Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Вакцина против ньюкаслской болезни для голубей

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Вакцина против ньюкаслской болезни для голубей"

На правах рукописи

СПИРИДОНОВ Артем Николаевич

ВАКЦИНА ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ДЛЯ ГОЛУБЕЙ

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

1 3 НОЯ 2014

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

00555516«

Владимир - 2014

005555169

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук

Ирза Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: Кушнир Анатолий Тимофеевич -

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ «ВНИИВВиМ» Россельхозакадемии), ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии.

Пименов Николай Васильевич -

доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ), профессор кафедры.

Ведущая организация • Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва.

Защита состоится « 09 » декабря 2014 г. в 1400 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.arriah.ru ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Автореферат разослан « 05 » ноября 2014 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций

ФГБУ «ВНИИЗЖ», Л

кандидат биологических наук ^-ул-^К Жбанова Татьяна Валентиновна

1 Общая характеристика работы

1.1 Актуальность темы исследования.

Ньюкаслская болезнь (НБ) - это широко распространенная высококонтагиозная пантропная инфекция многих видов птиц, включая голубей. Возбудитель - вирус ньюкаслской болезни - является парамиксовирусом птиц 1 серотипа (PMV-1), который относится к роду Avulavirus семейства Paramyxoviridae (Alexander D.J., 1988; Kaleta E.F., 1988).

Вирусы ньюкаслской болезни (ВНБ) сходны в антигенном отношении, но по генетическим особенностям подразделяются на несколько генотипов (Aldous E.W, 2003; Diel D.G., 2012). Среди вирулентных вирусов в настоящее время наибольшее распространение имеют генотипы V, VI и VII. Большинство вспышек НБ у кур в Евразии вызывают вирусы генотипа VII, в Америке - генотипа V. У голубей в основном циркулируют ВНБ генотипа VI (Lomniczi В., 1998; Miller P.J, 2010).

Таким образом, циркулирующий в популяциях голубей, диких и синантропных птиц вирус НБ может распространяться в птицеводческие хозяйства и голубятни, представляя серьёзную угрозу всему птицеводству (Пименов Н.В., 2009; Сюрин В.Н. и др., 1998; Alexander D. J., 1984; Ujvari D. et al., 2006).

В последние годы для специфической профилактики НБ в промышленном птицеводстве были разработаны живые и инактивированные эмульсионные вакцины (Старое С.К., Ирза В.Н. и др., 2005; Kaleta E.F. et al., 1985). Вакцинация породистых голубей против НБ также является обоснованным противоэпизоотическим мероприятием, признанным во всём мире (Шумский Н.И. и др., 2000).

Текущие программы вакцинопрофилактики почтовых и декоративных голубей в Англии, Бельгии, Германии, Польше и других странах преимущественно основаны на использовании эмульсионных инактивированных вакцин (Kaleta E.F. et al., 1985; Jaspers I.D. et al., 1989; Arzey G. et al., 2013).

В отечественном голубеводстве широкое применение получили живые вакцины на основе штаммов «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ» и «ГАМ-61». Иммунизация этими вакцинами обеспечивает создание у птиц иммунитета продолжительностью не более 34 мес. (Руденко Т.В., 2000; Пименов Н.В. и др., 2011). Применение инактивированных зарубежных эмульсионных вакцин способствует формированию более продолжительного иммунного ответа - до 9-12 мес. (Duchatel J.P. et al., 1986; Jaspers I.D. et al., 1989; Stone H.D., 1997). Выпускаемые в нашей стране инактивированные эмульсионные вакцины для профилактики НБ у кур не нашли широкого применения в

системе противоэпизоотических мероприятий в голубеводстве в силу возможного развития воспалительной реакции тканей в месте инъекции и отсутствия достоверных данных по их эффективности при иммунизации породистых голубей.

1.2 Степень разработанности проблемы. Отечественная вакцина против сальмонеллёза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц ассоциированная инактивированная после двукратной иммунизации обеспечивает более выраженный поствакцинальный иммунитет в сравнении с живыми вакцинами, но при этом не является эмульсионным биопрепаратом (Пименов Н.В. и др., 2011).

С учётом неблагополучия голубеводческих хозяйств по НБ назрела необходимость разработки отечественной эмульсионной вакцины против НБ для голубей, обеспечивающей выраженный и продолжительный иммунитет у привитых птиц и не обладающей реактогенными свойствами. Также актуальной задачей стало испытание защитных свойств разработанного препарата в острых опытах с заражением голубей современными вирулентными вирусами НБ генотипов VI и VII.

Исследования по разработке вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной в РФ ранее не проводились.

13 Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать и обосновать оптимальный компонентный состав вакцины, выбрать адъювант, позволяющий получать стабильную, ареактогенную эмульсию;

2) изучить физические и иммунобиологические свойства вакцины, обосновать прививную дозу;

3) изучить протективные свойства вакцины при заражении голубей высоковирулентными вирусами НБ, принадлежащими к различным генетическим группам;

4) провести сравнительные испытания разработанной вакцины с коммерческими препаратами;

5) определить сроки хранения вакцины;

6) разработать нормативную документацию на вакцину;

7) предложить оптимальную схему иммунизации голубей с применением разработанной вакцины.

1.4 Научная новизна результатов исследования:

- разработана технология изготовления и контроля вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной;

- изучены физические и иммунобиологические свойства вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной;

- предложена и апробирована в лабораторных и производственных испытаниях оптимальная схема вакцинации породистых голубей против НБ.

1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты научных исследований были использованы при составлении следующей нормативной документации:

- Промышленный регламент на производство вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной;

- СТО на вакцину против НБ для голубей инактивированную эмульсионную (СТО 00495527-0208-2014);

- Инструкция по применению вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной.

1.6 Положения, выносимые на защиту:

сравнительная оценка адъювантов в составе инактивированной вакцины;

определение оптимального компонентного состава вакцины;

• изучение физических и иммунобиологических свойств вакцины против НБ для голубей;

• обоснование прививного объёма;

• изучение протективных свойств вакцины при заражении голубей высоковирулентными вирусами НБ;

• изучение сроков хранения вакцины;

• сравнение иммунобиологических свойств вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной с коммерческими препаратами в лабораторных и производственных условиях;

внедрение в практику оптимальной схемы иммунизации голубей с применением разработанной вакцины.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В диссертационной работе представлены результаты исследований по разработке вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной. Изучены физические и иммунобиологические свойства препарата, предназначенного для специфической профилактики заболевания у голубей. Результаты научного исследования соответствуют пунктам 2, 3, 7, 8 и 10 паспорта специальности.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов исследования. Степень достоверности полученных результатов подтверждена статистической обработкой с

использованием общепринятых способов, достаточного количества проведенных исследований и наблюдений за подопытным поголовьем птиц.

