Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц

Леонов, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц"

Леонов Александр Владимирович

Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц

03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск 2005

Леонов Александр Владимирович

Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц

03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

; > л -г , , л« а

( •>',«-♦ МО

Оболенск 2005® -*» <г~ *.•

лта,^

Работа выполнена в Государственном научном центре прикладной микробиологии Министерства здравоохранения и социального обеспечения РФ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Научный консультант: доктор биологических наук

Гусев Виктор Владимирович

Герасимов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор Белоусов Василий Иванович

доктор ветеринарных наук,

профессор Душук Ростислав Владимирович

Ведущее учреждение' Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина

Защита состоится «/г? июня в 10 часов на заседании специализированного совета Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу 141142, Московская обл, Щелковский район, пос.Биокомбинат, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертациеймсокно ознакомится в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан «/¿» мая 2005 г. Ученый секретарь диссертацинного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время птицеводство относится к интенсивно развивающейся отрасли сельского хозяйства В связи с интенсификацией отрасли, созданием и массовым распространением новых конкурентно способных линейных и гибридных кроссов, первостепенной задачей является повышение сохранности молодняка и взрослой племенной птицы.

Одной ю инфекционных болезней, имеющей широкое распространение и обладающей высокой конгагиозностью, является пастереллез. Пастереллез представляет серьезную проблему в птицеводстве и животноводстве, поскольку возбудитель - Р. multocida обладает способностью мигрировать от одного вида птиц к другому и разным видам животных, приживляться в их организме и вызывать заболевания опасные для них (А.Н. Борисенкова, 1992).

Анализ эпидемиологических обследований, проведенных в больницах различных стран мира, а также а нал® зарубежной медицинской литературы, свидетельствует о том, что проблема пастереллезов актуальна и для медицины (И.А. Бакулов, 1995, EAldova et al, 1992, H.I. Chen, K.Hulten, J.EClamdge, 2002, B.S.Huber, D.V.Alhed, J.G.Camien, D D Frame, 2002). В России заболевание практически неизученно, что связано с нгоким уровнем з наний медицинских работников о этиопатогенезе данного заболевания, а также с отсутствием средств ее диагностики (ЮГ Степаншин, ИН. Манзенюк, Э.А. Светоч, 1997) В основе борьбы с пастереллез ом, помимо общих ветеринарно-санитарных и зоотехнических мероприятий, лежит специфическая профилактика.

Наиболее эффективными с точки зрения напряженности и продолжительности формируемого иммунитета являются живые вакцины, широко применяемые для профилактики сальмонеллезов, рожи свиней, сибирской язвы.

Живые слабовирулентные пастереллы в сравнении с инактивированными, а также с живыми авирулентными пастереллами обладают выраженной иммуногенностью (В.В Каширин, 1995) Согласно данным зарубежной литературы, живые аттснуированные штаммы более эффективны как вакцина, чем инактивированные штаммы (Dougan, 1994; Mais den et al., 1996; Simmons etaL, 1998,Makela, 2000).

Для профилактики пастереялеза птиц в России выпускают сухие живые вакцины против пастереллеза водоплавающей птицы ю штаммов АВ и К Краснодарской НИВС, но данные штаммы не имеют генетических маркеров В ГНЦ прикладной микробиологии предложен штамм SM-1, полученный в 1995г Ю Г Степаншиным с соавторами ш вирулентного эпизоотического штамма Р multocida № 576 и относящегося к серотипу Д

По данным зарубежной литературы у птиц распространен серотип А, но выделяют также серотип Д Антибиотикоустойчивые генетические маркеры позволяют дифференцировать вакцинные штаммы от полевых 0 А Светоч и др 2003)

Согласно современным международным требованиям вакцинные штаммы, применяемые для изготовления живых вакцин, должны иметь генетические маркеры, позволяющие отличить их от полевых штаммов, обладать стабильными биологическими свойствами, слабой остаточной вирулентностью и обеспечивать невосприимчивость к инфекции большинства животных при однократной иммунизации (М Я Ярцев 1996).

Преимуществом таких вакцин, помимо их высокой эффективности, является возможность их аэрозольного применения, что обеспечивает, в частности, в промышленном птицеводстве проведение массовых вакцинаций в короткие сроки, с минимальными затратами.

Цель и задачи исследований. Целью нашего исследования является получение эффективного вакцинного препарата против пастереллеза птиц - сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов 8М - 1 и ЬА - 25, методов ее контроля и применения, разработка технологии производства

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- разработать способ получения аттенуированных штаммов пастерелл, отвечающих современным требованиям, предъявляемые к вакцинным штаммам,

- селекционировать аттенуированны й штамм;

- изучить влияние продолжительности культивирования в жидкой питательной среде на основе гидролкзатов из непищевого сырья на образование капсулы и накопление капсульного антигена в процессе роста пастерелл

- создать технологию производства вакцины против пастереллеза птиц на основе аттенуированных штаммов серотююв А и Д (8М-1,1А-25).

- определить оптимальные дозы и разработать схему вакцинации для птицы

- изготовить экспериментальные серии вакцины и испытать ее в лабораторных и производственных условиях;

- разработать проект нормативно - технической документации (технические условия, временное наставление по применению) препарата;

Научная новизна.

Путем индуцированного мутагенеза получен атте ну иро ванный нггамм ^ЮнгеНа тикоскЗа ГЛ - 25, обладающий протективными свойствами и низкой остаточной вирулентностью.

Изучена морфология и ультраструктура пастерелл аттенуированных штаммов полученных путем индуцированного мутагенеза в сравнении с типовыми штаммами у птиц.

Изучен процесс капсулообразования и динамики накопления капсульного антигена культуры Рти1юс)(1а в зависимости от продолжительности культивирования на питательной среде из непищевого сырья

Показана возможность использования питательной среды из смеси гидролкзатов из непищевого сырья' рыбной муки, казеина, сгустков крови вместо мясных переваров без потери выхода биомассы и сохранением антигенных свойств при культивировании пастерелл.

Разработана технология изготовления и контроля «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов 55М - 1 и 1А - 25 против пастереллеза птиц»

Практическая значимость работы. Получен аттенуированный штамм 1А - 25, который можно рекомендовать для изготовления биопрепарата «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов 8М - 1 и 1А - 25 против пастереллеза птиц»

Разработана технология изготовления, контроля и применения «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов 8М - 1 и 1А - 25 против пастереллеза птиц».

Получены положительные результаты испытания вакцинного препарата, как на лабораторных, так и на естественно восприимчивых животных.

Испытана в производственных условиях «Сухая живая вакцина на основе аттенуированных штаммов 5М - 1 и 1А - 25 против пастереллеза птиц» Данный препарат отличается низкой остаточной вирулентностью и высокой иммуногенностью, что дает возможность его широкого применения в ветеринарной практике.

Применение питательной среды из смеси гидролюатов позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с себестоимостью биопрепаратов полученных с применением сред из мясных переваров.

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы

Апробация работы. Материалы диссертации доложены

- на международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» 24 - 25 апреля 2003г. - Щелково.

- на конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» 5-6 октября 2004г. - Щелково

- на межлабораторном научном семена ре ГНЦПМ - апрель 2005г.- Оболенск. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницдх машинописного текста и состоит из следующих разделов' введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками. Список литературы включает 167 источников, в том числе 74 отечественных и 93 зарубежных.

Собственные исследования

Материалы и методы Работа была выполнена на базе ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии (ФГУП ГНЦ ПМ)

В работе использовали штаммы РаяКигеНа ти1юс1(Ь № 712, № 1231, № 680, № Т80, а также эпизоотические штаммы (пастереллы, сальмонеллы, эшерихии, стрептококки, стафилококки, диплококки) выделяемые от павшей и вынуждено убитой птицы.

Работу с производственными штаммами, а также приготовление панкреатических гидролюатов крови (ПГКр), казеина (ПГК) и рыбной муки (ПГРМ), используемых в качестве основ питательной среды, осуществляли согласно разработанного нами лабораторного регламента по изготовлению и контролю данного вакцинного препарата Приготовление бульона панкреатического гидролизата мяса по Хсптингеру (БПГХ) проводили по стандартной методике Концентрацию водородных ионов в используемых питательных средах определяли потенциометрически на рН - метре «МР 220» (Швейцария); аминный азот - формолькым титрованием по методу Зеревсен - Гаврилова Для культивирования бактерий применяли следующие питательные среды' Ь-агар, ЦЗ-бульон и ГРМ-агар с добавлением 3-5 % цельной крови барана или лошадиной сыворотки

Культивирование бактерий Р ти1Юс1<1а в жидких питательных средах осуществляли в пробирках, колбах Эрленмейера емкостью 750 см3, бутылях емкостью 2,5 л , аэрирование проводили на шуттельаппарате УС67-88, ТУРЫ-2 (Чехия) с частотой 120 - 250 колебаний в минуту Также использовали лабораторные ферментеры АК-210, объемом 10дм3 и В-2, объемом 50 дм3 Вносимая посевная доза составляла 5-10% от объема среды

Общее количество бактерий определяли при помощи оптического стандарта мутности ГИСК им Тарасевича, а также путем измерения оптической плотности на "КФК-3" Количество жизнеспособных бактерий определяли путем титрования и подсчета колониеобразующих единиц в соответствии с рекомендациями.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам проводили методом разведений соответствующих препаратов в плотной питательной среде Р ти!юс1(1а с последующим высевом испытуемых культур (Ковалев В.Ф., и др. 1988). Выделение плазм ид проводили по методике Кадо и Лью (1981)

Для анализа степени аттенуации выделенных ангибиотикоустойчивых вариантов штамма №712 исследовали их вирулентность на лабораторных животных. Оценку вирулентности штаммов пастереллезного микроба проводили посредством определения величин Ш50 при подкожном заражении беспородных белых мышей, массой 18-20 г бактериальной суспензией в физиологическом растворе. Наблюдения за животными и учет падежа осуществляли в течение 10 суток после заражения.

Протективные свойства штамма 1А - 25 и ЭМ - 1 изучали на беспородных белых ' мышах, массой 18-20 г по 10 животных на одну иммунизирующую дозу.

Иммуногенность штаммов ТА - 25 и БМ - 1 оценивали по величине 50% - ной иммунизирующей дозы ВД50, определяемой по методу Кербера в модификации И.П Ашмарина и А А Воробьева на цыплятах 30 суточного возраста кросса хайсекс браун, и числу выживших животных в группе В качестве контроля использовали не иммунизированных птиц.

