Технологические этапы изготовления культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц

Гетман, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технологические этапы изготовления культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технологические этапы изготовления культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц"

На правах рукописи УДК 619:576.852.17-615.371

Гетман Елена Владимировна

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ЭТАПЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Щёлково-2000

Работа выполнена в отделе разработки способов промышленного культивирования клеток и вирусов Всероссийского научно-

I И

исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН, в ООО "БИОТА", в агрофирме "Николаевская" Саратовской области.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук

Б.В.СОЛОВЬЁВ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Э.Ф.ТОКАРИК;

кандидат биологических наук Ю.В.ЗУЕВ.

Ведущая организация: Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Защита диссертации состоится 15 декабря 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К120.17.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, п/о Кашинцево, Московская область, Щёлковский район, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан_ноября 2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Ю.Д.ФРОЛОВ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важнейшим условием успешного ведения промышленного птицеводства является надёжное благополучие стада по инфекционным заболеваниям. Борьба с вирусными заболеваниями приобретает всё возрастающую актуальность в связи с тем, что некоторые инфекции стали протекать атипично и ассоциироваться с различными факторами вирусной и бактериальной природы. В ряду инфекционных заболеваний птиц особое место занимает инфекционная бур-сальная болезнь (ИББ), что обусловлено рядом характерных особенностей как возбудителя, так и заболевания: устойчивость вируса во внешней среде, возможность субклинического течения болезни, наличие выраженного иммунодепрессивного влияния вируса.

До применения средств специфической профилактики годовой ущерб от ИББ исчислялся десятками миллионов долларов (США, Австралия). Кроме прямых экономических, похерь .1 данное заболевание представляет серьёзную опасность из-за иммунодепрессивного воздействия вируса, избирательно поражающего один из центральных органов иммунной системы птиц - бурсу Фабрициуса (Lukert P.D. 1975; Mazariegos L.A. 1990). Организм такой птицы не в состоянии дать ожидаемый иммунный ответ на введение вакцин против болезни Ньюкасла, инфекционного бронхита, болезни Марека и других (Auti М.М.1987; Nagi S.A. 1983; Mcllroy S.G.et al, 1989; Abou-Zeid A.-Z.A.,1995). К серьёзным экономическим потерям также приводит проявление на фоне ИББ вторичных инфекций: дерматита, гепатита, некротического энте-

рита, кокцидиоза, "синдрома расстройства всасывания кишечника" (Lamas J.H.,1990; Georgieva М.,1989; Kikuchi S.et al.,1998).

В настоящее время ИББ (болезнь Гамборо) зарегистрирована во всех странах мира, по актуальности занимает одно из первых мест в инфекционной патологии птицы и считается для стран с развитым промышленным птицеводством одной из наиболее трудноликвидируемых эпизоотии.

Вакцинопрофилактика ИББ стала неотъемлемой частью технологии ведения птицеводства. В связи с повторяющимися вспышками этого заболевания, вызываемыми новыми высоковирулентными штаммами возбудителя, в т. ч. на фоне мер вакцинопрофилактики, учёными и ветеринарными специалистами постоянно ведётся работа по усовершенствованию вакцин, технологий их изготовления, а также схем и методов специфической профилактики ИББ.

До 1992 года жесткое выполнение ветеринарно-санитарных правил, управление хозяйственными связями, а также применение средств специфической профилактики ИББ, главным образом зарубежного производства, позволяло контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции в России.

Однако, начиная с 1992 года, эпизоотическая ситуация во всём мире по ИББ резко осложнилась. Причиной сложившейся ситуации как отечественные, так и зарубежные учёные называют появление высокопатогенных штаммов вируса ИББ, недостаточную эффективность отдельных серий вакцины из-за неправильного хранения или разведения, а также использование для приготовления вакцины штаммов вируса с низкой инфекционной и иммуногенной активностью. Эти факторы

приводят к большим экономическим потерям в результате переболева-ния и массовой гибели птицы в возрасте от 21 до 45дней (Äther М.А.1993; Abdu Р.А.1988; Box P. 1989)

В настоящее время в птицехозяйствах РФ для профилактики ИББ используют отечественные вакцины из штамма "БГ" или штамма "Винтерфильд 2512" (Winterfeald 2512).

Для нас представляло научно-практический интерес изучить возможность получения вакцины против ИББ из вируса, репродуцированного в культуре фибробластов эмбрионов кур и перепелов.

Известно, что высокоэффективными, безвредными и экономически выгодными могут быть препараты, приготовленные с использованием современных промышленных технологий, методов стандартизации и контроля отдельных производственных стадий, сырья и готовой продукции.

В связи с вышесказанным, вопросы отработки этапов изготовления вакцины против ИББ (штамм «Био-92») и изучение биологической активности вакцины являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка технологических этапов изготовления вакцины против ИББ из нового штамма-изолята «Био-92».

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Изучить культурально-биологические свойства штамма "Био-92" вируса ИББ:

- чувствительность клеточных культур к вирусу;

- влияние возраста клеточных культур на репродукцию вируса;

- влияние сыворотки КРС на репродукцию вируса;

- условия титрования вируса ИББ в культуре клеток.

2. Разработать технологические приёмы получения и консервирования внеклеточного вируса ИББ (штамм "Био-92"):

- подобрать эффективный метод отделения инфицированных клеток от стекла;

- отработать ультразвуковой режим выделения вируса ИББ из инфицированных культур клеток перепелиных эмбрионов;

- определить условия консервирования и хранения вируса ИББ.

3. Изготовить и испытать опытные серии сухой вакцины против ИББ в лабораторных условиях и в птицехозяйстве:

- изучить иммуногенность сухой вирусвакцины из штамма "Био-92" при различных методах вакцинации БРР-цыплят в лабораторных условиях;

- провести анализ иммунного статуса суточных цыплят в птице-хозяйстве и определить динамику снижения уровня материнских антител для обоснования и выбора схемы вакцинации;

- определить эффективность вакцины против ИББ в условиях птицехозяйства.

Научная новизна. Разработаны технологические этапы изготовления вакцины против ИББ из штамма "Био-92". Определены условия репродукции, титрования и стабилизации внеклеточного вируса ИББ (штамм "Био-92").

Показано, что вирус ИББ (штамм "Био-92") репродуцируется в культуре фибробластов эмбрионов кур и перепелов, уровень его накопления в клетках позволяет получать вируссодержащие препараты с титром вируса 7,0-8,0 ^ТЦЦзо/см3.

Подобрана наиболее подходящая защитная среда, позволяющая избежать снижения биологического титра вируса ИББ (штамм "Био-92") в процессе лиофильного высушивания и хранения сухого препарата.

Разработана методика сбора и ультразвуковой дезинтеграции инфицированных культур клеток, обеспечивающая максимальный выход внеклеточного вируса.

Определено влияние различных разбавителей на сохранность инфекционного тигра вирусвакцины после разведения и рекомендован разбавитель для практического использования.

Показано отрицательное влияние сыворотки крупного рогатого, скота в составе культуральных питательных сред на проявление цито-патического действия вируса ИББ (штамм «Био-92»), Отработан способ снижения негативного влияния сывороточных ингибиторов, дающий возможность получить максимальный урожай вируса.

Установлена безвредность и высокая иммуногенность вакцины при внутримышечном, интраназальном введении и выпойке в дозе 10000 ТЦД50/см3 для коммерческих и БРР-цыплят суточного возраста.

Практическая ценность работы. Полученные результаты явились основой для разработки нормативной документации на производство, контроль и применение вакцины "БИОТА-Гамб" из штамма "Био-92".

Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии МСХ

РФ:

- Технические условия ТУ 9384.003-00008064-00 "Вирусвакцина "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)";

- "Временное наставление по применению вирусвакцины "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)".

В условиях птицехозяйства агрофирмы "Николаевская" показана более высокая эффективность иммунопрофилактики вакциной "БИОТА-Гамб" из штамма "Био-92" по сравнению с вакцинами из штамма "БГ" и "Винтерфильд 2512".

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на:

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина (1998 г.);

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП (2000г.);

- на межлабораторном заседании сотрудников ВНИТИБП (2000г.).

Объём и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и приложение. В списке литературы 257 источников, из них иностранных. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 3 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

В работе использовали вакцинный штамм-изолят вируса инфекционной бурсальной болезни "Био-92". Штамм поддерживается во ВНИТИБП и ООО «БИОТА» путем перемежающихся пассажей вируса на 6-10-дневных куриных 5РР-эмбрионах, культурах фибробластов перепелиных (ФЭП) и куриных БРР-эмбрионов (ФЭК). В настоящее время штамм паспортизирован и проходит комиссионные испытания в ВГНКИ с целью последующего депонирования в качестве производственного штамма.

В отдельных опытах была использована сухая вакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма "БГ" и "Винтерфильд 2512" производства ВНИИЗЖ. В опытах использовали 6-11-дневные эмбрионы, полученные путем инкубации яиц БРБ-кур породы белый леггорн (Ьотапп); БРР-цыплят, выведенных из яиц фирмы "Ьотапп", 8-9-дневные эмбрионы перепелов мясной линии ФГУП "Щелковский биокомбинат". Для промышленных испытаний и оценки иммуногенно-сти вакцины использовали цыплят-бройлеров кросс "АНАК-2000".

Размножение и титрование вируса проводили в первично-трипсинизированных культурах клеток 8-9-дневных перепелиных и культурах клеток 9-10-дневных куриных 8РР-эмбрионов. Трипсиниза-цию тканей эмбрионов и приготовление клеточных культур проводили по общепринятым методикам.

Клеточные культуры и вирус выращивали в стационарных условиях во флаконах вместимостью 50 см3 и 1,5 дм3 или в пробирках, с площадью ростовой поверхности соответственно 20 см2, 300 см2 и 2

см2. Температуру инкубации нормальных и заражённых клеточных культур поддерживали в пределах 37-38°С

Для выращивания клеток использовали среду Игла, среду 199 производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (г. Москва), гидролизат лактальбумина («Дифко», США), сыворотку крупного рогатого скота (КРС) производства Конотопского и Омского мясокомбинатов.

В качестве ростовой и поддерживающей сред использовали смесь равных объемов среды Игла и 0,5%-ного гидролизата лактальбумина на солевом растворе Хенкса (ГЛАХ), к которой добавляли сыворотку КРС соответственно до концентрации 10% и 1,5%. При лабораторном культивировании применяли в качестве ростовой и поддерживающей среды смесь сред 199 и Игла (1:2), с добавлением соответственно 5% и 1,5 % сыворотки КРС. Значения рН ростовой и поддерживающей сред были 7,1-7,4 и 7,4-7,6, соответственно. В культуральные среды добавляли пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин -100 мкг/мл.

Для обработки и трипсинизации тканей эмбрионов использовали солевой раствор Хенкса и 0,25%-ный раствор трипсина («Дифко», США). Для ополаскивания клеточных культур применяли фосфатно-солевой буферный раствор (7,0-7,2).

В качестве защитных сред использовали сахарозо-желатозную среду, содержащую 7% сахарозы и желатин в желатозной форме, среду СФГА (рН 6,9-7,2) .

Для разведения вируса использовали пептонный разбавитель ВНИТИБП (а.с. № 563175, 1974), также рабочий раствор концентрата разбавителя для противовирусных вакцин, применяемых в птицеводст-

ве (ТУ 9384-001-93840700-00) и фосфатно-солевой забуференный раствор (рН 7,0-7,2). Приготовление сред, растворов и разбавителей проводили совместно с канд. тех. наук В.В. Бронниковой.

Для выделения вируса ИББ из клеток инфицированную клеточную культуру снимали с поверхности стекла механически или криоме-тодом и разрушали на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1. Степень разрушения клеток контролировали путём микроскопии мазков.

Высушивание вируссодержащих материалов проводили в лаборатории консервирования биопрепаратов ВНИТИБП совместно с канд. тех. наук А.А. Нежутой на сублимационной установке «Юзифруа» (Франция). Массовая доля влаги сухих образцов вируса была в пределах 1,0-3,0 %.

Стабильность вируса ИББ определяли титрованием в 24-часовой культуре ФЭК или ФЭП. Сравнивали инфекционную активность образцов вируса до и после проведения испытаний.

Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации Аш-марина по формуле:

\ё ТЦДо/см3 = ^ - 8 - 0,5), где

- минимальное разведение, при котором наблюдается 100%-ный эффект; 8 - логарифм кратности разведения; У-сумма значений всех испытанных доз; Ь, -отношение числа культур клеток, давших положительную реакцию от заражения данной дозой к общему числу культур клеток, заражённых этой дозой; 0,5 - постоянная величина.

Для оценки материнского и поствакцинального иммунитета использовали реакцию нейтрализации (РН). Постановку РН осуществляли на первично-трипсинизированной культуре ФЭК или ФЭП по обще-

принятой методике с двукратным разведением исследуемых сывороток и постоянной дозой вируса ИББ штамм «Био-92» (100 ТЦД 50)-

Эффективность вакцинации рассчитывали по формуле: А-В

Э=- -100%, где

■ А

Э - эффективность вакцинации, %; А - число случаев ИББ в контрольной группе, .%; В - число случаев ИББ в опытной группе, %.

Статистическую обработку результатов проводили, используя учебное пособие Г.Ф. Лакина «Биометрия» (1980 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВИРУСА ИББ Изучение чувствительности клеточных культур ФЭК и ФЭП к вирусу ИББ

В отечественной и зарубежной практике особое место в системе культивирования вирусов занимает культура фибробластов эмбрионов перепелов. Это связано с хорошо известной устойчивостью японских перепелов к различным птичьим инфекциям, что в определённой мере уменьшает риск эндогенной контаминации выращиваемых вирусов патогенными микроорганизмами. Основываясь на этих данных, мы провели сравнительное изучение чувствительности к вирусу ИББ первичных культур ФЭК и ФЭП. При одинаковых условиях культивирования вирус ИББ накапливался в культурах ФЭК и ФЭП в одинаковой степе-

ни. Урожай вируса достигал 6,0-6.5^ lgTLЩ5o/cм ростовой поверхности.

