Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин"

ХАБАРОВ Александр Константинович

РАЗРАБОТКА ПРОЦЕССА ХЕМОСТАТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПАСТЕРЕЛЛ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ВАКЦИН

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, иммунология, микология с токсикологией и эпизоотология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ХАБАРОВ Александр Константинович

РАЗРАБОТКА ПРОЦЕССА ХЕМОСТАТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПАСТЕРЕЛЛ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ВАКЦИН

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, иммунология, микология с токсикологией и эпизоотология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ВОРОБЬЕВА Галина Ивановна доктор ветеринарных наук, профессор СУББОТИН Владимир Викторович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко»

Защита диссертации состоится 29 апреля 2005 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский район, пос. Биокомбинат, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан « 28 » марта 2005 г.

Научный руководитель

кандидат биологических наук

РАЕВСКИЙ Александр Андреевич

Научный консультант

доктор ветеринарных наук

АПАЛЬКИН Виктор Александрович

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди инфекционных заболеваний, наносящих животноводству и птицеводству большой экономический ущерб, значительное место занимают пастереллёзы. Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается повышением концентрации поголовья на ограниченной территории, что является предрасполагающим фактором к заболеванию пастереллёзом. Экономический ущерб от этого заболевания складывается из потерь от падежа, вынужденного убоя животных и затрат на проведение профилактических и лечебных мероприятий.

Технология изготовления бактериальных вакцин многоаспектная проблема, ключевым направлением которой является разработка управляемых процессов культивирования микроорганизмов.

В настоящее время в биологической промышленности получение бактериальной массы микроорганизмов для изготовления вакцин основано на периодическом способе культивирования, в течение которого свойства клеток и состав культуральной среды непредсказуемо изменяются.

По данным ряда исследователей наиболее эффективным по накоплению биомасссы бактерий, является хемостатное культивирование с лимитированием по источнику углерода.

Продуктивность непрерывного (хемостатного) выращивания микроорганизмов значительно превышает продуктивность периодического метода.

Поэтому весьма перспективны исследования, направленные на организацию процессов управляемого культивирования и, в частности, на непрерывные способы выращивания микроорганизмов, позволяющие создавать и длительное время поддерживать культуры с постоянной и точно определённой концентрацией биомассы, фазой и скоростью роста, а также с соотношением протективных антигенов.

Хемостатное культивирование микроорганизмов, при лимитировании их роста источником углерода, представляет собой весьма перспективное на-

3

правление при производстве ветеринарно-биологических препаратов, и в частности, средств специфической профилактики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц бактериальной этиологии.

В связи с вышеизложенным, весьма актуальным является исследование роста пастерелл в хемостатном режиме, получение биомассы пастерелл при этом способе выращивания, изготовление из нее опытных серий вакцин и исследование их иммуногенности.

Цель и задачи исследований. Цель работы - исследование и разработка процесса хемостатного культивирования Ра^еигеИа ти11оа«)а при производстве вакцин против пастереллёза сельскохозяйственных животных и птиц.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучение зависимости концентрации жизнеспособных пастерелл от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде;

- определение основных технологических характеристик хемостатного культивирования Ра51еиге11а ти!Юс1с!а (удельной скорости потребления глюкозы, экономического коэффициента, продуктивности по выходу микроорганизмов);

- разработка методики непрерывного (хемостатного) культивирования микроорганизмов в биореакторах;

- изготовление и испытание опытных образцов вакцин из пастерелл 2-го авирулентного (пастеровского) штамма, штаммов АВ и К Краснодарской НИВС, атак же штаммов А-8683, В-681, Д-Т-80.

Научная новизна работы. Впервые разработан способ хемостатного культивирования Раз1еиге11а тикоЫс1а Пастеровского штамма для производства вакцин. Данный метод применен для выращивания и других штаммов пастерелл.

Изучен характер роста РаБ1еиге11а тикоасЬ в непрерывном (хемостатном) режиме при лимитирования роста пастерелл глюкозой.

Получена зависимость концентрации пастерелл от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы (хемостатная кривая). Установлено отличие хемостатной кривой пастерелл от классической хемостатной кривой, описываемой теорией Моно.

Определены условия, при которых хемостатная культура пастерелл переходит на другой тип лимитирования (S0 и D).

В результате проведённых исследований определены оптимальные режимы хемостатного культивирования пастерелл для производства вакцин.

Практическая значимость работы. На примере Pasteurella multocida 2-го авирулентного (пастеровского) штамма впервые разработана методика непрерывного (хемостатного) культивирования микроорганизмов в биореакторах, которая была апробирована на штаммах АВ и К Краснодарской НИ-ИВС, А-8683, В-681, Д-Т-80.

Публикация результатов исследованиий. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы.

Апробация работы. Представленные в диссертации материалы доложены на международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2004), международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ФГУП "Щелковский биокомбинат" "Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее" (Щелково, 2004).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены

на 102 страницах машинописного текста, иллюстрированы 11 рисунками, 4 *f

таблицами и дополнены приложением. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список литературы, состоящий из 155 источников, в том числе 58 иностранных, приложение.

2. Собственные исследования

Работа выполнена в отделе разработки промышленной технологии изготовления противобактерийных препаратов и лаборатории разработки технологии сублимационного высушивания ВНИТИБП РАСХН.

2.1. Материалы и методы

При проведении экспериментов по хемостатному культивированию использовали в качестве объекта исследования культуру Раз1еиге11а тиНоаДа, 2-ой авирулентный (пастеровский) штамм, штаммы АВ и К Краснодарской НИИВС, штаммы А-8683, В-681, Д-Т-80.

Культивирование пастерелл в режиме непрерывного хемостатного выращивания проводили на многофункциональном лабораторном комплексе приборов и устройств АНКУМ-2М.

В процессе работы использовали производственную питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Перед засевом пастерелл в среду добавляли 0,1 % глюкозы в пересчёте на сухое вещество в виде 40%-ного раствора.

Содержание глюкозы в культуральной жидкости определяли антроно-вым методом, рН - потенциометрически, парциальное давление растворённого в среде кислорода (р02) - датчиками СКБ БП (г.Пушино), окислительно-восстановительный потенциал (ЕЬ) - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО-01.

Биореактор оснащён устройством слива по уровню, необходимым при работе в непрерывном режиме и позволяющим установить необходимый постоянный объём культуральной жидкости в аппарате. Подача питательной среды, растворы глюкозы и ЫаОН в биореактор осуществляли с помощью дозирующих устройств из соответствующих ёмкостей. Управление подачей

питательных растворов в режиме "хемостат" обеспечивало ручное задание

6

суммарного расхода жидкостей, при неизменных соотношениях компонентов питательной среды.

Физико-химические параметры при культивировании пастерелл поддерживали на определённых ранее оптимальных уровнях. В биореакторе поддерживали рН культуральной жидкости на уровне 7,8-8,2 ед., парциальное давление растворенного кислорода (р02) на уровне 30-40 % от насыщения кислородом воздуха. Процесс хемостатного выращивания пастерелл осуществляли при температуре 37 °С.

На каждой скорости разбавления после установления стационарного режима культуру выдерживали не менее 7 периодов генерации.

Проверку типа лимитирования осуществляли путем определения концентрации глюкозы в культуральной жидкости.

В процессе работы хемостатная культуру пастерелл исследовали по следующим показателям:

- морфология (микроскопирование мазков, окрашенных по Граму и Рома-новскому-Гимзе);

- культуральные свойства путём высева штаммов на МПА и МПБ;

- ферментативные и биохимические свойства (рост культуры на средах Гисса, образование сероводорода и индола);

- жизнеспособность (методом последовательного титрования на чашках Петри с кровяным агаром);

- оптическая плотность (на фотоколориметре КФК-2 и блоке оптической плотности БОП-5 аппаратуры АНКУМ-2М).

Характеристики процесса хемостатного культивирования: удельную скорость потребления глюкозы, экономический коэффициент и продуктивность по выходу микроорганизмов при различных скоростях разбавления и начальных концентрациях глюкозы в питательной среде рассчитывали по общепринятым методикам.

2.2. Результаты исследований

Ранее в отделе противобактерийных препаратов ВНИТИБП проведена работа по изготовлению вакцин из бактериальной массы Р.тикоаёа Пастеровского штамма с применением управляемого периодического культивировании. Это позволило приступить к исследованиям и разработке непрерывного (хемостатного) культивирования пастерелл.

2.2.1. Изучение зависимости концентрации жизнеспособных пастерелл пастеровского штамма от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде.