Антигенную структуру изучали в реакции иммунодиффузии по Оухтерлони (1967). Концентрацию белка в препаратах определяли по Бредфорд (1976) Количество капсульного антигена определяли по методике В ЯуиЮ и М МайитоЮ (1982) Процесс капсулообразования пастерелл в различные периоды культивирования на бульоне из смеси гвдролизатов БГРМККр - бульоне изучали на примере цггамма 1А-25.

Результаты исследований Изучение морфологических, тинкториальных, культуральных и

* ферментативных свойств шолятов Ра$(еиге11а тиЦос1с1а.

В результате данной работы проведено обследование 30 птицеводческих хозяйств различной специализации (куры, индейки, утки) яичного и мясного направления в 20 регионах страны и было выделено 565 изолятов Р. тикоЫёа Все они имели характерные для Р. тикос1(1а свойства, а именно: морфологически представляли собой мелкие (0,5 х 1,5 мкм), полиморфные (от кокков до длинных тонких нитей), в зависимости от возраста культуры, неподвижные грамотрицательные бактерии, что подтверждается литературными данными (М А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федоров, 1995).

При определении биохимических свойств выделенных изолятов пастерелл было показано, что по совокупности биологических свойств, выделенные изоляты

использованные в работе, соответствовали виду Р тиНос1<1а

Определение чувствительности полевых штаммов пастерелл к антибактериальным препаратам.

Культуры Р тиЬос1<!а проверены на чувствительность к антибактериальным препаратам Более (50 %) испытуемых изолятов чувствительны к большинству препаратов- энрофлоксацин, гентамицин, бензилпеницилин. Более (80%) устойчивы к тетрациклину, стрептомицину В двух изолятах устойчивых к энрофлоксацину и в одном изоляте устойчивому к тетрациклину выделены плазм иды. При определении молекулярной массы этих плазм ид, с помощью электроферетических подвижностей плазмид с известной молекулярной массой, установлено, что выделенные плазмиды имели молекулярную массу 3000 пар оснований и 2000 пар оснований. Наличие плазм ид у возбудителя пастереллеза открывает перспективу их использования для внутривидового типирования штаммов и генетических исследований.

Сравнение признаков антибиотикорезистенгносги, вирулентности с наличием плазмид в этих штаммах с типовыми не позволяет однозначно установить соответствия между присутствием плазмид в клетках Р. ти1юс1<1а, и их ангибиотикорезистенгностью и вирулентностью, поскольку показатель вирулентности ЛД50 всех исследованных штаммов сравнительно близкий.

Изучение нммуногенного родства аттеиуированного штамма вМ -1 При изучении нммуногенного родства и определении перекрестной защиты аттенуированного штамма БМ - 1, после подкожной двукратной иммунизации мышей с интервалом 10 дней в дозе 3,5 х 104 м.кл в объеме 0,2 мл, и заражения животных штаммами 1231 и Т-80 в дозе 5 Ш50, ориентируясь на 100% гибель животных в контрольной группе в течение 14 суток, получили результаты представленные в таблице 1.

Таблица 1

Результаты опытов через 14 суток после заражения вакцинированных мышей

Штамм Зараж. Зараж Живые Кол- Зараж. Кол-во Кол-во Процент

доза, вакц. вакц. во конгрол павших живых защиты

м кл. живот живот павш. живот живот. в контроле в контроле %

1231 (А) 80 10 0 10 10 10 0 0

Т-80(Д) 500 10 10 0 10 10 0 100

Исходя из данных таблицы, при определении перекрестной защиты было установлено, что иммунизация аттенуированным штаммом SM-1 обеспечивает гтротективный эффект при заражении мышей микробными клетками штамма Т-80 (Д), но не защищает животных при инфицировании бактериям и штамма 1231 (А) При высеве на плотные питательные среды из печени и селезенки павших мышей выделены микроорганизмы, соответствующие по совокупности биологических свойств, виду Р. multocida, что подтверждает наличие пастереллезной инфекции.

Получение атгенуированных штаммов

Получение аттенуиро ванны х про m водных штамма № 712 осуществляли с помощью индуцированного мутагенеза, под действием УФ - облучения с длиной волны 254 нм, и последующего отбора мутантов культуры Р multocida устойчивых к стрептомицину.

При применении УФ - облучения у бактерий присходит синтез и активизация ферментативной системы, участвующей в процессе репарации поврежденных цепей ДНК. Одним из таких процессов является фотореакгивация, происходящая на свету Для определения влияния процесса фотореактивации на выживаемость микробных клеток, облучение проводили как на свету, так и в темноте учитывая, что условия (концентрация клеток, рост их до облучения) были одинаковыми Полученные экспериментальные данные представлены на рисунке 1.

0 см 10см 30см Эйсм 40м« Ней 00ем 70см Мом Врмм

_В свет_И темнота_

Рисунок 1. Кинетика выживаемости микробных клеток

В ходе эксперимента было установлено, что под действием этого процесса выживаемость микробных клеток увеличивается и составляет 1,15 % от общего числа микробных клеток не облученной суспензии, в отличии от 0,38 % выживших микробных клеток в темноте. Для получения независимых мутантов одного типа, во время индукции мутаций мутагеном, культуру микробных клеток делили на порции и из каждой порции

отбирали, после периода инкубирования только по одному мутанту, с дальнейшим высевом культуры на Ь ■ агар со стрептомицином, увеличивая при этом его концентрацию

Полученные клоны под действием УФ - облучения по показателю вирулентности Ш50 существенно отличались от исходного штамма возбудителя. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Штамм Степень разведения микробных клеток ДДм

10' 1 10 10^ 10 10 10"* 10"' Ю-*

Исходный - - - 12/12 12/12 12/12 12/12 10/12 10

1 - - - 4/4 4/4 4/4 2/4 - 1х102

- - - 4/4 4/4 1/4 3/4 - 3x10'

8^9 - - 4/4 3/4 3/4 3/4 2/4 - 6x102

14 - - 4/4 3/4 2/4 2/4 2/4 - 2x103

26 - - 4/4 4/4 1/4 1/4 - - 1х104

- 3/4 4/4 3/4 2/4 1/4 - - 1х104

в^бб - 3/4 3/4 3/4 2/4 - - - 6x10"

81г82 - 4/4 2/4 3/4 0/4 - - - 1Х105

120 - 4/4 3/4 1/4 1/4 - - - 3x105

150 - 3/4 3/4 1/4 1/4 - - - 3x105

170 3/4 2/4 0/4 0/4 - - - - 4x10'

200 3/4 0/4 0/4 0/4 - - - - 8x10'

ем -1 - 2/4 2/4 0/4 0/4 - - - 3x106

Примечание: В числителе обозначено число павших животных после заражения, в знаменателе - общее количество животных.

Выявлено, что появление резистентности к стрептомицину приводит к ослаблению вирулентности возбудителя пастереллеза на 4 -5 порядков. Исходя из показателей Ш50 полученных штаммов, следует, что возникновение устойчивости к стрептомицину приводит к глубоким изменениям в геноме Р тикскнйа, выражающиеся в значительном снижении вирулентности бактерий.

Для оценки характера наследования приобретенных признаков из полученных мутантов, был выбран один аттенуированный штамм, который получил обозначение 1А -25 При исследовании стабильности сохранения " детерминанты путем поклонального

анализа наследственных признаков, выявлено, что в течение 10 пассажей на плотной питательной среде в отсутствии селективного давления антибиотика, 500 проверенных субъклонов не утратили устойчивости к стрептомицину в дозе 10000 мкг^м3, что говорит об отсутствии реверсии исследуемых клонов по признаку Бк " и стабильности наследования данной мутации.

Один из проанализированных выше клонов был пятикратно последовательно про пассирован через организм белых мышей (заражение ЮШ50) У выделенной Зй1 культуры определен показатель Ш50 для белых мышей при подкожном заражении. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Штамм Степень разведения микробных клеток 1Л)Я

101 10 10 10 ИГ 10^ 10' 10^

ЬА-25 3/4 0/4 0/4 0/4 - - - - 8x10'

Пассаж 3/4 0/4 0/4 0/4 - - - - 7,9x10"

Исходя из данных таблицы 3, показатель Ш$о пассированного штамма сопоставим с таковым для аттенуированного штамма, не пассированного на животных

Эти результаты доказывают устойчивость сохранения свойств аттенуированного штамма после пятикратного пассажа через организм белых мышей. Известно, что плазм иды способны осуществлять перенос фрагментов хромосомы, изменять чувствительность к бактериофагам и устойчивость к физическим и химическим воздействиям, поэтому исходный штамм № 712 и полученный из него аттенуированный штамм - 25, проверили на наличие плазмид, которых в данных штаммах обнаружить не удалось.

Изучение протекгивных и иммуногенных свойств аттенуированных штаммов ЬА -25 и вМ - 1

Анализируя данные, полученные в результате изучения протекгивных свойств штаммов 1А - 25 и вМ- 1 и представленные в таблицах 4 и 5, можно сделать вывод, что эти штаммы обладают высокими протективными свойствами, что подтверждается большим процентом выживших лабораторных животных в вакцинированной группе, по сравнению с контрольной группой В ходе проведенных экспериментов установлено, что двукратная подкожная иммунизация повышает протективный эффект, что характеризуется отсутствием павших животных после инфицирования вирулентными штаммами культуры Р. тиИос1<1а № 712 и № 576, по сравнению с контрольной группой

Таблица 4

Эффективность вакцинации мышей культурой Р. тиИопйа штамма ЬА - 25

Иммуниз ирующая Выживаемость животных при заражении

доза 1_А -25,м.к. вирулентным штаммом № 712

Количество павших Количество павших

мышей мыШей

при однократной при двукратной

вакцинации вакцинации

10^ 8/10 6/10

10* 4/10 2/10

10> 2/10 0/10

10" 1/10 0/10

Контроль 10/10 10/10

заражения

Таблица 5

Эффективность вакцинации мышей культурой Р. тикосМа штамма ЯМ -1

Иммуниз ирующая Выживаемость животных при заражении

доза 8М -1,м-к вирулентным штаммом № 576

Количество павших Количество павших

мышей мышеи

при однократной при двукратной

вакцинации вакцинации

10 100 10 100

104 - - 6/10 5/10

ю4 3/6 4/6 2/10 4/10

10' 2/6 1/6 0/10 3/10

10" 1/8 1/8 0/10 0/10

10' 0/6 1/6 - -

Контроль 4/4 4/4

заражения

При экспериментальном определении иммунизирующей дозы культуры -Р тиИос1<1а аггснуированных штаммов 1А - 25 и 5!М-1, на 30 суточных цыплятах получили результаты представленные в таблицах 6 и 7

