Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение факторов патогенности Pasteurella multocida с целью разработки нового поколения противопастереллезных вакцин

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов патогенности Pasteurella multocida с целью разработки нового поколения противопастереллезных вакцин"

£оо ? - А

На пробах рукописи

ШУБИНА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСГИ РавЬшгеНа тиНоаёа С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ . ПРОТИВОПАСТЕРЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИН

03.00. 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЩЕЛКОВО 2003

Работа выполнена во Всероссийском институте экспериментальной ветеринарии и на Федеральном государственном унитарном предприятии «Щелковский биокомбинат».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор,

лауреат Государственной премии СССР Н. Д. Скичко

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Э. А. Шегидевич

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор Д.И. Скородумов

Доктор ветеринарных наук, профессор В. И. Белоусов

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится » 2003 года в /О часов на

заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно -исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан « 2003г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю. Д. Фролов

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ { БИБЛИОТЕКА [

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы '

Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается концентрацией большого поголовья скота на ограниченной территории. В трудных экономических условиях современной России необходима не только правильная организация технологического процесса, но и высокая эффективность профилактических мероприятий против инфекционных заболеваний.

Такими заболеваниями являются пастереялезы сельскохозяйственных животных, вызываемые различными вариантами Pasteurella multoclda и Pasteurella haemolytica. Широкое Носительство этих микроорганизмов в верхних отделах дыхательного тракта здоровых животных, стрессы, связанные с транспортировкой, недостатками в условиях содержания, несбалансированного кормления, а также вирусные инфекции способствуют повреждению защитных механизмов органов дыхания, создают благоприятные условия для развития пневмонийных пастереллезов, имеющих очень большое распространение.

Различные формы пастереллезов наносят большой экономический ущерб сельскому хозяйству многих стран мира, входит в число наиболее распространенных заболеваний (А. Н. Борисенкова, 1971, 1983, В. И. Геведзе и др., 1980, М. А. Сидоров, В. И. Геведзе, 1983, Н. А. Масимов, 1992, Д. Ф. Осидзе, 1987, G. R. Carter, 1967, 1981, N. Mashiro et а].,1992, К. R. Rhoades et. Al., 1992, G. Zhao et. Ah, 1992, J. R. Brito et. Al., 1993). Разработка надежных средств специфической профилактики пастереллезов является актуальным вопросом в системе противоэпизоотических мероприятий.

Для борьбы с пастереллезами сельскохозяйственных животных учеными нашей страны и всего мира были разработаны живые и инактивированные вакцины, нашедшие широкое применение (Н. М. Никифорова, 1977, А. Н. Борисенкова, 1986, G. R. Carter, 1957, A. W. Confer et а]., 1985, R. D. Olson et al.,

1986, М. \У. Агаш е( а1., 1991, А. Мут1, 1992). Однако существующие вакцины изготавливаются из бактериальной массы пастерелл, выращенной без учета факторов патогенности, имеют ряд недостатков.

В связи с изложенным целесообразно усовершенствовать технологию промышленного изготовления противопастереллезных препаратов с учетом накопления, распределения, токсичности и перекрестной протективной активности биологических компонентов бактериальной клетки Р.п\иКоас1а, функционально относящихся к факторам патогенности возбудителя.

1. 2. Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы явилось изучение факторов патогенности Р.тиНос1с1а с целью разработки нового поколения вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1.2.1. В условиях Щелковского биокомбината проследить динамику накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе производственного глубинного культивирования и установить сроки накопления максимального количества поверхностных антигенов с учетом динамики роста

1.2.2. Изучить возможность адсорбции поверхностных антигенов пастерелл растворами хитозана, испытать возможные физические и сорбционные методы их концентрирования.

1.2.3. В опытах на лабораторных животных изучить токсические свойства соматических антигенов пастерелл различных серовариантов, их протективные характеристики при прямом и перекрестном заражении, а также токсичность промышленного адъюванта и его составляющих.

1.2.4. Усовершенствовать метод контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по серологическим вариантам А, В иБ с применением теста сывороточной защиты мышей и определением титра

антител к капсульным антигенам пастерелл в сыворотках крови иммунизированных подсвинков в РПГА.

1.2.5. С учетом полученных результатов изготовить и испытать опытные образцы поливалентной эмульгированной вакцины против различных форм пастереллезов сельскохозяйственных животных.

1.3. Научная новизна работы

В условиях производства прослежена динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования и испытаны физические и сорбционные методы их концентрирования.

Изучены токсические свойства соматических антигенов пастерелл различных серологических серовариантов P.multocida и прослежены их прямые и перекрестные протективные характеристики. Одновременно изучена токсичность минерального масла «Маркол» и эмульгаторов, входящих в состав эмульгированной вакцины.

Усовершенствован метод контроля иммуногенной активности серологических вариантов пастерелл, входящих в состав вакцины. Изучена возможность контроля иммуногенности с применением серологических тестов.

С учетом разработанных технологических приемов, по новой технологии изготовлены и испытаны опытные серии вакцины эмульгированной поливалентной против пастереллезов свиней, кроликов и пушных зверей.

1. 4. Практическая значимость работы..

Результаты проведенных исследований позволяют внести принципиальные изменения в технологию изготовления вакцин против пастереллезов сельскохозяйственных животных с учетом особенностей роста пастерелл в жидких питательных средах. Изучена токсичность и протективная активность соматических антигенов, что позволяет снизить реактивность противопастереллезных биологических препаратов и повысить их иммуногенность.

Разработан контроль иммуногенной активности эмульгированной поливалентной вакцины против пастереллеза свиней, кроликов и пушных зверей по серологическим вариантам А, В и О. Изучена возможность применения РПГА с целью определения титра антител к капсульным антигенам пастерелл для оценки эффективности противопастереллезной вакцины.

1. 5 Основные положения, выносимые на защиту:

1.5.1. Результаты изучения динамики накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе производственного глубинного культивирования и сроков накопления максимального количества поверхностных антигенов с учетом динамики роста

1.5.2. Результаты изучения возможности концентрирования поверхностных антигенов пастерелл физическими и сорбционными методами.

1.5.3. Результаты изучения в опытах на лабораторных животных токсических свойств соматических антигенов пастерелл различных серовариантов, их протективных характеристик при прямом и перекрестном заражении, а также токсичности промышленного адъюванта и его составляющих.

1.5.4. Метод контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по серологическим вариантам А, В и Б с применением теста сывороточной защиты мышей и определением титра антител к капсульным антигенам пастерелл в сыворотках крови иммунизированных подсвинков в РПГА.

1.5.5. Результаты испытания опытных образцов поливалентной эмульгированной вакцины против различных форм пастереллезов свиней, кроликов и пушных зверей.

1. 6. Апробация и публикация результатов.

Основные положения диссертации доложены: на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения В. А. Першина, 14 июля 1997 г.; на Пятой международной конференции «Новые

перспективы в исследовании хитина и хитозана», 25 - 27 мая 1999 г.; на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института (ВНИТиБЩ 8-9 июня 2000 г.; на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 24 - 25 апреля 2003 г.

1. 7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 3 графиками и 3 гистограммами. Список литературы содержит 217 источников, в том числе 100 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Исследования проводились в условиях бактерийного производства Федерального государственного унитарного предприятия «Щелковский биокомбинат», лаборатории бактериологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (ВИЭВ).

Штаммы. В работе использовали производственные штаммы Р^еигеПа ти1Юсяс1а, относящиеся к следующим серологическим вариантам по Картеру: 1231, Р.ти1юа<1а капсульного типа А, изолированный от больных пневмонией свиней; 681 Р.тиИскаба капсульного типа В, выделенный при геморрагической септицемии крупного рогатого скота; Т - 80 Р.тиИоас1а капсульного типа Д, изолированный от свиней с признаками пастереллезной пневмонии. Штаммы получали в ВИЭВ в лиофилизированном состоянии с сахарозо - желатиновой защитной средой в ампулах под вакуумом, хранили при температуре 4 °С.

Питательные среды: сывороточный бульон Хоттингера, сывороточный и кровяной агары Хоттингера, производственная питательная среда на основе перевара Хоттингера с рН 7,9 - 8,0, содержанием аминного азота не менее 175 -180 мг %.

Культивирование: культивирование P.multocida серологических вариантов А, В и Д проводили на плотных питательных средах в пробирках, чашках Петри и в жидких питательных средах в пробирках, флаконах, объемом 500 см 3 , бутылях, объемом 10 дм 3 . Производственное культивирование проводили в биореакторах французской фирмы «Лаваль», объемом 300 литров с ручной регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации.

Морфологические свойства выращенных культур изучали в мазках, окрашенных по Граму. Для обнаружения капсулы готовили тушевые мазки по методу Бурри - Гинса. Препараты изучали в световом микроскопе Биолам при увеличении х 100 в иммерсионной системе. Выращенные колонии проверяли на типичность роста и капсулообразование в косопроходящем свете. Типичные колонии имели характерное оранжевое свечение.

Оптическую концентрацию культур определяли фотометрическим методом на КФК - 2 по калибровочной кривой. рН измеряли на лабораторном иономере И - 135М.1.

Безвредность, токсичность, реактогенность и иммуногенность минеральных масел, адъювантов, соматических антигенов P.multocida трех серологических вариантов, а также опытных и производственных серий изучали на 36 подсвинках живым весом 10 - 12 кг, 27 кроликах массой 1,5 - 2 кг, 45 морских свинках массой 400 - 500 г, 75 белых мышах массой 20 - 25 г, 2425 белых мышах массой 16 - 18 г.

Серологические исследования: в качестве серологического теста применяли РПГА по тразиционной схеме с использованием пастереллезных антигенных и антительных эритроцитарных диагностикумов к капельным

антигенам пастерелл 0,3 % - ной концентрации. Тест проводился в лаборатории бактериологии ВИЭВ ведущим научным сотрудником Л. Я. Ставцевой.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования.

В соответствии с нормативно - технической документацией производственное глубинное культивирование пастерелл проводится до достижения стационарной фазы роста, без уделения внимания на сохранение биологически активных веществ, функционально относящимся к факторам патогенносги, в культуральной жидкости.

В начале работы нами была прослежена динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе промышленного глубинного культивирования и установлены сроки накопления их максимального количества.

В процессе реакторного культивирования отвирались почасовые пробы бактериальной суспензии от стадии адаптации до стадии стационарного роста. Исследовано 3 производственных культивирования. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из данных таблицы 1 в процессе производственного глубинного культивирования в реакторах происходило стабильное увеличение количества микробных клеток всех трех штаммов пастерелл.

Установлено, что фаза адаптации культуры к среде роста или лаг-фаза продолжалась до 6-го часа культивирования. Затем микробные клетки интенсивно делились до 10-го часа в фазе экспоненциального роста. Следующие 2 часа темп роста замедлялся, количество клеток увеличивалось незначительно (фаза замедления скорости роста), культура достигала фазы стационарного роста. Оптическая плотность культуры штамма А увеличилась с

10 до 12 часов роста на 0,8 млрд. / см3; штамма В - на 1,6 млрд. / см3; штамма Д на 1,94 млрд. / см3.

Таблица 1. Динамика накопления поверхностных антигенов Р.тиИоайа в кулмуральной жидкости в процессе культивирования.

Часы культивирования ОК, млрд. / см титр антител в РПГА

Штамм А-1231

4 4,9 1: 16

6 8,1 ±3,9 1:64

8 • 13,6 ±3,8 1:128

9 15,1 ±3,3 1:256

10 18,6+2,8 1:512

12 19,4 ±0,8 1:256

Штамм В - 681

4 5,6 1:32

6 7,13 ±2,4 1:64

8 11,26+2,8 1:128

9. 12,8 ±2,5 1:256

10 15,2 + 3 1:1024

12 16,8 ± 1,4 1:512

Штамм Д-Т-80

4 7,9 1: 32-1:64

6 9,8 ±2,6 1:64-1:128

8 14,7 ±4,5 1:128-1:256

9 16,48 ±3,95 1: 256

10 18,26 ±3,4 1:1024

12 20,2 ±0,6 1:512

Почасовые пробы подвергали центрифугированию при 14000 об / мин, фильтровали через миллипоровские пластины типа вв - 0,22. Далее полученные пробы культуральной жидкости исследовались в РПГА с антитеяьными диагностикумами к капсульным антигенам пастерелл.

Как видно из данных таблицы 1 параллельно с накоплением бактериальной массы в культуральной жидкости по мере удлинения срока выращивания наблюдалось нарастание титра поверхностных антигенов в среде роста

Через 4 часа культивирования выявлялся титр антигенов: штамм А - 1:16; В - 1:32; Д - 1:32 - 1:64. Далее через каждые 2 часа титр увеличивался в два раза до 10 часа (А - 1:512; В - 1: 1024; Д - 1: 1024). В 12-часовых пробах наблюдалось снижение титра антител в 2 раза (А - 1: 256; В - 1: 512; Д - 1: 512), при этом еще происходило незначительное накопление оптической концентрации клеток пастерелл.

Приведенные данные позволяют сделать заключение о том, что при производственном глубинном культивировании слабосвязанные слои поверхностных антигенов отделяются и переходят в культуральную жидкость, где могут быть обнаружены серологическими методами. По мере удлинения сроков выращивания биомассы пастерелл, титр поверхностных антигенов в культуральной жидкости нарастает, достигает максимума к 10 - му часу (для всех штаммов), а через 2 часа снижается в два раза, при этом оптическая концентрация клеток продолжает незначительно увеличиваться (для всех штаммов).

Из этого следует, что при промышленном культивировании полноценной культурой пастерелл производственных штаммов, с полностью сохраненными поверхностными антигенами, является 10-часовая культура.

2.2.2. Испытание возможности использования флокутнтов для концентрирования поверхностных антигенов пастерелл.

Материалы проведенных исследований свидетельствуют, что при промышленном культивировании пастерелл поверхностные антигены распределяются в культуральной жидкости.

С целью сохранения и концентрирования поверхностных антигенов пастерелл была испытаны методы их адсорбции растворами хитозана и других флокулянтов.

Во время производственного культивирования, отбирались почасовые пробы бактериальной суспензии от стадии адаптации до стадии стационарного роста

Исследовали сорбционные свойства анионных (гель гидроокиси алюминия и карбоксиметилцеллюлозу) и катионного (хитозан) флокулянтов с целью сравнения их осаждающих свойств антигенов пастерелл.

Испытывались условия осаждения (температура, рН, возраст культур, экспозициях отрабатывались различные концентрации хитозана, применялся хитозан с различным молекулярным весом (от 2 до 500 кДа) и степенью деацетилирования (СДА) в пределах 79 -97 %.

При получении наилучших результатов осаждения, отбирались пробы надосадочной жидкости и исследовались в РПГА с применением пастереллезного антительного эритроцитарного диагностикума к капсульным антигенам пастерелл. В качестве контрольных исследовали пробы культуральной жидкости, полученные в указанные выше сроки, осажденные центрифугированием при 14 тыс. об/мин.

Подбор концентрации растворов хитозана (то 0,5 до 10 %) показал, что наиболее эффективное осаждение клеток пастерелл достигается при использовании 1 % раствора, что соответствовало 0,02 % в пересчете на сухое вещество. Снижение концентрации хитозана до 0,5 % и увеличение ее до 10 % не улучшало связывающие свойства препаратов.

Вторым существенным условием осаждения клеток являлась величина рН. Установлено, что оптимальное значение находится в пределах 5,5 - 6,2 ед.

При этом наблюдали четкую картину связывания биомассы и разделения суспензий пастерелл на две фазы.

Большое влияние на активность растворов хитозана оказывал и его молекулярный вес. Использование хитозана с М>» 2, 10 и 35 кДа недостаточно эффективно. Осаждение клеток пастерелл проходило при использовании растворов хитозана с М\у в диапазоне 50 - 500 кДа. При этом наблюдали заметное разделение баксуспензий на осадок различной степени прочности и жидкую фракцию, представляющую собой кулыуральную жидкость. После внесения хитозана образование флокулянтов происходило уже через 1-2 мин. Полностью процесс заканчивался за 24 ч. Увеличение экспозиции до 48 - 72 ч не изменяло полученных результатов.

Сорбционные свойства хитозана проверяли на культурах пастерелл различных сроков роста В результате установлено, что клепки в бактериальных суспензиях 4-8 часовых культур в той или иной степени взаимодействуют с хитозаном. Однако наиболее полный эффект флокуляции наблюдали на более поздних сроках, а именно 10 - 12 часовых культурах.

Наиболее эффективно пастереллы осаждались при 4 °С образцами хитозана с М\¥ 50 - 250 кДа (СДА 79 %). Степень осаждения составила 95 -99,9 %. При более высоких температурах (22 - 37 °С) эффективность процесса снижалась до 62,7 - 84 % или образовавшиеся хлопья не оседали даже при длительной экспозиции. При этом хитозан с высоким обладал наименьшей флокулирующей способностью.

При анализе данных Р.ти1(:о<ас1а по сероварианту В можно отметить, что любой из использованных образцов хитозана довольно эффективно связывал бактерии этого штамма. Степень осаждения достигала 97,2 - 99, 9 %. Однако здесь, как и у штамма А, хитозан с 500 кДа при 22 и 37 "С формировал с бактериями не-оседающие крупные хлопья.

Культуры Р.ти11оа<1а сероварианта Д наиболее интенсивно связывались хитозаном с указанными выше М\у при 4 °С (степень флокуляции составила

97,7 - 99,9 %). Исключение составлял хитозан с М\у 100 кДа Здесь концентрация клеток в культуральной жидкости снижалась до 79 %. Отмечено, что повышение температуры сопровождалось снижением связывающей способности хитозана, особенно при его М\у 500 кДа

Резюмируя указанные в таблице данные, можно заключить что, характер и степень флокуляции клеток Р.тикосМа различных серовариантов зависели от целого ряда факторов, которые включают в себя температуру взаимодействия клеток с флокулянтом, М\у хитозана, степень его деацетилирования и др. Однако при всем многообразии условий эксперимента можно выявить некоторые общие закономерности. Клетки всех серовариантов Р.ти1юа<1а на различных сроках роста популяций эффективнее связывались хитозаном по мере увеличения его молекулярного веса. При этом температура осаждения заметно снижалась.

Так, если хитозан с 50 кДа флокулировал в условиях 22 - 37 °С, то хитозан с М\у 500 кДа почти всегда флокулировал при температуре 4 "С. Однако в целом сравнительный анализ выявил относительно ограниченную активность хитозана с 500 кДа Следует отметить, что наиболее эффективными для концентрирования клеток Р.тиКоаба являлись растворы хитозана с М\у 50 кДа (СДА - 85 %% 100 кДа

В данных экспериментальных условиях нам не удалось установить четкой зависимости характера и степени флокуляции пастерелл от «возраста» культур. И, наконец, при любых равных условиях эксперимента проведенные исследования позволили выявить степень зависимости связывания культур пастерелл от серовариантной принадлежности штамма В порядке возрастания эффективности связывания бактерий хитозаном штаммы можно расположить следующим образом: В, Д и А (99,9 %, 99,8 % и 99,2 %).

Параллельное использование анионных флокулянтов - гели гидроокиси алюминия и карбоксиметилцеллюлозы, для осаждения клеток пастерелл при различных условиях позволяло разделить бактериальные суспензии на

фракции. При этом надосадочная жидкость опалесцировала, осадок оставался рыхлым и занимал до 90 % объема

При получении наилучших результатов осаждения клеток, отбирали пробы надосадочной жидкости, фильтровали через миллипоровские пластины типа GS - 0,22. Пробы исследовали в РПГА с применением пастереллезного антительного эритроцитарного диагностикума к капсульным антигенам с целью исследования возможности концентрирования поверхностных антигенов данными сорбентами. Параллельно, в качестве контроля, тестированию подвергались культуральные жидкости, освобожденные от клеток центрифугированием при 14 тыс. об. / мин, также стерилизованные фильтрованием. Исследовались пробы, взятые на разных сроках трех производственных культивирований.

В пробах культуральной жидкости штамма А, освобожденной от клеток центрифугированием, в РПГА выявлялись следующие титры поверхностных антигенов: 6 часов - 1: 64; 8 часов - 1: 128; 10 часов 1: 512; 12 часов 1: 256. Аналогичные результаты были получены при исследовании культуральной жидкости, полученной осаждением растворами хитозана с различным молекулярным весом и разной степенью деацетилирования.

В центрифугированной культуральной жидкости серологического варианта В выявлялись следующие титры поверхностных антигенов: 6 часов -1: 64; 8 часов - 1: 128; 10 часов 1: 512; 12 часов 1: 256. В почасовых пробах культуральной жидкости штамма Д поверхностные антигены к 6 часам достигали титра 1: 64; к 8 часам - 1: 128 - 1: 256; к 10 часам - 1: 1024; к 12 часам - 1: 512. При сравнении титров капсульных антител в почасовых пробах культуральной жидкости штаммов В и Д, освобожденных от клеток пастерелл центрифугированием или осаждением хитозаном, выявлено, что титры не отличаются.

Изложенные данные свидетельствуют что, хитозан и другие сорбенты осаждают клеточные компоненты пастерелл, но не активны в отношении растворимых поверхностных антигенов.

2. 2. 3. Концентрирование поверхностных антигенов пастерелл методом ультрафильтрации на полых волокнах.

Проведенные исследования Р.ти11оас1а трех серологических вариантов с использованием различных флокулянтов показали, что поверхностные антигены невозможно концентрировать таким способом, в связи с чем нами был испытан метод ультрафильтрации на полых волокнах.

В работе использовали аппарат разделительный ультрафильтрационный на полых волокнах АР - 0,2 (ГО 117. 216. 00. 00. 00), предназначенный для концентрирования, разделения и очистки водных растворов биопрепаратов и биополимеров (ферментов, полисахаридов, вирусов и т.д.).

Промышленное глубинное культивирование производственных штаммов Р.тиИоаёа серологических вариантов А, В и Д проводили до 10-го часа роста, инактивировапи формалином (до 0,3 % - ной концентрации) 24 ч при 37 °С в реакторах периодически перемешивая. По окончании инактивации брали по 3 л бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугировали при 15 тыс. об/мин. Полученную культуральную жидкость концентрировали на ультрафильтрационной установке в 6 - 10 раз, фильтраты сохраняли. Концентраты и фильтраты трех серологических вариантов исследовали в РПГА с применением пастереллезных диагностикумов к капсульным антигенам в сравнении с титром капсульных антигенов в центрифугированной культуральной жидкости до ультрафильтрации. Всего было проведено концентрирование культуральных жидкостей Р.тиНоспс1а трех серологических вариантов 3 производственных культивирований.

Культуральную жидкость производственного штамма В ультрафильтровали до объема 300 мл (в 10 раз) в течение 0,5 часа Культуральная жидкость штаммов А и Д содержала большое количество слизи,

поэтому процесс ультрафильтрации замедлялся до 1 ч ( шт. А) - 1,5ч ( шт. Д). В результате было получено по 500 мл концентрата штаммов А и Д.

Проведенные серологические исследования показали, что уровень поверхностных антигенов в полученных концентратах повышался по сравнению с исходным уровнем в б - 10 раз. При исследовании в РПГА фильтратов культуральных жидкостей после ультрафильтрации, в них наличие капсульных антигенов не выявлено.

Результаты исследований показали, что методом ультрафильтрации на аппарате разделительном ультрафильтрационном на полых волокнах возможно концентрировать капсульные антигены пастерелл.

2.2.4. Токсичность и реактогенность минеральных масел и эмульгаторов, входящих в состав эмульгированных вакцин.

В состав адъюванта входит легкое минеральное масло и эмульгатор. В начале исследовали токсичность минерального масла отдельно, а затем к маслам добавляли эмульгаторы, так как они обладают высокой вязкостью, и затем также исследовали токсичность полученных адьювантов.

При введении лабораторным животным минеральных масел МЦ, «Pionier», 70 USP образовывались отеки, распространяющиеся к 10 дню на всю конечность, приводящую к потере подвижности. У морских свинок открывались свшци. Остальные масла обладали умеренной реакто ген но сть ю. У животных на месте введения образовывались отеки размером 3 х 2 см, свищи отсутствовали. Температура тела животных была в пределах нормы, масса тела не снижалась.

Использование в составе адьювантов безводного ланолина показало, что приготовленные на его основе эмульсии обладают большой вязкостью, что затрудняет введение препарата животным. После выдерживания этих эмульсий при температуре 37 °С образуется отстой масла до 1 см.

\

Эмульгатор № 384 обладает сравнительно низкой вязкостью, но при приготовлении эмульсии время эмульгирования приходилось увеличивать в 3 раза по сравнению с другими эмульгаторами.

Эмульгатор № 139 образовывал стойкую эмульсию, вязкостью не более 20 Ссг, при диспергировании в течение 1 мин, в которой образовывался отстой менее 0,5 см.

Сочетание в адъюванте легкого минерального масла Маркол 52 (92 %) и эмульгатора № 139 (8 %) приводило к наилучшим результатам. Адъювант не вызывал токсического эффекта Белые мыши, которым его вводили, оставались клинически здоровыми, прибавляли в весе, так же как и контрольные животные. Адъювант был умеренно реактогенен. У лабораторных животных на месте его введения образовывались незначительные асептические отеки, при отсутствии свшцей. Температура тела животных в течение срока наблюдения оставалась в пределах нормы, масса тела не снижалась. Эмульсия, приготовленная на его основе не расслаивалась при 37 "С в течение 15 дней наблюдения, отстой масла был не более 0,5 см. Она легко вводилась животным, так как обладала небольшой вязкостью (7 Сет).

На основании полученных данных можно сделать вывод что, адъювант, имеющий в своем составе 92 % легкого минерального масла Маркол 52 и 8 % эмульгатора № 139, был безвреден и нетоксичен для лабораторных животных, обладал умеренной реактогенностью. Эмульсия, приготовленная на его основе, была стабильна

2. 2.5. Токсические свойства соматических антигенов пастерелл. Эмульгированная вакцина, изготавливаемая Щелковским биокомбинатом, иммуногенна, но достаточно реактогенна для свиней, кроликов и пушных зверей. После вакцинации на месте введения образуются долго не рассасывающиеся гранулемы, иногда - отеки, что осложняет применение препарата в хозяйствах.

Для выяснения реактогенности вакцины необходимо иметь четкое представление о токсичности всех факторов патогенности возбудителя пастерелл еза

Культуры пастерелл трех серологических вариантов выращивали на сывороточном агаре Хоттингера при 37 °С в течение 20 часов, затем смывали 2,5 % - ным раствором № С1, доводили концентрацию клеток до 10 млрд. / мл. Экстрагировали поверхностные капсульные антигены на водяной бане при 56 °С при постоянном перемешивании в течение 1 часа. Далее двукратно центрифугировали при 15 тыс. об / мин по 20 мин. Клеточный осадок ресуспендировали стерильной дистиллированной водой до концентрации 10 млрд. / мл. Клеточную стенку разрушали методом последовательных многократных замораживаний - размораживаний, контролируя процесс разрушения высевом на сывороточный агар и бульон Хоттингера После получения стерильных высевов препараты центрифугировали двукратно при 20 тыс. об / мин по 20 минут. Осадок ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе до необходимой оптической концентрации (от 1 до 30 млрд. / мл).

Токсическую активность полученных препаратов клеточной стенки пастерелл изучали методом биопробы на белых беспородных мышах. Контроль токсической активности препаратов осуществляли в тесте изменения массы тела белых мышей, живой массой 15 - 16 г после инъекции. С этой целью животным вводили однократно внутрибрюшинно по 0,5 мл испытуемого препарата Контрольным мышам вводили по 0,5 мл стерильного физраствора Наблюдение за животными вели в течение 7 суток с ежедневным контролем среднесуточных привесов или отвесов.

При внутрибрюшинном введении препаратов клеточных стенок в дозах от 1 до 4,5 млрд. / см3 всех трех штаммов наблюдались привесы живого веса больше, чем в контрольной группе. Инъекция препаратов клеточных стенок в дозе 5 млрд. / см3 и 6 млрд. / см3 всех штаммов вызывала снижение привесов у

мышей. При введении дозы 7,5 млрд. / см3 штаммов А и Д наблюдался падеж 10 % животных. При инъекции клеточных стенок штамма В в той же дозе привесы отсутствовали. 9-миллиардная взвесь всех штаммов вызывала гибель мышей от 10 до 20 %. 15-миллиардная взвесь всех штаммов была причиной падежа до 30 % животных. Введение препаратов клеточных стенок в концентрации 20 - 30 млрд. / см3 всех штаммов обуславливало падеж 100 % животных.

Полученные данные свидетельствуют о том что, клеточные стенки пастерелл всех штаммов в концентрации до 6 млрд. / см3 не обладали токсичностью и не вызывали падежа лабораторных животных. Увеличение концентрации до 7,5 млрд. / см3 и выше сопровождалось гибелью белых мышей, достигающей максимальной (100 %) при 20 - 30 млрд. / см3.

2. 2.6. Иммуногенная активность соматических антигенов Р.тиНос111а трех серологических вариантов.

С целью выяснения прямой и перекрестной иммуногенной активности соматических антигенов Р.тиИоас1а трех серологических вариантов белых мышей вакцинировали приготовленными по методике описанной выше препаратами клеточных стенок.

Протективные свойства соматических антигенов пастерелл изучали при прямом и перекрестном методах заражения белых мышей. Животных иммунизировали двукратно внутрибрюшинно по 0,5 мл 3 млрд. / см3 взвесью клеточных стенок пастерелл трех штаммов с интервалом 14 дней. Через 21 день после последней инъекции заражали подтитрованными культурами пастерелл. Наблюдение за животными вели в течение 7 дней после заражения.

Как видно из данных таблицы 2 при прямом заражении соматические антигены обеспечивали сохранность 42 % мышей, привитых серологическим вариантом А, 86 %, привитых серологическим вариантом В и 50 % мышей, привитых серологическим вариантом Д. При перекрестном заражении

соматические антигены серологических вариантов А и Д совершенно не обеспечивали перекрестной защиты друг друга, в то время как соматические антигены этих серологических вариантов обеспечивали до 40 % защиты мышей, зараженных культурой серологического варианта В. Перекрестная защита соматических антигенов В сероварианта в отношении мышей, зараженных культурами серологических вариантов А и Д была значительно ниже и составляла от 15 до 20 %.

Таблица 2. Количество выживших иммунизированных животных после

заражения Р.тикоаёа, %.

Иммунизация \ Заражение Штамм А Штамм В Штамм Д

Штамм А 42 ± 2,3 36+3,5 0+0

Штамм В 20 ±2 86+2,4 14,3 +1,7

Штамм Д 0+0 41,6 ±3,1 50+2,5

На основании полученных данных можно сделать вывод, что иммунологическая активность соматических антигенов пасгерелл высока только при гомологичном заражении. Наблюдались перекресты между штаммами А и В, Д и В. Между штаммами А и Д перекрестная активность не выявлена.

2.2.7. Разработка контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины.

Был разработан метод контроля иммуногенной активности вакцины в отношении всех трех серологических вариантов Р.тиИоаМа. С этой целью свиней иммунизировали двукратно, через 21 день брали у них кровь и получали сыворотку по общепринятой методике.

Полученную сыворотку крови вводили подкожно в дозе 0,5 мл белым мышам весом 16 - 18 г, через 24 часа их заражали подтитрованными дозами культур Р.тиИоас1а всех трех серологических вариантов. Причем, чтобы избежать возможных ошибок при подтитровке, для заражения использовали не одно разведение культур, а по 3 - 4 каждого штамма Контроль был проведен на 5 производственных сериях противопастереллезной вакцины. Среднюю арифметическую ошибку вычисляли по методу Кербера в модификации Ашмарина и др. (1962). Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты заражения разведениями культуры пастерелл трех штаммов мышей опытных и контрольных групп.

Разведения культур P.multocida, использованные для заражения белых мышей Количество павших контрольных мышей через 7 дней после заражения, % Количество павших пассивно иммунизированных мышей через 7 дней после заражения, %

А-1231 10"1 100+0 53 ±17

10"2 93 ±5 53 ±24

10 a 89+5 0±0

10"4 51 ±5 0±0

В-681 10"J 100±0 13 + 13

10"4 100 ±0 5 ±5

Ю-3 100+0 0+0

ю-6 66 + 15 0+0

Д-Т -80 10"' 100 ±0 27 ±10

10"2 91 ±5 12 ±5

10J 50 ±5 0±0

Как видно из данных таблицы, серологический вариант А в разведении 1: 10""' вызывал 100 % гибель контрольных мышей и 53 % опытных. При

заражении иммунизированных сывороткой мышей в разведении 1: 10"3 все оставались живы, в то время как в контроле погибало 89 ± 5 %.

Мыши, зараженные культурой Р.тиИоа(1а сероварианта В в разведении 1: 10"3 в контрольной группе погибали все и в опытной 13 %. Заражение этой культурой в разведении 1: 10 ~5 вызывало 100 % - ную гибель контрольных мышей, а пассивно иммунизированные выживали все. Культура пастерелл сероварианта Б в разведении 1:10 вызывала 100 %- ную гибель в контрольной группе мышей, а в опытной - 27 ± 10 %. Разведение 1: 10 ~г культуры этого штамма было причиной гибели 91 ± 5 % контрольных мышей, а опытных - 12 ± 5 %. Заражение разведением 1: 10 "э вызывало 50 % - ную гибель контрольных мышей, в то время как пассивно иммунизированные оставались живы все.

Во всех опытах пассивно иммунизированные мыши, зараженные культурой пастерелл трех серологических вариантов в дозе Ы)50, оставались живы.

Проведенные исследования свидетельствуют, что иммуногенность противопастереллезных препаратов возможно контролировать в тесте сывороточной защиты мышей. Методика легко повторяема, достоверно отражает иммуногенную активность испытуемой вакцины для свиней.

Сыворотки крови поросят, вакцинированных двукратно поливалентной эмульгированной вакциной против пастереллеза, исследовались в РПГА для выявления уровня антител к капсульным антигенам пастерелл. Эти же сыворотки подвергались испытанию в тесте сывороточной защиты мышей.

Сыворотка с наличием титра антител к штамму А - 1: 8 - 16; В -1: 32 -64; Д -1: 8 - 16 - эффективно защищает белых мышей от экспериментального заражения пастереллами. Заражение белых мышей культурой Р.тиНоайа серологического варианта А в разведении 1: 10'3 вызывало гибель 80 % контрольных мышей, в то время как опытные оставались живы все.

Культура штамма В в разведении 1: 10 ~5 вызывала падеж всех контрольных мышей, а опытные выживали все. При повышении уровня антител к штамму В до 1:256, степень защиты возрастала до 4 Заражение культурой серологического варианта Д в разведении 1: 10 ~2 не вызывало гибель пассивно иммунизированных мышей, в то время как в контрольной группе погибло 90 % животных. Приведенные данные свидетельствуют о наличии корреляции между уровнем антител к капсульным антигенам пастерелл и степенью сывороточной защиты белых мышей к экспериментальному заражению.

Результаты исследований убедительно доказывают возможность контроля иммунологической активности противопастереллезной поливалентной вакцины серологическими методами.

Применение РПГА позволяет не проводить экспериментального заражения животных (свиней и белых мышей), что значительно снижает себестоимость препарата Кроме того, контролируется активность всех серовариантов Ра81еиге11а шиИоаба, входящих в состав поливалентной вакцины.

2.2.8. Испытание иммуногенной активности и реактогенности опытных серий вакцины против пастереллеза свиней.

В соответствии с утвержденной нормативно - технической документацией эмульгированная вакцина против пастереллеза свиней, кроликов и пушных зверей готовится с высокой концентрацией бактериальных клеток всех серологических вариантов (15 млрд. в 1 мл вакцины) и во многих случаях была реактогенна, вызывала отеки конечностей и не рассасывающиеся гранулемы, снижающие качество мяса при убое животных.

Нами были изготовлены опытные серии с пониженным количеством клеток возбудителя с учетом токсичности соматических и поверхностных антигенов и оптимальных сроков промышленного культивирования,

позволяющих наиболее полно сохранять поверхностные антигены пастерелл в куль тураль ной жидкости.

Производственное культивирование проводили до стадии замедления роста культур (10 часов), позволяющего максимально сохранять поверхностные антигены, растворенные в среде роста При этом использовали концентрацию суспензии бактериальных клеток трех серовариантов Р.тииоасЗа 18 ±3 млрд. /см3, что соответствует 9 млрд. / см3 в готовой вакцине (по 3 млрд. / см3 каждого штамма).

При приготовлении опытных серий использовали адъювант, отстоящий из 92 % минерального масла Маркол 52 и 8 % эмульгатора № 139.

В качестве контроля использовалась производственная вакцина состоящая из бактериальной массы с оптической плотностью 30 млрд. микробных клеток в 1 мл и 50 % адъюванта, содержащего 17 % ланолина и 83 % масла ПЭС-3.

Реактогенность вакцины определяли внутримышечным введением по 3 мл поросятам живой массой 10 - 12 кг. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней, потом их убивали и проводили патологоанатомический осмотр.

Контроль на иммуногенность проводили по отработанной методике в тесте сывороточной защиты мышей.

В качестве серологического теста применяли РПГА по отработанной Л. Я. Ставцевой методике.

Всего было проведено испытание трех опытных серий вакцины в сравнении с тремя производственными сериями, изготовленными по утвержденной ранее технологии.

У 50 % привитых производственной вакциной животных отмечали выраженное угнетение, отказ от корма в течение 1 суток. Через 10 дней при внешнем осмотре наблюдали припухлости в месте введения, разлитые отеки, при патологоанатомическом осмотре поросят, вакцинированных

производственной вакциной, обнаруживались олигогранулемы на месте введения размером 4 х 3 х 1,5 см, асептические отеки конечности.

У поросят, вакцинированных опытными образцами, клинических признаков угнетенного состояния и отеков конечностей не отмечали. Через 10 дней при внешнем осмотре наблюдали в месте введения небольшие уплотнения, при вскрытии обнаруживали на месте введения соединительно -тканные гранулемы, значительно меньших размеров (1,5 х 0,7 х 0,5 см).

При испытании на иммуногенность в тесте сывороточной защиты мышей установлено, что все испытанные серии вакцины (и опытные, и производственные) обеспечивали образование иммунных антител у поросят, достаточных для защиты мышей от заражения пастереллами в дозе 2 ЛД50. Но опытные вакцины вызывали повышение уровня капсульных антител к штамму В до 1:256, причем степень защиты мышей возрастала до 4

Изложенные данные свидетельствуют о том, что опытные серии вакцины, содержащие пониженное количество клеток пастерелл, менее реактогенны, чем промышленные серии, вызывают образование иммунных антител у поросят на одинаковом с промышленными сериями уровне к штаммам А и Д и на большем уровне к штамму В. Мыши, обработанные иммунной сывороткой поросят, были защищены от заражения пастереллами всех трех штаммов в дозе 2 ЛД50, при этом заражающая доза штамма В возрастала, так как в состав вакцины включались капсульные антигены данного сероварианта

3. ВЫВОДЫ.

3.1. При производственном глубинном культивировании Р.тиИоас1а создаются условия для распределения в культуральной жидкости растворимых поверхностно расположенных компонентов клеток. Серологическими методами максимальное количество поверхностных антигенов обнаруживается в бесклеточной культуральной жидкости к 10-му часу культивирования (для

всех трех штаммов), к 12 - му часу их уровень снижается в 2 раза. При этом оптическая концентрация клеток продолжает незначительно расти.

3.2. Однопроцентные растворы хитозана с молекулярным весом от 50 до 500 Кда эффективно осаждали клетки пастерелл трех серовариантов в кислой среде. При этом наиболее выражено разделение на фракции в культуральной жидкости в стадии торможения роста (10 - 12 час.). Лучшие результаты осаждения клеток хитозаном получены для серовариантов А и Д при 4 °С, для сероварианта В при 22 °С.

3.3. При исследовании обработанной хитозаном бесклеточной культуральной жидкости серологическими методами не выявлено снижения титра капсульных антигенов по сравнению с исходным уровнем. Таким образом, хитозан не связывает капсульные антигены пастерелл.

3.4. Ультрафильтрация культуральной жидкости на полых волокнах позволяет концентрировать поверхностные антигены пастерелл всех трех серологических вариантов.

3.5. При изучении токсичности соматических антигенов пастерелл для белых мышей установлено, что дозы клеточных стенок от 1 до 6 млрд. / см3 не обладали токсичностью и не вызывали падежа животных. Увеличение концентрации до 7,5 млрд. / см3 и выше сопровождалось гибелью белых мышей. Концентрация клеточных стенок пастерелл до 20 - 30 млрд. / см3 обуславливало 100 % - ную гибель опытных животных.

3.6. При испытании токсичности, безвредности и реактогенности большого количества адъювантов установлено, что адъювант, состоящий из 92 % минерального масла Маркол 52 и 8 % эмульгатора 139, не токсичен и умеренно реактогенен. Эмульсия, приготовленная на его основе, стабильна и обладает небольшой вязкостью, что обуславливает легкость введения этих препаратов животным.

3.7. Иммуногенность препаратов клеточных стенок пастерелл в дозе 3 млрд. / см3 достаточно высока: штамма А - 42, В - 86 %, Д - 50 %. Не выявлено

иммунологического сродства между штаммами А и Д. Перекрестная активность при иммунизации препаратами клеточных стенок пастерелл трех штаммов наблюдалась между штаммами А и В (36 %), В и А(20 %); В и Д (14,3 %), Д и В (41,6 %>

3.8. Контроль иммуногенной активности противопастереллезных препаратов методом сывороточной защиты мышей позволяет контролировать иммуногенность всех трех серологических вариантов Р.тикоаёа. Установлена корреляция между титром капсульных антигенов пастерелл в РПГА и степенью защиты животных от экспериментального заражения.

3.9. Опытные серии противопастереллезной вакцины со сниженным количеством клеток были менее токсичными, слабо реактогенными. Иммуногенность опытных серий была на уровне производственных в отношении серологических вариантов А и Д и выше в отношении серологического варианта В за счет сохранения поверхностных антигенов.

4. ПРА1СГИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Полученные данные позволяют внести изменения в технологию промышленного изготовления вакцины поливалентной инактивированной эмульгированной против пастереллеза свиней, проводить производственное глубинное культивирование пастерелл с учетом оптимального соотношения накопления количества клеток и наиболее полного сохранения поверхностных антигенов.

2. Проведенные исследования служат основанием для снижения количества клеток пастерелл в вакцине и использования минерального масла Маркол 52 и эмульгатора 139 в составе адъюванта

3. На основании проведенной работы разработана методика контроля иммуногенной активности противопастереллезной поливалентной вакцины, позволяющая контролировать все сероварианты пастерелл, включенные в биопрепарат.

4. Полученные данные позволяют в ближайшее время приступить к разработке компонентной вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных, в которой учитываются все факторы патогенности возбудителя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Шубина Е. А., Мельник Н. В., Албулов А. И., Фоменко А. С., Шинкарев С. М- Концентрирование бактериальных культур с использованием хитозана и его производных. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов Всероссийской научно -практической конференции, посвященной 70 - летию со дня рождения профессора В. А. Першина ВНИГИБП, г. Щелково, 1998 - с. 42^4.

2. Мельник Н. В., Скичко Н. Д., Шубина Е. А., Пышкина Т. Н., Албулов А. И. Применение хитозана и его производных для концентрирования баксуспензий. // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана Материалы Пятой конференции. Москва, 1999 - с.170 -171.

3. Мельник Н. В., Скичко Н. Д., Шубина Е. А., Зенов Н. И., Албулов А. И., Шинкарев С. М., Попова Т. Е., Шегидевич Э. А. Применение хитозана для осаждения клеток пастерелл из бульонных культур. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 30 - летию института ВНИТИБП, г. Щелково, 2000 - с.309 - 311.

4. Шубина Е. А., Скичко Н. Д., Зенов Н. И., Шегидевич Э. А., Попова Т. Е., Ставцева Л. Я. Динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы

международной научно - практической конференции. ВНИТИБП, г. Щелково, 2003-с. 12-73.

5. Шубина Е. А., Скичко Н. Д., Зенов Н. И., Ставцева Л. Я., Шегидевич Э. А., Попова Т. Е., Албулов А. И. Применение хитозана для связывания клеточных компонентов пастерелл. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы международной научно - практической конференции. ВНИТИБП, г. Щелково, 2003 - с. 134 - 135.

6. Шубина Е. А., Скичко Н. Д., Зенов Н. И., Шегидевич Э. А., Попова Т. Е., Ставцева Л. Я. Усовершенствование метода контроля поливалентной эмульгированной вакцины против пастереллеза свиней. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы международной научно -практической конференции. ВНИТИБП, г. Щелково, 2003 - с. 139 -141.

7. Шубина Е. А., Скичко Н. Д., Зенов Н. И., Шегидевич Э. А., Ставцева Л. Я., Попова Т. Е. Применение РПГА для контроля противопастереллезной вакцины. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы международной научно - практической конференции. ВНИТИБП, г. Щелково, 2003 -с. 142-144.

Tffp • 400, j .

Р17 6 2 Ö

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шубина, Елена Анатольевна

1. Введение 4 стр.

1.1. Актуальность темы 4 стр.

1.2. Цель и задачи исследований 5 стр.

1.3. Научная новизна 6 стр.

1.4. Практическая ценность 6 стр.

1.5. Апробация полученных результатов 7 стр.

1.6. Публикации 7 стр.

1.7. Объем и структура диссертации 7 стр.

2. Обзор литературы 8 стр.

2.1. Распространение и экономическая значимость пастереллезов 8 стр.

2.2. Историческая справка 9 стр.

2.3. Возбудители пастереллезов 13 стр.

2.4. Факторы патогенности Р.ти11ос1с1а 14 стр.

2.5. Культивирование пастерелл 21стр.

2.6. Специфическая профилактика пастереллезов 25 стр.

3. Собственные исследования 31стр.

3.1. Материалы и методы 31стр.

3.2. Результаты исследований 35 стр.

3.2.1. Динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования 35 стр.

3.2.2. Испытание возможности использования флокулянтов для концентрирования поверхностных антигенов пастерелл 46 стр.

3.2.3. Концентрирование поверхностных антигенов пастерелл методом ультрафильтрации на полых волокнах 56 стр.

3.2.4. Токсичность и реактогенность . минеральных масел и эмульгаторов, входящих в состав эмульгированных вакцин 57 стр.

3.2.5. Токсические свойства соматических антигенов пастерелл 60 стр.

3.2.6. Иммуногенная активность соматических антигенов Р.тикос1с1а трех серологических вариантов 63 стр.

3.2.7. Разработка контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины 65 стр.

3.2.8. Испытание иммуногенной активности и реактогенности опытных серий вакцины против пастереллеза свиней 70 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение факторов патогенности Pasteurella multocida с целью разработки нового поколения противопастереллезных вакцин"

1.1. Актуальность темы.

Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается концентрацией большого поголовья скота на ограниченной территории. В трудных экономических условиях современной России необходима не только правильная организация технологического процесса, но и высокая эффективность профилактических мероприятий против инфекционных заболеваний.

Такими заболеваниями являются пастереллезы сельскохозяйственных животных, вызываемые различными вариантами Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica. Эти микроорганизмы обитают в верхних отделах пищеварительного и дыхательного трактов здоровых животных. Стрессы, связанные с транспортировкой, недостатками в условиях содержания, несбалансированного кормления, а также вирусные инфекции способствуют повреждению защитных механизмов организма, что создает благоприятные условия для развития пневмонийных пастереллезов.

Различные формы пастереллезов наносят большой экономический ущерб сельскому хозяйству многих стран мира, входит в число наиболее распространенных заболеваний (А. Н. Борисенкова, 1971, 1983, В. И. Геведзе и др., 1980, М. А. Сидоров, В. И. Геведзе, 1983, Н. А. Масимов, 1992, Д. Ф. Осидзе, 1987, G. R. Carter, 1967, 1981, N. Mashiro et al.,1992, К. R. Rhoades et. Al., 1992, G. Zhao et. Al., 1992, J. R. Brito et. Al., 1993). Разработка надежных средств специфической профилактики пастереллезов является актуальным вопросом в системе противоэпизоотических мероприятий.

Для борьбы с пастереллезами сельскохозяйственных животных учеными нашей страны и всего мира были разработаны живые и инактивированные вакцины, нашедшие широкое применение (Н. М. Никифорова, 1977, А. Н. Борисенкова, 1986, G. R. Carter, 1957, A. W. Confer et al., 1985, R. D. Olson et al., 1986, M. W. Azam et al., 1991, A. Myint, 1992). Однако существующие вакцины изготавливаются из бактериальной массы пастерелл, выращенной без учета факторов патогенности, имеют ряд недостатков.

Поэтому целесообразно усовершенствовать технологию промышленного изготовления противопастереллезных препаратов с учетом распределения и накопления поверхностных антигенов при выращивании в жидких питательных средах, с учетом токсичности и перекрестной протективной активности соматических антигенов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шубина, Елена Анатольевна

5. ВЫВОДЫ.

1. При производственном глубинном культивировании Р.тикос1с1а создаются условия для распределения в культуральной жидкости растворимых поверхностно расположенных компонентов клеток. Серологическими методами максимальное количество поверхностных антигенов обнаруживается в бесклеточной культуральной жидкости к 10-му часу культивирования (для всех трех штаммов), к 12-му часу их уровень снижается в 2 раза. При этом оптическая концентрация клеток продолжает незначительно расти.

2. Однопроцентные растворы хитозана с молекулярным весом от 50 до 500 Кда эффективно осаждали клетки пастерелл трех серовариантов в кислой среде. При этом наиболее выражено разделение на фракции в культуральной жидкости в стадии торможения роста (10 - 12 час.). Лучшие результаты осаждения клеток хитозаном получены для серовариантов А и Д при 4 "С, для сероварианта В при 22 "С.

3. При исследовании обработанной хитозаном бесклеточной культуральной жидкости серологическими методами не выявлено снижения титра капсульных антигенов по сравнению с исходным уровнем. Таким образом, хитозан не связывает капсульные антигены пастерелл.

4. Ультрафильтрация культуральной жидкости на полых волокнах позволяет концентрировать поверхностные антигены пастерелл всех трех серологических вариантов в 6 - 10 раз.

5. При изучении токсичности соматических антигенов пастерелл для белых мышей установлено, что дозы клеточных стенок от 1 до 6 млрд. / см3 не обладали токсичностью и не вызывали падежа животных. Увеличение концентрации до 7,5 млрд. / см3 и выше сопровождалось гибелью белых мышей. Концентрация клеточных стенок пастерелл до 20 - 30 млрд. / см3 обуславливало 100 % - ную гибель опытных животных.

6. При испытании токсичности, безвредности и реактогенности большого количества адъювантов установлено, что адъювант, состоящий из 92 % минерального масла Маркол 52 и 8 % эмульгатора 139, не токсичен и умеренно реактогенен. Эмульсия, приготовленная на его основе, стабильна и обладает небольшой вязкостью, что обуславливает легкость введения этих препаратов животным.

7. Иммуногенность препаратов клеточных стенок пастерелл в дозе 3 млрд. / см3 достаточно высока: штамма А - 42, В - 86 %, Д — 50 %. Не выявлено иммунологического родства между штаммами А и Д. Перекрестная активность при иммунизации препаратами клеточных стенок пастерелл трех штаммов наблюдалась между штаммами А и В (36 %), В и А(20 %); В и Д (14,3 %), Д и В (41,6%).

8. Контроль иммуногенной активности противопастереллезных препаратов методом сывороточной защиты мышей позволяет контролировать иммуногенность всех трех штаммов Р.тикос1с1а. Установлена корреляция между титром капсульных антигенов пастерелл в РПГА и степенью защиты животных от экспериментального заражения.

9. Опытные серии противопастереллезной вакцины со сниженным количеством клеток были менее токсичными, слабо реактогенными. Иммуногенность опытных серий была на уровне производственных в отношении серологических вариантов А и Д и выше в отношении серологического варианта В за счет сохранения поверхностных антигенов.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Полученные данные позволяют внести изменения в технологию промышленного изготовления вакцины поливалентной инактивированной эмульгированной против пастереллеза свиней, кроликов и пушных зверей, проводить производственное глубинное культивирование пастерелл с учетом оптимального соотношения накопления количества клеток и наиболее полного сохранения поверхностных антигенов.

2. Проведенные исследования служат основанием для оптимальной компоновки вакцины и использования минерального масла Маркол 52 и эмульгатора 139 в составе адъюванта.

3. На основании проведенной работы разработана методика контроля иммуногенной активности противопастереллезной поливалентной вакцины, позволяющая контролировать иммуногенность всех серологических вариантов пастерелл, включенных в состав препарата.

4. Полученные данные позволяют в ближайшее время приступить к разработке компонентной вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных, в которой учитываются все факторы патогенности возбудителя.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шубина, Елена Анатольевна, Щелково

1. Аванян А. А., Кад Л. П., Павлова И. Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. М., 1972.

2. Агаева Э. М., Сидоров М. А. Антигенные и типоспецифические свойства фракций капсульного антигена Р.тииос1с1а. // Труды ВИЭВ, 1979, т. 50 с.95 -101.

3. Андросик Н. Н., Лях Ю. Г. Методические указания по диагностике, профилактике и мерам борьбы с пастереллезом сельскохозяйственных животных. Минск, 1999 22 с.

4. Андросик Н. Н., Лях Ю. Г. Профилактика пастереллеза сельскохозяйственных животных на современном этапе. // Весщ акадэмп навук Рэспублш Беларусь. Мшск, 2000, № 4 с. 62 64.

5. П.Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в бактериологических исследованиях. М., 1962.

6. Баран А. А. Электроповерхностные явления и устойчивость полимерсодержащих систем. Автореф.докт.дисс. Ленинград, 1982.

7. Блехерман Б. Е., Галибина Н. В., Александрова М. П., Ковальская. Влияние дегидратации и восстановления на ультраструктуру Раз1еиге11а тикоас1а. М., 1985 в. 2.

8. Бовкун Г. Ф. Антигенные свойства различных структур возбудителя пастереллеза. // Бюллетень ВИЭВ, 1976, в. 26 с. 57 -58.

9. Бовкун Г. Ф., Сидоров М. А. Иммунологическая характеристика антигенов возбудителя пастереллеза. // Ветеринария. 1977 № 7 с. 44 46.

10. Большаков И. Н., Насибов С. М. Связывание бактериального липополисахарида хитозаном при энтеросорбции в эксперименте. // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. М., 1999 с. 120.

11. Борисенкова А. Н. Значение соматических и капсульных антигенов Р.тикос1с1а в иммунологической специфичности вакцин. // Ветеринария. 1978 №5 с. 40-42.

12. Борисенкова А. Н. Изучение капсульных антигенов штаммов пастерелл (птичьих А вариантов) от кур методом преципитации в агаровом геле. // Болезни птиц. 1967 т. № 5 с. 75 80.

13. Борисенкова А. Н. Профилактика пастереллеза. // Птицеводство. 1983 № 12 с. 26.

14. Борисенкова А. Н. Роль клеточных компонентов Р.тиИос!с1а в развитии у птиц иммуногенности к пастереллезу. // Ветеринария. 1976 № 2 с. 45 46.

15. Борисенкова А. Н., Лебедева А. И., Гаврилова В. С. Новое в борьбе с болезнями птиц. 1984 с.21.

16. Борисенкова А. Н., Мошкин С. А. Токсические, антигенные и протективные свойства морфологических структур, выделенных из возбудителей пастереллеза кур. // Научные вопросы производства яиц и мяса птицы. 1975 т. 39 с. 146- 149.

17. Вайсман И. Ж. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяции. ЖМЭИ. 1984, 4,с.З.

18. Вайсман Э. И., Геведзе В. И. Степень антигенного родства пастерелл, выделенных от здоровых и больных пастереллезом животных. // Достижения вет.науки и передового опыта животноводству. 1976 в. 2 с. 140.

19. Вейцер Ю. И., Минц Д. М. Высокомолекулярные флокулянты в процессах очистки природных и сточных вод. М., 1981 201 с.

20. Ветеринарные препараты. Справочник под ред. Д. Ф. Осидзе. М., 1981 448 с. .

21. Ветеринарные препараты. Справочник. Сост.: Ю. Ф. Борисович, Л. В. Кириллов. Под ред. Д. Ф. Осидзе. М., 1981 448 с.

22. Власкина О. В. Патогенность серовариантов А, В и Э Р.тикос1с1а и фильтратов надосадочной жидкости их бульонных культур. // Ветеринария. 1999 №5 с. 30-32.

23. Воробьев А. А. Механизм действия адъювантов. // Успехи соврем.биологии. 1969 т. 68, вып. 1 (4) с. 72 89.

24. Воробьев А. А., Васильев Н. Н. Адъюванты. М., 1969,205 С.

25. Геведзе В. И., Вайсман Э. И. Эпизоотическая эффективность химической вакцины против пастереллеза свиней. // Достижения вет.науки и передового опыта животноводству. 1980 в. 5 с 38 — 40.

26. Геведзе В. И., Левченко И. Д. Вайсман Э. И. Изучение иммуногенных свойств химических и биофабричных вакцин против пастереллеза свиней в лабораторных и производственных условиях. // Труды Белорусского НИИЭВ. 1979 т. 17 с. 55-59.

27. Григорьева Г. И. Игнатов П. Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин. // Сельхоз.биология. 1987 № 2 с. 100- 104.

28. Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. М., 1978 372 с.

29. Гуславский А. И., Попова В. М. Вопросы очистки, разделения и концентрирования биологических жидкостей. // Тезисы докл. Всерос.научно-практ.конф. Научные основы производства вет.биол.препаратов. Щелково, 2000 с. 308 309.

30. Доморадский И. В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. М., 1971.

31. Душук Р. В. Сравнительная оценка иммуногенности вакцин против пастереллеза уток и гусей. // Тезисы докладов научно проиводст.конф.г. Ломоносов. Ленинград, 1985 ч. 2 с. 70 - 71.

32. Езепчук Ю. В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М. 1977.

33. Езепчук Ю. В. Патогенность как функция биомолекул. М., 1985.

34. Иванов В. Н. Энергетика роста микроорганизмов. Киев, 1981, с. 137.

35. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины поливалентной эмульгированной против пастереллеза свиней. ТУ 10.09 152 - 91.

36. Кадымов Р. А., Кунаков А. А., Седов В. А. Инфекционные болезни овец. М., 1987 с. 119, 126.

37. Калмыкова Л. И. Токсин Р.тииос1с1а серологического варианта Э и его свойства. Автореф.дисс.канд.вет.наук. М., 1992.

38. Карпухин Г. И., Шапиро Н. И. Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций. Ленинград, 1979, 192 с.

39. Кац Л. Н. Некоторые особенности субмикроскопической организации поверхностных и мембранных структур бактериальных клеток в связи с их функцией. Автореф.дисс.докт.биол.наук. М., 1971. •

40. Каширин В. В. Биологический принцип стандартизации штаммов бактерий возбудителей пастереллеза птиц. // Тезисы докладов Всеросс.н.-пр.конф. «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификациивет.препаратов.» М., 2001с.57 58.

41. Каширин В. В. Характеристика птичьих штаммов по капсульным антигенам и патогенности. // Методы и средства диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней животных. Сб.научн.тр. М., 1985 с. 96.

42. Коломнина Г. Ф., Антонова Н. И., Галибина Н. В., Лукьянова Е. М., Блехерман Б. Е., Рогожин С. П. Капсула и капсульный антиген Раз1еиге11а тикос1с1а сероварианта В. // Сб.научн.тр. ВГНКИ. М., 1989 с. 83 89.

43. Кольчан В. В. Изучение антигенного строения пастерелл в РДП. // Эпизоотология и патогенез болезней сельхоз.ж-х на Дальнем Востоке. Тр. Дальневост. ЗНИВИ. 1979 т. 10 с. 30.

44. Костюкова Н. Н., Езепчук Ю. В. Методологические подходы к конструированию химических вакцин против бактериальных инфекций. // Журнал микробиол., эпидемиол.и иммунол. 1984 № 8 с. 3 8.

45. Курбанов Ш. К. Характеристика серологических вариантов P.multocida, выделенных от телят. // Проблемы лейкоза и инф.заболеваний сельхоз.ж-х. 1988 с. 103- 105.

46. Курбанов Ш. К. Эпизоотологическое' значение различных серотипов P.multocida при массовых респираторных инфекциях телят в откормочных хозяйствах Автореф.дисс.канд.вет.наук. Самара, 1994.

47. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1978 с. 33.

48. Литвин В. Ю., Пушкарева В. И. Факторы патогенности бактерий: функция в окружающей среде. // Журнал микробиол., эпидемиол., и иммунол. 1994 № 5 с. 84-87.

49. Лях Ю. Г. Особенности специфической профилактики пастереллеза свиней в Белоруссии. // Материалы междунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с. 103 105.

50. Лях Ю. Г. Пастереллез свиней (эпизоотология и меры борьбы). // Аналитический обзор. Минск, 2000 36 с.

51. Лях Ю. Г. Пастереллез свиней в Белоруссии. Минск, 2002, 201 с.

52. Мазур Т. Типирование культур P.multocida ' методом капсульной деполимеризации мукополисахаридов. // Тезисы докл. Всеросс.н.-пр.конф. «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вет.препаратов». М., 2001, с. 55 56,

53. Масимов H. А. Значение пастерелл при остром респираторном синдроме парагриппа 3 у телят откормочных хозяйств ' промышленного типа. Автореф.дисс.канд.вет.наук. М., 1992.

54. Масимов Н. А. Значение пастереллоносительства при респираторных инфекциях телят. // Проблемы лейкоза и инф.заболеваний сельхоз.ж-х. 1988 с. 97-99.

55. Медуницын Н. В. Вакцинология. М., 1999 с. 15.

56. Мельников Н. И., Мельников В. Н., Гимранов М. Г. Ферменты патогенности и токсины бактерий. М., 1969.

57. Мертвецов Н. П., Беклемишев А. Б., Савич И. М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Новосибирск, 1987. 207 с.

58. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания. МУК 4.1/ 4.2. 588 96. М., 1998 с. 51.

59. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. М., 1981 с. 213.

60. Никифорова H. М. Итоги и перспективы борьбы с пастереллезами животных и рожей свиней. // Тр. ВГНКИ, М., 1977 т. 24 с. 74 -80.

61. Никифорова H. М., Соломатин В. И., Кузнецова О. В. Сравнительное изучение иммуногенной активности противопастереллезных вакцин. // Тр. ВГНКИ. M., 1977 т. 25 с. 197 201.

62. Осидзе Д. Ф. Инфекционные болезни животных. М., 1987 с. 188.

63. Основы общей биологии. Под ред. Э. Либберти. М., 1982 с. 148 160.

64. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978.

65. Петров О. В. Некоторые антигенные и структурные компоненты капсул Р.тиИоас1а. //Тр. ВИЭВ, 1971 с.39, с. 189.

66. Петровская В. Г. Проблема патогенности бактерий. М., 1967.

67. Петровская В. Г. Современные направления в изучении факторов, определяющих патогенные свойства бактерий. // Вестн. АМН СССР. 1976 № 1 с. 3 8.

68. Плохинский Н. А. Биометрия. М., 1970.

69. Подкопаев В. М., Степанов А. В., Муравьев В. Н., Белоусова Р. В. Инфекционные и инвазионные болезни молодняка крупного и мелкого рогатого скота. М., 1985 с. 45.

70. Попова Т. Е. Характеристика капсульных антигенов Р.тикос1с1а различных серологических вариантов. Автореф.дисс.канд.вет.наук. М., 1997.

71. Попова Т. Е., Ставцева Л. Я. Динамика образования антител к поверхностным антигенам пастерелл. // Диагностика и профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Покров, 1998 с. 366.

72. Раевский А. А. Перспективное технологическое направление культивирования бактерий при производстве вакцин. // Материалымеждунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с.61 -64.

73. Раевский А. А., Анисимова Л. В., Коротеева Л. А., Бушуева Н. Б. Разработка управляемого процесса культивирования стрептококков. // Материалы междунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с.68-71.

74. Раевский А. А., Рубан Е. А.и др. Об оптимальных условиях культивирования пастерелл на- логарифмической стадии роста. // ЭИ. Передовой н.-пр.опыт в биол.промышленности. М., 1984 № 10 с. 3 5

75. Раевский А. А., Ярцев М. Я. Влияние парциального давления растворенного кислорода на рост пастерелл. // Пр-во и контроль мед., вет.препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ. Вольгинский, 1999 с. 67.

76. Рождественская Т. Н. Гиалуронидаза Р.тиНоасЬ и ее ингибирование. Автореф.канд.дисс. Тарту, 1992.

77. Рубан Е. А., Самуйленко А. Я. Гомогенность культуральной среды микроорганизмов в биореакторе в процессе глубинного культивирования. // Материалы междунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с.74 76.

78. Рубан Е. А., Ярцев М. Я., Разумова Н. А. Динамика потребления глюкозы при периодическом культивировании пастерелл. // ЭИ. Передовой н.-пр.опыт в биол.промышленности. М., 1985 в. 10.

79. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. П. Н. Бургасова. М., 1978 с. 53.

80. Самуйленко А. Я., Рубан Е. А., Самуйленко С. А. Влияние растворенного кислорода на рост культур микроорганизмов и клеток животных. // Материалы междунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с.77 80.

81. Самуйленко С. А., Рубан Е. А., Самуйленко А. Я. Влияние концентрации парциального давления С02 на жизнедеятельность микроорганизмов и клеток животных. // Материалы междунар.н.-пр.конф. «Н.основы производства вет.биол.препаратов.» Щелково, 2003 с.80 83.

82. Сапегина Е. П., Анисимова Л. В., Раевский А. А. Динамика роста пастерелл при глубинном культивировании. // ЭИ. Передовой н.-пр.опыт в биол.промышленности. М., 1983 № 2 с. 5 10.

83. Сафронова Т. М., Бойцова Т. М. Хитозан как флокулянт нативного рыбного белка. // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. М., 1999 с. 251.

84. Саркисян X. В., Нерсесян С. Е., Егоян С. Г., Гаспарян Т. Э., Шекоян К. И. Сравнительное изучение эффективности противопастереллезной вакцины для свиней. // «Ветеринарная патология» № 1, 2003 с 135 137.

85. Сергеев В. А. Вирусные вакцины. Киев, 1993 с. 158.

86. Сидоров М. А., Геведзе В. И. Пастереллезы животных. // Ветеринария. 1983 № Юс. 43-47.

87. Сидоров М. А., Скородумов Д. И., Федотов В. Б. Под ред. Сидорова М. А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. М., 1995 319 с.

88. Сосницкий А. И., Потехин А. В., Ручнова О. И. Реактивность организма белых мышей на пастереллезную инфекцию в зависимости от возраста. // Пр-во и контроль мед., вет.препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ. Вольгинский, 1999 с. 70.

89. Сосов Р. Ф. Эпизоотология. М., 1974 с. 99.

90. Ставцева JI. Я., Попова Т. Е. Применение РПГА для серологической идентификации пастерелл. // Диагностика и профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Покров, 1998 с. 365.

91. Ставцева Л. Я., Попова Т. Е. Серологические методы для выявления капсульных антигенов пастерелл. // Тезисы докл. Всеросс. Н.-пр.конф. Научные основы производства вет.биол.препаратов. Щелково, 2000 с. 255 -257.

92. Станиславский Е. С. Бактериальные структуры и их антигены. М., 1971.

93. Сюрин В. Н.и др. Актуальная проблема ветеринарной вирусологии. // Ветеринария. 1977 № 4 с. 45 48.

94. Тесленко А. Я., Гирфанова Т. ф., Медведев Ю. В. Концентрирование суспензий микроорганизмов с помощью флокулянтов. М., 1984 48 с.

95. Тесленко А. Я., Попов В. Г. Хитин и его производные в биотехнологии. Обзор. М., 1982 39 с.

96. Тутов И. К., Ситьков В. И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставрополь, 1997 с. 75, 212 -213.

97. Шегидевич Э. А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота. Автореф.дисс.докт.вет.наук. М., 1993.

98. Шегидевич Э. А. Состояние и перспективы изучения пастереллезов сельскохозяйственных животных. // Труды ВИЭВ. 1984 т. 60 с. 58.

99. Шегидевич Э. А., Федотов В. Б., Крючков В. Я. Серотиповой состав P.multocida при пневмонии ягнят. //Труды ВИЭВ. 1983 т. 58 с. 15.

100. Юдаев А. П. Иммунобиологическая специфичность пастерелл, биохимическая и серологическая характеристика некоторых антигенных фракций, выделенных из них. Автореф.канд.дисс. М., 1975.

101. Ярцев М. Я. Перспективы современного производства бактериальных вакцин. // Тезисы докл. Всеросс.н.-пр.конф. Научн.основы производства вет.биол.препаратов. Щелково, 2000 с. 124—125.

102. Ярцев М. Я., Белоусов В. И., Главацкая О. В.и др. Пастереллезы животных и птиц: специфическая профилактика, лечение и методы борьбы. М., 1989 57 с.

103. Ярцев М. Я., Сапегина Е. П., Анисимова Л. В.и др; Морфология, культуральные и биохимические свойства пастерелл на разных стадиях роста при управляемом культивировании. // ЭИ. Передовой н.-пр.опыт в биол.промышленности. М., 1985 в. 8.

104. А1 Lebban Z. S., Corbeil L. В. et al. Rabbit pasteurellosis : Induced disease and vaccination. II Am. J. Vet. Res. 1988 v. 49 № 3 p. 312 - 316.

105. Aldova E., Frederiksen W. Et al. Aerogenic pasteurellas and Pasteurella Like organism isolated in Czechoslovakia. // Zentrabblatt fur Bacteriologie. 1992 v. 277 № lp. 139- 143.

106. Azam M. W., Hussain I., Ashfaque H. Comparative immunogenity of sonicated P.multocida and formalized in rabbits. // Pakistan Vet .J. 1991 v. 11 №3 p. 120- 122.

107. Baba T. Immunogenic Activity of Ribosomal Fraction Obtained from Pasteurella multocida. // Infekt. Immun. 1977 v. 15 № 1 p. 1 6.

108. Bain R. V. S. Studies on hemorrhagie septicemia of cat IV. A preliminary examination of antigens of P.multocida type I. // Brit. Vet. J. 1955. Ill, p. 492 -498.

109. Bakulina L. I. Isolation of the agent of hemorrhagic septicemia from sick gerbils. J. Microbiol. Epidemiol, and Immunol. 1961 № 5 p. 112 123.

110. Barnum D. A. Socioeconomic Significance of the HAP Group. // Can. J. Vet. Res. 1990v. 54 p. 1-5.

111. Batty M. A. Bullet. //Epizootic of Africa, 1973, 21, 2,p. 171 174.

112. Biberstein E. L. Our understanding of the Pasteurellaceae. // Can. J. Vet. Res. 1990 v 54 p. 78-82.

113. Bjorge R., Bolinbroke D. Fowl cholera in overwinterized mallard ducks. // Can. Vet. J. 1988 v. 29 № 5 p. 666 667.

114. Brito J. B., Piffer I. A., Wentz I., Brito M. A. Capsular types and toxin producing by strain of P.multocida isolated from pigs in Southern Brazil. // Rev. microbiol., 1993 v. 24 № 2 p. 94 97.

115. Cameron C. M., Bester F. J. Formulation on effective P.multocida vaccine for sheep. // J. Vet.Res. 1984 v. 54№ 3 p. 189-191.

116. Carter G. R. A bacterin for prevention of shipping fever in Canada. // Vet. Med. 1957 v. 32 № 5 p. 254 255.

117. Carter G. R. A new serological type of P.multocida from Central Africa. //t

118. Vet. Rec. 1961 v. 73 № 9 p. 1052.

119. Carter G. R. Further observation typing P.multocida by the indirect hemagglutination test. // Can. J. Med. 1962 v. 26 № 2 p. 238 240.

120. Carter G. R. Hyaluronidase production by B P.multocida from cases of hemorrhagic septicemia. // J. Clin. Microb. 1980 v. 11 № 1 p. 94 96.

121. Carter G. R. Observation on the pathology and bacteriology of shipping fever in Canada. // Can. J. Comp. Med. Vet. Sc. 1954 v. 18 № 10 p. 359 364.

122. Carter G. R. Pasteurella. Hadbuch der bacteriallen infektionen bei Tieren. 1981, p. 557-593.

123. Carter G. R. Pasteurello'sis : P.multocida and P.haemolytica . // In "Advances in veterinary science" VII New York - London, 1967 p. 321 - 379. •

124. Carter G. R. Some characteristic of type A strains of P.multocida . // Brit. Vet, J. 1958 v. 114 № 9 p. 356-357.

125. Carter G. R. Studies on P.multocida. I. A hemagglutination test for the identification of serological types. // Amer. J. Vet. Res. 1955 v. 16 № 3 p. 481 -484.

126. Carter G. R. Studies on P.multocida. II. Identification of antigenic characteristics and colonial variants. // Am. J. Vet. Res. 1957 v. 18 № 66 p. 210 -213.

127. Carter G. R. Studies on P.multocida. IV. Serological types from species other than cattle and swine. // Am. J. Vet. Res. 1959 v. 20 № 2 p. 173 175.

128. Carter G. R. The type specific capsular antigen of P.multocida. // Can. J. Med. Sc. 1952v. 30 № 1 p. 48-53.

129. Carter G. R., Bain R. V. S. Pasteurellosis (P.multocida ) a review stressing recent developments. // Vet. Rev. An. 1960 v. 6 № 2 p. 105 128.

130. Carter G. R., Byrne J. H. A serological study of hemorrhagic septicemia. // Cornell. Vet. 1953 XLIII № 1 p. 223 230.

131. Chengappa M. M. , Carter G. R., Chang T. S. A streptomycin dependent live Pasteurella multocida type 3 vaccine for the prevention of fowl cholera in turkey. // Avian Dis. 1979.

132. Confer A. W., Panciera R. J., Fulton R. W., Gentry M. J., Rummage J. A. Effect of vaccination with live or killed Pasteurella haemolytica on resistance to experimental bovine pneumonic pasteurellosis. // Am. J. Vet. Res. 1985 v. 46 № 2 p. 342 347.

133. Dhanda M. R., Das M. S., Lall J. M. , Seth R. N. Immunological studies on Pasteurella septica. I. Trials on adjuvant vaccine. Ind. J. Vet. Sci. Anim. Husb., 1956,28, p. 273-284.

134. Dubrenil J. D., Gilbert L., Jacques M. Cell surface characteristics and virulence in mice of P.multocida . // Zentralblatt fur Bakteriologie. 1992 v. 276 № 3 p. 366-373.

135. Fengsheng L., Jonglin W. A study on isolation and identification of pathogen of pasteurellosis and capsular antigen type. // J. North East Forest. Univ. 1993 v. 21 № 1 p. 49-53.

136. Fodor L., Donachie W. ELISA for the measurement of sheep antibodies to the capsular antigens of Pasteurella haemolytica serotypes. // Res. Vet. Science. 1985 № 45 p. 414-415.

137. Friedlander R. C., Olson L. D. Comparison of live avirulent M 9, Minnesota and CU fowl cholera vaccines. // Avian. Dis. 1991 v. 35 № 2 p. 251 - 256.

138. Ganiere J. P., Francoise E. Characterization of P.multocida from gingival scraping of dogs and cats. // Comp. Imm. Micr. and Inf. Dis. 1992 v. 16 № 1 p. 77-85.

139. Gaunt G., Moffat R. And Mukkur T. K. S. Fowl cholera: Immunization of chicken with potassium thiocynate (KSCN) extract of Pasteurella multocida serotype 3. // Avian Diseases. 1978, 21 (4), p. 543 548.

140. Gilmour N. J. et al. Pasteurellosis Vaccines. // Patent of G. R. № 0209219, date 19.03. 1980.

141. Gilmour N. J. The role pasteurellae in respiratory diseases of cattle. In Respiratory Diseases in cattle. // Ed. by W. B. Martin. Boston 1978 v. 3 p. 356 -362.

142. Heddleston K. L., Reisinger R. C. Studies on pasteurellosis. Ill Control of experimental fowl cholera in chickens and turkey with an emulsified killed vaccine. // Avian Dis. 1959 v. 3 p. 387 404.

143. Heddleston K. L., Walkol P., Rebers P.A. Dissociation of fowl cholera strain of P.multocida. // Avian Dis. 1964 v. 8 № • 7 p. 649 657.

144. Hetzman T., Michael A., Markenson T. Fowl cholera Vaccine. I I USA, Patent № 2003029, date 23.08.78.

145. Iwamtsu S., Sawada T. Relationship between serotypes dermonecrotic toxin production of P.multocida isolation and pneumonic lesion of porcine lung. // Jap. J. Vet. Sci. 1988 v. 50 p. 1200 1206.

146. Jacques M., Foiry B. Electron Microscopy Visualization of Capsular Material of P.multocida Types A and D labeled with Polycationic Ferritin. // J. Bacteriol. 1987 v. 1169 № 8 p. 3470 3472.

147. Jericho K. W. F., Cho H. Y., Kozub G. C. Protective effect of inactivated Pasteurella haemolytica bacterin challenged in bovine herpesvirus 1 experimentally infected calves. // Vaccine, 1990,v. 8 p. 315 - 320.

148. Kajikowa O., Matsumoto M. A protective antigen for turkey purified from a type I strain of P.multocida. // Vet. Micr. 1984 v. 10 № 1 p. 43 55.

149. Kim J. Y., Park J. M. and Kin D. N. Studies on the immunogenicity of Pasteurella multocida isolated from swine in Korea. // Res. Rep. of the Rural Development Adm. (Live stock and Veterinary) 1986, 28 (1), p. 77-93.

150. Knox K. W., Bain R. V. S. The antigens of P.multocida type 1.1. Capsular lipopolisaccharides. // Immun. 1960 v. 3 № 5 p. 352 362.

151. Kucera C. T., Wong T. C., Eis R. L. Development of chemically altered P.multocida vaccinal strain. // Am. J. Vet. Rec. 1981 v. 42 № 8 p. 1386 1394.

152. Larriviere S., Lebbanc L., Mittal K. R., Martinean G. R. Characterization of P.multocida from nasal cavities of piglets from farms with or without atrophic rhinitis. //J. Clinic. Med. 1992 v. 30 № 6 p. 2398 1401.

153. Lin S. T., Chen Y. Y., Yang S. Studies on a capsular subunit vaccine against fowl cholera IV. Some of the physical and chemical properties of the capsular antigen of the P.multocida. // Acta Vet. et Zootech. Sinica. 1988 v. 19 № 3 p. 195-200.

154. Little P. A., Lyon B. M. Demonstration of serological types within the nonhemolytic Pasteurellae. // Am. J. Vet. Res. ,1943,4, p. 110-112.

155. London S. A., You K. Antigenic analysis of dissociation and serological types of P.multocida. // Can. J. of Med. 1957 v. 3 № 7 p. 1021 1024.

156. Lu O., Rhoades K. R., Rimler R. B. A virulent of capsular strains of P.multocida for turkey.//Av. Diseases. 1988 v. 32 № 1 p. 121 125.

157. Maheswaran S. K., Thies E. S. Influence of encapsulation on phagocytosis of Pasteurella multocida by bovine neutrophils. // Infect. Immun. 1979 № 26 p. 76 -81.

158. Mashiro N., Motoru O., Yuichi A., Kiken O., Tomoatsu K. The first Outbreak of fowl cholera an Muslovy Ducks in Japan. // J. Vet. Med. Sci. 1992 v. 54 № 6 p. 1215-1217.

159. Maskell D. F., Donan Y. Strategies in bacterial vaccine development. // Immunochem. And Mol. Genet. Anal. Bact. Patogens.: Proc. Hab. Workshop, Amsterdam, 1988,p. 147- 157.

160. McKinney K. L., Rebers P. A. Purification of P.multocida antigens by ultracentrifugation and isoelectrofocusing. // Can. J. Microbiol. 1982 v. 28 № 3 p. 511-523.

161. Moller O. A new method for straining bacteria capsules. // Acta Pathol. Micr. Scad. 1951 v. 28 p. 127-131.

162. Mosier D. A., Confer A. W. The evaluation of vaccines for bovine pneumonic pasteurellosis. //Res. Vet. Sci. 1989 v. 47 № 1 p. 1 10.

163. Mukkur T. K. S. Immunogic and physiologic responses of calves inoculated with potassium thiocynate extract of P.multocida type A. // Am. J. Vet. Res. 1978 v. 39 № 8 p. 1263- 1273.

164. Mukkur T. K. S., Poliotis N. Possible immunological synergism among the protective antigens of P.multocida, type A. // J. Comp. Path. 1982 v. 92 № 2 p. 249-260.

165. Myint A. A live vaccine against hemorrhage septicemia. // Asian Live Stock. 1992v. 17 № 1 p. 1-4.

166. Myint A., Carter G. R. Prevention of haemorrhagic septicemia in buffaloes and cattle with a live vaccine. // Vet. Rec. 1989 v. 124 № 19 p. 508-509.

167. Nakai T., Kume K., Joslukawa H., Oyamada T. Et. Al. Changes in the nasal mucosa of specific pathogen fur neonatal pigs infected with P.multocida or B. bronchiseptica. // Jap. J. Vet. Sci. 1986 v. 48 № 2 p. 693-701.

168. Namioka S., Murata M. Serological studies of Pasteurella multocida. II. Characteristics of somatic (O) antigen of the organism. // Cornell Vet. 1961, 51 p. 507-521.

169. Namioka S., Murata M. Serological studies of Pasteurella multocida. III. O antigenic analysis of cultures isolated from various animals. // Cornell Vet. 1961, 51 p. 522-528.

170. Nocmier G., Rinel A. M., d'Hinterlond L. D., Wigzell A. Ribosomes as carriers for antigenic determinant of the surface of microorganisms. // Stand. Immunopharm. Natur. Und Synth. Immynomodul: Proe. Symp. 1992 p. 79-85.

171. Olson R. D., Schlink G. T. On stand duration of immunity and minimum dosage with CU cholera vaccine in turkeys via drinking water. // Avian. Dis. 1986 v. 30 №2 p. 87-92.

172. Ose E. E., M. S., and O. A Muenster, B. S. A method for evaluation of vaccines containing Pasteurella multocida. // Am. J. Vet. Res., 1968, vol. 29 N 9, p. 1863 1866.

173. Panciera R. J. Cortvet R. Et. Al. Bovine pneumotic pasteurellosis: Effect of vaccination with live P. species. // Am. J. Vet. Rec. 1984 v. 45 № 12 p. 25382542.

174. Paster L. Sur les maladies virulentes et en particulier sur la maladie appelée vulgarirement choiera des poules. // Acad. Sci., 1880, 90, 239, 952, 1030.

175. Phillips M., Rimler R. B. Protection of chickens by ribosomal vaccines from P.multocida: Dependence on homologies lipopolysaccharide. // Am. J. Vet. Rec. 1984 v. 45 №9 p. 1785-1789.

176. Pijoan C. Diseases of swine Pneumonic Pasteurellosis. 1992 p. 552-559.

177. Pijoan C., Trigo F. Bacterial adhesion of mucosal surfaces with special reference to P.multocida isolated from atrophic rhinitis. // Can. J. Vet. Rec. 1990 v. 54 p. 16-21.

178. Prince G. H. Antigenic studies on P.multocida using immunodiffusion techniques. III. Relationships between strains of P.multocida. // J. Comp. Path. 1966 v. 76 № 2 p.321-332.

179. Prince G. H., Smith J. E. Antigenic studies on P.multocida. I. Identification and nomenclature of the soluble antigens of a bovine haemorrhagic septicemia strains. // S. Comp. Path. 1966 v. 76 № 2 p. 303-314.

180. Pyliotis N. A., Mukkur T. K. S. Ultrastructural observation on P.multocida type A(bovine origin). // Res. Vet. Sci. 1981 v. 31 № 1 p. 87-89.

181. Rangel M. F., Aguadi C. P. P.multocida como agente desensade wante de pleuritis y pneumonia fibrinosa en cerdos. // Vet. Mex. 1992 v. 23 № 3 p. 231 -232.

182. Ramon G.C.//R. Acad. Sci, 1923, 177, 1338.

183. Rebers P. A., Heddleston K. L., Rhoades K. R. Isolation from P.multocida a LPS antigen with immunity and toxic properties. // J. Bacter. 1967 v. 93 № 1 p. 7-14.

184. Reilly L. L. Atrophic rhinitis in swine. Swine pasteurellosis. // Con. Anim. Health. 1981 p. 16

185. Rhoades K. R., Rimler R. B. Serological characterization of P.multocida strain isolate from wild ruminants as capsular serogroup B. // Vet. Rec. 1992 v. 130 №5 p. 331-332.

186. Rimler R. B., Angus R. D. et al. Evaluation of the specificity of P.multocida somatic antigen-typing antisera prepared in chickens, using ribosomelipopolisaccharide complexes as unocula. // Am. J. Vet. Rec. 1989 v. 50 №l p. 29-31.

187. Ringler D. H., Peter G. K., Chisp C. E., Keren D. F. Protection of rabbits against experimental pasteurellosis by vaccination with potassium thiocynate extract of P.multocida. // Inf. and Immun. 1985 v. 49 № 3 p. 498 504.

188. Roberts R. S. An immunological study of Pasteurella septica. // J. Comp. Patroll., 1947, 57 p. 261 -278.

189. Rosenbusch C. T., Merchant I. A. A study of the hemorragic septicemia Pasteurellae. J Bacteriol., 1939, 37 p. 69 -89.

190. Rutter J. M. Atrophic rhinitis in swine. // Ads. Vet. Sci. 1985 v.29 p. 239-279

191. Saif Edin M. Immunization of duck against P.multocida infection by avirulent CU strain. // Ass. Vet. Med. 1992 v. 27 № 53 p. 289-294.

192. Shewen P. E., Wilkie B. N. Antibody Titers to P.haemolytica A I in Ontario Beef Cattle. // Can. J. Comp. Med. 1982 v. 46 p. 354-356.

193. Shewen P. E., Wilkie B. N. Prevention of bovine pneumonia pasteurellosis. //

194. Highlights. 1985 v. 8 № 3 p.4-6.

195. Singh N., D. S. Sambyal, G. L. Soni and S. S. Sodni. Immunogenicity trial of Pasteurella multocida. // Indian J. of Animal Sciences, 1990, 60 (9), p. 1067 -1068.

196. Smith J. E. Studies on P. septica II. Some cultural and biochemical properties of strains from different host species. // J. Comp. Path. 1958 v. 68 p.315-323.

197. Smith R. H. Solid enzyme immunoassay of bovine antibody responses following immunization against natural infected with P.haemolytica . // Vet. Immun. Immunoplat. 1983 v. 5 № 1 p. 33-45.

198. Sriveslava K. K., Foster J. W. Characterization of an immunogenic fraction of P.multocida culture. // Can. J. Microb. 1977 v. 23 p. 197-201.

199. Stepheus I. R. Positive and Negative Aspects of Host Immune Response to Haemophilus, Actinobacillus and Pasteurella. // Can. J. Vet. Rec. 1990 v. 54 p. 41-44.

200. Syuto B., Matsumoto M. Purification of a protective antigen from a saline extract of P.multocida. // Inf. And Immun. 1982 v. 37 №3 p.1218-1226.

201. Trevisan V. Sul micrococco della rabia e sulla possibility di riconoscere durante il periodo d'meubazione, dall'esame del sangue della persona morsicata, si ha contratta l'infezione rabbica. Rend 1st Lombardo Ser. II, 1887, 20 p. 88 -105.

202. Trola V. L., Kazadzhov J. Neuraminidase activity of P.multocida. // Docl. Bolg. Med. Akad. Nank. 1969 v. 22 №5 p.517.

203. Tsuji M., Matsumoto M. Immunochemical relationship of the antigens purified from P.multocida strain 1059. // Am. J. Vet. Rec. 1988 v. 49 № 9 p.1510 — 1515.

204. Wei B. D., Carter G. R. Live streptomycindependent P.multocida vaccine for prevention of hemorragic septicemia. // Am. J. Vet. Rec. 1978 v. 39 p. 1534-1537.

205. Мы, нижеподписавшиеся, директор ФГУП «Щелковский биокомбинат» Скичко Н. Д., заместитель директора по производству Зснов I I. И., начальникi

206. ОБК Ольхов В. В., начальник цеха*№ 10 Ерохип В. И., старший микробиолог *

207. Заражение проводили подкожно по 0,5 мл одновременно стаким же количеством аналогичных по весу контрольных мышей. Наблюдение за животными 10 дней, смерть регистрировали. Результаты опыта учтены комиссионно и приведены в таблице № 1.

208. Далее полученная сыворотка крови вакцинированных и контрольного поросят тестировалась в РИГА с разработанными лабораторией бактериологии ВИЭВ эритроцитарными диагностикумами для определения титров антител к капсульным антигенам пастерелл.

209. О чем и составлен настоящий акт.1. 02.2002 г.1. Зенов Н. И.1. Начальник ОБК1. Ольхов В. В.1. Начальник цеха № 101. Ерохин В. И.1. Старший микроб*