После культивирования пастерелл в периодическом режиме процесс переводят в хемостатный путем осуществления непрерывной подачи питательной среды в ферментер и постоянного оттока культурапьной жидкости из него.

Основными факторами, с помощью которых можно управлять процессом хемостатного выращивания микрооганизмов являются скорость разбавления - О (отношение скорости подачи питательной среды в биореактор к его объему) и начальная концентрация лимитирующего рост фактора (глюкозы) в питательной среде - Бо-

При начальной концентрации глюкозы в питательной среде 1 и 3 г/л концентрация жизнеспособных пастерелл с увеличением скорости разбавления и соответственно удельной скорости роста монотонно уменьшается (рис.1). Причем у этой зависимости наблюдается два участка. До 0= 0,9-1,0 1/час концентрация пастерелл снижается с 33 млрд/мл микробных клеток до 8 млрд/мл при 80=3 г/л, а при начальной концентрации глюкозы в питательной среде равной 1 г/л снижение концентрации микроорганизмов с увеличением скорости разбавления происходит с 28 млрд/мл до 4 млрд/мл. На втором участке при Э>0,9-1,0 1/час концентрация жизнеспособных пастерелл

стабилизируется и остается постоянной вплоть до вымывания.

8

Хж, млрд/мл

О 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2

D, 1/час

Рис.1. Зависимость концентрации жизнеспособных пастерелл (Х„) от скорости разбавления (D) и начальной концентрации глюкозы в питательной среде (So) при \емостат-ном культивировании.

При увеличении начальной концентрации глюкозы в питательной среде количество микроорганизмов увеличивается, что наблюдается во всем диапазоне скоростей протока. Концентрация жизнеспособных пастерелл с увеличением скорости разбавления монотонно уменьшается при всех исследованных начальных концентрациях глюкозы.

Снижение концентрации пастерелл с увеличением скорости разбавления наблюдается также и при уровне начальной концентрации глюкозы в питательной среде равном 10 г/л. Концентрация микроорганизмов постепенно уменьшается с 34 млрд/мл при D=0,3 1/час до 7 млрд/мл при D=l,8 1/час.

Концентрация хемостатной культуры пастерелл при уровне глюкозы К) г/л превышает таковую при S=1 и Зг/л.

Это позволяет сделать вывод, что хемостатные кривые пастерелл отличаются от классической хемостатной кривой, описываемой теорией Моно. Отличие состоит в том, что при малых скоростях разбавления наблюдается увеличение концентрации пастерелл. При S()=10 г/л, это в какой то мере,

можно объяснить сменой лимитирующего фактора. При меньших начальных концентрациях глюкозы, вероятно, при малых скоростях разбавления, когда лимитирующая рост глюкоза используется почти до нуля, пастереллы вместо нее начинают потреблять продукты метаболизма, способные заменить данный субстрат.

Поскольку вымывание культуры происходит при скоростях разбавления больших, чем 1,8 1/час, максимальную скорость роста пастерелл в данных условиях можно оценить этим значением.

Результаты исследований процесса хемостатного культивирования пастерелл показали, что:

- при 50=1 и 3 г/л у зависимости Хж от О наблюдаются два участка: до скорости разбавления равной 0,9-1,0 1/час концентрация пастерелл монотонно снижается, а при О>0,9-1,0 1/час до скорости разбавления 1,8 1/час концентрация пастерелл остается постоянной;

- при 8о=10 г/л зависимость Хж от О носит ниспадающий характер, концентрация пастерелл равномерно снижается до скорости разбавления равной 1,8 1/час;

- с увеличением 80 концентрация пастерелл возрастает, что доказывает лимитирование их роста источником углерода - глюкозой;

- при 0> 1,7-1,8 1/час происходит вымывание культуры пастерелл.

2.2.2. Определение концентрации глюкозы в культурапьной жидкости

В условиях, когда глюкоза является лимитирующим фактором, рост культуры зависит от ее концентрации в культурапьной жидкости.

Исследовали зависимость концентрации глюкозы в культурапьной жидкости от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы и установили, что при 50=1 и 3 г/л концентрация глюкозы до скорости разбавления 1,8 1/час остается практически на одном уровне, что доказывает лимитирование роста пастерелл глюкозой.

При 50=10 г/л и 0>0,8 1/час происходит смена типа лимитирования, что подтверждается увеличением концентрации глюкозы в культуральной жидкости.

Как показали экспериментальные данные хемостатного культивирования пастерелл в условиях лимита глюкозы, концентрация лимитирующего рост субстрата почти во всём диапазоне скоростей разбавления равна 0,6 г'л. Только в режимах близких к критическому значению скорости разбавления, остаточная концентрация субстрата становится значительной величиной.

Лимитирование роста пастерелл в хемостатном режиме осуществляется глюкозой при 80=1 и 3 г/л и 0=0,3-1,8 1/час, а так же при 80=Ю г/л и В=0,3 -0,8 1/час. При 5о=Ю г/л и 0>0,8-1,0 1/час, хемостатная культура пастерелл переходит на другой тип лимитирования, так как данный режим культивирования протекает в условиях избытка глюкозы.

На основании экспериментальных данных можно сделать вывод, что хемостатная культура пастерелл может находиться в нескольких физиологических состояниях;

- при малых скоростях протока (0<0,8-0,9 1/час) и концентрации глюкозы в питательной среде 1 и 3 г/л культура характеризуется тем, что концентрация пастерелл монотонно уменьшается с увеличением скорости разбавления. Удельная скорость потребления глюкозы близка к нулю. Выделение кислых продуктов метаболизма незначительно. Рост пастерелл лимитирован глюкозой

- при скоростях протока больших 0,8-0,9 1/час и концентрации глюкозы в питательной среде 1 и 3 г/л выявлено, что концентрация пастерелл не зависит от скорости разбавления и остается постоянной вплоть до вымывания. Удельная скорость потребления глюкозы и удельная скорость выделения кислот начинают возрастать, рост пастерелл происходит в условиях лимита по глюкозе;

- при 80= 10 г/л концентрация пастерелл уменьшается с увеличением скорости разбавления, удельная скорость потребления глюкозы и выделение

11

кислых продуктов значительно больше, чем при начальной концентрации глюкозы в питательной среде 1 и 3 г/л. При П>0,8-1,0 1/час наблюдается увеличение концентрации глюкозы в культуральной жидкости и хемо-статная культура пастерелп переходит на другой тип лимитирования.

2.2.3. Определение экономического коэффициента

На каждой скорости разбавления определяли экономический коэффициент, который характеризует долю субстрата, израсходованную на синтез биомассы и показывает какое количество микроорганизмов можно получить в результате потребления определённого количества субстрата.

Установлено, что экономический коэффициент уменьшается с ростом начальной концентрации глюкозы в питательной среде. Экономический коэффициент увеличивается при малых значениях скоростей разбавления. Этот факт можно объяснить тем, что условиях лимита глюкозы величина текущей остаточной концентрации субстрата близка к нулю. При малых скоростях разбавления она становится настолько малой, что микробные клетки для поддержания жизнедеятельности начинают потреблять свои же продукты обмена. Поэтому экономический коэффициент при малых скоростях разбавления имеет более высокие значения.

2.2.4. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелп при хемостатном культивировании

Продуктивность по выходу показывает то количество микроорганизмов, которое можно получить с единицы объёма биореактора за единицу времени.

Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл зависит от начальной концентрации глюкозы в питательной среде. Каждому значению 80 соответствует своя кривая зависимости продуктивности по выходу жизнеспособных пастерелл от скорости разбавления (рис.2).

12

Величина продуктивности увеличивается по мере увеличения начальной концентрации глюкозы и неоднозначно зависит от скорости разбавления. Кривая зависимости продуктивности при начальной концентрации глюкозы в питательной среде равной 10 г/л имеет один максимум в диапазоне скоростей разбавления 1,0-1,2 1/час и составляет при этом 17,5 млрд/мл-час. Максимальная продуктивность по выходу пастерелл при 8„=3г/л наблюдается при 0=0,6-0,7 1/час и 1,6-1,8 1/час и равна 14,2 и 13,7 млрд/мл-час соответственно. При уровне начальной концентрации глюкозы в питательной среде равном 1 г/л кривая зависимости продуктивности имеет два максимума на двух участках скорости разбавления 0,5-0,6 1/час и при 0=1,5-1,6 ]/час, продуктивность по выходу пастерелл составляет соответственно 11 млрд/мл-час и 6 млрд/мл-час.

Зависимость продуктивности по выходу жизнеспособных пастерелл в установившихся режимах представлена на рис. 2.

