Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЭМУЛЬСИОННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЭМУЛЬСИОННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ"



На правах рукописи Для служебного пользования №42 дсп от 15 июля 2003 г. экэ Ыа

ПРУНТОВА Ольга Владиславовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЭМУЛЬСИОННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ПАСТЕ РЕЛ ЛЕЗ А СВИНЕЙ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Покров-2003

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник РУСАЯЕЕВ Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник КУШНИР Анатолий Тимофеевич доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ПИРОЖКОВ Михаил Константинович доктор биологических наук, профессор ПЕРЕВОЗЧИКОВ А Наталья Александровна

Ведущая организация:

ФГУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Защита диссертации состоится «1?» декабря 2003 года в часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 а Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарно л вирусологии и микробиологии Россе льхоэакаде м и и по адресу: 601120, г. Покрое Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « »* г.

Ученый секретарь диссертационного совета, -

В. Я. Саеукова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

( 1.1. Актуальность темы. Одной из важнейших ветеринарных проблем являются бактериальные болезни молодняка сельскохозяйственных животных с дизрейным и респираторным синдромом, на долю которых лриходися 75% от всех заболеваний, вызываемых не облигатно-патогенными микроорганизмами, среди которых ведущая роль принадлежит сальмонеллам и пастереллам. Проблема сальмонеллезов и пастереллёэов актуальна также и для медицины, о чем свидетельствуют результаты исследований, проведённых в больницах различных стран мира (Carter G„ 1967; А. А, Конолаткин, 1983; 8. А, Прискока и др.. 1990; Ю.Е. Полоцкий и др., 1992; И. М. Гараев, 1996; C.Wray et at., 2000). Экономический ущерб, наносимый животноводству сальмонеллезами и пастерелл&зами складывается из высокого отхода молодняка, снижения привесов и затрат на 'проведение оздоровительных и лечебных мероприятий (Р. В. Душук. 1982; Biberstein Е. L., 1990; И. А. Бакулое и др., 1994; Ю. Г. Степаншин и-др., 1997; A.M. Рахманов, Н.А. Яременко, 2003).

Как показывает мировой опыт вакцинация во многих случаях является одним из основных средств борьбы с инфекционными болезнями животных.

В настоящее время в арсенале иммунопрофилактики находится целый ряд вакцинных препаратов, которые различаются по составу, технологии производства, по способу применения и эффективности. Большинство из них обладает несомненными достоинствами, но и не лишены недостатков.

Эффективность инактиаированных вакцин зависит от количества и'качества антигена, природы и свойств адьюаанта, от технологии изготовления препарата и способа его применения. Их используют при целом ряде инфекционных болезней.

Важным моментом в технологии изготовления инактивированных вакцин является инактивация микробных клеток. Для инактивации культуры микроорганизмов обычно используют формалин. Однако установлено, что формалин модифицирует аминокислоты, ускоряет плавление,белков, вызывает сшивки белковых субъединиц и в результате ото го может снижать антигенную и иммуногенную активность бактериальных антигенов. В связи с этим необходим поиск новых инактиеантов, которые бы специфически инактивировали нуклеиновую кислоту, не оказывал влияния на лротективные антигены.

Одним из подходов к решению этого вопроса может быть использование азиридиноа. Их инактивирующее действие обусловлено депуринизэцмей и последующей деполимеризацией нуклеиновых кислот, микроорганизмов. Однако данные по инактивации бактерий азиридинами скудны, |Ггорой nE3ffipg82Jiy£w- '

Большинство moho- и ассоциированных вакцин против ластереллёэа и сальмонеллбэа свиней, используемых в нашей стране, выпускают в виде инактивированных формалином сорбированных и эмульсионных препаратов. Основными недостатками сорбированных вакцин являются: 1} необходимость многократных инъекций препарата:

2) относительно большие дозы вакцин;

3) они аффективны для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота, но у свиней не создают напряженного продолжительного иммунитета.

Применяемые в настоящее время эмульсионные вакцины превосходят по иммуногенности сорбированные, однако основным препятствием их широкого использования являются:

1) высокая вязкость, затрудняющая введение при массовых обработках животных;

2) высокая реактогенность, которая часто приводит к образованию в месте введения стерильных абсцессов.

Поэтому постановка вопроса о создании новых инактивированных эмульсионных вакцин, в частности, против сальмонелл&за и пастереллёэа свиней является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка технологии производства высокой ммуногенных инактивированных противосапьмонеллезных и противоластереллезных вакцин в виде моно- и ассоциированных препаратов, приготовленных по стандартной технологии с использованием д и мера этиленимина (Ы-(р-аминоэтил)этиленимин) (ДОИ) в качестве инактиванта микробных культур, -

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

• разработать режим инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ;

• подобрать маслянный адью вант для изготовления вакцин, обладающий умеренной peaктогенкостью и оптимальной вязкостью;

• разработать:

технологию производства и контроля инактивированной эмульсионной вакцины против сзльмонеллеэа свиней, технологию производства и контроля инактивированной эмульсионной вакцины против пэстереллеэа свиней, технологию производства и контроля ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза и * * ■ • сальмонеллеза свиней,

тест-системы на основе ИФА для выделения пропгвосапьмонеппезных и

противопаетереллезных антител. »

1.3, Научная новизна работы. Новизна исследований состоит в том, что в результате проведенных исследований:

впервые разработан метод инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ; разработаны: технология производства вакцины против сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной, технология производства вакцины - против пзстереллеэа свиней инактивированной эмульсионной, технология производства вакцины ассоциированной протиа пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной;

впервые разработаны и испытаны иммуноферментные тест-системы с использованием отечественных компонентов " и реактивов для выявления противосальмонеллеэных и противопаетереллезных антител в сыворотках крови свиней.

Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение: №2162340 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней» 2001 г.; №2162339 «Способ изготовления эмульсионной лротивопастереллеэной вакцины» 2001 г.; №2173560 «Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционых болезней бактериальной этнологии животных и птиц» 2001 г.

1.4. Практическая значимость работы. Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю инактивироаанных вакцин прошв сальмонеллеза и пастереллеза свиней, а также в нормативные документы по изготовлению и контролю иммуноферментных тест-систем для выявления антител к бактериям Salmonella enteríca subsp. enterica и Pasteurella multocida в сыворотках крови свиней, утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ:

1. «Вакцина против сальмонеллеза свиней инактивнрованная эмульсионная» ТУ 9304-093-00495527-02;

2. «Вакцина против пастереллеза свиней инактивнрованная эмульсионная» ТУ 9384-094-00495527-02;

3. «Вакцина ассоциированная против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактавированная эмульсионная» ТУ 9384-065-00495527-01;

4. «Набор ИФА для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subsp. enterica в сыворотках крови свиней» ТУ 9388-001-00495527-2002;

5.-' «Набор ИФА для выявления антител к бактериям Раз1еиге1!а тиИос^а в сыворотках крови свиней» ТУ 9388-002-00495527-2002.

Технология производства разработанных вакцин осуществлена в промышленном масштабе на базе ВНИИЗЖ. В течение с 1996 по 2002 г.г. было произведено: 7 серий вакцины против сальмонеллеза свиней инактиви ров энной эмульсионной (всего 4 075 132 доз), 3 серии вакцины против пастереллеза свиней инаетивированной эмульсионной (1 281 000 доз), 7 серий вакцины ассоциированной против пастереллёза И сальмонеллёза свиней инактивированной эмульсионной (1 368 000 доз). Эти вакцины с положительными результатами применяли в различных регионах РФ,

1.5. Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» ВНИИЗЖ, Владимир, 1995; Конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных» ВНИИЗЖ, Владимир. 27-31 октября 1997; Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ. «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных» - Покров, 1998; Международной научно-производственной конференции «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных», г. Воронеж, 19-21 мая 1999 г.; Конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ. «Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ», Вол ьги некий, 1999; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных», Минск, 2000; Международной научно-практичеехой конференции 'Борьба с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных", Покров, 1516 августа 2000; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биопогических препаратов», Щелково, 8-9 июня 2000; Научной конференции "Достижения молодых учёных - в ветеринарную практику*, Владимир, 2000 ; Конференции ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. Москва, 2001; 5-го зЧзду паразитоценолопв УкраЫи «Пробл, зооЫжен. вет, мед.», Харькив, 2001; Науково-пракг.конф, «СучасИ вет.та, технол.аспекти свинарства», Киев, 2002; Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Щелково, 2002 г; на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1991-2002 гг.

1.6. Публикации, По материалам диссертации опубликовано 43 научные работу в том числе 3 патента РФ на изобретения, утверждено в уста нов леном порядке 5 комплектов НД на разработанные вакцинные препараты и наборы для иммуноферментного анализа.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ инактивации сальмонелл и пастерелл ДОИ,

2. Технология производства и контроля вакцины инактиаированной эмульсионной против сальмонеллеза свиней.

3. Технология производства и контроля вакцины инактивированной эмульсионной против пастереллеза свиней.

4. Технология производства и контроля вакцины ассоциированной ина ктив и ро ванной эмульсионной против пастереллеза и сальмонеллеза свиней.

5. Набор ИФА для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subspecies enterica в сыворотках крови свиней.

6. Набор ИФА для выявления антител к бактериям Pasteurella multocida в сыворотках кроеи свиней.

1.8. Личный вклад соискателя.

Отработка режима инактивации сальмонелл и пастерелл, оценка антигенных и иммуногенных свойств разработанных вакцин и их производственные испытания выполнены совместно с сотрудниками лабораторий ВНИИЗЖ: лаборатории микробиологии, лаборатории молекулярной биологии и лаборатории малоизученных инфекций. Остальные исследования выполнены автором самостоятельно. '

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список литературы включает 467 источников, в том числе 219 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 57 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы

Штаммы бактерий: Pasteurella multocida Серовар А №115, Pasteurella multocida се ров ар А №1231, Pasteurella multocida серовар В №656, Pasteurella multocida серовар D №9, Salmonella choleraesuis N»370 и Salmonella typhimun'um

№371, Salmonella dublin №373, Salmonella enteritidis №7, S. anatum №295, S, lunby №350, S. theilalae №336, E. coli №320, полученные из коллекции ВГНКИ.

Инактиваты и инактивация: водный раствор д и мера этиленимина (ДО И) с содержанием активного вещества не мене© 15% фирмы *Фарма*-130 ( г.Покров) и формалин технический с содержанием формальдегида не менее 36% (ГОСТ - 162561). Количество ДОИ, которое необходимое для инактивации, рассчитывали, исходя из объема бактериальной суспензии, а также процентного содержания основного активного вещества в водном растворе инактиванта. Предварительно pH ДЭИ доводили 5М раствором уксусной кислоты до 7,2-8,0, Формалин использовали с учетом объема суспензии подлежащей инактивации. Инактивацию бактерий проводили при 26°С, 37°С и постоянном перемешиваниии и определяли концентрацию инактиванта (К50), обеспечивавшую гибель 50% клеток популяции, константу скорости инактивации (К) и время необходимое для инактивации до выбранного уровня оставшихся живых микробных клеток.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по общепринятой методике. Измерение адсорбции исследуемых проб проводили при длине волны 492 им на многоканальном спектрофотометре («Униплан», г. Москва).

Электронно-микроскопический анализ нативных и инактивиро ванных бактерий проводили на электронном микроскопе JEM-100В при увеличении 16000 раз. Предварительно бактерии очищали трехкратным центрифугированием (3000 об/мин 30 минут) и ресуспендированием в ФБР. Контрастирование препаратов проводили 4% ФВК pH 6,8, Электронная микроскопия выполнена доктором биологических наук, старшим научным сотрудником лаборатории малоизученных болезней А.П. Пономаревым.

Опытные образцы вакцин были изготовлены с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 фирмы * SEPPIC" и масляного адъюванта ВНИИЗЖ. Адъюванты смешивали с антигенами в соотношении 30% антигена и 70% адъюванта, эмульгировали на коллоидной мельнице. Полученные опытные образцы вакцин представляли собой эмульсию белого цвета, слегка вязкой консистенции.

Определение реактогенности масляных адъювантов проводили на лабораторных животных. Морским свинкам и кроликам вводили стерильные адьюванты внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозах 0,5 и 1,0 см3 соответственно. Спустя две недели животных убивали, вскрывали и учитывали макроскопические изменения в месте введения. Каждый адьювант испытывали на 5 животных. Белым мышам препараты вводили по методу Гарцета в модификации Е. В. Гусевой и А. И. Дудникова (1086),

Определение вязкости* Вязкость препаратов определяли при температуре ракцины 20°С капиллярным вискозиметром типа ВПЖ-2. Время истечения вакцины от первого до второго мениска измеряли с точностью 0,2 с. Кинематическую вязкость определяли по формуле: В = С х Г; где В - кинематическая вязкость, мм7/с; С - постоянная вискозиметра; Г - средняя арифметическая времени истечения вакцины, с.

Определение иммуногенности вакцин. ' Иммуногенную активность экспериментальных серий вакцин против сальмонеллеэа инактивированных ДЭИ и формалином определяли посредством контрольного заражения морских свинок. Вакцины разводили в плацебо (1 часть фосфатно-буферного раствора, 2 части адъюаанта) с трехкратным шагом и вводили животным внутримышечно в бедро в объеме 0,2 см3, используя по 4 морские свинки на разведение. Через 21 сутки после иммунизации всех вакцинированных и контрольных (не иммунизированных) животных заражали вирулентным штаммом S. "choleraesuis №370 подкожно в области живота в дозе 6 млрд.м.к. на животное. Результаты учитывали через 10 суток после гибели 50% контрольных животных и оценивали ло количеству выживших животных. ИмДи определяли по формуле: 1дИмД^МС=1дди-1дК{1 -0,5); где Дм - максимальная из опытных доз, Z - сумма значений, представляющих ссбой отношение числа не заболевших морских свинок к числу животных, взятых на каждую дозу вакцины, К- кратность разведения вакцины.