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), «международной научно-практической конференции, посвященной 55 летию ФГБУ «ВНИИЗЖ», международном семинаре «Montanide adjuvant for poultry vaccines» (OAE, Дубай, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010-2013 гт.

1.9 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.10 Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 191 источника, в том числе 86 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 19 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение результатов работы в ветеринарную практику.

1.11 Место выполнения работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 2010-2013 гг. в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Клинические исследования препарата проведены в частных голубятнях Владимирской и Курской областей.

1.12 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с сотрудниками отдела по болезням птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» Долговым Д.Л., Чвалой И.А., Евсеевым A.M., Маниным Т.Б., Сарбасовым А.Б., за что автор выражает им благодарность.

2 Собственные исследования 2.1 Материалы

Производственный штамм вируса НБ - лентогенный штамм «Ла-Сота» вируса НБ, полученный культивированием в 9-11-суточных эмбрионах СПФ-кур. Для изготовления вакцин использовали вируссодержащий материал с инфекционной активностью до инактивации не ниже 9,5 lg ЭИД50/СМ3 и агглютинирующей активностью в РГА не менее 1:1024.

Вирулентные штаммы:

- штамм NDV/Chicken/Rus/Amursky/1057/06 из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ», регистрационный № 5 от 15 июня 2012 г;

- изолят NDV/Pigeon/Kursk/02/13 из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Вакцины:

экспериментальные образцы инактивированных вакцин против НБ, изготовленные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011-2013 гг.;

- вакцина против НБ инактивированная эмульсионная, производственная серия № 30, изготовленная в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в декабре 2012 г.;

Адъюванты. Для изготовления экспериментальных образцов вакцины были использованы адъюванты: Montanide Gel 01 PR, Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 760 VG, Montanide ISA 763 A VG (SEPPIC, Франция) и Emulsidgen-D (MVP Laboratories, США).

Птицы. Клинически здоровые голуби «Курской», «Николаевской» и «Воронежской» пород, старше 35-суточного возраста, серонегативные к вирусу НБ.

Эмбрионы кур. Развивающиеся эмбрионы СПФ-кур (Lohmann Tierzucht, Германия).

2.2 Методы

Культивирование вируса НБ. Штамм «Ла-Сота» вируса НБ культивировали на развивающихся эмбрионах СПФ-кур. Вирусный материал вносили в ЭЭЖ СПФ яиц общепринятым методом и инкубировали в течение 72 ч. Оценку накопления вируса проводили по титру инфекционной активности в ЭЭЖ. Инактивацию вируса выполняли 10% раствором аминоэтилэтиленимина при температуре +22-24°С. После добавления инактиванта содержимое ёмкости аккуратно перемешивали в течение 24 ч. Полноту инактивации определяли методом 2 кратных пассажей в эмбрионы СПФ-кур.

Адъюванты Montanide ISA 70 VG, ISA 760 VG, ISA 763 A VG смешивали с антигеном НБ в соотношении 70:30 (по весу), адъювант Emulsidgen-D - 60:40. Смеси эмульгировали на лабораторном эмульсоре «Silverson Sealed Unit» (Англия) при скорости вращения 6000 об/мин в течение 6 мин. Адъювант Montanide Gel 01 PR смешивали с вирусной суспензией в соотношении 20:80, вручную взбалтывали в течение 1-2 мин до получения однородной консистенции.

Определение кинематической вязкости эмульсий. Вязкость эмульсий определяли с помощью вискозиметра ВПЖ-2, по ГФ XII, часть 1.

Определение стабильности вакцинной эмульсии:

1. Центрифугирование. Образцы вакцин помещали в установку Mistral 6М и центрифугировали при 1000g в течение 30 мин. Образец считали стабильным, если в нём не выделялась водная фаза, а верхняя фракция масла не превышала 10% от общего объёма эмульсии в пробирке.

2. Хранение при различных температурах. Пробы эмульсий хранили в стеклянных пробирках по 10 см3 при температурных режимах 4, 25 и 37°С. Препарат считали стабильным, если в течение 14 сут при температуре хранения 37°С в нём не выделялась водная фаза.

3. Экспресс-метод. Образцы вакцины замораживали в течение 1 ч при температуре минус 40°С. Далее пробирки с препаратами помещали на 1 ч в термостат с температурой 37°С. Отслоение водной фазы более чем на 15% свидетельствовало о неудовлетворительном качестве эмульсии, от 15% до 5% - качество удовлетворительное, менее 5% — хорошее качество.

Антигенную активность вакцины определяли на породистых голубях старше 35-суточного возраста. Сыворотки крови от птиц исследовали в РТГА на наличие антигемагппотининов к вирусу НБ. Вакцину считали антигенно-активной, если через 28 сут после вакцинации не менее чем у 80% привитых птиц титр антител составлял к вирусу НБ не ниже 5 log2 в РТГА.

Для обработки результатов исследований использовали статистические методы, применяемые в биологии. Построение графиков и математическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Office Excel.

23 Результаты собственных исследований

2.3.1 Выбор штамма вируса для изготовления вакцины. Для изготовления вакцины против НБ для голубей в качестве вируса НБ был использован производственный лентогенный штамм «Ла-Сота», обладающий по антигенным свойствам широким доминантным спектром защиты против эпизоотических штаммов НБ. При культивировании штамма на развивающихся эмбрионах СПФ-кур получали вирус с инфекционной активностью не менее 9,5 lg ЭИД50/СМ3 и агглютинирующей активностью в РГА до инактивации - 1:1024.

2.3.2 Сравнительная оценка адъювантов в составе вакцины. На первом этапе исследований необходимо было изучить иммуностимулирующие свойства адъювантов: Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 763 A VG и Montanide Gel 01 PR в составе экспериментальных образцов вакцин.

Изучение иммунобиологических свойств вакцин проводили на 50 серонегативных к вирусу НБ взрослых голубях породы «Курская». Птицу первых четырёх опытных групп иммунизировали образцами вакцин в грудную мышцу в прививном объёме 0,25 см3, пятая группа служила отрицательным контролем. На протяжении 42 сут отбирали пробы крови для оценки динамики формирования иммунитета (Рисунок 1, Таблица 1).

В результате исследования было установлено, что через 14 сут после однократной иммунизации прирост титров антител к вирусу НБ наблюдался во всех группах. Экспериментальная вакцина на основе адъюванта Montanide Gel Ol PR обладала выраженной антигенной активностью. В группе иммунизированных голубей на 14-е сут исследований средний титр антител составлял (6,7±0,6) log2, через 35 сут концентрация антигемагглютининов в сыворотках крови голубей не снизилась.

Рисунок 1 - Средние значения титров антител к вирусу НБ у голубей, привитых вакцинами на основе различных адъювантов

Несколько менее выраженной антигенной активностью обладал образец вакцины

№ 3 на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG: через 14 сут исследований средний

титр антител составлял (5,0±0,2) log2, и на 35 сут их концентрация в сыворотках крови

составляла (6,0±0,8) log2.