Таблица 6

Экспериментальное определение иммунизирующей дозы культуры Р. тикосМа штамма ЬА - 25 при пастереллезе у цыплят

Заражающая доза ЯЛ)» Иммунизирующая доза, млн. м. кл. Пало в контроле

540 360 180 90

Общее количество цыплят 10 10 10 10 10

Количество живых цыплят 10 10 9 8

Количество павших цыплят 1 2 10

Процент сохранности 100 100 90 80 0

Таблица 7

Экспериментальное определение иммунизирующей дозы культуры Р. шикосШа штамма 8М- 1 при пастереллезе у цыплят

Заражающая доза 51ЛЭ» Иммунизирующая доза, млн м. кл. Пало в контроле

580 290 150 70

Общее 10 10 10 10 10

количество

цыплят

Количество 10 10 10 8 _

живых

цыплят

Количество „ - 2 10

павших

цыплят

Процент сохранности 100 100 100 80 0

Исходя из данных таблиц 6 и 7.установлено, что при применении дозы 90 млн.м.к. для аттенуированного штамма LA - 25, сохранность цыплят в данной группе составила 80%, при 100% i ибели в контрольной, при иммунизации аттенуированным штаммом SM- 1 в дозе 70 млн м к сохранность птиц, также составила 80%. Дальнейшее увеличение иммунюирующей дозы до значения 360 - 540 млнм к для аттенуированного штамма LA - 25, и до 290- 580 млнм к доя аттенуированного штамма SM-1, сохранность цыплят в подопытных группах для обоих штаммов культуры Р muí toe ida составила 100%, при 100% гибели птиц в контрольной.

Эти результаты свидетельствуют о том, что аттенуированные штаммы LA - 25 и SM- 1 при иммунизирующей дозе 400 млнм к, обладают высоким протективным эффектом и на их основе возможно создание живой вакцины для профилактики пастереллеза птицы.

Питательные среды для культивирования вакцинных штаммов Путем сравнительного культивирования вакцинных штаммов LA - 25 и SM- 1 на двух жидких питательных средах, основами которых являлись ПГРМ, ППС, ПГКр и БППХ, получили результаты представленные на рисунке 2

SM-1 LA-25

■ Бульон Хоттингвра ■ Бульон ПГ

Рисунок 2. Концентрация живых микробных клеток на разных питательных средах

Из данного рисунка, следует, что выход бактериальной массы культуры Р. ти1юс!с1а у обоих штаммов практически равен, как при культивировании на экспериментальной среде так и на БПГХ, следует отметить, что количество аминного азота в обеих питательных средах составляет 160 мг%.

Изучение морфологии и ультраструкгуры атгенуированных штаммов ЬА - 25 и вМ-1 и влияние продолжительности культивирования на процесс капсулообразования

При изучении морфологии и ультраструктуры атгенуированных штаммов LA - 25 и вМ- 1 в сравнении с типовыми К? 712 и № 576, показал, что морфологически бактерии

этих образцов не отличаются друг от друга' клетки имеют овоидную, реже палочковидную форму, с ровной или слегка извилистой клеточной стенкой.

Исследование ультратонких срезов препаратов показало, что через 1 -2 часа после внесения посевного материала в ферментер, микробная популяция гетерогенна по форме, размерам и возрасту и тонкой структуре бактерий. Такая картина структуры популяции бактерий в начале ферментации объясняется присутствием в КЖ молодых интактных клеток 1 -ой 2 -ой генераций, бактерий на разных стадиях деления, а также небольшой части микробов на разных стадиях естественного старения, повреждений и лизиса, попавших в ферментер с инокулятом Через 4 часа культивирования микробная популяция претерпевала значительные качественные изменения, из культуральной жидкости исчезали старые и поврежденные клетки, а число бактерий с ингакгной ультраструкгурой увеличилось до 80 - 90 %.

Культура клеток 6 - часового роста в основном была представлена делящимися клетками. В данных клетках выявлялись фигуры деления в виде поперечных инвагинаций и перетяжек клеточной стенки, а также почкующихся коккообразных фрагментов. Гетерогенность микробной популяции сохранялось только по таким параметрам как форма, размеры и объем бактерий, но по строению тонкой структуры клеток популяция была абсолютна гомогенна, 97 - 99% микробов составляли молодые и ингакгные клетки. Такие быстрые качественные изменения биомассы за несколько генераций бактерий от начала ферментации свидетельствуют, что в среде обитания микробов отсутствуют факторы ингибирующие рост, а композиция питательной среды и условия культивирования являются благоприятными для развития культуры Р. ти!Юск1а

В результате прямого просмотра препаратов при инструментальных увеличениях 20 - 40 тыс. раз и анализа электронограмм выявлено, что примененный режш культивирования на БГРМККр - бульоне способствует формированию капсул и микрокапсул у большинства микробов спустя 8 часов от начала культивирования Морфологически полноценные клетки пастерелл, в культурах указанного срока культивирования, были представлены бактериями палочковидной или эллипсовидной формы с гладкой или слегка волнистой клеточной стенкой Цитоплазма характеризовалась электронной плотностью средней степени, обусловленной рибосом альным и и полисомальными структурами Нуклеоил, представленный тонкофибриллярными структурами ДНК, локализовался в центральной части цитоплазмы

После 10 часов культивирования в образцах клеток этого периода обнаруживались деструктивные и дегенеративные изменения Дальнейшее увеличение сроков

культивирования приводило к усиленному старению значительной части клеток Р тикос1(1а, которое выражалось в виде очагового и полного люиса цитоплазмы, вакуолизации нуклеоида.

Влияние питательной среды и времени культивирования штаммов ЬА - 25 и вМ -1 на количество капсульного антигена и его иммунологические свойства.

Изучение количества растворимого капсульного антигена культуры атгенуированных штаммов 1.Л 25 и 8М- 1, выращенных на плотных питательных средах агаре - ГШ и Хоттингера и жидких: из смеси гидролизатов ПРГМ, ПГК, ПГКр и ПГХ, показало, что количество капсульного антигена на агаре и бульоне Хоттингера на всех фазах роста образуется больше, чем на ГРМ агаре и бульоне из смеси гидролизатов, что по - видимому, связано с более полноценным аминокислотным составом данной питательной среды.

Экспериментальные данные представлены в таблицах 8 и 9.

Таблица 8

Динамика накопления капсульного антигена штаммов ЬА - 25 и вМ - 1 на плотных питательных средах

Штамм Количество капсульного антигена мг/мл

Хоттингер агар ГРМ -агар

6 час 8 час 10 час 12 час 6 час 8 час 10 час 12 час.

ЬА -25 0,078 ±0,02 0,094 ±0,02 0,136 ±0,03 0,166 ±0,04 0,044 ±0,01 0,065 ±0,02 0,100 ±0,0029 0,142 ±0,029

БМ -1 0,075 ±0,02 0,090 ±0,03 0,131 ±0,029 0,159 ±0,03 0,043 ±0,012 0,061 ±0,01 0,098 ±0,021 0,135 ±0,04

Таблица 9

Динамика накопления капсульного антигена иггаммов ЬА- 25 и вМ -1 на жидких питательных средах

Штамм Количество капсульного антигена мгЛил

Хоттингер бульон ГРМККр - бульон

4 час 6 час 8 час 10 час 4 час 6 час 8 час 10 час.

1А -25 0,018 ±0,005 0,039 ±0,012 0,045 ±0,013 0,027 ±0,008 0,012 ±0,003 0,020 ±0,003 0,037 ±0,01 0,022 ±0,005

БМ-! 0,015 ±0,004 0,036 ±0,01 0,041 ±0,010 0,023 ¿0,01 0,010 ±0,0025 0,017 ±0,005 0,033 ±0,01 0,019 ±0,006

К 10 часу культивирования на обеих жидких питательных средах количество капсульно! о антигена уменьшается, что связано с активизацией ферментативных процессов и разрушения капсульного слоя микроорганизма. Исследование иммунологических свойств полученных капсульных антигенов с помощью реакции РДП показало, что полосы преципитации с кроличьей сывороткой в разведении 1 256

образуются с 6, 8 часовой культурой выращенной на бульоне Хоттингера, а с культурой выращенной на смеси из гидролизатов только с 8 часовой. Следует отметить, что с 4 и 10 часовыми культурами выращенными на обеих питательных средах полосы преципитации не образуются, что по - видимому связано с недостаточным количеством и неполноценным строением капсульного антигена

Глубинное культивирование При проведении процесса глубинного периодического культивирования процесс ферментации прекращали в начале стационарной фазы, что соответствует 8 - часовому росту, когда концентрация живых микробных клеток перестает заметно увеличиваться, а количество капсульного антигена максимально Динамика накопления бактериальных клеток вакцинных штаммов ЬА - 25 и ЗМ-1, в зависимости от времени культивирования представлена на рисунке 5.

Рисунок 5. Накопление пасте ре лл при глубинном периодическом культивировании

Динамика роста данных штаммов отражает классическую кинетическую кривую роста, характерную для культуры микроорганизма Р тикоа'Иа

Оценка безвредности и иммуногенности вакцины Было изготовлено 3 экспериментальные серии «Сухой живой вакцины ш атгенуированных штаммов 5М-1 и - 25 против пастереллеза птиц», которые прошли лабораторные испытания на безвредность и иммуногенность

Исследование безвредности показало, что при вакцинации клинически здоровых цыплят в дозе согласно разработанному временному наставлению по применению «Сухой живой вакцины из атгенуированных штаммов ЗМ -1 и 1А - 25 против пастереллеза птиц»

и наблюдении за ними в течение 14 дней, лабораторные животные оставались клинически здоровыми, некрозов на месте введения препарата не наблюдали.

При юучснии иммуногенных свойств получили результаты, представленные в таблице Ю.

