Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц"

ПАВЛОВ СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ

Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск - 2004

ПАВЛОВ СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ

Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Государственном научном центре прикладной микробиологии Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Гусев Виктор Владимирович

доктор ветеринарных наук.

профессор

Бело) сов Василий Иванович

доктор ветеринарных наук,

профессор

Субботин Владимир Викторович

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится « 3 » июня 2004 г. в 12 часов на заседании специализированного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская обл.. Щелковский район, пос. Биокомбинат, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомился в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан «30» апреля 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

рос НАЦИОНАЛЬНА»

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы

Создание и возрождение крупных свиноводческих и птицеводческих комплексов сопровождается резким изменением эпизоотической ситуации по ряду инфекционных заболеваний и активизацией условно патогенных микроорганизмов. Большая плотность животных сопряжена с возможностью взаимного перезаражения, возникают идеальные условия для циркуляции возбудителей среди поголовья.

Сегодня на первый план выдвинулись желудочно-кишечные заболевания (в том числе сальмонеллез) и инфекции с поражением дыхательных путей.

Экономический ущерб от сальмонеллеза складывается из падежа части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшего поголовья.

На сегодняшний день проблема профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, в том числе и птицы, имеет не только экономическое, но и социальное значение. Свидетельством реального существования такой угрозы, по данным ВОЗ, являются участившиеся вспышки инфекций среди людей. Причину заболеваний связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами. Повышение устойчивости штамма Salmonella enteritidis создало предпосылку для передачи возбудителя от птицы к человеку и обратно. По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в семь раз. При этом этиологическая значимость S. enteritidis в заболевании людей возросла на 30%, животных - 75%, а число случаев обнаружения возбудителя в продуктах питания увеличилось на 50% (В. Ли, 2003).

В связи с этим в настоящее время во всем мире уделяется большое внимание разработке различных лечебных препаратов и сальмонеллезных вакцин.

Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя, как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам. Наблюдается селекция и циркуляция штаммов, несущих R-факторы, формирующиеся под влиянием вышеуказанных препаратов.

Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и способствовало селекции антибиотико-резистентных штаммов микроорганизмов. В ряде хозяйств обнаруживается 100% - ная. устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.

В настоящее время в птицеводстве, в качестве профилактических и лечебных средств, при сальмонеллезах применяют пробиотики и бактериофаги.

Для профилактики сальмонеллеза свиней, в настоящее время, широко используются как жидкие инактивированные вакцинные препараты на основе вирулентных штаммов S. choleraesшs и S. typhimurium, так и вакцины живые сухие из аттенуированных штаммов. Применение в ветеринарной практике и той и другой формы вакцины объясняется наличием у каждой своих преимуществ и недостатков.

Для профилактики сальмонеллеза свиней существует вакцина живая сухая из штамма ТС-177, который представляет собой «дикий» мутант, не имеет генетических маркеров, кроме пониженной вирулентности. Известна также вакцина живая сухая из супрессорного ревертанта S. choleraesuis №9. Штамм S. choleraesuis №9 (ФГУ ВГНКИ) отличается от эпизоотических штаммов высокой частотой (50%) выделения стрептомицинзависимых мутантов, большая часть из которых остается вирулентной. Поэтому использование этих вакцин приводит к затруднению при дифференциации вакцинного штамма от полевого, из-за необходимости изучения большого количества мутантных клонов (Э.А. Светоч и др. 2003).

Анализируя выше сказанное, можно сделать вывод, что разработка и совершенствование средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц остается актуальной задачей научных сотрудников, биотехнологов и практикующих врачей.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах, и совершенствование профилактики этого заболевания с помощью специфических средств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

-провести мониторинг сальмонеллеза свиней и птиц на территории Российской Федерации;

-разработать технологии производства, методы контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»;

-разработать нормативно-техническую документацию (технические условия и наставление по применению) на производство данных препаратов;

-испытать вакцины в лабораторных и производственных условиях;

-оценить протективную активность «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» в сравнении с другими существующими противосальмонеллезными вакцинами.

Научная новизна работы

Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителей сальмонеллеза свиней и птиц о роли S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gallmaram-pulloram в развитии эпизоотической ситуации, складывающейся в неблагополучных по сальмонеллезу отдельно взятых хозяйствах.

Обоснована необходимость создания вакцинных препаратов для профилактики сальмонеллеза свиней - на основе штаммов S. choleraesuis и S. typhimurium и сальмонеллеза птиц - на основе штаммов S. enteritidis и S. gallmaram-pulloram.

Показана возможность использования питательной среды на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) вместо мясных переваров без потери урожайности при культивировании сальмонелл.

«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов S. choleraesuis SC230 и S. typhimurium №3 по иммуногенным свойствам превосходит существующие вакцины против сальмонеллеза.

Практическая значимость работы

Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц». Созданы проекты научно-технической документации на вакцинные препараты по изготовлению и контролю.

Предложена питательная среда для культивирования вакцинных штаммов S. choleraesuis SC230, S. typhimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallinarum-pullorum T10 на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.

Получены положительные результаты испытания вакцинных препаратов, как на лабораторных, так и на естественно восприимчивых животных.

Публикация результатов исследовании

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Зарегистрировано 2 отчета о НИОКР ГНЦ прикладной микробиологии по

5

линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ 2001-2002 (Раздел «Разработка образцов готовых форм препаратов и наработка опытных партий вакцин против сальмонеллеза птиц, гемофилеза свиней. Получение лабораторного образца вакцины против коксиеллеза крупного рогатого скота») и 2002-2003 гг (Раздел «Разработка проекта нормативно-технической документации на приготовление «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

- на. международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря 2002 г. -Щелково.

- на межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ - апрель 2004г. -Оболенск.

Основные положения диссертации выносимые на защиту

Новые данные о роли полевых штаммов S. choleraesшs, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gaШnarum-puUorum в развитии эпизоотической ситуации в РФ, на примере 21 свиноводческого и 36 птицеводческих хозяйств из 27 регионов России.

Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ с содержанием ам. N > 600 мг%.

«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза птиц», характеризующаяся крайне низкой остаточной реактогенностью и способностью формирования стойкого специфического иммунитета.

«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней», обладающая крайне низкой остаточной реактогенностью и высокими иммуногенными свойствами по сравнению с другими сальмонеллезными вакцинами.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 115 источников, в том числе 83 отечественных и 32 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

Исследования по данной диссертации проведены в рамках тематики НИОКР по линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ в период с 2001 по 2004 гг. в ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии (ФГУП ГНЦ ПМ), в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах Московской, Пермской, Курской, Нижегородской,- Петрозаводской, Белгородской, Псковской, Волгоградской, Владимирской, Орловской, Смоленской, Ленинградской, Воронежской, Томской, Новосибирской, Архангельской, Астраханской, Самарской, Саратовской, Костромской, Калужской, Калининградской, Липецкой, Тульской, Ярославской областей, республики Мордовия и Краснодарского края.