Таблица 1 - Динамика формирования иммунитета к НБ у голубей, привитых инактивированными вакцинами с разными адъювантами

Образец Средний титр антител в F сроки отбора сывороток к ТГА, log2/ рови, сут

0 7 14 21 28 35

1. Montanide ISA 70 VG 0 2,25±0,3 2,3±0,5 3,7±0,4 3,7±0,7 4,8±0,3

2. Montanide ISA Gel 01 PR 0 2,25±0,2 6,7±0,6 7,0±0,6 6,7±0,9 6,7±0,9

3. Montanide ISA 763 A VG 0 2,0±0,4 5,0±0.2 4,7±0,3 4,7±0,9 6,0±0,8

4. Физраствор + антиген НБ 0 1,9±0,6 2,2±0,4 2,7±0,6 3,4±0,4 4,6±0,6

5. Контроль 0 0 0 0 0 0

Образец вакцины № 4 стимулировал иммунную систему птицы к выработке антител через 14 сут до (2,2±0,4) log2, через 35 сут - (4,6±0,6) log2. Вакцина на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG при исследовании на породистых голубях уступала по антигенной активности образцам № 2 и № 3 по величине иммунного ответа на 1,2-1,9 log2, и через 35 сут после иммунизации концентрация антигемагглютининов в крови составляла (4,8±0,3) log2

2.3.3 Определение оптимального компонентного состава инактивированной вакцины против НБ для голубей. В зависимости от рекомендаций производителей

адъювантов, прописи компонентного состава инакгивированных вакцин могут варьировать по соотношению антигена и адъюванта в ту или иную сторону, поэтому на следующем этапе работы необходимо было определить оптимальный компонентный состав.

При изготовлении образцов вакцин количество антигена НБ во всех образцах было уравнено и составляло 30,0 весовых частей, соотношение адъюванта соответствовало рекомендациям производителей.

На основе адъюванта Montanide Gel 01 PR было приготовлено два образца вакцины с разньми весовыми соотношениями компонентов (Таблица 2). В образце № 1 антиген НБ смешивали с адъювантом в соотношении 20:80. В образце № 2 антиген НБ разбавляли физраствором в соотношении 30:50, после чего в данную смесь добавляли 20 частей адъюванта Montanide Gel 01 PR. В образцах № 3 и № 4 антиген НБ объединяли с адъювантами Montanide ISA 760 VG и Montanide ISA 763 A VG в весовом соотношении 30:70. Образец № 5 содержал антиген НБ и физраствор в весовом соотношении 30:70.

Изучение антигенных свойств вакцины проводили на шести группах серопозитивных к вирусу НБ диких беспородных голубей по пять особей в каждой. До иммунизации средний титр антител в группах составлял 2,8 - 3,7 log2. Птиц первых четырёх групп иммунизировали образцами вакцины в область груди в объёме 0,25 см3. Пятую группу прививали антигеном НБ, шестую не вакцинировали и оставляли контрольной группой. При исследовании проб более высокие концентрации антигемагглютининов в крови отмечались в группах, иммунизированных образцами на основе адъювантов Montanide Gel 01 PR и Montanide ISA 763 A VG (Таблица 2).

Таблица 2 - Антигенная активность образцов вакцины на основе различных адъювантов против НБ для голубей

Образец / Адъювант Адъювянт/ антвгев Сроки отбора сывороток крови, сут/ средний титр антител в 1о&

0 7 14 21 28 35 60 90 120

1 Montanide Gel 01 PR 20:80 2,8*0,4 11,8±0,9 14,0*0.3 13,8±0,6 12,6±0,3 10,6±0,4 12,5*0,3 9,4±1,1 8,0*1,5

2 Montanide Gel 01 PR + физраствор 20:50:30 2,8*0,6 9,4*1,7 10,4*1,6 lo.oii.ü 9,8*1,4 8,8±1,0 9,7±1,1 8,6*0,8 5,8*1,0

3 Montanide ISA 760 VG 70:30 3,2±0,4 10,6*1,6 10,611,2 9,4±1,0 9,<¡±1,0 9,6*1,3 8,4±0.9 7,4±0,7 7,4*0,6

4 Montanide ISA 763 VG 70:30 2,8*0,5 11,«±1.1 14,2*0,4 13,040,9 13,4±0,4 10,8*0,7 11,0*0,3 8,2*0,5 8,2*0.2

5 Физраствор + антиген НБ 70:30 3,7*0,3 8,0±2,0 8,7*2,4 8,0±1,1 7,4±1,7 6,4±0,9 7,6*1,7 6,7*1,2 3,6*1,2

6 Контроль - 2,8*03 2,8*0,3 2,8*0,3 3,1*0,3 2,4±0,7 2,8*0,3 2,6*0,5 2,6*0,2 1,6*0,2

Образец вакцины № 1, изготовленный на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR, через 14 сут стимулировал прирост титров специфических антител до (14,0±0,3) log2, через 60 сут - (12,5±0,3) log2. На 120-е сут исследований средний титр антител в данной группе составил (8,0±1,5) log2. Образец № 2, изготовленный на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR и антигена НБ в соотношении с физраствором (30:50), стимулировал иммунную систему птицы к выработке специфических антител на 14 сут исследований в среднем по группе до (10,4±1,6) log2, через 60 сут - (9,7±1,1) log2. При последующих исследованиях сывороток крови наблюдалось значительное снижение титра специфических антител до значения (5,8±1,0) log2 к 120 сут опыта.

Вакцина на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG (образец № 4) через 14 сут после иммунизации стимулировала прирост антител в группе до (14,2±0,4) log2, через 60 сут - (11,0±0,3) log2, через 120 сут - (8,2±0,2) log2. В группе голубей, иммунизированных образцом вакцины № 3 на основе масляного адъюванта Montanide ISA 760 VG, через 14 сут после прививки средний титр антител к вирусу НБ составлял (10,6±1,6) log2, через 60 сут - (8,4±0,9) log2 и на 120-е сут снизился до значения (7,4±0,6) log2.

Самые низкие титры специфических антител были в группе птиц, иммунизированных образцом № 5, не содержащим адъювант. Через 14 сут после вакцинации уровень специфических антител был максимальным и составлял (8,7+2,4) log2. Результаты серологических исследований, проведённых на 90-е и 120-е сут, свидетельствовали о снижении уровня антител в сыворотках крови до (3,6+1,2) log2.

На следующем этапе исследований образец вакцины на основе адъюванта Emulsidgen-D в весовом соотношении адъюванта к антигену НБ 60:40 сравнивали с образцами вакцины на основе адъювантов: Montanide Gel 01PR в весовом соотношении -20:80 и Montanide ISA 763 A VG - 70:30.