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8

D, 1/час

Рис.2 Зависимость проективности по выходу жи¡неспособных пастерсчл (nacre ровский штамм) от скорости разбавления и начальной концентрации глюко!ы в установившемся режиме хемостатного культивирования

Сравнивая данные по продуктивности выхода пастерелл при различных способах культивирования получили следующие результаты.

При традиционном периодическом выращивании Р.тиИос1<1а получают концентрацию пастерелл примерно 10 млрд/мл через 16 часов культивирования. В этом случае продуктивность по выходу микроорганизмов составляет 0,625 млрд/мл час.

При управляемом периодическом процессе концентрация жизнеспособных пастерелл равна 30 млрд/мл за 6 часов выращивания, при этом продуктивность по выходу пастерелл составляет 5 млрд/мл в час.

Продуктивность же хемостатного культивирования пастерелл, например, при скороеги разбавления 0,7 1/час и начальной концентрации глюкозы в питательной среде 3 г/л равна 13,7 млрд/мл час. Таким образом, продуктивность хемостатного культивирования более чем в 20 раз превышает продуктивность традиционного периодического культивирования и в 2,7 раза - продуктивность управляемого периодического процесса.

2.2,5. Изучение билогических свойств пастерелл, полученных при хе чостатиом культивировали

Пастереллы, полученные при хемостатном культивировании (начальная концентрация глюкозы 0,3 г/л с увеличением скорости прогока от 0,3 до О,1) 1/час), морфологически не изменяются. Это однородные мелкие палочки, коккобактерии, окрашенные грамотрицательно. Незначительные изменения в морфологии клеток пастерелл начинают прослеживаться при скоростях разбавления, превышающих 1,0 1/час. При этом наблюдается укрупнение клеток, которые увеличиваются по мере повышения скоростей разбавления.

При высоких скоростях разбавления, близких к 0=1,8 1/час морфология клеток пастерелл начинает заметно изменяться - популяция представлена крупными и средней величины палочками, неравномерно окрашенными.

Проведены исследования по изучению влияния начальной концентра-^ ции глюкозы в питательной среде на биологические свойства пастерелл.. При конценграции глюкозы в питательной среде 1 г/л ярко выраженные изменения, характеризующиеся укрупнением клеток, наблюдаются при скоростях

близких к 0=1,8 1/час. При скорости протока 0,9 1/час в культуре пастерелл видимых изменений в морфологии клеток не обнаружено.

При Бо=10 г/л практически при всех исследованных скоростях разбав- -ления наблюдается полиформизм клеток. Только при 0=0,3 1/час отмечается типичная для данного штамма морфология - однородные мелкие палочки.

Приведенные выше данные говорят о том, что имеется прямая взаимосвязь между основными параметрами хемостатного культивирования пастерелл и их морфологией. Изменяя скорость разбавления и начальную концентрацию глюкозы в питательной среде можно найти режим культивирования, при котором микроорганизмы будут иметь типичные для данного штамма морфологию, культуральные, биохимические и антигенные свойства.

2.2.6. Результаты исследований экспериментальных обращав вакцины, изготовленной из 2-го авирулентпого (пастеровского) штамма пастерелл

Различные физиологические состояния пастерелл при непрерывном культивировании, естественно, не могут не сказываться на свойствах биопрепаратов, изготовленных из хемостатных культур.

В связи с этим, на основании полученных данных, были изготовлены экспериментальные образцы вакцин из хемостатных культур Р;Ыеиге11а ши1-Ю&да пастеровского штамма при следующих параметрах культивирования: начальная концентрация глюкозы в питательной среде 3 г/л, скорость разбавления 0,4 и 1,4 1/час. Стабильность опытных образцов вакцин испытывали после сушки и в процессе последующего хранения (рис.3).

Как показали исследования, лучшей стабильностью (биологические свойства и жизнеспособность) в процессе сублимационного высушивания и длительного хранения обладает вакцина, изготовленная из хемостатной культуры при 0=0,4 1/час, по сравнению с препаратом, изготовленным из культуры, выращенной при скорости разбавления 1,4 1/час.

Рис.3. Стабильность обра щов живых су.\и\ вакцин, ичготовленных ит хемостатных к>льтур Р. пнИихлйа пастеровского штамма.

Это, по видимому, связано с тем, что при более медленном протоке среды, т.е. при медленном росте культура испытывает более сильную лимитацию, более сильное голодание по субстрату.

2.2.7. Результаты исследований опытных образцов живых сухих вакцин, изготовленных из бактериальной массы пастерелл, штаммы АВ и К Краснодарской НИИС.

Опытные образцы вакцин исследовали на стабильность после сушки в процессе последующего хранения и на иммуногенность.

Результаты исследований показали, что лучшей стабильностью в процессе сушки и длительного хранения обладает вакцина, изготовленная из хе-мостатной культуры при скорости разбавления 0=0,4 1/час, несколько худшей стабильностью обладает вакцина из культуры с 0=0,7 1/час. Причем вышеуказанные образцы вакцин при длительном хранении были более стабильными по сравнению с контрольными, изготовленными из периодической культуры пастерелл. Наименьшей стабильностью обладали вакцины, изго-

16

товленные из бакмассы, полученной при скорости разбавления 0=1,4 1/час, что аналогично результатам экспериментальных образцов противопастерел-

лезной вакцины из пастеровского штамма. %

О 2 3 4 5 6 мес 7

Рис. 4. Стабильность опытныч образцов вакцин, и ¡готовленныч и( бакмассы пасгс-релл, шт. "К", полученных хемостатныч методом культивирования

Лучшая стабильность и в этом случае наблюдается у опытных образцов вакцин из штамма К Краснодарской НИВС, изготовленных хемостатным способом при 0=0,4 1/час. Это можно объяснить тем, что при более медленном протоке питательной среды, т.е. при медленном росте культура испытывает более сильное лимитирующее воздействие, более сильное "голодание" по глюкозе и ее защитные системы более приспособлены к различным стрессам, которыми являются последующие после выращивания стадии изготовления вакцины.

В условиях биопредприятия экспериментальные образцы вакцин против пастереллеза испытаны на безвредность и иммуногенность в остром опыте.

Результаты иммуногенной активности экспериментальных образцов вакцин против пастереллеза птиц из штаммов К и АВ Краснодарской НИВС, изготовленных из культур пастерелл, полученных непрерывным (хемостат-ным) способом представлены в таблице.

Таблица

Иммуногенная активность экспериментальных образцов вакцин, изготовленных из хемостатной культуры (штаммы АВ и К)

Серия вакцины Количество иммунизированных кур Количество кур, зараженных контрольным штаммом Результат

живы пали

1 "К" 10 10 10 -

2 "К" 10 10 9 1

3 "К" 10 10 10 -

Контрольная 10 10 8 2

1 "АВ" 10 10 10 -

2 "АВ" 10 10 10 -

3 "АВ" 10 10 9 1

Контрольная 10 10 9 1

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что опытные образцы вакцин изготовленные из бактериальной массы пастерелл (штаммы АВ и К), полученной хемостатным методом культивирования прошли с положительным результатом испытание на иммуногенность.

Таким образом, использование метода хемостатного культивирования пастерелл при изготовлении вакцин позволяет получать стабильную по биологическим свойствам бакмассу.

Разработанный режим хемостатного культивирования также успешно использован при выращивании других штаммов пастерелл: А-8683, В-681, Д-Т-80.

Непрерывное (хемостатное) культивирования производственных штаммов Р.тиКоас1а - А-8683, В-681 и Д-Т-80 в биореакторах при лимити-

18

рованиии их роста глюкозой показало более высокую продуктивность по сравнению с периодическим способом. Концентрация пастерелл при скорости разбавления 0,7 1/час и начальной концентрации глюкозы 5 г/л в установившемся режиме составляет 12-14 млрд/мл для шт. А-8683, 13-14 млрд/мл -для шт. В-681 и 10-12 млрд/мл - для шт. Д-Т-80.

Опытные образцы вакцин полученные непрерывным (хемостатным) методом культивирования, безвредны и их иммуногенная активность в среднем на 10% выше активности контрольной вакцины.

2.2.8. Разработка непрерывного (хемостатного) культивирования пастерелл

Основными стадиями хемостатного процесса выращивания Раз1еиге11а тиКос1с1а являются: приготовление питательной среды и растворов, подготовка аппаратуры АНКУМ-2М, получение посевного материала, культивирование бактерий в периодическом режиме, включение протока питательной среды, переходный режим, и, собственно, режим непрерывного (хемостатного) культивирования, характеризующийся постоянством показателей во времени.