Иммуногенную активность экспериментальных серий вакцин f против пастереллеза, инактивированных ДЭИ и формалином, определяли по валентности P.multocida серотипа А на 50 белых мышах массой 18-20 граммов. Вакцины разводили в плацебо с трехкратным шагом и вводили белым мышам подкожно в область спины в дозе 0,1 см1, используя по 4 животных на разведение. Группа контрольных животных состояла из 10 мышей, которым вводили плацебо в таком же объеме как указано выше. Через 21 сутки после иммунизации всех вакцинированных и контрольных животных заражали вирулентным штаммом Р. multocida №115 подкожно в область спины в дозе4,0±1,0 LDso. Результаты учитывали через 10 суток после гибели не менее 80% контрольных животных и оценивали по количеству выживших мышей. ИмД» определяли по формуле, представленной выше при описании определения ИадДяэ на морских свинках.

Определение эффективности вакцин. Оценку противоэпизоотической эффективности вакцин проводили в условиях нескольких крупных свиноводческих хозяйств, неблагополучных по данным инфекциям. Для этого проводили анализ

«

эпизоотической ситуации до и после применения вакцины. Результаты отражались в актах эпизоотологических обследований хозяйств.

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки экспериментальных данных были использованы методы, описанные И. П. Ашмзрмным, А. А. Воробьёвым (1962), Н, А. Плохи неким (1970), Н, Бей л и (1962).

2.2, РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка технологии получения бактериальной массы. Получение достаточного количества бактериальной массы со стабильными иммунобиологическими свойствами требует знания основных параметров культивирования микроорганизмов. 6 связи с этим первым этапом наших исследований было изучение биологических свойств и кинетических закономерностей роста при глубинном периодическом культивировании различных сероваров сальмонелл и пастерелл.

Определение параметров роста сальмонелл при глубинном культивировании. Целью данного раздела была отработка метода получения качественной стандартной бактериальной массы, то есть получение суспензии бактериальных клеток начала стационарной фазы роста.

Для этого необходимо было определить скорость роста бактерий каждого штамма и точно расчитать время выхода в стационарную фазу роста.

Глубинное периодическое культивирование бактерий 3. сЬо1егае5шз штамм №370, Э. 1урЫтипит штамм №371, 5. йиЬНп штамм №373 , З.егПепМз штамм №7 проводили в аппаратах АК-210 с принудительной аэрацией и перемешиванием в среде на основе перевара по Хоттингеру. Отбор проб в процессе культивирования осуществляли каждые 60 минут и определяли концентрацию микробных клеток путем высева на МПА в чашках Петри. Концентрацию микробов определяли в колон ие образующих единицах (КОЕ/см3). Опыты проводили в трехкратной повтори ости.

Полученные данные показали, что лаг-фаза у всех штаммов бактерий была различной ло продолжительности, несмотря на одинаковые "условия культивирования. Продолжительность лаг-фазы роста бактерий 3. 1урЫтиг(ит штамм №371 была самой короткой и составила 0.3 ч„ Э. сМегаезшз штамм №370 -0.6 ч, 3.етепМ1э штамм №7 - 1.0 ч, 3. <1иЫт штамм №373 - 1.2 ч.

Продолжительность экспоненциальной фазы роста микробных клеток была одинаковой у 5. сЬо1егоезш5 штамм №370, Э. 1урЫтиПит штамм №371 и 5.еп1епИсЛз

штамм №7 - 4 часа. В течение этой фазы роста концентрация Э. сМегаезмз штамм На370 увеличилась с 8,74 1д КОЕ/см1 до 10,2 1д КОЕ/см3. В стационарную фазу прирост микробов прекратился. Максимальное накопление живых бактерий 8. сМегаеэшз штамм N8370 за 7 часов культивирования составило 10,61д КОЕ/см3 или 40,0 млрд. микр.кл./ см3. За период экспоненциальной фазы роста концентрация живых бактерий Э, гурЫтипит штамм №371 выросла с 8,8 1д КОЕ/см1 до 10,4 1д КОЕ/см\ Максимальное накопление живых бактерий 5.'1урЫтигшт №371 за 7 часов периодического глубинного культивирования составило 10,71д КОЕ/см1 или 50,0 млрд.м.клУем3, что немного превосходит аналогичный показатель полученный для Б. сЬо1егае5шз штамм №370. Концентрация живых клеток З.еп(егк|'с113 штамм №7 в течение экспоненциальной фазы увеличилась с 8.791д КОЕ/см3 до 10.49 1д КОЕ/см3, а максимальное накопление бактерий за 7 часов культивирования составило 10.64 1д КОЕ/см' или 44 млрд м.к./см3. Экспоненциальная фаза роста Э. сШЫт штамм №373 составила б часов, тогда как у сальмонелл других серотипов - 4 часа, и завершилась стационарной фазой. Накопление живых бактерий за 9 часов периодического глубинного культивирования Было 10,65 1д КОЕ/см1 или 45 млрд. м.к./см1. Полученные результаты позволяют заключить, что кинетика роста исследуемых штаммов сальмонелл была характерной и имела лаг-фазу, фазу экспоненциального (логарифмического) роста и стационарную фазу. Но продолжительность этих периодов у испытанных серовариантов езльмонелл была различной.

г

Стационарная фаза у всех штаммов начиналась в разное время: через 6-9

часов и характеризовалась наибольшим количеством жизнеспособных клеток.

Наиболее важны для получения качественной стандартной биомассы три

количественные характеристики процесса размножения: продолжительность лаг-

фазы, скорость размножения в экспоненциальной фазе и урожай клеток, то есть

максимальная масса или максимальное число клеток находящихся в культуре во

время стационарной фазы (Д. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967; Е.А. Рубан, 1995).

Удельную скорость роста бактерий рассчитали по формуле на основании

полученных зависимостей логарифмов числа живых клеток от времени размножения

в экспоненциальной фазе исследованных серовариантов сальмонелл:

ц = 1п(№Но); ^ (1) где:

N0 - число клеток в нулевой точке отсчета времени, N - число клеток во время 1, 1 - время экспоненциального роста, ц - удельная скорость роста.

Удельная скорость роста бактерий S. choleraesuis штамм №370 составила 0,84 ч"1, S. typhimurium штамм №371 - 0,92 ч'\ S.enteritidis штамм №7 - 1.18 ч"\ S. dublin шггамм №373 -1,23 ч'1.

Время необходимое для того, чтобы число микробов увеличилось вдвое, является не менее важной характеристикой исследованных популяций. Этот показатель расчитывали с учетом удельной скорости роста микробов по формуле:

G=0,693/jí, (2) где:

0,693 • значение натурального логарифма числа 2,

д - удельная скорость роста микробной популяции,

G — время генерации или удвоения биомассы.

Самое короткое время генерации было у S. dublin штамм 373 - 0,56 ч, а самое продолжительное у S.choleraesuis штамм №370 — 0,82 ч.

Время генерации составило для S. typhimurium штамм №371 - 0,75 ч, для S.enteritidis штамм №7 — 0.587ч.

Полученные эксп ери мента льные данные позволяют заключить, что динамика роста сальмонелл в процессе суспензионного культивирования и время их генерации различаются между собой и дают возможность выбрать оптимальный режим культивирования для каждого штамма в отдельности.

Определение оптимальных параметров для роста пастерелл при глубинном культивировании. Задачей этого этапа исследование было изучение кинетики роста культуры пастерелл четырех Серова ров в оптимизированных условиях для определения времени окончания экспоненциальной фазы роста и перехода культуры в стационарную фазу.

Продолжительность лаг-фазы роста бактерий Р. multocida штамм №115 и Р. multocida штамм №1231 составила 0,8 часа. Лаг-фаза роста бактерий Р. muitocida штамм №656 была короче. Продопжительность ее составила 0,3 часа. Продолжительность лаг-фазы роста бактерий Р. multocida штамм №9 превышала данные полученные для Р. multocida штамм №115, Р. multocida штамм №1231 и Р. multocida штамм №656, этот период длился 1,8 часа.

Экспоненциальная фаза при росте бактерий Р.multocida штамм №115 и Р. multocida штамм №1231 длилась 3 и 3,1 часа соответственно. Концентрация бактерий P.multocida штамм №115 возрасла за этот период времени с 8,8 Ig КОЕ/см3 до 10,3 Ig КОЕ/см3. В стационарной фазе максимальное накопление живых клеток P.multocida штамм №115 составило 10,4 Ig КОЕ/см3, Р, multocida штамм №1231 -

10,4 lg КОЕ/см, P, multocida штамм №656 - 9,6 lg КОЕ/ см1 и Р. multocida штамм №9 составило 10,4 lg КОЕ/см3 или 25 млрд m.kícm5.

Удельная скорость роста бактерий Р. multocida штамм №115 составила 1,15 ч* \ Р. multocida штамм №1231 - 1,16 ч"1, Р. multocida штамм №656 - 1,02 ч"1, Р. multocida штамм №9 - 0,93 ч . С учетом удельных скоростей роста популяций пастерелл расчитали время необходимое для удвоения этих микробов по формуле (2). Получили, что для Р. multocida штамм №115 этот показатель составил 0,60 часа, для Р. multocida штамм №1231 - 0,61 часа, для Р. multocida штамм №656 - 0,68 часа, а для Р. multocida штамм №9 - 0,75 часа.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о незначительных различиях в динамике роста различных сероваров пастерелл. Но, учитывая то, что периодические культуры пастерелл находятся в неустойчивом состоянии и в случае даже незначительного временного нарушения режима культивирования (температуры, перемешивания, рН, воздухообмена) могут изменять свою физиологическую активность, вплоть до полного прекращения роста, что ведет к снижению качества и количества бактериальной массы, полученные экспериментальные данные необходимо учитывать при выборе режима культивирования для конкретного серовара пастерелл.

2.2.2. Разработка режима инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ.

Димер этиленимин (ДЭИ) широко применяют при инактивации ряда вирусов, есть сообщения об его использовании для инактивации как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Поэтому предварительно определили активность ДЭИ в сравнении с формалином при инактивации некоторых сероваров сальмонелл и пастерелл. Первоначально были установлены концентрации инакгивантов, обеспечивающих 50% инактивацию бактериальных клеток, по методу, предложенному Н.А. Улуповым и А.И. Дудниковым (1983). Полученные данные показали, что исследуемые инактиванты различаются по ииактивирующей активности в отношении бактерий S. choleraesuis штамм №370 и Р. multocida штамм №115. ДЭИ в концентрации 1,4% вызывал инактивацию 50% микробных клеток в популяции сальмонелл за 3 часа, тогда как формалин инактивировал такое же количество бактерий за то же время, но в концентрации 0,18%. Определение Кы позволило не только сравнить активность инакгивантов, но и явилось основанием для разработки режима инактивации сальмонелл ДЭИ. Инактивация Р. multocida штамм №115 происходила при концентрации ДЭИ не ниже 0,25%, Оормалин вызывал инактивацию микробов при концентрации 0,0625% в течение 1-3 часов. То

есть исследуемые инлктиванты различались по инактивирующей активности р

отношении ласт ере л л и сальмонелл.

Определение оптимальней концентрации инактиванта. Суспензии

бактерий S. choie га es uis штамм №370 «на кг и в провали ДЭИ в конечных

концентрациях 0,5%, 1%, 2% и 3îs активного вещества при температуре 37°С для

определения концентрации ДЭИ, вызывающей гибель микроорганизмов за

минимальный промежуток времени. Концентрацию жизнеспособных клеток на

разных стадиях инактивации определяли методом высева на МПА.

Анализ данных литературы показал, что ДЭИ относится к супермутагенам

группы злкилирующих агентов, малые дозы которых индуцируют морфологические

мутации, не влияющие на жизнеспособность клеток (Ю.Э, Борташевич, 1Э60; Н,П.

Блинов, 1989). ДЭИ в количество 1% и ниже вызывал инактивацию лишь части

микробной популяции S. choieraesuis №370, при увеличении концентрации ДЭИ до

3% и выше летальный эффект от воздействия инактиванта возрос. Поэтому мы

остановили свой выбор на концентрации 3% активного вещества ДЭИ в

бактериальной суспензии. Увеличение концентрации инактиаанта до 3% активного

вещества сократило время инактивации микробов S. choieraesuis 370 почти в 2 раза.

Дальнейшую работу мы проводили с использованием ДЭИ в концентрации 3%

активного вещества.

Кинетика инактивации ДЭИ различных ce posa ров сальмонелл. В

экспериментах использовали суспензии бактерий S. choieraesuis штамм №370, S.

typhimurium штамм №371, S. dob lin штамм №373 и S.enteritidis штамм №7, которые

выращивали методом глубинного культивирования в аппаратах АК-210, в ростовой

среде на основе перевара по Хогтингеру. Бактериальные суспензии инакгивировали

ДЭИ в концентрации 3% по активному веществу при 37°C и рН7,2-7,6. Средние

значения концентраций выживших микробных клеток определяли посредством

высева и титрования на M ПА.

Процесс инактивации микробных клеток различными химическими агентами

может быть выражен формулой экспоненциальной функции:

lgP=lgPeeM, (3) где:

Р - количество выживших микроорганизмов после воздействия испытуемой концентрацией инактиванта ( КОЕ/мл),

Ро - количество микроорганизмов до инактивации (КОЕ/мл), е - основание натурального логарифма, t - время инактивации (ч). к - константа скорости инактивации (ч"').

Основными параметрами, которые необходимо учитывать при определении продолжительности инактивации, являются: допустимый уровень оставшихся живых

клеток в инактивированной бактериальной суспензии и константа скорости инактивации.

*

Одной из важнейших проблем в технологи» изготовления убитых вакцин является проблема полноты инактивации, поскольку всегда существует вероятность выживания в инактивируемой суспензии хотя бы одного микроорганизма. Из этого следует, что цель инактивации состоит в снижении числа жизнеспособных клеток до пренебрежимо малого числа, но в этом случае возникают проблемы с контролем полноты инактивации методом высева на питательные среды.

Уровень оставшихся живых клеток расчитывали с учетом использованных объемов исходного бактериального сырья. Поскольку опыты проводили в ферментерах емкостью 10 л или 104 см3, то допускали возможность выживания 1 клетки на 10 л бактериальной суспензии, при инактивации, то есть 1д выживших клеток равен -4. Так как константа скорости инактивации к является эмпирическим коэффициентом формулы (3), то ее определяют исключительно экспериментально по данным динамики инактивации бактериальной суспензии.

На основании полученных средних значений концентраций выживших клеток была расчитана константа скорости инактивации (к) бактерий Э. сЬо^гаеэыз N8 370 по формуле (3):

к=2,31д(Ро/Р)«, (4)

ДО,31д(9,897/0,978)№6|84 ч*1

Затем, исходя из значения к и 19 допустимого уровня оставшихся живых клеток, расчитали время инактивации бактерий в, сИо^гаезию №370 3% ДЭИ по формуле:

г=2,31д(Р/Р0)/-к, (5)

которое составило

*=2,31дМ,0/9,897)/-6,84=4,67 ч.

Очень важным моментом является то, что значение к может быть использовано дпя расчета числа выживших клеток в любой момент времени инактивации (по формуле 3),

На основании полученных данных, построили кривые кинетики выживания сальмонелл, представленные на рисунке 1. Графики инактивации бактерий имели вид прямых линий, что соответствует экспоненциальному характеру процессов инактивации данных серовариантов сальмонелл. Расчитанные по формуле (4) константы скорости инактивации (к) для 3. (урЫтигшт, Б. (^иЫгп и З.еЫегШсЛэ составили 3,84 ч"', 3,64 ч*1 и 6.06 ч"1 соответственно. Как было установлено ранее, для Э. сЬо1егэези15 штамм №370 константа скорости инактивации (к) была равна

6,84 ч"1. Для 3. сЬо1егаезЫг штамм №370 значение к было наибольшим, что свидетельствовало о большей чувствительности этого сероварианта к воздействию ДЭИ, Бактерии сероваров в, (урЫплшшт штамм №371, Э. йаЬНп штамм №373 показали приблизительно одинаковую устойчивость к ДЭИ, так как различия между их значениями к были незначительны.

Время, необходимое для инактивации бактерий в. 1урМтиг!ит штамм №371, Э. сШЬИп штамм №373 и Э.ег^егШШв штамм №7 ДЭИ до выбранного уровня оставшихся живых клеток, принятого -41д, расчитали с учетом значений к по формуле (5). Полученные расчетные данные, представленные на рисунке 1, дают возможность прогнозировать вероятность выживания бактерий в процессе инактивации (в части графика после пересечения с осью абсцисс).

S.ch. S.typh. S.dublin S.enter.

Рис. 1. Скорость инактивации ДЭИ в концентрации 3% бактерий S. choteraesuls штамм №370, S. typhimurium штамм N9371, S. dublin штамм №373, S.enter!ticiis штамм Ns7 (принятый уровень остаточного вирулентного материала в суспенизии 10"*).

По результатам данного этапа работы можно заключить, что исследованные Серова риан ты сальмонелл обладают различной чувствительностью к инактивирующему действию ДЭИ. Наибольшая чувствительность к ДЭИ была

отмечена у бактерий серо варианта S.choleraesuis штамм №370 и S. ententes штамм №7, в то время как популяции S.typhimurium штамм №371 и S.dublin ила мм №373 показали относительную устойчивость к действию ДЭИ. Количественная оценка и анализ этих закономерностей явились основой для разработки технологии инактивации бактериальных антигенов и изготовления инактивированных вакцин, содержащих исследованные сероварианты сальмонелл.

Определение кинетики инактивации ДЭИ бактерий различных серовариантов Pasteurella multocida. Целью данного этапа работы было изучение кинетики инактивации бактерий четырех серовариантов Pasteurella multocida при воздействии ДЭИ и определение оптимальных параметров процесса их инактивации.

Суспензионные культуры P. muttotida №115, P. multocida №1231, P. multocida №656 и P. multocida №9 инактивировали ДЭИ аналогично процедуре, описанной для сальмонелл.

Для определения кинетики инактивации бактерий штамма P. multocida №115 использовали ДЭИ в концентрациях 0,5% и 1% по активному веществу. Инактивацию проводили при 37°С, в режиме постоянного перемешивания (30-40 об/мин) и рН7,2-7,6, так как ранее было установлено, что эти условия оптимальные.

Полученные данные подтвердили прямую зависимость скорости инактивации

микроорганизмов от концентрации инактованта, в данном случае, ДЭИ, поэтому для

определения других параметров инактивации пастерелл мы использовали ДЭИ в

0 г

концентрации 1% при 37 С.

Допустимая концентрация оставшихся живых клеток в этих опытах была

принята, как и в предыдущих опытах, с учетом используемого объема

бактериальных суспензий (10 л), то есть мы посчитали допустимым возможность

выживания 1 клетки в 10 л суспензии, подвергшейся воздействию инактиванта,

следовательно Ig выживших клеток равен -4. Используя формулу экспоненциальной

функции (3) теоретически расчитали все параметры процесса инактивации, включая i * и количество оставшихся живых бактерий в определенном объеме сырья.

Константы скорости инактивации (к) пастерелл ДЭИ в концентрации 1% расчитали по формуле (4), для бактерий P. multocida Net 15 эта величина была равна - 6,62 ч'1. Оптимальное время инактивации пастерелл ДЭИ в концентрации 1% до уровня -4lg остаточного вирулентного материала, расчитали по формуле(5) и оно составило 4,91 ч.

Необходимо отметить, что величина эмпирического коэффициента к=6,62ч'1 является справедливой только для 1%-ной концентрации ДЭИ. С изменением

концентрации микробных клотск в суспензии или концентрации иизктиванта изменится как продолжительность, так и константа скорости инактивации.

На рисунке 2 представлены графики инактивации па стерся л ДЭИ, построенные на основзнии полученных данных, которые также как и расчет констант скорости инактивации по формуле (4) показали, что инактивация исследуемых серотипоо пастерелл происходила с одинзковоП скоростью. Константы скорости инзктиозции пастерелл этих серовэриантса составили 6,84 ч'\ 7,24 ч-' и 7,09 ч'\ для Р. ти!1оск!а штамм N'11231, Р, гтшЛосМа штамм Г.^050 и Р. ти11оас(а штамм №9 соответственно. Для Р. тиЙосИа штамм N1115, как установленно ранее, этот показатель имел значение С,62 ч'1,

РМ N115 РМ N1231 РМ N656 РМ N9

Рис, 2. Нн активирующее действие дм мера этиленимина в концентрации 1% на клотки ластеролл (Р, тиНосШа штамм №115, Р.шиКосИа штамм №656 к Р. шиНосШа штамм №9) (принятый уровень оставшихся живых клоток в суспензии 10*4).

Время, необходимое для инактивации Р. тиКоагЬ штамм №1231, Р. гтшИос!с1а штамм Г,';С56 и Р. ти!1о&с1а штомм №9 ДЭИ до выбранного уровня оставшихся живых клоток, принятого -41д м.к., было расчитано по формуле (5) с учетом к. На

основании этих теоретических данных кривые инактивации четырех серотилов пастерелл были после пересечения с осью абсцисс (рис.2).

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что существенных различий в кинетике инактивации различных Сероварпантов пастерелл ДЭИ в концентрации 1% не обнаружено. Основные параметры инактивации пастерелл, определенные на модели Р. тиНоск1а №115, Р. ти1;сс1с1а №1231, Р. тиИоск)а №656 и Р. ггшЦосИа №9 и были включены в технологию изготовления поливалентной инактивированной вакцины из указанных штаммов.

2.2.3. Количественная оценка бактериальных антигенов на основе иммумоферментного анализа (ИФА)

Активность бактериальных протективных антигенов, локализованных в клеточной мембране, капсуле, жгутиках может в процессе инактивации существенно изменяться, поэтому возникла необходимость в проверке активности полученных инактивированных препаратов в ИФА,

Предварительно нами были получены специфические компоненты для ИФА и отработаны оптимальные схемы постановки непрямого твердофазного варианта этого анализа.

Определение антигенной активности бактериальных препаратов в ИФА.

В экспериментах использовали, как нативные бульонные культуры сальмонелл (3, сИо1егаезш5 штамм №370, З.еЫеги^з штамм N37, 3. е1иЫ:п штамм №373 и Э. 1урЫпяилигп штамм №371) и пастерелл (Р. ти!(осг(^а штамм №115, Р. гпиИосИа штамм №656 и Р. тиИосЙа штамм №9) в концентрации 1x109 мкр.кл/см3 по стандарту мутности, а так же препараты тех же культур инактивированных 3% ДЭИ и 0,5% формалином (сальмонеллы) и 1% ДЭИ и 0,3% формалином (пастереллы). Все перечисленные выше пробы проверипи в РА и непрямом твердофазном варианте ИФА. Полученные данные представлены в таблице 1.

8 ИФА наиболее высокую антигенную активность имели пробы нативных культур сальмонелл. Значения их оптической плотности и проб инактивированных препаратов представлены в таблице 1. Наблюдали снижение значений оптической плотности (ОП) у проб инактивированных препаратов по сравнению с нативными. В ИФА активность жгутиковых антигенов инактивированных препаратов существенно не отличалась для всех четырех серотипов сальмонелл, в то время как активность соматических антигенов препаратов инактивированных ДЭИ и формалином была различной. Одинаковые значения оптической плотности имели пробы сальмонелл, инактивированные ДЭИ и формалином в реакции с сыаороткой крови кролика, полученной на жгутиковый антиген сальмонелл, в то время как эти же пробы в

реакции с сыворотками кролика, полученными на соматические антигены, были различны. То есть соматический антиген в пробе сальмонелл, инактивированных ДЭИ, был активнее по сравнению с пробами сальмонелл ин активированным и формалином.

Результаты определения специфической активности пастереллезных антигенов (капсульных и соматических) в ИФА представлены в таблице 2.

Активность контрольных капсульных антигенов всех серотилов гтастерелл была самой высокой. Активность капсупьного АГ в пробах нативной культуры Р. muttocida №115, в пробах культур инактивированных ДЭИ и формалином значения оптической плотности были близки (0,146+0,007, 0,181±0,009 и 0,110±0,006 соответственно). Не было обнаружено существенных различий и в активности соматического антигена нативной культуры P. muttocida №115 и инактивированной 1% димером зтиленимина и 0,3% формалином.

Таблица 1.

Оценка активности антигенов сальмонелл инактивированных 3% ДЭИ и 0.5%

формалина в ИФА

_(п«Э)

№ Серотип сальмонелл Значение оптической плотности в ИФА (длина волны 492 нм)

Нативная культура Инактивация 3% ДЭИ Инактивация 0.5% формалина

S на ОАГ* S на ЖАГ* S на ОАГ Эна ЖАГ

1 S.ctioleraes. 0,74±0,043 0.745±0,038 0,663±0,031 0,558±0,063 0.44±0,016

2 S.typhimur. 0.99±0,048 0.815±0,049 0.652±0,023 0,587±0,049 0,60i0,042

3 S.dublin 0.76±0,039 0.631±0,041 0.534±0,043 0.303±0,023 0.57±0,033

4 S.enteritidis 0.74 ±0,045 0.606±0,043 0.526±0,045 0.279±0,014 0.62±0,044

Примечание:

*3 на ОАГ - гипериммунная сыворотка кролика, полученная на соматитический О-антиген гомологичного штамма;

"Б на ЖАГ - гипериммуннзя сыворотка кролика, полученная на жгутиковый Н-антиген гомологичного штамма.

Активность как капсульного, так и соматического антигенов нативной культуры Р. тиНос^а №656 и инактивированной ДЭИ не имела существеного различия (таблица 2), в то время, как активность капсульного и соматического антигенов Р. multocida №656 инактивированной формалином была заметно ниже. Значение ОП капсупьного антигена - 0,347±0,062 и соматического - 0,441±0,026 по сравнению со значениями ОП - 0,759±0,041 и 1,171±0,063 соответствующих антигенов пробы инактивированной ДЭИ.

Оценка активности антигенов Р.тиИос1Йа в ИФА

Таблица 2

N3 Наименование препарата Значение оптической плотности (ОП) в ИФА и на кти ворованных ласте ре л л

Р.тиКос^а штамм №115 Р.гтшИоск1а штамм №656 Р.тиКосйа штамм N89

Б на КАГ* Э на ОАГ* в на КАГ Э на ОАГ 5 на КАГ Э на ОАГ

1 Нативная культура 0,14610,007 0,759±0,04б 0,73310,038 1,17510,065 0,21810,012 0.68710,038

2 Инзктивированная 1%ДЭИ 0,18110,009 0,Э50±0,044 0,75910,041 1,17110,063 0,28410.014 0,75310,044

3 Инактивированная 0.3 формалина 0,1110,006 0,83410,048 0,34710,062 0.44110.026 0,21810,012 0.35710,022

4 Капсулькый антиген (контроль) 0,90110,047 0,01710,0008 0,98210,039 0,02110,001 0,79110,029 0,03410,001

5 Соматический антиген (контроль) 0,01310,0005 1,43410,076 0,07810,004 1,37010,072 0,09610,006 1,40210,074

Примечание;

* Б на КАГ-сыэоротка на калсульный антиген "5 на ОАГ-сыворотка на соматический антиген

Необходимо отметить высокую активность капсульного антигена данного штамма Р. multocida по сравнению с другими пастереллами, что может быть связано с его очень высокой вирулентностью (см. табл. 2).

Антигенная активность препаратов менее вирулентного штамма Р. multocida №9, относящегося по капсульному антигену к серотипу Д, несколько отличалась от активности выше названных штаммов. Активность нативной культуры и препарата, инакгивированного ДОИ, различалась не значительно. Наиболее низкой была активность соматического антигена пробы, инакгивированной формалином.

Таким образом показано, что при инактивации бактерий исследованных штаммов сальмонелл и по стере л л ДЭИ в концентрации 3% и 1% соответственно не было существенного снижения антигенной активности препаратов, В то время как при инактивации пасте ре лл формалином снижалась активность капсульного антигена у Р. multocida №656 и соматического антигена Р. multocida №9.

2.2 А. Разработка наборов ИФА для определения противосальмонеллезных и противопастереллезных антител в сыворотках крови свиней. Для определения количественных характеристик зависимости между дозой антигена и титрами специфических антител возникла необходимость заменить РА менее трудоемким и более чувствительным ИФА.

Целью этого этапа работы было создание наборов для выявления лротивосальмонеллезных и противопастереллезных антител в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при достижении высокой чувствитепьности и специфичности реакции, максимальном упрощении и ускорении процесс анализа.

Реакцию учитывали фотометрически при длине волны 492 нм, как по оптической плотности, так и вычислением «S/P отношения», то есть отношения оптической плотности исследуемой пробы (S-sample) к положительному (P-positive) контролю, то есть S/P - это отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительной контрольной сыворотки за вычетом из обоих значений оптической плотности отрицательного контроля.

В предварительных опытах было опредепено разведение контрольных и испытуемых сывороток, в котором корреляция вычисленных значений ^S/P со значениями титров, определенных методом последовательных разведений была самой высокой. Это было разведение 1:400, поэтому во всех последующих опытах исследуемые сыворотки использовали в одном разведении (1:400).

Разработка технологии изготовления наборов ИФА для выявления антител к бактериям рода Salmonella в сыворотках крови свиней. На этом

этапе работы были определены допустимые величины оптической плотности для 'контрольных гилериммуной (положительный контроль - PC) и нормальной (отрицательных^ контроль - NC) сывороток в разведении 1:400 посредством измерения их оптической плотности (0/7) на разных планшетах,более, чем в 50 повторностях, Для отрицательных контрольных противосальмонеллезных сывороток значение ОП было равно 0,103 ± 0,02; а для положительных контрольных сывороток -1,04 ±0,15.

Кроме контрольных сыворотох при тех же условиях (величина разведения и критерии для обоих контролей) более чем в 30 повторностях проверили пробы полевых сывороток, не содержащих специфических антител к бактериям Salmonella enteric а subsp. enteric а, но имеющих определенный уровень не специфической реакции, превышающий отрицательный контроль.

Результаты проведенных исследований _ позволили определить критерии оценки сывороток при исследовании их посредством иммуноферментных тест-систем для выявления антител к бактериям Salmonella enferica subsp. enteric о в одном разведении, то есть результаты реакции являются корректными, если показатель оптической плотности отрицательного контроля будет находиться в диапазоне [0,083*0,123], а положительного контроля будет находиться в диапазоне {0,88-И.2 J.

Для полученных значений оптической плотности контрольных сывороток определяли значения S/P-отношениЙ (S/P - это отношение оптической .плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительной контрольной сыворотки за вычетом из обоих значений оптической плотности отрицательного контроля), Зти значения S/P приняпи в качестве критериев для отрицательного и сомнительного результатов реакции: пробу сыворотки следует считать отрицательной, если величина S/P 5 0.2; сомнительной, если S/P в диапозоне от 0.21 до 0.29 или положительной, если S/P 2. 0.3.

Инструментальный фотометрический учет результатов анализа дал возможность количественно оценить титры антител в исследуемых пробах сывороток с использованием формулы линейкой регрессии (Плохинекий H.A., 1970). С этой целью более 300 проб сывороток, отрицательные и положительные контрольные сыворотки тестировали в разведении 1:400 и методом последовательных разведений в двух повторностях. Затем провели регрессионный анализ зависимости между Ig S/P - отношения при разведении 1:400 и lg конечного титра сыворотки, определенного методом последовательных разведений. 6

результате получили следующую формулу для выявления антител к бактериям Salmonella entérica subsp.entérica

LogioTHTP = 1.51 (Log™ S/P)+3.804, где:

legte ТИТР - десятичный логарифм титра антител в сыворотке крови свиньи;

S/P - отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительной контрольной сыворотки за вычетом из обоих значений оптической плотности отрицательного контроля;

1, 51 и 3,8 - постоянные коэффициенты тест-системы для выявления антител к бактериям So /топ ella е nie rica subsp. ente rica.

Все сыворотки, использовавшиеся в данной работе, были протестированы в реакции агглютинации (РА) для определения титров антител к бактериям рода Salmonella. Всего было исследовано более 300 полевых сывороток крови.

Коэффициент корреляции тест-системы для выявления антител к бактериям Sa/топе//а onf erica subspecies en te rica составил 0.939.

Разработка технологии изготовления наборов ИФА для выявления антител к бактериям Pasteurelta muUoclda в сыворотках крови свиней. На основании результатов предварительных исследований для разработки тест-системы для выявления противопастер&ллезных антител использовали антиген, полученный ультразвуковой дезинтеграцией и низкоскоростным центрифугированием, качество которого подтверждали в серологических реакциях (РА) а концентрацию антигена определяли спектрофотометрически (по методу Бредфорда). Допустимые величины ОП для контрольных гипер иммунной противопастереллезной и нормальной сывороток крови свиней определяли аналогично, как и при разработке предыдущего набора. Для отрицательных контрольных нормальных сывороток: значение ОП было равно 0,12 ± 0,02; для контрольных гипериммунных сывороток - 0.708 ±0.13.

Результаты проведенных исследований позволили определить критерии оценки реакции при исследовании их в данной тест-системе, то есть результаты реакции являются корректными, если показатель оптической плотности отрицательного контроля будет находиться в диапазоне [0,14 0,14], а показатель оптической плотности положительного контроля будет находиться в диапазоне [0,578* 0.838], Были также определены и критерии для отрицательного и сомнительного результатов реакции для полученных значений SIP.

Пробу сыворотки, исследуемую в данной тест-системе считают отрицательной, если величина S/P £ 0,2; сомнительной, если S/P в диапозоне от 0.21 до 0,29 или положительной, если S'P 2 0.3.

На основании результатов исследования более 300 проб сывороток в ,раэ ведении 1:400 и методом последовательных разведений в двух лсвтсрностях провели регрессионный анализ зависимости между Ig S/P - отношения при разведении 1:400 и Ig конечного титра сыворотки, определенного методом последовательных разведений. В результате получили следующие формулы: Log 1о ТИТР = 1.66 (1од1в S/P) + 3,623, где:

log,о ТИТР - десятичный логарифм титра антител в сыворотке крови свиньи;

S/P * отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической

плотности положительной контрольной сыворотки за вычетом из сбснх значений

оптической плотности отрицательного контроля;

1, 66 и 3,623 - постоянные коэффициэнты тест-системы для выявления антител к

бактериям Pasteurelfa multocida.

Все сыворотки, использовавшиеся в данной работе, были протестированы в РИГА для определения титров антител к бактериям Pasieureto multocida. Всего было исследовано более 300 полевых сывороток крови. Коэффициент корреляции составил 0.927.

Полученные в результате обобщения и анализа данные экспериментальных исследований явились основанием для разработки нормативной документации на изготовление опытной партии наборов и их использования в ветеринарной практике.

2.2.S. Влияние инактивации на сохранность антигенной структуры бактериальных препаратов. На данном £тапе работы необходимо бьшо выявить возможные изменения под воздействием ДЭИ в ультраструктуре клеток сальмонелл и пастерелл, а также возможное их разрушение, с образованием субклеточных фрагментов. Пробы нативной культуры S. choteraesuis №370, препарата этой культуры инаетивированной ДЭИ в концентрации 3% при 37°С, нативной культуры Р. multocida №115 и препарата этой культуры инаетивированной ДЭИ в концентрации 1% при 37°С исследовали в световой и электронной микроскопии. Концентрация микробных клеток в исследованных пробах составляла 10 млрд.м.кЛм3 по стандарту мутности. Для световой микроскопии препараты окрашивали по Граму по общепринятой методике (Методы общей микробиологии: /Под ред. Герхардта Ф. и др.. 1933).

В световой микроскопии были выявлены различия в форме, размерах и окраске клеток сальмонелл и пастерелл до и после воздействия ДЭИ. В препарате сальмонелл и пастерелл, инактивироваиных ДЭИ, наряду с характерными для данных возбудителей палочками, отмечали бактерии округлой формы, меньшего размера и более бледной окраски. То есть ДЭИ оказывает влияние на морфологические и тинкгориальные свойства сальмонелл. При повторном микроскопическом исследовании инактивироваиных сальмонелл и пастерелл (через

6 и 12 месяцев хранения их в фосфатно-буфер ком растворе при 4°С) было показано, что с увеличением срока хранения инактивированного препарата увеличивается и количество бактерий с измененной морфологией и тинкториальными свойствами (бледно окрашивающихся по Граму).

При электронно-микроскопическом исследовании нативных культур S. choleraesuis штамм №370 и Р. multocida штамм №115 было отмечено, что ультраструктурная организация исследуемых бактерий была типичной. При исследовании лреларагав сальмонелл и пастерелл, инактивированных ДЭИ и формалином наблюдали изменения в ультраетуктуре клеток по сравнению с исходными культурами. Более заметны эти изменения в препаратах инактивированных ДЭИ. В препаратах сальмонелл, инактивированных 0,5% формалином, отмечали увеличение складчатости клеточной стенки. В то время как клетки пастерелл, инактивироганные формалином, были похожи на типичные нативные бактерии. Длина формалинизированных сальмонелл составляла 806-1255 нм, а диаметр 569-633 нм. Пастереллы, обработанные формалином, имели длину 727-867 нм, диаметр 473-509 нм. Однако среди них выделяли единичные клетки округлой формы с измененной клетЬчной стенкой,

В препаратах, инактивированных 3% и 1% ДЭИ наблюдали изменения размеров и форм клеток. Сальмонеллы, инактивированные ДЭИ, имели длину 7581033 нм, диаметр 570-738 нм. Бактерии, инактивированные ДЭИ, заметно отличались от нативной культуры Р, multocida №115, Они имели меньшие размеры (длина 500-644 нм, диаметр 500-808 нм) и округлую форму и дефектную клеточную стенку. На поверхности бактерий отмечали скопления масс, не имеющих закономерной структуры. Появлялись округлые клетки с дефектной клеточной стенкой.

Таким образом, посредством световой и электронной микроскопии были выявлены различия в форме, размерах, окраске и ультраетуктуре клеток до и после воздействия инактивантов. Более заметны эти изменения в препаратах инактивированных ДЭИ. Было также показано, что с увеличением срока хранения инактивированных препаратов (6 и 12 месяцев) увеличивается и количество бактерий с измененными морфологией и тинкториальными свойствами.

2.2.6. Конструирование инактивированных эмульсионных вакцин.

На этапе конструирования (или компановки) инактивированных эмульсионных вакцин очень важно решение таких вопросов, как выбор типа эмульсии, обоснование количества антигена в прививной дозе, подбор адъюванта, подбор консерванта, обоснование прививного объема вакцины и др., так как главной целью подбора

компонентов дисперсной системы является получение эмульсионных вакцин, обладающих низкой вязкостью и высокой стабильностью.

С целью выбора менее реактогенного адъюванта для разрабатываемых препаратов на данном этапе работы провели сравнительное изучение реактогенности адъюванта ВНИИЗЖ, который широко применяется при изготовлении противовирусных вакцин, и Montan ¡de ISA-70 на морских свинках и кроликах. Менее реэктогенным оказался адъювэнт Montanide ISA-70. На основании полученных данных для дальнейшей работы по разработке технологии изготовления эмульсионных вакцин был отобран адью вант Montanide ISA-70, так как у лабораторных животных он вызывал менее выраженную воспалительную реакцию, чем другие здъюванты.

Изготовление опытных образцов инактивированных эмульсионных вакцин против сальмонеллёза и пастереллеза свиней. Эмульсионные вакцины изготавливали с соотношением масляной и водной фаз 50:50, 60:40,70:30, 80:20 на микроразмельчителе тканей РТ-2, при скорости вращения мешалки 6000 об/мин в течение 5 мин при температуре (20-22)°С, медленной подаче водной фазы и постоянном перемешивании адъюванта. Получение стабильной эмульсии типа "вода-масло* при использовании минимального количества адъюванта, в связи с его реактогенностью, и соответственно максимального содержания водной фазы антигена было главной задачей данного этапа работы. Исследование физических свойств показано на примере опытных образцов ассоциированной вакцины. Результаты этих исследований представлены в табл. 3. '

* Таблица 3.

Зависимость вязкости и стабильности опытных образцов ассоциированной

№ образца вакцины используемый адъювант процентное соотношение (%) антиген :адъюва нт среднее значение вязкости при t=20±2°C ммг/с стабильно эмульсии (< при t (°С :ть :ут>

2-8 18-22 37

1 ВНИИЗЖ 20:80 58,3 >180 >180 >14

2 30:70 67.2 >180 >180 >14

3 40:60 88.8 >180 >180 >14

4 50:50 96.7 >180 >180 >14

5 Montanide ISA70 20:80 60.3 >180 >180 >14

6 30:70 68.5 >180 >180 >14

7 40:60 86.9 <180 <90 <14

8 50:50 93.4 <30 <30 <7

Эмульсии, изготовленные с адъюванта ми ВНИИЗЖ и Montanide ISA-70, имели относительно низкую вязкость (от 58,3 до 96,7 ммг/с) и сохраняли стабильность в течение всего срока наблюдения, кроме образцов №№ 7 и 8. Незначительное

отслоение масла на поверхности гомогенной эмульсии (креминг) наблюдали при хранении вакцины в течении 3-4 мес при температуре (2-8}°С и (18-22)°С в образцах №Na 1, 2, 5 и 6. В образцах №№ 3, 4, кроме незначительного отслоения масла, наблюдали и образование рыхлого осадка антигена (ситинг). Вакцина приобретала первоначальный вид при тщательном встряхивании флаконов. Через 7-14 суток хранения при температуре 37° С и через 1-3 мес хранения при температуре (2-8)сС и (18-22)°С наблюдали расслоение эмульсии на водную и масляную фазы в образцах №№ 7, 8.

Эмульсии оставались стабильными даже после центрифугирования при 1000g в течение 30 мин во всех образцах вакцин, кроме №№ 7, 8. На основании полученных данных можно заключить, что образцы №№ 5 и б по физическим свойствам в большей степени соответствуют требованиям, предъявляемым к эмульсионным вакцинам.

Иммунобиологические свойства опытных образцов вакцин. При проведении испытаний безвредности и реактогенности препаратов мы'имели ввиду допустимые кормы таких реакций, но не их отсутствие, и учитывая peaктогенкость масляных адъюв актов, за максимальный прививной объём вакцины для лабораторных животных мы приняли - 0,2 см3, а для свиней - 0,5 см3.

Оценку иммуногенных свойств вакцин. И «активированных ДЭИ, проводили в сравнении с аналогично изготовленными вакцинами, инактивированными формалином, сразу после изготовления и в процессе их хранения. Эти исследования включали определение 50% имунизирующей дозы на морских свинках. ИмДю по антигену S. choleraesuís была равна 34 млн. м.к., а по антигену S. typhimurium - 45 млн. м.к.

Наряду с определением ИмД$о, сыворотки крови морских свинок были исследованы в РА с коммерческим антигеном S. choleraesuís через 10, 20 и 30 суток после вакцинации. Через 30 суток сыворотки крови 15-ти животных были оценены как положительные и у одной морской свинки (№15) - как сомнительная.

При сравнении иммуногенной активности опытных образцов вакцин, содержащих S. choleraesuís №370 и S. typhimurium №371, инактивированных как ДЭИ, так и формалином, было установлено, что вакцины различались по иммуногенкости. Величина ИмД$д для вакцины, инактивироаанкой ДЭИ, составляла 47,6±12,0 млн, м.к., в то время как для формалинизированной вакцины она равнялась 222,0 ± 20,8 млн. м.к. То есть иммуногенная активность димерного образца вакцины была в 4,7 выше, чем у формалинизироваиного.

Так как иммуногеная активность и на котированных препаратов в процессе их хранения может снижаться, величина ИмДм этих же вакцин была проверена через 6 и 12 месяцев хранения при 4°С. Для образца вакцины, инактивированной ДЭИ, величина ИмД5о через 6 месяцев хранения составляла 62.0 ±5,4 млн. м,к„ через 12 месяцев - 38,5±3,54 млн. м.к., а для вакцины, инактивированной формалином, через 6 месяцев хранения атот показатель равнялся 243,0±23,1 млн. м.к., а через 12 месяцев - 236,0±19,7 млн. м.к.

По представленным результатам можно сделать заключение, что опытные образцы вакцины, инактивированной ДЭИ, значительно превосходили по иммуногеной активности вакцину, и на ктив иро ванную формалином. Хранение обоих исследованных образцов в течение 12 месяцев при 4°С не вызвало существенного снижения их иммунобиологических свойств.

Определение ИмДм опытных образцов эмульсионных вакцин, содержащих пастереллы сероваров А, Р, В, инактивированных ДЭИ и формалином, проводили на белых мышах массой 16-18 г и на кроликах массой 1.5-1.8 кг. Все образцы вакцин содержали по 10 млрд,м.к./см5. При оценке иммуногенной активности на белых мышах установлено, что 0,5 см1 цельной вакцины защищает 75% белых мышей от контрольного заражения дозой 10 1.Р5о по серовзру В, По серовзру А 100% защиту белых мышей от контрольного заражения 4 Юмдает 0.5 см1 вакцины в разведении 1:27. В результате проведенных исследований установлено, что величина ИмД» -для кроликов .составляет 0.006 см3 или 60 млн. м, к. по каждому из двух сероваров (А и В).

При сравнении и мму ноге иной активности опытных образцов вакцин, содержащих Р. тиНосИа серовары А, В, О, как ин активированных ДЭИ, так и формалином, было установлено, что опытные образы вакцин различались по иммуногенности. Величина ИмДзд вакцины, инактивированной ДЭИ, составляла в среднем 67,6+8 млн. м.к./см3, а для инактивированной формалином • 291124.3 млн. м.к./*см, То есть образец вакцины, инактивированной ДЭИ, в 4,3 раза превосходил по иммуногенности формапинизированный. Через 6 месяцев хранения при 4°С величина ИмД50 для образца вакцины, инактивированной ДЭИ, составляла 61,9 ±4,3 млн. м.к./см1, а через 12 месяцев - 63+5.6 млн, м.к7см3, ИцВ» вакцины, инактивированной ДЭИ, через 6 месяцев хранения • 221 ±17,3 млн. м,к./см3, через 12 месяцев - 236 ±21,8x10® м.к./см'. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что иммуногенная активность вакцины, инактивированной ДЭИ, превосходила им му но генную активность вакцины, инактивированной формалином.

При хранении препаратов в течение 6 и 12 месяцев при 4°0 не было отмечено снижения их иммуногенноети.

Оценка иммуногенной активности ассоциированной вакцины включала определение ИмДю для лабораторных животных сразу после изготовления и через 12 месяцев после хранения при температуре от 2 до 15°С. Ее проводипи на белых мышах массой 18-20 г. и на морских свинках массой 350-400 г, В результате Проведенных исследований установлено, что величина ИмДзо по лзстереллезным антигенам составляет : серовар А - 0.024 см3 или 49 млн м.к„ серовар В - 0.027 см3 или 55 млн м.к., серовар Д - 0.027 см3 или 55 млн м.к. По сальмонеллезным антигенам: Э. сИо1егае5Ш5 - 0.019 см5 или 79 млн м.к., Б. (урЫтигшт - 0.022 см3 или 44 млн м.к. Через 12 месяцев хранения опытных образцов ассоциированной вакцины прошв пастереллеза и сальмонеллеза при температуре от 2 до 15°С на поверхности эмульсии наблюдали незначительное отслоение минерального масла (до 1/10 объема). При тщательном встряхивании вакцина приобретала вид гомогенной массы. Иммуногенную активность вакцины ассоциированной против пастереллеза и сальмонеллеза свиней через 12 месяцев хранения оценивали по значению 50% иммунизирующей дозы по каждому антигену пастерелл и сальмонелл на лабораторных животных, как описано выше. Было установлено, что иммуногенная активность вакцины ин активирован ной ДЭИ сохраняется в течение 12 месяцев хранения (срок испытания) при температуре от 2 до 15°С.

2.2.7. Лабораторные испытания экспериментальных и опытно-промышленных серий вакцин.

Лабораторные испытания экспериментальных и опьггно-промышленных серий разработанных нами вакцин включали: определение ИмДго для лабораторных животных и свиней, напряженность и продолжительность поствакцинального иммунитета у взрослых свиней и напряженность и продолжительность колострального иммунитета у новорожденных поросят.

С целью определения количественных характеристик зааисимости между дозой антигена, защитным эффектом и титрами специфических антител использовали регрессионный анализ. Статистическую обработку результатов проводили, используя уравнение линейной регрессии:

у я А - К' X, где:

у - процент защищенных животных в опыте (пробиты), титр специфических антител (1094):

X • разведение вакцины (1од5);

А и К - коэффициенты регрессии (К - тангенс угла наклона прямой у на х, А - точка на оси ординат, показывающая величину напряжённости иммунитета при иммунизации единицей антигена, у = А, при X = 0).

Оценку иммуногенных свойств сальмонелл в составе вакцины проводили на ^елых мышах и морских свинках. Белых мышей иммунизировали подкожно цельной вакциной и разведениями в плацебо 1:3, 1:9, 1:27, 1:81 и 1:243 в объёме 0,2 см*. Через 21 сутки после иммунизации опытных и контрольных животных заражали вирулентными штаммами сальмонелл: белых мышей - в дозе 4 ЛД«,о, а морских свинок - S, choleraesuis - 8 и 10 млрд м, к.. S. typhimurium - 6 и 8 млрд м. к. За животными наблюдали в течение 10 суток после контрольного заражения. Результаты определения иммуногенности S. choleraesuis на белых мышах представлены в таблице 4,

Таблица 4.

Оценка иммуногенной активности экспериментальной серии вакцины

против сальмоноллеза на лабораторных животных.

Вид антигена ИмДез для белых мышей ИмДсо Для морских свинок

(см*) М.к (cmj) М.к.

S. choleraesuis №370 0.0046 46 х 10° 0.0047 47 х 10°

S. typhimurium №371 0.0034 34 х 1015 0.0037 37 х 10е

Определение ИмДьо вакцины проводили на поросятах 60-суточного возраста, которое рассчитывали по отношению количества не заболевших (не имеющих симптомов заболевания и от которых не выделена гемо- и копрокультура) к общему числу заражённых животных в опыте. Значение ИмД50 составило 0,0107*0,0012 см5.

Напряженность и продолжительность иммунитета у животных, привитых

инактивированной эмульсионной вакциной против сальмонеллеза свиней

г

определяли методом контрольного заражения однократно иммунизированных поросят 25-суточного возраста и исследованием сывороток крови на наличие специфических антител.

Для определения продолжительности поствакцинального иммунитета поросят-сосунов 25-суточного возраста (п=250), полученных от невакцинировэнных свиноматок, разделипи на три группы. Животных первой группы (п=100) иммунизировапи вакциной однократно внутримышечно в области шеи в объёме 0,5 смэ. Поросят второй группы (п=100) - двукратно с интервалом между прививками 20 суток. Животных третьей группы (п=50) не иммунизировали (контрольная группа).

До вакцинации, через 21 сутки, а также через 3,5 и 7 месяцев у всех животных брали пробы крови для исследования сывороток в НФА на наличие специфических противосальмонеллёзных антител. Максимальный титр противосальмонеллёзных антител при однократной вакцинации достигал 1581, затем постепенно снижался и через 3 месяца после вакцинации показатель не превышал 145.

У поросят иммунизированных двукратно с интервалом в 20 суток, поел© первой вакцинации уровень противосальмонеллёэных антител составлял 925, к трём месяцам титры достигали максимального уровня - 1208. Титр противосальмонеллёэных антител постепенно снижапся и к пяти месяцам составил 514, а через 7 месяцев (срок наблюдения) не превышал 295 (уровень фона).

Продолжительность иммунитета к езльмонеллезу определяли посредством контрольного заражения 10 подсвинков 5 месячного возраста, из которых 5 - были иммунизированы в 25 суточном возрасте однократно в дозе 1 см3 вакцины, а пять животных - двукратно по 0.5 см1. Иммунизированных животных заражали внутрибрюшинно культурой штаммов Э. сЬо1егае5и!э №370 и Э, 1урЫтипшп N9371 в объеме 1 см3 с концентрацией 40 млрд^см3. Через 10 суток после заражения все животные остались живы. Таким образом, было показано, что двукратная иммунизация поросят в возрасте 25 суток вакциной против сапьмонеллеза свиней инакгивированной эмульсионной индуцирует образование специфических антител в течение 7 месяцев и обеспечивает защиту от заражения Э. сЬо!егаези1з штамм №370 и Э. 1урЫтигшт штамм №371 в объеме 1 см3 с концентрацией 40 млрд ./см3.

Таблица 5

Уровень противосальмонеллёэных кол острая ьных антител у поросят __ разного возраста__

Возрастная Количество Источник антител или причина Титр антител в ИФА

группа голов антителообразова ния (М±т)

Свиноматки 5 вакцина 4068±450

Поросята в возрасте

1 сутки 10 без молозива -

1 сутки 10 молозиво 4709±346

10 суток 10 молозиво 3543±137

28 суток 10 молозиво 2058±757

44 суток 10 молозиво 1103,6±355

53 суток 10 молозиво 353,2±194

62 суток 10 молозиво 77.2±62 -

Для определения поствакцинального противосальмонеллезного иммунитета супоросных свиней иммунизировали однократно за 40-45 суток до опороса. Через 7, 14, 21, 28 и 35 суток после вакцинации отбирали пробы крови у свиноматок и исследовали в ИФА.

У новорожденных поросят также отбирали пробы крови и исследовали в ИФА для определения колостральных антител. Динамика появления антител в пробах сывороткадэоеи поросят представлена в таблице 5.

Продолжительность колострапьного иммунитета к сальмонеллезу определяли посредством контрольного заражения 10 поросят в 25-суточном

возрасте. Животных заражали внутрибрюшинно культурой штаммов в, сЬо1егаези15 №370 и Э. (урЫгпиггшп N»371 в объеме 1 смэ с концентрацией 40 млрд./смЗ.

Полученные результаты позволяют заключить, что с 1 по 44 сутки после рождения сыворотки крови поросят по уровню лротивосальмонеллезных колостральных антител были положительными, и данный уровень колострапьных антител защищал животных от контрольного заражения.

Оценку им муноген моста вакцины против пастереллеза свиней инактивированной эмульсионной проводили на лабораторных животных и свиньях. Белых мышей иммунизировали подкожно цельной вакциной и разведениями в плацебо 1:3, 1:9, 1:27, 1:81 и 1:243 в объёме 0,2 см3. Учитывая значение ЛДю каждого штамма, составляли заражающие дозы на 1, 2, 4, 8, 16 и 32 ЛД^о. Иммуногенная активность антигенов па стере л л в составе вакцины на белых мышах оказалась одинаковой. Так среднее значение ИмД;э серовара А составило 46 х 106 м. к„ серовара В - 57 х 10е м. к., серовара О - 43 х Ю5 м. к.

Определение иммуногенной активности вакцины против пастереллеза проводили посредством однократной иммунизации поросят 25-суточного возраста объемной дозой 0.5 см3 с последующим контрольным заражением. Поросят заражали штаммами №N9115 и 1231 эндотрахеально посредством медицинской андотрахеальной трубки диаметром 6 мм в объеме 5 см5, а штаммом №656 * внутримышечно в область бедра заражающими дозами 10, 100 и 1000 ДСЦо в объёме 1,0 см5. За животными наблюдали в течение 10 суток после заражения. Заражающие дозы 10 и 100 ЛД» не вызывали гибели иммунизированных животных. Значение ИмДи в этих опытах составило < 0,002 см3. Контрольные животные пали в течение 36-48 часов. При заражении поросят дозой 1000 ЛДу» заболели и пали 5 из 13 иммунизированных животных. Значение ИмД» составило 0,0075 см3. Конрольные животные пали.

Таким образом, было показано, что иммуногенная активность антигенов пасте ре л л в составе вакцины, как для белых мышей (ИмДм серовара А составила 46 х 10е м. к., серовара В - 57 х 10е м. к., серовара Р - 43 х 10е м, к.), ток и для кроликов (ИмДзо серовара А составила 51 х 106 м. к„ серовара В - 62 х 10е м. к., а серовара О - 48 х 106 м. к.) оказалась приблизительно одинаковой, У поросят значение ИмД5о составило для Р. ти!ЮС1<Ь серовара А штамм №115 - 69 х 10* м. к., штамм №1231 - 66 х 106 м. к„ серовара В штамм № 656 - 75 х 10е м. к.

Напряженность иммунитета изучали на 9 поросятах 2-х месячного возраста, массой 15-20 кг и 15 подсвинках 6-ти месячного возраста. Через 21 день после иммунизации провели контрольное заражение серотипом В в дозе 3000 м.к„ что

составляет 47 свиных LDjq. контрольные животные пали в течение 36 часов. Вакцинированные животные остались живы.

Определение продолжительности поствакцинального иммунитета у свиней проводили на свинокомплексе ОАО "Ильиногорское' Нижегородской области. Поросят-сосунов 25-суточного возраста (п=250), полученных от невакцинированных свиноматок, условно разделили на три группы. Животных первой группы (п=100) иммунизировали вакциной однократно внутримышечно в области шеи в объёме 0,5 см3. Поросят второй группы (п=100) - двукратно с интервалом между прививками 20 суток. Животных третьей группы (п=50) не иммунизировали (контроль). Перед контрольным заражением пробы сывороток крови у всех животных исследовали в ИФА с целью определения уровня противопастереллезных антител.

Было показано, что уровень противопастереллёзных антител при однократной вакцинации в среднем ло группе составил 1807, который не снижался в течение 7 месяцев (срок наблюдения). У поросят иммунизированных двукратно с интервалом в 20 суток, после первой вакцинации уровень противопастереллёзных антител составлял 1807, к трём месяцам - они достигали максимального уровня • 2611, Уровень противопастереллёзных антител не снижался в течение 7 месяцев (срок наблюдения).

Напряжённость проти вопастере лпезно го иммунитета определяли также методом контрольного заражения животных. Для этого поросят первой группы спустя 3, 5 и 7 месяцев после вакцинации доставляли автотранспортом во ВНИИЗЖ, где размещали в блоке крупных животных титражного корпуса. Животных (п=72) заражали летальной дозой суточной бульонной культуры P. multocida серовар В штамм № 656. По результатам контрольного заражения можно заключить, что однократная иммунизация животных в 25-суточном возрасте обеспечивает гарантированную защиту животных от контрольного заражения дозой 10s ЛДзд Р. multocida серовар В штамм № 656 в течение 7 месяцев (срок наблюдения). Животные контрольной группы пали в течение 36-48 часов при заражении дозой 10 ЛДао.

Полученные результаты позволяют заключить, что разработанная вакцина против пастереллеза свиней эмульсионная ин активированная обладает выраженными протективными свойствами и обеспечивает защиту животных от пастереллеза в течение 7 месяцев.

Для оценки колострального иммунитета у новорожденных поросят супоросных свиноматок <п=5) иммунизировали однократно за 40-45 суток до опороса, У поросят-сосунов пробы крови отбирали на 1, 10, 20, 30 и 42 дни жизни. Напряженность

3Î

кслострапьного иммунитета у поросят оценивали по уровню антител в сыворотках крови, который определяли в ИОД, п методом контрольного заражения результаты по изучению динамики колострального иммунитета представлены на рисунке 3.

Максимальный уровень материнских антител в сыворотках крови поросят отмечали в первые сутки жизни животных - 2С01. В дальнейшем титры антител были ниже и к 42 суткам (срок наблюдения) достигали минимального значения -514.

s:

и

3 000 2 500 2 000 И 500

га

11 000

С]

о

500

г ч.' " -л'.

0 .

10 20 30 Возраст поросят(сутки)

El P.multocida _

Рис. 3. Уропснь колостральных антител у поросят, полученных от сшшоматок, иммунизироианных »шактивиропакной пакцннон протин пастсроллозз

Для оценки напряженности колострального иммунитета все поворошенные поросята условно были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группы (по 8 голов в каждой). Контрольное заражение животных проводили на 10, 20, 30 и 42 дни жизни. Поросят зд ража ля суточной бульонной культурой P. muîtocida сером р В штамм № 65С в дозе 1000 ЛД-,э внутримышечно, Всо поросята из опытных групп (вакцинированные), до 30-дневнсго возраста были устойчивы к контрольному заражению гомологичным штаммом бактерий. Контрольные животные (полученные от не вакцинированных свиноматок), заражённые P. muîtocida ссроваром В, погибали

в, течение 24-36 часов. Гибель поросят от пасте реппе за была подтверждена бактериологическим анализом.

Из результатов проведённых исследований следует, что поросята, полученные от однократно вакцинированных против пастереплёза свиноматок, имеют напряжённый колостральный иммунитет до 30-дневного возраста.

Таблица 6

Некоторые характеристики а ко пери ментальных серий вакцины ассоциированной против пастереллёза и сальмонеллёза свиней;

№ Определяемые -параметры Номер эспериментальной серии вакцины

1 2 3 4

1 Стабильность ст ст ст ст

2 Вязкость мм'/сек (М±т) 75±5 71±3 79±3 Б9±5

3 Стерильность + + + +■

■ 4 Полнота инактиваци + + + +

5 Безвредность б/в б/в б/в б/в

6 Реактогенностъ * с/р с/р с/р с/р

Примечание:

ст- стабильна; •*

+ - отсутствие роста коктаминин и ру ющей и специфической

микрофлоры; б/в - безвредна; с/р - спабореактогенна.

В лабораторных условиях были проведены испытания четырёх серий ассоциированной вакцины против ластереллеза и сальмонеллеза свиней. Результаты проверки некоторых свойств экспериментальных серий ассоциированной вакцины предстаепены в таблице 6,

Полученные результаты свидетельствует, что экспериментальные серии ассоциированной вакцины против пзстереллеза и сальмонеллеза стабильны, имеют постоянную вязкость (69-79 ммг/сек), стерильны, безвредны и слабо резктогенны.

. Определение напряженности, иммунитета у свиней, вакцинированных ассоциированной вакциной против, ластереллеза и сальмонеллеза инахтивированной эмульсионной, проводили на поросятах 25-суточного (п=12) и 5-ти месячного возраста (п=12). Восемь животных, иммунизировали внутримышечно за ухомкв.объеме 0.5 см1, остальных оставили дпя контроля (невакцинированные). Через 21 сутки после вакцинации животных разделили на 4 группы: (по 2 • вакцинированных подсвинка и 1 интактный) и провели контрольное заражение соответствующими штаммами пастерелл и сальмонелл.

Первую группу заразили: внутримышечно в бедро сероваром пастерелл В в дозе" 6.5X10* ж.м,к., что составляет 1000 свиных ЛДкь Контрольные животные пали через 36 часов. Вакцинированные животные остались живы. Вторую группу заразили

интратрахеально сероваром А в дозе 4 см3 20-ги часовой бульонной культурой с накоплением 1 млрд ж.м.к./ см1. Заражение проводили с помощью медицинской эндотрахеальной трубки (тип 6.5), которую вводили в трахею через рот. Контрольные животные заболели на 8 сутки. Вакцинированные животные остались клинически здоровыми. Третью группу заразили также интратрахеально сероваром Д в дозе 7 см3 20-ти часовой бульонной культуры с накоплением 1 млрд ж,м.к./см3. Контрольные животные заболели на 10 сутки. Вакцинированные животные остались клинически здоровыми. Четвертую группу заразили орально смесью из равных объемов двух штаммов сальмонелл (Б. сЬо^гаеэшэ штамм №370 и 1урМтипит штамм №371) в дозе 6X1010 м.к. (ИДюо) в объеме 50 см3. Заражение проводили с помощью желудочного зонда. Контрольные животные заболели на 9 сутки. Вакцинированные животные остались остались клинически здоровыми

Поросят 6-ти месячного возраста разделили на 4 группы и вакцинировали внутримышечно за ухом цельной ассоциированнЬй вакциной и ее трехкратными разведениями от 1:3 до 1:27. Через 21 день животных заразили Р. тиЙосИа серовара В в дозе 6.5X10* м.к,, что составляет 1000 свиных ЛДм>. внутримышечно с внутренней поверхности бедра. Все животные остались живы. Местная, общая и температурная реакция отсутствовали. Перед контрольным заражением у животных отобрали пробы крови для определения уровня противопастереллезных антител.

Результаты серологических исследований сывороток крови показали, что однократная вакцинация поросят 25-суточного возраста вакциной в объеме 0.5 см3 и 6-месячных поросят, как цельной, так и разведениями вакцины от 1:3 до 1:27, вызывает иммунный ответ, о чем свидетельствуют высокие уровни противопастереллезных антител у вакцинированных животных по сравнению с контрольными.

Иммуногенную активность четырех серий вакцин оценивали качественным методом на белых мышах и определением ИмДм на морских свинках. При качественной оценке белых мышей заражали подкожно, летальной дозой возбудителя (ДД50) в объёме 0,5 см3. Вакцину считали иммуногенной, если она предохраняла от гибели не менее 8 из 10 вакцинированных животных (по каждому серовару) в течение 10 суток после гибели 50% контроля.

Результаты определения ИмД$о на морских свинках представленны в таблице 7 и позволяют заключить, что ассоциированная вакцина против пастереллеэа и сальмонеллеза свиней иммуногенна, достоверной разницы мевду значениями ИмД;о по каждому антигену пастерелл и сальмонелл не наблюдали.

Таким образом, было показано, что разработанная вакцина ассоциированная против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактивированная эмульсионная обладает иммуногенной активностью, которая сохраняется в течение 12 месяцев хранения (срок испытания) при температуре от 2 до 15°С.

Колостральный иммунный ответ проверяли на супоросных свиноматках (п=4), которых однократно иммунизировали вакциной ассоциированной против сальмонеллеза и пастереллеза свиней. Вакцину вводили внутримышечно, в области верхней трети шеи в объёме 1,0 см1. В качестве контроля использовали неиммунизированных свиноматок (п=2) с аналогичным сроком супоросности.

Таблица 7.

Оценка иммуногенной активности ассоциированной вакцины через 12 _месяцев хранения на лабораторных животных_

Название ИмД» ИмДм

антигена для белых мышей для морских свинок

Р. ти»ос)с1а №115 63 млн.м.к.

Р. тиНосШ N8656 55 млн.м.к. -

Р. тиИосгйа №9 55 млн.м.к. -

5. сЬо^гаевЫв №370 - 91 млн.м.к.

Э. 1урШтипшг1 №371 - 40 млн.м.к.

Супоросных свиноматок (п=4) иммунизировали однократно за 40-45 суток до опороса. После опороса для определения напряженности иммунитета к соответствующему инфекционному агенту все новорождённые поросята условно были разделены на 4 опытные и 2 контрольные группы (по в голов в каждой). Контрольное заражение животных проводили на 10,20,30 и 42 дни жизни.

Одну группу поросят заражали внутримышечно Р. ти|(оас1а серовар В штамм №656 в дозе 6.5X104 КОЕ/см*, что составляет 1000 свиных ЛДэд. Остальных поросят заражали смесью из равных объемов двух штаммов сальмонелл (3. сЬо1егае5шз штамм N8370 и в. 1урЫтилит штамм №371) в дозе 50 см* суточной бульонной культуры. Все поросята из опытных групп, до 30-дневного возраста были устойчивы к контрольному заражению гомологичными штаммами бактерий. Контрольные животные (полученные от невакцинированных свиноматок), заражённые Р. ти)1оас1а сероваром В штамм №656, погибли в течение 24-36 часов. При заражении сальмонеллами контрольные животные пали через 2-4 суток. Из результатов проведённых исследований следует, что поросята, полученные от однократно вакцинированных против пастереллеза и сальмонеллёза свиноматок, имеют напряжённый колостральный иммунитет до 30-дневного возраста.

Динамику колостраяьно г о иммунного ото ста оценивал и посредством исследования сывороток крови поросят на наличие специфических антител в ИОА. Пробы крови у поросят отбирали на 1, 10, 20, 30 и 42 сутки жизни. Результаты по изучению динамики колострального иммунитета, представлены на рисунке 4.

Максимальный уровень материнских антител в сыворотках крови поросят отмечали в первые сутки жизни животных (против сальмонелле за - 3789, против пастереллеза - 4682) и он был достаточным для защиты от сапьмонелпеза (3257) и пастереллеза (3775) до 30 суток. В дальнейшем титры антител снижались и к 42 суткам (срок наблюдения) достигали минимального значения (против сапьмонелпеза — 3012, против пастереллеза - 3037),

5 000 -■-

< 4 000 '

в ^

§ 3 000

I-

р

га 2 000 -

о. и

Н 1 000 -

□ Р.тиНоЫс(а И 8.с(ю1ег.

Рис. 4. Уровень колостральных антител у поросят, полученных от свиноматок, иммунизированных ассоциированной вакциной.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина обладает высокой иммуногенней активностью для свиней и что поросята, полученные от однократно вакцинированных против пастереллеза и сальмонелл*;за свиноматок, имеют напряженный колостральный иммунитет до 30-дневного возраста.

2.2.8. Определение сроков сохранности инактивированных эмульсионных вакцин против пастереллеза и сальмонеллеза свиней.

Для эмульсионных инактивированных вакцин важным моментом является сохраннение физических свойств и иммуногенности препарата в течение срока годности. Поэтому оценка физических свойств и иммуногенности вакцины в течение этого периода (срока годности) была целью данного этапа работы. Оценку иммуногенной активности инактивированных эмульсионных вакцин проводили сразу после изготовления и через 6, 12 месяцев хранения при температуре 4-6°С посредством контрольного заражения иммунизированных белых мышех массой 1820 г и морских свинкок, весом 350-400 г.

На кавдое разведение брали 50 мышей (по 10 на каждый серовар ластерелл и сальмонелл), 50 не вакцинированных мышей использовали в качестве контроля. Через 21 сутки всех опытных' и контрольных животных заражали заранее оттитрованными смертельными дозами (4±1 Л Дм) бульонных культгур пастерелл и сальмонелл. Результаты исследований приведены в таблице 8.

Таблица 8.

Иммуногекные свойства инактивированных ДЭИ эмульсионных вакцин против сальмонеллеза и пастереллеза свиней в процессе хранения_

Название вакцины Наименование антигена Значение ИмДзд (ХЮ^см11) при хранении вакцины (мес)

0 I 6 | 12

Вакцина против сальмонеллеза ИмД50МС

в. сИо1егаез1лв 30±2 32±Э 36±5

3.1урЫпгшпит 26±5 40±7 43±6

ПДюМ

Вакцина против пастереллеза Р.тиИосгйа серовар А 56±4 64 М 67±5

Р.тиИосЮа серовар В 47±5 58±5 62±3

Р.тиИос^а серовар Д 46+7 59±3 65±3

ПДеоМ

Ассоцииро ванная вакцина Р.тиЧосИа серовар А 46+5 54±4 еэ±5.5

Р.тиНос1(1а серовар В 57±4 57±3 65±4

Р.тиНосйа серовар Д 43±7 58±4 55±3.5

Б. сЬо1егаези1э 92±5.5 91±5 112±4

3.1урЫтипит 34±6 39±3 41 ±6

Полученные результаты показывают, что иммуногенность вакцины через 6 и 12 месяцев хранения незначительно снизилась, но уровень различий между значениями ИмД^был статистически недостоверным.

Это свидетельствует о сохранении иммуногенной активности разработанных вакцин претив пастереллёзэ и сальмонеллёза свиней в течение 12 месяцев хранения при температуре 4-8°С. На основании полученных результатов был установлен срок годности препаратов, который составил 12 месяцев.

Полученные результаты были использованы для разработки нормативно-технической документации на опытно-промышленное производство вакцины против сальмонеллеза свиней ин активирован ной эмульсионной, вакцины против пастереллеза свиней ин активирован кой эмульсионной и вакцины ассоциированной против пастереллеза и сальмонеллёза свиней инактивированной эмульсионной.

2.2.9. Особенности разработанной технологии производства инактивированных эмульсионных вакцин против сальмонеллеза и пастреллеза свиней.

В результате проведенных исследований нами была разработана технология производства инактивированных эмульсионных вакцин против сальмонеллеза и пастереллеза, схема которой представлена на рисунке

Существенным отличием технологии, разработанной нами, от традиционной технологии явилось использование ДЭИ в качестве инактиванта бактериальных клеток и введение принципиально нового этапа после инактивации -низкоскоростного центрифугирования, посредством которого стало возможным освобождение микробных клеток от Среды культивирования, инактиванта. продуктов метаблизма клеток с последующим ресуспендированием до необходимых концентраций в стабилизирующей среде и последующим эмульгированием.

Использование ДЭИ в качестве инактиванта позволило не только получить высокойммуногенные антигены сальмонелл и пастерелл (стр. 26), н^ также значительно сократить время инактивации.

Инактивированную биомассу сальмонелл и пастерелл осаждали на проточной центрифуге типа ОТР-102К-01. После окончания центрифугирования роторы центрифуг с соблюдением условий стерильности переносили в бокс, где бактерийную массу собирали с роторов в стерильные емкости и разводили сахарозо-желатиноаой средой до расчетной концентрации по оптическому стандарту ГИСК им Тарасевича.

Введение этапа концентрирования бактериальной суспензии позволило строго соблюдать расчетные концентрации каждого антигена в стандартной прививной дозе вакцины, а освобождение от питательной среды, в которой культивировали и и »активировали бактерии, позволило снизить реакгогевность разработанных препаратов.

Культивирование в аппаратах АКА-210

Контроль чистоты и типичности •_роста_

Съём бактериальной массы

Конце нтри рование

Приготовление стабилизирующей среды

. Гомогени- —к Ресуспен-

зация дирование

Получение бактериальных суспензий

с расчетной концентрацией антигенов

Контроль

Фасовка, маркировка

Эмульги-I рование

Внесение адью ванта

Рис. 5. Основные этапы технологии изготовления разработанных инактквированных эмульсионных вакцин против сальмонеллвза и пастереллеза свиней

2.2.10. Производственные испытания инактивированных эмульсионных вакцин. Экспериментальные серии разработанных препаратов изготавливали в период с 1-996 по 2002 г.г. в лаборатории микробиологии ВНИИЗЖ. За этот период было произведено: 7 серий вакцины против сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной (всего 4 075 132 доз), 3 серии вакцины против

пастереллеза свиней инактивированной эмульсионной (1 281 ООО доз), 7 серий вакцины ассоциированной против пастереллёза и сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной (1 368 ООО доз).

Проверку противоэлизоотической эффективности экспериментальных серий перечисленных выше вакцин проводили в ряде неблагополучных по пастереппёзу и сальмонеллёзу хозяйствах Нижегородской, Ульяновской, Смоленской и Тульской областей РФ, а также трёх хозяйствах Херсонской области Украины. Вакцины применяли согласно наставлениям по применению, т. е. свиноматок вакцинировали однократно за 40-45 суток до опороса в объёме 1,0 см5. Полученных от них поросят иммунизировали двукратно с 20-25 суточного возраста с интервалом 20 дней, в объёме 0,5 см3. Животным всех возрастных групп вакцины вводили внутримышечно, в области верхней трети шеи.

Непосредственно под нашим наблюдением вакцины были применены на крупном свиноводческом комплексе ОАО "Ильиногорское' Нижегородской области, где использование препаратов в течение 1999-2002 г.г. позволило сократить заболеваемость на 16-20%, летальность - на 4-5%.

В частности, применение только ассоциированной вакцины против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной в этом хозяйстве позволило снизить количество выделений возбудителя сальмонеллеза в исследуемом материале С 6.2% в 1999 г. до 4.3% в 2002 г.

Таким . образом, результаты широких производственных испытании

г

разработанных инактивированных эмульсионных вакцин против пастереллеза и сальмонеллёза свиней показали, что разработанные вакцины безвредены, слабореактогенны и обладают высокой эффективностью.

Выводы.

1. Разработаны моновалентные и ассоциированная вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза свиней инактивированные эмульсионные, характеризующиеся безвредностью, низкой реактогенностью, выраженной антигенностью и и ммуногенн остью.

2. Оптимизированы условия культивирования производственных штаммов сальмонелл и пастерелл, обеспечивающие накопление бактериальной массы через 10 часов выращивания для сальмонелл в пределах 40-60 млрд.м.к./см3, а для пастерелл 15-20 млрд.м.к./см*.

3. Определены основные параметры кинетики инактивации ДЭИ (М-(р-аминоэтип)зтиленимин) сальмонелл и установлены существенные различия в константах скорости инактивации некоторых серовариантов (для в. сЬоЬгаеэшв к =6,84 ч'\ для Э. (урМтилит к =3,84 ч'\ для 3. сЭиЬИп к =3,64 ч*\ 1 для 5. етегШсКэ к =6,06 ч"), которые необходимо учитывать при расчете продолжительности времени инактивации.

4. Определены основные параметры кинетики инактивации ДЭИ пастерелл (для Р. тиПосМа серовар А №115 к =6,62 Ч'\ для Р. тиНос!с1а серовар А N31231 к =6,84 ч1, для Р. тиНосИа серовар В к «7,24 ч"1 и для Р. тиИос1£1а серовар О к =7,09 ч'*). на основании которых отработан режим их инактивации.

5. Установлено, что при инактивации ДЭИ сальмонелл штаммов сЬ^егаеБига №370, 3.1урЫтипит №371, 5. (1иЫ1п №373, 3. еп1елШз N07 и пастерелп штаммов Р. шиНосйа №115 серовар А, Р. гпиНосийа №1231 серовар А, Р. тиКосйа №656 сероаар В и Р. тиНосУа №9 серовар О, изменяются морфологические и тинкториальные, но сохраняются антигенные свойства бактерий,

6. Иммуногенная активность (ИцЕЬо.) опытных образцов вакцин против сальмонеллеза и пастереллеза, полученных инактивацией ДЭИ, превосходила иммуногенную активность таких же вакцин, но полученных при инактивации формалином, в 4.7 и 4.3 раза соответственно.

7. Получены количественные характеристики иммуногенноети (ИмДзо) по каждому штамму бактерий в отдельности как для лабораторных животных, так и для саиней, на основании которых определены необходимые количества антигена, стимулирующего иммунный ответ, достаточный для защиты от заражения летальной дозой вирулентного гомологичного штамма.

8. Для определения расчетной концентрации каждого антигена в стандартной прививной дозе вакцины в технологию изготовления вакцин после процесса инактивации введен этап концентрирования бактериальной суспензии посредством низкоскоростного центрифугирования с последующим приготовлением необходимых концентраций бактериальных суспензий (в прививной дозе должно содержаться* 2 млрд. м.к. антигена каждого серовара).

9. На основе непрямого твердофазного варианта ИФА разработаны тест-системы, предназначенные для количественного определения противосальмонеллезных и противопастереллезных антител rio уравнению регрессионной зависимости в сыворотках крови свиней при тестировании их в одном разведении, характеризующиеся высокой чувствительностью и специфичностью.

Практические предложения. Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю инактивированных вакцин против сальмонеллеза и пастереллеза свиней, в нормативные документы по изготовлению и контролю иммуноферментных тест-систем для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subspecies entérica и Pasteurella multocida в сыворотках крови свиней, утвержденные Департаментом ветеринарии, а также в полученные патенты на изобретения:

1. «Вакцина против сальмонеллеза свиней икактивированная эмульсионная» ТУ 9384-093-00495527-02; ;

2. «Вакцина против пастереллеза свиней икактивированная эмульсионная» ТУ 9384-094-00495527-02;

3. «Вакцина ассоциированная против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инэктивированная эмульсионная» ТУ 9384-065-00495527-01;

4. «Набор ИФА для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subspeces enterica в сыворотках крови свиней» ТУ 9388-001-00495527-; '

5. «Набор ИФА для выявления антител к бактериям Pasteurella multocida в сыворотках крови свиней» 2002 ТУ 0388-002-00495527-2002

6. Патент на изобретение №2162340 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней» 2001 г.;

7. Патент на изобретение №2162339 «Способ изготовления эмульсионной противопастереллеэной вакцины» 2001 г.;

8. Патент на изобретение №2173560 «Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционых болезней бактериальной этиологии животных и птиц» 2001 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пат. 2173560 Россия, МПК7 А61К 39/102, Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционых болезней бактериальной этиологии животных и птиц t Русалеев B.C., Гневашев В.М,, Прунтоеа О.В., Гусев A.A., Селиверстов В.В.

2. Пат. 2162340 Россия, МПК7 А61К 39/102. Способ изготовления вакцины против сальмонеллеэа свиней / Гусев АЛ., Толокно в A.C., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Колотилова Т.Г.

3. Пат. 2162339 Россия, МПК7 А61К 39/102. Способ изготовления эмульсионной противопастереплезной вакцины / Гусев A.A., Русалеев B.C., Сосницкий А.И., Гневашев В.М., Прунтова О.В.

4. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М. Применение ИОА для выявления лротивосальмонеллезных антител у свиней // Ветеринария. - 2001. -№12. -С. 18-20.

5. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Колотилова Т.Г„ Потехин А. И. Инактивация сальмонелл д им ером этиленимина// Биотехнология. -2001. -№б. - С.43-46.

6. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Селиверстов В.В., Колотилова Т.Г., Потехин A.B. Антигенная активность бактерий Salmonella choteraesuis и Pasteurella multoclda в ассоциированной вакцине при инактивации димером этиленимина // Сельскохозяйственная биология. - 2003. - №6. — С. 94-99,

7. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Селиверстов В.В., Колотилова Т.Г., Потехин A.B. Инактивация Pasteurella muttocida димером этиленимина // Ветеринария. - 2003. - №7. - С.22-24,

8. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В. Бактериальные вакцины в свиноводстве II Ветеринария. - 2001. - Ns6. - С. 18-21.

9. Русалеев B.C., Прунтова О.В., Гневашев В.М., Толскжш A.C. Профилактика сальмонеллезов молодняка сельскохозяйственных животных II РацветИНФОРМ. -2002. -№11. -С.30-31.

10. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М. Смешанная бактериальная инфекция в патологии молодняка сельскохозяйственных животных и птицы // Пробл.инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез .докл. конф. - Владимир, - 1997. - С. 190.

11. Прунтова О.В., Мудра к Н.С., Манвелян Г, С. Получение сальмонеллезных жгутиковых антигенов ft Пробп. инфекц, патологии с.-х. ж-ных: Тез докл.конф. -Владимир. -1997. - С. 191.

12. Русалеев B.C., Кулаков В.Ю., Гневашев В.М., Прунтова О.В. Опыт применения ферментативного гидролизата крови, как основы питательных сред при

культивировании сальмонелл // Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. - Владимир. -1997. - С, 187.

13. Гневашев В.М., Прунтова О.В., Кулаков В.Ю. Кинентика реакции агглютинации бактерий Salmonella choleraesuis // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных; Тез. докл. конф. - Владимир, -1997. - С. 191-192.

14. Русалеев B.C., Кулаков В.Ю., Гневашев В.М„ Прунгсвз О.В. Использование модифицированной среды высушивания при изготовлении живых сухих сальмонеллезных вакцин И Пробл, инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. - Владимир. - 1997. - С. 189-191.

15. Кулакоа В.Ю., Русалеев B.C., Гнеаашев В.М., Прунтова О.В. Суспензионное культивирование бактерий рода Salmonella U Пробл.инфекц,пагологои с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф, - Владимир, - 1997. - С. 192193.

16. Прунтова О.В., Мудрак Н.С., Гневашев В.М., Колотилова Т.Г., Потехин A.B., Шадроаа Н.Б. Применение непрямого варианта ИФА для выявления противосапьмонеллезных и противопастереплезных антител в сыворотках крови свиней // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и зкзотич, болезнями ж-ных: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящен. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998. - С. 369-371.

17. Прунтова О.В., Мудрак Н.С., Гневашев В.М., Колотилова Т.Г., Потехин A.B., Шадрова Н.Б. Оценка сыворотск крови по одному разведению при иммуноферментной диагностике сапьмонеппеза и ластереллеза свиней // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и окзотич. болезнями ж-ных; Матер. Междунар, научно-практ, конф,, посвящен, 40-летию ВНИИВВиМ. -Покров. - 1998. - С. 368-369.

18. Гневашев В.М., Русалеев B.C., Прунтова О.В., Копотило83 Т.Г., Потехин A.B., Шадрова Н.Б, Уровень колостральных и поствакцинальных антител против Salmonella choleraesuis в сыворотке крови свиней // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотич, болезнями ж-ных: Матер. Мехдунзр. научно-практ, конф., посвящен. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998. - С. 371-372.

19. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В,, Колотилова Т.Г., Потехин A.B., Шадрова Н.Б. Сравнительное изучение иммуногенной и антигенной активности инакгивированных противосальмонеллезных вакцин // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотич. болезнями ж-ных: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящен. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998, - С. 372-373.

20. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О,В., Колотило в а Т.Г., Потехин A.B., Шэ дрова Н.Б. Разработка вакцины против сальмонеллеза свиней инахтивированной сухой бивалентной с растворителем II Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотич.болезнями ж-ных: Матер. Между кар .научно-лракт. конф., посвящен. 40-летию ВНИИВВиМ. — Покров. - 1S98. -С, 238-245.

21. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М.. Сосницкий А.И., Шадрова Н.Б., Колотилова Т.Г., Потехин A.B. Применение иммуноферментного анализа для оценки противоластереллезного реконвалесцен тного и поствакцинального антительного ответа у свиней // Уч. Зал. Витебской гос. акад. Вет, Мед. - Т. 35. - Ч. 1. - Витебск, 1999. - С. 121-123.

22. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гнееашев В.М., Колотилова Т.П, Потехин A.B., Шадрова Н.Б. Применение иммуноферментного анализа для оценки противосальмонеллезного реконвалесцентного и поствакцинального антительного ответа у свиней // Экологмч. аспекты эпизоотол. и патологии ж-ных: Междунар.н.-произв.конф. г. Воронеж, 19-21 мая 1999 г. - Воронеж. • 1999. - С. 127-128.

23. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Колотилова Т.Г., Потехин A.B., Шадрова Н.Б. Разработка вакцины против сальмонеллеза свиней эмульсионной ин активирован ной II Экологич. аспекты эпизоотол. и патологии ж-ных: Между на р. н.- произв. конф. г. Воронеж, 19-21 мая 1999 г, - Воронеж. • 1999. - С. 132134.

24. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Колотилова Т.Г., Потехин A.B. Использование димера эти лени мина в качестве инактиванта при изготовлении противосальмонеллезных вакцин II Пр-во и контроль мед., вет.преп-ов, опыт применен.и реал из. их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-пет. ФГУП ПЗБ. — Вольгинский. - 1999. - С. 54.

25. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Сосницкий А.И., Шадрова Н.Б., Колотилова Т.Г., Потехин А.И. Разработка ассоциированной вакцины против пастереплеза и сальмонеллеза свиней эмульсионной инакгивированной II Уч. Зап. Витебской гос. акад. Вет. Мед.-Т. 35.-Ч. 1.-Витебск, 1999.-С. 127-129.

26. Прунтова О.В., Русалеев В.С„ Гневашев В.М., Потехин A.B., Колотилова Т.Г„ Шадрова Н.Б. Серологическая оценка противосальмонеллезного поствакцинального антительного ответа у свиней II Научн.основы произ-ва вет.биол.лреп.: Тездокл,- Щелково. - 2000. - С. 259-260.

27. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Ручнова О.И., Шадрова Н.Б. Видовой спектр энтеробактерий, выделенных от свиней с диарейным

синдромом И Диагност., проф. и меры борьбы с особо опасными, экэотическ, и зооантропоноз. боп. ж-ных: Сб. статей Меяудунар.науч.-прзкт.конф, 15-16 августа 2000 г„ Покров. - Покров. - 2000. - С. 241-243.

28. Колотилова Т.Г., Русалеев B.C., Прунтова О.В., Гневашев В.М., Потехин A.B. Сравнение скорости роста S.choleraesuis и S.typhimurium при гпубинном культивировании Я Диагност., лроф. и меры борьбы с особо опасными, экзотическ. и зооантропоноз, бол. ж-ных: Сб. статей Между нар. науч,-пра кг. конф. 15-16 августа 2000 г., Покров. - Покров, 2000. - С. 241-243.

29. Потехин A.B., Русалеев B.C., Прунтова О.В„ Гневашев В.М. Определение вирулентности различных серовэриантов PasteureHa multocida на лабораторных животных // Научн.осноеы произ-ва вет. биоп. преп: Тез. докл.- Щелково, - 2000. • С, 129-130.

30. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Потехин A.B., Колотилова ТГ. Лабораторная модель для оценки иммуногенности и нактивиро ванных протиаопастереллеэных вакцин // Диагност., проф. и меры борьбы с особо опасными, зкзотическ. и зооантропоноз. бол. ж-ных: Сб. статей Между нар науч. -грант.конф. 15-16 августа 2000 г., Покров. - Покров. - 2000. - С. 237-238,

31. Потехин A.B., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Сосницкий А.И., Колотилова Т.Г., Шадроаа Н.Б, Количественная оценка иммуногенной и антигенной активности ассоциированной вакцины против сальмонеллезд и пастереллеза свиней /I Достижения молодых ученых - ß вет.прахт. (Матер.конф.молодых ученых). - Владимир. - 2000. - С. 96-101.

32. Колотилова Т.Г., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О,В, Ислольэовние питательной среды для глубинного культивирования сальмонелл после многократной термической стерилизации // Научн.основы лроиз-ва вет, биол, преп: Тез. докл.- Щелково. - 2000. - С, 178.

33. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Потехин A.B., Колотилова Т.Г., Шадроаа Н.Б. Изучение иммуногенной активности ассоциированной вакцины против пастереллеза и сальмонеллеза свиней эмульсионной инакгивированной / // Актуал. Пробл. Патол. с.х.жив-ных: Мате р. между нар. научно-практ.конф. - Минск -2000. - С .323-324,

34. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Ручнова О.И., Шадрова Н.Б. Сравнительное исследование крови свиней на наличие протиеоиерсиниозных антител в ИФА и реакции агглютинации // Актуал. Пробл. Патол. с.х.жив-ных: Матер .между нар, научно-практ.конф, Минск-2000. -С.318-319,

35. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Колоти лова Т.Г., Потехин А.И., Шадрова Н.Б. Оценка активности пастереллезных антигенов в И OA // Уч. Зал. Витебской гос. акад. Вег. Мед, - Т. 37. -Ч. 2.— Витебск. -2001. - С. 137-138,

36. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Колотилова Т.Г., Потехин A.B., Шадрова Н.Б, Антигенная и иммуногенная активность пастереллезных антигенов, инактивированных димером этиленимина при различных условиях хранения У/ Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вег. л реп.: Теэ.д охл. М. - 2001. - С. 53-54.

37. Русалеев B.C., Прунтова О.В., Гневашев В.М., Колотилова Т.Г., Потехин A.B. Инактивация пастерелл и сальмонелл димером этиленимина // Уч. Зап. Витебской гос. акад. Вет. Мед. - Т. 37.-Ч. 2.-Витебск. -2001.-С. 135-137.

38. Потехин A.B., Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В. Сравните л ьная оценка эмульсионных вакцин против паетереллеза свиней на лабораторных животных // Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вет. преп.: Теэ.д окл. М,- 2001. — С. 54-55.

39. Потехин А.И. Русалеев B.C. Прунтова О.В., Семенова Г.М, Выбор масляного адью ванта для эмульсионной инактивирвоанной вакцины против паетереллеза свиней / // Пробл.зоошжен.вет.мед.: Зб.наук.лраць «Вег.на унии .-В и п. 7 (31). Матер. 5-го зЧзду пзраэитоценолопв УкраЫи.- Харькив. - 2001.- С. 312-315.

40. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Потехин A.B., Колотилова Т.Г., Семенова Г.М. Антигенные и иммуногенные свойства инактивированной эмульсионной вакцины против паетереллеза свиней И Сучасм вет.та технол.аспекти свинарстеа: 36.матер.науково-лракг.конф. - Кит. - 2002. - С, 30-31.

41. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Потехин A.B., Колотилова Т.Г., Семенова Г.М. Изучение колострального иммунитета при пастереллеэе у поросят // Сучасн1 вет.та технол.аспекти свинарстеа: Зб.матер.науково-лракт.конф. -Knie. - 2002. - С. 33-34.

42. Русалеев B.C., Гневашев В.М., Прунтова О.В., Потехин A.B., Колотилова Т. Г., Семенова Г.М. Определение напряженности и продолжительности поствакцинального иммунитета у свиней против паетереллеза Л Сучасм вет.та технол.аспекти свинаротва: Зб.матер.науково-практ.конф. — Knie. - 2002. - С, 31-32.

43. Потехин A.B., Русалеев B.C., Прунтова О.В., Гневашев В.М., Колотилова Т. Г. Иммуногенная активность вакцины против сальмонеллеза свиней инактивирвоанной эмульсионной после длительного хранения //Науч.основы технол.произ-ва ввт.б иопреларатов: Сб. докл. Междунар.конф.молодых ученых. -Щелково. 2002. - С. 97-98.

М20 6 9g