Для проведения опыта было сформировано пять групп по 10 голов в каждой серонегативных к вирусу НБ голубей. Образцами вакцин иммунизировали первые три группы. Четвертую группу прививали антигеном НБ, пятую не вакцинировали и оставляли контрольной группой. Иммунизацию проводили в грудную мышцу в прививной дозе 0,25 см3 и на протяжении 180 сут наблюдали за динамикой накопления специфических антител.

Полученные результаты, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что на протяжении 180 сут исследований образцы вакцины после однократной прививки обеспечивали продолжительный иммунный ответ у голубей. Во всех вакцинированных группах птиц титры антител на 21-е сут значительно превышали требуемый минимум

5 log2, а иммунный статус контрольной (невакцинированной) группы оставался на одинаковом уровне в течение всего срока наблюдения (180 сут).

Рисунок 3 - Динамика формирования и продолжительность иммунитета к НБ у голубей, привитых инактивированной вакциной с разными адъювантами

Средний титр антител в группе птиц, привитых образцом вакцины на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR, через 14 сут составлял 6,3 log2, через 28 сут определялся в диапазоне 12-13 log2. В группе птиц, иммунизированных образцами вакцин на основе адъювантов Montanide ISA 763 А VG и Emulsidgen-D, титр специфических антител через 28 сут составлял 8,4 log2 и 10,4 log2, соответственно. Через 42 сут у птиц во всех трёх группах концентрация антигемагглютининов в крови снижалась и определялась в диапазоне от 7,7 log2 до 8,7 log2. При серологическом исследовании сывороток крови через 4 и 6 мес. после иммунизации титр антител в опытных группах составлял от 4,7 log2 до 5,7 log2.

По результатам исследований установлено, что все три образца вакцины индуцировали у привитых птиц формирование высокого уровня гуморального иммунитета к вирусу НБ, наиболее антигенно-активным был образец вакцины на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR.

2.3.4 Изучение физических свойств образцов инактивированной вакцины против НБ для голубей, изготовленных на основе различных адъювантов

Важными критериями оценки эмульсионных вакцин являются стабильность, вязкость и гранулометрический состав эмульсии. Определение относительной вязкости и стабильности вакцинных эмульсий выполняли с использованием следующих методов: гранулометрического анализа, центрифугирования, экспресс-методом и тестом «быстрого старения».

Все результаты лабораторных исследований, представленные в таблице 3, были выполнены на основании методических рекомендаций ФГБУ «ВНИИЗЖ» (1,2).

—О—Moiiiiiiiide Gel Ol PR —fJJ— Einiilsi(Igeii-X> —•—Контроль

сроки отбора I

2 50 55 65 85 120 150 BIBOPOTOK крови, сут

—С*—MOHtaiiKlelSA "763 A VG - — Iltf.lK II!H||[><>Н:|НМ1.М1 Ulfriiri'H HE

. Таблица 3 - Физические свойства экспериментальных образцов вакцины против

НБ для голубей

Адъювант Стабильность Тип эмульсии Кинематическая вязкость, мм2/с

центрифугирование экспресс-метод «быстрое старение»

Montanide ISA 763 A VG А -2%. С-98% А -2% С-98% А -2% С-98% «вода-масло» 51,3

Montanide ISA 760 VG А-2% С - 98% А-4% С-96% А-4% С-94% Е-2% «вода-масло» 74,2

Emulsidgen-D н/и н/и н/и «масло-вода» 17,3

Montanide Gel 01 PR н/и н/и н/и н/и 15,0

Примечания: А - прозрачное масло в верхней фракции; С — нормальная эмульсия;

Е - водная фракция; н/и - не исследовали

Критерии оценки стабильности экспериментальных препаратов на основе адъювангов Montanide Gel 01 PR и Emulsidgen-D отличались от общепринятых методов, применяемых для эмульсионных биопрепаратов. Вакцину на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR, не являющуюся эмульсионной, и вакцину на основе адъюванта Emulsidgen-D с прямым типом эмульсии - «масло-вода» подвергали длительному хранению в течение 180 сут (период наблюдений) при температуре 2-8°С на предмет видимого разделения фаз, в том числе и водной (коалесценции), образования хлопьев, сгустков или плотного осадка на дне флаконов.

Хорошей стабильностью обладала эмульсия, полученная с использованием адъюванта Montanide ISA 763 A VG. Образец вакцины не отделял водную фазу, а расслоение на фракции в процентном соотношении не превышало допустимого значения. Также стабильным показал себя образец на основе адъюванта Montanide ISA 760 VG. Образец вакцины на основе адъюванта Emulsidgen-D отделял водную фазу с образованием хлопьев и плотного осадка на дне флаконов. Вакцина на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR в течение периода хранения не имела признаков нестабильности, указанных выше.

Относительная вязкость всех образцов была в допустимых значениях: от 15,0 до 74,2 мм2/с, однако наибольшей вязкостью обладала эмульсионная вакцина на основе адъюванта Montanide ISA 760 VG (74,2 мм2/с).

Гранулометрический анализ образцов вакцин показал, что эмульсия вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG являлась тонкодисперсной и гомогенной, поскольку средний диаметр частиц составлял 0,708 мкм и значение индекса гомогенности было равным 0,8. Вакцина, изготовленная на основе адъюванта

Emulsidgen-D, также имела тонкодисперсный и гомогенный состав, средний диаметр частиц составлял 0,677 мкм, а индекс гомогенности - 1,2. Образец вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 760 VG имел неоднородный гранулометрический состав и был представлен частицами нескольких семейств со средним диаметром 0,762 мкм и индексом гомогенности 2,4.

2.3.5 Обоснование прививного объёма и оценка реактогенных свойств образцов вакцины против НБ для голубей. Коммерческая доза инактивированных эмульсионных вакцин, в том числе и серийно выпускаемых в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для всех видов птиц, составляет 0,5 см3. С учётом экстерьерных особенностей и меньшей по сравнению с другими видами птиц массы тела голубя, необходимо было провести целенаправленные исследования по обоснованию прививного объёма, равного 0,25 см3.

Исследования проводили на семи группах серонегативных к вирусу НБ голубей породы «Воронежская» и «Курская» по пять гол. в каждой. В образце № 1 антиген НБ был разбавлен физраствором в соотношении 30:50, соответственно, после чего в данную смесь было добавлено 20 частей адъюванта Montanide Gel 01 PR. В образце № 2 антиген НБ объединяли с адъювантом Montanide ISA 763 A VG в соотношении 30:70 (по весу). Образец № 3 содержал антиген НБ и физраствор (рН 7,2) в соотношении 30:70 (по весу), соответственно.

Птиц в группах № 1, № 3 и № 5 иммунизировали в грудную мышцу образцами вакцин в прививном объёме 0,25 см3, а в группах № 2, № 4 и № 6 - по 0,5 см3. Голубей 7-й группы не прививали (контрольная группа).

