Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма "ГАМ-61"

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма "ГАМ-61""

На правах рукописи

ОЛ

V Р I я, Г*| £

Руденко Татьяна Владиславовна

ВАКЦИНА ПРОТИВ НЫОКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ИЗ ШТАММА «ГАМ-61»

03.00.06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, В.И.Смоленский

Заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации

Официальные оппоненты:

• Осидзе Н.Г. - Доктор биологических наук, профессор, завлабораторией ЗАО пс птицеводству «Братцевское»

• Рукавишников A.B. - Кандидат биологических наук, главный специалист Отделения ветеринарной медицины РАСХН

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ).

Защита диссертации состоится « ^//^//^liooo г. в назаседании диссерта-

ционного совета Д120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское ш., д.5, ВГНКИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ. [«

Автореферат разослан •

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации

2000 г.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы В условиях специализированных птицеводческих хозяйств первостепенное значение принадлежит иммунопрофилактике инфекционных болезней вирусной этиологии. Высокая концентрация поголовья на ограниченных территориях, одновременное содержание неоднородных по возрасту и физиологическому развитию птиц, использование кормов, обсемененных болезнетворными агентами, постоянное поступление ремонтного молодняка из эпизоотически опасных хозяйств и регионов, создают благоприятные условия для быстрого возникновения и распространения инфекционных болезней, оперативная профилактика и ликвидация которых невозможны без применения современных иммунологических препаратов (Alexander D.J., 1980,1987,1995).

Одной из наиболее опасных инфекций является ньюкаслская болезнь (Ж). Несмотря на обстоятельные исследования в области эпизоотологии НБ, расшифровку молекулярных основ патогенности возбудителя, наличия детально отработанных методов диагностики и профилактики, это заболевание до настоящего времени является актуальным не только для птицеводства стран, стационарно неблагополучных по НБ, но и для европейских государств, многие годы свободных от высоковирулентных вариантов возбудителя (World Animal Health, 1996, 1997).

По данным Международного Эпизоотического Бюро в 1996 г. в мире официально зарегистрировано 2277 неблагополучных по НБ пункта, в 1997 г.-2382, в 1998 г-2385. В последнее время на некоторых континентах начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 зарегистрированных неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 г. было зафиксировано 69 случаев возникновения нькжаслской болезни, в 1997-98 гг.—98.

В Российской Федерации за период 1996-2000 гг. было отмечено всего лишь 13 пунктов, где заболевание проявлялось клинически. Однако, заметно увеличилось количество хозяйств с атипичным течением НБ, о наличии которой можно судить только по обнаружению чрезвычайно высоких титров антител, снижению общей сохранности и продуктивности. По мнению ряда ученых, одной из возможных причин, объясняющих данную ситуацию, является изменение антигенной или конформационной структуры вирулентных штаммов вируса НБ, что неизбежно при длительном направ-

ленном антительном прессинге (Collins M.S., Strong I., Alexander D.J.,1994). Следствием этого является неполная комплементарность измененного вируса антителам, формирующимся в ответ на введение большинства традиционных профилактических препаратов, предложенных более 40-50 лет назад и до настоящего времени производящихся отечественной биологической промышленностью (Alexander D.J., 1981,1988,1997).

Поэтому с научной и практической точек зрения представлялась важной и своевременной разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально «поздней» селекции. Такой штамм, обозначенный «ГАМ-61» («А(в)ВН») был получен в начале 70-х годов сотрудником ЦВЛ Михальским Г.А. путем аггенуа-ции на первичной культуре клеток почки теленка и эмбрионах кур высоковирулентного вируса НБ, выделенного от павших 25-ти суточных цыплят птицефабрики «XXII партсъезда» Луховицкого района Московской области. При этом основные иммунобиологические свойства штамма были не изучены.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание вакцины против ньюкаслской болезни, отвечающей современным требованиям, предъявляемым к противовирусным биологическим препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить иммунобиологические свойства штамма «ГАМ-61», предлагаемого в качестве продуцента новой вакцины.

• Проверить эффективность вакцины в лабораторных и производственных условиях.

• Разработать технологию изготовления вирусвакцины, методы ее контроля, подготовить нормативную документацию (НД).

1.3. Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

• Определены генетические параметры и иммунобиологические характеристики штамма «ГАМ-61» вируса НБ, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, и предложен для производства вакцины.

• Изучен механизм формирования ранней резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61».

• Разработан новый метод контроля иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием рефе-ренс-серий вакцин.

• Установлена структурная и филогенетическая близость искуственно-атгенуированных мезогенных штаммов «ГАМ-61» и «Н» с высоко вирулентными изолятами В1фуса ньюкаслской болезни (ВНБ). Доказано, что последовательность нуклеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания FO-белка вирусов НБ детерминирована, что позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Снижение вирулентности штаммов ВНБ в процессе аттенуации не связано с нуклеотидными заменами в функционально важных участках генов F и HN.

Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ на изобретение: «Штамм Paramyxovirus, используемый для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни кур». Патент РФ № 2055890 от 10.03.96т.

1.4. Практическая значимость. Подготовлена и утверждена в установленном порядке нормативная документация на «Вирусвакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую» (Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г. и Наставление по применению вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» № 13-4-2/490 от 27.12.95 г.). Разработана инструкция по изготовлению и контролю вакцины (утверждена директором ВГНКИ 12.1995 г.).

Вакцина из штамма «ГАМ-61» зарегистрирована в РФ и выпускается серийно по заявкам потребителей во ВНИИТиБП и на Краснодарской биофабрике.

Разработаны «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХи П РФ 23.06.97 г.

Метод оценки иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин введен в ТУ № 9384-080-95 от 25.12.95 г. «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 46-21-567-80 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая

против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакщша сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота». 1.5. Апробация. Материалы диссертации доложены на XIII научной конференции молодых ученых (10.01.1992), на 11-ом Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, 1997), на 10-ой Европейской конференции по птицеводству (Израиль, 1998), а также на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней, Ученого Совета ВГНКИ.

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 2345 от 12.98 г.).

1.6. Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в двух заключительных отчетах ВГНКИ: за 1991-1993 гг. № Гос. регистрации 01910034974; за 1994-1996 гг. № Гос. регистрации 01940007075; в комплекте НД на вакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61», а также в 15 научных статьях, включая Патент РФ на изобретение, и «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• Результаты изучения биологических свойств штамма «ГАМ-61» в сравнении со штаммом «Н» вируса НБ.

• Технология изготовления и контроля вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61».

• Методики и результаты разработки количественных показателей оценки иммуно-генности вакцин против ньюкаслской болезни.

• Результаты испытания эффективности вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61» в лабораторных и производственных условиях.

• Результаты исследований функционально важных участков генома вируса НБ для определения антигенных модификаций полевых возбудителей и изучения молекулярных основ процесса атгенуации штамма «ГАМ-61».

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на Н98 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

».СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в 1991+1999 гг. в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстъе Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). Часть исследовашш проведены во ВНИИЗЖ, в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента МСХ и П РФ (ЦНМВЛ).

