаезшБ № 370;
- очистка и концентрирование бактериальной массы;
- оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении вакцины против сальмонеллеза свиней;
- отработать оптимальную схему применения вакцинных препаратов в опытах на лабораторных животных (доза, кратность, интервал);
- испытать безвредность, реактогенную и антигенную активность экспериментальных серий вакцины на супоросных свиноматках и поросятах послеотъем-ного периода в условиях свиноводческих хозяйств.
Научная новизна работы. Научно обоснованы и практически впервые разработаны основные технологические этапы и технология промышленного производства сухой живой вакцины протии сальмонеллеза свиней с использованием современного технологического оборудования и процессов. Применение на практике математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления сальмонелл, значения концентраций компонентов питательной среды, параметры управляемого режима культивирования, оптимизировать защитную среду высушивания, и, в конечном счете, отработать и получить современную промышленную технологию производства высокоэффективной сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Разработаны дозы и кратность применения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Изготовлены опытно-промышленные серии сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней разных возрастных групп, проведены испытания препаратов в хозяйствах.
Практическая ценность работы. Применение разработанных технологий производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней дает большой иммунологический, экономический и социальный эффект.
Использование разработанных технологий производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней способствует сокращению времени культивирования и повышения накопления жизнеспособных клеток сальмонелл, стабильности по биологическим свойствам и лучшую сохраняемость в процессе длительного хранения и использования.
По разработанной технологии изготовлено 58 серий вакцины. В производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В хозяй-
ствах проведено 19 научно-производственных опытов и производственных испытаний на супоросных свиноматках и поросятах послеотъемного периода. Результаты испытаний включены в Методическое положение «Опытно-промышленный регламент производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней», 2011 г., Методическое положение «Инструкция по применению сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней», 2011 г., утвержденные на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 2011 г.
Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту:
- оптимизация состава питательной среды для выращивания сальмонелл;
- разработка управляемого процесса глубинного культивирования сальмонелл;
- оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней;
- разработка дозирования и кратность применения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней;
- определить иммунологическую эффективность от применения разработанной сухой живой вакцины для свиней разных возрастных групп.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:
- в виде ежегодных отчетов по темам г
-
Меньшенин, Владимир Викторович
-
доктора биологических наук
-
Щёлково, 2013
-
ВАК 03.01.06
- Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц
- Вакцины против клещевого энцефалита, бешенства и гепатита В
- РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЭМУЛЬСИОННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ
- Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ
- Лечебно-профилактические препараты на основе токсин-продуцирующих микроорганизмов для агропромышленного комплекса