Таблица 4 - Титр специфических антител к вирусу НБ после иммунизации экспериментальными образцами вакцины в разном прививном объёме

Образец № группы Адъювант Объём, см3 Титры антител в разные сроки после вакцинации, log

14 сут 28 сут 60 сут

1 1 Montanide Gel 01 PR (20:50:30) 0,25 6,1 7,9 7,4

2 Montanide Gel 01 PR (20:50:30) 0,5 6,6 8,2 7,6

2 3 Montanide ISA 763 A VG (30:70) 0,25 4,2 7,4 7,6

4 Montanide ISA 763 A VG (30:70) 0,5 4,6 7,9 7,9

3 5 Антиген НБ + физраствор (30:70) 0,25 2,4 3,8 2,8

6 Антиген НБ + физраствор (30:70) 0,5 3,2 4,0 3,25

7 Контроль - 0 0 0

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что при иммунизации голубей образцами инактивированной вакцины в объёмах 0,25 и 0,5 см3 существенных отличий в величине иммунного ответа не выявлено: разница составляла от 0,3 до 0,5 log2. После прививки через 60 сут концентрация антнгеммагглютининов в сыворотке крови в группах № 1 и 2 снизилась незначительно - на 0,5-0,6 log2, соответственно. В группах голубей, привитых образцом вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG, независимо от прививного объёма - 0,25 или 0,5 см3, концентрация антител к вирусу НБ значительно превышала защитный уровень и составила 7,6 и 7,9 log2, соответственно.

Результаты проведённых исследований свидетельствовали, что прививной объём - 0,25см3, независимо от используемого образца инактивированной вакцины, является достаточным для создания напряжённого иммунитета к вирусу НБ у голубей.

Изучение реактогенных свойств образцов инактивированной вакцины против НБ, изготовленных на основе различных адъювантов. Одним из наиболее критичных методов оценки выпускаемых биопрепаратов являются опыты по изучению безвредности вакцины. Сущность метода заключается в исследовании реакций организма на введение заведомо завышенных доз вакцины и адъюванта.

Для проведения исследований были использованы голуби пород «Курская» «Воронежская» в количестве 56 гол., серонегативных к вирусу НБ; образцы вакцин, изготовленные на основе адъювантов: Montanide ISA 763 А VG, Montanide ISA 760 VG в соотношении 70:30 (по весу) и Montanide Gel 01 PR в соотношении 20:30:50, а также образцы адъювантов, для чего было приготовлено 3 образца «плацебо», в которых антиген НБ был заменён физраствором в том же весовом объёме.

Экспериментальные образцы вакцины вводили в мышцу груди в объеме 0,5 см3 (2 кратная прививная доза). В течение периода наблюдения (21 сут) проводили ежедневный клинический осмотр привитых птиц и выборочное визуальное исследование мест введения вакцины. Через 21 сут осуществляли послеубойную оценку степени поражения тканей по критериям, предложенным Н. D. Stone (3). Места введения биопрепаратов осматривали на наличие некрозов, кровоизлияний, гранулём и прочих изменений.

В результате проведённого исследования (Таблица 5) по оценке местных тканевых реакций было установлено, что преимуществом обладал образец вакцины, изготовленный на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG. При исследовании тканей в области введения вакцин было определено отсутствие видимых

макроскопических поражений: кровоизлияний, отёков, гранулём и т.д., в четырёх случаях из восьми наблюдали лишь остатки инкапсулированной эмульсии. Образец «плацебо» на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG также не вызывал побочных тканевых реакций в местах инъекции, где можно было наблюдать лишь небольшие участки с инкапсулированной эмульсией.

Таблица 5 - Оценка местных тканевых реакций на введение образцов вакцины

против НБ для голубей

Образец № Адыо вант Прививной объём Отсутствие изменений Степень

лёгкая средняя тяжёлая

1 Montanide ISA 763 A VG + антиген НБ 0,5 см3 4/8 4/8 - -

2 Montanide ISA 763 A VG + физ раствор 5/8 3/8 - -

3 Montanide Gel 01 PR + антиген НБ 0,5 см3 4/8 2/8 2/8 -

4 Montanide Gel 01 PR + физраствор 4/8 2/8 2/8 -

5 Montanide ISA 760 VG + антиген НБ 0,5 см3 - - 2/8 6/8

6 Montanide ISA 760 VG + физраствор - - 4/8 4/8

7 Контроль (антиген НБ + физраствор) 0,5 см3 8/8 - - -

Среднюю степень поражения тканей наблюдали после введения образцов вакцины и «плацебо», изготовленных на основе адъюванта Montanide Gel 01 PR. Местные тканевые реакции характеризовались воспалительным процессом в подкожной клетчатке и присутствием остатков диффузно распределённой вакцины.

Выраженные поражения тканей регистрировали в результате применения вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 760 VG, во всех случаях наблюдалось образование обильных скоплений олеогранулём, сильные воспалительные реакции с отложениями фибрина и крупных инкапсуляций вакцинной эмульсии.

2.3.6 Изучение протективных свойств вакцины против НБ для голубей. Для

изучения протективных свойств препарата были проведены комиссионные испытания иммуногенной активности вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной. В исследованиях использовали экспериментальную вакцину против НБ для голубей инактивированную эмульсионную, серии № 1; 40 серонегативных к вирусу НБ голубей 35-суточного возраста породы «Курская». Контрольное заражение

проводили высоковирулентным вирусом НБ - штаммом NDV/Chicken/Amursky/1057/06 (генотип Vlld) и изолятом NDV/Pigeon/Kursk/02/13 (генотип VIb2), вьщеленным от голубя, павшего с клиническими признаками ньюкаслской болезни в Курской области.

Изучение антигенных свойств вакцины проводили на трёх группах голубей. Птиц первой группы в количестве 20 гол. иммунизировали однократно в область груди в дозе 0,25 см3; птиц второй группы в количестве 10 гол. — аналогичным образом, и ревакцинировали в возрасте 125-140 сут в дозе 0,25 см3. Голубей третьей группы в количестве 10 гол. не вакцинировали (отрицательный контроль).

С целью проведения контрольного заражения вирулентными вирусами НБ разных генетических линий, птиц первой группы разделили на подгруппы А и Б по 10 гол. в каждой, птиц из второй и третьей (контрольной) групп - на соответствующие подгруппы А и Б по 5 особей в каждой. Голубей подгрупп А заражали вирусом генотипа Vlld, подгрупп Б - VIb2. Заражение проводили в дозе 6,0 lg ЭИД5о/0,5см3 перорально, т.е. моделируя естественные условия заражения.

В результате эксперимента было установлено, что голуби, иммунизированные экспериментальной инактивированной вакциной против НБ, оставались клинически здоровыми в течение периода наблюдения (14 сут).

Вирулентные вирусы НБ генотипов VIb2 и Vlld вызывали заболевание и гибель птиц в невакцинированных группах, так, у птиц в контрольной группе № 3 А клиническое проявление болезни регистрировали с шести сут (угнетение, расстройство ЖКТ, парезы и параличи крыльев, «закручивание шеи»). На 7-8-е сут с клинической картиной НБ две головы пало, и у двух из трёх особей в группе наблюдали характерные клинические признаки НБ. В контрольной группе № 3 Б на 7-е сут после заражения с клинической картиной, характерной для НБ, один голубь пал, и у двух из остальных четырёх особей также наблюдали клинические признаки заболевания («закручивание шеи», паралич конечностей).

Таким образом, было установлено, что вакцина против НБ для голубей обладает выраженными протективными свойствами в отношении вирулентных вирусов НБ, относящихся к генотипам Vlld и Vft>2.

Результаты серологических исследований, представленных в таблице 6, указывают на прирост титров антител к вирусу НБ на величину от 1,25 log2 до 4,9 log2 через 14 сут после контрольного заражения. У выживших голубей контрольных групп сероконверсия на вирусы НБ генотипов VII и VIb2 составила (6,7±0,66) log2 и (7,75±1,0) log2, соответственно.

Таблица 6 - Выявление антител к вирусу НБ в сыворотках крови голубей после контрольного заражения

Группа/ подгруппа Штамм/ изолят Титр специфических антител в РТГА, 1оЙ2

перед КЗ 7 сут после КЗ 14 сут после КЗ

Группа №1 А 28 сут после вакцинации ИОУ/СЫскеп/ АтигекуЛ 057/06 6,2±0,49 8,0±0,54 11,1±0,55

Б ШУЛ^еоп/ Кигек/02/13 6,1 ±0,6 8,8±0,36 10,2±0,71

Группа №2 А 80 сут после 2-й вакцинации ЖУ/СЫскеп/ АтигекуЛ 057/06 7,5±0,96 7,75±1,1 8,75±1,31

Б НБУЛ^еоп/ Кигек/02/13 9,0±0,54 11,6±0,68 11,4±0,81

Группа №3 А Контроль ИБУ/СЫскеп/ Атигеку/! 057/06 0 0,8±0,70 6,7±0,66

Б КОУЛ^еоп/ Кигек/02/13 0 1,0±0,87 7,75±1,0

Примечание: КЗ - контрольное заражение.

23.1 Изучение условий и сроков хранения вакцины против НБ для голубей.

Изучение физических свойств вакцины проводили по следующим параметрам: кинематическая вязкость, стабильность эмульсии, тип вакцинной эмульсии. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Оценка физических свойств образцов вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной, хранившихся при температуре 2-8°С

Образцы вакцин Фракции вакцин Тест Кинематическая вязкость, ммг/с

центрифугирование экспресс-метод «быстрое старенне»

Свежеприготовленный А 1% 1% 1% 49,8

В н/о н/о н/о

С 99% 99% 99%

После 3 мес. хранения А 2% 1% 2% 54,6

В н/о н/о н/о

С 98% 99% 98%

После 6 мес. хранения А 2% 3% 2% 56,1

В н/о н/о н/о

С 98% 97% 98%

После 9 мес. хранения А 3% 3% 2% 56,4

В н/о н/о н/о

С 97% 97% 98%

После 12 мес. хранения А 4% 4% 3% 57,4

В н/о н/о н/о

С 96% 96% 97%

Примечания: А - прозрачное масло; С - нормальная эмульсия;

В- жидкая эмульсия; и/о — не обнаружено.

Параллельно с исследованиями по оценке физических свойств вакцины проводили изучение антигенной активности образцов при хранении в течение 12 мес. (Таблица 8). На каждом периоде испытаний (6, 12 мес.) серонегативных к вирусу НБ породистых голубей разделяли на две группы по 10 гол. в каждой. Опытную группу иммунизировали вакциной внутримышечно в область груди в объёме 0,25 см3. Для оценки антигенной активности вакцины до вакцинации и на 14, 21 и 28 сут после неё производили отбор проб крови для серологических исследований.

Таблица 8 - Антигенные свойства образцов вакцины против НБ для голубей инактнвироваиной эмульсионной, хранившихся при температуре 2-8°С

Образцы вакцины Группы птиц Титры антител к вирусу НБ в РТГА,

сроки отбора сывороток крови, сут

перед вакц. | 14 21 | 28

Свежеприготовленный привиты 0 | 4,2±0,3 5,1 ±0,4 | 6,8±0,5

контроль 0 | 0 0 | 0

После 6 мес. хранения привиты 0 ; 3,7±0,4 5,4±0,8 | 6,2±0,5

контроль 0 | 0 0 | 0

После 12 мес. хранения привиты 0 1 3,6±0,6 5,2±0,3 | 7,2±0,8

контроль 0 I 0 0 | 0

Данные таблицы 8 свидетельствуют о том, что в процессе хранения экспериментальных образцов вакцины снижение антигенной активности не происходило. Титр специфических антител к вирусу НБ в РТГА через 28 сут после иммунизации голубей составлял: (6,8±0,5) — после применения свежеприготовленного образца, (6,2±0,5) и (7,2±0,8) 1о§2— через 6 и 12 мес. хранения.

23.8 Доклинические комиссионные исследования вакцины против НБ для голубей. Согласно приказам директора ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») № 174 от 10.07.2013 г. и № 231 от 25.09.2013 г. были проведены доклинические комиссионные исследования вакцины против НБ для голубей.

При исследовании физико-химических и иммунобиологических свойств было установлено, что вакцина стабильна, безвредна и обладает выраженными антигенными свойствами (Таблица 9).

Заключительным этапом проведения доклинических комиссионных исследований являлся контроль иммунобиологических свойств вакцины. 30 серонегативных к вирусу НБ голубей были разделены на три группы по 10 гол. в каждой. Птиц 1-й группы прививали экспериментальной инактивированной вакциной внутримышечно в область груди в дозе 0,25 см3; птиц 2-й группы - живой вакциной из штамма «Ла-Сота», интраназально в дозе 6,7 ^ ЭИД5(/гол; птиц 3-й группы - одновременно вакциной

Таблица 9 - Иммунобиологические показатели вакцины против ньюкаслской болезни для голубей, серия № 2, дата выпуска 09.2013 г.