В работе исг льзовали: штаммы вируса ныокаслской болезни: «ГАМ-61» ("А(в)ВН"), "IT', "Ла-Сота", "В", "Бор-74 ВГНКИ, "Т-53"; ПМВ-2-4,6-9; ортомиксо-вирусы птиц, лошадей, свиней, аденовирус уток и наборы референс-сывороток к ним; первично-трипсинизированные и перевиваемые культуры клеток: ФЭК, ФЭУ, ФЭП, ПЭК, ТБ; Hela, Нер-1, СПЭВ, GA и Ст(КСТ). Морфологические исследования материалов проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100CXII и светового микроскопа «Биолам Ломо». Выделение вируса НБ проводили на СПФ-эмбрионах кур 9-10 сут, возраста по общепринятой методике. Концентрировали путем осаждения ПЭГ6000, очищали в ступенчатом градиенте CsCl-сахароза. Фракционирование градиента проводили с помощью проточного спектрофотометра "Увикорд" (LKB) при 254 нм. Инфекционную активность вакцинных и контрольных штаммов вируса НБ, а также образцов вакцин и вирусных изолятов определяли титрованием на 9-10 сут эмбрионах кур, культурах клеток или цыплятах 20-25 сут возраста по общепринятой методике и рассчитывали по методу Кербера Г. Титр гемагглютининов у штаммов ВНБ устанавливали в РГА микрометодом по известной методике. Нейраминидазную активность определяли с субстратом 4=метилумбеллиферил=Д=нейминидом и выражали в количестве расщепленного субстрата на мл исходного вируса за один час (мкг/мл/ч). Экспериментальное заражение привитых и контрольных цыплят проводили внутримышечно вирулентным штаммом «Т-53» вируса НБ в дозе 3,0 lg ЛД50. Результаты контрольного заражения оценивали положительно при условии гибели цыплят с патологоанатомическими признаками, характерными для НБ. Терморезистентность штаммов ВНБ определяли путем воздействия на вируссодержащую ЭЭЖ температуры 56°С в течение 60 мин, температуры 37°С в течение 7 сут, а также после хране-

ния при 4°С в течение 4 лет (срок наблюдения). Устойчивость к рНз,0 и рНю.о - после 4-х часового контакта. Результаты оценивали по сохранности остаточной гемагглюти-иирующей и инфекционной активностей. Чувствительность штаммов ВНБ к хлороформу изучали по методу A. Nayer и K.Bogel, к эфиру Rovozzo, C.N. Burke, описанных Лярски 3. (1980). Остаточную вирулентность штаммов ВНБ оценивали по индексам интрацеребральной (1CPI) и внутривенной патогенности (IVPI), а также по тесту эмбриональной чувствительности (MDT/MLD) (Alexander D.J., 1995). Наличие специфических антител в сыворотках крови определяли в реакции торможения гемагг-лютинации (РТГА), реакции нейтрализации (РН), постановку которых проводили по общепринятым методикам, и в иммуноферментном анализе (ИФА). Для постановки и учета ИФА применяли иммуноферментные диагностические наборы производства ВНИИЗЖ, ВНИВИП, фирм ГОЕХХ, BioChek, KPL и оборудование Flock Chek (ШЕХХ Laboratories B.V.) или аналогичные установки фирм «Дейнатек» (Англия) и «Оптон» (Германия). Дифференциацию штаммов осуществляли методом ОТ-ПЦР. Нуклеотид-ную последовательность вариабельной области генов F и NH изучаемых штаммов определяли методом прямого секвенирования амплифицированных фрагментов с помощью программируемого амплификатора РТС-100 MiniCycler (MJ Research Inc., США) и набора fmol DNA Seguencing System (Promega, США). При анализе нуклео-тидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology) версия 1.0 (N. J.Knowles, IF AN, Великобритания), с применением алгоритмов филогенетического пакета Phylip 3.5с (Felsenstein J/ PHYLIP, Version 3.5с/ Department of Genetics, University of Washington, Seattle,1993). Оценку клеточного иммунитета проводили в реакции спонтанного розеткообразования по уровню Т-лимфоцитов согласно методике, рекомендованной ВОЗ (1990). Уровень эндогенного и экзогенного интерферона определяли в РН на культуре клеток ФЭК с вирусом везикулярного стоматита штамм «Индиана». Препараты для гистологических исследований в виде парафинированных или замороженных срезов толщиной 5-20 мкм окрашивали по методу Браше пиронин-метиловым зеленым. Результаты учитывали под световым микроскопом (увеличение х4800) по количеству специфически окрашенных плазматических клеток. Препараты для электронноскопического исследования концентрированного и очищенного вируса

готовили методом негативного контрастирования 4% фосфорно-вольфрамовой кислотой. Исследовали при инструментальном увеличении х 40000- 112000.

Изучение биологических свойств штамма "ГАМ-61" проводили совместно с сотрудниками ВГНКИ Горевой И.П., Смоленским В.И., Родиным Ю.В. Постановку ОТ-ПЦР осуществляли совместно с сотрудниками ВНИИЗЖ Дрыгиным В.В., Грибановым О.Г.. Гистологические исследования выполнены совместно с сотрудником ЦНМВЛ Барабановым И.И. Морфологию вакцинного штамма изучали совместно с сотрудником ВГНКИ Могильным Ю.И.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Морфология.

При электронномикроскопическом исследовании штамм «ГАМ-61» был представлен типичными для парамиксовирусов вирионами округлой или филламентозной форм размером 80-120 нм с пепломерами по всей поверхности мембраны.

2.2.2. Идентификация.

В РТГА гемагглютинирующую активность штамма "ГАМ-61" задерживали только сыворотки к парамиксовирусам птиц первого серотипа. Сыворотка к штамму «ГАМ-61», в свою очередь, тормозила гемагглютинирующую активность только штаммов: «Ла-Сота», «Н», «Бор-74 ВГНКИ», «В|» и «Т-53» вируса НБ. Результаты перекрестной РН также подтвердили принадлежность штамма «ГАМ-61» к первому серотипу ПМВ, поскольку Ш во всех случаях имел значение 5,0^6,0 1ё ЭЛДзо/см3 (^ЭИД50/сМ3).

Степень антигенного родства штамма «ГАМ-61» со штаммами «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ», «В1», «Н» и «Т-53», рассчитанная по формуле Арчетги и Хорсфалла, составила 90ч-100 %, что указывало на полную их тождественность.

2.2.3. Нуклеотидное секвенирование генома.

Вследствие недостаточной чувствительности РТГА и РН антигенных различий между штаммами ВНБ в данных реакциях обнаружить не удалось. Поэтому была определена нуклеотидная последовательность вариабельных участков генов НЫ и Б штамма "ГАМ-61" в сравнении с другими вакцинными и эпизоотическими штаммами вируса

НБ в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для выявления структуры, кодируемых данными генами пептидов и возможных молекулярных постат-тенуационных изменений.

В предварительных опытах было проведено компьютерное сравнение нуклеотид-ных последовательностей в гене Б, кодирующем сайт разрезания Ро-белка 18 вакцинных и вирулентных штаммов, в том числе 6, выделенных на территории России, со значительным временным интервалом (1953-1996 гг.). Была выбрана система прайме-ров, позволяющая проводить амплификацию участков генов НЫ и Р штаммов ВНБ и получать косвенную информацию об изменении антигенной структуры длительно циркулирующих вирусов.

По нуклеотидным последовательностям почти все штаммы вируса НБ были распределены в 6 групп патогенности, для которых последовательности аминокислотных остатков в сайте расщепления Ро-белка были четко детерминированы. Не соответствовали этой закономерности только три, анализируемых в опытах штамма: «Котагоу» и «Веаис1еНе С/45 и штамм «298/84».

Для штамма «Т-53», выделенного на птицефабрике «Томилинская» в 1953 г., последовательность а.о. в данном сайте разрезания была ЮК^КИР, что характерно для представителей VI группы, имеющих самые высокие индексы патогенности (1СР1/1 \Ф1> 1,7/2.4 -2,9). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности у другого высоковирулентного штамма «№3», выделенного нами в 1991г. на Ставропольской птицефабрике, на 2-3% отличалась от штамма «Т-53» (МК^ИИ7), что могло быть доказательством изменения антигенной структуры полевых вирусов НБ, циркулирующих в настоящее время в птицехозяйствах страны. По соотношению индексов - он был отнесен также к VI группе патогенности.

Последовательность аминокислотных остатков, установленная у штамма «БОР-74 ВГНКИ» (СКСЮКЬ) являлась характерной для слабовирулентных вирусов НБ и при соотношении индексов патогенности 0.0/0.0 позволяла отнести его к группе 1Ь, куда входят большинство известных лентогенных вакцинных вариантов ВНБ.

Нуклеотидная последовательность участков генов Б и НИ штамма «Бор-74 ВГНКИ» была сравнена со штаммом «Бор-82», выделенным Ю.Х.Креймером в 1982 г., также как и штамм «Бор-74 ВГНКИ», от цыплят птицефабрики «Боровская» Тюмен-

ской области. Установлено, что кодируемый изученным участком гена F фрагмент белка Fo за 8 лет естественной циркуляции вируса не претерпел каких-либо изменений. Белок HN за это же время подвергся существенным изменениям (2,7% нуклео-тидных и 2,5% аминокислотных отличий) и хотя эти замены оказались консервативными, полученные результаты также доказывали наличие антигенной изменчивости штаммов ВНБ в процессе эволюции. Филогенетический анализ относит эти штаммы к группе асимптоматичных вирусов.

Результаты ОТ-ПЦР, а также данные филогенетического анализа показали структурную (по изучетгым пептидам) и филогенетическую близость штаммов «ГАМ-61» и «Н». Оба штамма были получены путем аттенуации велогенных вирусов НБ, что, тем не менее, не привело к существенным изменениям в структуре пептидов, кодируемых генами F и HN, поскольку последовательность аминокислотных остатков в сайте разрезания пептида Fo штаммов RRQRRF была характерна для велогенных представителей и снижение патогенности вируса в результате аттенуации, видимо, обусловлено другими причинами.

2.2.4. Устойчивость штамма «ГАМ-61» к химическим и физическим факторам.

Была изучена устойчивость штамма «ГАМ-61» к эфиру, хлороформу, кислой и щелочной среде, температурному воздействию. После обработки вируссодержашей ЭЭЖ эфиром и хлороформом в течение 18ч при температуре 4°С инфекционный титр снижался на 3,75+5,0 Ig ЭЛД50 и 2,25+6,6 lg ЭЛД50 (признаки Eth+, Ch+).

Четырехчасовое воздействие кислой (plh.o) и щелочной (рНю.о) среды существенной потери инфекционной и ГА-активности шт. «ГАМ-61» не вызывало (признаки рНз.о", рНю.о').

Прогревание ЭЭЖ при 56°С в течение одного часа не приводило к полной инактивации изучаемого штамма, поскольку остаточные ГА- и инфекционный титры были в пределах 2,25±0,25 log2 и 1,75+0,25 lg ЭЛД50. При 37°С инфекционная и ГА- активность сохранялись в течение 7 сут, хотя потери достигали 2,5+0,5 lg ЭЛД50 и 3,25+0,25 log:. Полученные результаты позволили сделать заключение о достаточно высокой термостабилыюсти шт. «ГАМ-61» (признак Ts") и открывали перспективы создания нового профилактического препарата с пролонгированным сроком годности.

Нами впервые была изучена стабильность шт. "ГЛМ-61" в сравнении с «Н» и «Т-53». Установлено, что под воздействием температуры 56°С вакцинный шт. «Н» сохранял часть исходной биологической активности на уровне, сопоставимом с показателями шт. "ГАМ-61", тогда как высоковирулентный шт."Т-53"'- практически полностью инактивировался. Данные опыта позволили сделать заключение о терморезистентности шт. «ГАМ-61» (признак Те") и свидетельствовали о свойственной штаммам ПМВ-1 неоднородности по показателям термостабильности.

2.2.5. Гемагглютшшрующая и ненрамшшдазная активность. Штамм «ГАМ-61» агглютинировал эритроциты кур, голубей, уток, гусей, кроликов, морских свинок, барана, крупного рогатого скота, при этом ГА-титр достоверно не отличался.

Нейраминидазная активность штамма имела значение 1500+50 мкг/мл/ч, что было выше на 100-120 ед., чем у шт. «Н» и ниже на 400 и 1628 ед., чем у шт. «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ». Полученные данные согласовывались с известной закономерностью об обратной зависимости между нейраминидазной активностью и вирулентностью штаммов вируса НБ.

2.2.6. Способность к репродукции в различных биологических системах.

Способность шт. «ГАМ-61» к репродукции в эмбрионах кур (гс^Ье-признак) оценивали при различных температурно-временных режимах инкубирования и заражающих дозах.

Было установлено, что оптимальной биологической системой являются куриные эмбрионы 9-10-ти суточного возраста, инкубируемые при температуре 37+0,5°С в течение 48ч-72 ч. Максимальный выход вируса наблюдали при инокуляции их в дозе 4,0-=-5,0 ЭЛД50. В данном режиме удавалось получать от одного эмбриона 6,0-7,5 см"1 внруссодержащей жидкости с титром 8,5+9,5 ЭЛД5().

Снижение температуры до 25+0,5°С не обеспечивало накопление вируса с высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью и в достаточном объеме.

При температуре инкубирования 40+0,5°С показатели репродуктивной активности штамма существенно не отличались от результатов, полученных при температуре 37+0,5°С, однако общий выход ЭЭЖ был снижен, вероятно, за счет более интенсивно-

го испарения околоплодных жидкостей в среднем на 4,0 см3, что делало нерентабельным использование данного режима в целях накопления вируссодержащей ЭЭЖ.

Экспериментально доказанные условия оптимальной репродукции вируса в КЭ явились основой разработанной инструкции по изготовлению и контролю вирусвак-цины из штамма «ГАМ-61».

Была также изучена способность штамма к размножению в 5 первично-трипсинизированных и 5 перевиваемых клеточных линиях (гс^-прйзнак). Во всех случаях репродукция шт. «ГАМ-61» характеризовалась образованием рефрактильных групп клеток, которые можно было наблюдать уже через 24 ч после заражения. В дальнейшем появлялись симпласты, содержащие два или несколько ядер, наблюдалась деструкция клеток и отслоение их от стекла. Уровень гемагглютинина после трехкратного пассирования не превышал 2,0+3,0 1оцг, а инфекционный титр был не выше 3,0+3,5 ^ ТЦД50. Полученные результаты позволили сделать заключение, что культуры первичных и перевиваемых клеток непригодны для целей получения вакцины из шт. «ГАМ-61» и позволили характеризовать гс£са1 отрицательно. 2.2.7. Вирулентность.

Вирулентность шт. «ГАМ-61» оценивали по индексам патогенности при внут-римозговом (1СР1) и внутривенном (1УР1) его введении цыплятам, которые рассчитывали по методу Хансона, и тесту эмбриональной чувствительности (МЕ>Т/МЫ)).

При определении 1СР1 проявление клинических признаков заболевания наступало на 4-е сут, гибель на 5-7-е сут. При вскрытии павшей птицы отмечали энтериты, гастриты, кровоизлияния в пейеровых фолликулах, на границе мышечного и железистого желудка. Значение 1СР1 находилось в диапазоне 1,41+1,45, что свидетельствовало о принадлежности шт. «ГАМ-61» к мезогенной группе ВНБ. При определении 1УР1 признаки заболевания проявлялись на 5-8 сут, при этом гибели и параличей не наблюдали. 1УР1 был равен 0,1, что характерно для представителей мезогенных штаммов вируса НБ. Величина МЕ)Т/МЫ) составила 72-90 ч, что также свойственно мезоген-ным штаммам вируса НБ.

Индексы патогенности для шт. «Н» были выше на 0,35; 0,31, МОТ/МЮ меньше на 12 ч. Полученные результаты давали объяснение факту отсутствия вирулентности

шт. «ГАМ-61» для цыплят раннего возраста и наличию остаточной реактогенности у шт. «Н».

2.2.8. Стабильность.

В течение 15-ти циклов пассирования на КЭ шт. "ГАМ-61", практически, полностью сохранял исходные показатели инфекционный, ГА-активности и иммуногенности. Инфекционный и ГА-титр штамма колебался на уровне 9,0-^9,5 ^ ЭЛД50 и 6,5+7,7 1о^ и не зависел от количества проведенных пассажей (р<0,01). Средний геометрический титр антигемагглютининов у всех групп привитых цыплят был на уровне 4,8+6,2 1о{£. Устойчивость привитых цыплят к экспериментальному заражению составляла 100%.

2.2.9. Реверсибельность.

Способность шт. «ГАМ-61» сохранять исходную степень атгенуации оценивали путем 10-кратного пассирования его на 10-ти суточных СПФ-цыплятах.

Установлено, что многократное пассирование не вызывало клинического перебо-левания или гибели привитых цыплят, а также проявления патологоанатомических изменений, характерных для НБ, что свидетельствовало о его стабильности и неспособности к реверсии в вирулентную форму.

2.2.10. Вирусоносительство и вирусовыделение.

Для определения способности штамма размножаться в организме привитой птицы, путей и продолжительности его выделения во внешнюю среду от привитых цыплят отбирали пробы головного мозга, печени, селезенки, трахеи и образцы помета и проводили изоляцию вируса. Результаты представлены графически на рис.1.

Как видно из рисунка, вакцинный вирус обнаруживали во всех материалах с 3 по 9 сут после заражения. Через три дня после иммунизации его количество в головном мозге и трахеи было на уровне 1,0 и 1,75 ^ ЭЛДзо, в помете 2,75 1» ЭЛД50, в печени и селезенке - в 10-100 раз выше. На 7 сут интенсивность репродукции штамма достигала максимума, В последующие 1-2 сут вирус исчезал из печени и помета. С 7,65 до 2,25 ЭЛД50 уменьшалось его количество в головном мозге, до 1,25 ^ ЭЛД50 в селезенке. В трахее возбудитель сохранялся, практически, без потери активности, что, вероятно, обусловлено преимущественным выделением штамма из организма через респираторный тракт.

Полученные результаты, свидетельствовали об отсутствии выраженного тропизма у изучаемого штамма. Вместе с тем, максимальное накопление его в мозге (7,65 ЭЛД50) может быть проявлением признаков нейротропности, характерной для представителей велогенной группы ВНБ, откуда ведет родословную изучаемый штамм. 2.2.11. Сроки наступления поствакцинального иммунитета.

Результаты опытов по определению сроков формирования поствакцинального иммунитета цыплят, привитых штаммом "ГАМ-61" представлены в таблице.

Табл.1.

Динамика формирования резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61»

Метод вакцинации Доза элд50) Время заражения после прививки (ч) 24 48 72 96 120 144 168 Количество выживших цыплят после экспериментального, заражения (%) КЗ50 (ч) КЗоо 00

в/м 6,0 20 40 50 90 100 100 100 71,3 95,8

и/н 7,0 20 40 60 90 90 100 100 71,5 95,9

энтер. 7,0 30 50 60 70 80 100 100 71,8 119,4

аэро-зольно 2,5 10 40 60 80 90 100 100 71,7 119,4

Контроль - После заражения погибало 90-100 % цыплят

Как видно из таблицы, невосприимчивость к экспериментальному заражению наблюдали у 20% цыплят уже через 24 ч после иммунизации их штаммом "ГАМ-61". Через 48 ч этот показатель увеличивался до 40-50%, к 72 ч количество резистентных птиц составляло 50-60%, в более поздние сроки - 80-100%.

Рассчитанное по результатам данных опытов время наступления резистентности у 50% цыплят (КЗ50), привитых внутримышечно составило 71,3 ч; интраназально-

71,5; энтерально-71,8 ч; аэрозольно-71,7 ч. Кинетика защиты 90% привитых цыплят (КЗод) при внутримышечной иммунизации составила 95,8 ч; интраназальной-95,9 ч; энтеральной-119,4 ч; аэрозольной-119,4 ч. 2.2.12. Механизм формирования раннего иммунитета.

Результаты опытов по изучению факторов иммунитета у цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61», представлены на рисунке.

Рис.2.

Динамика формирования факторов резистентности у цыплят, привитых штаммом "ГАМ-61"

120 100 80

SS 60 40 20

46 13 5 '

„1алЛ-

Розеткообра- И „,

зчощие 9 % выживших цыплят ^ Титр антител ^¿Уровеньэн-

Т-лнмфоциты 1 после заражения догенного

Как видно из рисунка, защитная роль гуморальных антител через 72+96 ч после вакцинации была исключена, поскольку первые «следы» их (0,8 log:) были установлены только через 96 ч после иммунизации. Минимальный протективный титр антител (2,5-г2,61о£г) формировался лишь к 120-168 ч, что совпадало с полной невосприимчивостью к заражению.

Негативные результаты нейтрализации вируса везикулярного стоматита образцами сыворотки крови, отобранными в этот период, свидетельствовали об отсутствии защитной роли экзогенного интерферона.

Однако, шт. «ГАМ-61» оказался активным индуктором экзогенного интерферона. В пробах культуральной жидкости, отобранной даже через 24 ч после инфициро-

;ания штаммом спленоцитов и клеток костного мозга, интерферон накапливался в :оличестве более 10,0 1о£2, что было сопоставимо с показателями штамма «Н».

Результаты предыдущих опытов (п.2.2.!0.) по изучению патогенеза поствакци-гальной инфекции показали, что шт. «ГАМ-61» способен активно (в течение 72 ч) )епродунироваться и накапливаться во внутренних органах привитых цыплят. Этот |)акт служил косвенным доказательством проявления вирусной интерференции, пре-тятствуюшей прижнвляемости и диссемннации вирулентного вируса, поскольку боль-шшство привитых цыплят к этому времени были устойчивы к экспериментальному сражению.

Наряду с интерференцией многие исследователи значительную роль в ранней противовирусной защите отводят факторам клеточног о иммунитета. Большое значение отводится функции Т-лимфоцитов, участвующих не только в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, но и регулирующих функциональную активность В-лимфоцитов, ответственных за синтез антител. В наших опытах было установлено, что количество розеткообразующих Т-лимфоцитов неуклонно повышалось к 24 ч после вакцинации до 48,9 % с тенденцией к стабилизации и уменьшению с начала выраженного антнтелообразования (120-168ч), что совпадало с формированием резистентности у части привитых цыплят.

Морфологические изменения в иммуннокомпетентных органах в этот период характеризовались значительным увеличением Т-лимфоцитов и активной их дифференциацией в плазмоциты, а также увеличением числа пиронинофильных клеток, что согласовалось с результатами реакции спонтанного розеткообразования.

Таким образом, проведенные исследования доказывают, что формирование ранней невосприимчивости к вирусу НБ обусловлено шггерфероиогеппей и интерферирующей способностью штамма «ГАМ-61» в ассоциации с факторами клеточного иммунитета, что находит подтверждение в современной специальной литературе. 2.2.13. Антигенная активность и иммуиогеиность.

Результаты опытов по изучению антигенной активности и иммуногенности шг. «ГАМ-61» представлены в таблице.

Табл.2.

Антигенная активность и иммуногенность штамма «ГАМ-61» _ в сравнении со штаммом «Н»__

Штамм Метод иммунизации, № группы Доза Og ЭЛД») Сроки наблюдения (сут) 7 14 21 28 М+ш за период наблюдения (1о&) Сроки наблюдения (сут) 7 14 21 28 Эффективность иммунизации (%)

Ср. геометрич. титр антител (1о&)

ГАМ-61 В/и, № 1 6,0 2,8 5.4 4.5 3.5 4,4 + 0,55 100 100 100 80

«-» Энтер., Л» 2 7.0 2,2 4.2 4,4 3,2 3,5 ± 0,75 100 100 100 80

«-» И/наз., № 3 7.0 2,5 4,8 4,3 3,1 ЗЛ + 0,9 100 100 100 80

«-» Аэроз., №4 2,5 2.5 4.6 5,1 3,0 4,2 ± 1,7 100 100 100 80

Н В/м, № 5 6.0 4,1 5.6 5,8 6,0 5,4 ± 0,6 100 100 100 80

«-» Энтер., № 6 7.0 4.0 5.0 5,0 5,0 4,7 + 0,04 100 100 100 100

Контроль №7 - 0.5 0.3 - - - Погибало 80-100 % цыплят после заражения

Как видно из таблицы, по антигенной активности, оцениваемой в РТГА, РН и ИФА, шт. «ГАМ-61» несколько уступал шт. «Н», но давал равнозначные показатели иммуногенности, обеспечивая защиту, практически, всех привитых цыплят при 8090% гибели поголовья в контроле. Средний титр антител у цыплят, привитых внутримышечно, составил 4,4+0,55 1оё2, энтерально - 3,5+0,75 1оЯ2, что на 1,0-1,2 к^г меньше показателя штамма «Н». Недостаточно высокая антигенная активность шт. «ГАМ-61» в полной мере компенсировалась его абсолютной безвредностью, поскольку у привитых цыплят поствакцинальной реакции не наблюдали, тогда как у 10-15% птиц, вакцинированных шт. «Н», проявлялись признаки остаточной вирулентности (отказ от корма, низкая посадка, парезы, отставание в росте). 2.2.14. Продолжительность поствакциналыюго иммунитета определяли по серологическим показателям и устойчивости цыплят к заражению через 1-4 мес после прививки. Результаты опытов показали, что к 28 сут после вакцинации титры антител снижались до минимального уровня (3,0-3,5 ^2), обеспечивающего защиту 80% привитого поголовья. Поэтому для поддержания иммунитета возникала необходимость в назначении повторной вакцинации. Через 30 сут после ревакцинации титр антител возрастал в среднем на 1,3-2,0 1о£г при 100% эффективности иммуни-

зации и сохранялся с небольшими колебаниями в течение 5 мес, обеспечивая защиту не менее чем 80% привитых цыплят. Дополнительное введение после этого шт. «ГАМ-61», также как и любой другой живой или инактивированной вакцины против НБ, обеспечивало выработку антигемагглютининов в протективных титрах (3,0 и выше), защищающих привитое поголовье до конца срока эксплуатации.

2.2.15. Иммунизирующие дозы и безвредность штамма «ГАМ-61».

Доза вакцинного вируса, обеспечивающая 90% защиту поголовья при интрана-зальном, энтеральном и внутримышечном введении составила: 6,7; 6,8; 6,4 ^ ЭЛД50 в лабораторных опытах и 7,0; 6,9; 6,45 1§ ЭЛД50 при производствешшх испытаниях, при аэрозольной вакцинации цыплят и взрослой птицы - 600 и 1400 ЭЛД5о соответственно. Уровень поствакцинальных антител изменялся пропорционально введенной дозе вируса и обеспечивал абсолютную защиту цыплят при достижении значения 3,0 и более 1о£2. При этом после экспериментального заражения титр антител достоверно не увеличивался, что подтверждало высокую протективную способность штамма и правильно определенные иммунизирующие дозы. Отсутствие признаков заболевания и положительной сероконверсии после контрольного заражения привитых цыплят свидетельствовало о наличии биологического иммунитета у вакцинированных птиц, что согласуется с современными представлениями по оценке протективных свойствах биопрепаратов. Введение штамма в дозах, в 100 и даже 1000 раз превышающих ИмДзд, не вызывало поствакцинальных осложнений, что свидетельствовало о его полной безвредности.

2.2.16. Отработка технологии изготовления и контроля вакцины из штамма «ГАМ-61».

В предыдущих опытах (п.2.2.6.) были определены основные технологические параметры культивирования штамма, обеспечивающие максимальный его выход. Для стабилизации шт. «ГАМ-61» было испытано 4 прописи защитных сред, включая обезжиренное молоко (О.М.), среды ВГНКИ-3, ВНИИЗЖ, СПЛФ, 75%-ный раствор сахарозы, которые добавляли в различных пропорциях и лиофшшзировали по общепринятым методикам.

После термоинактивации в течение 7 сут при температуре 37°С образцов вакцин с защитными средами О.М., ВНИИЗЖ, ВГНКИ-3 и СПЛФ титр вируса снижался на 1,0;

0,75; 0,75 и 0,5 ^ ЭЛД50. Сахароза не оказала стабилизирующего действия и из опытов была исключена. Рассчитанное по формуле, предложенной Скотниковой Т.А. (1981) для вакцины из штамма «Ла-Сота», срок годности препарата составлял 30+35 мес, что, на наш взгляд, было маловероятно. Поэтому для экспериментального подтверждения прогнозируемых сроков хранения образцов вакцины, были определены их инфекционная, антигенная активность и иммуногенность через 3,6,9,12,18 и 24 мес.

Полученные результаты показали, что независимо от разновидности стабилизатора титр вакцинного вируса закономерно снижался каждые 3 мес в среднем на 0,25 достигая минимально допустимого значения по ТУ на вакцины против НБ к 18 мес. При этом менее стабильными оказались образцы с О.М.

Титр поствакцинальных антител у привитых цыплят за период наблюдения достоверно не уменьшался и составлял 4,0+5,5 1оог при 90+100%-ной устойчивости их к экспериментальному заражению.

Прогнозируемое время хранения вакцины, рассчитанное по упомянутой формуле, примерно, в два раза выше экспериментально установленного, что потребовало пересмотра введенного в формулу коэффициента, значение которого оказалось равным 2,67. При пересчете полученных показателей с учетом данного коэффициента, время сохранности вакцины не превышало 20 мес, что коррелировало с результатами острых опытов и позволяло рекомендовать тест «ускоренного старения» для оценки стабильности серий вакцины из штамма «ГАМ-61».

2.2.16.1. Совершенствование метода контроля нммуногенности вакцин против ньюкаслской болезни.

Основу предлагаемого метода оценки иммуногенности вакцин против НБ составил принцип сероконверсии. Была стандартизирована методика определения поствакцинальных антител у привитых цыплят, изложенная в «Методических указаниях по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)». Это позволило использовать современное микротитраци-онное оборудование, однозначно интерпретировать получаемые результаты и, тем самым, унифицировать методику оценки иммуногенности вакцины по ее антигенной активности.

Доказано, что уровень поствакцинальных антител прямо пропорционален дозе ¡водимого вируса и не зависит от разновидности вакцинных штаммов. Возрастание юзы вакцин закономерно приводило к увеличению количества особей с высоким фовнем гуморальных антител. Все цыплята с титром антител 3,0 log2 и выше были ,'стойчивы к заражению вирулентным штаммом. Большинство из них (84-100%) с фовнем антител ниже 3,0 logs оказались чувствительны к вирулентному вирусу и югибали на 5-6 сут после инфицирования.

Методика контроля вакцины на иммуногенность в условиях ОБК биопредприя-гий и оценки полученных результатов включала определение уровня гуморальных антител, индуцируемых серийно производимыми образцами вакцины в сравнении со :пециально подготовленными нами эталонными препаратами (референс-вакцинами). Референс-вакцины, получившие статус стандарта ВГНКИ, должны вызывать выработку штител в титрах не менее 4,0 log2 у всех цыплят, привитых в дозе 1,0-0,1 ИмД90 и эбеспечивать 100% защиту при экспериментальном заражении через 14 сут после прививки, а также соответствовать всем другим требованиям, предусмотренным в ТУ на вакцины против НБ.

Оценка иммуногенности по результатам РТГА с сыворотками цыплят после вакцинации референс-вакциной и испытуемой серии препарата предусматривает расчет коэффициента эффективности иммунизации - К. При получении К, равном 0,8 или выше, серии вакцины считались иммуногенными. Новый метод контроля введен в ТУ на вакцины против НБ, прошел апробационные испытания в ОБК Курской и Краснодарской биофабрик, Щелковского биокомбината, ВНИИТиБП, ВНИВИП, где было проверено более 100 серий препаратов и получены положительные отзывы. 2.2.17. Испытания эффективности вакцины из штамма "ГАМ-61" в производственных условиях

Производственные испытания вакцины из шт. «ГАМ-61» проводили в 12 стационарно неблагополучных по НБ птицехозяйствах южных и юго-восточных областей РФ, республики Дагестан и в Днепропетровской области Украины.

После применения нового препарата сохранность поголовья бройлерных хозяйств возросла, в среднем, на 11% и составляла 96+2,4 % (82+3,5% в контроле), а суточные привесы увеличились с 12-15 г до 18-26 г.

В хозяйствах яичного направления от кур, привитых вакциной из шт. «ГАМ-61» было получено в среднем 249 яиц на несушку при уровне яйценоскости 68 %. Сохранность поголовья увеличилась на 11,9 %, выводимость цыплят достигала 80%, количество эмбрионов-«задохликов» не превышало 1,75-2,0 %.

В контрольных группах, где профилактику НБ проводили только лентогенными вакцинами общая сохранность не превышала 78,9%, яйценоскость и выводимость была на 5% и 3% ниже, а количество эмбрионов-«задохликов» возрастало на 1,0-1,5 %.

По нашим данным, подтверждешшм актами комиссионными испытаний, вакцина против НБ из штамма «ГАМ-61» в неблагополучных хозяйствах различного направления выращивания оказалась эффективным препаратом. Промышленное производство вакцины освоено во ВНИИТиБП, на Краснодарской биофабрике. В период с 1994-1999 гг. для нужд птицехозяйств выпущено 71,5 млн. доз вакцины, с помощью которой решена проблема ньюкаслской болезни в ряде хозяйств указанных регионов.

ВЫВОДЫ

1. Штамм "ГАМ-61" по морфологическим признакам, устойчивости к действию физико-химических факторов, тинкториальным свойствам, степени вирулентности и другим биологическим характеристикам (Eth , Ch , рНз о", рНю,о\ Is", NH+, Н\ rctclK+, ret"1', ICPI-1,4Ы,45; -IVPI-0,1; MDT/MLD - 72+90 ч) является типичным представителем мезогенной группы вакцинных штаммов ВНБ. Отличие его от штамма «Н» заключается в отсутствии остаточной реактогенности для цыплят младших возрастных групп, выраженной антигенной активности и иммуногенности при различных методах введения.

2. Штамм «ГАМ-61» генетически однороден, сохраняет биологические свойства при многократном пассировании, не реверсибелен. Нуклеотидная последовательность фукционально значимых участков генов F и HN аналогична штамму "Н" и не отличается от высоковирулентных изолятов вируса НБ.

3. Последовательность нукпеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания FO-белка вирусов НБ, за некоторым исключением, четко детерминирована, что позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Искусственная

эттенуация вирулентных штаммов НБ не приводит к существенным заменам в струк-гуре полипептидов, кодируемых генами Б и НЫ и, вероятно, обусловлена кумуля-гивностью изменений во всех белках вириона.

4. Биологической системой для промышленного культивирования штамма «ГАМ-61» являются куриные эмбрионы 9-10 суточного возраста, при инфицировании которых в аллантоисную полость в дозе 4,0+5,0 ^ ЭЛД50 и инкубировании в течение 48+72 ч при температуре 37+0,5°С обеспечивает максимальный выход ЭЭЖ (6,5-8,5 см3 с одного куриного эмбриона) с титром 8,5-9,5 ЭЛД50.

5. Резистентность к экспериментальному заражению цыплят, иммунизированных шт. "ГАМ-61, формируется в течение 72-96 ч и обусловлена интерфероногенной и интерферирующей способностью штамма и активацией факторов клеточного иммунитета.

6. Разработана и освоена в промышленных условиях технология изготовления вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61». Вакцина предназначена для применения в угрожаемых и неблагополучных птицехозяйствах с острым и латентным проявлением заболевания. Препарат безвреден, антигенно и иммуногенно активен при аэрозольном, интраназальном, внутримышечном и энтеральном методах введения в дозах 600+1400 ЭЛДяъ 7,0 6,0 1£, 6,0 ЭЛД50 соответственно.

7. Предложенный метод контроля иммуногенности вакцин против НБ по результатам сероконверсии с использованием референс-серий препарата коррелирует с результатами экспериментального заражения и в полной мере отражает протективные свойства препарата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Подготовлена, утверждена и согласована с Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ нормативная и технологическая документация на «Вирусвакцину против ныокасл-ской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую»: Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г.; Наставление по применению № 13-4-2/490 от 27.12.95 г. Разработана

инструкция по изготовлению и контролю вакцины, утвержденная директором ВГНКИ 12.1995 г.

2. Вакцина из штамма «ГАМ-61» зарегистрирована в РФ и выпускается серийно по заявкам потребителей во ВНИИТиБП и на Краснодарской биофабрике.

3. Разработаны «Методические указания по определению уровня антител к вирус> ньюкаслской болезни в реакции торможения гсмагглютинации (РТГА)», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 23.06.97 г.

4. Внесены изменения в разделы ТУ 9384-080-95 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 46-21-567-80 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» по контролю иммуногенности серий вакцин, исключающие экспериментальное заражение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Пост вакцинальная инфекция у цыплят, иммунизированных вирусом ньюкаслской болезни//Сб.научн.тр ВГНКИ, 1994.-т.55.-с.214-218.

2. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Совершенствованш методики контроля вакцин против НБ//С6. науч. тр. ВГНКИ,1995.-т.57.-с.56-63.

3. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Сухая вирусвакцин; против ньюкаслской болезни из мезогенного штамма «ГАМ-61; (« А(в)ВН»)//Ветеринария, 1995.-5 .-с.8.

4. Патент РФ на изобретение; «Штамм Paramyxovirus, используемый для изготовле ния вакцины против ньюкаслской болезни кур» патент № 2055890 от 10.03.96.Г.

5. Смоленский В.И., Руденко Т.В. Механизм формирования иммунитета при исполь зовании вакцины против ньюкаелкой болезни из штамма «ГАМ-61 »//Тезисы доклад научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня основали Курской биофабрики, Курск,1996.-с.298-300.

6. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. New «GAM-61» strain vaccine against Newcastle disease//XI th Intemation congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest,1997,- p.207.

7. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Родин Ю.В., Горева И.П. Разработка и испытание новой вакцины против ньюкаслской болезни//Вестник ветеринарии, Ставрополь, 1998.-№2.-с.75-82.

8. Родин Ю.В., Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин В.В. Оценка эпизоотической ситуации и особенности специфической профилактики при ньюкаслской болезни//Вестник ветеринарии, Ставрополь, 1998.-№2.-с.66-75.

9. Смоленский В,И., Руденко Т.В. Иммунопрофилактика ньюкаслской болезни в птицехозяйствах//Ветеринария, 1998.-№12.-е. 18-20.

10. Руденко Т.В. Improvement of methods for control of vaccines against Newcastle disease in the Russian Federation, 10 th European poultry conference, Israel,1998, p.21-22.

11. Грибанов О.Г., Старов С.К., Смоленский В.И., Дрыгин В.В., Гусев A. A. The study of russian strains of Newcastle disease virus//10th European poultry conference, Israel, 1998.p.78..

12. Григоренко А.И., Махлай A.A., Колосков A.B., Крамской Н.В., Смоленский В.И., Горева И.П., Токарик Э.Ф., Руденко Т.В., Фисинин В.И., Филоненко В.И. Сухая живая вакцина против ньюкаслской болезни «Оровак-НБ»//Ветеринария,1999.-№10.-с.20-23.

13. Грибанов О.Г., Перевозчикова Н.А., Старов С.К., Смоленский В.И., Руденко Т.В. Штаммовая дифференциация вируса ньюкаслской болезни с помощью обратной транскрипции-ПЦР и секвенирования: смена популяции//Молекулярная биология,1999,-№10.-с.20-238.

14. Методические указания по определению уровня ангител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемаггшотинации (РТГА). МСХ и П РФ 23.06.97 г.

15. Смоленский В.И., Руденко Т.В. Иммунобиологические свойства нового штамма вируса ньюкаслской болезни//Аграрная наука,2000,- № 2, с.13-18.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Руденко, Татьяна Владиславовна

ВВЕДЕНИЕ .7

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о нькжаслской болезни.12

1.1.1. Клинические признаки и формы проявления.17

1.1.2. Патологоанатомические изменения

1.2. Биологические свойства вируса ньюкаслской болезни

1.2.1. Таксономическое положение, антигенный и химический 21-23 состав вируса

1.2.2. Морфология.23

1.2.3. Выделение и методы культивирования вируса.24

1.2.3.1. Способность вируса к репродукции при различной температуре.25

1.2.3.2. Способность вируса к репродукции в культурах клеток.26

1.2.4. Аттенуация вирулентных штаммов вируса ньюкаслской болезни.27

1.2.5. Гемагглютинирующая активность.30

1.2.6. Нейраминидазная активность.

1.2.7. Интерфероногенная активность и интерферирующая спо- 31-33 собность.

1.2.8. Термостабильность.33

1.2.9. Бляшкообразование.34

1.2.10. Антигенные свойства вируса.35

1.2.11. Вирулентность и основы патогенности .36

1.3. Иммунная система птиц.38

1.3.1. Иммунитет при ньюкаслской болезни.

1.3.1.1. Клеточно-опосредованный иммунитет. Краткая хг 40-43 иммунокомпетентных клеток.

1.3.1.2. Гуморальный иммунитет.43

1.3.1.3. Локальный иммунитет.45

1.4. Средства специфической профилактики ньюкаслской болезни.

1.4.1. Вакцины из лентогенных штаммов .46

1.4.2. Вакцины из мезогенных штаммов .51

1.4.3. Инактивированные вакцины.53

1.4.4. Генно-инженерные вакцины.55

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма "ГАМ-61""

Актуальность темы. В условиях специализированных птицеводческих хозяйств первостепенное значение принадлежит иммунопрофилактике инфекционных болезней вирусной этиологии. Высокая концентрация поголовья на ограниченных территориях, одновременное содержание неоднородных по возрасту и физиологическому развитию птиц, использование кормов, обсеменных болезнетворными агентами, постоянное поступление ремонтного молодняка из эпизоотически опасных хозяйств и регионов, создают благоприятные условия для быстрого возникновения и распространения инфекционных болезней, оперативная профилактика и ликвидация которых невозможны без применения современных дммунологи-ческих препаратов (129,143,146,149).

Одной из наиболее опасных инфекций является ньюкаслская болезнь (НБ). Несмотря на обстоятельные исследования в области эпизоотологии НБ, расшифровку молекулярных основ патогенности возбудителя, наличия детально отработанных методов диагностики и профилактики, это заболевание до настоящего времени является актуальным не только для птицеводства стран, стационарно неблагополучных по НБ, но и для европейских государств, многие годы свободных от высоковирулентных вариантов возбудителя (329,330).

По данным Международного Эпизоотического Бюро в 1996 г. в мире официально зарегистрировано 2277 неблагополучных по НБ пункта, в 1997 г. - 2382, в 1998 г. - 2385. Причем, в последнее время на некоторых континентах вновь начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 зарегистрированных неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 г. было зафиксировано 69 случаев возникновения ньюкаслской болезни, в 1997- 98 гг.-98.

В РФ за период с 1996 г. по 2000 г. было отмечено всего лишь 13 пунктов, где заболевание проявлялось клинически (307,329). Однако заметно увеличилось количество хозяйств с атипичным течением НБ, о наличии которой можно судить только по появлению чрезвычайно высоких титров антител, снижению общей сохранности и продуктивности. По мнению ряда ученых, одной из возможных причин, объясняющих данную ситуацию, является изменение антигенной или конформационной структуры вирулентных штаммов вируса НБ, что неизбежно при длительном направленном антительном прессинге (202). Следствием этого является неполная комплементарность измененного вируса антителам, формирующимся в ответ на введение большинства традиционных профилактических препаратов, предложенных более 40-50 лет назад и до настоящего времени производящихся отечественной биологической промышленностью (129,130,145,150) .

Поэтому с научной и практической точек зрения представлялась важной и своевременной разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально «поздней» селекции. Такой штамм, обозначенный «ГАМ-61» («А(в)ВН») был получен в начале 70-х годов сотрудником ЦВЛ Михальским Г.А. путем аттенуации на первичной культуре клеток почки теленка и эмбрионах кур высоковирулентного вируса НБ, выделенного от павших 25-ти суточных цыплят птицефабрики «XXII партсъезда» Луховицкого района Московской области. При этом основные иммунобиологические свойства штамма были не изучены.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание новой вакцины против ньюкаслской болезни, отвечающей современным требованиям, предъявляемым к противовирусным биологическим препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить иммунобиологические свойства пггамма «ГАМ-61», предлагаемого в качестве продуцента новой вакцины.

• Проверить эффективность вакцины в лабораторных и производственных условиях.

• Разработать технологию изготовления вирусвакцины, методы ее контроля, подготовить НД.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

• Определены генетические параметры и иммунобиологические характеристики штамма «ГАМ-61» вируса НБ, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, и предложен для производства вакцины.

• Изучен механизм формирования ранней резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61».

• Разработан новый метод контроля иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин.

• Установлена структурная и филогенетическая близость искуственно-аттенуированных мезогенных штаммов «ГАМ-61» и «Н» с высоко вирулентными изолятами ВНБ. Доказано, что последовательность нуклеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания Fo-белка вируса НБ детерминирована. Это позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Снижение вирулентности в процессе аттенуации не связано с нуклеотидными заменами в функционально важных участках генов F и HN.

Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ на изобретение: «Штамм Paramyxovirus, используемый для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни кур». Патент РФ № 2055890 от 10.03.96.г.

Практическая значимость. Подготовлена и утверждена в установленном порядке нормативная документация на «Вирусвакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую» (Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г. и Наставление по применению вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» № 13-4-2/490 от 27.12.95 г.). Разработана инструкция по изготовлению и контролю вакцины (утверждена директором ВГНКИ 12.1995 г.).

Вакцина из штамма «ГАМ-61» зарегистрирована в РФ и выпускается серийно по заявкам потребителей во ВНИИТиБП и на Краснодарской биофабрике.

Разработаны «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХи П РФ 23.06.97 г.

Метод оценки иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин введен в ТУ 9384-080-95 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 9384-002-22727671-00 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота».

Апробация. Материалы диссертации доложены на XIII научной конференции молодых ученых (10.01.1992 г.), на 11-ом Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, 1997), на 10-ой Европейской конференции по птицеводству (Израиль, 1998), а также на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней, Ученого Совета ВГНКИ.

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 2345 от 12. 98 г.).

Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в двух заключительных отчетах ВГНКИ: за 1991-1993 гг. № Гос. регистрации 01910034974; за 1994-1996 гг. № Гос. регистрации 01940007075; комплекте НД на вакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; а также в 15 научных статьях, включая Патент РФ на изобретение, и «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• Результаты изучения биологических свойств штамма «ГАМ-61» в сравнении со штаммом «Н» вируса НБ.

• Технология изготовления и контроля вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61».

• Методики и результаты разработки количественных показателей оценки иммуногенности вакцин против ньюкаслской болезни.

• Результаты испытания эффективности вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61» в лабораторных и производственных условиях.

• Результаты исследований функционально важных участков генома вируса НБ для определения антигенных модификаций полевых возбудителей и изучения молекулярных основ процесса аттенуации штамма «ГАМ-61».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 19& страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Руденко, Татьяна Владиславовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Полученные результаты свидетельствуют отом, что вакцина из штамма «ГАМ-61» является эффективным противоэпнзоотнческим препаратом для хозяйств, стационарно неблагополучных по НБ, и позволяют надежно контролировать эпизоотическую ситуацию .

Систематическое применение вакцины из штамма « ГАМ-61» способствует вытеснению из стада вирулентных возбудителей НБ и оздоровлению поголовья от данного заболевания.

И-ДСуровцева И.П.Горева Т.В.Руденко ' Ю.В.Родин

О f 9 %

Краснодарский птицепром 24 сентября 1993 год

19Ч?

Прйл. Я

Заключительный акт по результатам испгтаяи;: в Краснодарском к'оао опытно -лоо-шшлешшх серий вирусвакципы против" ишодслодо»; болозш" из штак;,а"А(в)Б1Г1 в течение 1993 года. гласпо разрешения Главного Управления ветеринарии от 07.05.92г. •46/442 в условиях птицефабрик Краснодарского края в 1393 году >дилнсъ испытания опытно -проглышлеиных серий вирусвакцины против злско:] болезни из шташла "А (в )ШГ'. зкцияа была изготовлена согласно требованиям Временной инструкции

•отовленкю к контролю сухой вирусвакципы из штаглма"А(в)ВН" , утгор;::::.

1\ директором НИЖИ ветпрепаратов 20.03.92г. ятрэль вакцины проводив согласно Т требованиям ТУ на вакцину, дащш-ТУВ КСХ РФ 07.05.92 г., а выпускали по. результауагл порчтрования. актуемую вакцину применяли на птицефабриках "Приморская", "Арыа-ая"," Внселковокая". вдну' использовали поело предварительной иммунизации птицепого-вакциной из лентогенного штамма. гщефабркка^исолкоБСкая"- плоцрелродуктор. Основное направло.'ше-ащяваяив реммолодняка до 90-дневного возраста. Вакцина прпменя

0 следующей схеме: я вакцинация( 10-12 дн)-"Бор-74 ШШ1 "-интраназально; вакцинация ( ¿2-42 ди)/"Бэр-74 .ВШЕ" -интраназально ( но по-ашям ИГА ); | я вакщшцпя ( 62-70 дн.)-"А(в)ВН"- внутримышечно. пршито 42Ь300 голов. После применения испытуемой вакцины пост-алыще ослошюния не отмечались. Применение вакцины из штамма И" обеспечивало 100% напряженность иммунитета,титры опоцифкчес-тмтол к вирусу пыокаслскои 'болезни через 14 дне:; после гакцина-ходошсь в пределах 6,2-8,3 через 2В дней- 5,7- . ице>а брлка "Армавирская "-яичного направления. / га применялась по следующей схеме: ^ вакшнашя( 10-~;. дк)-"Ла-Сота"-выпаивание; . . ! вакцинация ( 20-22 дн)-'М:а-Сота"-выпапБаиие ( по показания:;: А):,

1 павддаиия ( 35-40 дн)~"А(б)1;]1" -БЕутркмкшечпо-0,5 мл; ) гаданагепя ( ('5-71: дп) -"А(б)Ш"-вяутримкшечно-1,0 гл. щлшто Т75С00 голов.; После прймоноыш испытуемо?: вакцин постзпечиэало 100/j напряженность шялукитета ,титри опоц-тфитоотах антптол ipycy Iяыокас леко•5 болезни находились б пределах о. зтаточно высокая ап:-:^генная активность ктрускактчш связала с год отходом птлцн »вкзваяныдз поставкам нодобракачествспдкх корглов. фабрика "Пркиорскал"--шеного направления. Вакщша применялась здукэдеЯ схеме г j вакщиаиия ( 12 дн)-"Бор-74 ВГШ'Ц - вшаиваиие; 1 вакцинация "Еор-74 ВПШ" проводится по показаниям Ш Л, я вакщшацня ( CG-Г.о дн.)~"Л(в)ЗН"- внутряглшючно. Йявпто J2GS0 голов. Применение вакщшк обеспечивало Ю0# напря-сь хшг/упитета, титры антител к вирусу 1Ш составили 0.

•о испытуемой вакциной в Краснодарское крае привито 55С9ЗД голов.

Л.Тайласуков

С.Б. Спарников

Гуденко