Вскрытие павших и вынужденно убитых животных и птиц, патологоанатомическое обследование и отбор патологического материала проводили по стандартным методикам.

При бактериологическом исследовании патологического материала, с целью выделения возбудителей бактериальных инфекций, определения их культурально - морфологических, биохимических свойств и серотипирования руководствовались утвержденными Департаментом-ветеринарии МСХРФ методическими указаниями.

В работе использованы эпизоотические штаммы (сальмонеллы, эшерихии, пастереллы, цитробактеры, клебсиеллы, серрации) выделенные от павших и вынуждено убитых поросят и цыплят.

Биохимические свойства полевых штаммов сальмонелл исследовали с помощью набора ЭНТЕРОтест 24 (Lachema, Чехия).

Для определения подвижности сальмонелл использовали полужидкий агар (0,2% агар-агара).

При проведении диагностики сальмонеллеза в РА на стекле использовали сальмонеллезные сыворотки Краснодарской биофабрики.

Для определения чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам взят метод разведений данных препаратов в плотной питательной среде (АГРМ) (В.Ф. Ковалев и др. 1988).

Концентрацию в ПГРМ водородных ионов определяли потенциометрически на рН - метре «МР 220» (Швейцария); аминного азота - формольным титрованием по методу Зеренсен - Гаврилова; триптофана по A.M. Пешкову.

Технология изготовления «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц» разработана совместно со специалистами ООО «НПФ «Диавак».

Для производства экспериментальных и промышленных серий вакцин использовали аттенуированные вакцинные штаммы:

-Salmonella choleraesuis SC230 (ГНЦПМ); -Salmonella tyhpimurium №3 (ФГУ ВГНКИ); -Salmonella enteritidis SE204 (ГНЦПМ); -Salmonella gallinarum-pullorum T10 (ГНЦПМ).

Инкубирование вакцинных штаммов проводили на. плотных и жидких питательных средах в аэробных условиях и температуре 37°С.

Культивирование, вакцинных штаммов, в жидких питательных средах.осуществляли в пробирках, колбах Эрленмейера вместимостью 750

3

см .

Аэрирование проводили на шуттель-аппарате VC67-88, TYPLT-2 (Чехия) с частотой 150 - 250 колебаний в минуту.

Для глубинного периодического культивирования использовали биореакторы АК-210 (объемом 10 дм3) и В-2 (объемом 50 дм3). Вносимая посевная доза составляла 5-10% от объема питательной среды.

Общее количество бактерий определяли при помощи оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича на 1*1Cf м. к., а также путем определения оптической плотности. Измерение оптической плотности осуществляли на фотоколориметре «КФК-3» (Россия) в кювете с длинной оптического пути 0,5 см, длине волны 540 нм, с вычетом оптической плотности соответствующей питательной среды.

Количество жизнеспособных бактерий определяли по методу конечных разведений и подсчета колониеобразующих единиц в соответствии с рекомендациями Мейнел Д., Мейнел Э. (1967).

Для изучения морфологии и тинкториальных свойств бактериальных клеток применяли метод окраски по Граму, микроскопию окрашенных препаратов проводили на стереоскопическом микроскопе PZO (Польша), при увеличении D 1200.

Безвредность вакцин определяли на: -белых мышах массой тела 16-18г; -цыплятах 5-10-сут. возраста.

При определении иммуногенной активности препаратов использовали:

-морских свинок живой массой 350 - 400г; -цыплят 5-10-сут. возраста; -поросят 14-22 дневного возраста. Вакцинацию осуществляли методами: -подкожной инъекции - для морских свинок; -перорального введения -для цыплят; -внутримышечной инъекции - для поросят.

Иммунизированных лабораторных животных инфицировали контрольными штаммами (после предварительной подтитровки ЛД50 на соответствующем виде животных):

-Salmonella choleraesuis №370 (ФГУ ВГНКИ);

-Salmonella tyhpimurium №371 (ФГУ ВГНКИ);

-Salmonella enteritidis «Суворовский» (ГНЦПМ);

-Salmonella gallinarum-pullorum №36 (ГНЦПМ).

Заражение и морских свинок и цыплят проводили подкожно.

При оценке гуморального иммунитета использовали сыворотки крови вакцинированных поросят, полученные из хвостовой вены (v. caudalis). Титр сывороточных антител определяли в реакции агглютинации на стекле с суточными агаровыми культурами штаммов S. choleraesuis №370 и S. tyhpimurium №371.

Оценку макрофагального звена клеточного иммунитета осуществляли фагоцитарным методом и методом высева для определения колония образующих единиц (КОЕ).

2.2. Результаты исследований

2:2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции свиней и птиц

Широта распространения сальмонеллеза свиней и птиц на территории РФ, а так же характер, который данное заболевание приобрело в ряде областей, требуют проведения постоянного эпизоотического анализа. Получение обобщенных данных, подтвержденных лабораторными исследованиями, позволяет вовремя проводить профилактические мероприятия в неблагополучных по данному заболеванию хозяйствах и предотвращать дальнейшее распространение возбудителей.

Нами в период с 2001 по 2004г. проведен мониторинг инфекционных заболеваний бактериальной этиологии у свиней и птиц на территории РФ. Обследовано 21 свиноводческое и 36 птицеводческих хозяйств в 27 регионах России. Бактериологическому исследованию подвергнуты 9100 образцов проб патологического материала от павших и вынуждено убитых 572 голов поросят и 1703 цыплят.

Статистические данные о выделении возбудителей бактериальных инфекций свиней представлены в таблице № 1 и птиц - № 2.

Таблица № 1

Результаты исследований патологического материла от павших и

вынуждено убитых поросят

Возбудители Статистика по годам (%)

2001' 2002 2003 2004'

Эшерихии 46,9 38,7 37,3 40,2

Сальмонеллы 28,6 32,7 33,0 31,0

в т.ч. cholerae suis 18,6 20,0 20,7 19,3

typhimurium 9,8 12,4 12,0 11,6

редких групп 0,2 0,3 0,3 0,1

Стафилококки 4,2 3,6 4,0 4,3

Продолжение таблицы № 1

Стрептококки 13,0 14,5 15,0 14,3

Пастереллы 2,8 3,1 3,4 3,2

Гемофилы. 0,5 0,4 1,7 2,4

Псевдомонады 2,0 3,0 1,0 0,8

Энтеробактерии (Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Serratia) 2,0 4,0 4,6 3,8

Результаты представленные в таблице № 1 свидетельствуют, что сальмонеллы выделены из 31,3% исследованного от поросят патологического материала.

Среди выделяемых микроорганизмов-возбудителем сальмонеллеза поросят в 67%-тах являлась - Salmonella choleraesuis, в 32% - Salmonella typhimurium, в 1% - сальмонеллы редких групп.

Таблица № 2

Результаты исследований патологического материла от павшей и _вынуждено убитой птицы______

Возбудители

Статистика по годам (%)

2001

2002

2003

2004

Эшерихии

51,1

49,0

49,1

49,5

Сальмонеллы

22,1

24,4

25,0

24,8

в т.ч. enteritidis

19,9

20,0

20,2

20,7

gall inarum-pul 1 orum

0,6

1,1

1,3

0,9

typhimurium

1,6

3,0

3,2

3,1

редких групп

0,0

0,3

0,3

0,1

Стафилококки

5,9

4,7

4,9

5,3

Стрептококки

12,9

13,5

13,8

13,7

Пастереллы

2,8

2,7

2,5

2,6

Гемофилы

0,0

0,2

0,4

0,5

Псевдомонады

2,4

3,0

2,0

1,5

Энтеробактерии (Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Serratia)

1,8

2,5

2,3

2,1

Данные представленные в таблице № 2 свидетельствуют, что сальмонеллы выделены из 24,1% исследованного от птиц патологического материала.

Из числа выделенных сальмонелл 82,4% - это S.enteritidis, 11,8% - S. gaШnaram-puПoram и 5,8% - сальмонеллы редких групп.

Результаты проведенных исследований показали, что 47,4% свиноводческих и 48,6% птицеводческих хозяйств являются эпизоотическими очагами сальмонеллезной инфекции.

2.2.2 Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам

При определении чувствительности к антибактериальным препаратам использовали 24 культуры S. choleraesшs, 12 культур S. tyhpimurium, 20 культур S. enteritidis и 14 культур S. gallmaram-pulloram, выделенных из патологического материала.

В результате проведенной работы установили, что преобладающее количество (более 50 %) культур сальмонелл к ряду препаратов имеют очень высокую резистентность (тетрациклин, стрептомицин, бензилпенициллин, фуразолидон). И лишь к некоторым антибактериальным препаратам, таким как левомицетин, полимиксин М, неомицин, гентамицин, энрофлоксацин отмечается чувствительность выделенных изолятов сальмонелл.

Таким образом, лечение и профилактика сальмонеллеза могут быть успешными, при условии определения лекарственной устойчивости выделенных эпизоотических штаммов сальмонелл.

Поскольку главной целью изучения эпизоотической обстановки в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах было совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц, следующим этапом нашей работы была разработка технологий производства и испытания вакцинных препаратов.

2.2.3 Технология изготовления и контроль живых вакцин против сальмонеллеза

2.2.3.1 Питательные среды для культивирования вакцинных штаммов

Для получения стабильных, высоких результатов в накоплении бактериальной массы и одновременном снижении материальных затрат при культивировании вакцинных штаммов choleraesuis SC230 и S.

tyhpimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gaШnaram-pulloram ^0) в лабораторных и промышленных условиях, нами испытана питательная среда - бульон на основе гидролизата рыбной муки (БГРМ). Апробацию питательной среды проводили путем сравнительного культивирования вакцинных штаммов на двух жидких питательных средах, основами, которых являлись панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) и панкреатический гидролизат мяса по Хоттингеру (ПГМХ), с содержанием ам^>600мг%.

Культивирование вакцинных штаммов осуществляли в колбах Эрленмейера, вместимостью 750 см3, на шуттель-aппарате ^67-88, TYPLT-2 (Чехия) при частоте 150 - 250 колебаний/мин, в течение 14 часов

при t - 37°С.

На рисунке №1 приведены накопления бактериальной массы.

средние данные максимального

Рисунок № 1

В результате установлено:

-выход бактериальной массы (количество живых клеток) одного и того же штамма практически равен, как при культивировании на бульоне Хоттингера, так и на БГРМ;

-бактериальные клетки обладают характерными для сальмонелл тинкториальными и серологическими свойствами.

2.2.3.2 Подготовка посевного материала

Для получения посевного материала использовали ампулы с сухой культурой S. choleraesшs SC230 и S. tyhpimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gaШnaram-puПoram ^0.

Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера на шуттель-аппарате ¥067-88, TYPLT-2 (Чехия) с частотой 150 - 250 колебаний/мин, в течение 14 часов при t - 37°С. Динамику роста клеток оценивали при контролировании концентрации живых микробных клеток (ж.м.к.) и измерения оптической плотности среды. По полученным результатам выстраивали кривые роста бактериальных клеток для каждого вакцинного, штамма (рисунок №2).

Из данных, представленных на рисунке № 2, следует, что время приготовления посевников вакцинных штаммов S. choleraesuis SC230, S. typЫmurшm №3, S. enteritidis SE204 и S. gaШnaram-puПoram T10 находится

в пределах 8-10 ч. культивирования. Культура, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, наиболее пригодна для использования в качестве посевного материала (М.Я. Ярцев 2000; Н.И. Галиакберова и др. 2001,2002).

Рисунок № 2.

2.2.3.3 Глубинное периодическое культивирование вакцинных штаммов S. choleгaesuis SC230, S. tyhpimuгium №3, S. enteгitidis SE204и S. gaШnaгum-pulloгumTЮ

Для выращивания культуры вакцинных штаммов в биореакторах АК-210 (объемом 10 дм3) и В-2 (объемом 50 дм3) вносили посевной материал из расчета 5-10 % от общего объема, 40% раствор глюкозы до 0,1%-ной концентрации к объему среды и М§Б04 7 Н2О - 0,5 г/л.

При глубинном периодическом культивировании (аэрация 0,5 - 1 дм3 воздуха на 1 дм3 культуры в минуту, перемешивание 350 об/мин.) концентрация микробных клеток к 10 часам выращивания, в зависимости от вакцинного штамма, находилась в пределах 23,1-26,1 млрд.м.к./см3.

Культивирование прекращали в начале стационарной фазы роста, когда концентрация микробных клеток перестает заметно увеличиваться.

На рисунке № 3 представлена динамика накопления бактериальных клеток вакцинных штаммов в зависимости от времени культивирования (по результатам 3-х ферментации каждого штамма).

В районе 8-10 ч. культивирования увеличение концентрации живых микробных клеток замедляется и затем их количество начинает медленно уменьшаться.

Рисунок № 3

Динамика роста вакцинного штамма Salmonella choleraesuis SC230 отражает классическую кинетическую кривую роста.

Динамика роста других вакцинных штаммов (S. tyhpimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallinarum-pullorum T10) характеризуется замедлением роста в процессе культивирования, так как к этому периоду времени (7-9 ч.) клетками использованы легкоусваемые питательные вещества и происходит перестройка ферментативной системы бактерий для потребления оставшейся части питательных веществ.

Использование питательной среды БГРМ вместо мясных питательных сред при культивировании сальмонелл показало возможность ее применения без потери урожайности

Изготовление и контроль экспериментальных серий вакцин проводили согласно разработанным регламентам по изготовлению и контролю данных вакцинных препаратов.