Наименование показателя Характеристика и нормы Оценка препарата

Внешний вид, цвет Эмульсия белого цвета. При хранении допускается незначительное расслоение эмульсии, однородность которой восстанавливается при интенсивном взбалтывании соответствует

Наличие посторонней примеси, трещин флаконов, нарушение укупорки и маркировки не допускается отсутствуют

Стерильность должна быть стерильна стерильна

Стабильность эмульсии: высота верхней прозрачной фракции, мм, не более 10 5

Вязкость, не более мм2/с 150 56,2 мм^/с

Полнота инактивации вирус должен быть полностью инактивирован вирус полностью инактивирован

Безвредность должна быть безвредна безвредна

Антигенная активность через 21 сут после иммунизации: - не менее чем у 80 % привитых голубей, титр антител в РГГА не ниже 1:32 (5 log2) РТГА от 1:128 до 1:1024; средний титр антител (8,1±0,28)

инактивированной и живой теми же способами и в тех же дозах. Непривитые цыплята в количестве 10 гол. составляли 4-ю контрольную группу.

Заражение высоковирулентным вирусом НБ проводили внутримышечно в дозе 6,0 ^ ЭИД5(/0,5см3 в следующие сроки после иммунизации: 1-й группы - на 28-е сут, 2-й - на 14-е сут, 3-й - на 14-е сут (Таблица 10).

Таблица 10 - Схема эксперимента

Группа Вакцина Метод вакцинации Контрольное заражение, сут после вакцпнашш

1 Вакцина против НБ для голубей, серия № 1, дата выпуска 04.2013 г. внутримышечно 0,25см3 на 28-е сут

2 Вакцина против НБ для голубей, серия № 1, дата выпуска 04.2013 г.; Вакцина против НБ из штамма «Ла-Сота» сухая живая, серия №9, дата выпуска 05.2013 г. внутримышечно 0,25см3; интраназально 6,7 lg ЭИД50/ГОЛ. на 14-е сут

3 Вакцина против НБ из штамма «Ла-Сота» сухая живая, серия № 9, дата выпуска 05.2013 г. интраназально 6,7 lg ЭИД50/ГОЛ. на 14-е сут

4 Контроль - на 14-е сут

В течение 14 сут после заражения (срок наблюдения) вакцинированные голуби всех трех групп оставались клинически здоровыми. В контрольной группе клиническое проявление симптомов НБ регистрировали через трое сут (угнетение, нарушение двигательной активности, запрокидывание головы, расстройство ЖКТ), и на 4-5-е сут с клинической картиной НБ 10 голов пало.

Результаты исследования сывороток крови голубей в РТГА до и после заражения показаны в таблице 11.

Таблица 11 - Динамика накопления антител к вирусу НБ после прививки вакцинами против НБ и после контрольного заражения

Группа Титры антител к вирусу НБ в РТГА (M±m), log2

сроки отбора сывороток крови, сут

до контрольного заражения после заражения

Д/в 7 14 21 28 7 14

1 0 1,9±0,3 3,6±0,5 6,3±0,5 7,4±0,6 7,6±0,4 8,2±0,6

2 0 1,6 ±0,5 4,2±0,6 * 4,2±0,59 5,2±0,5

3 0 2,1±0,5 2,8±0,3 * 5,2±0,63 7,0±0,7

4 0 0 0 0 0 0 0

Примечания: д/в - до вакцинации

* - контрольное заражение. В результате исследования было установлено, что сероконверсия на вирус контрольного заражения у голубей, привитых инактивированной вакциной, была незначительной и составила от 0-0,2 1о§2 на 7-е сут и от 0,6 до 1,0 - на 14-е сут. В случае использования только живой вакцины прирост титра антител составил на 7-е сут после контрольного заражения 2,4 а на 14-е - 4,2

По результатам исследований было сделано заключение, что вакцина против НБ для голубей обладает безвредностью, стабильностью, выраженной иммуногенной активностью и защищает птицу от гибели и клинического проявления заболевания при внутримышечном заражении велогенным штаммом вируса НБ. Также показано, что голуби хорошо переносят вакцинацию живой вакциной из штамма «Ла-Сота» при иммунизации одной куриной назальной дозой - 6,7 ^ ЭИД50/ГОЛ. Сочетанная схема вакцинации птиц с использованием инактивированной и живой вакцины является наиболее технологичной и может с положительным эффектом применяться для иммунизации голубей против НБ.

2.3.9 Сравнение иммунобиологических свойств вакцины против НБ для голубей с коммерческими аналогами в производственных условиях. Исследования проводили на 350 взрослых голубях породы «Курская» в Курской области, в ранее неблагополучном по НБ хозяйстве. Иммунобиологические свойства вакцины

оценивали по результатам исследований сывороток крови до и после иммунизации через 1,5 и 6 мес. (срок наблюдения) и по результатам сохранности птицепоголовья. Через 6 мес. после однократной иммунизации средний титр специфических антител по группе составлял (5,75±0,55) ^2, гибель птицы и клиническая картина НБ в группе привитых экспериментальной вакциной отсутствовала. Сохранность поголовья голубей в хозяйстве составила 98%.

Одновременно вакцину этой же серии испытывали на благополучной по НБ птиц голубятне во Владимирской области. В сравнительных производственных испытаниях были использованы ранее применявшиеся на голубятне препараты: вакцина «Сальмовир» против сальмонеллёза и парамиксовирусной инфекции голубей инактивированная эмульсионная (Словакия); вирусвакцина против НБ из штамма «ГАМ -61» сухая (Россия); вирусвакцина против НБ из штамма «Бор - 74 ВГНКИ» сухая (ООО «БиАгро» Россия).

Вакциной против НБ для голубей (ФГБУ «ВНИИЗЖ») было иммунизировано 140 гол. породистых голубей 35-40-суточного возраста, в прививном объёме 0,25 см3. Одну группу голубей иммунизировали вакциной против НБ для голубей инактивированной эмульсионной сочетанно с вирусвакциной против НБ из штамма «ГАМ-61» сухой.

Таблица 12-Сравнительная оценка антигенной активности вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной с коммерческими

препаратами

Группа № Вакцины Доза, способ прививки Средний титр антител в РТГА , logj

д/в через 1,5 мес. через 3,0 мес.

1 - вакцина против НБ для голубей, сер № 1 (ФГБУ «ВНИИЗЖ») 0,25см3 внутримышечно 2,6±0,5 6,5±0,65 7,6±0,84

2 - вакцина против НБ для голубей, сер № 1 (ФГБУ «ВНИИЗЖ») - вирусвакцина против НБ из штамма «ГАМ-61» сухая 0,25см^ внутримышечно интраназально 6,7 lg ЭИД5о/гол. 1,8±0,7 7,5±0,56 8,4±0,7

3 - вирусвакцина против НБ из штамма «ГАМ-61» сухая интраназально 6,7 lg ЭИД50/гол 2,6±0,5 1,2±0,27 *

4 вакцина «Сальмовир» (Словакия) 0,3 cmj подкожно 1,4±0,7 1,8±0,5 *

5 - вирусвакцина против НБ из штамма «Бор - 74 ВГНКИ» интраназально 6,7 lg ЭЩЬо/гол. 1,4±0,7 5,39±0,6

Примечания: - титры антител к вирусу НБ в РТГА, log2 (M±m);

* - внеплановая ревакцинация птицы вакциной против НБ для голубей инактивированной эмульсионной (серия № 2, 09.2013 выпуска).