Таблица 10

Результаты лабораторных испытаний «Сухой живой вакцины ю аттенуированных штаммов вМ -1 и ЬА - 25 против пасте ре ллеза птиц» на безвредность и

иммуногенность

Кол - во Безвредность Доза Иммуногенная активность

ЦЫПЛЯТ заражения Контрольное инфицирование

Штамм Штамм

№712(А) №576(Ц)

Пали Сохранность Пали Сохран Пали Сохран

(гол ) (%) (гол.) ность (%) (гол.) ность (%)

10 голов 0/10 100

Вакцини- 5 10* 0/5 100 0/5 100

рованные 5 104 0/5 100 0/5 100

15 голов 5 ю5 1/5 80 1/5 80

Контроль- 5 10' 5/5 0 5/5 0

ные 5 103 5/5 0 5/5 0

15 голов 5 103 5/5 0 5/5 0

Из данных таблицы видно, что гибель птиц после заражения вирулентными штаммами дастерелл в опытных (вакцинированных) группах отсутствовала или была минимальной (20%) при заражении дозой 105 м.кл/см3, в то время как в контрольных группах (неаакцинироваиных) отмечалась 100% летальность при заражении в дозе 103 мкл/см3 Таким образом, экспериментальные данные представленные в таблицею свидетельствуют о безвредности и высокой иммуногенной активности испытанной вакцины

Полученные положительные результаты позволили провести апробацию данной вакцины в производственных условиях Для производственного испытания подобрали неблагополучное по пастереллезу птицеводческое хозяйство ООО «Вторая пятилетка» Воронежской области.

Производственные испытания

В ходе производственного испытания, результаты представлены в таблицей «Сухой живой вакцины га аттенуированных штаммов 55М- 1 и 1_А - 25 против пастереллеза птиц» при иммунизации опытной группы вакциной согласно разработанному временному наставлению по применению, случаев осложнений после вакцинации и прорыва иммунитета не регистрировали.

Следует отметить, что в контрольной группе в которой применяли антибактериальные препараты падеж составил 12,5 %.

Таблица 11

Результаты производственных испытаний «Сухой живой вакцин из аттенуированных штаммов вМ -1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц»

Группа Количество голов Пало от пастереллеза Сохранность

Гол. % %

Опытная 3 тыс 0 0 100

Контрольная 3 тыс 375 12,5 87,5

Исходя из полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод, что «Сухая живая вакцина из аттенуированных штаммов ЭМ- 1 и против пастереллеза птиц» обладает достаточно высокими протективными свойствами

Полученные результаты при выполнении данной работы позволили сформулировать следующие выводы

Выводы

1 Путем индуцированного мутагенеза получен аттенуированный штамм ЬА - 25 имеющий генетический маркер, что позволяет его дифференцировать от эпизоотических изолятов пастерелл, сохраняющий приобретенные свойства, и обладающий протекгивной активностью и низкой остаточной вирулентностью

2 Наиболее выраженным капсулообразованием на среде на основе гидролюатов ш непищевого сырья обладают пастереллы в фазе замедления скорости роста и в начале стационарной фазы, наступающей через 8 часов культивирования.

3. Разработана технология изготовления «Сухой живой вакцины из аттенуированных штаммов SM-1 и LA ~ 25 против пастереллеза птиц»

4. Разработана схема вакцинации и определены оптимальные дозы пастерелл в живой вакцине для кур - 400 млн. м .кл.

5 Полученные экспериментальные серии вакцины прошли лабораторные и производстве иные испытания (в неблагополучном по данному заболеванию хозяйстве) с положите ль ным и результатам и.

6. Разработан проект нормативно - технической документации (технические условия и временное наставление по применению) на производство данного препарата.

Практические предложения

Представлены для рассмотрения и согласования в Департаменте ветеринарии Мивсельхоза России проект технических условий и временное наставление по применению «Сухой живой вакцины против пастереллеза птиц».

Список опубликованных работ

I Леонов А В , Гусев В.В Изучение иммуногенного родства аттенуированного штамма SM-1 при экспериментальном пастереллезе мышей// Научн.основы производства вет.биолог. препаратов: Тез.докл междун.научно - практ конф. 24-25 апреля 2003г

2. Леонов А В., Гусев В В Оценка протективных свойств аттенуированного штамма культуры Pmultocida LA-25 //Научн основы произ водства вет биолог препаратов' Тез.докл междун.научно - практ .конф. 5-6 октября 2004г.

3. Леонов А.В , Гусев В.В. Получение аттенуированного штамма P.multocida // Ветеринария,- 2004.-№ 10.- С.23 - 26.

4. Справка о депонировании авторского штамма Р multocida LA-25 / Леонов А.В.

Отпечатано в ООО «Мещера» зак. №186, тир. 100 экз.

pi o d о о

РНБ Русский фонд

2006^4 5897

\ \

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леонов, Александр Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Род Раз1еиге11а - общие сведения

2.2. Культурально-морфологические свойства Раз1еиге11а тикоаск

2.3. Биохимические свойства

2.4. Антигенные свойства

2.5. Специфическая профилактика пастереллеза птиц

2.5.1. Классификация и характеристика вакцинных препаратов

2.6. Мутации у микроорганизмов

2.6.1. Механизмы репарации мутаций у бактерий

2.7. Получение аттенуированных штаммов

2.7.1. Химический мутагенез

2.7.2. Физический мутагенез

2.7.3. Инсерционный мутагенез

2.7.4. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез

2.7.4.1. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез с использованием ДНК фага М

2.7.4.2 Олигонуклеотиднаправленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК

2.7.4.3. Случайный мутагенез с использованием «врожденных» олигонуклеотидных праймеров

2.8. Биотехнология и технология производства вакцин

2.8.1. Питательные среды

2.8.2. Подготовка посевного материала и глубинное культивирование

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты исследований^

3.2.1. Изучение морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств типовых и эпизоотических штаммов

3.2.2. Определение чувствительности полевых штаммов пастерелл к антибактериальным препаратам

3.2.3. Изучение иммуногенного родства аттенуированного штамма БМ -1 со штаммами сероваров А и Д

3.2.4. Получение аттенуированного штамма Раз1еиге11а тикоас1а

3.2.5. Изучение протективных и иммуногенных свойств штамма ЬА- 25 и БМ

3.2.6. Питательные среды для культивирования вакцинных штаммов

3.2.7. Изучение морфологии и ультраструктуры аттенуированных штаммов БМ -1 и ЬА- 25 в сравнении с типовыми штаммами № 712 и №

3.2.8. Изучение процесса капсулообразования в зависимости от продолжительности культивирования культуры

3.2.9. Влияние питательной среды и времени культивирования штаммов ЬА-25 и БМ -1 на количество капсульного антигена и его иммунологические свойства

3.2.10. Технология изготовления и контроль живой вакцины против пастереллеза

3.2.10.1. Подготовка посевного материала

3.2.10.2. Глубинное культивирование

3.2.10.3. Сушка, отмывка, концентрирование

3.2.10.4. Оценка безвредности и иммуногенности вакцины 3.2.11. Производственные испытания вакцины

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц"

В настоящее время птицеводство относится к интенсивно развивающейся отрасли сельского хозяйства. В связи с интенсификацией отрасли, созданием и массовым распространением новых конкурентно способных линейных и гибридных кроссов, первостепенной задачей является повышение сохранности молодняка и взрослой племенной птицы.

Одной из инфекционных болезней, имеющей широкое распространение и обладающей высокой контапюзностью, является пастереллез. Пастереллез представляет серьезную проблему в птицеводстве и животноводстве, поскольку возбудитель - P. multocida обладает способностью мигрировать от одного вида птиц к другому и разным видам животных, приживляться в их организме и вызывать заболевания опасные для них (А.Н. Борисенкова, 1992).

Экономический ущерб, наносимый пастереллезом птицы, характеризуется высокой летальностью при остром течении заболевания и сопровождается снижением яйценоскости и процента выводимости цыплят, ухудшением кондиционных качеств мяса при хроническом течении.

Анализ эпидемиологических обследований, проведенных в больницах различных стран мира, а также анализ зарубежной медицинской литературы, свидетельствует о том, что проблема пастереллезов актуальна и для медицины (И.А. Бакулов, 1995, E.Aldova et al., 1992, H.I. Chen, K.Hulten, J.E.CIarridge, 2002, B.S.Huber, D.V.Allred, J.G.Carmen, D.D.Frame, 2002). В России заболевание практически неизученно, что связано с низким уровнем знаний медицинских работников о этиопатогенезе данного заболевания, а также с отсутствием средств ее диагностики (Ю.Г. Степаншин, И.Н. Манзенюк, Э.А. Светоч, 1997).

Нерациональное применение химиотерапевтических средств широкого спектра действия способствует естественной селекции антибиотико-резистентной микрофлоры, что значительно усугубляет эпизоотическую ситуацию в птицеводческих хозяйствах нашей страны.

В основе борьбы с пастереллезом, помимо общих ветеринарно-санитарных и зоотехнических мероприятий, лежит специфическая профилактика.

Живые слабовирулентные пастереллы в сравнении с инактивированными, а также с живыми авирулентными пастереллами обладают выраженной иммуногенностью (В.В. Каширин, 1995). Согласно данным зарубежной литературы, живые аттенуированные штаммы более эффективны как вакцина, чем инактивированные штаммы (Dougan, 1994; Marsden et al., 1996; Simmons et al., 1998; MSkela, 2000).

Для профилактики пастереллеза птиц в России выпускают сухие живые вакцины против пастереллеза водоплавающей птицы из штаммов АВ и К Краснодарской НИВС. В ГНЦ прикладной микробиологии предложен штамм SM-1, полученный в 1995г Ю. Г. Степаншиным с соавторами из вирулентного эпизоотического штамма P. multocida № 576 и относящегося к серотипу Д. По данным зарубежной литературы у птиц выделены серотипы А и Д. В настоящее время за рубежом созданы и проходят испытания живые вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, свиней, кроликов, птицы. Основа таких вакцинных препаратов - аттенуированные штаммы возбудителя, полученные различными путями, в том числе - индуцированного мутагенеза и дальнейшего отбора мутантных производных возбудителя, устойчивых к антибиотикам. Антибиотикоустойчивые генетические маркеры позволяют дифференцировать вакцинные штаммы от полевых (Э.А. Светоч и др.2003).

Проблема специфической профилактики пастереллеза, несмотря на многолетнее применение вакцин, в условиях промышленного птицеводства, относится к числу недостаточно решенных и нуждается в дальнейшей разработке и совершенствовании.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является получение эффективного вакцинного препарата против пастереллеза птиц, представляющего сухую живую вакцину на основе аттенуированных штаммов Раз1еиге11а тиКоаёа БМ - 1 и ЬА - 25, методов ее контроля и применения, разработка технологии производства.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- разработать способ получения аттенуированных штаммов пастерелл, отвечающих современным требованиям, предъявляемые к вакцинным штаммам;

- селекционировать аттенуированный штамм;

- изучить влияние продолжительности культивирования в жидкой питательной среде на основе гидролизатов из непищевого сырья на образование капсулы и накопление капсульного антигена в процессе роста пастерелл.