В стерильный биореактор загружали жидкую питательную среду, изготовленную на основе мясного гидролизата - перевар Хоттингера. В среду производили посев культуры Р. тиКос1с1а (пастеровский штамм) и культивировали в течение 3-4 часов. Затем включали проток питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем поступающих за 1 час в ферментер составлял 0,3-1,8 объема суспензии в аппарате, а концентрация глюкозы в питательной среде была в пределах 1 и 3 г/л. Одновременно снимали зажим с устройства слива бактериальной суспензии в сборную емкость, тем самым, осуществляя непрерывный отток культуральной жидкости из биореактора.

В биореакторе стабилизировали рН культуральной жидкости на уровне

7,8-8,2 ед. подачей ЫаОН, а р02 на уровне 30-40 % от насыщения кислородом

19

воздуха - изменением расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки.

Периодически отбирали пробы для определения типичности культуры и чистоты роста.

После установления в биореаторе постоянной концентрации пасте-релл и культивирования в течение 7 периодов генерации бактерийную суспензию использовали для изготовления опытных образцов вакцины.

В указанных выше пределах изменения скорости разбавления, концентрации глюкозы в питательной среде, рН и р02 рост пастерелл лимитируется источником углерода - глюкозой.

При оптимальном режиме хемостатном выращивании Р. multocida с учетом продуктивности, биологических свойств хемостатной культуры в том числе, иммуногенности, стабильности опытных образцов вакцин при длительном хранении скорость разбавления находится в пределах 0,5-0,9 1/час, а начальная концентрация глюкозы в питательной среде - 1-5 г/л.

3. Выводы

3.1. Изучено влияние скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде на рост Pasteurella multocida при хемостатном культивировании и получена хемостатная кривая. Отличие полученной хемостатной кривой пастерелл от классической (теория Моно), состоит в том, что при малых скоростях разбавления наблюдается увеличение концентрации пастерелл.

3.2. Определены основные характеристики хемостатного культивирования пастерелл. удельная скорость потребления глюкозы, экономический коэффициент, продуктивность по выходу микроорганизмов.

3.3. Выявлены условия, при которых глюкоза является лимитирующим рост пастерелл фактором (S0 и D).

3.4. Применение непрерывного (хемостатного) культивирования пасте-релл позволило повысить продуктивность процесса в 20 раз по сравнению с традиционным периодическим способом культивирования и в 2,7 раза по сравнению с продленным периодическим (управляемым) способом выращивания.

3.5. При получении биомассы пастерелл для изготовления вакцин скорость разбавления поддерживают в пределах 0,5-0,9 1/час при начальной концентрации глюкозы в питательной среде 1-5 г/л.

3.6. Разработана методика непрерывного хемостатного культивирования микроорганизмов в биореакторах на модели Пастеровского штамма пастерелл, которая апробирована и на других штаммах пастерелл.

3.7. Опытные образцы вакцин, изготовленные из бакмассы пастерелл, полученной хемостатным способом культивирования отвечали необходимым требованиям (биологические свойства, включая безвредность и иммуноген-ность), предъявляемым к биологическим препаратам.

4. Практические предложения

4.1. Впервые разработана методика непрерывного хемостатного культивирования пастерелл в биореакторах.

4.2. Использование хемостатного метода выращивания пастерелл позволяет существенно повысить производительность процесса при сохранении биологических свойств культуры.

4.3. Разработанный технологический процесс может быть использован при производстве биологических препаратов из других видов микроорганизмов.

5.Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Раевский A.A., Анисимова J1.B., Коротеева J1.A., Хабаров А.К. Разработка технологии культивирования и изготовление ассоциированной вакцины против стрептококкоза, гемофилеза и пастереллеза евшей. Материалы Международной научно-практической конференции "Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее", Щелково, 2004, С. 173-174.

2. Раевский A.A., Еремец В.И., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А., Хабаров А.К. Разработка и испытание ассоциированной вакцины против инфекционных пневмоний свиней бактериальной этиологии. Материалы Международной научно-практической конференции "Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее", Щелково, 2004, С. 174-203.

3. Хабаров А.К., Раевский A.A. Разработка технологического процесса непрерывного культивирования пастерелл при производстве поливалентной ГОА вакцины против пастереллеза свиней. Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково, 2004, С.45-48.

4. Хабаров А.К., Раевский A.A. Изучение характера роста пастерелл при хемостатном культивировании. Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2004, С.49-51.

i

>-5906

РНБ Русский фонд

2006-4 5279

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. № 115 тир. 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хабаров, Александр Константинович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Классификация процессов культивирования.

1.2. Характеристика процессов культивирования.

1.3. Теория хемостата.

1.4. Отклонения закономерностей роста микроорганизмов от i теории Моно.

1.5. Культивирование Pasteurella multocida.

1.6. Вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц.

1.7. Применение хемостатного культивирования в научных исследованиях и в производстве биологических препаратов.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты исследования.

2.2.1 Изучение зависимости концентрации пастерелл пастеровского штамма от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде.

4 2.2.2. Определение концентрации глюкозы в культуральной жид, кости.

2.2.3. Определение удельной скорости потребления глюкозы и гидроокиси натрия на стабилизацию рН.

2.2.4. Определение экономического коэффициента.

2.2.5. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл при хемостатном культивировании.

2.2.6. Изучение биологических свойств пастерелл, полученных при хемостатном культивировании.

2.2.7. Результаты исследований экспериментальных образцов вакцин, изготовленных из хемостатных культур пастерелл (пастеровский штамм.

2.2.8. Результаты исследований опытных образцов живых сухих вакцин, изготовленных из бактериальной массы пастерелл, штаммов АВ и К Краснодарской НИВС, полученной непрерывным (хемостатным) методом культивирования.

2.2.9. Изготовление и испытание опытных образцов вакцин про-с тив пастереллеза свиней, полученных из штаммов А-8683,

В-681, Д-Т-80 непрерывным (хемостатным) способом культивирования

2.2.10. Разработка непрерывного (хемостатного) культивирования пастерелл.

3. Обсуждение результатов исследования.'.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин"

Актуальность темы. Среди инфекционных заболеваний, наносящих животноводству и птицеводству большой экономический ущерб, значительное место занимают пастереллёзы. Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается повышением концентрации поголовья на ограниченной территории, что является предрасполагающим фактором к заболеванию пастереллёзом. Экономический ущерб от этого заболевания складывается из потерь от падежа, вынужденного убоя животных и затрат на проведение профилактических и лечебных мероприятий.

Одним из наиболее значимых технологических этапов в производстве биологических препаратов, предназначенных для специфической профилактики инфекционных заболеваний бактериальной этиологии, является культивирование микроорганизмов. Именно на этой технологической стадии производства вакцин происходит синтез антигенов, от которых зависит эффективность иммунопрепаратов. В процессе выращивания бактерий необходимо одновременно с увеличением выхода биомассы добиваться того, чтобы возбудитель не изменял свои биологические свойства. Для этого необходимо создавать оптимальные условия культивирования с учётом физиологического состояния микроорганизмов. Технология изготовления бактериальных вакцин многоаспектная проблема, ключевым направлением которой является разработка управляемых процессов культивирования микроорганизмов.

В настоящее время в биологической промышленности получение бактериальной массы микроорганизмов для изготовления вакцин основано на периодическом способе культивирования, в течение которого свойства клеток и состав культуральной среды непредсказуемо изменяются.

По данным ряда исследователей наиболее эффективным по накоплению биомасссы бактерий является хемостатное культивирование с лимитированием по источнику углерода (69, 103).

Продуктивность непрерывного (хемостатного) выращивания микроорганизмов значительно превышает продуктивность периодического метода.

Поэтому, весьма перспективны исследования, направленные на организацию процессов управляемого культивирования и, в частности, на непрерывные способы выращивания микроорганизмов, позволяющие создавать и длительное время поддерживать культуры с постоянной и точно определённой концентрацией биомассы, фазой и скоростью роста, а также с соотношением протективных антигенов (6, 75).

Хемостатное культивирование микроорганизмов при лимитировании их роста источником углерода представляет собой перспективное направление при производстве ветеринарно-биологических препаратов и, в частности, средств специфической профилактики инфекционных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных бактериальной этиологии.

В связи с вышеизложенным, весьма актуальным является исследование роста пастерелл в хемостатном режиме, получение биомассы пастерёлл при этом способе выращивания для изготовления вакцин.