В результате проведённых исследований (Таблица 12) было установлено, что по антигенной активности вакцина против КБ для голубей инакгивированная эмульсионная превосходит коммерческие препараты, используемые для профилактики данной инфекции. В группе, где применялась вакцина производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», через 1,5 мес. после иммунизации средний титр специфических антител составлял (6,5±0,65) log2, через 3 мес. - (7,6±0,84) log2. В группе птиц после сочетанной прививки живой и экспериментальной инактивированной вакциной уровень антител в сыворотках крови голубей через 1,5 мес. составлял (7,5±0,56) log2, а через 3 мес. - (8,4±0,7) log2. В группе птиц после иммунизации вирусвакциной против НБ из штамма «Бор - 74 ВГНКИ» через 1,5 мес. концентрация антигеммагглютининов составляла (5,39±0,6) log2. Величина иммунного ответа на живую вакцину из штамма «ГАМ-61» и на инактивированную вакцину «Сальмовир» была недостаточной для защиты поголовья.

Таким образом, проведённые сравнительные испытания показали, что вакцина против НБ для голубей обладает выраженной антигенной активностью, не уступает коммерческим аналогам и в дальнейшем может быть рекомендована для профилактики данного заболевания.

3 Выводы

1. По результатам испытаний образцов эмульсий и гелевых композиций на основе пяти адъювантов установлено, что наиболее выраженный иммунный ответ у голубей при умеренной реактогенности обеспечила вакцина на основе адъюванта Montanide ISA 763 A VG.

2. Определены наиболее важные физические показатели вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной: вязкость - 56,2 мм2/с, средний диаметр частиц - 0,708 мкм, тип вакцинной эмульсии - «вода-масло». Показана стабильность эмульсии в тестах с использованием центрифугирования и экспресс-метода «быстрого старения».

3. Установлен оптимальный прививной объём - 0,25 см3, при котором у голубей, привитых подкожно или внутримышечным способом, формируется выраженный иммунный ответ. Подтверждена безвредность препарата в указанной дозировке и двойном прививном объёме.

4. Установлено, что вакцина против НБ для голубей инактивированная эмульсионная после однократной прививки серонегативных птиц индуцирует выработку антител к вирусу НБ в титрах > 6 log2 на 21-е сут. Продолжительность поствакцинального иммунитета составляет не менее 6 мес.

5. Показано, что вакцина против НБ для голубей инактивированная эмульсионная через 28 сут после введения обеспечивает защиту привитых птиц от

клинического проявления болезни и гибели при энтеральном и внутримышечном заражении вирулентными вирусами НБ: штаммом генотипа Vlld и изолятом генотипа VIb2.

6. Срок хранения инактивированной эмульсионной вакцины при температуре 2-8°С составляет не менее 12 мес.

7. В сравнительных испытаниях вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной с коммерческим аналогом («Сальмовир») в производственных условиях установлено, что препарат производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» безвреден для птицы, обладает выраженными иммуногенными свойствами и не уступает аналогу по эффективности.

8. С целью обеспечения надёжной защиты голубей от НБ для широкой практики предлагается совместная вакцинация молодняка голубей в возрасте 30-35 сут инактивированной эмульсионной и живой вакциной из штамма «Ла-Сота», с последующей ревакцинацией через каждые 6 мес.

9. Успешно проведены комиссионные доклинические и широкие производственные испытания разработанной вакцины в ряде частных голубеводческих хозяйств на породистых голубях. Подготовлен комплект НД на вакцину против НБ для голубей инактивированную эмульсионную.

4 Практические предложения

Результаты научных исследований явились основой для нормативно-технической документации на вакцину против ньюкаслской болезни для голубей:

- «Стандарт организации на вакцину против НБ для голубей инактивированную эмульсионную (СТО 00495527-0208-2014).

«Инструкция по применению вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной».

- «Промышленный регламент на производство вакцины против НБ для голубей инактивированной эмульсионной».

5 Список литературы

1. Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин / Д. Л. Долгов, В. В. Борисов, С. В. Фролов; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2007. - 11 с.

2. Методика определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии "вода-масло" / Д.А. Лозовой, Д.Л. Долгов, В.В. Борисов; ФГУ «ВНИИЗЖ». -Владимир, 2005. - 12 с.

3. Stone H.D. Newcastle disease oil emulsion vaccines prepared with animal, vegetable, and synthetic oils // Avian Diseases. - 1997. - Vol. 41. - P. 591-597.

6 Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Спиридонов, А.Н. Оценка сероконверсии вируса ньюкаслской болезни в популяции синантропных голубей / А.Н. Спиридонов, Т.Б. Манин // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. - С. 47-48.

2. Спиридонов, А.Н. Современные методы вакцинопрофилактики ньюкаслской болезни у голубей = Current techniques of vaccinal prevention of Newcastle disease in pigeons / A.H. Спиридонов, B.H. Ирза, A.M. Евсеев // Ветеринария сегодня. - 2012. - № 2. - С. 17-21.

3. Спиридонов, А.Н. Оценка эффективности адъювантов фирмы "SEPPIC" в составе инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни для голубей / А.Н. Спиридонов, Д.Л. Долгов, Т.Б. Манин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 78-86.

4. Роль адъювантов в разработке эффективных и безопасных вакцин для птиц / J.B. Arous, L. Dupuis, А. Спиридонов, Р. Яшин // Ветеринария сегодня. - 2013. - № 1(4). -С. 11-16.

5. Изучение антигенной активности и реактогенных свойств образцов вакцины против ньюкаслской болезни для голубей, разработанных на основе адъювантов фирмы "SEPPIC" / А.Н. Спиридонов, Д.Л. Долгов, В.Н. Ирза, Р.В. Яшин // Ветеринария и кормление. - 2013. - № 5. - С. 49-51.

6. Иммунибиологические свойства инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни для голубей / А.Н. Спиридонов, П.И. Репин, В.Н. Ирза, И.А. Чвала, Д.Л. Долгов // Ветеринария. - 2014. - № 7. - С. 28-32.

7 Список сокращений и условных обозначений АЭЭИ - аминоэтилэтиленимин КЭ - куриные эмбрионы НБ - ньюкаслская болезнь РГА - реакция гемагглютинации РТГА - реакция торможения гемагглютинации СПФ - свободные от патогенной флоры ЭИД50/СМ3 - 50% эмбриональная инфекционная доза ЭЭЖ - экстраэмбриональная жидкость

Подписано в печать 08.10.2014 г. Форма 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животньгх» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)