- создать технологию производства вакцины против пастереллеза птиц на основе аттенуированных штаммов серотипов А и Д (БМ-1, ЬА-25).

- определить оптимальные дозы и разработать схему вакцинации для птицы

- изготовить экспериментальные серии вакцины и испытать ее в лабораторных и производственных условиях;

-разработать проект нормативно - технической документации (технические условия, временное наставление по применению) препарата;

Научная новизна работы

Путем индуцированного мутагенеза получен аттенуированный штамм Раз1еиге11а тииоас1а ЬА - 25, обладающий протективными свойствами и низкой остаточной вирулентностью.

Изучена морфология и ультраструктура пастерелл аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25, в сравнении с типовыми штаммами у птиц.

Изучен процесс капсулообразования и динамики накопления капсульного антигена культуры Р.тикоас1а в зависимости от продолжительности культивирования на питательной среде из непищевого сырья.

Показана возможность использования питательной среды на основе гидролизатов из непищевого сырья: рыбной муки, казеина, сгустков крови вместо мясных переваров без потери выхода биомассы и сохранением антигенных свойств при культивировании пастерелл.

Разработана технология изготовления и контроля «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц».

Основные положения выносимые на защиту

1. Путем индуцированого мутагенеза, при применении ультрафиолетового облучения, получен аттенуированный штамм ЬА - 25, имеющий генетический маркер, что позволяет дифференцировать его от эпизоотических штаммов пастерелл.

2. Полученный штамм обладает протективными свойствами и низкой остаточной вирулентностью и сохраняет свои свойства.

3. «Сухая живая вакцина из аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц» обладает низкой остаточной реактогенностью и формирует специфический иммунитет.

4. При культивировании в жидкой питательной среде на основе гидролизатов из непищевого сырья, клетки пастерелл, на примере штамма ЬА - 25, в фазе замедления скорости роста и в начале стационарной фазы, обладают более выраженным капсулообразованием, в отличие от других фаз роста.

Научно-практическая значимость работы

Получен аттенуированный вакцинный штамм Р.тикоаёа ЬА - 25, который можно рекомендовать для изготовления биопрепарата «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц».

Разработана технология изготовления, контроля и применения препарата «Сухой живой вакцины на основе аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц».

Испытан в производственных условиях препарат «Сухая живая вакцина на основе аттенуированных штаммов БМ - 1 и ЬА - 25 против пастереллеза птиц». Данный препарат отличается низкой остаточной вирулентностью и высокой иммуногенностью, что дает возможность его широкого применения в ветеринарной практике.

Применение питательной среды из смеси гидролизатов позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с себестоимостью биопрепаратов полученных с применением сред из мясных переваров.

2. Обзор литературы 2.1. Общие сведения

Пастереллез, вызываемый бактериями вида Pasteurella multocida, высококонтагиозное заболевание многих видов сельскохозяйственных животных, с высокой летальностью и тенденцией к стационарности.

Пастереллез регистрируется повсеместно (D.L. Dillehay et al., 1991, В.К. Yeo et al., 1993, M.C.L. De - Alwis et al., 1993, P.J. Kelly et al., 1994, A. Voigts et al., 1997, P.J. Blackhall et al., 1998). Возбудители пастереллеза поражают крупный рогатый скот, овец, свиней, буйволов, лошадей, домашнюю и дикую птицу, собак, грызунов, пушных зверей и др. животных (А. Н. Борисенкова, 1971, 1983, Н.П. Чистов и др., 1973, G.R. Carter, 1967, 1981, K.R. Rhoadez et al., 1992, G.Zhao et al., 1992, J.R. Brito et al., 1993).

Бактериологическими исследованиями установлено широкое носительство пастерелл. По данным Е.И. Буткина (1972), Е.М. Кожевникова (1974), культуры P. multocida выделяли от 88 видов млекопитающих и 44 видов птицы. Многие авторы отмечают, что данные микроорганизмы нередко являются обитателями респираторного тракта клинически здоровых животных (В.И. Павлов, 1978, Н.А. Масимов, 1988, G.R.Carter, 1967, J.C. Glorioso et al., 1982, D.J.Weber et al., 1984, C. Pijoan et al., 1990, M. Kruger et al., 1993). Процент выделения P.multocida от здоровых сельскохозяйственных животных колеблется в пределах от 10 до 19,3% (Ш.К. Курбанов, 1988). Smith Y.E.(1955),выделил P. multocida в 54% случаев из миндалин и в 10% случаев — из полостей носа от 100 здоровых собак. На основании своих данных и анализа литературы, опубликованной до 1955 г. по выявлению этого вида бактерий, он установил, что выделение пастерелл варьировало от 3,5 до 7 % у крупного рогатого скота, буйволов и до 90 % - у кошек. Имеются также данные об изоляции пастерелл в 6% случаев из макроскопически неизмененных легких, в 63% из миндалин здоровых свиней и в 44% - при наличии воспалительных процессов в легких (Р.В. Душук, 1985).

Высоковирулентные штаммы P. multocida вызывают геморрагическую септицемию животных и холеру птиц, однако частота поражаемости и важность пастерелл различных видов в качестве потенциального патогенного агента, стали известны лишь после интенсивного исследования вирусных заболеваний, которые показали, что слабовирулентные штаммы пастерелл чаще являются возбудителями вторичных инфекций (Р.В. Душук, 1998).

В настоящее время общепризнано, что помимо геморрагической септицемии и холеры птиц P. multocida вызывает и другие формы пастереллеза с клиникой пневмонии, мастита, атрофического ринита, менингита, энцефалита, абортов и абсцессов у разнообразных домашних и диких животных во многих странах мира (В.И. Геведзе, 1987, N.J.L. Gilmour, 1978, G.J. Giles et al., 1980, Lugtenberg et al., 1986, J.M. Rutter,1985, K.B. Pederson, 1988, A.S. Ward, 1990, S. Lamiere et al., 1992)

Несмотря на то, что первое сообщение об этом заболевании было сделано еще в 1919 году (цит. по W. Frederiksen, 1993), до 60-х годов пастереллез у человека выявлялся довольно редко и считался инфекцией животных. К настоящему времени эта инфекция зарегистрирована и интенсивно исследуется в странах Западной Европы, США и Канаде. Исследования, проведенные в Швеции на 146 инфицированных людях за период с 1989 по 1992 годы, позволили выделить 159 штаммов пастерелл, из которых 95 были типированы как Р. multocida, остальные относились к видам P. canis, P. stomatis, Р. séptica, P. dogmatis (Е. Holst et al., 1992). Случаи заболевания людей пастереллезом отмечены также в Японии, Франции, Испании.

Результаты исследований, проведенных в последние годы, подтверждают возможность прямой трансмиссии Р. multocida от кошек не только к животным, но и к человеку. При этом Р. multocida у кошек выделяли в 65% случаев и 1,4% - у собак в, основном, в соскобах с десен (J. Ganiere et al., 1992). Клинические формы проявления пастереллеза очень разнообразны.

К настоящему времени зарегистрированы заболевания людей пастереллезом с клиникой синусита, фарингита, отита, трахеита, пневмонии, менингита, перитонита, гастроэнтерита, цистита, вагинита, эндокардита, перикардита, септического артрита, остеомеилита, конъюнктивита, эндофтальмита, абсцессов на коже и подкожной клетчатке, печени, почках и бартолиниевой железы (Burne F. D. et al 1979, Itoh M. Et al., 1980, Singh C.P., et al., 1983, Weber J. D., et al., 1984, Kumar A., et al., 1991, Caldeira L et al., 1993, Giacomini. T et al, 1993, Fredericsen. W., 1993)

Пастереллез относят к числу опасных профессиональных заболеваний людей, занятых в различных областях животноводства и птицеводства (Fransis D.P., et al., 1975). Установлено, что пастереллы не являются постоянными обитателями верхних дыхательных путей или пищеварительного тракта человека и большинство заболеваний возникает при контактах с животными (Carter G.R., 1967). В 80 из 136 подобных случаев обнаружена первичная респираторная инфекция, но имеются также сообщения об асептических абсцессах, аппендицитах, заболеваниях центральной нервной системы, обусловленных пастереллами (Bruun В.А., 1983, Thompson С.М., 1984, Душук Р.В., 1988).

Впервые бактерия Pasteurella была обнаружена в крови птицы больной птичьей холерой в 1877 году. В 1880 году возбудителя холеры кур в чистой культуре выделил и охарактеризовал его морфологию и биохимию Луи Пастер. Название Pasteurella присвоено возбудителю в 1910 году в его честь.

Исследования, положившие начало изучению пастереллезов, провел в 1878 году O.Bollinger, изучая болезнь диких животных и крупного рогатого скота, характеризующуюся сильной инфильтрацией и множественными геморрагиями на серозных и слизистых оболочках различных органов. В 1885 году Kit изолировал микроорганизм из крови больных телят и назвал его Bacterium bipolarmulticidium.

Позже было отмечено, что по ряду признаков заболевание, которое описал O.Bollinger, имело много общего с холерой кур, а также энзоотической болезнью диких свиней. На этом основании в 1886 году F. Huppe объединил их под общим названием " геморрагическая септицемия". За указанный период возбудители геморрагической септицемии были выделенны от ряда животных и по зоологической классификации Линнея получали название в соответствии с животным, от которого были изолированы: В. suiseptica, В. boviseptica, В. aviseptica и т.д. (цит. по S.N.Hussani, 1975).

По современной классификации пастереллы объединены в секцию 5, семейство Pasteurellaceae, в котором один род - Pasteurella. Род включает много видов, основные из которых Pasteurella multocida с подвидами (séptica и gallicida) P. dogmatis, P. stomatis, Р. gallinarum, P. canis, P. ananis, P. langaa, P. avium, P. aeroenes, P. haemolitica, P. pneumotropica, P. volantium, P. ureae. Систематику рода нельзя считать законченной, на основании изучения ДНК гомологии P.aeroenes, P.haemolitica, P. pneumotropica оказались близки к бактериям рода Actinobacillus.

Из 9 видов, официально относящихся к роду Pasteurella (согласно «Руководству по систематике бактерий Бержи» за 1985 год), наиболее важное значение в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных и птиц принадлежит виду Pasteurella multocida (D.A. Barnum, 1990, E.L. Biberstein et al., 1991, G. Zhao et al., 1992).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Леонов, Александр Владимирович

5. Выводы

1. Путем индуцированного мутагенеза получен аттенуированный штамм ЬА - 25 имеющий генетический маркер, что позволяет его дифференцировать от эпизоотических изолятов пастерелл, сохраняющий приобретенные свойства, и обладающий протективной активностью и низкой остаточной вирулентностью.