Цель и задачи исследований. Цель работы - исследование и разработка процесса хемостатного культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин против пастереллёза сельскохозяйственных животных и птиц.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучение зависимости концентрации жизнеспособных пастерелл от скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде;

- определение основных технологических характеристик хемостатного культивирования Pasteurella multocida (удельной скорости потребления глюкозы, экономического коэффициента, продуктивности по выходу микроорганизмов);

- разработка методики непрерывного (хемостатного) культивирования микроорганизмов в биореакторах;

- изготовление и испытание опытных образцов вакцин из пастерелл 2-го авирулентного (пастеровского) штамма, штаммов АВ и К Краснодарской НИВС, а так же штаммов А-8683, В-681, Д-Т-80.

Научная новизна работы. Впервые разработан способ хемостатного культивирования Pasteurella multocida пастеровского штамма для производства вакцин. Данный метод применен для выращивания и других штаммов пастерелл.

Изучен характер роста Pasteurella multocida в непрерывном (хемостат-ном) режиме при лимитирования роста пастерелл глюкозой.

Получена зависимость концентрации пастерелл от скорости, разбавления и начальной концентрации глюкозы (хемостатная кривая). Установлено отличие хемостатной кривой пастерелл от классической хемостатной кривой, описываемой теорией Моно.

Определены условия, при которых хемостатная культура пастерелл переходит на другой тип лимитирования.

В результате проведённых исследований определены оптимальные режимы хемостатного культивирования пастерелл для производства вакцин.

Практическая значимость работы. На примере Pasteurella multocida 2-го авирулентного (пастеровского) штамма впервые разработана методика непрерывного (хемостатного) культивирования микроорганизмов в биореакторах, которая была апробирована на штаммах АВ и К Краснодарской НИВС, А-8683, В-681, Д-Т-80.

Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы.

Апробация работы. Представленные в диссертации материалы доложены на международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2004), международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ФГУП "Щелковский биокомбинат" "Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее" (Щелково, 2004).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В России теория процессов культивирования разрабатывалась такими видными учеными, как Н.Д. Иерусалимский, П.И. Николаев, И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова, И. А. Баснакьян, за рубежом - J. Monod, A. Novic, D. Herbert, C.Pert (4-11, 35, 36, 37, 56, 59, 62, 64-70, 126, 133, 134, 140).

В каждом микробиологическом производстве процессу культивирования отводится значительная роль. Он определяет эффективность производственного процесса и качество продуктов микробного синтеза, которые в настоящее время используют для изготовления вакцин, диагностикумов, анатоксинов, антибиотиков, ферментов, биополимеров, органических кислот и других веществ. Культивирование микроорганизмов позволяет рационально использовать или устранять промышленные отходы, очищать сточные воды, получать кормовой белок из не пищевого сырья и т.д. Процесс культивирования является базисом всех научных исследований мира микроорганизмов в области морфологии и цитологии, физиологии и биохимии, молекулярной биологии, генетики и экологии (68).

Процесс культивирования бактерий является важным этапом при производстве биологических препаратов. Ему предшествует работа со штаммами и подготовка питательной среды. Синтез антигенов, необходимых для разра ботки вакцин, происходит именно на этапе культивирования микроорганизмов. Необходимо также обеспечить соответствующий уровень выделения и очистки антигенов, сохранения определенного количества живых или убитых микробных клеток в препарате.

При производстве биологических препаратов важное значение имеет выбор способа культивирования микроорганизмов, который должен быть основан на знании существующей классификации этих процессов. Выбранный метод выращивания бактерий должен быть нацелен на конечную цель - препарат, для которого он предназначен, и соответствовать будущим масштабам производства.

В настоящее время уделяется большое внимание управляемым процессам культивирования микроорганизмов. Управление может быть частичным или полным, осуществляться вручную или автоматически, быть постоянным или изменяться по ходу процесса. Средствами управления или управляющими воздействиями являются скорость разбавления, концентрация субстрата, физико-химические параметры культивирования, скорость вращения мешалки, подача газов и ряд других факторов. Управляемое культивирование - это процесс, подвергающийся целенаправленному воздействию для получения культур с заданными свойствами: скорость роста, концентрация микроорганизмов, набором, количество и молекулярные параметры антигенов (10).

Использование управляемых методов выращивания бактерий и, в частности, непрерывного (хемостатного) культивирования привело к появлению такого понятия, как физиологическое состояние микроорганизмов, которое подразумевает взаимоотношение микробной популяции с питательной средой. Оно характеризует хемостатную культуру в стационарном состоянии, когда можно задать определенные условия, охарактеризованные качественно и количественно, и изучать любые параметры энергетического и конструктивного метаболизма и особенности строения клетки, что и составляет физиологические свойства клеток (70, 131).

При культивировании микроорганизмов все проявления жизнедеятельности клетки можно оценить с помощью количественных характеристик. Имеются исследования физиологического состояния микроорганизмов в хе-мостате при разных скоростях роста и различных лимитирующих факторах. Было установлено, что при лимитации роста углеродом органическое вещество используется полностью на построение биомассы и выход биомассы из использованного субстрата максимальный. При лимитации роста минеральными элементами микроорганизмы поглощают двух-трехкратный избыток источника углерода и энергии, но не успевают превратить его в биомассу (62,152).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Хабаров, Александр Константинович

4. ВЫВОДЫ

4.1. Изучено влияние скорости разбавления и начальной концентрации глюкозы в питательной среде на рост Pasteurella multocida при хемо-статном культивировании и получена хемостатная кривая. Отличие полученной хемостатной кривой пастерелл от классической (теория Моно), состоит в том, что при малых скоростях разбавления наблюдается увеличение концентрации пастерелл.

4.2. Определены основные характеристики хемостатного культивирования пастерелл: удельная скорость потребления глюкозы, экономический коэффициент, продуктивность по выходу микроорганизмов.

4.3. Выявлены условия, при которых глюкоза является лимитирующим рост пастерелл фактором (So и D).

4.4. Применение непрерывного (хемостатного) культивирования пастерелл позволило повысить продуктивность процесса в 20 раз по сравнению с традиционным периодическим способом культивирования и в 2,7 раза по сравнению с продленным периодическим (управляемым) способом выращивания.

4.5. При получении биомассы пастерелл для изготовления вакцин скорость разбавления поддерживают в пределах 0,5-0,9 1/час при начальной концентрации глюкозы в питательной среде 1-5 г/л.

4.6. Разработана методика непрерывного хемостатного культивирования микроорганизмов в биореакторах на модели пастеровского штамма пастерелл, которая апробирована и на других штаммах пастерелл.

4.7. Опытные образцы вакцин, изготовленные из бакмассы пастерелл, полученной хемостатным способом культивирования отвечали необходимым требованиям (биологические свойства, включая безвредность и иммуногенность), предъявляемым к биологическим препаратам.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

5.1. Впервые разработана методика непрерывного хемостатного культивирования пастерелл в биореакторах.

5.2. Использование хемостатного метода выращивания пастерелл позволяет существенно повысить производительность процесса при сохранении биологических свойств культуры.

5.3. Разработанный технологический процесс может быть использован при производстве биологических препаратов из других видов микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хабаров, Александр Константинович, Щелково

1. Андреева Е.А., Шульговская Е.М., Работнова И.Л.,Торможение роста Candida utilis Н+ и ОН-ионами. Микробиология. - 1970. - 39. - № 2. - С. 269-273.

2. Баснакьян И.А. Синхронно делящиеся культуры микроорганизмов как метод изучения в биологии. Микробиол. — 1965. №2. — С. 85.

3. Баснакьян И.А. Синхронизация деления брюшнотифозных бактерий разведением культуры питательной средой // Микробиолог. — 1966. Т.7, С. 107-111.

4. Баснакьян И.А. Экспериментально аналитические исследования жизнедеятельности Salmonella typhy при непрерывном культивировании: Дисс. д-ра биол. наук. М.,1974.

5. Баснакьян И.А., Запорожцев Л. Н. Некоторые аспекты интенификации производства бактерийных препаратов. Микробиол. — 1976. - №11. -с.30.

6. Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Кузьмин С.Н. Патология и физиология патогенных микроорганизмов. Микроб. 1981. - Т. 9, - С. 17-27.

7. Баснакьян И.А., Боровкова В.М. Запорожцева JI. Н. Классификация процессов культивирования микроорганизмов: Тр. Моск. научно исслед. инта вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, 1981. - С. 5-17.

8. Ю.Баснакьян И.А. Оптимизация процессов культивирования микроорганизмов в иммунобиотехнологии. ЖМЭИ. - 1989. - №5. - С. 90 - 96.

9. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М: Медицина, 1992. - 192 с.

10. Борисенкова А.Н., Мошкин С.А., Токсические, антигенные и протектив-ные свойства морфологических структур, выделенных из возбудителей пастереллёза кур // Научные вопросы производства яиц и мяса птицы — 1975.-Т. 39.-С. 146-149.

11. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллёза // Птицеводство. — 1983. -№12.-С. 26.

12. Буткин Е.И. Пастереллёз (холера) птиц. М: Колос. — 1972. — с. 184.

13. Вайсман И.Ж. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций // ЖМЭИ. — 1984. Т.4. — С.З.

14. Ветеринарные препараты. Справочник. Ю.Ф. Борисович, Л.В. Кириллов / Под. ред. Д.Ф. Осидзе. М., 1981. - С. 448.

15. Геведзе В.И., Вайсман Э.И. Эпизоотическая эффективность химических вакцин против пастереллёза свиней // Достижения вет. науки и передового опыта животноводству. - 1980. - С. 38-40.

16. Геведзе В.И., Левченко И.Д., Вайсман Э.И. Изучение имуногенных свойств химических и биофабричных вакцин против пастереллёза свиней в лабораториях и производственных условиях: Труды белорусского НИИЭВ. 1979.-Т. 17-С. 55-59.

17. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин // Сельхоз. биология. 1987. - №2. -С. 100-104.

18. Грубер И.М. Имуногенные свойства Salmonella typhi, полученных при непрерывном культивированиии. Автореф. дисс.канд. мед. наук. М., 1971.

19. Данилова М.В. Надирова И.М. Ефимцева Т.В. Зависимость жизнеспособности бактерий после лиофилизации и при длительном хранении от величины остаточной влажности // Изд. АН СССР. Сер. биол. 1980. - 3. - С. 449-451.

20. Домарадский И.В. Возбудители пастереллёзов и близких к ним заболеваний. М: Медицина, 1971. 287 с.

21. Дубров И.С. Основы иммунопрофилактики пастереллёза уток аэрозолями второй вакцины Краснодарский НИВС (из штамма «К») против пастереллёза водоплавающих птиц. Автореф. дисс. канд. вет. наук. Л., 1987. -21с.

22. Душук Р.В. Сравнительная оценка имуногенности вакцин против пастереллёза уток и гусей: Тезисы док. научн.- производст. конф. г. Ломоносов, 1985. — 4.2. - С. 70-71.

23. Езепчук Ю.В. Симпозиум. Генетические и химические основы вирулентности бактерий: теоретические и практические аспекты. — 1972. С. 42.

24. Езепчук Ю.В .Бимолекулярные основы патогенности бактерий. М., 1977.

25. Жданова Л.Г. Непрерывные культуры как физиологические системы для изучения антигенных и иммуногенных свойств тифозных бактерий. Авто-реф. дисс. докт. мед. наук, 1974.

26. Запорожцев Л.Н., Баснакьян И.А., Ильинская Е.А. Биологоэкологическое изучение процессов культивирования микроорганизмов. Ж. Микробиология. 1977. - № 10. - С. 37-43.

27. Запорожцев Л.Н., Баснакьян И.А., Грунтович B.C., Мельникова В.А., Крылов Ю.М., Матвеев В.В. Значение фазового портрета в прогнозировании процессов культивирования микроорганизмов -Микробиол. 1977. -№10.

28. Иванов В.Н. Энергетика роста микроорганизмов. Киев, 1981, с. 137.

29. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М., 1963.

30. Иерусалимский Н.Д. Теоретические и промышленные аспекты микробиологического синтеза // Вестник АН СССР. 1965. — 4. - С. 42-50.

31. Иерусалимский Н.Д., Неронова Н.М., Количественная зависимость между концентрацией продуктов обмена и скоростью роста микроорганизмов. Доклады АН СССР. 1965. 161. - 6. - С. 1437-1440.

32. Кац Л.Н. Некоторые особенности субмикроскопической организации поверхностных и мембранных структур, бактериальных клеток в связи с их функцией. Автореферат дисс. д-ра. биол. наук. М, 1971.

33. Каширин В.В.Биологический принцип стандартизации штаммов бактерий возбудителя пастереллёза птиц: Тез. докл. Всеросс. н.-пр. конф. «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов ». М., 2001. - С. 57-58.

34. Кожемяка Н.В. Профилактика болезней птиц основа эффективного ведения отрасли // Ветеринария. - 1989. — 9. - С. 3-6 .

35. Коломнина Г.Ф., Антонова Н.И., Галибина Н.В., Лукьянова Е.М., Семе-нютина Г.А., Немчинов Н.Н., Рогожин С.П., Шегидевич Э.А. Физиологические и морфологические особенности пастерелл в процессе культивирования: Сб. науч. тр. ВГНКИ. М., 1989. С. 78-82.

36. Костюкова Н.Н., Езенчук Ю.В. Методологические подходы к конструированию химических вакцин против бактериальных инфекций // Журнал микробиолог., эпидемиол. и иммунол. 1984. №8. — С. 3-8.

37. Кулак В.Г. Получение токсинов и анатоксинов клостридиум эдиматиенс типа А в реакторах: Дисс. канд. мед. наук. М., МНИИВС им. Мечникова 1972.- 147 с.

38. Мазур Т. Типирование культур P. multocida методом капсульной деполимеризации мукополисахаридов // Тез. док. Всероссийской науч.- практич. конф. "Совершенствование методов контроля, стандартизации, и сертификации вет.препаратов". М., 2001. - С. 56.

39. Малек И. Роль непрерывных процессов и их изучения в развитии современной науки и в производстве. Непрерывное культивирования микроорганизмов. М : Пищевая пром-сть, 1968. С. 9.

40. Масимов Н. А. Значение пастерелл при остром респираторном синдроме парагриппа-3 у телят откормочных хозяйств промышленного типа. Авто-реф. дисс. канд. вет. наук. М., 1992.

41. Матвиенко Б.А. Пастереллы. Ветеринарная микробиология. / (Под ред. Е. В.Козловского и П. А. Емельяненко. — М., 1982.-С. 177-180.

42. Мельников В.Н. О зависимости токсинообразования бактерий от условий выращивания. Аэробные инфекции. М., МНИИВС им. Мечникова, 1960.-Вып. 9.-С. 224.

43. Мероприятия по профилактике и ликвидации инфекционных болезней животных: Ветеринарное законодательство / Под. ред. А.Д. Третьякова. -М., 1981.-С. 75-199.

44. Мертвецов Н.П., Беклемишев А.Б., Савич И.М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Новосибирск, 1987. — 207 с.

45. Музыченко Jl. А., Валуев В.И. Использование полунепрерывного культивирования микроорганизмов для получения продуктов биосинтеза: Тез. докладов на 2 Всесоюзн. совещ. "Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов". М., 1978. — С. 112.

46. Мусил Я., Новакова О., Кунз К. Современная биохимия в схемах. — М., 1981-213 с.

47. Мутафаров С.Б., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. рН- ауксостат: теория и практика. Пущино, - 1985. - С. 41.

48. Немирович-Данченко М.М. Диализное культивирование Clostridium botulinum типа Е. Автореф. дисс.канд. биолог, наук. Томск, 1973. — 3 с.

49. Николаев П.И. Шестеренко А.Ф. Караваева JI. Т. Выращивание микроорганизмов на плотных питательных средах в аппаратах АКМ-Ш: Мат. конф., посвященной 50-летию института «Микроб». Саратов, 1968, С. 35.

50. Николаев П.И., Соколов Д. П. // Приклад, биохимия. 1968. - Т.4. - №4. -С. 365-372.57.0сидзе Д.Ф. Инфекционные болезни животных. М., 1987. 188 с.

51. Падерин Ю.П., Гусев В.В., Выборнов С.К. Некоторые особенности культивирования P. multocida штамм SM-1: Тез. док. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щёлково, 2000. С. 134-136.

52. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М: Мир, 1978.-331 с.

53. Петровская В.Г. Проблема патогенности бактерий. М., 1967.

54. Печуркин Н.С. Применение непрерывного культивирования для изучения эволюционных и экологических процессов: Тез. докл. .2 Всес. совещ. "Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов". М., 1978, с. 3.

55. Позмогова И.Н. // Успехи микробиологии. 1974. — Вып. 9 - С. 952 - 955.

56. Попова Т.Е. Характеристика капсульных антигенов P.multocida различных серологических вариантов. Автореферат, диссканд. вет. наук. М.,1997.

57. Работнова И.Л., Иванова И. И. Рост и развитие микробных культур // Успехи микробиол. 1971. - №6. - С. 67-107.

58. Работнова И.Л. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов // Вест. АН СССР. 1974. - №4. - С. 118.

59. Работнова И. Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингиби-рование роста микроорганизмов. — М., Наука, 1979. — 207с.

