Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии изготовления и контроля вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма "БГ"

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии изготовления и контроля вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма "БГ""

На правах рукописи

Для служебного пользования №8 дсп от 08.02.2000 г. экз. №30

УДК 619; 616.476-022.6: 615.371

КУЗНЕЦОВ Юрий Валентинович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ВИРУСВАКЦИНЫ СУХОЙ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ КУР ИЗ ШТАММА «БГ»

03.00.06 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте

защиты животных

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший

научный сотрудник БОРИСОВ A.B.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор УЗЮМОВ В.Л. (ВНИИЗЖ, Г.Владимир);

доктор биологических наук ФОМИНА Н.В. (МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина, г. Москва).

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный

научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г.Москва).

Защита состоится «18» апреля 2000 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода Российской Федерации по адресу: 600900, г.Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан 15 марта 2000 года. Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М.Семенова

/7$ ¿и/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) является высококонтагиозной иммунодепрессивной инфекцией цыплят, которая характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей.

ИББ широко распространена и поражает продуктивное птицеводство во всем мире. В Российской Федерации заболевание птиц ИББ с наличием клинической формы зарегистрировано в большинстве административно-географических регионов. Часто встречается субклиническая форма болезни.

ИББ наносит значительный экономический ущерб, обусловленный гибелью (5-70%) птиц, снижением прироста массы тела, возрастанием процента браковки птиц и тушек. Большой урон связан с иммунодепрессивным воздействием вируса, избирательно поражающего один из центральных органов иммунной системы - фабрициеву сумку. Опасность иммунодепрессии данного вируса состоит не только в снижении иммунной реакции организма, но и в том, что переболевание инфекционной бурсальной болезнью влияет на восприимчивость птиц к возбудителям других болезней, как вирусной, так и бактериальной этиологии.

Общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают полного оздоровления птицехозяйств от инфекционной бурсальной болезни . Поэтому в комплексе ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и ликвидации инфекции основное внимание уделяется специфической профилактике - вакцинации, которая должна проводиться с учетом наличия в сыворотке крови цыплят материнских антител.

Так, во всех странах мира, включая Россию, в качестве единственно правильного и надежного направления выбрана вакцинация птиц с применением живых и инактивированных вакцин против данного заболевания. В связи с появлением в стране с 1991 года целого ряда очагов заболевания, вызванного вирусом с высокой патогенностью, и значительной смертностью заболевшей птицы, возникла проблема

создания эффективных средств диагностики и вакцинопрофилактики ИББ. Разработанные в 70-е годы первые живые вакцины из аттенуированных полевых штаммов вируса часто не давали положительных результатов. Усовершенствованные так называемые «промежуточные» вакцины не могли преодолеть пассивный иммунитет. Поэтому усилия ученых были направлены на создание вакцин, способных преодолевать пассивный иммунитет и индуцировать создание напряженного активного иммунитета. Отечественная живая вакцина из штамма «ВНИВИП» в очагах инфекции не обеспечивала ожидаемого эффекта.

Во многих странах для профилактики заболевания ИББ молодняк кур вакцинируют живыми вакцинами из «горячих» штаммов вируса. После получения отечественного штамма «БГ», а также использования штамма «Винтерфилд-2512» вируса ИББ, были разработаны вакцины, пригодные для профилактики этой болезни. Однако, многие вопросы, связанные с промышленным получением вируссодержащего сырья, технологией лиофилизации и подбором защитной среды для проведения этого процесса, а также изучением иммуногенеза у молодняка кур после введения сухой вирусвакцины требуют дальнейшего рассмотрения. В связи с этим решение ряда научных и технологических вопросов разработки и внедрения в промышленное производство технологии получения живых вакцин, обладающих высокой эффективностью против ИББ, является актуальной, научной и практической задачей.

Цель работы. Главной целью исследований была разработка технологии изготовления и контроля вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ».

Основные задачи исследований:

- отработать оптимальные условия культивирования штамма «БГ» вируса ИББ на СПФ-куриных эмбрионах;

изучить влияние процесса замораживания-оттаивания на биологическую активность штамма «БГ» вируса ИББ;

- подобрать оптимальную защитную среду, обеспечивающую минимальные потери биологической активности штамма «БГ» вируса ИББ при лиофилизации и определить оптимальный компонентный состав вирусвакцины, обладающей высокими иммунобиологическими свойствами;

- разработать технологию получения вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур;

- изучить стабильность иммуногенных свойств вирусвакцины в процессе хранения;

- определить иммунодепрессивное действие вирусвакцины сухой из штамма «БГ» вируса ИББ;

- изучить иммуногенные свойства вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ» в лабораторных и промышленных условиях;

- провести сравнение иммуногенных свойств отечественных и импортных живых вакцин против ИББ в лабораторных и промышленных условиях.

Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что:

- отработаны оптимальные условия культивирования штамма «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни кур на СПФ-куриных эмбрионах;

- изучены биологические свойства вируса ИББ штамм «БГ» в процессе замораживания-оттаивания;

подобрана защитная среда и компонентный состав, обеспечивающий сохранение вируса в процессе лиофилизации;

- разработана технология получения вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ»;

- изучены иммуногенные свойства этой вакцины в лабораторных и производственных условиях;

- определена стабильность иммуногенных свойств вакцины в процессе хранения;

-4- определено иммунодепрессивное действие штамма «БГ» вируса

ИББ;

- проведено сравнительное изучение иммуногенных свойств импортных и отечественных вакцин против ИББ.

Научная новизна работы подтверждена получением 2 патентов на изобретения (Патенты РФ №2127602; №2127604).

Практическая значимость. На основании экспериментальных исследований впервые разработана вирусвакцина сухая против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ» и подготовлена нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение этой вирусвакцины, которая одобрена ученым советом ВНИИЗЖ и утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 18.02.1998г. на постоянный срок действия.

Промышленная технология изготовления вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» внедрена во ВНИИЗЖ. Эта вакцина успешно применяется в большинстве птицеводческих хозяйств Российской Федерации, в республиках: Украина, Беларусь, Молдова, Узбекистан.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование условий культивирования штамма «БГ» вируса ИББ для получения вирусвакци.чы сухой.

2. Отработка технологии получения вирусвакцины сухой из вируса ИББ штамм «БГ»:

- изучение процесса замораживания-оттаивания и его влияние на биологические свойства вируса ИББ;

подбор оптимальной защитной среды, пригодной для лиофилизации вируса и оптимального компонентного состава вирусвакцины против ИББ;

- изучение изменений иммуногенных свойств вирусвакцины в процессе хранения;

- определение иммунодепрессивного действия штамма «БГ» вируса

ИББ.

-53. Изучение иммуногенных свойств вирусвакцины сухой против

инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ» в лабораторных

и промышленных условиях.

4. Сравнение иммуногенных свойств импортных и отечественных живых вакцин против ИББ.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1995-1999г.г. и на научной конференции ВНИИЗЖ (г. Владимир, 1995).

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложений, список литературы (195 источников, в том числе 148 иностранных) и дополнена 6 приложениями. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 1 рисунком.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования по диссертационной работе выполнены в 1994-1999 гг. в лаборатории болезней птиц Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Штаммы вируса ИББ. В исследованиях использовали эталонный патогенный штамм «52/70-М» вируса ИББ, полученный из ВГНКИ. и производственно-вакцинный штамм «БГ» вируса ИББ, полученный путем многократных последовательных пассажей полевого изолята на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,956,70 1д ЭИД^л

Эмбрионы. В работе использовали 9-11-ти суточные эмбрионы от безлейкозных кур из ОНЦ РАМН и СПФ-ВАЛО-куриные эмбрионы, полученные из фирмы «Ломан Тирцухт» (Германия).

Подопытные животные. Проверку вакцины на безвредность и иммуногенность проводили на клинически здоровых серонегативных к

ИББ цыплятах 10-30-суточного возраста, яичных и мясных пород, полученных из хозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням.

Стабилизирующая среда. В качестве защитной среды при лиофилизации производственно-вакцинного штамма «БГ» вируса ИББ использовали среду «ВНИИЗЖ».

Получение производственной серии вирусванцины сухой против ИББ из штамма «БГ» проводили согласно разработанным «Инструкции по изготовлению и контролю живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц (болезни Гамборо) из штамма «БГ» (1995) и ТУ 9384-006-00008064-98 «Вирусвакцина сухая против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ»» от 18 февраля 1998 года.

Определение стерильности вакцины. Определение стерильности вакцины проводили согласно ГОСТу 28085-89 и «Тестам на стерильность и чистоту от контаминации биологических материалов», 1996.

Определение биологической активности вируссодержащего материала. Биологическую активность определяли титрованием каждой серии вакцины на 10-суточных СПФ-куриных эмбрионах.

Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации И П. Ашмарина (1962).

Определение безвредности вакцины. Для проверки на безвредность каждому из 10 цыплят выпаивали 10-кратную дозу вакцины. 10 цыплят того же возраста не вакцинировали.

Цыплята должны оставаться клинически здоровыми в течение 10 суток наблюдения.