2. Наиболее выраженным капсулообразованием на среде на основе гидролизатов из непищевого сырья обладают пастереллы в фазе замедления скорости роста и в начале стационарной фазы, наступающей через 8 часов культивирования.

3. Разработана технология изготовления «Сухой живой вакцины из аттенуированных штаммов БМ-1 и ЬА — 25 против пастереллеза птиц»

4. Разработана схема вакцинации и определены оптимальные дозы пастерелл в живой вакцине для кур - 400 млн. м.кл.

5. Полученные экспериментальные серии вакцины прошли лабораторные и производственные испытания (в неблагополучном по данному заболеванию хозяйстве) с положительными результатами.

6. Практические предложения

Представлены для рассмотрения и согласования в Департамент ветеринарии Минсельхоза России проект технических условий и временное наставление по применению «Сухой живой вакцины против пастереллеза птиц»

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонов, Александр Владимирович, Оболенск

1. Алимов A.M., Котылев O.A. Сравнительная оценка питательных сред при культивировании вакцинного штамма листерий АУФ. Ученые записки КВИ. Казань: 1975. -Т. 119.-158 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М. - 1962. Бакулов И.А., Буткин Е.И., Ведерников В.А., Юрков Г.Г. Эпизоотология с микробиологией. - М.: "Агропромиздат", - 1987.

3. Бакулов И.А., Васильев Д.А., Козлова Д.И.// Вопр. вет. микробиол., эпизотол. и вет. сан. экспертизы. - Ульяновск, 1994 (1995).- 4.2. - С. 26 - 32.

4. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992.

5. Баснакьян И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. М.: Наука, 1982.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. В 2 т. М.: Мир, 1989.

7. Борисенкова А.Н. Изучение иммуно-биохимических свойств штаммов пастерелл типа "А" // Болезни птиц. -1971. т.7. - № 18. - с. 297-300.

8. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза // Птицеводство 1983. - № 12. - с.26.

9. Борисенкова А.Н. Антигенная, иммунохимическая и биологическая характеристика P.multocida и специфическая профилактика пастереллеза птиц: Автореф. дис. д-ра вет. наук: Санкт Петербург, 1992.40 с.

10. Воронин A.M. // Успехи микробиологии.- 1983. Т.18. - С.143 - 163.

11. Бухвальдер Р., Фухс Х.-В., Хайдер Г., Хипе Т. и др. Иммунопрофилактика болезней животных. Пер. с нем. М.: Колос, 1981. - 415 с.

12. Буткин Е.И., Плеханов Б.П. Испытание имульгированных вакцин против пастереллеза птиц // Научные труды, Воронежского сельскохозяйственного института. -1972. т.70. - с.22 - 25.

13. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций. Журн Микробиол. 1984. - № 4. - 3 - 8 с.

14. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич A.B. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига: Зинатне, 1987. -263 с.

15. Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Борзилов А.И. Получение вакцинных штаммов сальмонелл с помощью инсерционного мутагенеза// Ветеринария. 1997.- №9. - С.20 - 24.

16. Галиакберова Н.И., Алимов A.M., Макаев Х.Н. Изыскание питательной среды и оптимизация условий культивирования сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 июня 2001г. Щелково: 2001. - 103 - 106 с.

17. Галиакберова Н.И., Алимов A.M., Макаев Х.Н. Влияние дозы и фазы роста посевного материала на выход бактериальной массы сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 декабря 2002г. Щелково: 2002. - 91 -93с.

18. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. Минск. Урожай. 1989. с.135.

19. Геведзе В.И., Фарнаков Н.П., Спицерев А.Х. Нервная форма пастереллеза у крупного рогатого скота // Ветеринарная наука производству. 1987. - в.25. - с. 17.

20. Герхард Ф. // Методы общей бактериологии. Пер. с англ. М.: Мир, 1984. Т.З

21. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 227 - 246 с.

22. Душук Р.В. Мат. Всес. Конф., «Эпизоотол. эпидемиол., средства защиты, диагностики, терапии и специфич. проф. инфекц. болезней, общих для человека и животных». — Львов; 1988.

23. Душук Р.В., Романенко Э.Е., Шапошникова Е.К. и др. Антигенная характеристика Pasteurella multocida и этиологическая значимость сероваров // Журн. микробиол. эпидем. и иммунология. 1998. - №3. - С. 108 -112.

24. Емельяненко П.А. Учение об инфекции и иммунитете // Ветеринарная микробиология. М.: Колос, 1982. - 82 - 137 с.

25. Жданова Л.Г Значение исследований по физиологии патогенных микроорганизмов в вакцинном производстве. Труды Московского НИИВиС. М.: 1979. - 18 — 28 с.

26. Заерко В.И. Производство живых вакцин против сальмонеллеза животных на питательных средах из непищевого сырья: Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 1996. - 18с.

27. Заерко В.И., Ситьков В.И., Тутов И.К. Совершенствование специфической профилактики пастереллеза // Ветеринария 2000. № 6. - с.20 - 22.

28. Заерко В.И., Разработка и внедрение универсальной технологии изготовления, контроля и применения вакцин против пастереллеза животных: Автореф. дис. д-ра вет. наук.-М., 2002.-47с.

29. Ильина Т.С. // Генетика. 1981. - Т. 17. - № 1.

30. Илюхин В.Н. // Журн.микроб. 1985.- №2. - С. 110 - 114.

31. Каширин В.В. Иммуногенные свойства штаммов Pasteurella multocida // Ветеринария 1995. №10. - с.25 - 28.

32. Ковалев В.Ф., Волков И.Б., Виолин Б.В., Ортман Р.А. и др. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии: Справочник. М.: ВО Агропромиздат, 1988. - 222 с.

33. Ковалев H.A., Музычин С.И., Бутьянов Д.Д., Антюков М.А. и др.; Под ред. H.A. Ковалева Профилактика инфекционных болезней животных. Минск: Ураджай, 1988. - 65 -68 с.

34. Кожевников Е.М. Локализация P.multocida в организме птицы // Ветеринария. -1974. -№1. с.59 - 61.

35. Курбанов Ш.К. Характеристика серологических вариантов P.multocida, выделенных от телят // Проблемы лейкоза и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. 1988. - с. 103 - 105.

36. Леонов A.B., Гусев В.В. Изучение иммуногенного родства аттенуированного штамма SM — 1 при экспериментальном пастереллезе мышей// Научн. основы производства вет.биолог.препаратов: Тез.докл.междун.научно практ.конф. 24 - 25 апреля 2003 г.

37. Леонов A.B., Гусев В.В. Оценка протективных свойств аттенуированного штамма культуры P.multocida LA 25 //Научн. основы производства вет.биолог.препаратов: Тез.докл.междун.научно - практ.конф. 5-6 октября 2004 г.

38. Леонов A.B., Гусев В.В. Получение аттенуированного штамма P.multocida

39. Ветеринария 2004.- № 10.- С.23 - 26.

40. Масимов H.A. Значение пастереллоносительства при респираторных инфекциях телят // Проблемы лейкоза и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. -1988.-с. 97-99.

41. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: «Триада-Х», 1999. — 272 с.

42. Миллер Дж. // Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. М., Мир.1976.4 3. Мосичев М.С., Складнев A.A., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.

43. Павлов В.И. Изучение биологических свойств эпизоотических штаммов пастерелл и культур, выделенных от свиней пастереллоносителей // Сб. науч. тр. СибНИВИ. -1978.1. В.32.-С.98- 102.

44. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Пер. с англ. -М.: Мир, 1978.

45. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М. Медицина., 1986.

46. Покровский В.И. Медицинская микробиология . М.: ГЭОТАР Медицина. - 1988.

47. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. М.: Наука, 1983.

48. Попова Т.Е., Шегедевич Э.А., Клицунова Н.В. Характеристика поверхностных антигенов Pasteurella multocida, выделенных методом вводно солевой экстракции // Биотехнология. - 2000. - №4. - С. 15-21.

49. Работнова И.А., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизма. М.: Наука, 1979.

50. Работнова И.А., Баснакьян И.Н., Боровкова В.М., Запорожцев J1.H. Процессы культивирования микроорганизмов. Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1982. - №4. - 559 - 573 с.

51. Работнова И.Л. // Микробиология. 1980. - Т.49, вып.4.- С. 634 - 638.

52. Равилов А.З. с соавт. Микробиологические среды. Казань: ФЭН, 1999. - 398 с.

53. Раевский A.A. Разработка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин. Автореф. дис. канд. биол. наук. Щелково, 2002.

54. Раевский A.A. Перспективное техническое направление культивирования бактерий при производстве вакцин. Материалы Международной науч.-практ. конференции 24-25 апреля 2003г. Щелково: 2003. - 61 - 64 с.

55. Рахманин П.П., Самуйленко А.Я., Ломакина Т.А. Основные направления развития агробиологической промышленности России. // В кн. Курская биофабрика. К 100-летию биологической промышленности России. Курск: 1996.

56. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы биотехнологии производства биологических препаратов (Теоретические основы, технологические линии оборудования). В 2 т. М.: 2000. -Т. 1.-376 с.

57. Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Панин А.Н., Гусев В.В. и др. Вакцина против сальмонеллеза свиней. Приоритет №2003116802 от 4 июня 2003 г.

58. Сидоров М.А. // Методические рекомендации по изготовлению типоспецифических сывороток и их применению для серологической типизации Р. multocida -1984.

59. Степаншина В.Н., Коробова О.В., Степаншин Ю.Г., Светоч Э.А., Гусев В.В. Иммунохимические свойства белка капсулы P.multocida и его роль в процессе диссоциации микроба// Биотехнология. 1996. -№11. - С. 16-21.

60. Степаншин Ю.Г., Манзенюк И.Н., Светоч Э.А. Pasteurella multocida: инфекции у человека// Антибиотики и химиотерапия. 1997. - вып. 42. - № 1. - С. 37 - 44.

61. Степаншин Ю.Г., Манзенюк И.Н., Светоч Э.А., Гусев В.В., Душук Р.В Получениеи оценка свойств аттенуированного штамма P.multocida SM 1 // Ветеринария. - 1998. - № 9. -С. 16-19.

62. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б.; Под ред. М.А. Сидорова Определитель зоопатогенных микроорганизмов: справочник. М.: Колос, 1995. - 201 - 204с.

63. Фробишер М. Основы микробиологии. М.: Мир, 1963.

64. Чистов Н.П., Сычев Н.В. Опыт борьбы с пастереллезом и кампилобактериозом на племенных птицеводческих заводах.// Болезни птиц. 1973. - т.9. - № 20. - с.89.

65. Шубина E.H., Скичко Н.Д., Попова Т.Е. Динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования. Тез. докл. междун. научно -практической конференции 24 25 апреля 2003 г. - Щелково. - с. 72 - 73.

66. Ярцев М.Я. Разработка технологии производства живых сухих вакцин против пастереллеза птиц, рожи и бруцеллеза животных (экспериментальные исследования и внедрение) Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1991.

67. Ярцев М.Я., Баснакьян И.А., Раевский A.A. Разработка технологии производства живых сухих вакцин против пастереллеза птиц и рожи свиней // Журн. микроб, и эпидемиолог. — 1993. №3. - С.63 - 70.

68. Ярцев М.Я., Бушуева Н.Б., Раевский A.A., Анисимова J1.B. и др. Технология промышленного производства бактериальных вакцин.// Ветеринария. 1998. - №3. - 22 - 24с.

69. Ярцев М.Я. Специфическая профилактика и технология вакцинного производства при сальмонеллезах.// Ветеринария. 1996. № 8. - 47 - 51 с.

70. Ярцев М.Я. Показатель роста микроорганизмов в управляемых процессах культивирования// Ветеринария. 2000. № 4. - 25 - 28 с.

71. Aldova F., Frederiksen W., Panckova V. //Zbl. Bacteriol. Hyg. 1992. - Bd.277(l). -S.139-143

72. Bain R.V.S. Studies on hemorrhagic septicemia of cat Iv. A preliminary ehamination of antigens of P.multocida tupe 1 // Brit.Vet.J. 1955. -111.- p.492 - 498.

73. Barnum D.A. Socioeconomic Significance of the HAP Group // Can.J.Vet.Res. 1990. -v.5. -№4. -p.l - 5.

74. Biberstein E.L. et al.Our understanding of the Pasteurellaceae // Canad. J. Vet. Res. -1990.-V. 54.-P. 78-82.

75. Blackhall P.J., Fegan N., Chew G.T.I., Hampson D.J. Population structure and diversity of avian isolates of Pasteurella multocida from Australia // Microbiol. Reading. 1998. - Vol. 144 ( pt. 2 ). - P. 279 - 289.

76. Bradford M.M. A rapid and sensitive metod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the princeple of protein dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V.72. — N. 1. — P.248 -256.

77. Brito J.B., Piffer I. A., Wentz I., Brito M.A. Capsular types and toxin production by shains of P.multocida isolated from pigs in Sontherer Brazil // Rev. Microbiol. 1993. - v.24. № 2. -p.94 - 97.

78. Brogden K.A. et.al., Serologic tupes and phusiologic characteristics of 46 avian Pasteurella anatipestifer cultures // Avian Dis. 1978,26:891-89

79. Bruun B.A. //Acta Pathol. Microb. Immun. Scand. Sect. B. 1983. - V. 91. - P. 329331.

80. Carter G.R. Studies on P.multocida .1. A hemagglutination test for the identification of serological types //Amer.J.Vet.Res. 1955. - v. 16. - № 3. - p.481 - 484.

81. Carter G.R. Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella hemolitica // Advance in Veterinary Sciens. -1967. V.l 1. - P. 128 - 158.

82. Carter G.R. //Handbuch der bacteriellen Infectionen bei Tieren. 1981. - Bd.3. - S.557-593.

83. Coulondre C., Miller J.H. Genetic studies of the lac repressor.IV. Mutagenic specifity in the lac I gene of Escherichia coli // J. Mol. Biol., 1977. 117, 577 606.

84. Chatfield S.N. et al. Construction of a genetically defined Salmonella typhi Ty2 aroA, aroC mutant for the engineering of a candidate oral typhoid-tetanus vaccine// Vaccine. 1992. 10. P.53 -60.

85. Chen T.Y. et al. // Guandong Agricult. Sci. 1985. - V. 2. - P. 37 - 41.

86. Chen H.I., Hulten K., Clarridge J.E. Taxonomic subgroups of Pasteurella multocida correlate with clinical presentation// J. Clin. Microbiol. 2002. Sep; 40 (9): 3438 41.

87. Chengappa M.M., Carter G.R., Chang T.S. A streptomycin dependent live pasteurella multocida type - 3 vaccine for the prevention of fowl cholera in turkeys // Avian Dis. 1979. Jan. -Mar.; 23 (1): 57-61.

88. Confer A.M. et al. Immunogens of Pasteurella // Vet.Microbiol. 1993. - V. 37. - P.3 - 4.

89. De alwis M.C.L. The epidemiology of haemorrhagic septicaemia in Srilanka // Australian Center for international Agricultural Research. - 1993. - № 43. - P. 98 - 102.

90. Diallo I.S., Bensick J.C., Frast A.J. Molecular studies on avian strains of Pasteurella multocida in Australia // Vet.Microbiol. 1995. Sep.; 46 (1 3): 335 - 42.

91. Dillehay D.L., Paul K.S., DiGicamo R.F., Chengappa M.M. Pathogenicity of Pasteurella multocida A:3 in flemissh Giantand new Zeland White rabbits // Lab. Anim. 1991. - Vol. 25. -№ 4.-P. 337-341.

92. Dougan G. The molecular basis for the virulence of bacterial patogenes implication for oral vaccine development. 1998. Microbiology, 140,215-224.

93. Dowden S., Glazerbrook J.A., Strike P. // Molec. gen. Genet., 1984, vol.193., p. 316321.

94. Fransis D.P., Holmes M.A., Brandon G. Pasteurella multocida: Infections after domestic animal bites and scratches // JAMA -1975; 233:42 45.

95. Frederiksen W. //Zbl. Bact. 1993; 279: 1:27 34.

96. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W. DNA Repair and Mutagenesis. Washington, 1995. -P. 407-486.

97. Ganiere J.P., Francoise E. et al. Characterization of P.multocida from gingival scraping of dogs and cats // Comp.Imm.Microbiol.& Inf.Dis. 1992. - v. 16. - № 1. - p.77 - 85.

98. Giles C.J., Smith I.M. et al. Chemical, bacteriological and epidemiological observation on infections atrophic rhinitic in Southern England // Vet.Rec. 1980. - v. 106. - № 1. - p.25 - 28.

99. Gilmor N.J. The role pasteurellae in respiratory diseases of cattle. In: Respiratory diseases in cattle // Ed.by W.B.Martin. Boston. - 1978. - v.3. - p.356 - 362.

100. Glorioso J.C., Jones G.W., Rush H.G., Penther L.J. et al. Adhesion of P.multocida to rabbit pharyngeal cells and its possibl role in rabbit respiratory tract infection // Inf.& Immun. -1982. v.35. - № 8. - p.l 103 - 1109.

101. Gourdon R. et al. // Ann. Inst. Past. 1957. - V. 93. - P. 251.

102. Hadson J.R. // Bull. Off. Inter. Epis. 1954. - V.42. - P.267-277.

103. Hemert P. // Progress in indust. Microbiol., 1974, 13.

104. Hertman I., Markenson Y., Michael A. A vaccine strain of P.multocida obtained by mytagenesis // Prog. Clin. Biol. Res. 1980, 47 : 125 32.

105. Holst E., Rollo F.J., Miorner H.Characterization and distribution of Pasteurella species recovered from infected humans // J.Clin. Microbiol. -1992.,30,11.

106. Hussani S.N. A tohonomic study of strains of P.multocida from a variety of animals and geographical sources // Ph.D., Thesis Univ.London.1975.

107. Itoh M., Tierno P.M., Milstoc M., Berger A.R. A unique outbreak of Pasteurella multocida in chronic disease hospital //Am J Publ Heath 1980;70:1170 1173.

108. Jonas M., Morishita T.Y., Anglick E.J. Characterization of nine Pasteurella multocidaisolates from avian cholera outbreaks in Indonesia. // Avian Dis. 2001. Jan Mar.; 45 (1): 34 - 42.

109. Kedrak A., Borkowska opaska B. Analysis of protein paterns of Pasteurella multocida strains isolated from poultry // Bull.Vet. Inst. Pulawy. 46, - P.149 - 155.

110. Kelli P.J., Chitauro D., Rohde C., Rukwava J., Maijok A., Davelaar F., Mason P.R. Diseases and management of basckuard chicken flocks in Chitungwiza, Zimbabwe // Avian Dis. -1994. - Vol. 38 (3 ). - P. 626 - 629.

111. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small Plasmids//J. Bacterid. 1981.-Vol. 145.-P. 1365.

112. Lariviere S., Leblanc L., Mittal K.R., Martinean G.R. Characterization of P.multocida from nasal cavities of piglets from farms with or without atrophic rhinitis // J.Clinic.Med. 1992. -v.30. -№ 6. - p.1398 -1401.

113. Lee M.D., Henk A.D. TnlO insertional mutagenesis in Pasteurella multocida // Vet. Microbiol. 1996, May; 50 (1- 2): 143 8.

114. Little P.A. et al. // Am. J. Vet. Res. -1943. № 4. - P. 110 - 112.

115. Lu.O., Rhoades K.R., Rimler R.B. A virulens of capsular strains of P.multocida for turkey // Av.Diseases. 1988. - v.32. - № l.-p.l21 -125.

116. Lu Y.S., Pakes S.P. Protection of rabbits aganst experimental pasteurellosis by a streptomycin — dependent P.multocida serotype 3: A live mutant vaccine / Inf. & Immun. 1981. Dec; 34 (3): 1018-24.

117. Lugtenberg B., Van Boxtel R., Evenberg D. et al. Biochemical and Immunological characterization of cell surfase proteins of P.multocida strains cousing atrophic rhinitis in swine // Inf.& Immun. 1986. - v.52. - № 4. - p. 175 - 182.

118. Makela P.H. Vaccines, coming of age after 200 years. 2000. FEMS. Microbiol. Rev. 24, 9 -20.

119. Monod J. La technigue de culture continue: theorie ef applications, Ann. Inst. Pasteur, Hans, 79,1960. pp. 390 - 410.

120. Mosier D.A. et al. Pasteurella haemolytica antigens associated with resistens to pneumonic pasteurellosis// Inf. & Immun 1989; 57: 711-716.

121. Nakamura M. et al. Plasmid-cured Salmonella enteritidis AL1192 as a candidate for a live vaccine// Inf.& Immun. 1985, 50(2):586 587.