60. Работнова И.Л., Позмогова И.Н., Баснакьян И.А. Хемостатное и периодическое культивирование при изучении физиологии микроорганизмов. Итоги науки и техники. Микробиология, М., 1981.

61. Работнова И.Л., Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Запорожцев Л.Н. Процессы культивирования' микроорганизмов // Сер. Биологическая 1982. -№4. С. 559-560 с.

62. Работнова И.Л. Тактика оптимизации микробиологических проектов // Антибиотики и медицинская биотехнология. — 1986. №7. - С. 509.

63. Работнова И.Л. Физиология микроорганизмов и управляемое культивирование // Успехи микробиологии. — 1990. №24. - С. 92.

64. Раевский А.А., Рубан Е.А. И др. Об оптимальных условиях культивирования пастерелл на логарифмической стадии роста. // Э. И. Передовой на-уч.-пр. опыт в биолог, промышленности. М., 1984. - № 10. - С. 3-5.

65. Раевский А.А., М.Я. Ярцев, Е.П. Сапегина, Л.В. Анисимова. Непрерывное культивирование пастерелл при лимитировании роста глюкозой // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. М., 1987. С. 57.

66. Раевский А.А., Ярцев М.Я. Влияние парциального давления растворенного кислорода на рост пастерелл // Пр-во и контроль мед., вет. препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ. Вольгинский, 1999. — С. 67.

67. Раевский А.А. Перспективное технологическое направления культивирования бактерий при производстве вакцин // Материалы междунар. науч-пр. конф. «Научные основы производства вет. биол. препаратов». Щёлково, 2003.-С. 61-64.

68. Раевский А.А. Разработка управляемого культивирования Pasteurella mul-tocida. Дисс.кандидата биологических наук, 2002.

69. Раевский А.А., Анисимова JI.B., Коротеева JI.A., Бушуева Н. Б. Разработка управляемого культивирования стрептококков // Материалы междунар. науч. пр. конф. «Научные основы производства вет. биол. препаратов». -Щёлково, 2003. - С. 68-71.

70. Редикульцев Ю.В., Ширшиков Н.В., Кудряшев В.К., Пермяков Е.А. Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов // Патент №2193594, 20002.

71. Рубан Е.А., Ярцев М.А., Разумова Н.А. Динамика потребления глюкозы при периодическом культивировании // ЭИ Передовой науч.- пр. опыт в биолог, промышленности. М., 1985. - 10.

72. Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Гомогенность культуральной среды микроорганизмов в биореакторе в процессе глубинного культивирования // Материалы междунар. науч.- пр. конф. « Научные, основы производства вет. биол. препаратов». — Щёлково, 2003. С. 74-76.

73. Садовская Г.М., Пидопличко Н.С., Гуревич Ю.Л., Печуркин Н.С., Фуряе-ва А.В. Рост и образования липидов дрожжей Lipomyces L- 199 при непрерывном культивировании И Прикл. биохим. и микробиол. 1976. -Т.12. - №1. - С. 79.

74. Самуйленко А. Я., Рубан Е. А., Самуйленко С.А. Влияние растворенного кислорода на рост культур микроорганизмов и клеток животных // Материалы междунар. науч.- пр. конф. "Научные основы производства вет. биол. препаратов". Щёлково, 2003.- С. 77-80.

75. Сапегина Е.П., Анисимова JI.B., Раевский А.А. Динамика роста пастерелл при глубинном культивировании // Э.И. Передовой науч.- пр. опыт в биол. промышленности. М., 1983. - №2. - С. 5-10.

76. Складнёв А.А., Васильев Н.Н., Амбросов Б.А. Основные1 направления в моделировании роста популяции микроорганизмов // Журнал Всесоюзного химического общества. 1973. - №2. - С. 494-503.

77. Сосницкий А.И., Потехин А.В., Ручкова О.И. Реактивность организма белых мышей на пастереллёзную инфекцию в зависимости от возраста // Пр-во и контроль мед., вет. препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ., Вольгинский, 1999 С. 70.

78. Сосов Р. Ф. Эпизоотология. М., 1974. - С. 99.

79. Шафарастова Л.Д., Иванова И.И., Работнова И.Л. Особенности роста периодической культуры., Вас. Megaterium. Микробиология. - 1971. - Т. 40, №3.-С. 379.

80. Шегидевич Э.А. Состояние и перспективы изучения пастереллёзов сельскохозяйственных животных // Труды ВИЭВ. 1984. - Т. 60, С. 58.

81. Шкидченко А.Н. Совместное действие лимитирующего и ингибирующего факторов на рост дрожжей в проточной культуре // Микробиология. — 1977.-Т. 45.- ЖЗ.-С. 456.

82. Штоффер Л.Д. Биосинтез пенициллина при непрерывном и периодическом культивировании Penic. Chrysogenum с экспоненциально возрастающей подачей глюкозы // Прикл. биохимия и микроб. 1979. - Т.5. - Вып. 2, С. 233.

83. Яровенко B.JI. Основные закономерности спиртового и ацетоно- бутилового брожения // Пищевая промышленность. — 1975. С. 104.

84. Яровенко B.JL, Нахманович Б.М., Шеблыкин Н.П., Яровенко В.В. Зависимость сохранения наведённой стерильности питательной среды при ферментации. М : ОНТИТЭИ микробиопром. 1976. - Сер.1. - С. 22.

85. Яровенко B.JI. Основы технологии непрерывного культивирования Penic. chrysogenum // Тез. докл. 2 Всесоюз. совещ. «Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов». — М., 1978. — С. 61.

86. Яровенко B.JI. Ровинский JI.A. Моделирование и оптимизация микробиологических процессов в спиртовой промышленности // Пищевая промышленность. 1978. - С. 103.

87. Ярцев М.Я., Сапегина Е.П., Анисимова JI.B. и др. Морфология культу-ральные и биохимические свойства пастерелл на разных стадиях роста при управляемом культивировании // ЭИ Передовой науч.-пр. опыт в биологической промышленности. -М., 1985. С. 8.

88. Ярцев М.Я., Белоусов В.И., Главацкая О.В.и др. Пастереллёзы животных и птиц: специфическая профилактика, лечение и методы борьбы. -М.,1989. 57с.

89. Aiba S., Nagai S., Nishisawa X., Energetik and nucleic analysis of chemostatic culture of Asotobacter vinelandii. // J.Gen.Apll.Microbiolol. 1967a. 13. — 1. — 73.-83.

90. Aldova E., Frederiksen W. Et al. Aerogenic pasteurellas and Pasteurella- Like organism isolated in Czechoslovakia // Zentrabblatt furv Bacteriologie. 1992. - Vol. 227. - №1. - P. 139-143.

91. Вава Т. Immunogenic Activity of Ribosomal Fraction Obtained from Pas-terella multocida // Infekt. Immun. 1977. - Vol. 15. - № 1. - P. 1-6.

92. Bain R. В. S. Studies on hemorrhagic septicemia of cat 4. A preliminary examination of antigens of P. multocida type 1 // Brit. Vet. J.- 1955.- №3. — P. 492 498.

93. Bergter F., Knorre W.A. Computersimulation von Wachstum und Pro-ductbilng bei Saccharomyces cerevisiae. L.allg.Microbiolog.-1972.-Vol.l2. -№8.-P. 613-629.

94. Biotechnology / Ed. H.J. Rehm, G. Reed. Weinheim, 1983. Vol.3.

95. Bjorge R, Bolinbroke D. Fowl cholera in overwinterized mallard dusks // Can . Vet. J. 1988. - Vol. 29. - №5. - P. 666-667.

96. Brito J.B., Piffer I.A., Wentz I., Brito M .A. Capsular types and toxin producing by strain of P. multocida isolated from pigs in Southern Brazil // Rev. microbiol. 1993. - Vol. 24. - №2. - P. 94-97.

97. Brown D.E., Vass R.C. Maturity and product formation in cultures of microorganisms //Biotechnol. Bioeng. 1973.-Vol. 15.-№1.-P. 321.

98. Cameron C.M., Bester F.J. Formulation on effective P. multocida vaccine for sheep // J. Vet. Res.- 1984.- Vol. 54. №3. - P. 189-191.

99. Carter G.R. The type specific capsular antigen of P.multocida // Can. J. Med. Sc.- 1952.-Vol. 30.-№ l.-P. 48-53.

100. Carter G.R., Bain R.B.S. Pasteurellosis (P. multocida) a review stressing recent developments // Vet. Rev. An. 1960. - Vol. 6. - №2. - P. 105-128.

101. Carter G.R. Pasteurellosis: P.multocida and P.haemolytica // Advances in veterinary science. VII New York - London. - 1967. - P. 321-379.