При статистической обработке полученных данных достоверных различий по накоплению вируса в этих клеточных культурах установить не удалось. Поэтому, дальнейшие исследования проводили с использованием культуры ФЭП.

Влияние возраста культуры клеток на репродукцию вируса ИББ (штамм "Био-92")

Динамику накопления вируса в культурах ФЭП разного возраста изучали путём титрования проб, отобранных через каждые 24 часа после заражения 1, 2 и 3-суточной культуры ФЭП, в течение 7 дней выращивания заражённых клеточных культур (рис. 1).

Вирус ИББ в наибольшем титре накапливался на 5-е сутки при заражении суточной культуры клеток.(7,25 ^ТЦДо/см3). Тогда как в 2 и 3-суточных культурах накопление вируса на 5-е сутки культивирования было меньше на 1,0 и 1,51§, соответственно. Титр вируса в 2 и 3-суточных культурах был ниже, чем в 1-суточной культуре уже через 2-е :уток культивирования инфицированных клеток, а различие в титре вируса составило 0,5

0 1 2 3 4 5 6 7

Возраст культур ФЭП ( сутки)

Рис. 1. Зависимость титров и динамика накопления вируса ИБ1 от возраста зараженных культур ФЭП

1 - суточная культура ФЭП;

2 - двухсуточная культура ФЭП;

3 - трехсуточная культура ФЭП.

Подбор сред для серийного разведения, обеспечивающих стандартные результаты титрования

В качестве сред для серийных разведений вируса были испытан: среды СФГА, Игла и 199. Титр вируса при серийном разведении в ср< де Игла и СФГА был значительно выше, чем при серийном разведени

в среде 199 (р<0,05, р<0,01), при использовании которой титр вируса снижался на 0,5 ^ ТЦЦ5о/см3. Таким образом, для получения наиболее стандартных результатов при титровании вируса ИББ (штамм "Био-92") целесообразнее использовать среду СФГА или Игла.

Для оценки воспроизводимости результатов титрования внеклеточного вируса использовали в качестве стандартного препарата опытную серию сухой вакцины, изготовленную 11.06.99 и хранившуюся при минус 38-40°С. Вирус этой серии титровали в течение года на 10 различных партиях суточных культур клеток ФЭП, с использованием для серийных разведений среды Игла. Учёт результатов проводили на 5-е сутки после заражения клеточных культур.

На основании обработанных данных 10 титровании вируса определена ошибка воспроизводимости (коэффициент вариации) результатов титрования. Для этого рассчитывали среднее квадратическое отклонение. Оно равно 0,337 ТЦЦ_<о/см3. Коэффициент вариации составил 20,57%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости результатов.

На основании результатов, изложенных в настоящем разделе, мы рекомендуем для титрования внеклеточного вируса ИББ (штамм "Био-92") использовать суточную культуру ФЭК или ФЭП, серийные разведения готовить на среде Игла. Эти условия позволяли получать гарантированно воспроизводимые результаты.

Влияние сыворотки КРС на репродукцию вируса ИББ в культуре клеток

Сыворотка крови является важной составной частью большинства ростовых и поддерживающих сред, используемых для культивирования клеток и вирусов. Отдельные компоненты сыворотки КРС являются супрессорами, подавляющими репродукцию вируса ИББ в культуре клеток. (ОаьНа1 У и, е1 а1.,1986). Была проведена сравнительная оценка степени репродукции вируса ИББ в зависимости от: 1) сред и растворов, используемых для предварительной обработки культуры ФЭК перед адсорбцией вируса; 2) концентрации сыворотки КРС в поддерживающей среде, а также влияние инактивации сыворотки перед её использованием в составе поддерживающей среды.

Нам удалось показать, что сыворотка КРС существенно влияет на проявление цитопатического действия и накопление вируса в культуре клеток. Для ополаскивания клеточного слоя, с целью снижения супрессорных свойств оставшейся после культивирования ФЭК сыворотки, использовали фосфатно-солевой буферный раствор, среду Игла и 199. Часть клеточных культур не ополаскивали, а другую дополнительно обрабатывали сывороткой КРС. В результате такой обработки сывороткой отмечено полное блокирование репродукции вируса в культуре клеток. В то же время в культурах ФЭП, предварительно отмытых от сыворотки, наблюдали хорошо выраженные цитопатические изменения.

Максимальный титр инфекционной активности (7,5 ^ ТЦЦзо/см3) вируса ИББ отмечен в культуре ФЭК, предварительно об-

работанной средой Игла. При отмывании культур ФЭК фосфатно-солевым буферным раствором и средой 199 вирус ИББ накапливался в 2-10 раз и в 2-3 раза ниже, соответственно. Результаты дальнейших исследований показали, что выход вируса был максимальным при содержании 1,5% сыворотки в поддерживающей среде (7,5 ^ТЦЦу/см3); с увеличением концентрации сыворотки (2 и 5%) выход вируса снижался на 0,5 и 11g, соответственно. Уменьшение концентрации сыворотки до 1% отрицательно сказывалось на качестве клеточных культур и накоплении вируса (снижение выхода вируса на 0,251g) . С целью устранения ингибирующих свойств сыворотки КРС были проведены эксперименты по использованию в поддерживающей среде инактивированной сыворотки. Сыворотку инактивировали при 56°С 30 мин. Инактивирован-ную сывор.отку КРС вводили в состав поддерживающей среды также в концентрации 1.5%.- . _

Использование инактивированной сыворотки КРС в составе поддерживающей среды позволило увеличить "урожай" вируса ИББ на 0,25 ^ТЦЦ50/см3, то есть примерно в 2 раза.

Проведённые исследования .позволили отработать метод предварительной (перед внесением вирусного материала для заражения клеточной культуры) обработки клеточной культуры, установить оптимальную концентрацию сыворотки КРС в поддерживающей среде (1,5%) и возможность использования инактивированной сыворотки КРС. Использование разработанных методических приёмов значительно повышает выход вируса ИББ в культурах клеток ФЭП и ФЭК.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЁМОВ ПОЛУЧЕНИЯ И КОНСЕРВИРОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ВИРУСА ИББ Отработка методики отделения инфицированных клеток от стекла При традиционных методах культивирования цитопатогенные

вирусы накапливаются, как правило, в культуральной среде в результате специфической деструкции клеток. При выращивании в культуре клеток вирус ИББ, репродуцируясь, выходит в поддерживающую среду, но накапливается там в титре не более 5 ^ ТЦДзо/см3. Поэтому для получения вируссодержащего материала, пригодного для изготовления вакцины с высоким титром, необходимо было выделять вирус непосредственно из клеток. С целью отработки условий выделения внеклеточного вируса ИББ сравнивали два метода отделения инфицированных клеток от стекла: криометод (замораживание-оттаивание) и механический метод (соскабливание инфицированных клеток со стекла скребком). Исследования проводили с использованием одних и тех же партий культуры ФЭП. 24-часовую культуру ФЭП заражали суспензией вируса ИББ, через 72-96 часов в одной половине культуральных сосудов инфицированные клетки снимали криообработкой, в другой - механически.

В результате установлено, что при механическом съёме инфицированных клеток выход вируса был в 3-5,5 раза больше, чем п|эи съёме криометодом. Учитывая эти результаты, в дальнейших исследованиях использовали механический метод отделения клеток от стекла.

Отработка режимов ультразвуковой дезинтеграции клеток, инфицированных вирусом ИББ

Для разрушения клеток использовали один из современных методов, позволяющий получить большой выход внеклеточного вируса -метод ультразвуковой дезинтеграции. Взвеси инфицированных клеток объёмом 150-350 см" подвергали воздействию ультразвука при частотах 22 и 35 Кгц, интенсивности ультразвука 0,25-0,6 ватт/см3, в течение 30-240 сек. В связи с тем, что процесс ультразвуковой дезинтеграции клеток сопровождался повышением температуры обрабатываемых суспензий, вируссодержащие образцы помещали в тающий лёд на весь период ультразвукового воздействия. Ультразвуковую обработку инфицированных клеток проводили с паузами для охлаждения: после 5-10 сек ультразвуковой обработки следовал 10-15-секундный перерыв.

Установлено, что полное освобождение вируса из инфицированных клеток в процессе их ультразвуковой обработки при плотности ультразвука 0,25-0,6 ватт/см3 происходило через 60-90 сек и не зависело от частоты ультразвуковых колебаний. Выход вируса ИББ зависел от времени воздействия, объёма обрабатываемых за один цикл клеточных взвесей и плотности ультразвуковых колебаний.

При ультразвуковой обработке 150 см3 взвеси инфицированных клеток в течение 60 сек, с плотностью ультразвуковых колебаний 0,6 ватт/см3, удавалось получать максимальный выход внеклеточного вируса (7,5^ ТЦД50 /см3), тогда как при обработке 350 см3 максимальный выход вируса отмечали только через 90 сек. В эти же сроки при микроскопии мазков взвесей наблюдали полную деструкцию клеток.

На основании полученных'результатов определён режим ультразвуковой дезинтеграции инфицированных культур клеток на дисперга-торе УЗДН-1: частота 22 или 35 Кгц, объём клеточной суспензии 150350 см3, плотность ультразвука 0,6-0,25 ватт/см3, продолжительность обработки 60-90 сек, соответственно (после каждого 10 сек ультразвукового воздействия - 10-секундный перерыв для охлаждения материала).

Стабильность вируса ИББ при высушивании, хранении и растворении перед использованием вакцины

В процессе работы по подбору наиболее эффективной защитной среды для суспендирования, лиофилизации и хранения вируса ИББ использовали среду СФГА и сахарозо-желатозную среду, а в качестве контроля - фосфатно-солевой буферный раствор.

Защитные среды СФГА и сахарозо-желатозная обеспечивали полную(сохранность инфекционной активности вируса ИББ при лиофилизации. Во всех контрольных образцах без стабилизатора титр инфекционной активности вируса снижался на 0,25-1,0 ТЦЕЦо/см3. Поскольку защитные среды СФГА и сахарозо-желатозная обладают примерно одинаковым стабилизирующим эффектом рекомендовано использовать обе эти среды для изготовления сухой вакцины против ИББ "БИОТА-Гамб".

Образцы сухих вирусвакцин, изготовленных в лабораторных условиях, исследовали на стабильность инфекционности в процессе хранения при различной температуре: минус 38-40°С, минус 4-10°С, 4-6°С, 18-25°С. Установлено, что инфекционная активность вируса, вы-

сушенного в СФГА и сахарозо-желатозной среде при температуре хранения минус 38-40°С, минус 4-10с'С и 4-6°С не снижалась в течение одного года (срок наблюдения). При температуре 18-25°С инфекционная активность вируса снижалась через 6-9 мес на 1,0-1,5 ^ ТЦЦ50/СМ3. Оценку стабильности вакцинного вируса в тех же образцах сухой вакцины, которые закладывали на длительное хранение при различных температурах, проводили в тестс ускоренной инактивации при повышенном температурном режиме (37°С, 7 суток). Показано, что инфекционная активность вируса, высушенного в контрольной среде (без ;табилизатора), в процессе термоинактивации снижалась на 2,5 gTЦЦ5o/cм3, тогда как среда СФГА и сахарозо-желатозная среда проявили выраженный защитный эффект - инфекционая активность вируса ;нижалась не более чем на 0,25^ТЦД50/см3. При этом прослеживается :оответствие снижения титра вируса в образцах вирусвакцины в тесте ускоренного старения" и снижения титра вируса при длительном хра-1ении препарата в различных температурных условиях.

Для определения оптимальных условий, при которых вакцина в шведенном состоянии сохраняет необходимую активность, в качестве избавителей сухих образцов использовали среду 199 (контроль), пеп-онный разбавитель (ВНИТИБП) и разбавитель, приготовленный из Концентрата разбавителя для вирусвакцин, применяемых в птицевод-тве» (ООО "БИОТА"), а также фосфатно-солевой буферный раствор, "ухие образцы с известным титром восстанавливали каждым из ука-анных разбавителей (рН 6,9-7,2) и выдерживали при различной темпе-атуре: 4-6°С, 18-25°С, 37-38°С. Образцы разведённой вакцины титро-

вали сразу и через 1, 2 и 3 часа хранения при указанных выше температурах.

Полученные данные свидетельствуют о том, что титр вируса после разведения вакцины в пептонном разбавителе и хранении при температуре 4-6°С, 18-25°С оставался на одном уровне в течение 2 часов, при 37-38°С сохранялось лишь 56,2% первоначальной инфекционной активности вируса. Рабочий раствор концентрата разбавителя также обеспечивал сохранность инфекционной активности вируса в течение 2 часов при температуре хранения разведенной вакцины 4-6°С, 18-25°С. Среда 199 (контроль) в такой же мере предохраняла вирус от инактивации при температуре хранения 4-6°С, 18-25°С в течение 2 часов, тогдг как при 37-38°С инфекционный титр вируса значительно (на 43,8%' снижался в течение первого часа. Титр вакцины, разведенной в фос фатно-солевом буферном растворе, снижался уже через 1 час храненш при 4-6°С.

Проведённые исследования позволили подобрать защитные сре ды для сублимационного высушивания, обеспечивающие максималь ное сохранение инфекционной активности вируса ИББ: среды СФГА 1 сахарозо-желатозная, которые в равной мере защищали вирус от инак тивации при хранении сухого препарата при температуре 4-6°С в тече ние 12 месяцев. Эти условия хранения вакцины внесены в норматив ную документацию.

Тест "ускоренного старения" - степень инактивации вакцинног вируса ИББ при температуре 37°С в течение 7 дней подтверждает пра вильность выбора защитных сред для вируса ИББ.

Для разведения сухих вакцин для парентерального применения )екомендован раствор "Концентрата разбавителя для противовирусных ¡акции, применяемых в птицеводстве", который обеспечивает выжи-5аемость вируса в разведённой вакцине в течение 2 часов хранения в щапазоне температур от 4°С до 38°С.

Изготовление и испытание опытных серий вирусвакцны против ИББ из штамма" Бно-92" в лабораторных н производственных условиях

Оценка нммуногенности препарата и определение вакцинальной дозы на SPF-цыплят в лабораторных условиях

Во ВНИТИБП были изготовлены 4 экспериментальные серии закцины против ИББ из штамма "БИО-92", проведены их контроль и испытания в лабораторных условиях и в птицехозяйстве. Серии вакци-Е1Ы были стерильны, безвредны для суточных цыплят, свободны от контаминации посторонними вирусами и имели титр инфекционной активности не менее 6,75 ^ТЦДзо/см3.

Для изучения иммуногенности и определения дозы сухой вирус-вакцины против ИББ (штамм "Био-92") при различных методах вакцинации, проведены опыты на 16 группах SPF-цыплят (по 5 голов в группе).

Цыплят 1-5 групп прививали путём выпаивания разведённой водой вакцины в объёме 10 см3 на одного цыплёнка. В группах 6-10 цыплят прививали вакциной интраназально в объёме 0,05 см3. Цыплят с IIIS групп вакцинировали внутримышечно в объёме 0,2 см3. Вакцину для интраназального и внутримышечного введения разводили рабочим рас-

твором концентрата разбавителя. Цыплят всех групп вакцинировали в суточном возрасте. Разведения вакцины готовили так, чтобы в прививном объёме содержалось 500, 1000, 2000, 4000, 10000 ТЩЬ вируса.

Цыплят группы 16 не вакцинировали.

За цыплятами вели клиническое наблюдение и регистрировали сохранность птицы. Признаков заболевания, отставания в росте или гибели цыплят не отмечалось. Через 21 день после вакцинации цыплята каждой группы были обследованы на наличие ВН-антител в крови. Сыворотки исследовали в реакции нейтрализации в разведении с 1:8 до 1:526 со 100 ТЦД50 вируса ИББ из штамма "Био-92". В результате исследований установлено, что внутримышечное и интраназальнос введение вакцины против ИББ (штамм "Био-92") суточным БРР-цыплятам в дозе не менее 2000 ТЦЦ^о, вызывает иммунный ответ, обеспечивающий 100%-ную защиту. Для получения аналогичного результата методом выпаивания необходимо 4000 ТЦД50 на одного цыплёнка. Вакцина в дозах 2000-10000 ТЦД50была не реактогенна.

Испытание вакцины против ИББ из штамма "Био-92" в условиях птицехозяйства

Производственные испытаний проводились на птицефабрике агрофирмы "Николаевская" Саратовской области при участии гл. ветврача агрофирмы В.М. Спиридонова.

С целью определения схемы вакцинации против ИББ на первом этапе работы был изучен иммунный статус суточных цыплят и динамика уровня материнских антител (рис.2). В реакции нейтрализации (РН)

исследовали пробы сывороток крови 1,5,7,10,14-суточных цыплят (260 проб).

Результаты исследования показали, что 50% цыплят суточного возраста имели материнские антитела в титре 1: 64 и ниже, 40%-1:64- 1: 256, и только 10% цыплят содержали материнские антитела в титре 1:512.

Возраст, сут.

Рис. 2. Динамика снижения уровня материнских антител к вирусу ИББ в сыворотках крови цыплят.

Таким образом, уже у 50% цыплят в суточном возрасте, имеющих итры материнских антител 1:64 и ниже, мог развиться ожидаемый им-1унный ответ на введение вакцины против ИББ, или же эти цыплята 1ыли потенциально восприимчивы к заражению полевым вирусом 1ББ. Результаты серологического контроля статуса суточных цыплят видетельствовали о необходимости вакцинировать их в суточном воз-асте. Время второй вакцинации установили, исходя из времени полу-

распада антител - равное для бройлеров 2,82 суток и динамики снижения уровня трансоварильных антител (рис.2).

При проведении производственных испытаний препарата цыплят-бройлеров кросса "АНАК-2000" вакцинировали в суточном возрасте. Вакцину вводили внутримышечно в области внутренней поверхности бедра, в объёме 0,2 мл (10000 ТЦД50). Вакцину разводили в растворе "Концентрата разбавителя для противовирусных вакцин, применяемых в птицеводстве". Вторую вакцинацию проводили методом выпаивания в 10-суточном возрасте. Вакцину разводили водопроводной водой из расчета 10 мл (10000 ТЦЦ50) на цыплёнка. Для сравнения использовали группы птиц, привитых вакциной из штамма "БГ" и "Вин-терфильд 2512" по схемам, рекомендованным «Наставлениями» по применению этих препаратов.

Указанные группы цыплят содержали в изолированных друг от друга помещениях.

Во время испытания вели наблюдения за падежом птицы, устанавливали причину падежа по результатам патологоанатомическогс вскрытия. Результаты испытания приведены в таблице, из данных ко торой следует, что максимальная эффективность (95-100%) наблюда лась при использовании вакцины против ИББ из штамма "Био-92" п< рекомендуемой нами схеме.

Оценка эффективности вакцинации против ИББ вакциной БИОТА-Гамб» из штамма «Био-92» при разных схемах ее применения

Вакцина и схема вакцинации Количество голов, гол. Общий падеж, гол./% Падеж от ИББ, гол./% Эффективность, %

: вакцинирован-хе 69720 38749/55,5 20123/28,9'

ИОТА-Гамб», ема 1 28690 3639/12,7 395/1,3 95,5

39050 2928/9,4 - 100

ИОТА-Гамб», ема 2 60530 4479/7,4 928/1,5 94,8

ИОТА-Гамб», емаЗ 61054 8433/13,8 1392/2,2 92,3

63935 10421/16,3 1534/2,4 91,6

з штамма «БГ», ема 4 29654 3162/10,66 425/1,43 95,0

64890 11102/17,1 7102/10,9 62,2

з штамма «БГ», ;ема 3 54251 3162 2017/10,9 87,2

62140 11102 3623/5,8 79,9

Зинтерфильд», :ема 5 62340 13695/17,3 1355/2,1 92,5

хема 1 - 1- я вакцинация в 1-сут; 2-я - в 10-сут. возрасте;

хема2-1-я вакцинация в 10-сут; 2-я - в 20-сут. возрасте;

>сема 3 - 1-я вакцинация в 5-суг; 2-я - в 15-сут. возрасте; 3-я - в 25 суг. возрасте;

хема 4-1-я вакцинация в 5-сут; 2-я - в 15-сут. возрасте;

хема 5-1-я вакцинация в 5-сут; 2-я - в 10-сут. возрасте.

уточный цыплят прививали внутримышечно, остальных с питьевой водой.

ВЫВОДЫ

1. Первично-трипсинизированныс культуры ФЭК и ФЭП в ра] ной степени являются чувствительными к вирусу ИББ (штамм "Бис 92") и обеспечивают накопление вируса в высоком титре (7,0-8, 1ёТЦД5о/см3).

2. Применение механического способа отделения инфицирова! ных вирусом ИББ клеток ФЭП от стекла позволяет увеличить выхо вируса в 3-5,5 раз по сравнению с криометодом.

3. Отработан режим ультразвуковой дезинтеграции инфицирс ванных клеточных культур: объём обрабатываемой взвеси 150-350 см плотность ультразвука 0,6-0,25ватт/см3 и время обработки 60-90 се! соответственно, который обеспечивает максимальный выход внеюк точного вируса и получение гомогенных вируссодержащих суспензий

4. Отмывание культуры ФЭП или ФЭК средой Игла и 1,5%-на концентрация инактивированной сыворотки КРС в поддерживающе среде обеспечивают получение максимального "урожая" (6,75-7, 1§ТЦД5о/См3) вируса ИББ.

5. Для воспроизводимости результатов титрования со средне квадратичным отклонением 0,337 и коэффициентом вариации 20,57°, наиболее приемлемой оказалась первично-трипсинизированная 24 часовая культура ФЭП.

6. Наибольшей стабилизирующей способностью при лиофильног высушивании вируса ИББ обладали среды СФГА и сахарозо желатозная, обеспечившие стабильность инфекционной активности ви руса в сухом препарате в течение 12 месяцев при 4-6°С.

т выживаемость вируса в разведённой вакцине в течение 2 часов при :ранении в температурном диапазоне от 4°С до 38°С.

8. Изготовлены и испытаны в лабораторных и производств ен-[ых условиях опытные и опытно-промышленные серии сухой вакци-[ы против ИББ (штамм "Био-92"). Установлено, что внутримышечное и [нтраназальное введение вакцины против ИББ суточным БРР-(ыплятам в дозе не менее 2000 ТЦД50 вызывает иммунный ответ, обес-[ечивающий 100%-ную защиту. Для получения аналогичного результа-а методом выпаивания необходимо не менее 4000 ТЦЦ50 на одного [ыплёнка. Вакцина в дозах 2000-10000 ТЦД50 является безвредной и ереактогенной.

9. В условиях птицехозяйства показана высокая эффективность акцины против ИББ "БИОТА-Гамб" при двукратной вакцинации цып-ят: внутримышечной - в суточном, а затем методом выпаивания в 10-уточном возрасте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. "Временная инструкция по изготовлению и контролю вирус-акцины "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни Золезни Гамборо)", утвержденная директором ООО "БИОТА" 29 ию-я 2000г.

2. Технические условия ТУ 9384.003-00008064-00 «Вирусвакцина ВИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни амборо)", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22 ав-^ста 2000г.

3. "Временное наставление по применению вирусвакцины эИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни амборо)", утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22 ав-/ста 2000г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Гетман Е.В., Смоленский В.И Баррос-Палома Е.В. Разработка нового разбавителя для вирусвакцин применяемых в птицеводстве. // Тез. Всероссийской научно практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождени профессора В.А.Першина,- Щелково.-1998.-С. 14.

2. Бобровская И.В., Румянцева И.В., Гетман Е.В. Определение ка чества вакцинального процесса у цыплят, привитых моновалентно! вакциной против болезни Марека.// Тез. Всероссийской научно практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП,- Щел kobo.-2000.-C.15.

3. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Гетман Е.В., Самуйленко А.Я Елизова H.A. Динамика материнских антител к вирусу инфскционно; бурсальной болезни у цыплят и определение сроков иммунизации./ Тез. Всероссийской научно-практической конференции, посвященно] 30-летию ВНИТИБП,- Щелково,- 2000,- С.21.

4. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Гетман Е.В. Сравнительна оценка методов выделения вируса ИББ из клеток.// Тез. Всероссийско научно-практической конференции, посвященной 30-летш ВНИТИБП,- Щелково,- 2000,- С.22.

5. Гетман Е.В., Слепенко Т.Б., Соловьев Б.В. Влияние сыворотк КРС на.репродукцию вируса ИББ в культуральной системе.// Тез. Все российской научно-практической конференции, посвященной 30-летш ВНИТИБП,- Щелково,- 2000,- С.24.

6. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Гетман Е.В., Нежута A.A., Сер бис E.H. Влияние состава защитной среды на активность вируса ИБ (шт. БИО-92) после лиофилизации и в процессе хранения при разл№

1ых температурных режимах.// Тез. Всероссийской научно-трактической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП.- Щел-cobo.-2000.-c.26. •

7. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Е., Самуйленко А.Я., Гетман Е.В., Елизова H.A., Яковлев С.С., Спиридонов В.М. Испытание вакцины 1ротив инфекционной бурсальной болезни из штамма «БИО-92» в про-{зводственных условиях.// Тез. Всероссийской научно-практической :онференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП,- Щелково,- 2000,127.

8. Яковлев С.С., Венгеренко JI.H., Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Самуйленко А.Я., Гетман Е.В. Сравнительная характеристика эффек-ивности вакцин против инфекционной бурсальной болезни цыплят фи острой вспышке заболевания.//. Тез. Всероссийской научно-фактической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП,- Щел-:ово,- 2000,- С.28.

9. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Самуйленко А.Я., Гетман Е.В. О озможности разработки комплексной вакцины против болезни Маре-а и инфекционной бурсальной болезни.// Тез. Всероссийской научно-фактической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП,- Щел-obo.-2000.-C.31.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гетман, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика заболевания.

1.2. Характеристика возбудителя ИББ.

1.3. Специфическая профилактика ИББ.

1.4. Характеристика технологических этапов изготовления вакцины против ИББ.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Изучение условий культивирования вируса ИББ.

2.2. Разработка технологических приемов получения, консервирования и использования внеклеточного вируса ИББ.

2.3. Изготовление и испытание опытных серий сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «Био-92» в лабораторных и производственных условиях.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технологические этапы изготовления культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц"

Вакцинопрофилактика инфекционной бурсальной болезни стала неотъемлемой частью технологии ведения птицеводства. Накопленный в мировой практике огромный объем научной информации указывает на необходимость исследований по данной проблеме. В связи с повторяющимися вспышками этого заболевания, вызываемыми новыми высоковирулентными штаммами возбудителя, в т.ч. на фоне мер вакцинопрофилактики, учёные всего мира постоянно занимаются разработкой и усовершенствованием вакцин, технологий их изготовления, а также схем и методов специфической профилактики. актуальность работы. Одной из самых рентабельных отраслей животноводства является птицеводство.