Всего было произведено 2 экспериментальных серии «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и 3 серии «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц».

Каждая серия прошла лабораторные испытания- с учетом современных требований, в том числе на безвредность и иммуногенную активность.

2.2.3.4 Оценка безвредности и иммуногенности вакцин

Испытание «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» на безвредность и иммуногенность проводили на чувствительных к сальмонеллезу лабораторных животных. Моделью в первом случае служили белые мыши, а во втором - морские свинки.

Для проверки безвредности и иммуногенности «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц» использовали цыплят 5-10-сут. возраста. Полученные результаты представлены в таблице №3 и №4.

Таблица № 3

Результаты лабораторных испытании «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» на безвредность и

иммуиогеииость

Кол-во животных Безвредность (белые мыши) Иммуногенная активность (морские свинки)

Контрольное инфицирование

S. choleraesuis №370 S. typhi Ж murium 171

Пали (гол.) Сохран ность (%) Пали (гол.) Сохран ность (%) Пали (гол.) Сохран ность (%)

10 гол. 0/10 100

Вакцини рованные 10 гол. 0/5 100% 0/5 100%

Контрольные 10 гол. 5/5 0% 5/5 0%

Безвредность 100%

Иммуногенность 00%

Из данных таблиц № 3 и № 4 видно, что результаты испытаний были положительными и свидетельствовали о безвредности, и достаточно

15

высокой протективной активности этих биопрепаратов. Полученные положительные результаты позволили провести апробацию данных вакцин в производственных условиях.

Таблица №4

Результаты лабораторных испытаний «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц» на безвредность и иммуногенность

Кол-во цыплят Безвредность Иммуногенная активность

Контрольное инфицирование

Б. ег^егШсНв «Суворовский» Б. §аШпагит-риПогит № 36

Пали (гол.) Сохран ность (%) Пали (гол.) Сохран ность (%) Пали (гол.) Сохран НОСТЬ (%)

10 гол. 0/10 100

Вакцинированные 20 гол. 0/10 100% 0/10 100%

Контрольные 20 гол. 5/10 50% 4/10 60%

Безвредность 100%

Иммуногенность 00%

2.2.4 Производственные испытания вакцин

С учетом полученных данных о эпизоотической ситуации на территории РФ, для производственных испытаний подбирали неблагополучные по сальмонеллезу птицеводческие и свиноводческие хозяйства.

Ими стали Ливенский свинокомплекс по производству свинины «ОАО Агрофирма «Ливенское мясо» Орловской области и птицеводческое хозяйство ОАО СПП «Суворовское» Тульской области.

В «ОАО Агрофирма «Ливенское мясо» в эксперименте использовали 113 голов поросят в возрасте 14-22 дн., из них 52 головы являлись опытной группой и 61 голова - контрольной.

Иммунизацию животных контрольной группы проводили согласно используемой на комплексе схеме коммерческой вакциной против сальмонеллеза свиней. При иммунизации опытной группы вакцинирующая доза (1 млрд. ж.м.к.) и схема вакцинации являлись аналогичными для уже существующих противосальмонеллезных вакцин.

В результате испытания бивалентной вакцины против сальмонеллеза свиней случаев осложнений после вакцинации не наблюдали, прорыва иммунитета не регистрировали.

Таблица № 5

Результаты испытаний «Бивалентной вакцины живой сухой против

сальмонеллеза свиней»

Группа животных Кол-во голов Заболело сальмонеллезом Протективная активность препарата

гол. % %

опытная 52 0 0 100

контрольная 61 2 3,3 96,7

Таким образом, следует отметить, что «Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» подтвердила свою способность формирования стойкого специфического иммунитета.

В ОАО СПП «Суворовское» в эксперименте использовали 32 тыс. голов цыплят в возрасте 5-10 дней, из них 16 тыс. голов являлись опытной группой и 16 тыс. голов - контрольной.

При иммунизации опытной группы вакцинирующую дозу (1 млрд. ж.м.к.) и схему вакцинации использовали согласно разработанному временному наставлению по применению «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц». В контрольной группе для профилактики сальмонеллеза применяли антибактериальные препараты.

В результате испытания бивалентной вакцины против сальмонеллеза птиц случаев осложнений после вакцинации и прорыва иммунитета не регистрировали.

Таблица № 6

Результаты испытаний «Бивалентной вакцины живой сухой против

сальмонеллеза птиц»

Группа Количество голов Пало от сальмонеллеза Сохранность

гол. % %

опытная 16 тыс. 0 0 100

контрольная 16 тыс. 729 4,6 95,4

По результатам исследования можно сделать вывод, что «Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза птиц» обладает достаточно высокими протективными свойствами.

Однако, в отличие от птицеводства, в свиноводстве широко используются как жидкие инактивированные сальмонеллезные вакцины, так и вакцины живые сухие из аттенуированных штаммов. Поэтому одной из задач данной работы являлось не только определение иммуногенной

активности разработанной «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней», но и сравнение ее с другими сальмонеллезными вакцинами.

2.2.5 Сравнительная оценка иммуногенных свойств «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» с другими сальмонеллезными вакцинами

Сравнение иммунотенной активности сальмонеллезных вакцин осуществляли в лабораторных и производственных условиях. В первом случае использовали как прямой метод оценки иммунитета (острый опыт), так и косвенные (оценка гуморального иммунитета и макрофагального звена клеточного иммунитета).

2.2.5.1 Оценка протективной активности сальмонеллезных вакцин

Проведение острого опыта в лабораторных условиях осуществляли на клинически здоровых морских свинках живой массой 350 - 400г.

Оценка протективной активности сальмонеллезных вакцин в производственных условиях проведена на Ливенском свинокомплексе по производству свинины «ОАО Агрофирма «Ливенское мясо» Орловской области. В исследованиях использовано 149 голов поросят в возрасте 14-30 дн.

Результаты опытов по определению иммуногенных свойств сальмонеллезных вакцин представлены в таблице № 7 и № 8.

Таблица № 7

Результаты испытаний сальмонеллезных вакцин в опытах на морских

свинках

№ Наименование испытуемой вакцины Сохранность %

Результаты заражения контрольным штаммом в. с!ю1егае$1Ш №370 Результаты заражения контрольным штаммом в. (урЫтипит №371

V» опыта V» опыта

1 2 3 1 2 3

1 I 100 100 80 100 80 100

2 II 60 80 80 80 60 80

3 III 20 20 40 - - -

4 контроль 20 20 0 0 20 0

Таблица №8

Результаты сравнительных испытаний протективной активности-сальмонеллезных вакцин в производственных условиях»_

№ Наименование Кол-во Заболело• Протективная

испытуемой г животных сальмонеллезом активнсть

вакцины в группе препарата

гол. % %

1 I 52 0 0 100

2 II 49 1 2,1 97,9

3 III 48 4 8,3 91,7

Примечание:

I- «Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов Б. сЬо1егае:зш8 БС230 и Б. 1урЫтипит №3;

II- «Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов Б. сЬо1егае:зш8 №9 и Б.' 1урЫтипит №3;

III- «Формолвакцина гидроокисьалюминиевая против сальмонеллеза свиней».

Результаты сравнительных испытаний вакцин показывают высокую протективную активность бивалентной вакцины против сальмонеллеза свиней из аттенуированных штаммов Б. сИо1егае8Ш8 БС230 и Б. 1урЫтипит №3.

2.2.5.2 Оценка гуморального иммунитета

Сравнительную оценку гуморального иммунитета у поросят, иммунизированных разными противосальмонеллезными вакцинами, осуществляли в реакции агглютинации с сальмонеллезным антигеном на стекле. Кровь у животных брали из хвостовой вены (V. саиёаШ) до начала вакцинации и через 7, 14, 21,28 дней и 2 месяца после иммунизации.

Из полученных результатов (рисунок № 4) видно, что корреляция между степенью защиты иммунизированных животных и уровнем гуморальных антител в сыворотках крови не существует. Нами подтверждено, что сальмонеллезная инфекция и вакцинация против нее

активизирует формирование преимущественно клеточного иммунитета, а оценив его или поставив острый опыт, можно сказать более точно о напряженности иммунитета после применения той или иной противосальмонеллезной вакцины.

Рисунок № 4

Показатели титров антител в РА у поросят, иммунизированных разными вакцинами против сальмонеллеза

□ Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней из аттенуированных штаммов Б. сИо1егаезшз вС230 и Э.

|урЫтипит №3

□ Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза

свиней из аттенуированных штаммов Э. сЬо^гаезшв №9 и Б.

^рЫтипит №3

□ Формол вакцина гидроокисьалюминиевая против

сальмонеллеза свиней ■ Контроль

2.2.5.3 Оценка макрофагального звена клеточного иммунитета

Остаточную токсигенность и способность вакцинных штаммов S. choleraesuis №9 и S. choleraesuis SC230 преодолевать неспецифические бактерицидные механизмы оценивали методом фагоцитоза на макрофагальной линии клеток J774.

Полученные данные свидетельствовали, что через 2ч. в результате фагоцитоза обоих вакцинных штаммов наступает пик активности макрофагов и затем медленное снижение. К 48ч. сальмонеллы практически полностью лизируются макрофагами. Однако вакцинный штамм S. choleraesuis SC230 в достоверно большем количестве поглощается макрофагами через 2 и 6ч.

Одновременно, при микроскопическом контроле было видно, что морфологически и покоящиеся и активированные макрофаги не изменяются, сохраняя целостность цитоплазматической мембраны и не теряя функциональной активности Это указывает на практическое отсутствие токсигенности связанной с активностью 3-го типа секреции сальмонелл. С этим связана и ускоренная, по сравнению с вакцинным штаммом 8. сЬо1егае8Ш8 №9, элиминация 8. сЬо1егае8Ш8 8С230 из макрофагов через 24ч.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что меньшая токсигенность вакцинного штамма 8.сЬо1егае8Ш8 8С230 благоприятна для формирования повышенной антигенной нагрузки на макрофаги и благоприятствуют выполнению ими главной функциональной активности по презентации антигенов и экспрессии провоспалительных цитокинов протективного иммунитета.

3. ВЫВОДЫ

1. Мониторинг возбудителей сальмонеллезов свиней и птиц показал, что в настоящее время 47,4% свиноводческих и 48,6% птицеводческих хозяйств являются эпизоотическими очагами сальмонеллезной инфекции. Лечение и профилактика сальмонеллеза могут быть результативным, при условии определения лекарственной устойчивости выделенных штаммов сальмонелл.

2. Использование БГРМ вместо мясных питательных сред, при культивировании вакцинных штаммов сальмонелл, не приводит к потере урожайности, бактериальные клетки, сохраняют характерные для сальмонелл тинкториальные и серологические свойства, себестоимость вакцинных препаратов снижается по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.

3. Разработана и освоена технология изготовления «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц».

4. Полученные экспериментальные серии вакцин прошли лабораторные и производственные испытания (в неблагополучных по данному заболеванию хозяйствах) с положительными результатами.

5. Сравнительная оценка протективной активности используемых в практике сальмонеллезных вакцин и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов 8. сЬо1егае8Ш8 8С230 и 8. 1урЫтигшт №3 показала, что экспериментальная вакцина превосходит по иммуногенным свойствам, как инактивированные, так и живые сухие аналоги.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Представлены для рассмотрения и согласования в Департамент ветеринарии Минсельхоза России технические условия и наставления по применению «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц».

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В. Гусев, Э. Светоч, Н. Глазков, М. Теймуразов, С. Павлов / Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций // Птицеводство, 2003, №2, с. 8-10.

2. В.В. Гусев, С.М. Приходько, СИ. Павлов, М.Г. Теймуразов / Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве // Ветеринария, 2004, № 2, с. 7-8.

3. В.В. Гусев, СИ. Павлов, СМ. Приходько, М.Г. Теймуразов / Актуальность проблемы сальмонеллеза в промышленном птицеводстве // Практик, 2002, № 9-10, с. 94-96.

4. В.В. Гусев, М.Г. Теймуразов, СМ. Приходько, СИ. Павлов / Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций в промышленном птицеводстве // Ветеринарный консультант, 2002, № 19, с. 17-19.

5. С.И. Павлов, В.В. Гусев / Сравнительная характеристика иммунизирующих свойств противосальмонеллезных вакцин // Сб. докл. Межд. Конф. «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Щелково, 2002, с. 99-101.

Отпечатано в ООО «Мещера», зак. 805, тир. 100 экз.

1-9748

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлов, Сергей Иванович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Род Salmonella - общие сведения

2.1.1. Мониторинг бактерий рода Salmonella

2.1.2. Биологические свойства

2.1.3. Антигенная структура

2.2. Средства специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц

2.3. Классификация и характеристика вакцинных препаратов

2.4. Биотехнология и производство вакцин

2.4.1. Питательные среды

2.4.2. Приготовление посевного материала

2.4.3. Глубинное культивирование микроорганизмов

2.5. Оценка иммуногенной активности вакцинных препаратов

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции свиней и птиц

3.2.2. Бактериологические исследования на сальмонеллез

3.2.3. Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам;

3.2.4. Технология изготовления и контроль живых вакцин против сальмонеллеза

3.2.4.1. Питательные среды для культивирования вакцинных штаммов

3.2.4.2. Подготовка посевного материала

3.2.4.3. Глубинное периодическое культивирование вакцинных штаммов S. choleraesuis SC230, S. tyhpimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallinarum-pullorum T

3.2.4.4. Оценка безвредности и иммуногенности вакцин

3.2.5. Производственные испытания вакцин

3.2.6. Сравнительная оценка иммуногенных свойств «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» с другими сальмонеллезными вакцинами

3.2.6.1. Оценка протекгивной активности сальмонеллезных вакцин

3.2.6.2. Оценка гуморального иммунитета

3.2.6.3. Оценка макрофагального звена клеточного иммунитета

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мониторинг и совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц"

Актуальность темы

Создание и возрождение крупных свиноводческих и птицеводческих комплексов сопровождается резким изменением эпизоотической ситуации по раду инфекционных заболеваний и активизацией условно патогенных микроорганизмов.

Большая плотность животных сопряжена с возможностью взаимного перезаражения, возникают идеальные условия для циркуляции возбудителей среди поголовья.

В последние годы ветеринарные службы наибольшее внимание уделяют профилактике вирусных инфекций и практически перестали контролировать бактериальные, что привело к увеличению процента заболеваемости сельскохозяйственных животных и птицы.

На первый план выдвинулись желудочно-кишечные заболевания (в том числе сальмонеллез) и инфекции с поражением дыхательных путей.

Возникновение и широкое распространение желудочно-кишечных болезней поросят обусловлено воздействием на их организм многих этиологических факторов.

По данным Шахова А.Г. (2003) при изучении этиологии желудочно-кишечных болезней поросят в 187 свиноводческих хозяйствах 10 областей России установлено: в 72% хозяйств диареи были вызваны бактериями, в 23% - вирусами, в 3% - простейшими, в 1% - патогенными грибами и лишь в 1% хозяйств возбудители из патологического материала не выделены.

Сальмонеллез относится к числу убиквитарных зооантропонозов. Экономический ущерб от сальмонеллеза складывается из падежа части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшего поголовья.

На сегодняшний день проблема профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, в том числе и птицы, имеет не только экономическое, но и социальное значение. Свидетельством реального существования такой угрозы, по данным ВОЗ, являются участившиеся вспышки инфекций среди людей. Причину заболеваний связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами. Адаптация штамма Salmonella enteritidis к организму птицы, повышение его устойчивости создали предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку и обратно. По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в семь раз. При этом этиологическая значимость S. enteritidis в заболевании людей возросла на 30%, животных — 75%, а число случаев обнаружения возбудителя в продуктах питания увеличилось на 50%.

Так, в Голландии - стране, где санитарно-гигиенические требования к качеству мяса наиболее жесткие, из тушек мяса выделяют сальмонеллы видов S. gallinarum, S. typhimurium, S. enteritidis, S. hodar, S. anatis, S. dublin и др., и список этот постоянно пополняется. Развитые экономически страны несут ощутимые потери от сальмонеллезов. Так, в США убытки такого рода оцениваются в 2 млрд. долларов, в Канаде - в 300 млн. долларов (В. Ли, 2003).

В настоящее время во всем мире уделяется большое внимание разработке различных препаратов и вакцин, направленных на борьбу с возбудителями этой инфекции.

Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам. Наблюдается селекция и циркуляция штаммов, несущих R-факторы, формирующиеся под влиянием вышеуказанных препаратов.

Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и способствовало селекции антибиотико-резистентных штаммов микроорганизмов. В ряде хозяйств обнаруживается 100% - ная устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.

Таким образом, на сегодняшний день специфическая профилактика сальмонеллеза играет главную роль в создании эпизоотического благополучия и успешном развитии свиноводческих и птицеводческих хозяйств.

В настоящее время в птицеводстве в качестве профилактических и лечебных средств при сальмонеллезах применяют пробиотики и бактериофаги.

Для профилактики сальмонеллеза свиней в настоящее время широко используются как жидкие инактивированные вакцинные препараты на основе вирулентных штаммов S. choleraesuis и S. typhimurium, так и вакцины живые сухие из аттенуированных штаммов. Применение в ветеринарной практике и той и другой формы вакцины объясняется наличием у каждой своих преимуществ и недостатков.

Жидкие инактивированные вакцины часто не обеспечивают эффективной защиты иммунизированных животных. Они имеют более низкую иммуногенность за счет действия инактиванта, повреждающего антигенные структуры клеток микроорганизмов. К тому же сальмонеллезные антигены в организме иммунизированных животных не способны размножаться и реплицироваться, что ограничивает их циркуляцию и проявление клеточного иммунитета.

Одной из основных причин медленного внедрения в практику живых вакцин является минимальная возможность применения антибиотиков до и после иммунизации.

Для профилактики сальмонеллеза свиней существует вакцина живая сухая из штамма ТС-177, который представляет собой «дикий» мутант, не имеет генетических маркеров, кроме пониженной вирулентности. Известна также вакцина живая сухая из супрессорного ревертанта S. choleraesuis №9. Штамм S. choleraesuis №9 (ФГУ ВГНКИ) отличается от эпизоотических штаммов высокой частотой (50%) выделения стрептомицинозависимых мутантов, большая часть из которых остается вирулентной. Поэтому использование этих вакцин приводит к затруднению при дифференциации вакцинного штамма от полевого, из-за необходимости изучения большого количества мутантных клонов (Э.А. Светоч и др. 2003).

Анализируя выше сказанное, можно сделать вывод, что разработка и совершенствование средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц остается актуальной задачей научных сотрудников, биотехнологов и практикующих врачей.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах и совершенствование профилактики этого заболевания с помощью специфических средств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

-провести мониторинг сальмонеллеза свиней и птиц на территории Российской Федерации;

-разработать технологии производства, методы контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»;

-разработать нормативно-техническую документацию (технические условия и наставление по применению) на производство данных препаратов;

-испытать вакцины в лабораторных и производственных условиях;

-оценить протективную активность «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» в сравнении с другими существующими противосальмонеллезными вакцинами;

Научная новизна работы

Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителей сальмонеллеза свиней и птиц о роли S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum в развитии эпизоотической ситуации, складывающейся в неблагополучных по сальмонеллезу отдельно взятых хозяйствах.

Обоснована необходимость создания вакцинных препаратов для профилактики сальмонеллеза свиней на основе штаммов S. choleraesuis и S. typhimurium и сальмонеллеза птиц на основе штаммов S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum.

Показана возможность использования питательной среды на основе ПГРМ вместо мясных переваров без потери урожайности при культивировании сальмонелл.

Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов S. choleraesuis SC230 и S. typhimurium №3 по иммуногенным свойствам превосходит существующие противосальмонеллезные вакцины.

Практическая значимость работы

Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц». Созданы проекты научно-технической документации (НД) на вакцинные препараты по изготовлению и контролю.

Предложена питательная среда для культивирования вакцинных штаммов S. choleraesuis SC230, S. typhimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallinarum-pullorum T10 на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.

Получены положительные результаты испытания вакцинных препаратов как на лабораторных, так и на естественно восприимчивых животных.

Публикация результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Зарегистрировано 2 отчета о

НИОКР ГНЦ прикладной микробиологии по линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ 2001-2002 (Раздел «Разработка образцов готовых форм препаратов и наработка опытных партий вакцин против сальмонеллеза птиц, гемофилеза свиней. Получение лабораторного образца вакцины против коксиеллеза крупного рогатого скота») и 2002-2003 гг. (Раздел «Разработка проекта нормативно-технической документации на приготовление «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

- на международной конференции «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Сб. докл. Межд. конф. молодых ученых 5-6 декабря 2002 г. -Щелково, 2002 г;

- на межлабораторном научном семинаре, ГНЦПМ - Оболенск, апрель 2004г.

Основные положения диссертации выносимые на защиту

1.Новые данные о роли полевых штаммов S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum в развитии эпизоотической ситуации в РФ на примере 21 свиноводческого и 36 птицеводческих хозяйств из 27 регионов России.

2.Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ с содержанием ам. N > 600 мг%.

3.«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза птиц», характеризующаяся крайне низкой остаточной реактогенностью и способностью формирования стойкого специфического иммунитета.

4.«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней», обладающая крайне низкой остаточной реактогенностью и высокими иммуногенными свойствами по сравнению с другими сальмонеллезными вакцинами.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 115 источников, из них 83 отечественных и 32 зарубежных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Павлов, Сергей Иванович

1. Мониторинг возбудителей сальмонеллезов свиней и птиц показал, что в настоящее время 47,4% свиноводческих и 48,6% птицеводческих хозяйств являются эпизоотическими очагами сальмонеллезной инфекции. Лечение и профилактика сальмонеллеза могут быть результативными при условии определения лекарственной устойчивости выделенных штаммов сальмонелл.2. Использование БГРМ вместо мясных питательных сред при культивировании вакцинных штаммов сальмонелл не приводит к потере урожайности, бактериальные клетки сохраняют характерные для сальмонелл тинкгориальные и серологические свойства, себестоимость вакцинных препаратов снижается по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.3. Разработана и освоена технология изготовления «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц».4. Полученные экспериментальные серии вакцин прошли лабораторные и производственные испытания (в неблагополучных по данному заболеванию хозяйствах) с положительными результатами.5. Сравнительная оценка протективной активности используемых в практике сальмонеллезных вакцин и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов S. choleraesuis SC230 и S. typhimurium №3 показала, что экспериментальная вакцина превосходит по иммуногенным свойствам как инактивированные, так и живые сухие аналоги.6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Представлены для рассмотрения и согласования в Департамент ветеринарии Минсельхоза России технические условия и наставления по применению «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Сергей Иванович, Оболенск

1. Алимов A.M., Котылев О. А. Сравнительная оценка питательных сред при культивировании вакцинного штамма листерий АУФ. Ученые записки КВИ. - Казань: 1975. - Т. 119.-158 с.

2. Андросов Ф.З., Беляев И.Я., Клочко Р.Т,, Ковалерчук Л.И. и др.; Под ред. В.Я. Антонова Справочник ветеринарного лаборанта. - М.: Колос, 1981. - 40-41,89-91 с.

3. AHT0H0B Б.И., Борисова В.В., Волкова П.М., Каменева Л.П. и др.; Под ред. Б.И. Антонова Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные исследования. - М.: Агропромиздат, 1986. -177 - 209 с.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962, - 127-173 с.

5. Баев И.А. Биотехнология. - М.: Наука, 1984. б.Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. - М.: Медицина, 1992.

6. Баснакьян И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. - М.: Наука, 1982.

7. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. - В 2 т. М.: Мир, 1989.

8. Бухвальдер Р., Фухс Х.-В., Хайдер Г., Хипе Т. и др. Иммунопрофилактика болезней животных. Пер. с нем. - М.: Колос, 1981. - 415 с.

9. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций. Журн Микробиол. - 1984. - № 4. - 3 - 8 с.

10. Валеева Ф.К. Автореф. дис... канд. вет. наук. - Алма-Ата, 1966. П.Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. - Рига: Зинатне, 1987. -263 с.

11. Га11иакберова Н.И., Алимов А.М., Макаев Х.Н. Изыскание питательной среды и оптимизация условий культивирования сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 июня 2001г. - Щелково: 2001. - 103 - 106 с.

12. Галиакберова Н.И., Алимов А.М., Макаев Х.Н. Влияние дозы и фазы роста посевного материала на выход бактериальной массы сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 декабря 2002г. - Щелково: 2002. - 91 - 93 с.

13. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. Пер. с англ. - М.: Мир, 1983. Т.З 21 .Гинзбург Н.Н. Живые вакцины. - М.: Медицина, 1969.

14. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 227 - 246 с.

15. Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С., Прямухина Н.С. и др.; Под ред. В.И. Покровского Энтеробактерии. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 1985. - 121 - 164 с.

16. Гусев В.В., Павлов СИ., Приходько СМ., Теймуразов М.Г. Актуальность проблемы сальмонеллеза в промышленном птицеводстве. Журн. Практик. - 2002. - № 9-10. - 94 - 96 с.

17. Гусев В.В., Теймуразов М.Г., Приходько СМ., Павлов СИ. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций в промышленном птицеводстве. Журн. Вет. консультант. - 2002. - № 19.-17-19 с.

18. Гусев В., Светоч Э., Глазков Н,, Теймуразов М. и др. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций. Журн. Птицеводство. - 2003. - № 2. - 8 - 10 с.

19. Гусев В.В., Приходько СМ., Павлов СИ., Теймуразов М.Г. Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве. Журн. Ветеринария. - 2004. - № 2. - 7 -8 с.

20. Дзагуров Г., Быченко Б.Д. Термины и определения, относящиеся к стандартным образцам биологических препаратов, используемых в медицине. Сборник трудов ГИСК им. Тарасевича и Московской НИИВиС - М.: 1972. -1 - 6 с,

21. Котова А.Л., Белозеров Е.С, Сальмонеллезы. - Алма-ата: Гылым, 1992.

22. Ли В. Физал - и сальмонелла исчезнет. Журн. Птицеводство. - 2003. - №2. - 21 - 22 с.

23. Лярски 3. Диагностика вирусных болезней животных. Пер. с пол. - М.: Колос, 1980. - 217-233 с.

24. Матвиенко Б.А. Иммуногенность аттенуированных штаммов сальмонелл. Журн. Ветеринария. - 1970. - № 8. - 44 - 45 с.

25. Матвиенко Б.А. Ветеринарная микробиология. - М.: Колос, 1982.

26. Машины, установки, системы.: Каталог / Фирма Pharmatec. - Германия, 1996.

27. Медуницын Н.В. Вакцинология. - М.: «Триада-Х», 1999. - 272 с.

28. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.

29. Паутов В.Н., Чичерин Ю.В., Евстигнеев В.И. Протективные свойства фракции чумного микроба в эксперименте. Журн. микробиол. - 1979. - №10. - 37 - 42 с.

30. Перт Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Пер. с англ. - М.: Мир, 1978.

31. Позмогова И.Н. Воздействие температур выше оптимальных на бактерии и дрожжи. - Изд-во АН СССР, сер. биол. -1978. - №2.

32. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. - М.: Наука, 1983.

33. Покровский В.И. Энтеробактерии. - М.: Медицина, 1985. ЗО.Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 363 - 378 с.

34. Работнова И.А. Роль физико-химических условий (рН и гНг) в жизнидеятельности микрорганизмов. - М.: Наука, 1957.

35. Работнова И.А., Поамогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизма. - М.: Наука, 1979.

36. Работнова И.А., Баснакьян И.Н., Боровкова В.М., Запорожцев Л.Н. Процессы культивирования микроорганизмов. - Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1982. - №4. - 559 - 573 с.

37. Равилов А.З. с соавт. Микробиологические среды. - Казань: ФЭН, 1999. - 398 с,

38. Раевский А.А. Разработка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин. Авореф. дне... канд. биол. наук. - Щелково, 2002.

39. Ряпис л.А,, Беляков В.Д. Проблемы номенклатуры и классификации сальмонелл и сальмонеллезов. Журн. микробиол. - 1995. -№ 4. -115-118 с.

40. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б.; Под ред. М.А. Сидорова Определитель зоопатогенных микроорганизмов: справочник. - М.: Колос, 1995. - 201 - 204 с.

41. Сохин А.А. Парадокс инфекционного иммунитета. Журн. микробиол. - 1988. - № 1. - 73 - 80 с. бб.Стерилизаторы фирмы «Гетинте».: Каталог / Фирма Getinge. - Германия, 1996.

42. Табаева А.А., Котова А.Л. Вопросы таксономии и номенклатуры бактерий рода SALMONELLA. Журн. Микробиология. - 200L - № 6. - 110 - 113 с.

43. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. - М.: Медициа, 1983. - 216 -217 с.

44. Ураков Н.Н., Волков В.Я., Боровик Р.В. Функциональное состояние и механизмы повреждения микрорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов. Журн. Биотехнолоигия. - 1988. - Т. 4 - №4. - 420 -432 с.

45. Фробишер М. Основы микробиологии. - М.: Мир, 1963.

46. Хейфец А.Б. Теоретические и методические основы оценки эффективности специфической профилактики. - М.: Медицина, 1968.

47. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. - М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 192 - 193 с.

48. Шефлер С, Минцер Л., Бенеш Опыты по получению атгенуированных штаммов и иммуногенных штаммов энтеробактерий. Журн. ЖМЭИ. - 1957. - №8. - 8 - 14 с.

49. Шустер Б.Ю. Вакцины из атгенуированных штаммов сальмонелл: Дис... докт. вет. наук. - М., 1988.

50. Ярцев М.Я. Разработка технологии производства живых сухих вакцин против пастереллеза птиц, рожи и бруцеллеза животных (экспериментальные исследования и внедрение) Автореф. дис... докт. биол. наук. - М., 1991.

51. Ярцев М.Я., Бушуева Н.Б., Раевский А,А., Анисимова Л.В. и др. Технология промышленного производства бактериальных вакцин. Журн. Ветеринария. - 1998. - №3. - 22 -24с.

52. Ярцев М.Я. Специфическая профилактика и технология вакцинного производства при сальмонеллезах. Журн. Ветеринария. 1996. - № 8. - 47 - 51 с.

53. Ярцев М.Я. Показатель роста микроорганизмов в управляемых процессах культивирования. Журн. Ветеринария. 2000. - № 4. - 25 - 28 с.

54. Botes H.I. W. // Bull. Off. Int. Epiz. - 1968

55. Emst R.R. Sterilisation by heat. In «Desinfection, Sterilisation and Preservation». // Led and fabiger, Philadelphia, Pennsylvania, - 1977. - pp. 481 - 521.

56. Hansen N.H., Riemann H. Factors affecting the heat resistane of nonsporing organisms. // L. Appl. Bacteriol, - 26, - 1963. - pp. 314 - 333

57. Haurowits F. Immunochemistry and the biosynthesis of antibodies. New - Jork, 1.ondon,Interscience. -1968. - pp. 301.

58. Hemert P. // Progress in indust. Microbiol., 1974,13

59. Hinshelwood C.N. The chemical kinetics of the bacterial cell. // Clarendon Press, Oxford, 1946.

60. Kluyver A.J., Perquin L.H.C., Biochemische Zeit., 266,68 (1933)

61. Le Minor L., Veron M., Popoff M.Y. Proposition pour une nomenclature des Salmonella. Ibid. 1982,133 B: - pp. 245 - 254.

62. Le Minor L., Popoff M.Y., Laurent B. et al. Individualisation dune septieme sous-espece de Salmonella: S. choleraesuis subsp. indica subsp. nov. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 1986, 137 B: -pp.211-217.

63. Litwin J. A survey of various media and growth factors used in evil cultivation // Dev. Biol. Stand. - 42, -1979. - pp. 37 - 45.

64. Minkevich I.B. M'ass-Energy Balance for Microbial Product Synthesis. Biochemical cell Culture Aspects. // Biotech. Bioeng, - 25, -1267, - 1983,

65. Monod J. Recherhes sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. 2"** edn., Hermann, Paris, 1942.

66. Pasteur L. Annales de Chime et de Physique, 3 // Serie, - 58, - 324, - 1869.

67. Raulim M. J. Annales des Scinces Naturellus, 5 Serie, - 11, - 93, - 1869.

68. Rohn O. Physicas methods of sterilisation of microorganisms. // Bacteriol. Rev., - 9, - 1945. - pp. 1 - 47.

69. Schodel F. // Infection. - 1992. 20. 1.

70. Scholes G., Weiss J. Chemical action of X-rays on nucleic acid and related substanus in aqueous systems. // Biochem. J., - 56, - 1954. - pp. 65 - 72.

71. Scott W.J. // Advances in Food Research, - 7, 83, - 1957.

72. Siiman R.W,, Bagley B.I. The visoostat: Prodnetstet method ef feed - rate control in oontinions fermentation. // Bloend, 21,1979. - pp. 173 -179. I lO.Slator A., J. chem. Soc, 119,115, (1921). II I.Smith H.W. / /1 . Higiene. 1965. 63. 1.

73. Solomons G.L. Materials and methods in fermentation. Academic Press, - London and New York,-1969.-pp. 335 in.Sykes Q, «Methods in Microbiology», Vol. 1., Academic Preess, New York, - 1969. - pp. 77-121.