102. Carter G.R. Pasterella. Hadbuch der bacteriallen infektionen bei Tieren. -1981.-P. 557-593.

103. Clogg R.A., Light P.A. Growth yields of Torulopsis utilis grown in continuous culture with glycerol of iron as the growth-limiting nutrient // Biochem. J.,-1961.-Vol. 124.-№1.-P. 152-154.

104. Confer A.W., Panciera R.J., Fulton R.W., Centry M.J., Rummage J.A. Effect of vaccination with live or killed Pasterella haemolytica on resistance toexperimental bovine pneumonic pasteurellosis. I I Am. J. Vet. Res.- 1985. — Vol. 46, №2. -P. 342-347.

105. Dahad S.K. Redox potential as a letter subsitute for dissolved oxsigen in fermentation process control // Biotehnol. and Bioeng. 1982. - Vol.24. - P. 2123-2125.

106. Dawson P. Continuously synchronised growth- J. Appl. Chem. Biotechnol. 1972.-№3.-P. 103.

107. Dierieux W. Effect of varios feed additives on immune response of turkeys vaccinated with live P. multocida in drinking water // Avian Dis. 1980. —Vol. 24. №2.-P. 481-485.

108. Ellwood D.C., Tempest D.W.// Adv. Microbiol. Physiol. 1972. - Vol. 7. -P.83-118.

109. Fencl Z. Novak M. Prediktion of the course of continuous fermentation on the basis of analysis of the bacfh process // Folia microbial.-1969. V.14. — P. 314.

110. Fiechter A. Mitteilungen der Versuchsstation fur das Carungsgewerbe. — 1967.-21.-7/8.-P. 87-92.

111. Fiechter A. Continuous Cultivation of yeasts.- Methods in cell Biology. New- York-San Francisco-London. Acad. Press. Inc., 1975. Vol. 11. — P. 24 -44.

112. Frese E. Sheu C., Gallier S. Production of cyclodextrin glicosyltransferase by bacth and chemostat culture of Bacillus macerans in chemically defined medium//Nature. 1973.-V. 241. - №2.-P. 321.

113. Gallup D.,Gerhardt P. Interactions in methane-utilizing mixed bacterial culture in chemostat.- Appl. Microbiolog. 1963. - Vol. 11.- №3. - P. 506.

114. Harrison D.E.F., Loveless J.E. The effect of growth conditions on respiratory activity and growth efficiency in facultative anaerobes grouwn in chemostat culture. J.Gen.Microbiol. 1971. - Vol. - №68. - №1. - P. 35-43.

115. Harisson D.E.F. Physiological effects of dissolved oxygen tension and redox potential on growing populations of microorganisms // J. Appl.Chem. Biotech-nol. -1972. Vol. 22. - P. 417-440.

116. Heddleston K.L., Rebers P.A. Fowl cholera: cross- immunity induced in turkeys with formalin — killed in-vivo -propagated Pasterella multocida // Avian Dis.-1972. Vol.16. - №3 - p. 578-586.

117. Herbert D. Recent Progress in Microbiology. Oxford, 1959. - P. 381 -396.

118. Kjaergaard L. Joergensen B. Simple equipment for establishing continuous synchronous cultures of microorganisms // Biotechnol. Bioeng. — 1979. Vol. 21,№1.-P. 147.

119. Klinremberg A. An analisis of the principles of batch and continuous operation //Chem. Eng. Sci. 1955. - №4. -P. 39.

120. Landvall P. Dialysis Cultivation of Bacteria. Stokholm, 1977. P. 101.

121. Leuenberger H.G.W. Cultivation of Saccharomyces cerevisiae in continuous culture. I. Growth kinetics of a respiratory deficient yeast strain grown in con-tinu-ous culture. // Arch. Microb. 1971. - Vol 79. - P. 176-186.

122. Malek I. // Continuous cultivation microorganisms: Symposium. Prague, 1958.-P. 11-28.

123. Mashiro N., Motoru O., Yuichi A., Kiken O., Tomoatsu K. The first Outbreak of fowl cholera an Muslovy Ducks in Japan // J. Vet. Med., Sci.- 1992. — Vol. 54, № 6. P. 1215-1217.

124. Monod I. The growth of bacterial cultures // Ann. Rev. Microbiol. 1949.-№3- P. 374-394.

125. Monod I. Latechnique culture continue Theorie et applications. LL Ann. Inst. Pasteur, Paris. 1950. -Vol. 79. - P. 390 - 410.

126. Moss E.J., Rickard P.A.D., Such F.E., Caiger P. The response by microorganisms to steady-state growth in controlled concentrations of oxygen and glucose. 2. Saccharomyces carlsbargensis // Biotechnol. Bioeng. — 1971. Vol. 13. - №1. - P. 63-75.

127. Myint A., Carter G.R. Prevention of haemorrhagic septicemia in buffaloes and cattle with a live vaccine // Vet. Rec. 1989. - Vol. 124. - №19. - P. 508509.

128. Myint A.A. live vaccine against hemorrhage septicemia. // Asian Live Stock.- 1992.-Vol. 17.-№1.-P. 1-4.

129. Nagai S., Nishisawa X., Doin P.A., Aiba S.Energy fdifference in metabolism between glucose and acetate in chemostat culture of Azotobakter vineladii // J.gen.Microbiol. 1972. -Vol. 18.-P.201-208.

130. Nomioka S., Murata M. Serological studies of Pasterella multocida 2 Characteristics of somatic (O) antigen of the organism // Cornell Vet. -1961.-51.-p. 507-528.

131. Novick A. Szilard L. Experiments with the chemostat on spontaneous mutation of bactetria. Proc. Nat. Acad. Sci . U.S.A., 1950 b. - Vol. 36. - P. 708719.

132. Olson R. D., Schink G.T. Onset and duration of immunity and minimume dosage wit CU cholera vaccine in turkeys via drinking water // Avian Dis. -1986.-Vol.30. №1.-P. 87-92.

133. Paster L. Sur les maladies et en particulier sur la maladie appellee vulgari-rement cholera des poules // Acad. Sci. 1880. - P. 90, 239, 952, 1030.

134. Poultry vaccine: Патент №3855408 США 'МКИ 2 A61 К 23/00/ Mash -eswaran S.K. (США)//Заяв. 16.07.73.; Опуб. 17.12.74; НКИ 424/92-10 с.

135. Reilly L.L. Atrophic rhinitis in swine. Swine pasteurellosis // Con. Anim. Health.-1981.-P. 16.

136. Rhoades K.,R., Rimler R.B. Serological characterization of P. multocida strain isolate from wild ruminants as capsular serogroup В // Vet. Rec. — 1992. -Vol. 130.-№ 5.-P. 331-332.

137. Rutter J. M . Atrophic rhinitis in swine // Ads. Vet. Sci. 1985. - Vol. 29.-P. 239-279.

138. Schultz. Gerhard Ph. Dialysis culture of microorganisms: design, theory, and results//Bact. Rev. 1969.-Vol. 33.-P.1.

139. Schlink G Т., Olson L.D. Fowl cholera vaccination of growing turkeys with CU strain via routes other than oral // Avian Dis.-1987. Vol. 31, №1.- p. 2228.

140. Singler N., Malkinson M. An avirulent live P. multocida vaccine for drinking water and aerosol administration against turkey cholera // Avian Pathol. -1979. -Vol .8. №4. - P. 391-399.

141. Solomons G.L. Improvements in the dosing and operation of the chemostat. J.appl. Chem. Biotechnol. 1972. - Vol. 22. - P. 217-228.

142. Tempest D.W. The place of Continuous culture in microbiological re-sench.Adv. in Microbiol. Physiology. London-New-York. - 1970. - Vol. 4. — P. 223-250.

143. Tempest D.W., Diks J.W., Microbiol, physiol. and continuous culture // London, 1967.-P. 140.- 154.

144. Westmacott D., Primrose S. B. Synchronous growth of Rhodopseudomonas palustris from the Swarmer phase. // J.Gen.Microbiol.- 1976,-Vol. 94, №1.-p.l 17.

145. Yoshida F., Yamane Т., Nakamoto K. Stimulatory effect of hydrostatik pressure on the cell division in cultures of E. colli. Biotechnol. Bioeng. — 1973. — V. 15.-P. 257.

146. Zhao G., Pijoan C., Murtangh M., Molitor T. W. Use of restriction endonu-clease analysis and ribotyping to study epidemiology of P. multocida in closes swine hurds // Inf. and Immun. 1992. - Vol. 60. - №4. - P. 1401-1405.