Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Экспериментальное обоснование пероральной иммунизации против сальмонеллёза свиней

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование пероральной иммунизации против сальмонеллёза свиней"

На правах рукописи

У''

Лощинин Максим Николаевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА СВИНЕЙ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

5 ДПР 2012

Москва-2012

005020446

005020446

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Субботин Владимир Викторович

Официальные оппоненты;

Соколов Михаил Николаевич, доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, Лауреат премии Совета Министров СССР, ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, заведующий отделом

Сидорчук Александр Андреевич, доктор ветеринарных наук, профессор, Лауреат премии Совета Министров СССР, ФГБОУ ВПО Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, заведующий кафедрой

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится »¿^■у/Сс.'-с^сг 2012 г. в ^ ~часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии наук по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, 24, к.1, ВИЭВ, тел. (495) 970-03-69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии

Автореферат разослан ¿72012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сальмонеллезы все еще широко распространены в животноводческих хозяйствах и наносят отрасли существенный экономический ущерб. В последние годы заболеваемость крупного рогатого скота составляла 2,3-3,8%, мелкого рогатого скота - 2,5-9,9%, свиней - 3,4-14,1%, птицы (сальмонеллез + тиф-пуллороз) - 1,4-2,2%. Сальмонеллезы являются и значимой социальной проблемой, являясь причиной массовых вспышек пищевых токсикоинфекций у людей (J.G.Martel,1994; Г.Л. Пухлякова, 1994; А.Б. Кононенко, 1994; О.В. Бухарин, 2000; Л.А. Кафтырева, 2008).

Для специфической профилактики болезни используют живые вакцины из апенуированных штаммов или инактивированные на основе цельнокле-точных антигенов (Б.Ю.Шустер, 1987; В.И.Заерко, 1996; А.А.Шевцов, 2006; С.В. Ленёв и др.,2007 и др.). Живые вакцины более иммуногенны чем инактивированные, но многократные пассажи апенуированных штаммов на животных с вторичными иммунодефицитами ведут к их реверсии в исходное вирулентное состояние, что нередко заканчивается вспышками болезни на вакцинированном поголовье. Инактивированные вакцины не обладают достаточной иммуногенностью (A.A. Сидорчук, 1989). Увеличение прививочных доз данных препаратов в большинстве случаев невозможно из-за их значительной реактогенности, которую связывают с эндотоксином возбудителя (Б.БЛершин, 1980; М.А.Сидоров и др., 1991; М.А.Сидоров и др., 1992;

A.А.Воробьев, 1998, Н.А.Солдатенко и др., 2009 и др.).

Установлено, что лизис сальмонелл гидроксиламином с последующим осаждением растворимых антигенов клеток солями кальция позволяет снизить токсигенность при сохранении антигенности материала.

B.В.Кудрявцевым (1993) показано, что полученные таким образом антигены при внутримышечном введении лабораторным животным (мыши, кролики) и поросятам обладают как антигенными, так и иммуногенными свойствами и перспективны для разработки средств специфической профилактики.

В крупных свиноводческих предприятиях животных вакцинируют против целого ряда болезней бактериальной и вирусной этиологии. Этот затратный и трудоемкий процесс можно облегчить при условии использования групповых методов иммунизации, таких, как аэрозольный или пероральный, нашедших широкое применение преимущественно в птицеводстве и, в меньшей степени, в других отраслях животноводства.

Цель работы заключалась в изучении возможности перорального применения лизат-антигенов сальмонелл для создания специфического иммунитета к возбудителю болезни.

Задачи исследований:

- изучить реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым беспородным мышам в сравнении с корпускулярными антигенами;

- изучить антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл, динамику сывороточных и копроантител у лабораторных животных при разных схемах их пероральной иммунизации;

- дать изотипическую характеристику иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии ВАЬВ/с в процессе поствакцинального иммунного ответа при пероральном и подкожном введении лизат-антигенов;

- отработать оптимальную схему пероральной иммунизации мышей ли-зат-антигенами сальмонелл и изучить иммуногенность этих антигенов в опыте прямого заражения;

- изучить безвредность и антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят и отработать оптимальную схему их пероральной иммунизации;

- изучить эффективность пероральной иммунизации поросят лизат-антигенами сальмонелл в условиях неблагополучного по сальмонеллезу свиноводческого хозяйства.

Научная новизна. Впервые в ветеринарной практике экспериментально обоснована возможность пероральной иммунизации свиней против сальмо-

неллеза с использованием лизатов клеток возбудителя.

Охарактеризованы реактогенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при их внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении. Установлено, что в зависимости от способа введения они менее реактогенны в сравнении с корпускулярными в 3,6-6,1 раза. Реактогенность лизат-антигенов наименее выражена при их пероральном введении, максимально - при внутрибрюшинном.

Установлена динамика сывороточных и копроантител к сальмонеллам при разных схемах пероральной иммунизации лабораторных животных (белые беспородные мыши, кролики).

Дана изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии ВАЬВ/с в процессе поствакцинального иммунного ответа при пероральном введении лизат-антигенов сальмонелл в сравнении с их подкожным использованием.

Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации мышей, обеспечивающая выраженный иммунный ответ, защиту от заражения высоковирулентными сальмонеллами и позволяющая отказаться от использования защитных веществ совместно с лизат-антигенами.

Доказана безвредность лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации ими поросят и установлена динамика специфических сывороточных и копроантител при различных схемах пероральной иммунизации поросят. Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации поросят лизат-антигенами сальмонелл.

Практическая значимость. Результаты исследований позволяют рекомендовать метод лизиса сальмонелл гидроксиламином солянокислым для получения антигенов возбудителя, пригодных для групповой пероральной иммунизации поросят, которая обеспечивает формирование как местного мукозального, так и системного противосальмонеллезного иммунитета.

Разработаны методические рекомендации «Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предна-

значенных для оральной иммунизации животных» (рассмотрены и одобрены Ученым советом ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ, протокол № 42 от 20.03.2008 г.) и методические наставления «Разработка метода и оценка эффективности пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза ли-зат-антигенами возбудителя», одобренные секцией «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.) и утвервденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым (03.10.2011 г.).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко (Москва, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел» (Москва, 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства» (Новочеркасск, 2010 г.); Международной научной конференции «Производство, эффективность и качество» (Москва, 2011 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп с.х. животных, рыб и пчел» (Москва, 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

- экспериментальные данные, характеризующие остаточную реактоген-ность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения лабораторным животным;

- схема пероральной иммунизации животных лизат-антигенами сальмонелл, обеспечивающая возможность отказа от защитных веществ;

- основные показатели иммунологической перестройки организма лабораторных животных в ответ на пероральное введение лизат-антигенов сальмонелл, обеспечивающие формирование местного мукозального и системного иммунитета к сальмонеллезу;

- схема пероральной иммунизации поросят против сальмонеллеза с использованием лизат-антигенов возбудителя.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в т.ч. 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.

Личный вклад соискателя. Основная часть исследований выполнена лично автором. Опыты по изучению вирулентности штаммов сальмонелл проведены совместно с д.в.н., проф. Д.И.Скородумовым и к.в.н. Д.В.Беликовым (МГУГТБ); глубинное культивирование штаммов сальмонелл для получения биомассы и последующего изготовления лизат-антигенов -совместно с к.в.н. Е.Э.Школьниковым, к.б.н. Л.В.Анисимовой и к.б.н. Л.А.Коротеевой (ГНУ ВНИТИБП); иммунологические исследования - совместно с к.б.н. И.Ю.Ездаковой (ГНУ ВИЭВ). Соискатель благодарит всех соавторов за помощь, оказанную при выполнении нашей работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 252 источника, из них 166 отечественных и 86 зарубежных и приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 17 рисунками.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2006-2011 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ РАСХН (задание 08.02, этап 08.02.02. «Создать новые и усовершенствовать существующие средства и ме-

ходы борьбы с возбудителями массовых инфекционных болезней молодняка продуктивных животных») на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур и лаборатории иммунологии ГНУ ВИЭВ, на кафедре микробиологии и иммунологии МГУПБ, в отделе бактериальных препаратов ГНУ ВНИТИБП, КФХ «Спыну» Можайского района Московской области и ЗАО «Скороднянское» Белгородской области.

В опытах использовали 620 белых беспородных мышей и 60 мышей линии ВАЬВ/с живой массой 16-18 г., 12 кроликов породы «Советская шиншилла» живой массой 2-2,5 кг, 3066 поросят, живой массой 7-8 кг, 374 супо-ростных свиноматки. Штаммы БЛрИутигшт № 415 и йсйо/егаезии; № 370 получены из ВГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора. Тинктори-альные и культурально-морфологические свойства сальмонелл изучали общепринятыми методами. Их серологическую идентификацию проводили в РА на стекле при помощи сывороток сальмонеллёзных О-комплексных и мо-норецепторных О- и Н- агглютинирующих (ФГУП «Курская биофабрика -фирма «Биок»), ферментативную активность определяли при помощи теста ЭНТЕРО-Рапид 24. Гидроксиламиновый антиген готовили в отделе бактерийных препаратов ГНУ ВНИТИБП по методу НИИВС им. Мечникова, разработанному для шигелл и других микроорганизмов (авторское свидетельство №1298981. Крейлин Л.С. и др.). Концентрацию микробных клеток определяли при помощи стандарта «мутности» ГИСК им. Тарасевича.

Для РНГА и РНАт использовали диагностикумы эритроцитарные саль-монеллёзные О-антигенные жидкие групп 6,7 и 1,4,12 (ФГУП «НПО» Мик-роген МЗ РФ); сыворотку диагностическую сальмонеллёзную адсорбированную сухую - А, В, С, Д, Е для РА - ПЕСТАЛ (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов). Подсчет форменных элементов крови производили общепринятыми методами.

Число розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразо-вания (И.П.Кондрахин и др., 1985). Перитонеальные макрофаги получали ме-

тодом адгезии на пластик (Ю.Н.Федоров, ЛЮ.Ездакова, 2008). Фагоцитарную активность и фагоцитарное число определяли при помощи частиц латекса по стандартной методике. Количество Т- и B-лимфоцитов определяли в реакции иммунофлуоресценции с моноклональными антителами к CD2 и CD 19 мыши («DakoCytomation»), Концентрацию иммуноглобулинов в биологических жидкостях мышей выявляли в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, по инструкции фирмы производителя (Sigma Immunochemicals). Результаты ИФА оценивали на фотометре «Multiskan МСС/340» при длине волны 492 нм. Полученный цифровой материал по РА, РНГА и РНАт подвергали логарифмированию, для чего степень разведения при кратности 1:2 перевели в числовые значения (Сайдулин Т.С., 1992). Среднюю арифметическую (М) и стандартную ошибку (т) определяли по методикам, описанным И.П.Ашмариным и И.А.Ворбьёвым (1962). Достоверность разницы двух сравниваемых показателей определяли по таблице Стью-дента. Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Основные биологические свойства штаммов сальмонелл По культуральным, морфологическим, тинкториальным, ферментативным свойствам изучаемые штаммы соответствовали роду Salmonella. Штамм № 370 по антигенной структуре относится к группе Ci и сероварианту S.choleraesuis, а штамм 415 - к группе В и сероварианту S.typhimurium. При определении величины LDÍ0, которую рассчитывали методом Рида-Менча, установлено, что штамм S.choleraesuis № 370 вызывает гибель 50% животных, взятых в опыт и зараженных внутрибрюшинно в дозе 120 бактериальных клеток, а штамм S.typhimurium № 415 - в дозе 730 бактериальных клеток на голову. Полученные экспериментальные данные свидетельствовали о вы-

сокой вирулентности изучаемых штаммов сальмонелл, стабильности вирулентности и других биологических свойств, что позволило использовать эти штаммы для решения поставленных задач.

2.2.2. Реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым мышам

На белых беспородных мышах живой массой 16-18 г определяли величину 1^50 при разных способах введения лизат-антигенов сальмонелл в сравнении с цельноклеточными (корпускулярными) антигенами (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная реактогенность корпускулярных и лизат-антигенов сальмонелл при разных способах их введения белым мышам

Способ Штаммы сальмонелл Виды антигена Величина 1ЛЗ50,

введения микр. кл.

£ с/го/егаетом № 370 корпускулярный 6,58x10"

внутрибрюшинно лизированный 23,72x10"

8.1урЫтигшт № 415 корпускулярный 6,18x10"

лизированный 25,11x10"

Хсйо/егае.ш'.у № 370 корпускулярный 11,61x10"

подкожно лизированный 60,99x10"

5.1урЫтигЫт № 415 корпускулярный 17,70x10"

лизированный 79,90x10"

£ с^го/егаелки № 370 корпускулярный 24,07x10"

перорально лизированный 128,46x10"

5.1урЫтипит №415 корпускулярный 19,92x10"

лизированный 121,99x10"

Для этого сформировали 36 групп по 10 животных. Каждой из групп корпускулярные антигены вводили в двукратно возрастающих дозах, а лизи-рованные антигены - в дозах эквивалентных этим величинам в объеме 0,5 см3. За животными наблюдали в течение 10-ти суток, отмечая число павших и выживших в каждой из групп. Из таблицы 1 видно, что антигены из лизи-рованных клеток сальмонелл обоих сероваров были менее реактогенны (в 3,6-6,1 раза) в сравнении с корпускулярными при всех способах их введения. Оба варианта антигенов наиболее реактогенны при внутрибрюшинном и наименее реактогенны при оральном способе введения.

2.2.3. Определение оптимальной схемы пероральной иммунизации лизат-антигенами сальмонелл в опытах на лабораторных животных

2.2.3.1. Динамика титров лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации кроликов

Из 12 кроликов сформировали 4 группы по 3 кролика в каждой. Кроликов группы № 1 иммунизировали перорально 3 дня подряд суточной дозой, эквивалентной 900 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена, кроликов группы № 2 - перорально, дробно, двумя циклами по 3 дня подряд с интервалом между циклами 16 дней суточной дозой, эквивалентной 450 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена, кроликов группы № 3 - аналогичным образом тремя циклами по 3 дня подряд с интервалом между циклами 16 дней суточной дозой, эквивалентной 225 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена. Животные группы № 4 служили неиммунным контролем. Антиген сальмонелл обнаруживался в фекалиях и в крови животных уже через 12 час. после первого его перорального введения. Выявляемые титры были тем выше, чем большая доза антигена использовалась для иммунизации (рис.1).

——900 млрд - — 450 млрА •—225 млрд

Сутки иммунного ответа

Сутки иммунного ответа

(а) (б)

Рис. 1. Динамика титров антигена в фекалиях (а) и крови (6) кроликов В крови максимальные тигры антигена выявляли на 3-й сутки. Максимальные титры антигена в фекалиях выявляли на 3-5 сутки. Их величина так же носила дозозависимый характер (12,3±0,3, 6,7±0,3, 4,7±0,6 log 2 при дозах эквивалентных 900x10®, 450><109 и 225x109 микр. кл. на голову в сутки соответственно). Общее время обнаружения или время циркуляции антигена в крови было практически одинаковым и равнялось 10-13 суткам при всех 3-х

дозах. Третий цикл иммунизации осуществляли только минимальной дозой. В крови, при этом отмечали вдвое меньший подъем титров антигена, чем после первого цикла, а срок его циркуляции сократился с 13 до 4 дней.

2.2.3.2. Динамика титров антител к О-антигенам сальмонелл у кроликов, иммунизированных перорально лизат-антигенами сальмонелл

Величина титров специфических иммуноглобулинов в крови и фекалиях, а также длительность их циркуляции имели прямую пропорциональную зависимость от дозы антигена, используемой для иммунизации (рис,2).

Дробная иммунизация циклами по 3 дня позволяла поддержать титры специфических иммуноглобулинов в отдаленный от начала иммунизации срок (25-30 дней) на более высоком уровне, чем при иммунизации одним циклом, но при этом не позволила достичь тех максимальных величин тиров в ранний поствакциналный период (10-21 сутки), которые обеспечивает один трехдневный цикл в максимальной дозе.

900 млрд 450 млрд 225 млрд

(а) (б)

Рис. 2. Динамика титров антител в фекалиях (а) и крови (б) кроликов Дробная иммунизация циклами по 3 дня не обеспечила и увеличения сроков обнаружения специфических иммуноглобулинов в крови и кишечнике кроликов.

2.2.3.3. Изучение параметров клеточного иммунитета кроликов после пероральной иммунизации лизат-антигеном сальмонелл

Кровь для исследования брали из ушной вены кроликов на 7-е, 25-е, 39-е, 54-е и 66-е сутки от начала первого цикла иммунизации. Динамика розет-кообразующих клеток в процессе иммунного ответа представлена на рис. 3, из которого видно, что клеточный ответ регистрировался при всех 3-х схемах

——900 млрд • - 450 млрд ■»--225 млрд

Ко>р4злЫ цикл

Сутки иммунного ответа

17 кйедаз^Ц^з^^ШН

| 2 цикл { Зцикп | Сутки иммунного ответа

иммунизации и был наиболее выражен при одном 3-дневном цикле с использованием максимальной дозы. Повторные циклы иммунизации обеспечивали повторное увеличение количества Т- и В-лимфоцитов.

На 66-е сутки иммунного ответа число розеткообразующих клеток у опытных кроликов было достоверно большим, чем у контрольных.

Установлен статистически достоверный (р<0,05) рост фагоцитарной активности и отсутствие значимой разницы в динамике этого показателя при всех 3-х циклах. Таким образом, показано, что разделение дробной иммунизации на циклы не целесообразно, поскольку второй и, в особенности, третий циклы происходят на фоне формирующегося иммунного ответа и часть используемого

Рис. 3. Динамика Т- и В-клеток крови кроликов, пероралъно иммунизированных лизат-антигеном Б.ЦрЫтипит в дозе 900млрд.мк.кл. при 1 цикле иммунизации (а), 450 млрд.мк.кл. при 2 циклах иммунизации (б), 225 млрд.мк.кл. при 3 циклах иммунизации (в).

(В)

при этом антигена блокируется факторами специфического и неспецифического иммунитета. Более целесообразно использовать дробную иммунизацию не деля ее на циклы, т.е. используя один, но более продолжительный,

чем три дня подряд цикл перорального введения антигенов.

2.2.3.4. Антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл и определение оптимальной схемы при пероральной иммунизации мышей

Белых беспородных мышей (п=20) иммунизировали в течение 5-ти суток дозой антигена, эквивалентной 20 млрд. микр. кл. без протектора (1 гр.), с 1% пектина (2 гр.) и, сорбированным на отрубях (3 гр.). Мыши групп № 4, 5 и 6 получали аналогичные антигены в течение 10 суток подряд в суточной дозе, эквивалентной 10 млрд. микр. кл. Суммарная доза антигенов во всех группах составляла 100 млрд. микр. кл./гол. На 5-е, 10-е, 20-е, 25-е и 30-е сутки после последнего введения препаратов определяли величины сывороточных и ко-проантител к О-антигенам сальмонелл.

Из данных таблиц 2 и 3 видно, что уровень копроантител (15-20 сутки наблюдения) был в среднем выше уровня сывороточных на 4-5 разведений или в 16-32 раза. К концу месячного срока наблюдения этот показатель составил 3-4 разведения или 8-16 раз.

Таблица 2

Динамика сывороточных антител к S.typhimurium у пероралъно иммунизированных мышей

Типы антигенов Схема иммунизации Срок исследования (сутки после иммунизации) и средние титры (п=3) сывороточных антител (log j)

5 10 15 20 25 30

Без протекторв 5 дней 2 1,7 2 1 1 1

10 дней 4 2 3 3 2 1

С 1% пектина 5 дней 1,7 2 1,7 1 1 1

10 дней 3 3 2,7 2 2 1,3

Сорбированный на отрубях 5 дней 2,7 2 3 4 2,7 2

10 дней 2,7 2 3 3,3 3 3,3

Контроль 0 0 0 0 0 0

Таблица 3

Динамика копроантител к S.typhimurium у пероралъно иммунизированных мышей

Типы антигенов Схема иммунизации Срок исследования (сутки после иммунизации) и средние титры (п=3) копроантител (log 2)

5 10 15 20 25 30

Без протекторв 5 дней 5 10 11 8 7 5

10 дней 11 10,7 8 8 6 4,7

С 1% пектина 5 дней 5 7 7 7,3 7 6

10 дней 7,3 6,3 5,7 6 6,3 6

Сорбированный на отрубях 5 дней 4 7,3 8,3 6,3 6 5,7

10 дней 4,3 8 6,7 6 5 4,7

Контроль 0 0 0 0 0 0

Таким образом, установлено, что 5-10-кратное введение антигена обеспечивает его длительный контакт с лимфоидной тканью кишечника. Иммунный ответ на антигены с протекторами и без них практически не отличался ни по своей величине, ни по длительности в исследуемые сроки.

2.2.4. Изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мыши в процессе поствакцинального иммунного

ответа

В опыте по определению уровня иммуноглобулинов в кишечнике и селезенке было использовано 60 мышей линии BALB/c. Сформировали 4 группы: мышей группы 1 иммунизировали в течение 10 дней подряд с кормом (per os) лизат-антигеном S.typhimurium штамм 415 и S.choleraesuis штамм 370 (1:1) в дозе 10 млрд. микробных клеток на мышь в сутки (п=20); мыши группы 2 (контрольные) получали корм без вакцины (п=10); мышей группы 3 иммунизировали однократно подкожно лизат-антигеном S.typhimurium штамм 415 и S.choleraesuis штамм 370 (1:1) в дозе 10 млрд. микробных клеток на мышь (п=20); мышам группы 4 (контрольные) вводили подкожно 0,2 мл физиологического раствора (п=10).

Исследование Ig в кишечнике и селезенке мышей линии BALB/c проводили методом ИФА на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки иммунного ответа.

Отмечался подъем уровня IgG (13 log 2, контроль 12 log 2) в селезёнке на 7-е и 14-е сутки при введении лизат-антигена per os. Увеличение IgM в кишечнике (4 log 2, контроль 2 log 2) в 2 раза по сравнению с контролем при пероральном введении происходило на 7-е, а при подкожном на 14-е сутки. При пероральном введении антигена отмечалось значительное повышение IgA в кишечнике (12 log 2, контроль 10 log 2) на 7-е сутки после вакцинации, а IgG на 21-е сутки (13 log 2, контроль 9 log 2).

2.2.5. Клеточный иммунный ответ у мышей при подкожной и пе-роральной иммунизации лизат-антигенами сальмонелл

Схема опыта аналогична представленной в разделе 2.2.4. Исследования в РИФ проводили на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после вакцинации. Отмечалось достоверное (р<0,05) увеличение количества лимфоцитов к 14-м суткам

после вакцинации обоими способами (табл. 4). Увеличение количества нейтрофилов на 1-е сутки со снижением на 21-е, связано с общей активацией иммунной системы. Количество моноцитов достоверно возрастало на 1-7-е сутки при пероральной и в течение всего срока наблюдения при подкожной иммунизации. Повышение фагоцитарной активности и фагоцитарного числа у мышей после пероральной иммунизации отмечалось на 7-е сутки 49,3% (контроль 15,8%) и 4,5% (контроль 1,8%) соответственно.

Таблица 4

Динамика показателей иммунокомпетентных клеток мышей (п=60), М±т

Группы животных и сроки исследований

Показатели, Контроль Опыт

% 1-е сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки

1 3 1 3 1 3 1 3

Лимфоциты 83,0 81,0 85,4 87,6 91,2 89,2 96,4 95,0 95,2 91,0

±1,3 ±1,3 ±2,9 ±1,3* ±1,7* ±2,9* ±1,0* ±0,9* ±1,1* ±1,3*

Нейтрофилы 6,8 6,2 11,8 8,4 6,2 7,8 3,0 4,0 4,2 7,8

±1,24 ±1,1 ±2,2* ±1,3 ±1,1 ±3,2 ±0,54 ±1,14 ±0,8 ±1,15

Моноциты 0,2 0,1 2,8 4,0 2,6 2,8 0,6 0,8 0,6 1,2

±0,02 ±0,02 ±0,96* ±0,4* ±0,9* ±1,5* ±0,01* ±0,1* ±0,04* ±0,37*

Примечание: * р<0,05 При сравнении данных, представленных на рис.4а и 46, можно видеть повышение числа тимоцитов и спленоцитов на 1-е и 7-е сутки после введения антигена по сравнению с контролем, но также видно значительно меньшее количество Т- и В-лимфоцитов по сравнению с показателями при пероральной вакцинации.

(а) (б)

Рис. 4. Динамика Т- и В клеток при пероральной (а) и подкожной (б) иммунизации

2.2.6. Изучение иммуногенности лизат-антигенов при пероральной иммунизации мышей в опыте прямого заражения

В опыте прямого заражения перорально привитых белых мышей установлено, что 1ЛЭ5о для контрольных животных составила 2,6x102 микр. кл. Для мышей получавших испытуемый препарат на фоне пробиотика 1ЛЭ5о -1,8*105 микр. кл., а без пробиотика -1,1*105 микр. кл.

Таблица 5

Результаты прямого заражения перорально привитых мышей

Заражающие Иммунные животные Контроль

дозы С пробиотиком Без пробиотика (не иммунные)

кол-во пало кол-во пало кол-во пало

голов голов % голов голов % голов голов %

5x10' 8 0 0 9 0 0 8 3 37,5

5x10^ 10 1 10 9 2 22,2 8 б 75

5x10' 10 3 30 8 3 37,5 8 8 100

5*Ю4 10 6 60 10 6 60 8 8 100

5х105 9 7 77,8 7 6 85,7 11 11 100

1ЛЭ5<, 1,8хЮ5 ЫхЮ5

Таким образом, пероральная иммунизация мышей предлагаемым методом позволила получить разницу в величине 1Л}5о в сравнении с интактными животными в 423,1-692,3 раза, что свидетельствует о выраженной иммуногенности препарата. Пероральная иммунизация на фоне пробиотика позволяет повысить устойчивость животных к заражению вирулентной культурой сальмонелл (табл. 5).

2.2.7. Антигенные и иммуногенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят

В КФХ «Спыну» Московской области, благополучном по сальмонелле-зу, сформировали 7 групп поросят по 8 голов, подобранных по принципу аналогов. Поросята групп № 1, № 3 и № 5 получали лизат-антигены 10 дней подряд в дозах, эквивалентных соответственно 200, 400 и 600 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена на голову в сутки с 45 по 54 дни жизни. Животные групп № 2, № 4 и № 6 дополнительно с 15 по 45 дни жизни и в течение всего срока иммунизации получали пробиотикт Лактобифадол из расчета 10 г на голову в сутки. Контрольные животные (группа № 7) ни пробиотик, ни

Таблица 6

Динамика сывороточных антителу поросят, вакцинированных перорально лизат-антигенами сальмонелл (Mim, log2)

Дозы антигена и схема иммунизации, п=8 Сутки поствакцинального иммунного ответа

7 14 21 31 41

S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler.

200 млрд. 1 2,0±0,9 2,3±0,3 3,3±0,3 3,3±0,3 2,5±0,7 3,3±0,3 2,0±0,9 1,8±0,6 0 0

2 1,8±0,3 2,3±0,3 4,0±0,06 3,7±0,3 3,0±0,05 3,5±0,2 2,5±0,3 2,0±0,03 2,0±0,09 2,0±0,3

400 млрд. 3 2,2±0,4 2,3±0,3 3,6±0,3 4,0±0,6 3,3±0,5 3,5±0,9 1,8±0,6 2,б±0,7 0 1,0±0,6

4 2,6±0,6 2,6±0,3 4,5±0,03 4,7±0,3 3,5±0,2 3,5±0,3 3,0±0,2 2,6±0,3 2,0±0,06 2,0±0,2

600 млрд. 5 2,6±0,3 3,0±0,6 4,0±0,7 4,0±0,9 3,6±0,7 3,5±0,5 2,3±0,3 2,6±1,0 0 1,0±0,7

6 2,8±0,3 3,3±0,3 5,5±0,5 5,3±0,3 4,0±0,05 4,5±0,2 3,6±0,1 3,0±0,3 2,4±0,5 2,8±0,3

Контроль 0 0 0 0 0 1,0±0,5 0 1,0±0,3 0 1,0±0,3

Таблица 7

Динамика копроантител у поросят, вакцинированных перорально лизат-антигенами сальмонелл (Mim, logz)

Дозы антигена и схема иммунизации, п=8 Сутки поствакцинального иммунного ответа

7 14 21 31 41

S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler. S.typhim. S.choler.

200 млрд. г 1 5,6±0,3 5,0±10,6 7,3±0,7 7,3±0,6 7,3±0,9 7,0±1,0 5,0±0,6 4,6±0,6 3,5±1,5 3,0±0,9

2 5,5±0,7 7,0±1,0 8,3±0,7 8,3±0,2 8,5±0,3 7,5±0,2 5,6±0,3 5,5±0,3 4,0±0,7 4,0±0,3

400 млрд. 3 4,3±0,3 5,3±0,5 7,6±0,3 7,3±0,9 7,6±1,0 7,0±0,5 5,3±0,9 5,0±0,5 3,0±0,6 3,0±1,0

4 7,0±0,6 6,6±0,3 8,6±0,3 9,5±0,3 9,0±0,3 9,3±0,3 6,6±0,3 6,0±1,0 4,0±0,3 3,0±0,5

600 млрд. 5 5,6±0,7 7,0±0,6 9,3±0,3 9,0±0,6 8,0±0,3 7,6±0,3 6,6±0,3 6,0±1,0 4,0±0,6 4,0±0,7

6 7,6±0,3 8,0±0,3 10,6±0,3 10,3±0,3 9,5±0,3 10,0±0,2 7,0±0,6 6,3±0,3 5,0±1,0 5,0±0,3

Контроль 0 0 0 0 2,0±0,3 2,0±0,5 2,0±0^ 2,0±0,2 3,0±0,3 3,5±0,5

Примечание: р<0,05 1,3,5 - антиген без пробиотика; 2,4,6 — антиген с пробиотиком

сальмонеллезные антигены не получали, иными препаратами против сальмо-неллеза не прививались.

Интенсивность иммунного ответа носила дозозависимый характер (табл. 6 и 7). Максимума титры сывороточных антител достигали к 14 суткам, удерживались на этом уровне в течение 5-7 дней и далее снижались. Титры копро-антител достигали максимума к 14-21 дню, после чего их уровень снижался.

Копроантитела обнаруживались в значительно большем количестве. Пиковый их уровень (14-21 дни наблюдения) к 5.ЦрЫтипит был в среднем выше сывороточных на 4-5 разведений (в 16-32 раза), а к 5.сйо/егае5ии - на 3-6 разведений (в 8-64 раза). Более длительным был и срок обнаружения копроан-тител - 41 день после иммунизации (срок наблюдения).

Достоверных изменений лейкоцитарной формулы крови у опытных поросят в сравнении с контрольными выявлено не было. Установлен дозозависимый характер стимуляции фагоцитарной активности и увеличения числа нейтрофилов к 7-14-м суткам иммунного ответа.

Таким образом, изучаемый препарат в испытанных дозах безвреден для поросят 45-54-дневного возраста. Оптимальной является схема иммунизации, предусматривающая 10-кратное введение антигена в дозе, эквивалентной 600 млрд. микр. кл.на голову. Иммунизация на фоне пробиотика сопровождается тенденцией к повышению титров как сывороточных, так и копроантител, а также позволяет увеличить однородность иммунного ответа у поросят.

2.2.8. Производственные испытания метода пероральной иммунизации свиней лизат-антигенами возбудителя

В условиях неблагополучного по сальмонеллезу свиноводческого хозяйства (ЗАО «Скороднянское» Белгородской области) провели два производственных опыта.

В опыте 1 за 25-28 дней до ожидаемого опороса 302 свиноматки иммунизировали испытуемыми антигенами внутримышечно в дозе, эквивалентной 15 млрд. микр. кл./ гол. и через 10 дней в той же дозе. Всех полученных от свиноматок поросят разделили на 2 группы. Поросята группы № 1 (882 гол.) в те-

чение 5 дней подряд ежедневно с 30 по 35 день жизни получали лизат-антигены в суточной дозе, эквивалентной 1 200 млрд. микр. кл./гол. Поросят группы № 2 (918 гол.) вакцинировали теми же антигенами внутримышечно, двукратно в 30-ти и 43-дневном возрасте в дозе, эквивалентной 5 млрд. микр. кл/гол. При отъеме от свиноматок в возрасте 35 дней из поросят группы №1 сформировали сектор численностью 644 головы, из поросят группы № 2 -сектор численностью 638 голов. В эти же сроки был укомплектован контрольный сектор численностью 643 головы из поросят, не вакцинировавшихся против сальмонеллеза.

Таблица 8

Динамика антител в сыворотках крови поросят (п=10)

Группы жи- Антитела к S.choleraesuis Антитела к S. typhimurium

вотных Возраст поросят (сут.)

30 53 30 53

№ 1 1:360 1:280 1:200 1:208

№2 1:340 1:460 1:164 1:384

№3 (контр.) 1:285 1:84 1:114 1:33

Титры колостральных антител в 30-и дневном возрасте (табл.8) к двум сероварам сальмонелл в опытных группах не имели существенных различий и были достаточны для предотвращения массовых вспышек сальмонеллеза. Титры поствакцинальных антител свидетельствуют о том, что внутримышечная вакцинация обеспечивала более высокий уровень сывороточных антител, в сравнении с пероральной иммунизацией. Вместе с тем, об иммунологической эффективности пероральной иммунизации свидетельствует разница в тирах между животными данной группы и не прививавшимся контролем, где к 53-дневному возрасту обнаруживали лишь незначительные титры остаточных молозивных антител.

Из группы № 1 на откорм было передано 590 подсвинков, сохранность в ней составила 91,6%. Из группы № 2 - 546 подсвинков, сохранность составила 85,6%. В контрольной группе аналогичные показатели составили 518 голов и 80,5%. Средняя живая масса одной головы при передаче на откорм составила

30,4 кг, 29,0 кг и 29,4 кг в группах № 1, № 2 и контрольной группе соответственно.

В опыт 2 отобрали 72 свиноматки, трехкратно иммунизированные против сальмонеллеза вакциной ППД. Всех полученных от них поросят разделили на 2 группы. Поросята группы № 1 (опыт, 282 гол.) 10 дней подряд с 20-го по 30-й дни жизни получали лизат-антигены сальмонелл (З.сЛо/егаешл) в суточной дозе, эквивалентной 600 млрд. микр. кл./гол. Поросята группы № 2 (контроль, 285 гол.) против сальмонеллеза не вакцинировались.

» Антитела в сыворотке

—С— Контроль

& Антитела в фекалиях

— *<— Контроль

15 дней 35 дней 60 дней Сутки после иммунизации

Рис. 5.Динамика титров антител в сыворотке и фекалиях поросят, п=10.

На рис. 5 представлена динамика антител в сыворотке крови и фекалиях поросят, которая свидетельствует об иммунологической эффективности испытанной схемы вакцинации. Об эпизоотической эффективности этой схемы свидетельствуют хозяйственные результаты данного опыта.

Из группы № 1 на откорм было передано 263 подсвинка, сохранность в ней составила 93,3%. Из группы № 2 - 238 подсвинков, сохранность - 83,5%.

Средняя живая масса одного поросенка при отъеме от свиноматок в опытной группе была 8,32 кг, в контрольной группе - 8,20 кг, при передаче на откорм - 31,6 и 30,2 кг соответственно. Таким образом, испытанная схема иммунизации позволила повысить сохранность поросят на 9,8 % и увеличить среднюю живую массу при передаче на откорм на 1,4 кг в сравнении с не привитым против сальмонеллеза контролем.

3. ВЫВОДЫ

1. Лизат-антигены из штаммов S.choleraesuis № 370 и S.typhimurium № 415 менее реактогенны по сравнению с корпускулярными антигенами (в 3,66,1 раза в зависимости от метода аппликации) при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном способах введения белым мышам, что обеспечивает возможность иммунизации животных в более высоких дозах. Корпускулярные и лизированные антигены наименее реактогенны при пероральном способе введения.

2. Лизат-антигены сальмонелл, перорально введенные кроликам, выявляются в крови и фекалиях животных через 12 часов. Максимальные тиры 0-антигена при 3-дневном цикле иммунизации выявляются на 3-5-е сутки, их величина имеет дозозависимый характер. Разделение дробной иммунизации на циклы не целесообразно, поскольку повторные циклы иммунизации проводятся на фоне развивающегося иммунного ответа.

3. Пероральная иммунизация мышей, предусматривающая введение антигена в течение 5-10-ти дней подряд обеспечивает длительное антигенное воздействие на иммунокомпетентные органы, что позволяет отказаться от использования протективных веществ без ущерба для интенсивности и длительности иммунного ответа, при этом уровни копроантител в 2-3 раза превышают уровни сывороточных антител.

4. Установлено, что местный иммунный ответ более выражен при перо-ральной иммунизации, чем при подкожной так как увеличивается уровень секреторных антител в кишечнике на 7-е сутки (IgA 12 log2, контроль -10 log2, IgM 4 log2, контроль - 2 log2,) и IgG на 21-е сутки (13 log2, контроль - 9 log2).

5. Пероральная иммунизация мышей лизат-антигенами сальмонелл в опыте прямого заражения повышает величину LD50 с 2,6x102 микр. кл./гол. (интактный контроль) до 1,1х105 микр. кл./гол., что свидетельствует о выраженной иммуногенности и эффективности предлагаемой схемы иммунизации. Пероральная иммунизация на фоне пробиотического препарата Лактобифадол

позволяет повысить устойчивость животных к заражению вирулентной культурой сальмонелл (1Л35о = 1,8х105).

6. Лизат-антигены сальмонелл в дозах, эквивалентных 200, 400 и 600 млрд.микр. кл. корпускулярного антигена на животное в сутки, безвредны для поросят с 20-дневного возраста и при 10-кратном пероральном введении обеспечивают синтез специфических антител и активацию клеточного звена иммунитета. Оптимальной является суточная доза лизат-антигена, эквивалентная 600 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена.

7. Пероральная иммунизация поросят испытуемыми антигенами на фоне пробиотического препарата Лактобифадол позволяет повысить титры сывороточных и копроантител, увеличить однородность иммунного ответа у поросят и увеличить среднесуточные привесы на 73,3-91,1% по сравнению с контролем и на 33,3-57,8% по сравнению с группами без применения пробиотика.

8. Экспериментально обоснована возможность пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя. В условиях неблагополучного по сальмонеллезу хозяйства пероральная иммунизация лизат-антигенами сальмонелл позволила повысить сохранность поросят в сравнении с внутримышечным использованием этих антигенов на 6%, в сравнении с не вакцинированным контролем - на 11,1%, а живую массу поросят к моменту передачи их на откорм на 1,4 и 1,0 кг соответственно.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для разработки средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней предлагается использовать антигены возбудителя, получаемые путем лизиса бактериальных клеток гидроксиламином солянокислым. Лизат-антигены способны обеспечить эффективный и безопасный с эпизоотической точки зрения, технологичный в использовании метод групповой пероральной иммунизации, в результате которого у привитых животных формируется как системный, так и местный иммунитет. Предлагаемый метод может быть использован как самостоятельно, так и в сочетании с пробиотиком

®

Лактобифадол , что обеспечивает дополнительный неспецифический профилактический эффект.

Методические наставления «Разработка метода и оценка эффективности пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя» могут быть использованы для разработки средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней перорального применения.

Методические рекомендации «Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенные для оральной иммунизации животных» используются в учебном процессе при подготовке ветеринарно-санитарных врачей (МГУПБ).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенных для оральной иммунизации животных / Д.И. Скородумов, Д.В. Беликов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин // Методические рекомендации - М.: МГУПБ, 2008.

2. Субботин В.В., Сидоров М.А., Лощинин М.Н. К вопросу о возможности энте-ральной иммунизации свиней против сальмонеллеза инактивированными препаратами // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр. -М.: ВИЭВ.- 2006.- С.139-141.

3. Влияние протективных веществ и иммунного статуса лабораторных животных на динамику прохождения сальмонеллёзных антигенов по желудочно-кишечному тракту /Д.В. Беликов, Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин, Л.В. Анисимова, Л.Б. Соловьёв, ЛА. Коротеева // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: материалы международной научно-практической конференции.- Щёлково: ВНИТИБП, 2007.-С.229-233.

4. Влияние агар-агара, пектина и предшествующей оральной иммунизации на динамику движения орально введенных антигенов сальмонелл по желудочно-кишечному тракту животных / Д.В. Беликов, Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин, Е.Э Школьников, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева // Журнал «Ветеринария и кормление».- 2008.-Ш.-С. 6-7.

5. Лощинин М.Н., Субботин В.В. Антительный ответ у мышей при пероральной иммунизации против сальмонеллёза //«Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчёл»: материалы международной научно-практической конференции. - М.: Труды ВИЭВ, 2009.-Т.75.- С. 437-441.

6. Субботин В.В., Лощинин М.Н. Динамика гуморальных и секреторных антител у поросят, иммунизированных перорально против сальмонеллёза // Журнал «Ветеринария и кормление». - 2009.- №5.- С. 4-5.

7. Лощинин М.Н., Субботин В.В., Ездакова И.Ю. Антителогенез при пероральной иммунизации мышей против сальмонеллёза // «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства»: материалы всероссийской научно-практической конференции.- Новочеркасск, 2010.-С.56-59.

8. Изотопическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мыши в процессе поствакцинального иммунного ответа / И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева, В.В.Субботин, М.Н.Лощинин, Д.В.Рукавицын /. - М.: Труды ВИЭВ, 2010.-Т.76.-С.34-38,

9. Ездакова И.Ю., Субботин В.В., Лощинин М.Н. Количественная характеристика Т-, В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа. - М.: Труды ВИЭВ, 2010,-Т.76.- С.29-33.

10. Лощинин М.Н. Клеточный иммунный ответ у мышей при пероральной и подкожной вакцинации лизат-антигенами сальмонелл // Журнал «Ветеринария и кормление». - 2011. - №2. - С. 46-47.

11. Лощинин М.Н., Субботин В.В. Эффективность пероральной иммунизации свиней против сальмонеллёза лизат-антигенами возбудителя // Ветеринарная медицина. - 2011.- №1.- С. 34-36.

12. Лощинин М.Н. Динамика показателей иммунокомпетентных клеток мышей линии ВАЬВ/с при пероральной и подкожной иммунизации лизат- антигеном БдурЫтипит и Б.сЬокгаезшв II «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и др. возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчёл» - М.: ВИЭВ, 2011. - Т. 77. - С. 254-256.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 21.03.2012 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Лощинин, Максим Николаевич, Москва

61 12-16/91

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

ЛОЩИНИН МАКСИМ НИКОЛАЕВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА СВИНЕЙ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Субботин В.В.

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ................................................................................4

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................10

2.1. Сальмонеллёзы животных и их значение для животноводства и ветеринарии на современном этапе....................................................10

2.2. Биология и экология сальмонелл..................................................12

2.3. Патогенез сальмонеллезной инфекции..........................................18

2.4. Постинфекционный и поствакцинальный иммунитет при сальмонеллезе..............................................................................22

2.5. Вакцинопрофилактика при сальмонеллезе животных и возможности ее совершенствования........................................................................28

2.5.1. Современные средства и методы для вакцинопрофилактики сальмонеллеза млекопитающих животных и птицы................................28

2.5.2. Теоретические и практические аспекты перорального метода

иммунизации...............................................................................34

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46

3.1 Материалы и методы..................................................................46

3.2 Результаты собственных исследований..........................................53

3.2.1 Основные биологические свойства штаммов сальмонелл..................53

3.2.2 Реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым беспородным мышам.............................................57

3.2.3. Определение оптимальной схемы пероральной иммунизации лизат-антигенами сальмонелл в опытах на лабораторных животных..................61

3.2.3.1. Динамика титров лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации кроликов...................................................................61

3.2.3.2. Динамика титров антител к О-антигенам сальмонелл у кроликов, иммунизированных перорально лизат-антигенами сальмонелл.................65

3.2.3.3. Изучение параметров клеточного иммунитета кроликов после пероральной иммунизации лизат-антигеном сальмонелл.........................71

3.2.3.4. Антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл и определение оптимальной схемы при пероральной иммунизации мышей.....................76

3.2.4. Изогипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мыши в процессе иммунного ответа.......................80

3.2.5. Клеточный иммунный ответ у мышей при подкожной и пероральной иммунизации лизат-антигенами сальмонелл.........................................84

3.2.6. Изучение иммуногенности лизат-антигенов при пероральной иммунизации мышей в опыте прямого заражения.................................90

3.2.7. Антигенные и иммуногенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят...................................................92

3.2.8. Производственные испытания метода пероральной иммунизации свиней лизат-антигенами возбудителя................................................98

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 105

5. ВЫВОДЫ..............................................................................122

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 124

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125

8. ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................150

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Сальмонеллезы продуктивных млекопитающих животных и птицы являются не только значимой проблемой ветеринарии с экономической точки зрения, но и важной социальной проблемой, поскольку создают угрозу и нередко являются причиной массовых вспышек пищевых токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии у людей [Martel, 1994; Пухлякова,1994; Кононенко,1994; Бухарин, 2000; Кафтырева,2008]. Несмотря на значительное количество работ, посвященных вопросам борьбы и профилактики этой болезни, она все еще широко распространена в животноводческих хозяйствах и наносит отрасли существенный экономический ущерб. По данным ветеринарной отчетности последних лет (2003-2009 гг., ФГУ Центр ветеринарии) сальмонеллез в Российской Федерации неизменно входит в первую десятку в структуре инфекционной патологии крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птицы. В указанный период доля сальмонеллеза в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота составляла 2,3-3,8%, мелкого рогатого скота - 2,5-9,9%, свиней - 3,4-14,1%, птицы (сальмонеллез + тиф-пуллороз) - 1,4-2,02%.

Важнейшим элементом комплексной системы борьбы с сальмонеллезной инфекцией является вакцинация. С этой целью используют живые вакцины из аттенуированных штаммов возбудителя или инактивированные на основе цельноклеточных (корпускулярных) антигенов [Шустер, 1988; Заерко, 1995; Шевцов, 2006; Ленёв и др.,2007и др.]. Общепризнано, что живые вакцины более иммуногены по сравнению с инактивированными корпускулярными препаратами. Но многократные пассажи аттенуированных вакцинных штаммов на животных с вторичными иммунодефицитами ведут к их реверсии в исходное вирулентное состояние, что нередко заканчивается вспышками болезни на вакцинированном поголовье. Инактивированные вакцины не обладают достаточной иммуногенностью [Сидорчук, 1989]. Увеличение прививочных доз данными

препаратами в большинстве случаев невозможно из-за их довольно высокой реактогенности, которую связывают с эндотоксином возбудителя [Першин, 1980; Сидоров и др., 1991; Сидоров и др., 1992; Воробьев, 1998, Солдатенко и др., 2009 и др.]

В настоящее время установлено, что лизис сальмонелл гидроксиламином с последующим осаждением растворимых антигенов клеток солями кальция позволяет снизить токсигенность при сохранении антигенности материала, получаемого таким способом. В.В.Кудрявцевым (1993) показано, что полученные подобным образом антигены при внутримышечной аппликации лабораторным животным (мыши, кролики) и поросятам обладают как антигенными, так и иммуногенными свойствами и перспективны для разработки средств специфической профилактики.

В крупных свиноводческих предприятиях животных приходится вакцинировать против целого ряда болезней бактериальной и вирусной этиологии. Это затратный и трудоемкий процесс, который можно было бы облегчить при условии использования групповых методов иммунизации, таких например, как аэрозольный или пероральный, нашедших широкое применение преимущественно в птицеводстве и, в меньшей степени, в других отраслях животноводства.

Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в изучении возможности перорального применения лизат-антигенов сальмонелл для создания специфического иммунитета к возбудителю болезни.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- изучить реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым беспородным мышам в сравнении с корпускулярными антигенами;

- изучить антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл, динамику сывороточных и копроантител у лабораторных животных при разных схемах их пероральной иммунизации;

- дать изотопическую характеристику иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии ВАЬВ/с в процессе поствакцинального иммунного ответа при пероральном и подкожном введении лизат-антигенов;

- отработать оптимальную схему пероральной иммунизации мышей лизат-антигенами сальмонелл и изучить иммуногенность этих антигенов в опыте прямого заражения;

- изучить безвредность и антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят и отработать оптимальную схему их пероральной иммунизации;

- изучить эффективность разработанного метода иммунизации в условиях неблагополучного по сальмонеллезу свиноводческого хозяйства.

Научная новизна исследований. Впервые в ветеринарной практике экспериментально обоснована возможность пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза с использованием лизатов клеток возбудителя.

Охарактеризованы реактогенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при их внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении. Установлено, что в зависимости от способа введения они менее реактогенны в сравнении с корпускулярными в 3,6-6,1 раза. Реактогенность лизат-антигенов наименее выражена при их пероральном введении, максимально -при внутрибрюшинном.

Установлена динамика гуморальных и копроантител к сальмонеллам при разных схемах пероральной иммунизации лабораторных животных (белые беспородные мыши, кролики).

Дана изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии ВАЬВ/с в процессе поствакцинального

иммунного ответа при пероральном введении лизат-антигенов сальмонелл в сравнении с их подкожным использованием.

Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации мышей, обеспечивающая выраженный иммунный ответ, защиту от заражения высоковирулентными сальмонеллами и позволяющая отказаться от использования защитных веществ совместно с лизат-антигенами.

Доказана безвредность лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации ими поросят и установлена динамика специфических сывороточных и копроантител при различных схемах пероральной иммунизации поросят. Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации поросят лизат-антигенами сальмонелл.

Практическая значимость исследований.

Результаты исследований позволяют рекомендовать метод лизиса сальмонелл гидроксиламином солянокислым для получения антигенов возбудителя, пригодных для групповой пероральной иммунизации поросят, которая обеспечивает формирование как местного мукозального, так и системного противосальмонеллезного иммунитета.

Разработаны в соавторстве:

методические рекомендации «Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенных для оральной иммунизации животных» (рассмотрены и одобрены Ученым советом ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ, протокол № 42 от 20.03.2008 г.);

методические наставления «Разработка метода и оценка эффективности пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя», одобренные секцией «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.) и утвержденные

академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым (03.10. 2011 г.).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко (Москва, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел» (Москва, 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства» (Новочеркасск, 2010 г.); Международной научной конференции «Производство, эффективность и качество» (Москва, 2011 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп с.х. животных, рыб и пчел» (Москва, 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

экспериментальные данные, характеризующие остаточную реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения лабораторным животным;

- схема пероральной иммунизации животных лизат-антигенами сальмонелл, обеспечивающая возможность отказа от защитных веществ;

- основные показатели иммунологической перестройки организма лабораторных животных в ответ на пероральное введение лизат-антигенов сальмонелл, обеспечивающие формирование местного мукозального и системного иммунитета к сальмонеллезу;

- схема пероральной иммунизации поросят против сальмонеллеза с использованием лизат-антигенов возбудителя.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в т.ч. 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.

Личный вклад соискателя. Основная часть исследований выполнена лично автором. Опыты по изучению вирулентности штаммов сальмонелл проведены совместно с д.в.н., проф. Д.И.Скородумовым и к.в.н. -Д.В.Беликовым (МГУПБ); глубинное культивирование штаммов сальмонелл для получения биомассы и последующего изготовления лизат-антигенов -совместно с к.в.н. Е.Э.Школьниковым, к.б.н. Л.В.Анисимовой и к.б.н. Л.А.Коротеевой (ГНУ ВНИТИБП); иммунологические исследования -совместно с к.б.н. И.Ю.Ездаковой (ГНУ ВИЭВ). Соискатель благодарит всех соавторов за помощь, оказанную при выполнении нашей работы.

Объем и структура диссертационной работы. Материалы диссертации изложены на 152 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 17 рисунками. Список литературы включает 252 источника, в том числе 166 отечественных и 86 зарубежных авторов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Сальмонеллёзы животных и их значение для животноводства и ветеринарии на современном этапе

Сальмонеллезы - группа бактериальных болезней, преимущественно молодняка сельскохозяйственных животных, в том числе и птиц, промысловых и мелких домашних животных.

У животных сальмонеллезы могут протекать в виде трех основных форм: первичные, вторичные и бактерионосительство.

Первичные сальмонеллезы при остром течении характеризуются лихорадкой, явлениями септицемии, токсикоза и поражением кишечника, а при хроническом - воспалением легких. У взрослых животных (кобыл, овец и реже у коров) могут наблюдаться аборты.

Вторичные сальмонеллезы осложняют течение основного заболевания (чума свиней, гемофилезный полисерозит свиней, пастереллез и др.), при этом характерные для сальмонеллеза признаки обычно выражены слабо или отсутствуют вовсе.

Бактерионосительство сальмонелл характеризуется тем, что животные, будучи внешне здоровыми, выделяют бактерии во внешнюю среду с фекалиями и мочой. У таких животных возбудителя обнаруживают главным образом в печени (в желчи, в слизистой желчного пузыря, в лимфатических узлах печени), в мезентериальных лимфатических узлах, в содержимом слепой кишки [Скородумов и др., 2005]. В числе прочего, длительное бактерионосительство обусловлено способностью сальмонелл переживать и размножаться внутри макрофагов, костном мозге [Зуев, Татарчук, 2007].

Несмотря на множество работ, посвященных проблеме сальмонеллеза, а так же на то, что разработан комплекс диагностических, лечебных и профилактических мероприятий при данной болезни, сальмонеллезы продуктивных животных постоянно регистрируются как за рубежом, так и в нашей стране. По данным ФГУ «Центр ветеринарии» в 2000 - 2010 гг.

количество ежегодно регистрируемых неблагополучных пунктов по сальмонеллезу крупного рогатого скота колебалось в пределах от 231 до 670, а по сальмонеллезу свиней - от 114 до 589. В последние годы данная патология постоянно входит в первую десятку инфекционных болезней птицы, крупного рогатого скота, свиней.

Экономический ущерб, причиняемый, сальмонеллёзами складывается из убытков от падежа молодняка, отставания в росте и развитии переболевших животных, абортов, а также расходов, связанных с организацией профилактических и лечебных мероприятий. А.М.Рахманов, Н.А.Ярёменко [2003] сообщают, что за период с 1997 по 2001 гг. средняя летальность при инфекционных болезнях свиней составляла 28,5%, а при сальмонеллёзе была выше средней и составила 31,7% . По данным официальной статистики заболеваемость сальмонеллезом крупного рогатого скота в 2006-2009 гг. составляла ежегодно от 1874 до 2404 голов, а летальность от числа заболевших - от 30,8% до 32,9%. Аналогичные показатели за тот же период в свиноводстве составили от 4987 до 15024 голов и от 33,6% до 80,9%. Ежегодно вакцинации против сальмонеллеза в те же сроки подвергалось 4875,-5663,3 тыс. голов крупного рогатого скота и 9976,3-11332,9 тыс. голов свиней (ФГУ «Центр ветеринарии»). По данным Э.П.Каревой и др. [2003] в неблагополучных по сальмонеллезу хозяйствах инфицирование новорожденных поросят сальмонеллами составляет 19%, 2-3-х недельных сосунов - 42,2%, отъёмышей - 66,3%, поросят на доращивании - 48%. До 25% переболевших поросят остаются бактерионосителями, а у свиноматок сальмонеллоносительство регистрируют в 22-46% случаев.

Сальмонеллезы постоянно находятся в центре внимания мировой общественности, так как являются зо