Важнейшим условием успешного, рентабельного ведения промышленного птицеводства является надёжное благополучие стада по инфекционным заболеваниям. Борьба с вирусными заболеваниями приобретает всё возрастающую актуальность в связи с тем, что некоторые инфекции стали протекать атипично и ассоциироваться с различными факторами вирусной и бактериальной природы. В ряду инфекционных заболеваний птиц особое место занимает ИББ, что обусловлено рядом характерных особенностей как возбудителя, так и заболевания: устойчивость вируса во внешней среде, возможность субклинического течения болезни, наличие выраженного иммуноде-прессивного влияния вируса.

До применения средств специфической профилактики годовой ущерб от ИББ исчислялся десятками миллионов долларов (США, Австралия).Кроме прямых экономических потерь (гибель инфицированной птицы составляет 575%) данное заболевание представляет серьёзную опасность из-за иммуно-депрессивного воздействия вируса (103,149), избирательно поражающего один из центральных органов иммунной системы птиц - бурсу Фабрициуса (172, 190, 191, 208). Организм такой птицы не в состоянии дать ожидаемый иммунный ответ на введение вакцин против ньюкастлской болезни, инфекционного бронхита, болезни Марека и других (66, 205, 228). К серьёзным экономическим потерям также приводит проявление на фоне ИББ вторичных инфекций: дерматита, гепатита, некротического энтерита, кокцидиоза, "синдрома расстройства всасывания кишечника".

В настоящее время ИББ (болезнь Гамборо) зарегистрирована во всём мире и по актуальности занимает одно из первых мест в инфекционной патологии птицы и считается для стран с развитым промышленным птицеводством одной из наиболее экономически важных болезней, а в ветеринарно-санитарном отношении - одной из наиболее трудно ликвидируемой эпизоотией.

В связи с большой опасностью ИББ для птицеводства, изучение данного заболевания, разработка и совершенствование мер борьбы с ним было развёрнуто во многих странах мира, в том числе и в России (1-51).

До 1992 года жесткое выполнение ветеринарно-санитарных правил, сформированность хозяйственных связей, а также применение средств специфической профилактики ИББ, главным образом импортного производства, позволяло контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции (4,11,18,31,40, 46, 50, 77).

Однако, начиная с 1992 года эпизоотическая ситуация во всём мире по ИББ резко осложнилась. Причиной сложившейся ситуации, как отечественные, так и зарубежные учёные, называют появление высоко патогенных штаммов вируса ИББ, недостаточную эффективность отдельных серий вакцины из-за неправильного хранения или разведения, а также использование для приготовления вакцины штамма вируса с низкой инфекционной и имму-ногенной активностью. Эти факторы приводят к большим экономическим потерям в результате массовой гибели птицы в возрасте от 21 до 45 дней (49, 53, 59, 58, 80).

На протяжении ряда лет различными исследователями в нашей стране, (Алиев А.С., Борисов А.В., Гусев А.А., Норкина С.Н., Соловьёв Б.В., Сле-пенко Т.Б., Смоленский В.И. и др.) и за рубежом (Baxendal W., Beltran

I.,Chang D.S., Edwards J. И др.) велись работы по созданию вакцин против ИББ. В настоящее время в России применяются препараты из вакцинных штаммов Винтерфильд, БГ, ВНИВИП, Д-78, ВГНКИ, репродуцированных в разных биологических системах (куриные эмбрионы, культуры клеток различного происхождения).

Применяемые в РФ в настоящее время вакцины готовятся или из «горячего» штамма БГ или «мягкого (умеренного)» штамма Винтерфильд (Winterfeald), каждый из которых имеет определенные недостатки. В наших исследованиях использован штамм-изолят "Био-92" вируса ИББ, по характеру и степени реактогенности занимающий промежуточное положение между штаммами " БГ" и "Винтерфильд". Вакцина из данного штамма, на наш взгляд, будет востребована в тех хозяйствах, где эффективность вирусвакцин из штаммов "БГ" или "Винтерфильд" недостаточно высока.

Известно, что высокоэффективными в иммунопрофилактике, иммуно-генными, безвредными и экономически выгодными могут быть препараты, приготовленные с использованием современных промышленных технологий, методов стандартизации и контроля отдельных производственных стадий, сырья и готовой продукции.

В связи с вышесказанным, актуальным является отработка технологических этапов изготовления вакцины против ИББ из штамма «Био-92». цель и задачи исследований. Цель работы - разработать технологические этапы изготовления вакцины против ИББ из нового штамма-изолята «Био-92», изучить культурально-биологические свойства штамма «Био-92» вакцинного вируса ИББ и провести лабораторные и производственные испытания вакцины против ИББ.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи: - отработать эффективный метод выделения вакцинного вируса ИББ из инфицированных фибробластов эмбрионов перепелов;

-отработать технологию культивирования вируса, в зависимости от возраста культуры клеток, времени культивирования вируса и состава куль-туральных сред;

- определить условия консервирования и хранения вируса ИББ;

- изучить зависимость иммуногенной активности вируса от дозы, способа введения препарата и уровня материнских антител в сыворотке крови цыплят;

- изготовить и провести испытания опытных серий сухой вакцины против ВИББ в полевых условиях. научная новизна. Разработаны технологические этапы изготовления вакцины против ИББ из штамма "Био-92". Определены условия репродукции, титрования и стабилизации внеклеточного вируса ИББ (штамм "Био-92").

Подобрана наиболее подходящая защитная среда, позволяющая избежать снижения биологического титра вируса ИББ (штамм "Био-92") в процессе лио-фильного высушивания и хранения сухого препарата.

Определено влияние различных разбавителей на сохранность инфекционного титра вирусвакцины после разведения и рекомендован разбавитель для практического использования.

Показано отрицательное влияние сыворотки крупного рогатого скота в составе культуральных питательных сред на проявление цитопатического действия вируса ИББ (штамм «Био-92»), Отработан способ снижения негативного влияния сывороточных ингибиторов, дающий возможность получить максимальный урожай вируса.

Установлена безвредность и высокая иммуногенность вакцины при внутримышечном, интраназальном введении и выпойке в дозе 10000 ТЦДзо/см для коммерческих и SPF-цыплят суточного возраста. практическая ценность работы. Полученные результаты явились основой для разработки нормативной документации на производство, контроль и применение вакцины "БИОТА-Гамб" из штамма "Био-92".

Разработаны и утверждены департаментом ветеринарии МСХ РФ:

- Технические условия ТУ 9384.003-93840700-00 "Вирусвакцина "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)";

-"Временное наставление по применению вирусвакцины "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)".

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП (2000г.);

- на межлабораторном заседании сотрудников ВНИТИБП (2000г.). объём и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и приложение. В списке литературы 257 источников, из них 206 иностранных. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 3 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гетман, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Первичнотрипсинизированные культуры ФЭК и ФЭП в равной степени являются чувствительными к вирусу ИББ (штамм "Био-92") и обеспечивают накопление вируса в высоком титре (7,0-8,0 lgTLyWcM3).

2. Применение механического способа отделения инфицированных вирусом ИББ клеток ФЭП от стекла позволяет увеличить выход вируса в 3-5,5 раз по сравнению с криометодом.

3. Отработан режим ультразвуковой дезинтеграции инфицированных клеточных культур: объём обрабатываемой взвеси 150-350 см Л плотность ультразвука 0,6-0,25ватт/см3 и время обработки 60-90 сек, соответственно, который обеспечивает максимальный выход внеклеточного вируса и получение гомогенных вируссодержащих суспензий.

4. Отмывание культуры ФЭП или ФЭК средой Игла и 1,5%-ная концентрация инактивированной сыворотки КРС в поддерживающей среде обеспечивают получение максимального "урожая" (6,75-7,0 ^ТЦДзо/см ) вируса ИББ.

5. Для воспроизводимости результатов титрования со среднеквадратичным отклонением 0,337 и коэффициентом вариации 20,57% наиболее приемлемой оказалась первичнотрипсинизированная 24-часовая культура ФЭП.

6. Наибольшей стабилизирующей способностью при лиофильном высушивании вируса ИББ обладали среды СФГА и сахарозо-желатозная, обеспечившие стабильность инфекционной активности вируса в сухом препарате в течение 12 месяцев при 4-6°С.

7. Для разведения сухой вакцины перед её парентеральном применении рекомендован раствор "Концентрата разбавителя для противовирусных вакцин, применяемых в птицеводстве", который обеспечивает выживаемость вируса в разведённой вакцине в течение 2 часов при хранении в температурном диапазоне от 4°С до 38°С.

8. Изготовлены и испытаны в лабораторных и производственных условиях опытные и опытно-промышленные серии сухой вакцины против ИББ (штамм "Био-92"). Установлено, что внутримышечное и интраназальное введение вакцины против ИББ суточным SPF-цыплятам в дозе не менее 2000 ТЦДзо

87 вызывает иммунный ответ, обеспечивающий 100%-ную защиту. Для получения аналогичного результата методом выпаивания необходимо не менее 4000 ТЦД50 на одного цыплёнка. Вакцина в дозах 2000-10000 ТЦД50 является безвредной и нереактогенной.

9. В условиях птицехозяйства показана высокая эффективность вакцины против ИББ "БИОТА-Гамб" при двукратной вакцинации цыплят: внутримышечной - в суточном, а затем методом выпаивания в 10-суточном возрасте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. "Временная инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)", утвержденная директором ООО "БИОТА" 29 июня 2000г.

2. Технические условия ТУ 9384.003-00008064-00 «Вирусвакцина "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22 августа 2000г.

3. "Временное наставление по применению вирусвакцины "БИОТА-Гамб" против инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо)", утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22 августа 2000 г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как видно из обзора цитированной литературы, инфекционная бур-сальная болезнь (болезнь Гамборо) широко распространена среди кур промышленных стад во многих странах мира и до применения средств специфической профилактики наносила большой экономический ущерб (50, 53, 56, 80).

Болезнь протекает в острой и субклинической форме.

Профилактика ИББ осуществляется путём выпаивания, внутримышечного или интраназального введения вакцин из живых или инактивиро-ванных вирусов ИББ. Вакцина готовится в виде лиофилизированного препарата (живая), и эмульс-вакцина (инактивированная). Показано, что сухая вакцина в основном используется для вакцинации птицы в раннем возрасте, тогда как инактивированная для вакцинации птицы родительского стада. При изготовлении живой вакцин вакцинные штаммы размножают в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур. Инкубационное яйцо, для этих целей получают из специализированных птицехозяйств, где птица свободна от специфических патогенных объектов (SPF).B лабораторных условиях для культивирования вируса, используют так же культуру фибробластов перепелиных эмбрионов(З) и перевиваемые культуры клеток Vero, RK-13, ВНК-21, CV-1, CG-91, LSCE-BK3, МА-104, BGM-70 (42).

Важным этапом получения сухой вакцины является освобождение внеклеточного вируса ИББ из инфицированных клеток и его стабилизация. Получение внеклеточного вируса осуществляют криометодом или обработкой ультразвуком.

Оценку биологической активности вакцины проводят методом титрования вируса в культуре клеток, а также на основании обнаружения поствакцинальных антител в сыворотке крови привитых цыплят в РН в культуре клеток, и контрольного заражения вирулентным штаммом ВИББ.

Схема вакцинации разрабатывается для каждого хозяйства, в зависимости от эпизоотической ситуации, циркулирующего в хозяйстве вируса и иммунного состояния птицы.

Цыплята, с титром материнских ВНА в разведении выше 1:64 (РН), 1:400 (ИФА) не восприимчивы к введению вакцинного вируса.

Таким образом, проблема технологии культивирования ВИББ, освобождения вируса из инфицированных клеток, его стабилизация являются актуальной, так же, как вопросы оценки биологической активности в процессе изготовления, хранения и применения сухой вакцины против ИББ.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 1997-2000 г. в отделе разработки способов промышленного культивирования клеток и вирусов Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, в ООО "БИОТА" и в птицехозяйстве агрофирмы "Николаевская" Саратовской области.

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали вакцинный штамм-изолят вируса инфекционной бурсальной болезни "БИО-92". Штамм поддерживается во ВНИиТИБП и ООО «БИОТА» путем перемежающихся пассажей вируса на 6-10-дневных куриных SPF-эмбрионах, культурах фибробластов перепелиных и куриных SPF-эмбрионов. В настоящее время штамм проходит комиссионные испытания в ВГНКИ как производственный с последующим депонированием в ВГНКИ.

В отдельных опытах была использована сухая вакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма пБГ"и "Винтерфильд", производства ВНИИЗЖ.

Экспериментальные животные. В опытах использовали 9-10 дневные эмбрионы, полученные путём инкубации яиц SPF-кур, породы белый леггорн (Lomann); суточных цыплят породы белый леггорн из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств, SPF-цыплят, выведенных из яиц фирмы "Lomann", 8-9-дневные эмбрионы перепелов мясной линии ФГУП "Щёлковский биокомбинат". Для промышленных испытаний и оценки иммуногенности вакцины использовали цыплят-бройлеров кросс "АНАК-2000", АФ "Николаевская".

Клеточные культуры и среды. Для размножения и титрования вируса использовали первичные культуры клеток 8-9-дневных перепелиных и 9-10-дневных куриных эмбрионов и SPF-эмбрионов. Трипсинизацию тканей эмбрионов и приготовление клеточных культур проводили по общепринятым методикам, с учетом рекомендаций, разработанных во ВНИТИБП.

Клеточные культуры и вирус выращивали в стационарных условиях во флаконах вместимостью 50 см3 и 1,5 дм' флаконах или в пробирках, с пло

2 2 2 щадью ростовой поверхности соответственно 20 см , 300 см и 2см .

Температуру инкубации нормальных и заражённых клеточных культур поддерживали в пределах 37-38°С

Для выращивания клеток использовали среду Игла, среду 199 производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, г. Москва, гидро-лизат лактальбумина («Дифко», США), сыворотку крупного рогатого скота (КРС) производства Конотопского и Омского мясокомбинатов.

В качестве ростовой и поддерживающей сред использовали смесь равных объёмов среды Игла и 0,5% гидролизат лактальбумина на солевом растворе Хенкса (ГЛАХ), к которой добавляли сыворотку КРС соответственно до концентрации 10% и 1,5%. При лабораторном культивировании применяли в качестве ростовой и поддерживающей среды, смесь сред 199 и Игла (1:2), содержащую соответственно 5% и 1% сыворотки КРС. рН ростовой и поддерживающей сред составлял 7,1-7,4 и 7,4- 7,6, соответственно. В культу-ральные среды перед использованием добавляли антибиотики пенициллин

3 3

100 ед/см стрептомицин-100 мкг/см .

Солевые растворы. Для обработки и трипсинизации тканей эмбрионов использовали солевой раствор Хенкса и 0,25% раствор трипсина («Дифко», США).

Для ополаскивания клеточных культур применяли забуференный физиологический раствор (7,0-7,2),содержащий (г/литр): ЫаС1(хч)-8; Na2HP04-2H20 (хч) - 1,3; КН2Р04(хч) - 0,2.

Защитные среды. Защитной средой для лиофилизации вируса ИББ служила сахарозо-альбуминовая среда СФГА, содержащая (г/литр): альбумин сывороточный, лиофилизированный, производства НПО «Аллерген» г.

Ставрополь -10 (1%); КН2Р04 (хч) - 0,5 (0,0038М); К2НР04 (хч) - 1,25 (0,0072М); сахарозу (хч) - 7,45 (0,218М); моноглютамат натрия (ч) - 0,83 (0,0049М). рН среды СФГА - 6,9-7,2, а так же среда, приготовленная по прописи ВНИТИБП ( оформляется документация), содержащая фосфатные соли, сахарозу (7%) и желатин в желатозной форме рН 7,0-7,2.

Разбавители. Для разведения вируса использовали пептонный разбавитель ВНИТИБП (а. с. №563175,1974), представляющий собой 2% раствор пептона на 0,05М глициновом буферном растворе, рН 7,0-7,2. Для приготовления разбавителя использовали пептон сухой ферментативный (для микробиологических целей) производство Семипалатинского мясокомбината, глицин (чда), также рабочий раствор "Концентрата разбавителя для противовирусных вакцин, применяемых в птицеводстве" (ТУ 9384-001-93840700-00) При испытании в качестве разбавителя сухих образцов внеклеточного вируса применяли забуференный физиологический раствор (рН 7,0-7,2), содержащий (г/литр): NaCl (хч) - 8; Na2HP04-2H20 (хч) - 1,3; КН2Р04 (хч) - 0,2. Приготовление сред, растворов и разбавителей проводили совместно с канд. тех. наук В.В. Бронниковой.

Стерилизация сред и растворов. Среду ГЛАХ, растворы Хенкса и трипсина, защитную среду СФГА стерилизовали фильтрацией через асбестовые пластины EKS-2 (ГДР). Концентрат разбавителя стерилизовали фильтрацией через пластины Millipor 0 0,22.

Забуференный физиологический раствор, пептонный разбавитель стерилизовали путём автоклавирования при избыточном давлении 0,5 кг/см (111-115°С) в течение 15-30 минут.

Размножение вируса в культуре клеток. Для заражения вирусом использовали 24-72-часовые культуры клеток с полностью сформированным клеточным слоем. Заражение проводили путём внесения на монослой вируса ИББ. В соответствии с условиями опытов через 96-144 часа культивирования, когда специфические цитопатические изменения были отчётливо выражены на 60-100% площади клеточных культур, осуществляли съём инфицированных клеток. Собранные клетки с целью консервирования подвергали замораживанию в криозащитной среде, или разрушали в стабилизирующей среде для получения внеклеточного ИББ.

Вирус некоторых промежуточных пассажей в виде суспензии инфицированных клеток подвергали криоконсервированию и хранили в парах азота (температура -154°С). Консервирование проводили путём суспендирования дезагрегированных инфицированных клеточных культур в защитной среде СФГА, и последующего охлаждения вирусного материала.

Выделение вируса ИББ из клеток. При проведении исследований по отработке методики сбора инфицированных клеток и выделения из них вируса, клеточную культуру снимали с поверхности стекла механически, и крио-методом. Клетки собирали в защитную среду. Взвешенные в защитной среде клетки переносили в охлаждаемые льдом цилиндрические флаконы и разрушали с помощью ультразвука. Работу проводили на ультразвуковом диспер-гаторе УЗДН-1. Контролировали тепловой режим усилителя мощности и постоянную подачу и слив проточной воды для охлаждения рабочего излучателя в процессе работы. Перед началом работы устанавливали частотный диапазон и регулировали настройку генератора на резонансную частоту при максимальном значении выходной мощности.

Степень разрушения клеток контролировали путём микроскопии мазков.

Лиофилизация вируса ИББ. Высушивание вируссодержащих материалов проводилось на сублимационной установке «Юзифруа» (Франция) в лаборатории криоконсервирования биопрепаратов ВНИТИБП.

Ультразвуковые лизаты инфицированных клеток сразу же после приготовления замораживали при минус 38-40°С и сохраняли при этой температуре до высушивания. Вируссодержащий материал, расфасованный по 2 мл в пенициллиновые флаконы, выдерживали перед сушкой при минус 40-50°С в течение 18-20 часов, затем обезвоживали в вакууме (50-100мкм) в течение 30-32 часов. В период сублимации температуру высушиваемых материалов поддерживали в пределах минус 32-35°С. Вторую фазу лиофилизации - досушивание проводили при положительной температуре, но не выше + 25°С. Массовая доля влаги сухих образцов вируса была в пределах 1,0-3,0%.

Определение стабильности вируса ИББ. Для определения влияния температуры на биологическую активность вируса сухие образцы помещали на хранение при минус 38-40°С, минус 4-10°С, 4-6°С и 18-22°С. Через определённые отрезки времени по 3 образца, хранившихся при каждом температурном режиме, исследовали на инфекционную активность и сравнивали инфекционную активность вируса до и после хранения при различной температуре.

Определение инфекционной активности. Вирус титровали в 1-, 2-, 3суточной культуре клеток ФЭК или ФЭП. Клеточные культуры (не менее 4 пробирок на каждое разведение) инокулировали вирусом путём внесения на монослой 0,1 мл соответствующего разведения вируссодержащей суспензии. После 30 минутной адсорбции вируса, при 37°С вносили в пробирки поддерживающую среду. На пятые сутки после инокуляции вирусом клеточные культуры проверяли на наличие ЦПД вируса. Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации Ашмарина, по формуле: lg ТЦД50 = lgDN -S (ZLi-0,5), где Dn - минимальное разведение, при котором наблюдается 100% цитопатиче-ский эффект; S - логарифм кратности разведения; X - сумма значений всех испытанных доз; Li - отношение числа культур клеток, давших положительную реакцию от заражения данной дозой, к общему числу культур клеток, заражённых этой дозой; 0,5 - постоянная величина.

Эффективность вакцинации рассчитывали по формуле: А-В

Э= .100%, где А

Э - эффективность вакцинации, %; А - число случаев ИББ в контрольной группе, %; В - число случаев ИББ в опытной группе, %.

Реакция нейтрализации. Для оценки поствакцинального и материнского иммунитета использовали реакцию нейтрализации (РН). Постановку РН осуществляли на первичнотрипсинизированной культуре ФЭК или ФЭП по общепринятой методике с двукратным разведением исследуемых сывороток и постоянной дозой вируса ИББ штамм «Био-92» (100 ТЦД50)

Статистическую обработку результатов проводили, используя методы, описанные в книге Лакина Г. Ф. (28).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Изучение условий культивирования вируса ИББ

Известно, что культура клеток является наиболее приемлемой моделью для изучения динамики накопления вируса и пригодна для репродукции и накопления вируса в лабораторных и промышленных объёмах. Размножение ВИББ в культуре фибробластов эмбрионов птиц сопровождается развитием цитопатических изменений. Данные литературы свидетельствуют о том, что вирус ИББ успешно культивируется в первичной культуре фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), фибробластов эмбрионов уток (ФЭУ), почек эмбрионов кур (ФЭП). Степень репродукции вируса в клеточных культурах и его накопление зависит от вида, возраста, условий культивирования, морфологических особенностей клеток и др. С целью изучения влияния некоторых факторов на чувствительность клеточной культуры и воспроизводимость результатов сравнивали тип и возраст клеточных культур ФЭК и ФЭП, состав ростовой и поддерживающей среды, сроки культивирования вируса и среды для разведения при титровании вируса.

2.1.1. Изучение чувствительности клеточных культур ФЭК и ФЭП к вирусу ИББ В отечественной и зарубежной практике особое место в системах культивирования вирусов занимают клетки фибробластов эмбрионов перепелов. Это связано с хорошо известной естественной устойчивостью японских перепелов к различным птичьим инфекциям что в определённой мере уменьшает риск спонтанной эндогенной контаминации выращиваемых вирусов патогенными микроорганизмами. Нами проведены опыты по сравнительному изучению накопления вируса ИББ в культурах ФЭК и ФЭП. Установлено, что при равных условиях культивирования вирус накапливается в культурах ФЭК и в культуре ФЭП в одинаковых титрах (6,75-7,5 ^ТЦД50/См3)

При статистической обработке данных сравнительного титрованиия вируса в исследованных образцах достоверных различий установить не удалось. В связи с этим в дальнейшем для разработки этапов промышленного изготовления вакцины против ИББ использовали культуры клеток ФЭП. В экспериментальных исследованиях также использовали ФЭК.

2.1.2. Влияние «возраста» культуры клеток на репродукцию вируса ИББ

На следующем этапе изучали влияние возраста культуры на степень репродукции вируса ИББ в культуре ФЭП. Для этого каждую партию клеточной культуры делили на 2 или 3 части, которые использовали для титрования одного образца вируса через 1 или 2, и 1,2 или 3 суток роста. Заражение клеток и инкубирование культур проводили в стандартных условиях. Результаты учитывали в течение 144 часов. Полученные данные приведены в таблице 1. Из данных, приведённых в таблице 1, видно, что титр вируса всех испытанных образцов был значительно выше в суточной культуре ФЭП, чем в 2 и 3- суточной культуре.

Динамику накопления вируса в культурах клеток ФЭП разного «возраста» изучали путем титрования проб, отобранных каждые 24 часа после заражения 1-, 2- и 3-суточной культуры ФЭП и их культивирования в течение 7 дней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гетман, Елена Владимировна, Щёлково

1. Алиев А.С.,Кудрявцев Ф.С., Джавадов Э.Д. Диагностика инфекционного бурсита кур.// Ветеринария,-1991,- № 3,- С.36- 40.

2. Алиев А.С. Инфекционная бурсальная болезнь птиц.//Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук.-1993.

3. Алиев А.С., Калыкова Г.К., Белостоцкая Г.Б. Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма "ВНИВИП".// Тезисы докладов н.-пр. конференции ВНИИЗЖ,- 1995,- С. 242.

4. Ануфриева Т.А., Ольшевская Т.И. Инфекционный бурсит кур (болезнь Гамборо): Обзор лит ВНИИЗЖ. // Отдел пат. исслед. и научной информации Владимир,- 1992,- С. 19.

5. Бакулин В.А., Алиев А.С., Радчук Л.А., Кудрявцев Ф.С., Савостьянов Г.А., Миркина JI.M., Тульская И.И. Цилиндрические структуры вируса болезни Гамборо. Ветеринария,- 1990,- №12,- с. 28-30.

6. Берхане И. Изучение иммунодепрессивных свойств вируса инфекционной бурсальной болезни.// Материалы междунар. научн. конф. "Общая эпизоотология: иммунол., экол. и методол. проблемы". Харьков.- 1995,- С. 472-475.

7. Бирман Б.Я. Голубничий В.П., Косько А.Ф., Насонов И.В., Литвяк B.C., Захарик Н.В., Айгистов 0.3., Лысый З.Г., Леонченко О.В. Оценка эффективности живых вакцин против инфекционного бурсита (болезни Гамборо)//

8. Вет. наука производству,- Минск,- 1996,- Вып.32,- С. 56-60.

9. Борисов А.В., Кузнецов В.Н. Оценка эффективности различных живых вакцин против инфекционной бурсальной болезни птиц.//Тез. докл. н,-пр. конф. "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных." ВНИИЗЖ,-1995,-С. 232.

10. Борисов А.В.; Гусев А.А. Разработка мер по диагностике и профилактике ИББ птиц в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации.// Проблемы инфекционной патологии животных. Владимир.-1997,- С. 139-143.

11. Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Шип илов В.И., Шажко Ж.А. Инфекционная активность вируса болезни Гамборо (БГ) в зависимости от способа культивирования.// Научные основы технологии пром.пр-ва вет.биол.препаратов. -Щелково. 1996,- С. 17.

12. Герман В.В., Ольховик J1.A., Красников Г.А., Колоусова Н.Г. Повышение эффективности вакцинопрофилактики при болезни Гамборо.// Материалы междунар. науч. конф. "Общ. эпизоотология: иммунол, экол. и мето-дол. пробл." -Харьков,- 1995,- С. 475-476.

13. Гетман Е.В., Слепенко Т.Б., Соловьев Б.В. Влияние сыворотки КРС на репродукцию вируса ИББ в культуральной системе.// Тез. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП.- Щелково. 2000,- С.24.

14. Годизов П.Х. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СТ" и эффективность специфической профилактики инфекционной бурсаль-ной болезни кур. //Диссертация на соискание степени канд. вет. наук: 16.00.03,- Защищена Тарту,- 1990.

15. Джавадова И.М. Болезнь Гамборо у кур в эксперименте. // Комплекс противоэпизоотических и спец. мероприятий по борьбе с болезнями птиц. Л,- 1990,-С. 48-54.

16. Калыкова Г.К. Вирус инфекционной бурсальной болезни индеек. // Тез.докладов к н.-пр. конференции'Ъирусные болезни сельско- хозяйственных животных",-ВНИИЗЖ- 1995.

17. Кожемяка Н. Инфекционная бурсальная болезнь. // Птицеводство. -1996,- N6,- С.22-24.

18. Кудрявцев Ф.С., Алиев А.С. Иммунопрофилактика инфекционного бурсита. // Ветеринария .- 1984,- № 5,- С.37-39.

19. Кунаков А.А., Машукова Ф.А. К вопросу ветеринарно-санитарной оценки мяса кур при инфекционной бурсальной болезни (ИББ). // Тез.докл.междунар.науч.-практ. конф. "Актуал.пробл.вет.-сан.контроля сельскохозяйственной продукции". -М. 1995,- С. 22-23.

20. Лагуткин Н.А. Козаков С.Л. Некоторые аспекты действенного контроля инфекционных болезней птиц. // Вопросы вет. вирусологии, микро-биол., эпизоотологии. Покров.-1992.-С.246-248.

21. Лагуткин Н.А. Профилактика инфекционных болезней птиц.// Птицеводство .-1995. -№2. -С. 16.

22. Лакин Г.Ф. Биометрия. //" Высшая школа".-1980г.

23. Малахов М.В. Изоляция полевых штаммов вируса болезни Гамбо-ро. //Наук. Досягнення в галуэ вет. медицини. -Харк1в,- 1997,- С. 33-35.

24. Муляк С.В.; Медведев И.Ф. Пути профилактики инфекционной бурсальной болезни в длительно не благополучных птицехозяйствах. // BicH. аграр. науки. 1996,- N 5,- с. 45-48.

25. Насонов И.В., Захарик Н.В. Роль свободно-радикального окисления в иммуногенезе и патогенезе инфекционной бурсальной болезни птиц. // Вет. и зооинж. пробл. в животноводстве и науч.-метод.обеспечение учебн.процесса. -Минск. 1997,- С. 194-196.

26. Новиков Б.В., Дмитренко В.В. Влияние вируса болезни Гамборо на иммунный статус цыплят. // Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. 1992,- Т. 1,- С. 167.

27. Прудников B.C., Громов И.Н. Иммуноморфологические реакции у цыплят, вакцинированных против болезни Гамборо. // Вет.и зооинж. пробл.в животноводстве и науч.-метод. обеспечение учебн. процесса. -Минск. 1997,-С.204-206.

28. Соловьёв Б.В., Слепенко Т.Б., Самуйленко А.Я. Разработка комплексной вакцины против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни кур. //Тез. докл. конф. Щёлково.-1996.-С. 14.

29. Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б., Гетман Е.В. Сравнительная оценка методов выделения вируса ИББ из клеток.// Тез. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП,- Щелково. -2000,- С.22.

30. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В.,Фомина Е.В. Диагностика вирусных болезней животных. М.,- ВО "Агропромизд".-1991.-С.61,75.

31. Фомина Н.В. и др. Вирусы животных. МВА,- 1991.-С.94.

32. Щербакова JI.О.,Щербаков А.В., Дрыгин В.В.,Борисов А.В. Антигенная вариабельность штаммов вируса инфекционной болезни птиц (ИББ), использующихся в качестве вакцин.// Тез. докл. н.-пр. конф. Владимир.1995.-С. 237.

33. Юрченко O.J1. 1нфекцшна бурсальна хвороба в птахогосподарствах Украши,розробка методт та засоб1в д1агностики.// Авто-реф.дис.канд.вет.наук; Укр.акад.аграр.наук.1н-т експеримл юишч.вет.медицини,- Харюв. 1994,- С. 13.

34. Aba-Adulugba Е.Р., Ibu J.O., Ohanekwu Н., Majiagbe К.А.А comparative evaluation of a Nigerian and three strains of live infectious bursal disease (Gu-roboro) vaccines. // Bull.anim. Health Product.in Africa. 1993,- Vol. 41, №1.- P. 512.

35. Abdu P. A. Case reports infectious bursal disease in a flock of broilers and local Nigerian chickens. // Bull. Anim. Health and Product in Africa. 1988,-Vol.36, № 3,- P.269-271.

36. Adejoro S.O. Stress sparks epidemics. // World Poultry. 1990, T. 55. -№ 2. - P. 27, 29.

37. Aghakhan S.M., Fereidouni S.R., Abshar N., Marunesi C., Saini Z. Characterization of a highly virulent infectious bursal disease virus. // Arch.Inst.Razi,1996.-N46/47. P. 55-63.

38. Anon. IBD chick vaccine. // Intern. Hatchery Pract. 1990. - T. 4, № 7.1. P. 37.

39. Appleton S. Factors affecting early broiler chick mortality. // Poultry Dis.- 1986. T. 45, № 533. - P. 264-268.

40. Armstrong L.D., Tabel H., Riddell C. Subclinical infectious bursal disease in the broiler industry: interim report // Vet. Res. -1981. Vol.108, № 6. - P. 8889.

41. Asdrubali G. Dinamica della produzione antioorpale et metodiche di de-terminazione. // Cliri. Veter. 1988. Vol.111, №1/2. - P. 5-14.

42. Ather M.A. Infectious bursa, disease in chicken. // Poultry Adviser. -1993,- Vol.26, iss.12. P. 27-30.

43. Azad A., Hassan S.M., Qubih T.S. Determination of maternal immunity against infectious bursal disease in broiler chicks. //Assiut veter. med. J. 1991. - T. 25, №49. - P. 211-215.

44. Azad A. A. et.al. Пат. 643216 //Австралия, опубл. 11.11.93

45. Azad A.A., Hudson P.J., O'Donnell J.J. Infection bursal disease virus vaccine. // Annu rept. CSIRO. Div. Protein chem.- Merbourhe. 1983-1984. -P. 40-41.

46. Auti M.M. Infectious Bursal Disease (Gumboro) vaccinations. // Poultry Guide. 1987. - T. 24, №11 /12. - P. 217-219.

47. Bastami M.A., Amer M.M., Khilfa D.A., Hamouda A.S. Effect, of live Gumboro disease virus vaccine on the immune response of chickens to Newcastle disease vaccination. //Assiut. veter. Died. J. 1986. -Vol.17, № 33. - P. 205-209.

48. Baxendale W. Immunity to infectious bursal disease. // Avian Immunology Proc. of the 16th poult. Sci. Symp. -1981. P. 227-234.

49. Baxendale W., Lutticken D. The results of field trials with an inactivated Gumboro vaccine. //Dev. Biol. Stand. -1982. -Vol.51, № 2. P. 211-219.

50. Bayyari G.R., Story J.D., Beasley J.N., Skeeles J.K. Pathogenicity studies of an Arkansas variant infectious bursal disease virus. // Avian Dis.- 1996. Vol.40, №3. - P. 516-532.

51. Bayyari G.R., Story J.D., Beasley J.N., Skeeles J.K. Antigenic characterization of an Arkansas isolates of infectious bursal disease virus. // Avian Dis.-1996. Vol.40, № 3. - P. 588-599.

52. Becht H, Muller H., Muller H.K. Comparative studies on structural and antigenic properties of two serotypes of infectious bursal disease virus. // J. gener. Virol. 1988. -Vol.69, № 3. - P.631-640.

53. Becht H. Infectious bursal disease virus. // Gorret Top.Microbiol. Immunol.-1980. Vol.90. -P.107-121.

54. Beltran I., Lucio В., Antillon A. Evaluation of infectious bursal disease (IBD) vaccination programs in the field. // Proceedings of 30 th Western poultry disease conference and 15 th Poultry health symposia. 1981. - P. 4-5

55. Bennejean G. Immullation des vaccins aviaires a virus inactives en ex-ciolent huileux: bilans et perspectives. //Dev. Biol. Stand. -1982. Vol.51. - P.11-17.

56. Berg N.W. Rapid detection of infectious bursal disease antibodies by counter immunoelectrophoreais. // Avian Path. 1982. Vol.11, № 4. - P. 611-614.

57. Bidin Z. Immunosupresija i bolesti immunokompetentnih organa peradi. //Praxis Veter.-1986. -Gb.34, br.3/4. P. 263-272.

58. Box P. High maternal antibodies help chickens beat virulent virus. // World Poultry. 1989. - 53. - P. 17-19.

59. Brown J., Resurrection R.S., Dickson T.G., Home A. The relationship of egg yolk and serum antibody. 1. Infectious bursal disease virus. // Avian Dis.-1989.-T. 33, №4.-P. 654-656.

60. Budincevic Ivanka. Usporedno istrazivanje imunogenosti vakcina Gam-borske bolesti pri premljenih iz virusa umnozenih na stanicnoj kulturi pilecih fibro-blasta odnosno na pilecem embriju. // Peradarstvo. 1986. - Vol.21,№ 4. - P. 11-15.

61. Bumstead N., Reece R.L., Cook J.K.A. Genetic differences in susceptibility of chicken lines to infection with infectious bursal disease virus. // Poultry Sc.-1993. Vol. 72, N3,- P. 403-410.

62. Butcher G.D., Harms R.H., Winerfiled R.W. Relationship between delayed on set of egg production and involution of the bursa of fabricius in white leghorn chickens. //Avian Dis.-l989. Vol.33, №. 2. - P. 361-364.

63. Cao Y.C., Yeung W.S., Law M., Bi Y.Z., Leung F.C. & Lim B.L. Molecular characterization of seven Chinese isolates of infectious bursal disease virus: classical, very virulent, and variant strains. //Avian Dis.- 1998. №42. - P. 340-351.

64. Cavanagh D. Monoclonal antibody and nucleic acid probes for the diagnosis of avian diseases. // Avian Dis.-1986. Vol. 30, №1. - P. 12-18.

65. Cernik K. Die Verbreitung von Adenoviren, Reoviren und Viter der +Infektiosen Bursitis in Geflugevgrossbestanden in der CSSR. // Wien. tierarztl. Mschr.- 1985,- T. 72, №1. P. 7-13.

66. Cessi D., Nardelli. Infectious bursal disease vaccine. Some remarks on production and control. //Dev. biol. stand. 1976. - Vol. 33. - P. 340-342.

67. Cessi D., Gualandi L. Infectious bursal disease (Gumboro disease) and its control in Italy. // Bull. off. int. Epizoot. 1977. - Vol.88, № 4-5. - P. 255-262.

68. Chandra M., Singh В., Gupta P.P. et al. Clinicopathological, hematological and biochemical studies in some outbreaks of nephritis poultry. // Avian Dis.- 1985. -Vol.29, № 3. -P.590-600.

69. Chandravanshi R.R.S. Strategic planning of IBD control. // Poultry Adviser.-1993. Vol.26. - P. 8.

70. Chang C.P., Hamilton P.B. Increased severity and new symptoms of infectious bursal disease during alfatoxicosis in broiler chickens. // Poultry Dis.- 1982. -Vol.61, №6,- P.1061-1068.

71. Chang J.D.T., Eidson C.S., Kleven S.H. Vaccination against Marek "s disease and infectious bursal disease. 3. Growth rate of both turkey herpesvirus and infectious bursal disease virus in coinfected cell. // Poultry Sci.- 1985. T. 64, № 5. -P. 841-843.

72. Ghang D.S., Eidson C.S., Kleven S.H. Simultaneous applicatioT of live turkey herpesvirus and infectious bursal disease vaccines against Mareks disease and infectious bursal disease. // Poultry Sci.- 1985. Vol.64, № 1. -P.78-83.

73. Chettle N.J., Stuart J.C. & Wyeth P.J. Outbreaks of virulent infectious bursal disease in East Anglia. // Veterinary Record. 1989. -№125. - P. 271-272.

74. Cloud S.S., Lillehoj H.S. & Rosenberger J.K. Immune dysfunction following infection with chicken anemia virus and infectious bursal disease virus. I.

75. Kinetic alterations of avian lymphocytes subpopulations. // Veterinary Immunology and Immunopathology. -1992a. 34. - P. 337-352.

76. Coletti M. Immunodepressione da malattia di Gumboro. // Selez.veter. -1997. -N 8/9. P. 611-628.

77. Cosgrove A.S. An apparently new disease of chicken-avian nefrosis. // Avian Disease. 1962. -№6. - P. 385-389.

78. Cowenhowen H. (1991) Vaccination dates prediction for gumboro disease. //http: www/manzaanodragon. Com/manzanovalley / gumborobroilers

79. Dai Hai Yu. Inhibitory factor on plague formation of infectious bursal disease virus in bovine serum. // J. Jap. Vet. Med. Assn.- 1984. -Vol.37, № 11. P. 725-729.

80. Dai-Hai Yu, Izawa Hisao, Kodami Takesi. Mechanism of suppression by bovine serum on growth of infectious bursal disease virus. // Jap. J. Vet. Sci.- 1986. -Vol.48, № 6. -P.1141-1146.

81. Dhillon A. Dhillon A. Singh. Pathology of avian adenovirus serotypes in the presence of Escherichia coli in infectious bursal disease virus infected specific-pathogen-free chickens. // Avian Dis.- 1986. Vol.30, № 1. - P.81-86.

82. Dohms J.E., Saif l.M. Criteria for evaluating immunosuppression. // Avian Dis.- 1984. Vol.28, № 2. -P.305-310.

83. Dohms J.E., Jaeger J.S. The effect of infectious bursal disease virus infection on local and systemic antibody responses following infection of 3-week-old broiler chickens. //Avian Dis.-1988. Vol.32, № 4. p.632-640.

84. Dormitorio T.V., Giarobrone J.J., Duck L.W.Sequence comparisons of the variable VP2 region of eight infectious bursal disease virus isolates. // Avian Dis.-1997,-Vol.41, №1. p. 36-44.

85. Dorn P. Wirksamkeit von Gumboro-Vakzinen bei Mastelterntieren und deren Kuken Dt. // Geflugelwirtsch. Schwemeprod. 1986. - T. 38, №20. - P. 590591.

86. Dybing J.K., Jackwood D.J. Antigenic and immunogenic properties of baculovirus-expressed infectious bursal disease viral proteins. //Avian Dis.- 1998. -Vol.42, №1. P. 80-91.

87. Eddy R.K. Antibody responses to infectious bursal disease virus serotypes 1 and 2 in ducks. // Veter. Rec.-1990. T. 127, №15. - P. 382.

88. Eddy R.K., Chettle N.J., Wyeth P.J. Serological survey of the incidence of infectious bursal disease serotypes 1 and 2 in chicken and turkey flocks in England. // Veter. Rec.- 1985. T. 117, №16. - P. 415.

89. Edwards K.R., Muskett J.C., Thornton D.H. Duration of immunosupres-sion caused by a vaccine strain of infectious bursal disease virus. // Res. Vet. Sci.-1982. Vol.32, №1. -P.79-83.

90. Edwards J. Battom fine has killed vaccines. // Poult. Dig. -1985. Vol. 44, №515. -P. 8-9.

91. Eidson C.S., Gelb J., Villegas P. Comparison of incativated and live infectious bursal disease virus vaccines in White Leghorn breeder flock. // Poultry Sci.-1980. Vol.59, № 121. - P. 2708-2716.

92. Fadly A.M., Witter R.L., Lee L.F. Effects of chemically or virus-induced immunodepression on response of chickens. // Avian Dis.- 1985. T. 29, №1. - P. 12-25.

93. Fahey K.J., Erny К., Crooks J. A Conformational immunogen on VP-2 of infectious bursal disease virus that induces Virus-neutralizing antibodies that passively protect chickens. // J. gener. Virol. 1989. - T. 70, №7. - P. 1473-1481.

94. Fernandez-Arias A., Martinez S. & Rodriguez J.F. The major antigenic protein of infectious bursal disease virus, VP2, is an apoptotic inducer. // Journal of Virology. -1997. 71. - P. 8014-8018.

95. Fusel L.W. Poultry industry strategies for control of immunosuppressive diseases. // Poultry Sc.-1998. Vol.77, №8. - P. 1193-1196.

96. Gardin Y. Controle de la vaccination contre la maladie de Gumboro par la methode Elisa. //Aviculteur. 1990. - T. 511. - P. 64-71.

97. Giambrone J.J. IBD spray vaccination: if water fails, try it. // Broiler Ind.- 1984. T. 47, №10. -P. 52-54.

98. Giambrone J.J. Microculture neutralization test for serodiagnosis of three avian viral infections. // Avian Dis.-1980. Vol. 24, №1. - P.284-287.

99. Giambrone J.J. Experience with Gumboro disease vaccines. // Broiler Ind.- 1983. Vol.10, №3. - P. 80-86.

100. Giambrone J.J., Clay R.P. Efficacy of coarse sprays administration of commercial intermediate infectious bursal disease vaccines. // Poultry Sci.- 1986. -Vol.65, №4. -P.807-808.

101. Giambrone J. J., Clay R.P. Evaluation of the immunogenicity, stability, pathogenicity, and immunodepressive potential of four commercial live infectious bursal disease vaccine. // Poultry Sci.- 1986. Vol.65, №7. - P.1287-1290.

102. Giambrone J.J., Clay R.P. Vaccination of day-old broiler chicks against Newcatle disease and infectious bursal disease, using commercial live and/or inactivated vaccines. //Avian Dis. 1986. - Vol.30, №3. - P.557-561.

103. Giambrone J.J., Eckman M.K. Immunization of young broiler chickens with IBD virus vaccine. // Highlights Agr. Res.- 1980. -Vol.27, № 2. P. 18.

104. Glick B. The ontogeny and microenvironment of the avian thymus and bursa of Fabricius: contribution of specialized cells to the avian immune response. // Adv. in veter.Sci.comp. Med.- New York, London, 1985. -Vol.30. P. 825-827.

105. Granzow H., Birghan C., Mettenleiter T.C., Beyer J., Kollner B. & Mundt E. A second form of infectious bursal disease virus-associated tubule contains VP4. // Journal of Virology. -1997. 71, №11.- P. 8879-8885.

106. Gudding R., Schaller G.Vaksinasjon mot infeksios bursitt (Gumbor6 disease). //Fjorfe. -1990. -T. 107,№4. -S. 170-171.

107. Habnewald R., Paesch R., Ziedler K. Untersuchungen zur Antikorper-entwicklung bei ein und zweimaliggegen infektiose Bursitis immunisierten Junghen-nenbestanden der Legerichtung. // Mh. Veter. Med.-1990. T. 45, №18. -S.37-41.

108. Haddad E.E., Whitfill C.E.,Avakian A.P., Ricks C.A., Andrews P.D., Thoma, J.A.& Wakenell P.S. Efficacy of a novel infectious bursal disease virus immune complex vaccine in broiler chickens. //Avian Dis.-1997. -41. -P. 882-889.

109. Haffer K. Gumboro disease serious immunosuppressor. // Poultry Intern. -1987,-Vol.26, №5. -P.38.

110. Henderson K.S., Jackwood D.J. Comparison of the dot blot hybridization assay with antigendetection assays for the diagnosis of infectious bursal disease virus infections. //Avian Dis.- 1990. T. 34, №3. -P. 744-748

111. Henry C.W., Williams W.P. The detrimental effect of vaccinating parentally immune broilers with a modified live virus vaccine for infectious bursal disease.//Avian Dis.-l 980. -Vol.24. -№ 4. P. 1021 -1026.

112. Hiraga M., Nunoya Т., Otaki Y., Tajima M., Saito T. & Nakamura T. Pathogenesis of highly virulent infectious bursal disease virus infection in intact andbursectomized chickens. // Journal of Veterinary Medical Science. -1994. 56. - P. 1057-1063.

113. Hirai K., Calnek B.W. In vitro replication of infectious bursal disease, virus in established lymphoid cell lines and chicken B-lymphocytes. // Infect. Im-mun.-1979. Vol.25, № 3. p. 964-970.

114. Hirai K., Funakoshi Т., Makai Т., Shimakura S. Sequential changes in the number of surface immunoglobulin bering B- lymphocytes in infectious bursal virus-infected chickens. // Avian Dis.- 1981. Vol.25, № 2. - P.484-496.

115. Hitchner S.B. Limitations of vaccines for poultry. // Poult. Dig. -1983.- Vol.49. P.29-30.

116. Howie R.I. & Thorsen J. Identification of a strain of infectious bursal disease virus isolated from mosquitoes. // Canadian Journal of Comparative Medicine. -1981. -45. P. 315-320.

117. Hudson P.J., McKern M.M., Pahey K.J., Azad A.A. Predicted sequence of the host-protective immunogen of infectious bursal disease virus. // FEES Letters. -1986. Vol.201, № 1. - P. 143-146.

118. Ide P.R Infectious bursal diseas. // Poultry health Bull. -1986. Vol. 1.-P. 1-4.

119. Igbokwe 1.0. Salako M.A., Rabo J.S., Hassan S.U. Outbreak of infectious bursal disease associated with acute septicemia colibacillosis in adult prelature hens. //Rev. Elevage Med.veter. -1996. -T.49, №2. P. 110-113.

120. Iordanidis P.I., Koumpati M.G., Artopios E.V. The role of maternal antibodies in preventing infectious bursal disease (IBD, Gumboro disease) during the first weeks of age of chicks. // Bull.Hellen.Veter.Med.Soc. -1991. -Vol. 42, № 4.- P. 245-249.

121. Ismail N.M., Saif Y.M., Wigle W.L. Infectious bursal disease virus variant from commercial leghorn pullets. // Avian Dis.-1990. T. 34, № 1. -P. 141-145.

122. Jackwood D.J., Saif Y.M., Moorhead P. D. Immunogenicity and anti-geniciti of infectious bursal disease virus serotypes II and I in chickens. //. Avian Dis. 1985. - Vol.29, №4. - P. 1184-1194.

123. Jackwood D.H., Saif Y.M., Hughes J.H. Replication of infectious bursal disease virus in continuouscell lines. // Avian Dis.- 1987. T. 31, №2. - P. 370375.

124. Jackwood D.J., Sommer S.E., Odor E Correlation of enzyme-linked immunosorbent assays titers with protection against infectious bursal disease virus. // Avian Dis.- 1999. Vol.43, № 2. - P. 189-197.

125. Jackwood D.H., Saif Y.M. Antigenic diversity of infectious bursal disease viruses. // Avian Dis.- 1987. Т. 31, № 4. - P. 766-770.

126. Jackwood D.J., Jackwood R.J. Molecular identification of infectious bursal disease virus strains. // Avian Dis.-1997. -Vol.41, №1. P. 97-104.

127. Jamaguichi S., Jmade Т., Kawamura H. Growth and infectivity titration of virulent infectious bursal disease virus in established cell lines from lymphoid leukosis tumor. //Avian Dis.-1981. -Vol.25, № 4. P.927-935.

128. Jetteur P. Stabilite au frigo ET au congelateur du vaccin D 78 contre la maladie de Gumboro du poulet: Essai prelim. // Tropicultura. -1990. Vol.8, № 3- P. 147-148.

129. Jhala M.K., Kher H.N., Chaudhari H.M. Immunosuppressive effect of infectious bursal disease virus against Newcastle disease vaccination. // Indian J. anim. Sc.- 1990. -T. 60, № 9. P. 1065-1066

130. Josipivic D., Puhar J., Mrzel J. et al. Uppesnost upotrebe inaktivisane vakcine GUMBORO bolesti-Pliva // Peradarstvo. -1985. Vol.20, № 5. - P.5-6.

131. Johnston P.A., Liu H., O'Connell Т., Phelps P., Bland M., Tyczkowski J., Kemper A., Harding Т., Avakian A., Haddad E., Whitfill C., Gildersleeve R. & Ricks C.A. Applications in ovo technology. // Poultry Science. -1997. -76. P. 165178.

132. Kaufer I., Weiss E. Significance of bursa Fabricius as target organ in infectious bursal disease of chickens. // Infect Immune. 1980. - Vol.27, № 2. -P.364-367.

133. Kawamura H., Samaguchi S. Growth of infectious bursal disease virus in established cell lines from lymphoid leukosis tumors. // 7th Intern. Gongr. of the World Veter. Poult. Assoc., Oslo-Horway, July 1-3. -1981. P.34.

134. Kembi F.F., O.O.Delano, M.A.Oyekunle. Effect of three different routes of administration on the immunogenicity of infectious bursal disease vaccine. //Revue Elev.Med.vet.Paus trop-1995. -48(1). -P. 33-35.

135. Kibenge, F.S.B., Qian, В., Cleghorn, J.R. & Martin, C.K. . Infectious bursal disease virus polyprotein processing does not involve cellular proteases. // Archives of Virology. -1997. -142, №12. P. 2401-2419.

136. Kissling R., Henk P. Erfahrungen mil der Gumboro-Vakzinierung in Osterreich. //Arch. Geflugelk. 1983. -Bd47,H6. - S.225-232.

137. Klucinski W., Kopec-Szlezak J., Grabarczyk M. Morphological changes in blood lymphocytes of chickens infected with infectious bursal disease virus. // Zbl. Veter.-Med. Reihe B. 1984. - T. 31. -S. 518-525.

138. Kreager K. Successfully vaccinating for IBD. // Egg Ind.- 1989. T. 95, №8. -P. 18-20.

139. Kreater K. JBD vaccination timing. // J. Poult. Dig. 1988. - Vol. 47, № 552.-P. 126.

140. Kulkarni A.B., Paranjpe V.L., Sardeshpande P.D., Ajin-kya S.M. Immunological studies with egg adapted infectious bursal disease virus. // Curr. Sci. 1984. - Vol.53, № 16. - P.852-854.

141. Lamas J.H.Problemas secundarios decorrentes da doenca de Gumboro. // Avicult. Suinocult. Industr. Carnes. 1990. - T. 80, № 968. - P. 28-29.

142. Landgraf H. New prophylactic aspects of gumboro vaccination. // Poultry internat. -1986. -T. 25, № 2. -P. 64, 66-67

143. Lange H., Muller H., Kaufer J., Beeht H. Pathogenic and structural properties of wild type infectious bursal disease virus (IBDV) and virus grown in vitro. // Arch. Virol. 1987. -Vol.92, № 3-4. - P. 187-196.

144. Lasher, H.N. & Shane, S.M. Infectious bursal disease. //World's Poultry Science Journal. -1994. 50. -P. 133-166.

145. Lin Z., Kato A., Otaki Y., Nakamura Т., Sasmaz E. & Ueda S. Sequence comparison of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. // Avian Diseases. 1993. - P. 315-323.

146. Lucio В., Hitchner S.B. Response of susceptible versus immune chicks to killed, live-modified, and wild infectious bursal disease virus vaccines. // Avian Dis. 1979. - Vol.23, № 4. -P. 1037-1050.

147. Lukert P.D., Leonard J., Davis R.B. Infectious bursal disease virus: Antigen production and immunity. // Am. J. Veter. Res.- 1975. Vol.36, № 4. - P. 539540.

148. Mazariegos L.A., Lukert P.D., Brown J. Pathogenicity and immunosuppressive properties of infectious bursal disease "Intermediate" strains. // Avian Dis.- 1990. T. 34, №1. -P. 203-208

149. Mcllroy, S.G., Goodall, E.A. & McCracken, R.M. Economic effects of subclinical infectious bursal disease on broiler production. // Avian Pathology. -1989.-18, №3.-P. 465-480.

150. Mcllroy S.G., Goodall E.A., Bruce D.W., McCracken R.M. & McNulty M.S. The cost benefit of vaccinating broiler flocks against subclinical infectious bursal disease. // Avian Pathology. 1992. - 21, №1. - P. 65-76.

151. Mc Nulty M.S., Allan G.M. and McFerran J.B.Isolation of infectious bursal disease virus from turkeys. // Avian Patrol. 1979. - 8. - P. 205-212.

152. Montgomery R.D., Villegas P., Dawe D.L., Brown JA Comparison between the effect of an avian reovirus and infectious bursal disease virus on selected aspects of the immune system of the chicken. // Avian Dis.- 1986. T. 30, № 2.-P. 298-308.

153. Mousa S., Soliman A., Gad N. Immune response and patogenecity of commercially available infectious bursal disease vaccines. // Assuit. veter. med. J. -1988. Vol.20, № 39. - P. 186-192.

154. Muller H.Replication of infectious bursal disease virus in lymphoid cells. // Arch. Virol. -1986. T. 87, № 3-4. - P. 191-203.

155. Muller H., Schnitzler D., Bernstein F., Becht H., Cornelissen D. & Lut-ticken D.H. Infectious bursal disease of poultry: antigenic structure of the virus and control. // Veterinary Microbiology. 1992. - 33. - P. 175-183.

156. Mundt E., Beyer J. & Muller H. Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus infected cells. // Journal of General Virology. 76. -P. 437-443.

157. Mundt E. & Vakharia V.N. Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996. - 93. - P. 11131-11136.

158. Mundt E., Kollner B. & Kretzschmar D. VP5 of infectious bursal disease virus are not essential for viral replication in cell culture. // Journal of Virology. 1997. -71.-7. -P. 5647-5651.

159. Nagarajan M.M. & Kibenge F.S.B. Infectious Bursal Disease Virus: a review of molecular basis for variations in antigenicity and virulence. // Canadian Journal of Veterinary Research. 1997a. - 61. - P. 81-88.

160. Nagarajan M.M. & Kibenge F.S.B. The 5'-terminal 32 base pairs conserved between genome segment A and В contain a major promoter element of infectious bursal disease virus. // Archives of Virology. 1997b. -142. -P. 2499-2514.

161. Nagi S.A., Marquez В., Sahin N. Maternal antibody and its effect on infectious bursal disease immunization. // Avian Dis. 1983. - Vol.27, № 3. - P.623-631.

162. Nakamura Т., Otaki Y., Lin Z., Kato A. Rapid and quantitative assay system for measuring anti-infectious bursal disease virus antibody using monoclonal antibody bound to polystyrene latex microspheres. // Avian.Dis. 1993. - Vol. 37, № 3. - P. 786-792.

163. Nielsen O.L., Sorensen P., Hedemand J.E., Laursen S.B., & Jorgensen P.H. Inflammatory response of different chicken lines and В haplotypes to infection with infectious bursal disease virus. // Avian Pathology. 1998. -27. -P. 181-189.

164. Nieper H. & Muller H. Susceptibility of chicken lymphoid cells to infectious bursal disease virus does not correlate with the presence of specific binding sites. //Journal of General Virology. 1996. - Vol.77, № 6. -P. 1229-1237.

165. Nunoya Т., Otaki Y, Tajima M, Hiraga M. & Saito T. Occurrence of acute infectious bursal disease with high mortality in Japan and pathogenically of field isolates in SPF chickens. // Avian Diseases. 1992. - 36. - P. 597-609.

166. Ojeda F., Skardova I., Guarda M.I., Ulloa J. & Folch H. Proliferation and apoptosis in Infection with Infectious Bursal Disease Virus: a flow cytometric study. //Avian Diseases. 1997. - 41. - P. 312-316.

167. Okoye J.O.A., Aba-Adulugba E.P. Comparative study of the resistance or susceptibility of coal Nigerian and exotic chickens to infectious burial disease. // Avian Pathol. 1998. - Vol.27, № 2. - P. 168-173.

168. Oppling V., Muller H. & Becht H. The structural polypeptide of infectious bursal disease virus carries group- and serotype-specific epitopes. // Journal of General Virology. 1991a. -72. - P. 2275-2278.

169. Oppling V., Muller H. & Becht H. Heterogeneity of the antigenic site responsible for the induction of neutralizing antibodies in infectious bursal disease virus. //Archives of Virology. 1991b. - Vol.119. -P. 211-223.

170. Panda S.K., Rao A.T. Effect of infectious bursal disease virus infection on immunity to ranikhet disease in chickens. // Poultry Adviser. 1993. - Vol. 26, iss. 10. - P. 35-38.

171. Panisup A.S., Verma K.C., Kataria J.M. Infectious bursal disease in chickens: disease status precipitated condition and experimental studies. // Indian J. Poultry Sc.- 1987. T. 22, № 3. - P. 245-250.

172. Petek M. And Mandelli G. Proprieta biologichedium reovirus isolato da un facalaio di malattia Gomboro. //Atti. Soci. Ital. Sci. Vet. -1968. -№22. P. 875879.

173. Rao V.S.R. Infectious bursal disease in chickens. A study report. // Poultry Adviser. 1988. - T. 21, № 12. -P. 49-52.

174. Ray D.K., Bhowmik M.K., Sarkar P. Effect of experimental infection of infectious bursal disease virus in White Leghorn chickens. // Indian J. Poultry Sc.-1985. -T. 20, №4. -P. 249-254.

175. Reece R.L., Gould J.A., Hindmarsh M. Studies on a vaccine against infectious bursal disease. //Aust. Vet. J. 1982. - Vol.59, №1. - P.27-29.

176. Renaldi A., Cessi D., Cervio G., Lodetti E. Attenuazione del virus della malattia di Gumboro e prove vaccinazione in laboratorio e in practica. // Kuova veter.- 1972. An. 48, № 4. -P.216-223.

177. Rojs O.Z. Infectious bursal disease in Slovenia: current situation and control by different vaccination programs. // Praxis veter.- 1998. Vol.46, № 1/2. -P. 67-72.

178. Rosales A.G., Villegas P., Lukert P.D. Pathogenicity of recent isolates of infectious bursal disease virus in specific-pathogen-free chickens: Protection conferred by an intermediate vaccine strain. // Avian Dis.- 1989. T. 33, № 4. - P. 729734.

179. Rosales A.G. Designing an effective Gumboro control program. // Poultry Dig. 1989. - T. 48, № 565. - P. 120-124.

180. Rosenberg J., Sharma J, Belzer S.W., Nordgren R.M. & Nagi S. Flow cytometric analysis of Bcell and T cell subpopulations in virus. // Avian Diseases. -1994. -38. P. 16-21.

181. Sharma J.M. Embryo vaccination of specific-pathogen-free chickens with infectious bursal disease. Virus: tissue distribution of the vaccine virus and protection of hatched chickens-against disease. // Avian Ids. 1986. - T. 30, №4. -P. 776780.

182. Sharma J.M., Karaca K., Pertile T. Virus-induced immunosuppression in chickens. // Poultry Sc.- 1994. Vol. 73, №7. - P. 1082-1086.

183. Smith R. Discovery of IBD variants suggests need for new vaccines. // Foodstuffs. 1986. - T. 58, № 13. -P. 10.

184. Snyder D.B. changes in the field status of infectious bursal disease virus. // Avian Pathol. 1990. - T. 19, № 3. - P. 419-423

185. Silim A., Venne D. Comparison of egg-yolk and serum antibody titers to four avian viruses by enzyme-linked immunosorbent assay using paired field samples. // Avian Dis.- 1989. T. 33, № 4. - P. 643-648.

186. Snyder D.B., Vakharia V.N. & Savage P.K. Naturally occurring-neutralizing monoclonal antibody escape variants define the epidemiology of infectious bursal disease viruses in the United States. // Archives of Virology. 1992. -127.-P. 89-101.

187. Sofei D.M., Avram E., Danes M. Gumbovivac-CC live vaccine against infectious bursal disease prepared on cell cultures Studies and researches in veterinary medicine. // Bucharest. 1996. - Vol.4. - P. 31.

188. Solano W., Giambrone J.J., Williams J.C. et al. Effect of maternal antibody on timing of initial vaccination of young with leghorn chickens against infectious bursal disease virus. // Avian Dis.-1986. Vol.30, № 4. - P. 648-652.

189. Survashe B.D. Watch out for Gumboro. // Poultry. 1990. - Vol. 6, №3. - P. 37-39.

190. Tsukamoto K., Obata H., Hihara H. Improved preparation of ELISA antigen of infectious bursal disease virus. // Avian Dis.- 1990. T. 34, №1. - P. 209213.

191. Thompson G., Mohammed H., Bauman В., Naqi S. Systemic and local antibody responses to infectious Bronchitis virus in chickens inoculated with infectious bursal disease virus and control chickens. // Avian Dis.- 1997. Vol.41,№ 3. -P. 519-527.

192. Thornton G. Mississipi IBD problem, solutions are explained. // Poultry Dig. 1982. - Vol.41, № 490. - P. 604-605.

193. Tsukamoto K., Matsumura Т., Mase M., Imai K. A highly sensitive, broad-spectrum infectivity assays for infectious bursal disease virus. // Avian Dis.-1995. Vol.39, №3. -P. 575-586.

194. Yamada S., Matsuo K., Uchinuno Y. Susceptibility of ducks and. duck-origin cells cultures to infectious bursal disease-virus. // Avian Dis.-1982. -Vol. 26, №3. P. 596-601.

195. Yamaguchi Т., Ogawa M., Miyoshi M., Inoshima Y., Fukushi H. & Hirai K. Sequence and phylogenetic analyses of highly virulent infectious bursal disease virus. // Archives of Virology. -1997. №142. - P. 1441-1458.

196. Yao K., Takamoto N. Infectious disease in chickens. // Niwaatori-No-Kenkyi-1981. -Vol.56,№12. -P. 63-67.

197. Vakharia V.N., He J., Ahamed B. & Snyder D.B. Molecular basis of antigenic variation in IBDV. //Virus Research. -1994b. №31. - P. 265-273.

198. Van den Berg T.P. & Meulemans G. Acute infectious bursal disease in poultry; protection afforded by maternally derived antibodies and interference with live vaccination. // Avian-Pathology. -1991. T. 20, № 3. - P. 409-421.

199. Van den Berg T.P., Gonze M., Morales D. & Meulemans G. Acute infectious bursal disease in poultry: immunological and molecular basis of antigenicity of a highly virulent strain. //Avian Pathology. 1996. -Vol.25, №4. - P. 751-768.

200. Whetzel P.L., Jackwood D.J. Comparison of neutralizing epitopes among infectious bursal disease viruses using. // Avian Dis.- 1995. Vol.39, № 3. -P. 499-506.

201. Winterfield R.W., Dhillon A.S., Thacker H.L., Alby L. Immune responseof white leghorn chicks from vaccination with different strains of infectious bursal disease virus. // Avian Dis.-1980. -Vol.24, № 1. P. 179-188.

202. Winterfield R.W., Thacker H.L. Immune response and pathogenicity of different strains of infectious bursal disease virus applied as vaccines. // Avian Dis.-1978,-Vol.22, №4. P. 721-731.

203. Wood G.W., Muskett J.C., Thornton D.H. The interaction of live vaccine and maternal antibody in protection against infectious bursal disease. // Avian Path.-1981,-Vol.10, №3.-P.365-373.

204. Wyeth P.J., Cullen G.A. Maternally derived antibody effect on susceptibility of chicks to infectious bursal disease . //Avian, path.-1976,- Vol.5.- P.253-260.

205. Wu C.C., Thiagarajan D., Lin T.L. ELISPOT assay for detection of antibody secreting cells to infectious bursal disease virus in chickens. // Poultry Sc.-1998. Vol.77, № 5. - P. 662-669.

206. Yachida S., Iritani Y. Plaque reduction neutralization tests for the serodi-agnosis of infectious bursal disease. // Jap. J. Veter. Sci.- 1977. Vol.39, № 1. - P. 15.

207. Zajac J., Novotna L. Vyhodnotenie vysledkov ELISA pri kvantitativ-nom stanoveni protilatok proti infekcnej burzitide hydiny. // Veter.Med. (Praha). -1991.-T. R. 36, c. 12. S. 737-743.

208. Zorman O., Cajavec S., Josipovic D. Evaluation of the inactivated infectious bursal disease vaccine (gumpeskal, PLIVA) in laboratory and field conditions. //Praxis Veter.-1991. T. 39, № 1. - S.85-94.115

Информация о работе

Гетман, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Щёлково, 2000
ВАК 03.00.23

Диссертация

Технологические этапы изготовления культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы