Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка режимов инактивации пастерелл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка режимов инактивации пастерелл"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ . ЕКСПЕШЕНТАШЮЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я.Р.КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКОЙ .АКАДОШ1Л СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

г г " .

На правах рукописи

БУШУЕВА Наталия Борисовна

РАЗРАБОТКА РЕЖИМОВ ИНАКТИВАЦИИ ПАСТЕРЕЛЛ 03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

А' в тореферат

. диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва -

1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель:

- доктор биологических наук М.Я.ЯРЦЕВ.

Научный консультант:-

- доктор биологических наук, профессор А.М.ПОВЕРЕННЫЙ.

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, профессор М.А.СИДОРОВ;

-'кандидат биологических наук, старший научные сотрудник Л.Б.СОЙОВЬ1

Ведущая организация: Московская ветеринарная академия им. К.И. Скрябина. - '

Защита диссертации состоится 199^ г. в . " часо]

на заседании специализированного совета Д 020.28.01 по защите диссе] таций на соискание учёной степени доктора наук при Всероссийском нау но-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии км. Я.Р Коваленко -по адресу: 109472, Москва, Кузьминки,-ВИЬВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭД.

Автореферат разослан "к 199<^г.

Учёный секретарь специализированного

совета, кандидат ветеринарных наук Ф.Г.Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для профилактики бактериальных и вирусных инфекций применяют живые и инактивированные вакцины. В качествес живых вакцин обычно используют аттенуированные или гибридные штаммы и направленные мутанты. Однако применение живых вакцин связано с определенными сложностями: при непрерывных пассажах на искусственных питательных средах не всегда удается сохранить иммуногенность микроорганизма в неизменном виде, необходимо учитывать возможность реверсии вирулентности. Применение вакцин, полученных методами генной инженерии, ограничено законодательством многих стран, особенно в вопросах, касающихся освобождения рекомбинантных микроорганизмов в окружающую среду (Г. Хайдер, 1981; It И. Зодор, В. И. Черное, 1987;' С. Wit, G.Corea, 1989; A.Goerlich, М. Кг arm i ch, 1989; P. P. Pastoret, 1990).

Вследствие этого, во многих случаях предпочтительнее использовать инактивированные вакцины, которш .подразделяются на традиционные корпускулярные вакцины, инакхкггфованкые каким-либо химическим или физическим инактивантом, и бесклеточные вакцины, которые могут содержать растворимые проте^ивные- антигены, субклеточные компоненты или синтетические протективные антигены. В последнее десятилетие в мировой практике наблюдаются тенденции к разработке инактивированных вакцин. Наиболее перспективными являются бесклеточные вакцины на основе протективных антигенов бактерий, поскольку эти препараты безвредны и хорошо стандартизуются, но в настоящее время и обычныэ корпускулярные вакцины являются важной частью правильно сбалансированных программ иммунопрофилактики, особенно в ве-терккарии (D. Maskell, G. Dou-jan, 1988; D. J. Rowlands, 1988; L. A. Babiuk, 1988; У. C.Jordan, 1989; Л. Bobbins," 1990).

К преимуществам инактивированных вакцин относятся отсутствие опасности размножения микроорганизмов и реверсии вирулентности, обеспечение более однородного иммунного ответа в стаде, возможность создания пассивного иммунитета у потомства путем иммунизации беременных самок. Инактивированные вакцины легче комбинировать, чем живые, т.к. отсутствует проблема интерференции микроорганизмов, возникающая при совместном введении, некоторых живых вакцин (S.Eske-lund, 1981; D.Shapiro, 1985; T.T.Brown, 1987).

Биологическая промышленность нашей страны выпускает около 20 инактивированных вакцин и анатоксинов, однако общепринятые режимы инактивации, разработанные в основном в 60-е годы, недостаточно эффективны и нуждаются в усовершенствовании. Основными их недостатками являются избыточное, количество инактиванта, чаще всего формальдегида (ФА), вводимого в бактериальную культуру, неоправданно затянутое время инактивации и проведение процесса инактивации в том же реакторе, где производится культивирование бактерий.

Инактивированные вакцины широко применяются при профилактике пастереллеза животных и птиц, поскольку с созданием крупных комплексов пастереллез широко распространился во всем мире. Исследования по этому вопросу проводятся практически во всех европейских государствах, США, . Канаде, Японии и т.д., что свидетельствует о внимании к этой проблеме и ущербе, наносимом пастереллезом. хозяйству многих стран. Многочисленные исследования подтверждают разнообразие антигенных, иммуногенных и вирулентных свойств пастерелл, что создает значительные сложности при совдании эффективных средств специфической профилактики (ß. R. Carter, 1972; Sh.Namioka,- 1978; А. Н. Борисенкова, 1979; К. A. Brogden, R. В. Rimler, 1982; M.Bisgaard, S. Houghton и др., 1991).

Живые вакцины, используемые для профилактики пастереллеза, часто обладают значительной остаточной вирулентностью и реактоген-ностью и, кроме того, могут вызывать развитие длительного паетерел-лоносительства. Инактивированные вакцины свободны от этих недостатков, но обычно имеют недостаточно высокую иммуногенность, причем снижение иммуногеиности как правило объясняют действием инактиван-та, повреждающего поверхностные антигенные структуры пастерелл (А. Н. Борисенкова, 1984; Ь. Окегшап, Ь. Бралс^, 1989; В. Реге1шап, 0. На^геЬ и др., 1991). Таким образом, пастреллы являются перспективной моделью для разработки щадящих режимов инактивации бактерий, т. к. можно попытаться оценить влияние процесса инактивации на их иммуногенность.

Цели и задачи исследования. Цель работы - разработка цедящих режимов инактивации пастерелл, отработка технологии инактивации пастерелл в лабораторных условиях, оценка возможности использования предложенных режимов и технологии в производственных Г'словиях.

В, соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- разработать щадящий режим инактивации пастерелл при совместном действии сублетальной концентрации ФА и УФ-излучения в сублетальной дозе;

- разработать ездящий режим инактивации пастерелл при совместном действии сублетальной концентрации ФА и нефизиологической температуры ( > 37 ОС );

- разработать рекомендации по технологии инактивации микроорганизмов в щадящих режимах;

- испытать предложенные режимы.инактивации в производственных условиях;

- оценить влияние режимов инактивации на иммуногенность пасте-

релл.

Научная новизна. Разработаны щадящие режимы инактивации бактерий при совместном действии инактивантов различной физико-химической природы в сублетальных концентрациях и дозах, обеспечивающие в 2,0 - 2,5 раза более высокую иммуногенность инактквированных пасте-релл, по сравнению с режимом инактивации, используемым при производстве пасткреллезных вакцин в биологической промышленности.

' Предложен способ получения инактивированной вакцины мезофиль-ных бактерий, защищенный (в соавторстве) авторским свидетельством N 1225074 от 15 декабря 1985 г. с приоритетом от 19 января 1984 г.

Предложена технология инактивации пастерелл в установке для инактивации микроорганизмов, защищенной (в соавторстве) авторским свидетельством N 1266032 от 22 июня 1986 г. с приоритетом от 26 февраля 193Е г.

Разработаны щадящие режимы инактивации антигенов Р. ти11ос1с1а сероваров А,В и Л, используемых для получения противопастереллезных сывороток.

Предложен способ получения гипериммунной сыворотки против рес пираториых заболеваний крупного рогатого скота,' защищенный (в соавторстве) авторским свидетельством N 1795582 от 8 октября 1992 г. с приоритетом от 19 июля 1990 г.

Получено положительное решение от 20 мая 1991 г. (заявка N 4366683/13 (080285) на выдачу авторского свидетельства) на способ получения сыворотки для лечения и профилактики пастереллезов сельскохозяйственных яивотных, преимущественно свиней, пушных зверей и «оликов.

У|рШ':тиче£кая_ ®лность_работы. Результаты проведенных' исследо-использованы пщ производстве опытно-промьшшенных серий сыво-

ротки против пастереллеза, сальмонеллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и сыворотки против пастереллеза свиней, кроликов и путаных зверей на Орской биофабрике.

Раеработая регламент технологического процесса инактивации пастерелл 1 лабораторный) в установке для инактивации микроорганизмов при совместном действии ФА и УФ-излученкя и ФА и нефизиологической температуры (>37 ОС).

Примененные в работе методологические подходы к созданию инак-гивированных пастереллезных биопрепаратов могут быть использовали при проведении исследований и разработке технологии изготовления других инактивированных бактериальных вакцин и антигенов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на четвертом Всесоюзном биохимическом съезде ( Ленинград, 1979 1, Всесоюзной конфе-рэнции "Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов" (Москва, 1981), второй и третьей Всесоюзных конференциях "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов" (Щелково, 1981, 1987), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и Продовольственная программа" (Киев, 1989), Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций" (Алма-Ата, 1991).

Публикации. По материала»/ диссертации опубликовано 9 научных работ, получено 3 авторских свидетельства и 1 положительное решение.

Объем диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах маши-' нолисного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы (182 источника, в том числе 95 иностранных). Работа ил-

люстрирована 7 рисунками, 11 фотографиями и £2 таблицами. Приложение на 44 страницах включает 154 патентных' источника, лабораторный регламент технологического процесса инактивации пастерелл и акты комиссионного контроля опытно-промышленных серий сывороток против пастереллеза сельскохозяйственных животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в 1982-1992 г. г. в лаборатории консервирования биопрепаратов, лаборатории лечебных сывороток и биостимуляторов и отделе противобактерийных препаратов ВНИиТИБП и является частью исследований по усовершенствованию технологии изготовления инакти-вированных биопрепаратов.

В работе использовали бактериальные культуры Escherichia coll штамм 675, P. multocida 2-го авирулентного (пастеровского) штамма, вирулентного штамма 712, вирулентных штаммов Л-71. Т-72, Б-70 и 915, использовавшихся для изготовления вакцины против пастереллеза кур и индеек на Сумской биофабрике, и P. multocida вирулентных штаммов 8683 (серовар А), 656 (серовар В) и Т-18 (серовар Д), использо-вавимхся для получения поливалентной гипериммунной сыворотки против пастереллеза сельскохозяйственных животных.

Лиофилизированная культура Е. coli шт. 675 была получена из ВГЫКИ тзетпрепаратоБ, затем ее культивировали в 5-литровой бутыли со средой Хоттингера в течение 24 ч при 37 ОС, центрифугировали при скорости вращения 2000 об /мин., отмывали физиологическим раствором, смешивали с сахарозо-желатиновой средой, фасовали по 4 мл в пенициллиновые флаконы и высушивали на сублимационной установке

"Юзифруа". Стандартизованные таким способом лиофилизированные образцы использовали для получения бактериальных суспензий Е.coli шт. 675 при проведении многофакторного эксперимента по оптимизации ре-' жима инактивации и в опытах по исследованию кинетики инактивации бактерий.

Работа с производственными вирулентными штаммами P. multoclda Д -71, Т-72, Б-70 и 915 проводилась на Сумской йиофабрике.

Культивирование P. tail toe i da штаммов 8683, 656 и Т-18 проводили в лаборатории микробиологии ВЮВ.

Многофакторный эксперимент по оптимизации режима инактивации бактерий проводили на модели бактериальной суспензии Е.coli шт.675 по методу Бокса. В качестве инактивантов использовали ФА и его производное - мок жтилолглицин (ММГ), раствор ФА в трехкратном молярном избытке глицина.

Инактивацию бактериальных суспензий Е.coli ст. 675 и P.multoci-da nrr. 712, пастеровского и производственных вирулентных штаммов при" совместном действии ФА и УФ-излучения и ФА и повышенной (>37 ОС) температуры проводили в лабораторной установке для инактивации бактерий. 1

Концентрацию вводимого в бактериальную суспензию ФА определяли иодометркчес!им методом, дозу У О-излучения - методом уранил-оксала-товой агашгамзтрни (Л. П. Кренков, 1976; В. Нойес, ЕБекельхайд, 1951).' Количество жизнеспособных бактериальных клеток на разных стадиях инактивации (КОЕ/мд) определяли методом подсчета колоний, выросших на плотной питательной ерэде: для Е.coli использовали агар Хэттингера, для пастерелл - кровяной агар. 'Стерильность инакгивиро-ваняых образцов бактериальных суспензий проверяли пересевами на МПБ, МПА и ЫППБ.

Обработку результатов исследований кинетики инактивации Е.coli пгг.675 и Р. multocída шт. 712, пастеровского и производственных вирулентных штаммов проводили методом наименьших квадратов (ЕЮ.Урбах, 1964). ¿

При исследовании серологической активности инактивированных бактерий в РА использовали образцы бактериальной суспензии Е. coli шт. 675, инактивированные 0,1% ФА при 37 ОС (имитация производственного режима); 0,05% ФА при 37 ОС; 0,02% ФА и УФ-облучением и О, 02% ФА при 45 ОС и образцы инактивированных в тех же режимах бактериальных суспензий Р. multocída пастеровского штамма и производственных вирулентных штаммов. Концентрация всех образцов перед постановкой РА была доведена до 1,0 млрд. кл/мл по оптическому стандарту. Агглютинирующие сыворотки получали на кроликах весом 2,5-3,0 кг, РА проводили общепринятым методом и рассчитывали средние арифметические титров агглютинации и доверительные интервалы средних арифметических ( И. П. Воробьев, А. А. Ашмарин, 1962).

Проверку иммуногенных свойств инактивированных бактериальных суспензий проводили на 90-120-дневных курах в два этапа: 1) предварительная проверка (согласно инструкции по изготовлению и контролю эмульсин-вакцины против пастереллеза кур и индеек) с целью выявления образцов, перспективных для дальнейших исследований и Z) определение ЗД/50 инактивированных 'оораецов методом постоянной дг.аы антигена. Параллельно с определением ЭД/50 ь каждум опыте проводили определение ЛД/50 культуры Р. multocída шт. 712, использовавшейся для заражения.

Расчет и статистическую оценку величин ЭД/50 инактивированных образцов бактериальнй суспензии Р. multocída шт. 712 производили по методике Кербера в модификации И. П. Воробьева и А. А. Ашмарина.

Одновременно с определением иммуногенности было проведено исследование антигенной активности в РА сывороток крови кур, иммунизированных, инактивированными в различных режимах образцами бактериальной суспензии Р. multocida шт. 712 .

У иммунизированной птицы на 8-е и 16-е сутки после иммунизации брали кровь из подкрыльцовой вены - у 5 кур из каждой группы при предварительной проверке иммуногенности и у 10 кур из каждой группы при определении ЭД/50. В качестве антигена для РА использовали культуру Р. multocida шт. 712, инактивированнуто О,ЗХ формалином в течение 72 ч при 37 ОС. Перед постановкой РА антиген разводили до концентрации 1,0 млрд. кл /мл, затем 0,5 мл антигена добавляли к 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки и выдерживали 18-20 ч при 37 ОС. Результаты РА оценивали по четырехплюсовой системе и рассчитывали средние геометрические титров агглютинации и доварите льные интервалы для средних геометрических (И. П. Воробьев, А. А.Аш-марин, 1962).

Электронно-микроскопическое исследование пастерелл инактивиро-ванных в различных , режимах Проводили на электронном микроскопе "ДЮМ-100 Б".

Результаты исследований

1. ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ЩАДЯЩИХ РЕЖИМОВ ИНАКТИВАЦИИ БАКТЕРИЙ

1.1. Многофакторный эксперимент по оптимизации процесса инактивации бактерий на модели Е. col i шт. 675 .

Для .обоснования щадящих режимов инактивации бактерий нами был

проведен многофакторный эксперимент по оптимизации процесса инактивации на модельной бактериальной суспензии Е.coli авирулентного штамма 675 ФА и его производным - ММГ. Было исследовано влияние • концентрации бактериальной суспенэии, конечной концентрации инакти-вэнта в бактериальной суспензии, pH, температуры и времени инактивации ни ннлиьНем&еть бактерий. Б результате были получены неполные квадратна уравнения,. ад<-кьагко описывающие процесс инактивации Е. col i шт. 075 ФА и ММГ. Рыло ¡¡оказано, что наибольшее влияние на ироц»-с<.' инактиьации «жирным №жц*нт1>ация инактивннтн в бактериальной «.-усп^нс'ии, ьр'-мя и ч'емпер^гур* инактивации. При проведении мног< >l*tKi-<.ч'Ного '-Koiii-1'имгнтм мы ' м' ра'ничилиоь выявлением Акторов ьарьироьсшия, окаьыьсиищйх uiipe4cjiiiiüui(se ьлияние' на параметр оптимизации - выживаемость бактерий, т.к. дальнейшее проведение эксперимента было бы связано с необходимостью учитывать еще один параметр оптимизации - нммуногенность получаемого препарата, на которую увеличение концентрации инактиванта и повышение температуры инактивации выше определенных пределов оказывают отрицательное влияние.

Проведенный эксперимент также выявил равноценность инактиваци-онных возможностей ФА и ММГ, что согласуется с данными других авторов (М. И. Парфанович, А. М. Поверенный и др., 1979; Л. Б. Эльберт, Е. Ф. Ефимова, 1981).

1.2. Исследование кинетики инактивации бактерий Е.coli шт. 675 и пастерелл при совместном действии кчактивантов ■ различной физико-химической природы

В работах А. М. Поверенного и его сотрудников было показано, что при проведении инактивации бактерий ФА при температуре 45-47 ОС

наблюдается выраженное синергичеекое действие ФА и указанных температур на жизнеспособность клеток, а также исследован механизм си-нергического действия ФА и УФ-облученйя в сублетальных концентрациях и дозах на жизнеспособность бактерий. На основании этих данных было сделано предположение, что можно существенно уменьшить количество вводимого в бактериальную суспензию инактиванта, если проводить процесс инактивации при совместном действии ФА и УФ-излучения или ФА и повышенной температуры (45 ОС).

Выла исследована кинетика инактивации и рассчитаны константы скоростей инактивации бактерий Е.col i и пастерелл пастеровского штамма ФА различных концентраций в диапазоне температур 37-45 ОС. Показано, что при проведении инактивации при 45 00 можно уменьшить концентрацию ФА в бактериальной суспензии до 0,02%.

Также была исследована кинетика инактивации бактерий Е. col i и

\

пастерелл пастеровского штамма при совместном действии ФА в сублетальной концентрации (0,02%) и УФ-излучения в сублеталькой дозе - ' 0,5 Дж/м?

Обработка полученных результатов методом наименьших квадратов показала, что процесс инактивации бактерий при совместном действии инактивантов различной физико-химической природы описывается кинетическим уравнением первого порядка, общий вид которого: У - В,- В, X , где У = lg (N:/N„ Д) - логарифм процента выживаемости бактерий; X - время инактивации, сек; В, и В, - ¡коэффициенты регрессии ( В,- константа инактивации). ■

В результате этих исследований мы пришли к выводу, что можно добиться полной и необратимой инактивации микроорганизмов в течение 4-6 ч и уменьшить количество вводимого в бактериальную суспензию ФА в 5-7 раз, по сравнению с концентрациями'ФА, обычно используемыми

при изготовлении, инактивированных вакцин в биологической промышленности (0,10-0,15%), если проводить процесс инактивации бактерий при совместном действии 0,02% ФА и УФгизлучения "в дозе 0,5 Дж/маили при совместном действии 0,02% ФА и температуры 45 ОС.

Разработанные на Р. multocida пастеровского штамма щадящие режимы инактивации пастерелл были испытаны в условиях Сумской биофабрики на пастереллах производственных вирулентных штаммов Д-71, Т-72, Б-70 и 915, использовавшихся для изготовления инактивирован-ной вакцины против пастереллеза птиц. Показано, что полная и необратимая инактивация 24-часовой культуры пастерелл концентрации 21 -24 млрд. кл /мл, полученной из реактора, происходила за 4-6 ч, следовательно, разработанные нами режимы инактивации не потребовали изменений при переходе с пастеровского штамма на производственные.

Были получены инактивированные в разработанных режимах образцы культур пастерелл, использовавшихся для изготовления трех производственных серий вакцины, в качестве контрольных образцов были взяты образцы; бактериальных суспензий тех же серий, инактивированные в производственных условиях. Эти образцы вместе с образцами бактериальных суспензий Е.coli шт.675 и Р. multocida пастеровского штамма, инактивированных в разработанных наш щадящих режимах и режиме, имитирующем производственный, использовали для исследования их серологической активности в РА.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ И ИММУНОГЕНШХ СВОЙСТВ БАКТЕРИИ, ИНАКТИВИРОВАННЫХ В ЩАДЯЩИХ РЕЖИМАХ

2.1. Исследование серологической активности инактивированных бактерий в РА

В работе испольэовали образцы бактериальных суспензий Е. colí

шт. 575, инактивированные 0,02% ФА при 45 ОС в течение 6 ч; при совместном действии 0,02% ФА и УФ-излучения в дозе 0,5 Дж/м^с последующей инкубацией в темноте при 37 ОС в течение 6 ч; 0,05% ФА при 37 ОС в течение б ч и 0,10% ФА при 37 ОС в течение 24 ч (имитация производственного режима), а также образцы инактивированных в тех же режимах пастерелл пастеровского и производственных вирулентных штаммов.

Агглютинирующие сыворотки получали на кроликах весом 2,5-3,0 кг, стандартным антигеном Е. coli шт. 675 служила микробная взвесь концентрации 3,0 млрд. кл /мл, прогретая при 65 ОС в течение 35 мин. Схема иммунизации:' 0,3; 0,6; 1,0; 1,5 и 2,0 мл антигена с интервалом 4-5 суток между инъекциями в краевую вену уха кролика.

В качестве стандартного антигена Р. multocida пастеровского штамма использовали бактериальную суспензию с концентрацией 1,0 млрд. кл/мл, инактивированную 0,3% формалином в течение 72 ч при 37 ОС. Схема иммунизации: 2 мл антигена вводили подкожно, затем через' 7 суток вводили 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,0; 3,0 мл антигена с интервалом 4-5 суток мегзду инъекциями в краевую вену уха кролика. Сыворотку'на производственные штаммы пастерелл получали аналогично, используя в качестве стандартного антигена инагстивированный 0,05% ФА при 37 ОС в течение 6 ч образец производственной бактериальной суспензии.

Была получены статистически достоверные титры агглютинации этих образцов с сыворотками, полученными на кроликах. Показано, что наибольшей активностью в РА отличались образцы всех бактериальных суспензий, инвктизированных 0,02% ФА при 45 ОС. Все микроорганизмы, инаотивированныэ при совместном действий 0,02% и УФ-излучения, проявляли активность в РА, близкую к активности образцов, инзктизи-

оованных в производственном или имитирующем производственный режим.

2.2. Определение иммуногенности бактерий Р. multocída агг. 712, инактивированных в различных режимах

Для исследования иммуногенных свойств пастерелл, инактивированных в различных режимах, было решено использовать Р. muí too ida вирулентного штамма 712, т. к. условия культивирования производственна»- Вирулентных штаммов Д-71, Т-72, Б-70 и 916 и качество получаемой бактериальной суспензии не позволяли установить различия в иммуногенности инактивированных в производственных упловиях пастерелл, зависящие от режима инактивации. В работе использовали 18-часовую культуру Р. multocída шт. 712, инактивированную в разработанных нами щадящих режимах, в режиме, имитирующем производственный, и е дополнительном режиме, позволяющем, по сравнению с производственным, вдвое уменьшить количество ФА, вводимого в бактериальную суспензию, и сократить время инактивации до Б ч. Последний режим бш предложен на случай, если бы оброазцы бактериальной суспензии, инактивированные в одном из щадящих режимов, оказались неиммуноген-ныш. "

Предварительные опыты, проведенные согласно инструкции по изготовлению и контролю эмульсин-вакцины против пастереллеза кур i индеек , показали, что все исследованные образцы обладали хорош; выраженными иммуногенными свойствами, что позволило в дальнейше! работе исключить "страховочный", дополнительный режим инактивации i обойтись без применения адъкжанта.

Р ОПЫТ'ЧХ по опр»ДОЛЕЧИ" Щ'ТЛ И^ПЪЧЬЗОРЪЧИ пбряянн }в-'«ООВО! кульчуры P. W'jîLuOlua un. 71 г. H.niKTiI»f!;>OftaHnt>e ri [\'М ро^им.-)*" flp:

совместном действии 0,02% ФА и УФ-излучения в дозе о.п Дж'м* I последующей инкубацией в темноте при 37 00 в течение & ■■ ^ ре ним ФА+УФ); при совместном действии 0,02% ФА и 45 ОС в течение 4 ч (ре жим ФА+Т) и в режиме, имитирующем производственный, - 0,10% ФА, 37 ОС, 24 ч (режим ПР). Иммуногенность образцов проверяли на курах в возрасте 3-4 месяцев, ЭД/50 определяли методом постоянной дозы антигена. В каждом опыте на контрольной группе птиц проводили определение ЛД/50 культуры Р. тиИос!с1а шт. 712, использовавшейся для заражения, т.к. эта величина варьировала в различных опытах.

Параллельное определение ДЦ/50 позволяло выразить определяемые величины ЭД/50 в относительных единицах (в ЛД /60) и давало, возможность сравнивать уровни иммунологического ответа (выраженные- количеством ЛД/50 вирулентного штамма, которому противостоят 50£ имуни-зированных птиц) в различных опытах, что было бы невозможно при расчете ЭД/50 классическим методом, только в абсолютных единицах.

Результаты определений ЭД/50 представлены в табл. 1.

Расчеты ЭД/50 проводили по формуле:

УД/50 Ды - 5 - 0,5 ), где Д„ - максимальная из

испытанных доз, £ - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей. - отношение числа птиц, погибших от введения данной дозы, к общему числу птиц, которым эта доза была введена, су-

мма значений Ьс. , найденных для всех испытанных доз.

Результаты расчетов приведены в табл. 2.

Таблица 1

Сводная таблица результатов опытов по определению ЭД/ЬО образцов бактериальной суспензии Р. тиШхПйа шт. 712, инаетивированных в различных режимах

1 1 Режим | инакти-| вации | Доза гараже -НИИ, мл 1 ! 1 1 ОПЫТ I | Число Падеж Ц| ' птиц | ■ 1 2 ОПЫТ | Число Падеж Lj. | птиц | 3 опыт Число Падеж L; птиц

ФА+УФ | Cl.bxio' 0,5x10* 0,5x10* 0, bXlQ 1 I 8* 1 8 1 8 1 8 I 6 2 1 0 б/а | 2/8 | 1/8 | 0/8 | 'J* 9 9 9 8 7 1 0 8/9 | 7/9 | 1/9 j 0/9 | 9* 9 9 9 7 4 . 1 0 7/9 4/S 1/9 0/9

<ШТ I 0,5x10 o.bxio4 0,5x1 о' 0,5x10 1 | 10 | 10 | 10 | 10 1 7 2 1 0 7/10| 2/10| 1/10| 0/101 9* 9 9 У 6 5 2 0 6/9 | 5/9 | 2/9 | .0/9 | 10 10 10 10 7 5 2 0 7/10 5/10 2/10 0/10

IIP | o.bxio' o.bxi'o1 0,5x10s 0. 5x10* о о о о \ 6 4 2 1 6/101 4/10| 2/10| 1/10» 10 10 10 10 У 8 3 1 9/101 8/10| 3/101 1/10! 9* 9 9 9 8 5 . 3 0 8/9 6/9 3/9 0/9

Koirr- ! роль | (опред. | ЯД/50) | 1 0,5x1 б3 0,bxl6" 0,5x1q" o.nxio' г | 7 1 7 ! 7 1 7 1 , - 5 2 1 0 5/7 | . 2/7 | 1/7 i 0/7 | ........ j б 6 6 6 Б 4 Z 0 5/6 I 4/6 I 2/6 | 0/6 | i 6 6 6 6 6 2 1 0 . 6/6 2/6 1/6 0/6

Примечание: * - число птиц в подгруппах меньше 10 вследствие неспецифической гибели птицы в период мсиду иммунизацией и заражением.

Таблица 2

Результаты расчетов средних геометрических и доверительных интервалов ЭД/50 бактериальных суспензий Р. multocida шт. 712, инактиви-рованных в различных режимах

Режим 1 опыт 2 опыт | 3 опыт X (геом.)

инакти- ЭД/50, ЭД/50 ЭД/50, . ЭД/50 1 ЭД/50, ЭД/50 (в W50)

вации мл f 1 ЛД/50) мл (в ЛД/50) I мл (в ДЦ/50)

ФА+УФ 1:84,3 104,2 1:379,2' 113,6 11:136,2 146,8 120,2

(77.6-186,2)

ФА+Т 1:63,2 139,0 1:176,0 244,9 ¡1:158,9 125,9 ' 162,6

Г (66,7-397,2)

ПР 1:126,2 69,6 1:769,2 54,1 11:379,2 52,7 58,3

• (39,8-85,5)

Конт- 1: 8787 - 1: 43103 11:20000 - -

роль

(ЛД/50) 1 1 | 1 -------- ., .

Поскольку значение верхней границы доверительного интервала (доверительные интервалы приведены в скобках в табл. 2) для ЭД/50 образца, инактивированного в режиме, имитирующем производственный, превышает значение нижней границы доверительных интервалов для

ЭД/50 образцов, ииактивированных в разработанных наш щадящих режимах. оценку достоверности различий ЭД/50 исследованных образцов проводили по формуле:

' Х^ ■ Х*^ I > tp З^^/п, - 1/Ид. где п, и - числа

опытов, в которых получены средние Х,^ и Х^ .. - коэффициент Стыоденга, причем число степеней свободы п* - п< + - 2» и

— г.

х - х^ ), + О le х - х^

n + п - 2

Расчеты показали, что различия между ЭД/50 образцов, инактиви-рованных в щадящих режимах, и образца, инактивированного в режиме, имитирующем производственный, достоверны с вероятностью 95%. Статистически достоверных различий между ЭД/50 образцов, инактивиро-ванных в щадящих режимах, не обнаружено. Таким образом, установлено, что иммукогенность образцов P. multocida шт. 712.. инактивирован-ных при совместном действии ФА и УФ-излучения в еуйдетальных концентрации и дозе и при совместном действии сублетальной концентрации ФА и повышенной температуры, в 2,0-2,5 раза превышает иммукогенность контрольных образцов, инактивированных в режиме, имитирующем производственный.

2.3. Исследование в РА сывороток крови птиц, иммунизированных инактивированными культурами P. multocida шт. 712

Одновременно с определением ЭД/50 инактивированных пастерелл

проводили исследования сывороток крови иммунизированных птиц в РА для определения ответной реакции на введение антигена. В предварительных опытах было установлено, что титры антит.ел в крови иммунизированных птиц в реакции с гомологичным антигеном достигали максимума на 15-е сутки после иммунизации и затем оставались неизменными до контрольного заражения на 21-е сутки. Поэтому для определения динамики образования антител сыворотки крови птиц получали на 8-е и 16-е сутки после иммунизации, РА-ставили по общепринятой методике и рассчитывали средние геометрические титров агглютининов- (из 30 значений) и их доверительные интервалы. Как на 8-е, так и на 16-е сутки, наибольшую активность в РА проявляли сыворотки крови птиц, иммунизированных образцами культур Р. гшиосШа шт. 712, инактивирован-ными 0,02, X ФА при 45 ОС в течение 4 ч (1:292 и 1:422). Результаты РА с сыворотками крови птиц, иммунизированных образцами, инактиви-рованными при совместном действии 0,02% ФА и УФ-излучекия (1:186 и 1:266), и образцами, инактивированными в режиме, имитирующем производственный (1:149 и 1:225), достоверно не отличались ¿руг от друга. Таким образом, прямой корреляции между иммуногенностью инакти-вированных пастерелл и накоплением антител в сыворотках крови иммунизированных ими птиц не наблюдается, что согласуется с данными других авторов ( А. И. Лебедева, 1982).

Следовательно, по величине титров агглютинирующих сывороток в РА образцы можно расположить в следующем порядке: 0,03% ФА, 45 ОС,4 ч > 0,02% ФА+УФ, 37 ОС, 5 Ч > 0,10* ФА.37 ос,24 Ч

?.. 4. Электронно-микроскопическое исследование пастерелл, инактивированных в различных режимах

Анализ электронограмм и визуальные наблюдения инактивированных иастерелл пастеровского штамма и шт. 712 показали, что при всех исследовавшихся режимах инактивации основная масса клеток морфологически не изменена и имеет характерные для Р. тиН^осШа размеры и форму. Анатомически такие клетки представлены трехслойной клеточной стенкой и цитоллазматической мембраной, плотно прилегающей К цитоплазме. Обычно в них хорошо просматриваются рибосомы, полисомы, мембранные образования и тонкофибриллярная структура нуклеоида. В клетках на различных стадиях деления видны фигуры деления и почкующиеся фрагменты.

Более подробный анализ электронограмм инактивированных пасте-релл как пастеровского штамма, так и штамма 712, свидетельствует о повреждениях или изменениях, возникших под действием ФА или обусловленных явлениями протеолитического расщепления в результате остаточной активности ферментов клеток, подвергшихся инактивации. В образцах суспензий пастерелл, инактивированных при совместном действии сублетальной концентрации ФА и повышенной температуры, наблюдали наиболее выраженные изменения основных структур клеток, размеры которых увеличивались, а форма округлялась. Указанный режим обеспечивал инактивацию ферментов и фиксацию ультраструктур клеток, однако сравнительно высокий температурный режим и низкая концентрация* ФА, по-видимому, обусловливали нарушение проницаемости мембраны, что приводило к появлению набухших, крупных клеток с "грыжевид-ными" выступами клеточной стенки.

Концентрация ФА, использовавшаяся для инактивации бактериаль-

ных суспензий в производственных и имитирующих производственные условиях, обеспечивала инактивацию бактериальных клеток и стабилизацию ультраструктур, но не приводила к полному блокированию ферментативной активности, в результате чего в препаратах обнаруживали большое число клеток с очагами лизиса и автолиза, наблюдаемыми в отдельных случаях по всей плоскости среза.

Особенно большое количество таких, представленных полностью ьаиуетеьшими клеточными стенками, эдектронно-оптически прозрачных клеток (до 5QX от общего числа) наблюдали в.иниктиьированных в производственном режиме на Сумской Сиофабрике образцах вирулентных штаммов цаетерелл Д-71, Т-72, Б-'70 и S15, жшольвобаьюжсн. для изготовления :?муль<.'ин-ракцины против пасгерелде** кур и индеек.

Инактивация при совместном действии 0,0Т-:~ <1<А и УФ-излучения, максимальную сохранность мор'!"-1 лотки и ультраетруктуры ПУСТ»-*;'"-,»л: клетки, ИнактИВИрОЪаННЫе Ь атом Пра.КТИЧеОКЙ Hé

отличаг') <Н' Кл-ТУК НеИЬаКТИЫ'!роЪаННЫХ ьулм-^п.

тчпучЕНКе у,кд кт VBKR'iF А.КНЫХ Р-ЩАДНи^К-' гКЗ«ИМЕ АпТИГККОБ ? янунрц, для ^т.тлкгания гг-îkpa- •

.Î;Fh"H->Ï i ИГ!?Fй!ЯС»'Нп0»5 скгг.р.-д-ни uFC'TKB .•.КЧЬ-'К- .ЗЮчЯИПГББННЫХ ЙЬТЛГЧЫХ

п'. и' ••'./[•-•,''"Ьаний «*клк«чл-

НИе, Ч-j ' • |:;ч» »i»f rtMMyH«"-KriHX .•fexfHi-r >lj *-1!Н{'*•!'< ИН-чК'ГИ-

вированных с КямИ щаД^щид {»-лИМ , К 11-.« <.\ИуЧ-1иХ Ког-

да ОСОбеННО важным '-'>>.иаНеНИ>- КЛеТоЧНЫл i-'^Kryi',

ОТ которых оависит ИММУНОГеННОСТЬ ilpeUàpam, СЛеДУ«* ИОЦиЛЬНОЬаТЬ режим инактивации при совместном действии сублетальной концентрации

ФА и УФ-излучения в сублетальной дозе, т.к. клетки, инактивирован-ные в зтом режиме, . практически не отличаются, согласно данным электронно-микроскопических исследований, от клеток исходных куль-

I

тур (до инактивации). В случаях, когда от препарата требуется создание высокого уровня антител в иммунизируемом организме, например, • при получении инактивированного антигена для иммунизации животных-продуцентов в сывороточном производстве, предпочтительнее использовать режим инактивации при совместном действии сублетальной концентрации ФА и повышенной температуры (45 ОС).

Этот режим был использован для получения инактивированных антигенов Р. muí toe ida шт. 8683 (серовар А), шт. 656 (серовар В) и шт. Т--80 (серовар Д), применяемых для получения гипериммунной сыворотки против пастереллеза сельскохозяйственных животных. Исследование кинетики инактивации пастерелл указанных штаммов показало, что, несмотря на имевшие место различия в термостабильности (при '45 ОС) этих штаммов, полная и необратимая инактивация 6-часовых культур пастерелл всех сероваров происходила при совместном действии 0,02% ФА и 45 ОС за 4 ч.

Превентивная активность сывороток, полученных с использованием антигенов, инактивированных в разработанном нами пддящем режиме, удовлетворяет принятым в биологической промышленности стандартам, что удостоверяется актами комиссионного контроля опытно-промшлек-ных серий сывороток против пастереллеза, сальмонеллээа, парагриппа--3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и против пастереллеза свиней, кроликов и пушных зверей, изготовленных на Ор-ской биофабрике. .

ВЫВОДЫ

1. Разработаны щадящие режимы инактивации пастерелл при совместном действии 0,02% ФА и УФ-излучения в дозе 0,5 Дж/м*и при совместном действии 0,02% ФА и температуры 45 ОС, позволяющие умень-' шить количество вводимого в бактериальную суспензию ФА в 5-7 раз, по сравнению с производственным режимом, и сократить время инактивации с 24 ч до 4-6 ч.

2. Предложено проводить процесс инактивации бактерий в указанных режимах в установке для инактивации микроорганизмов, в которой можно осуществлять равномерное смешивание инактиванта с бактериальной суспензией р поток*, в небольшом объеме, последующую обработку ОактсрИсгльной суопеньии о ЬБ(-данным ь нее инактивантом УФ-излучени- • ем и инкубацию инактивируемой бактериальной суспензии при заданной температуре до окончания процесса инактивации.

Разработан лабораторный регламент инактивации пастерелл в щадящих режимах в установке для инактивации микроорганизмов.

3. Исследована кинетика инактивации P. multooida шт. 712, пастеровского штамма, производственных вирулентных штаммов Д-71, Т-72, Б-70, 915, использовавшихся для изготовления эмульсин-вакцины против пастереллеза кур и индеек, вирулентных штяямов 8683 (серовар А), 656 (серовар В) и Т-80 (серовар Д), использующихся для изготов-' ления сывороток против пастереллеза с/х животных, в разработанных шздящих режимах. Показано, что несмотря на различия в термостабильности штаммов, режимы практически не нуждаются в корректировке или требуют очень незначительных изменений, касающихся времени инактивации, при работе с различными штаммами пютерелл, даже относящимися к разным серовара|"\

4. Проведено электронно-микроскопическое исследование влияния режимов инактивации на морфологию и ультраструктуру пастерелл, показано, что микроорганизмы, инактивированные при совместном действии 0,02% ФА и УФ-излучения в дозе 0,5 Дж/мгсохраняют морфологию и ультрасг1'руктуру в максимальной степени и их электронограммы практически не отличаются от электронограмм неинактивированных пастерелл, t ■} время 1С6К наибольшие изменения наблюдаются в клетках, инакти-вированных при совместном действии 0,02% ФА и температуры 45 ОС.

5. Показано, что разработанные щадящие режимы можно использовать для инактивации пастереллевных культур концентрации 20-2Б млрд. кл /мл, полученных в реакторах в производственных условиях Сумской биофабрики.

6. На Р. multocida шт. 712 показано, что использование шадящих ре-жимов инактивации позволяет в 2,0-2,5 раза повысить иммуноген-ность инактивированных культур пастерелл , по сравнению с культурами, инактивированными в производственном режиме.

7. Предложено использовать режим инактивации при совместном действии 0,02% ФА и температуры 45 ОС для получения инактивированных янтигенпр, р. multocida шт. 8683, шт. 656 и шт. Т-18, используемых при иы-<лиьл»"мии '.'ыещ-отки против пастореллеза сельскохозяйственных жичотных. Опытно-промышленные серии сывороток против пастереллеза, иальмонеллеьа, парагриппа-З и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого ско^а и против пастереллеза свиней, пушных зверей и кроликов, изготовленные на Орской биофабрике в 1991 г. удовлетворяли существуют, im нормативным требованиям и были рекомендованы к широким производственным испытаниям.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований использованы при производстве опытно-промышленных серий сывороток против пастередлеза сельскохозяйственных животных на Орской биофабрике..

Предложен способ получения гипериммунной сыворотки против ре1 спираторных заболеваний крупного рогатого скота (авторское свидетельство N 1795582, 1992) и способ получения сыворотки для лечения и профилактики пастереллезов сельскохозяйственных животных, преимущественно свиней, пушных зверей и кроликов (положительное решение по заявке N 4866683/13 (080285), 1991).

Предложены способ получения инактивированной вакцины мевофиль-ных бактерий (авторское свидетельство N 1225074, 1985) и установка для инактивации микроорганизмов (авторское свидетельство N 1266032, 1986).

■ СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Антигены Р. ш1и>с1с!а, инактивированные в . щадящем режиме/ ЕВ. Бушуева, Г. Ф. Коломнина, Н. Н. Немчинов, К К ГалиСина// Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов. Сборник научных трудов ВГНКИ. - М. , 1989. - С. 91-95.

2. Бушуева Е Б. К обоснованию.параметров режима инактивации бактерий// Научн. основы технологии пром. производства вет. биопрепаратов. Тез. докл. второй Всесоюзной конф. - М, 1981. -• V. £0 -91.

3. Бушуева Н. Б., Сапегина Е. П., Козловская А. Ы. Щадящие режимы инактивации пастерелл// Научн. основы технологии пром. производства вет. биопрепаратов. Тез. докл. третьей Всесоюзной конф. - М., 1987. -С. 172-173.

4. Еушуева Н. Б., Токарик Э. Ф., Поверенный А. М. Обоснование параметров режима инактивации бактерий// Разработка, апробация и государственный контроль вет. препаратов. Тез. докл. ■ Всесоюзной конф. - М. , 13.Я1. - П. 41-¿Л.

5. Взаимодействие формальдегиды и ме'млольнйх проиякодннх аминокислот с белками/ Г. М.Ротт, ИХ А. Семин, Н. Б. Бушуева, A. Ü Поьйрунный // Четвертый Всесоюзный биохимический съезд. Тез. научн. сообщений. - М. , 1979.- Т.З. - С. 151-152.

6. Влияние режима инактивации на морфологию и ультрьетруктуру микробных клеток/ Е В. Бушуева, Б. Е. Блехерман, Е В. Галибина, А. М. Поверенный // Передовой науч. -произвол, опыт в биолог, промышл.: Ш ВНИиТИБП. - М, 1985.- N 10. - С. 1-3.

7. Влияние режимов инактивации на иммуногенность пастерелл/ Е Б. Бушуева, Е. TL Салегина, М. Я. Ярцев и др. // Ветеринария. - 1987. - N 6.- С. 28-30.

8. Использование щадящего режима инактивации для получения антигенов Р. multoc i da/ ЕВ. Бушуева, Г. Ф. Коломнкна, ЕЕНэмчшов, Е В. Галибина// Биохимия с/х животных и Продовольственная программа. Тез. докл. Всесоюзного, симпоз. - Киев, 1989. - С. 29.

'9. Использование аедязцих режимоз инактивации для получения антигенов Р. muí toe ida и Р, hastialyt i са/ Е Е. Бгу'ауеьз, Г. Ф. Коломнина, Е Е Галибина и др. // Биотехнология и биофизика микробных популяций. Тез. дока. Всесоюзной конф.- Алма-Агз, 1991.- С. 42.