Определение иммуногенности вакцины. Иммуногенность вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ» определяли на СПФ-цыплятах 14-суточного возраста.Всех цыплят вакцинировали орально по одной дозе вакцины (1000 ЭИД50). Через 10 дней аналогичным способом проводили ревакцинацию.

Оценку эффективности вакцины определяли через 14 дней после повторной вакцинации путем исследования сыворотки крови на наличие антител в РДП и ИФА с использованием наборов фирм KPL, IDEXX, ВНИИЗЖ, и по контрольному заражению патогенным штаммом «52/70-М» вируса ИББ, интраназально в дозе 100 ЦИД.

Наблюдение за цыплятами после контрольного заражения вели в течение 10 суток.

Обработка полученных в ИФА результатов проводилась согласно прилагаемым к наборам инструкциям. Далее в тексте значения титров представлены в виде величин, обратных разведениям.

Статистическая обработка результатов исследований.

Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили согласно общепринятым методам биометрии и константным методам по Н.В. Садовскому, а также, используя программу «Statistical Graphics System» (USA, 1985-1986) для персонального компьютера IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеристика вакцинно-производственного штамма «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни кур

Для изготовления вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур использовали аттенуированный штамм «БГ» вируса ИББ кур, который является безвредным и обладает высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью. Штамм «БГ» является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма «БГ» был выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики «Уральская» Оренбургской области в 1993 году. Производственный штамм «БГ» получен в лаборатории болезней птиц A.B. Борисовым с сотрудниками в 1993-1994 гг. путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур.

Штамм «БГ» депонирован в Государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института

контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 21.06.1996 г. под регистрационным номером «БГ» 102 «ДЕП».

Отработка оптимальных условий культивирования вакцинного штамма «БГ» вируса ИББ кур

Успешная разработка и производство вакцины основаны на использовании качественного вирусного сырья. Поэтому в первую очередь было необходимо подобрать условия культивирования штамма «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни, позволяющие нарабатывать максимальное количество вируса с высокой биологической активностью.

На начальных этапах исследования был подобран оптимальный способ заражения СПФ-куриных эмбрионов штаммом «БГ» вируса ИББ.

В качестве потенциально возможных проверяли способы заражения СПФ-куриных эмбрионов в аллантоисную полость, на ХАО через искусственную пугу и на ХАО через естественную пугу по способу, основанному на легкой, щадящей скарификации подскорлупной оболочки и внесении вирусного материала между ХАО и подскорлупной оболочкой на границе пуги.

Испытания проводились в пяти повторностях на 1500 СПФ-куриных эмбрионах по каждому из способов заражения

Результаты проведенных исследований отражены в табл. 1.

Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что способ заражения куриных эмбрионов в аллантоисную полость для культивирования штамма «БГ» вируса ИББ не эффективен. Несмотря на отсутствие неспецифической гибели эмбрионов в течение первых 48 часов, процент специфической гибели в течение всего времени культивирования в общей сложности составлял только 60%, в то время как 40% куриных эмбрионов оставались живыми.

Оба способа заражения КЭ на хорионаллантоисную оболочку практически идентичны друг другу. Так, основной процент специфической гибели эмбрионов падает на период 72-120 часов после заражения, причем ' максимальная гибель КЭ была отмечена через 96 часов

культивирования и составила 40,6% в случае заражения куриных эмбрионов на ХАО через естественную пугу и 48,4% - через искусственную пугу. Отличие названных способов заражения в следующем. Во-первых, неспецифическая гибель куриных эмбрионов при заражении на ХАО через естественную пугу в 4,3 раза ниже таковой при заражении на ХАО через искусственную пугу. Во-в;горых, в качестве еще одного, более существенного отличия, можно отметить то, что в общей сложности специфическая гибель КЭ составляет 97,9% при их заражении на ХАО через естественную пугу и 90,9% - через искусственную, причем в течение основного времени культивирования (72-120 часов) она равна 94,5% и 90,9%, соответственно.

Таблица 1

Динамика гибели СПФ-куриных эмбрионов после различных

способов заражения штаммом «БГ» вируса ИББ

Способ заражения КЭ Неспецифическая гибель КЭ, % Специфическая гибель КЭ по часам в % Живые

72 96 120 144 168 I 192 216 I КЭ. % ■

в аллантоис-ную полость - 6,7 20,0 13,3 10,0 I 6,7 ; 3,3 40.0

на ХАО через естественную пугу 2,1 39,3 40,6 14,6 2,7 0,7 I

на ХАО через искусственную пугу 9,1 15,2 ! 48.4 I ! : | 27.з: ; I I

Помимо исследования динамики специфической гибели КЭ. изучали биологическую активность штамма «БГ» вируса ИББ также в динамике при перечисленных выше способах заражения

Результаты проведенных исследований представлены в табл. 2.

Биологическая активность вируса ИББ из штамма «БГ» в динамике при разных способах заражения СПФ-куриных эмбрионов

Способ заражения КЭ Биологическая активность вируса по часам, 1д ЭИДбо/ш, Неспецифическая гибель КЭ,%

72 96 120 144 168 192 216

в аллантоисную полость - 5,60± 0,06 5,60± 0,09 4,80± 0,10 4,80± 0,06 4,00± 0,11 3,40± 0,09 —

на ХАО через естественную пугу 6,20± 0,07 6,75± 0,09 5,90± 0,10 5,55± 0,05 5,45± 0,06 - - 2,1

на ХАО через искусственную пугу 6,40± 0,10 6,80± 0,03 5,80± 0,08 - - - - 9,1

Анализ полученных результатов и последующее их сравнение с результатами исследований, представленными в табл. 1, позволяют отметить, что данные обеих таблиц подтверждают друг друга. Так, исходя из данных табл. 2, заражение куриных эмбрионов в аллантоисную полость для культивирования штамма «БГ» вируса ИББ не эффективно. Биологическая активность вируса даже в период, соответствующий максимальному уровню специфической гибели эмбрионов (120 часов), существенно ниже такового при заражении эмбрионов на хорионаллантоисную оболочку (через естественную пугу - 5,90 1д ЭИД5о/ил и через искусственную пугу - 5,80 1д ЭИД5о,ыл). Биологическая же активность вируса при заражении на ХАО через естественную и искусственную пугу в период максимальной специфической гибели эмбрионов (72-120 часов) высокая и достигает максимального значения через 96 часов после инфицирования: 6,75 1д ЭИД50/ЫЛ и 6,80 1д ЭИД50;ып, соответственно

Таким образом, детальное рассмотрение перечисленных выше трех способов заражения куриных эмбрионов показало в качестве наиболее приемлемых путей инфицирования эмбрионов два метода: заражение КЭ на хорионаллантоисную оболочку через естественную и через искусственную лугу, полностью исключая заражение в аллантоисную полость. Из двух оставшихся 'способов заражения наиболее эффективным является заражение куриных эмбрионов на ХАО через естественную пугу, . что подтверждается результатами исследований, представленных в табл.1 и 2. Кроме того, процесс инфицирования на ХАО через искусственную пугу является более трудоемким и увеличивает время заражения при массовом получении вирусного сырья. Также следует отметить, что при данном способе заражения потребуется примерно в 2 раза больше площади инкубаторного парка, чем при заражении на ХАО через естественную пугу.

Помимо выбора наиболее эффективного и приемлемого способа заражения СПФ-куриных эмбрионов, были 'проведены исследования, касающиеся накопления вируса инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» в различных частях эмбриона (голова, тушка, печень, ХАО, аллантоисная жидкость).

Полученные данные были обобщены и представлены в табл. 3.

Анализ приведенных в табл. 3 данных позволил заключить, что максимальное накопление вируса ИББ происходит в голове и тушке эмбриона, 7,15±0,03 1д ЭИД50/Мл и 7,10+0,01 1д ЭИД50;„1л. соответственно, минимальное - в ХАО - 4,40+0,04 1д ЭИД50;мп

Учитывая, что биологическая активность штамма «БГ» вируса ИББ в непотрошенной тушке высока и составляет 6,94 1д ЭИД5о;,,л, лишь незначительно уступая активности вируса в отдельных частях эмбриона, в дальнейшем для промышленного приготовления вирусного сырья при производстве вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ» использовали непотрошенные тушки и аллантоисную жидкость при

наличии у павших эмбрионов характерных изменений, таких как отечность головы, кровоизлияния, изменения печени.

Таблица 3

Накопление вируса ИББ из штамма «БГ» в различных частях СПФ-куриных эмбрионов (п=5)

№ п/п Части КЭ Контроль, незараженные КЭ Опытные КЭ

Средняя масса различных частей КЭ, г Средняя масса различных частей КЭ, г Биологическая активность, !д ЭИД50;и„

1 Непотрошеная тушка 9,44±0,33 10,69±0,23 6,94±0,02

2 Голова 2,76±0,04 3,86±0,18 7,15±0,03

3 Тушка без головы и печени 6,31±0,32 6,38±0,42 7,10±0,01

4 Печень 0,37±0,02 0,45±0,04 5,90±0,03

5 ХАО 0,68±0,07 0,85±0,05 4,40±0,04

6 Аллантоисная жидкость 12,45±0,69 10,03±1,29 6,85±0,07

7 Масса яйца | 63,87±0,94 60,7111,79

Таким образом, в результате проведенных исследований для заражения СПФ-куриных эмбрионов штаммом «БГ» вируса ИББ как наиболее эффективный был выбран способ инфицирования КЭ на ХАО через естественную пугу и определено, что для производства вакцины необходимо использовать непотрошенные тушки куриных эмбрионов.

Конструирование вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни на основе штамма «БГ»

В ходе исследований было проверено влияние процесса замораживания-оттаивания на биологическую активность вируса ИББ из штамма «БГ».

После размола СПФ-куриных ■ эмбрионов образцы вируссодержащего гомогената замораживали при температуре минус 40°С в течение 24 часов и оттаивали под струей воды при температуре 18-20°С в течение 3 часов. Один цикл замораживания-оттаивания составлял 27 часов.

Результаты проведенной серии опытов представлены в табл. 4.

Таблица 4

Влияние замораживания-оттаивания на биологическую активность

штамма «БГ» вируса ИББ (п=5)

Количество замораживаний-оттаиваний Биологическая активность вируса, 1д ЭИД50/Мл |

1 6,32±0,08 '

2 6,50±0,15

3 7,13±0,07

4 6,22±0,07

5 5,95±0,10

Нативная суспензия до замораживания 6,28±0,09

Анализ представленных в табл. 4 данных позволяет сделать вывод, что наиболее эффективным является трехкратное замораживание-оттаивание. Так, в этом случае наблюдается наиболее высокая биологическая активность вируса, которая составила 7,13±0,07 1д ЭИД50/МЛ. Необходимо отметить, что даже одно- и двукратное замораживание-оттаивание позволяет достичь более высоких значений

биологической активности вируса ИББ по сравнению с активностью вируса в нативной суспензии до замораживания (6,28±0,09 1д ЭИД5о,мл).

Таким образом, в результате трехкратного процесса замораживания-оттаивания происходит более полное освобождение вирусных частиц из клеток эмбриона с сохранением наиболее высокого уровня биологической активности штамма «БГ» вируса ИББ.

Особое внимание в .ходе конструирования вирусвакцины сухой на основе штамма «БГ» было уделено подбору стабилизаторов и выбору оптимального компонентного состава (мас.%) вакцины. .

Результаты проведенных исследований показали, что оптимальной защитной средой для лиофилизации и хранения вирусвакцины сухой претив ИББ из штамма «БГ» является защитная среда «ВНИИЗЖ». Наибольшая эффективность вакцины имеет место, когда в ее состав входит 90% вируссодержащего материала и 10% стабилизаторов.

Определение параметров лиофилизации вакцины

В ходе исследований была отработана схема процесса лиофилизации жидкого полуфабриката вакцины, которая основана на определении эвтектической точки исходного материала.

Предлагаемый режим сублимации обеспечивал такое высушивание вирусвакцины, при котором понижение биологической активности вирусного материала было минимальным, а остаточная влажность конечного продукта не превышала 3%.

Приготовление производственных серий вирусвакцины сухой

против ИББ

Технологический процесс изготовления вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» включает в себя поддержание производственного штамма «БГ» вируса ИББ, из которого готовят рабочую матровую расплодку вируса, а затем производственные партии вирусного сырья. Путем смешивания вируссодержащего материала с защитной средой получается полуфабрикат вакцины, который подвергается лиофильному высушиванию и получается готовый препарат. Полученную вакцину

контролиругат на биологическую активность, на стерильность, безвредность и иммуногенность. Вакцину, прошедшую контроль, до реализации хранят при температуре 2-8°С.

Технологический процесс получения сухой вирусвакцины для наглядности представлен в виде следующей схемы на рис.1.

Контроль вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» Определение биологической активности вакцины Биологическую активность определяли титрованием каждой серии вакцины на 10-суточных СПФ-куриных эмбрионах.

После утверждения нормативно-технической документации на вирусвакцину сухую против ИББ кур из штамма «БГ» лабораторией с 1995 по 1999 гг. было изготовлено 45 серий вакцины объемом 25-50 млн. доз каждая с биологической активностью от 5,50 до 6,80 1д ЭИД50/Мп.

Определение безвредности вакцины Результаты проверки вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» с 1995 по 1999 гг. показали 100%-ную безвредность данной вакцины.

Определение оптимальной иммунизирующей дозы Для определения оптимальной иммунизирующей дозы вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ» использовали вакцину с биологической активностью 6,0 1д ЭИД5о/мп в разведении содержащим в 1 мл 1, 10, 50, 100, 1000 и 10000 ЭИД50. Каждой дозой было провакцинировано по 30 цыплят путем выпаивания. Через 10 суток аналогично проводили ревакцинацию. Через 14 суток после второй иммунизации всех цыплят заражали интраназально патогенным штаммом «52/70-М» вируса ИББ в дозе 100 ЦИД на голову и наблюдали в течение 10 суток.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. 5.

1. Хранение и поддержание производственного штамма «БГ»

2. Приготовление рабочей матровой расплодки вируса ИББ

3. Получение производственной партии вирусного сырья

4. Составление полуфабриката вакцины

4а. Подготовка вируссодержащего материала

V

46. Составление защитной среды

5 Подготовка и лиофильное высушивание полуфабриката вакцины

6. Контроль вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ»

| 6а. определение I биологической активности

6Ь.определение стерильности вакцины

6с. определение безвредности вакцины

6(1. определение иммуногенности вакцины

т

'Т

т

т

______&_____

7. хранение вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ»

Рисунок 1. Основные этапы изготовления вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ».

Определение оптимальной иммунизирующей дозы

Доза на голову, ЭИД50 Вакцинировано гол. Результаты контрольного заражения. Заболело, гол. % защиты

10000 30 0 100,0

1000 30 0 100,0

100 30 2 93,4

50 30 5 83,3

10 30 12 60,0

1 30 18 40,0

Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 5, 100%-ную защиту поголовья от ИББ обеспечивали дозы 10000 ЭИД50 и 1000 ЭИД50 на голову, в то время, как при дозе 100 ЭИД5о процент защиты составлял уже 93,4%. Учитывая, что доза в 10000 ЭИД50 на голову на порядок превышает дозу в 1000 ЭИД50, которая также полностью предохраняет поголовье от заболевания, последнюю можно считать оптимальной иммунизирующей дозой.

Определение биологической активности и иммуногенных свойств вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ»после хранения Проведены сравнительные исследования по определению биологической активности и иммуногенных свойств свежеприготовленной вакцины и вакцины, которую хранили в течение 12 месяцев при температуре 2-8°С, результаты которых приведены в табл. 6.

Приведенные в табл. 6 данные позволяют заключить, что хранение в течение 12 месяцев не приводит к ухудшению качеств вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ».

Биологическая активность и иммуногенные свойства свежеприготовленной и взятой после хранения вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» (п=5)

№ п/п Срок хранения Биологич. активность, Вакцинировано, Результаты контрольного заражения Титры антител

1д ЭИД50/МЛ гол. Заболе- % ИФА РДП,

ло гол. защиты 1од2

Свеже

1. приготовленная вакцина 6,65±0,08 30 0 100 7515±653 3,80±0,64

2. Вакцина после 12-месячного хранения 6,60±0,11 30 0 100 7175±586 3,40±0,48

Так, биологическая активность вакцины после 12-месячного хранения практически не отличалась от таковой у свежеприготовленной вакцины (6,60±0,11 1д ЭИД50/мл и 6,65±0,08 1д ЭИД50/„Л, соответственно). Кроме того, она не уступала свежеприготовленной по иммуногенности, обеспечивая 100%-ную защиту поголовья от ИББ, и показывала высокие показатели в серологических реакциях (7175±586 в ИФА и 3,40±0,48 1од2в РДП).

Определение стерильности вакцины

Определение стерильности вирусного сырья описано в разделе «Материалы и методы».

Наличие бактериальной и грибковой микрофлоры во всех сериях'не установлено.

С 1999 г. для экспресс-диагностики стерильности готовой вакцины и ее компонентов в наших опытах использовался соево-казеиновый бульон согласно Инструкции «Питательный раствор казеин-соя-бульон»

(ВНИИЗЖ, Байер, 1997). Данный метод позволяет в течение 2-3 суток при

температуре 30°С определить возможную загрязненность биоматериала 1

аэробной и анаэробной бактериальной и грибковой микрофлорой. Определение иммунодепрессивного действия штамма «БГ»вирусаИББ Для определения иммунодепрессивного действия штамма «БГ» вируса ИББ брали цыплят 15-суточного возраста, которых иммунизировали вирусвакциной сухой против ИББ птиц из штамма «БГ»-и вакциной против' болезни Ньюкасла из штамма «Ла-Сота». Вакцинацию цыплят против ИББ проводили двукратно выпаиванием, а против болезни Ньюкасла - интраназально из расчета 1 коммерческая доза на голову, согласно разработанной схеме. В возрасте 42 суток цыплят всех групп обескровливали и полученные сыворотки крови наследовали на наличие антител к ИББ и болезни Ньюкасла (БН) в реакциях ИФА и РЗГА, результаты которых представлены в табл. 7.

Таблица 7

Напряженность иммунитета против ИББ и БН у цыплят, привитых вакциной против ИББ из штамма «БГ» и против болезни Ньюкасла

из штамма «Ла-Сота»

I ! № п/п I I Характеристика групп цыплят Титры антител в ИФА и РЗГА

ИББ Болезнь Ньюкасла

ИФА РЗГА, 1од2 |

! 1. Вакцинированы против ИББ и БН 4077±468 1700±321 6,52±0,15 ,

! 2 I Вакцинированы против БН н.о. 1742±444 6,59±0,1 ;

3 | Контроль | н.о. н.о. н.о.

Примечание: н.о. - не обнаружено.

Результаты, приведенные в табл. 7, показывают..что татры антител против болезни Ньюкасла в сыворотках крови цыплят, иммунизированных вирусвакциной сухой против ИББ из штамма «БГ» и вакциной против болезни Ньюкасла из штамма «Ла-Сота» и

неиммунизированных против ИББ и привитых против болезни Ньюкасла, практически не отличаются.

Таким образом, вирусвакцина сухая против ИББ из штамма «БГ» не обладает выраженным иммунодепрессивным действием.

Сравнительная оценка иммуногенных свойств вакцин против инфекционной бурсальной болезни кур

Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности

разработанной вакцины и различных жиеых вакцин против ИББ

«

отечественного и зарубежного производства.

Была проведена серия опытов, в которой использовались вакцины «Тавиар» (Италия), «Д-78» (Голландия), «Гумбораль СТ» (Франция), из штамма «ВНИВИП» (Россия) и из штамма «БГ» (Россия).

Изучение эффективности указанных вакцин проводили на СПФ-цыплятах 14-суточного возраста. Для иммунизации каждой вакциной использовалось по 30 цыплят. Всем цыплятам инокулировали орально По одной дозе вышеназванных вакцин и через 10 дней аналогично проводили ревакцинацию. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения патогенным штаммом «52/70-М» вируса ИББ всех групп цыплят через 14 суток после повторной вакцинации.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. 8.

Как видно из данных табл. 8, максимальный процент защиты цыплят от заболевания ИББ обеспечивала вакцина из штамма «БГ» -100%; минимальный - 46,7% - вакцина из штамма «ВНИВИП». Процент защиты птицы, остальных вакцин, составил: 76,7% - вакцина из штамма «Гумбораль СТ», 73,3% - вакцина из штамма «Д-78» и 60,0% - вакцина из штамма «Тавиар».

Проведенные испытания в 1995 г. на неблагополучной по ИББ бройлерной птицефабрике «Новгородская» трех живых вакцин против ИББ [вирусвакцина сухая против ИББ из штамма «БГ», «Гумбораль СТ» (Франция) и «Гумбокал СПФ» (Хорватия)] также показали явное преимущество вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» в

обеспечении защиты поголовья птицы от инфекционной бурсальной болезни.

Таблица 8

Результаты исследований по определению иммуногенной эффективности различных живых вакцин против ИББ

№ п/п Наименование вакцины Вакцинировано, гол. Результаты контрольного заражения

Заражено, гол. Заболело, гол. % защиты от заражения

1 «Тавиар»(Италия) 30 30 12 60

2 «Д-78» (Голландия) 30 30 8 73,3

3 «Гумбораль СТ» (Франция) 30 30 7 76,7

4 «ВНИВИП» (Россия) 30 30 16 46,7

5 «БГ» (Россия) 30 30 0 100

6 Контроль 30 30 29

Таким образом, проведенная • сравнительная оценка иммуногенности различных отечественных и импортных живых вакцин против ИББ показала, что вирусвакцина сухая против ИББ кур из штамма «БГ» является более надежным и эффективным биопрепаратом по сравнению с отечественной вакциной из штамма «ВНИВИП» и импортными вакцинами, обеспечивая практически полную защиту поголовья птицы от заболевания ИББ.

ВЫВОДЫ

1

1. Разработана технология изготовления и контроля вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ», которая обладает высокой иммуногенной активностью, хорошей сохраняемостью, не обладает реактогенностью и обеспечивает защиту

кур от ИББ при применении в производственных условиях и в птицехозяйствах.

2. Установлено, что наиболее эффективным способом инфицирования 'СПФ-куриных эмбрионов является заражение на хорионаллантоисную оболочку через естественную лугу, что позволяет получать вируссодержащее сырье с биологической активностью более 6,20 1д ЭИДбо/мл-

3.-Экспериментально показано, что после инфицирования СПФ-куриных эмбрионов на хорионаллантоисную оболочку наивысшее накопление вируса ИББ из штамма «БГ» происходит в голове и тушке куриных эмбрионов (7,15±0,03 1д ЭИД50/„л и 6,94±0,02 1д ЭИД50/МЛ, соответственно).

4. Установлено, что трехкратное замораживание-оттаивание зараженных эмбрионов приводит к более полному освобождению вирусных частиц из клеток эмбриона и повышению титра биологической активности вируса ИББ из штамма «БГ» на 0,85 1дЭИД5о/мл по сравнению с титром суспензии из тушек, не подвергавшихся замораживанию-оттаиванию.

5. Определено, что оптимальной защитной средой при изготовлении вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» является стабилизирующая среда «ВНИИЗЖ», которая при лиофильном высушивании обеспечивает сохранность вируса с минимальным снижением титра биологической активности (0,25±0,04 1д ЭИД50,МЛ). Эта среда обеспечивает надежное сохранение биологической активности вирусвакцины и при хранении.

6. Подобран и обоснован компонентный состав, который обеспечивает наибольшую иммуногенную эффективность вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» (90% вирусного сырья и 10% защитной среды «ВНИИЗЖ»).

7. Изучена сохраняемость биологических свойств вирусвакцины при длительном хранении и установлено, что хранение вирусвакцины в течение 12 месяцев (срок наблюдения) при температуре 2-8°С не

приводит к снижению качества и иммунобиологических свойств препарата.

8. В лабораторных и производственных опытах показано, что

оптимальной иммунизирующей дозой вирусвакцины сухой против ИББ

кур из штамма «БГ», является доза, в которой содержится 1000 ЭИД50 на

голову. Эта доза вакцины индуцирует образование напряженного и

/

длительного иммунитета у кур.

9. При сравнительной оценке иммуногенности различных отечественных и импортных живых вакцин против ИББ показано, что вирусвакцина сухая против ИББ кур из штамма «БГ» по качеству и иммуногенности превосходит существующие отечественные и импортные вакцины, применяемые в хозяйствах Российской Федерации, является надежным и эффективным средством, обеспечивающим практически полную защиту поголовья птицы от заболевания инфекционной бурсальной болезнью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработана вирусвакцина сухая против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма «БГ» и подготовлена нормативно-техническая документация на е.е изготовление, контроль и применение, которая одобрена ученым советом ВНИИЗЖ и утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 18.02.1998 г. на постоянный срок действия.

Промышленная технология изготовления вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» внедрена во ВНИИЗЖ и за период с 1995 по 1999 годы изготовлено 45 серий вирусвакцины сухой против ИББ кур из штамма «БГ» объемом 25-50 млн. доз каждая.

Российским агенством по патентам и товарным знакам в 1999 году выданы 2 патента на штамм «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и на вакцину против инфекционной бурсальной болезни птиц (Патенты РФ: №2127602; №2127604).

Данная вакцина применяется в большинстве птицеводческих хозяйств Российской Федерации, в республиках Украина, Беларусь, Молдова, Узбекистан.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Кузнецов Ю.В., Гусев A.A., Смоленский В.И., Норкина С.Н. Иммуногенность различных живых вакцин против ИББ птиц// Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. науч.-практ. конф. 17-21 апреля 1995 г.- Владимир, 1995,- С.233.

2. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Кузнецов Ю.В., Федосеев К.Ю., Гусев

A.Ä., Смоленский В.И., Норкина С.Н. Отработка схемы иммунизации птицы против инфекционной бурсальной болезни вирусвакциной сухой из штамма «БГ»// Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. науч.-практ. конф. 17-21 апреля 1995 г.-Владимир, 1995.-С.234.

3. Гусев A.A., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Марков Г.В., Кузнецов

B.Н.,Михалишина З.Я., Кузнецов Ю.В., Гусев С.А., Щербакова Л.О., Федосеев К.Ю. Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики ИББ,- ВНИИЗЖ,- ГНТП «Вет. благополучие» (этап 08.02.М). (заключительный) Владимир, 1995.-научный отчет №186.- 85 с.

4. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Гусев A.A., Кузнецов Ю.В., Смоленский В.И., Норкина С.Н. Штамм «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц: Пат. №2127602 РФ. Заявл.: 24.11.97; 0публ.:20.03.99.

5. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Гусев A.A., Кузнецов Ю.В.,

Смоленский В.И., Норкина С.Н. Вакцина против инфекционной

бурсальной болезни птиц: Пат. №2127604 РФ. Заявл.: 14.04.98;

t

Опубл.:20.03.99.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ Тираж 80 экз.; март 2000 г.