122. Namioka S. // Trop. Agr. Res. 1980. - V. 13. - P.55-62

123. Nimi D. //J. Japan Soc. Vet. Scr. 1924. - V.3. - P. 309.

124. Ochi Y. // J. Japan Soc. Vet. Scr. 1933. - V. 12. - P. 185 - 197.

125. Ouch terlony O. // Handbook of Experimental Immunology / Ed.P.M.Weiz. Oxford, 1967.-P.665-706.

126. Pasteur L. Annales de Chime et de Physique, 3 // Serie, 58, - 324, - 1869.

127. Pederson K.B. Atrophic rhinitis in pigs: proposal for a ravised definition // Vet.Res. -1988.-v.l22/-№l.-p.l80-181.

128. Pijoan C., Trigo F. Bacterial adhesion of mucosal surfaces with special reference to P.multocida isolates from atrophic rhinitis // Can.J.Vet.Res. 1990. - v.54. - p. 16 - 21.

129. Prakash L., Sherman F. Mutagenic specificity: reversion of iso 1 - cytochrome C mutant of yeast // J. Mol. Biol., 79,65 - 82 (1973).

130. Prince G.H. Antigenic studies on P.multocida using immunodiffusion techniques 111. Relationships between strains of P.multocida // J.Comp.Pahtol. 1966. - v.76. - № 2. - p.321 - 322.

131. Prince G.H., Smith J.E.Antigenic studies on P.multocida. I. Identification andnomenclature of the solubl antigens of a bjvine haemorrhagic septicemia strains // J.Comp.Path. -1966. v.76. № 2. - p.303 -314.

132. Reinolds E.S. The use of lead citrate at higt pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J.Cell Biology .-1963.-V.17.- pp.208 212.

133. Rice Y.T., Bierer B.W., Dick Y.M. Vaccination of chickens througt the drinking water with a live, P.multocida vaccine // Poult. Sci. 1979. Jan., 58 (1): 18 22.

134. Rimler R.B. Cross protection factors of P.multocida passive immunization of turkey against fowl cholera caused by different serotypes // Avian.Dis. 1987; 31:884 887.

135. Roberts R.S. // J.Comp. Path.Therap. 1947. - V. 57. - P. 261 - 278.

136. Rohn O. Physicas methods of sterilisation of microorganisms. // Bacteriol. Rev., 9, -1945.-pp. 1 -47.

137. Rozenbush C.T., Merchant I.A. // J. Bacteriol. 1939; 37:69 89.

138. Rhoades K.R., Rimler R.B. Serological characterization of P.multocida strains isolate from wild ruminants as capsular serogroup B // Vet.Rec. 1992. - v.130. - № 5. - p.331 - 332.

139. Rutter J.M. Atrophic rhinitis in swine // Adv.Vet.Sci. 1985. - v.29. - p.239 - 279.

140. Ryter A. et al. // Z. Nathurforsch. 1958. vol. 138. p.587 607.

141. Scott W.J. // Advances in Food Research, 7, 83, - 1957.

142. Siiman R.W., Bagley B.I. The visoostat: Prodnetstet method ef feed rate control inoontinions fermentation. // Bloend, 21,1979. pp. 173 - 179.

143. Simmons C.P., Dunstan S.J., Tachejian M. Vaccine potential of attenuated mutants of

144. Corinebacterium pseudotuberculosis in sheep. // Inf.& Immun. 1998. 66, 3863 - 3869.

145. Singh C.P., Spurrell J.R.R.Pasteurella multocida endocarditis // Br Med J 1983;286:1862.

146. Smith Y.E. Studies on Pasteurella septica. I. The occurrence in the nose and tonsils of dogs // J. Comp.Pathol. 1955. - V.65. - P. 239 - 245.

147. Sykes Q. «Methods in Microbiology», Vol. 1., Academic Press, New York, 1969. - pp.77. 121. 148.

148. Syuto B., Matsumoto M. Purification of a protective antigen from a 2,5% saline extract ofPasteurellamultocida//Inf.&Immun. 1982.-V. 37.-N. 3.-P.1218-1226.

149. Tanaka A.Y. // Infect. Dis. 1926.- V. 38. - P. 421 - 428.

150. Thomson C.M. Neonatal septicemia and meningitis due to Pasteurella multocida // Pediatr. Infect. Dis. 1984. - V.3. - P.559-561.

151. Tsuji M., Matsumoto M. Immunochemical relationship of three antigens purified from Pasteurella multocida strain P-1059 // Am. J. Vet. Res. 1988. - V. - 49.- N.9. - P. 1510-1515.

152. Voigts A., Ngaisiue G., HentonM.M., Hubschle O.J.B. Haemorrhagic septicaemia due to Pasteurella multocida tupe B 2 in Namibia // Trop anim - health - prod. - 1997. Vol. 29 ( 4 ). -P. 247 - 248.

153. Ward A.S. Isolation of Pasteurellaceae from bovine abortions // J.Vet.Diagn.Invest. -1990. v.2. - № 1. - p.59 - 62.

154. Waymouth C., Ham R.G., Chappie P.J., eds. The Growth Requirements of Vertebrate Cells in Vitro. Cambrige: Univ. Press. London and New York, 1981.

155. Weber D.J., Wolfson J.S., Swartz M.N. et al. // Medicine; 63:2:4:399 405.

156. Wilson M.A., Duncan G.E., Nordholm B.M. Pasteurella multocida isolated from wild birds of North America: a serotype and DNA fingerprint study of isolates from 1978 to 1993 // Avian Dis. Jul. Sep., 39 (3): 587-93.

157. Woodgate R., Rajiagopalan M., Chi Lu, Eshols H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989.- Vol.86. P. 7301 - 7305.

158. Yeo B.K., Moknar I. Hemorragic septicaemia of buffalo in Sadah, Malaysia // Australian Center for international Agricultural Research. 1993. - № 43. - P. 112 -115.

159. Zoller M.J., Smith M. //Nucleic Acids Res. 1982. 10. 6487 6500.

160. Zhao g., Pijoan C., Murtangh M., Molitor T.W. Use of restriction endonuclease analisis and ribotyping to study epidemiology of P.multocida in closed swine herds // Inf.& Immun. 1992.-у.60.-№4. -р. 1401 1405.

161. Музей живых культур Государственного научного центра Прикладноймикробиологии принял в коллекцию авторский (ие) штамм (ы)

162. Pasteure lia multocida IA-25наименование микроба в латинской транскрипции, номер штамма, особое обозначение и генетическая характеристика в символах)

163. Штамм (ы) выделен (ы) и изучен (ы) Леоновым A.B. Государственного научного центра Прикладной микробиологиидолжность, ученая степень, фамилия, имя. отчество и инстигут-разработчик)

164. Штамм (ы) принят (ы) , в лиофилизированном состоянии в количестве 5 (ампул) ампул с приложением паспорта.

165. Штамму (ам) присвоен (ы) номер (а) 5057в коллекции музея живых культур Государственного научного центра Прикладной микробиологии.

166. Адрес депозитора 142279. Российская Федерация. Московская область. Серпуховский р-н. п. Оболенск.

167. Адрес коллекции 142279. Российская Федерация, Московская область. Серпуховский р-н. п. Оболенск. ГН

168. Первый заместитель руковод

169. Зав. музеем живых культур, к.м.н.1. В.Я. Волков В.М. Жирков1. УТВЕРЖДАЮ

170. СУХАЯ ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА1. ПТИЦ

171. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ (ТУ экспериментальное)

172. Вводится на опытную партию Срок введения с "^У" сс^мч^ £гоу200 Ну.

173. РАЗРАБОТЧИКИ: Научный консультант ГНЦ ПМ, доктор биологических наук профессор1. В.В. Гусев200^г.

174. Начальник отдела ГНЦ ПМ, кандидат технических наук1. Ю.П. Падерин6 " сл.яЛл 200^г.

175. Младший научный сотрудник ГНЦ ПМ .A&S^CT' " A.b. Леонов

176. Утверждаю / Первый заместитель1. Ъгнцпмаков В.Я. Ц 2004г.

177. Временное наставление по применению вакцины сухой живой против пастереллеза птиц1. Общие положения

178. Вакцину хранят в сухом темном месте при температуре от 2 до 10°С.

179. Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления при соблюдении указанных условий хранения.

180. Растворителем для вакцины служит чистая, прокипяченная в течение 10-15 минут и охлажденная до комнатной температуры, вода.

181. Вакцину в ампулах с нарушенной целостью или без этикеток, а также не использованную в течении 6 часов после растворения и ампулы из-под вакцины обеззараживают путем кипячения в течение 10 минут.

182. Порядок применения вакцины

183. Вакцину прменяют для профилактики пастереллеза кур, индеек в неблагополучных по этой болезни хозяйствах.

184. Лечебными свойствами вакцина не обладает.

185. За 7 дней до применения вакцины и в течение 7 дней после иммунизации из рациона птицы исключают антибиотики и другие лекарственные препараты, действующие на пастерелл.

186. Вакцинации подвергают только клинически здоровую птицу. Вакцина не вызывает осложнений.

187. Иммунитет у птицы наступает через 7-10 дней после введения второй дозы вакцины и сохраняется до 1 года.

188. О проведенной вакцинации составляется акт, в котором указывают количество и возраст привитой птицы, срок годности и дату ее изготовления, фамилии и должности лиц, проводивших вакцинацию.

189. Мы, нижеподписавшиеся^ , ЛАлл ро1. Л^Асоставили настоящий акт и том, что в период с иоо^Л^ту 200^ гпо «^6 » ихх^о^ 200Ч. г. было вакцинировано противиюигл^и-е ^о с/1 У\УУ\АЛЛАА„название инфек^онного заоолсианпя

190. Яооо УУыЖ .ГОЛОВ 1аМ^О\ААХ>\ЛУ\количество цифрами вил1Л жМотногов возрасте £5" -— сЫе^диен, месяцев, лет^

191. Для иммунизации использовали изготовленную ООО <(НПФ "Диавак"1. ЦЯСМЮ удурию Иуоииил^

192. С/ Полное наименование биопрепарата согласно Ликоткеи1. Серия № 3 У ^ контроль 31. От 5i0.OS.O4,

193. Дата изготовления препарата

194. Вакиинацию проводили согласно действующему наставлению по применению.

195. Случаев осложнений после иммунизации не наблюдалось.

Информация о работе

Леонов, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Оболенск, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леонов, Александр Владимирович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц"

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Леонов, Александр Владимирович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонов, Александр Владимирович, Оболенск

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и испытание сухой живой вакцины против пастереллеза птиц
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология