Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стандартизация методов изготовления сухой вирусвакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней на основе глубинного культивирования вирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шкабура, Юрий Петрович, Москва



ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

( ВГНКИ )

На правах рукописи

ШКАБУРА ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ

УДК: 619:615.371:578.834.1

СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА

03.00.06. - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук НОЧЕВНЫЙ В.Т. Доктор биологических наук ГРУЗДЕВ К.Н.

Москва - 1999

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ТГЭ - трансмиссивный гастроэнтерит ТЭ - тканевые эксплантаты ЭЛПС - эксплантаты легких плодов свиней ЭКПС - эксплантаты кишечника плодов свиней Д - доза заражения КЖ - культуральная жидкость ЭВМ - электронновычислительная машина КМ -культуральная модель ПС - питательная среда СК - сыворотка крови ГЛА - гидролизат лактальбумина

ГЛАХ - гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса ГЛАЭ - гидролизат лактальбумина на растворе Эрла ОМ - обезжиренное молоко

СЖФ - сахарозо-желатиновая среда в фосфатном буфере

К - константа скорости инактивации

ЗС - защитная среда (стабилизатор)

п/о - пероральная иммунизация

в/м - внутримышечная иммунизация

и/н - интраназальная иммунизация

НД - нормативная документация

ИП - индекс пролиферации

УК - урожай клеток

НТД - нормативно-техническая документация

ПЛК - перевиваемая линия клеток

ЦПД - цитопатогенное действие

ЦПЭ - цитопатогенный эффект

ПП - почка поросенка

ПЭС - почка эмбриона свиньи

ТП - тестикулы поросят

ЩС - щитовидная железа свиньи

СЖС - слюнная железа свиньи

КС - кишечник свиньи

ПК - почка крольчонка

ПЩ - почка щенка

КЭ - куриные эмбрионы

- 2 -СОДЕРЖАНИЕ

1 . ВВЕДЕНИЕ...................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней < историческая

справка)....................................................8

2.2. Характеристика возбудителя ТГЭ свиней.....................13

2 . 3 . К.ультуральные свойства вируса ТГЭ свиней..................16

2.4. Использование суспензий переживающих тканей в вирусологической практике...........................................25

2.5. Особенности патогенеза и иммунитета у животных при ТТЭ свиней....................................................35

2.6. Средства и методы специфической профилактики ТГЭ свиней... 39

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 . 1 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................54

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.2 Сравнительная оценка чувствительности культуральных моделей к вирусу ТГЭ свиней...................................67

3.3. Влияние некоторых Факторов на накопление вируса ТГЭ свиней

в суспензии переживающих тканей...........................70

3.4. Определение оптимальных параметров глубинного культвирова-ния вируса ТГЭ свиней с использованием математических методов планирования и анализа многофакторного эксперимента.75

3 . 5 . .Усовершенствование технологической линии для глубинного

культивирования вируса....................................81

3.6. Оптимизация технологических параметров культивирования

вируса. ТГЭ свиней в суспензии переживающих тканей.........90

3.6.1. Способ культивирования....................................91

3.6.2. Системы и условия перемешивания...........................94

3.6.3. Интенсивность аэрации и рН среды.............."............95

3.6.4. Степень заполнения, :......................................97

3.6.5. Объем реактора.................................'...........99

3. 6 . 6 . Двухстадийное культивирование вируса.....................100

3.7. Усовершенствование метода изготовления питательных сред..102

3.8. совершенствование технологии крупномасштабного культивирования вируса ТГЭ свиней...............................105

3.9. Подбор стабилизатора и режима лиофилизации вирусвакцины..109

3.10. Промышленное производство антигена и вирусвакцины против ТГЭ свиней...............................................115

3.11. Стабильность вирусвакцины против ТГЭ свиней в процессе длительного хранения.....................................122

3.12. Эффективность вирусвакцины сухой культуральной против ТГЭ

♦

свиней в эксперименте и ветеринаркой практике..........125

3.13. Технико-экономическое обоснование производства вирусвакцины против ТГЭ свиней на основе глубинного культивирования вируса....................................................136

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................141

5. ВЫВОДЫ...................................................151

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................155

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................156

8 . ПРИЛОЖЕНИЯ...............................................192

ВВЕДЕНИЕ

Болезни желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, в том числе трансмиссивный гастроэнтерит (ТГЭ) свиней, широко диагносцируется во многих странах мира и имеют тенденцию к

Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней - остро протекающая контагиозная болезнь, которая поражает животных всех возрастных групп, характеризуется рвотой, изнуряющей диареей, обезвоживанием организма, отвесами, высокой смертностью поросят в первые дни жизни и наносит свиноводству значительный экономический ущерб. В связи с отсутствием эффективного медикаментозного лечения, основным средством борьбы с ТГЭ свиней является специфическая профилактика при помощи живых и инактивированных вакцин, технология изготовления которых несовершенна (47, 51, 103).

Анализ существующих технологий показывает, что для произ-

способы выращивания клеточных культур в стационарных условиях, роллерных установках и аппаратах различной модификации (139, 140, 141), а для получения антигенов - методы крупномасштабного культивирования вирусов в суспензии растущих клеток и переживающих тканей. Первое направление, за небольшим исключением (изготовление вакцин против ящура в культуре клеток ВНК-21/13), в нашей стране практически не реализовано. Широкие перспективы промышле-ного культивирования вирусов открывает простой и высокоэкономичный метод переживающих тканей (24, 38, 85, 86, 109, 110).

Не отвечает современным требованиям способ получения вирус-вакцины против ТГЭ свиней в первичной культуре клеток ПЭС. Неотложного решения требуют также вопросы, связанные с модернизацией

распространению (13, 28, 97, 103).

/

вирусных препаратов (BII) используют в основном рутинные

технологического оборудования, подбором культуральных моделей (КМ}, оптимизацией условий культивирования вируса в суспензии переживающих тканей, а также возможностью использования "суспензионных" антигенов для изготовления иммуногенного биопрепарата.

Поэтому исследования, направленные на изыскание новых средств, методов контроля и получения активных антигенов в больших объемах имеют для биопроизводства бесспорную актуальность.

Крупный вклад в решение вышеуказанных проблем внесли отечественные (В.А.Сергеев, 1966, 1976, 1990; Д.Ф.Осидзе, 1974; A.C.Новохатский, 1979, 1982: Л.П.Дьяконов, 1980, 1983; В.Н.Сюрин, 1984) и зарубежные исследователи (Р.Адаме, 1963; С-.Д.Перт, 1978; P.A. Сппиер и др., 1989; Р.Фрешни, 1989; В.Гриффите, 1989; И.Лас-тински, 1989). Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику.

Цели и задачи исследований.

Целью исследований является разработка способа изготовления сухой вирусвакцины против ТГЭ свиней на основе глубинного культивирования вируса в суспензии переживающих тканей.

В связи с поставленной целью в задачи исследования входило:

- подобрать культуральную модель для получения вируса ТГЭ свиней глубинным методом;

- оптимизировать условия культивирования вируса в суспензии тканевых эксплантатов (ТЭ):

- усовершенствовать технологию производства вирз^са и вакцины в больших объемах;

- изучить условия стабилизации вирусвакцины;

- определить условия и сроки хранения препарата;

- изучить эффективность вирусвакцины в эксперименте и ветеринарной практике;

- разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на изготовление, контроль и применение "сухой вирусвакцины против ТГЭ -свиней из штамма ВГНКИ" .

Научная новизна.

Впервые получены научно-обоснованные данные, положенные в основу разработки технологии изготовления "сухой вирусвакцины против ТГЭ свиней из штамма ВГНКИ", репродуцированного в суспензии переживающих тканей.

Впервые определена высокочувствительная культуральная модель для получения вируса в больших объемах. . Показана эффективность и экономическая целесообразность использования математического метода планирования и. анализа многофакторного эксперимента для определения оптимальных технологических показателей культивирования вируса ТГЭ свиней в суспензии переживающих тканей в реакторах.

Изучены основные иммунобиологические свойства штамма ВГНКИ и получены экспериментальные данные о его пригодности к использованию в составе сухой вирусвакцины против ТГЭ свиней".

Определены оптимальные технологические показатели культивирования вируса в суспензии переживающих тканей в реакторах и изготовления вирусвакцины.

Практическая значимость работы.

На Омском биокомбинате внедрена промышленная технология изготовления "сухой вирусвакцины против ТГЭ свиней из штамма ВГНКИ". Экономически обосновано и даны практические рекомендации по применении препарата в ветеринарной практике.

Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на изготовление и контроль сухой вирусвакцины против ТГЭ свиней.

Апробация работы.

Основные положения исследований доложены и получили положительную оценку на научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка крупного рогатого скота и свиней" (Новосибирск, 15-16 октября 1996 г.);Ученом совете ВГНКИ ветпрепаратов (Москва, 1997-1998); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 12 февраля, 1998).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Основные положения работы, выносимые на защиту

- Оптимизация условий культивирования вируса ТГС свиней в суспензии переживающих тканей плодов свиней в реакторах.

- Технология изготовления и методы контроля сухой вирусвакцины из штамма ВГНКИ против ТГЭ свиней на основе антигена, выращенного глубинным методом.

- Эффективность вирусвакцины для профилактики ТГЭ свиней.

- 8 -2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (историческая

справка)

Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней - контагиозное, остропротекакяцее инфекционное заболевание, которому подвержены все возрастные группы животных. Заболевание характеризуется высокой смертностью, особенно среди новорожденных поросят до 10 дневного возраста. У взрослых животных болезнь протекает инапа-рантно и оканчивается полным выздоровлением, смертность не превышает 1-2% (28, 97, 103, 259).

Болезнь впервые описана в США, где была установлена его ин-фекционность и доказана вирусная природа возбудителя (182). В настоящее время ТГЭ регистрируется на всех континентах (187), но особенно в странах с интенсивно развитым свиноводством (Великобритании, Франции, Италии, Испании, Венгрии, Германии, Польше, Австралии, Канаде, Африке, России и странах СНГ) и имеют тенденцию к широкому распространению (28, 97 103, 146, 179, 189, 190, 192, 193. 204, 206, 251, 274, 286, 289. 308, 309). Этому в значительной степени способствует интенсификация животноводства, создание крупных промышленных комплексов, содержание свиней на ограниченных территориях, изменение условий содержания и кормления, а также персистенция вируса в организме переболевших животных, перезаражение поросят в помете и при формировании откормочных групп (28, 97, 103).

ТГЭ причиняет значительный экономический ущерб, который складывается из прямых потерь от гибели поросят, недополучения продукции, а также от расходов на профилактические ветеринар-но-санитарные мероприятия. Ежегодные потери от ТГЭ свиней оцени-

ваются в Великобритании в размере 20-60 млн. Фунтов стерлингов, во Франции 77 млн Франков, в США - 180 млн. долларов (276, 290).

Трансмиссивному гастроэнтериту подвержены все возрастные группы свиней. Другие виды сельскохозяйственных и лабораторных животных к. вирусу не чувствительны. Интенсивность проявления клинических признаков, степень и частота поражения органов и тканей зависит от возраста. Физиологического состояния и условий содержания животных, а также вирулентности возбудителя и многих других Факторов (2, 28, 36, 39, 44, 47, 51, 97).

Пик инфекции отмечается с середины ноября и к концу апреля заболеваемость свиней ТГЭ резко падает (266). Основными источниками инфекции являются больные и переболевшие свиньи, продукты Pix убоя, инфицированные корма, вода, помещения, а также предметы ухода за животными. Определенную роль в распространении инфекции играют также собаки. кошки.скворцы, грызуны и мухи (51. 121, 184, 266, 275).

В естественных условиях наиболее распространенный путь заражения животных - алиментарный и аэрогенный. Первичное размножение вируса наблюдается в цитоплазме эпителиальных клеток (энтероци-тах) ворсинок тощей и подвздошной кишок, а также в клетках слизистой носа и легких, миндалинах и мезентериальных лимфатических узлах. Доказано выделение вируса с молоком свиноматок, что вызывает быстрое распространение инфекции среди поросят-сосунов (277). Длительность вирусоносительства колеблется от 2 мес. до года и более (309).

После заноса возбудителя в хозяйство болезнь быстро распространяется и за несколько дней поражает всех животных. В репро-дукторных хозяйствах, при отсутствии эффективных мер борьбы, бо-

лезнь принимает стационарный характер, а в комплексах инфекция активизируется в периоды туровых опоросов и длится 2-3 месяца (2, 28, 39, 51, 97).

При первичном возникновении ТГЭ поражаются свиньи всех возрастов, а гибель поросят достигает 100%. В стационарно неблагополучных хозяйствах поросята обычно болеют перед отъемом (148).

Периодическому обострению инфекции способствуют факторы, снижающие резистентность организма свинопоголовья, а также несоблюдение ветеринарно-санитарного режима содержания животных (103).

Клиническая картина болезни определяется характером эпизоотического процесса, напряженностью иммунитета стада и может быть острой, хронической и атипичной. Клинические признаки болезни у животных различных возрастных групп заметно отличаются, но во всех случаях имеет место расстройство желудочно кишечного тракта (2, 47).

Первые клинические признаки болезни наблюдают уже через 12-16 часов после экспериментального заражения животных (беспокойство, сменяющееся угнетением, отказ от корма и рвотой). В рвотных массах обнаруживают большое количество непереваренного молока. У больных животных отмечают также посинение пяточка, взъ-ерошенность щетины, кожный покров с серым оттенком, мышечная дрожь, поросята скучиваются, появляется озноб (65). Через 1-2 часа после первичного появления рвоты развивается прогрессирующий профузный понос, приводящий к дегидротации организма и гибели поросят. Каловые массы жидкие, желтовато-зеленого цвета с пузырьками газа. У свиней снижается или совсем исчезает аппетит, появляется жажда и слабость, уменьшается или полностью пропадает секреция молока. Животные быстро худеют. Температура тела животных на-

ходится в пределах нормы. Возможна гипертермия (39, 44, 49, 136, 138, 264).

Выраженность клинических признаков болезни, продолжительность ее и исход обратно-пропорциональны возрасту животных. Падеж поросят при инфицировании до 5-дневного возраста составляет 100%, в 5-10 дневном - 67%, в 10-15 дневном - 54,4%, в 15-20 дневном -33%, в 20-25 дневном - 20%; среди отъемышей и подсвинков - 1% (64, 103, 136, 138).

У убитых в атональном состоянии и павших поросят от ТГЭ па-тологоанатомические изменения наблюдаются в желудочно-кишечном тракте и ассоциируются, в основном, с исключительной дегидротаци-ей организма (2, 28, 88, 170, 171).

Подкожная клетчатка и мышцы обезвожены, дряблой консистенции, органы грудной полости без видимых изменений. Печень и селезенка кровенаполнены, последняя плотная и слегка увеличена.

Желудок, как правило, наполнен свернувшимся молоком. Слизистая оболочка дна желудка крупноскладчатая, набухшая, катарально воспалена, диффузно или локально гиперемирована, часто с наличием точечных кровоизлияний. Иногда в желудке находят язвы. Около 50% поросят, убитых в течение первых 3-х дней с момента инфицирования, имеют небольшие геморрагии на диафрагмальной части желудка.

Кишечник наполнен непереваренным молоком, от желтого до серо-красноватого цвета, часто с наличием пенящейся жидкости. Стенка тощей и подвздошной кишок истощена, а слизистая оболочка от серого до бордового цвета, покрыта мутной слизью местами с точечными кровоизлияниями или изъязвлена. Слизистая оболочка слепой и ободочной кишок поперечноскладчатая, набухшая и диффузно-гипере-мирована. У большинства животных выявляют кроме того обширные ин-

Фильтраты из эозиноФилов. Брыжеечные лимфатические узлы серовато-белого цвета, слегка набухшие с застойными явлениями в кровеносных сосудах (88).

Важным признаком ТГЭ свиней является также заметное укорочение ворсинок в тощей и подвздошной