Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бивалентная вакцина против болезни Марека из вируса 1 и 3 серотипов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Бивалентная вакцина против болезни Марека из вируса 1 и 3 серотипов"

На правах рукописи

Абдуллоева Елена Юрьевна

БИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА ИЗ ВИРУСА 1 И 3 СЕРОТИПОВ

03.02.02 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 НОЯ 2015

Владимир-2015 005564224

005564229

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» ФГБУ «ВНИИЗЖ»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Камалова

Наталья Евгеньевна

Официальные оппоненты: Еремец Владимир Иванович - доктор

биологических наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», заместитель директора по научной работе

Ярыгина Елена Игоревна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», профессор кафедры

радиобиологии и вирусологии имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва

Защита состоится 15 декабря 2015 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир). Полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного руководителя размещены на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» www.arriah.ru.

Автореферат разослан «15» октября 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета ФГБУ «ВНИИЗЖ», кандидат -

биологических наук у^'К^^ТХ'МС Жбанова Татьяна Валентиновна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Птицеводство в Российской Федерации (РФ) является одной из важнейших отраслей сельскохозяйственного производства. Значительное влияние на экономические показатели хозяйств птицеводческой индустрии оказывают иммунодепрессивные вирусные заболевания, приводяшие к гибели птицы. Одной из таких инфекций является болезнь Марека (БМ) — неопластическое заболевание, характеризующееся различным проявлением клинической картины - от параличей до образования лимфоидных опухолей внутренних органов и кожи. Вместе с тем снижается общая резистентность инфицированной птицы к другим инфекциям. Вакцинопрофилактика является неотъемлемой мерой борьбы с БМ. Однако, несмотря на повсеместное применение вирусвакцин против БМ, в РФ на сегодняшний день процент гибели от заболевания фиксируется в пределах 5-35%, представляя серьезную проблему и принося убытки птицехозяйствам. Одной из причин инцидентности заболевания является появление более вирулентных штаммов вируса болезни Марека (ВБМ), против которых существующие в РФ моновалентные и бивалентные вирусвакцины недостаточно эффективны.

Конструирование поливалентных вирусвакцин основано на комбинации апатогенного для кур вируса герпеса индеек (ВГИ, ВБМ 3 серотипа) и двух других серотипов ВБМ. Однако бивалентная вирусвакцина из вируса 2 и 3 серотипов способна защитить против действия патотипа средней вирулентности и малоэффективна для птицеводческих хозяйств с высоким уровнем заболеваемости, а вирусвакцины на основе комбинации вируса серотипов 1+2+3 не рекомендуют применять на птице родительского стада, так как в этом случае невозможна ротация вакцинации.

Для профилактики инфекции за рубежом применяют вирусвакцины на основе ВБМ 1 и 3 серотипов, которые не уступают по эффективности вирусвакцине из ВБМ 2 и 3 серотипов и способны защитить против действия высоко- и особовирулентных изолятов ВБМ. Вследствие отсутствия отечественного аналога руководители птицеводческих хозяйств вынуждены закупать вирусвакцину на основе ВБМ серотипов 1+3 у зарубежных фирм по достаточно высоким ценам. Таким образом, разработка отечественной высокоэффективной клеточно-ассоциированной бивалентной вирусвакцины против БМ из штаммов вируса 1 и 3 серотипов и оценка ее иммуногенности является актуальной для обеспечения ветеринарного благополучия по БМ в птицеводческих хозяйствах страны.

1.2 Степень разработанности проблемы. Опубликовано значительное количество работ о результатах исследований и внедрении в ветеринарную практику вакцин против БМ (Лукина В.А., 1991, 1992; Куляшбекова Ш.К., 2000, 2003, 2005; Курненкова Е.В., 2009; ПяткинаА.А., 2009; Basarab О., 1976; Biggs P.M., 1997; Buscaglia С., 2004; Cui Н, 2013; Witter R.L., 1982, 1992, 2001). Число вакцинных штаммов вируса, обладающих высокой иммуногенностью, ограничено. В РФ большое распространение получили моновалентные вирусвакцины из ВБМ штаммов «3004» и «Владимир» 1 и 3 серотипов, соответственно, обладающие достаточно иммуногенным действием и обеспечивающие адекватной защитой против вирулентного ВБМ.

За рубежом разработаны и активно применяются бивалентные вирусвакцины из ВБМ 1 и 3 серотипов. Публикаций, посвященных исследованиям по разработке бивалентной вирусвакцины из ВБМ 1 и 3 серотипов в РФ, в доступной научной литературе не было. Поэтому для ветеринарии РФ вопрос о разработке клеточно-ассоциированной бивалентной вирусвакцины против БМ из эффективных отечественных штаммов вируса является актуальным.

1.3 Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка клеточно-ассоциированной бивалентной вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3» из ВБМ штамма «3004» и вируса герпеса индеек (ВГИ) штамма «Владимир» и изучение ее иммунобиологических характеристик. Для выполнения поставленной цели были определены следующие задачи:

-оценить возможность использования синтетических коммерческих питательных сред для получения вакцинного сырья из ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир»;

- определить иммунизирующую дозу клеточно-ассоциированной бивалентной вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3» из ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир»;

-доказать отсутствие интерференции между ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», входящими в состав вирусвакцины «Маривак 1+3»;

- исследовать стабильность клеточно-ассоциированных ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», входящих в состав вирусвакцины «Маривак 1+3»;

- доказать эффективность и безвредность бивалентной вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3».

1.4 Научная новизна исследований:

- разработана отечественная клеточно-ассоциированная бивалентная вирусвакцина против БМ «Маривак 1+3» из ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир»;

- проведена сравнительная оценка культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с использованием различных синтетических коммерческих питательных сред и установлено преимущество применения питательной среды ОМЕМ/Р-12;

- изучены параметры роллерного культивирования вирусов с использованием среды ОМЕМЛМ2;

- определена иммунизирующая доза вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3» и изучены ее иммуногенные и протективные свойства;

-доказано отсутствие интерференции между ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», входящими в состав вирусвакцины «Маривак 1+3», в месте их репликации;

- исследована стабильность ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», входящих в состав вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3»;

- изучена эффективность и безвредность использования вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3» в лабораторных и производственных условиях.

1.5 Теоретическая и практическая значимость исследований. Полученные результаты исследований были использованы при составлении нормативной документации:

- Промышленный регламент на производство вирусвакцины против болезни Марека «Маривак 1+3»;

-СТО на вирусвакцину против болезни Марека «Маривак 1+3» (СТО 00495527-0231-2015);

- Инструкция по ветеринарному применению вирусвакцины против болезни Марека «Маривак 1+3».

Для практического и научного интереса при культивировании вирусов БМ предложено использование синтетической питательной среды ОМЕМЛМ2. Получены уравнения скорости инактивации вируса при экспозиции вирусвакцины против БМ в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» для температурных режимов 4, 22 и 37°С, которые позволяют прогнозировать величину остаточной инфекционности агента в клеточно-ассоциированной вирусвакцине при проведении профилактических мероприятий.

1.6 Методология и методы исследований. Методология исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно-восприимчивых животных. В работе были использованы вирусологические (культивирование и индикация вирусов), молекулярно-биологические (ПЦР), серологические и иммунологические (ИФА, PH, РТМЛ) методы исследований со статистической обработкой данных.

1.7 Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальные данные сравнительной оценки культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с использованием различных синтетических коммерческих питательных сред.

2. Параметры роллерного культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с использованием среды DMEM/F-12.

3. Определение оптимальной иммунизирующей дозы бивалентной вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3».

4. Результаты изучения динамики накопления вируснейтрализующих антител в организме SPF-цыплят, привитых различными вирусвакцинами против БМ производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

5. Накопление вирусов вакцинных штаммов «3004» ВБМ и «Владимир» ВГИ, входящих в состав вирусвакцины «Маривак 1+3», в эпителии перьевых фолликул SPF-цыплят.

6. Результаты изучения безвредности вирусвакцины «Маривак 1+3».

7. Стабильность разработанной вирусвакцины «Маривак 1+3».

8. Результаты испытаний вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3» в условиях птицефабрик.

1.8 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. В ходе выполнения работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГБУ «ВНИИЗЖ» д.в.н. Куляшбекова Ш.К., к.б.н. Пяткина A.A., к.в.н. Кулаков В.Ю., к.б.н. Меньщикова А.Э., к.б.н. Шульпин М.И., к.в.н. Константинов A.B., Константинова Е.А., за что автор выражает им искреннюю благодарность. При проведении отдельных этапов работы практическую помощь оказывали сотрудники лаборатории профилактики болезней птиц сектора культуральных вакцин.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов опытов подтверждена их статистической обработкой. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на

заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2011-2015 гг.), научно-практических конференциях: "Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия" (X Международная науч.-практ. конф., Новосибирск, 2015 г.), «Молодой ученый: естественные и медицинские науки» (III Международная науч.-практ. конф., Санкт-Петербург, 2015 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена также комиссионными испытаниями.

1.10 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для кандидатских и докторских диссертаций.

1.11 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В диссертационной работе представлены результаты исследований по разработке клеточно-ассоциированной бивалетной вирусвакцины против БМ из отечественных штаммов вируса 1 и 3 серотипов. Изучены иммунобиологические и протективные свойства препарата, предназначенного для специфической профилактики заболевания. Результаты научного исследования соответствуют 3, 7 и 10 пунктам паспорта специальности 03.02.02 «Вирусология».

1.12 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 191 источников, в том числе 130 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 6 рисунками и дополнена приложением аннотаций документов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы

Вирус и вакцины. ВБМ, штамм «3004 №109-Деп», и ВГИ, штамм «Владимир №124-Деп», производственные. Инфекционная активность ВБМ штамма «3004 №109-Деп» — 6,0* 10s ФОЕ/см3, ВГИ штамма «Владимир №124-Деп» - 1,2х106 ФОЕ/см3. Штаммы вируса паспортизированы и депонированы в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» [6, 7].

ВБМ, высоковирулентный штамм «Md5», получен из коллекции «Collection of animal viruses and antisera, chlamidiae and rickettsiae» (США, 2006). Инфекционная активность на 7 пассаже составила 2,9x10б ФОЕ/см3.

Вакцины: экспериментальные серии живой клеточно-ассоциированной бивалентной вирусвакцины из ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма

«Владимир» «Маривак 1+3», изготовленные в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ» за период 2011-2015 гг.; производственные серии клеточно-ассоциированных вирусвакцин «Марек-3» из ВГИ штамма «Владимир», «Марек-R» из ВБМ штамма «3004», «Бимарек» из ВГИ штамма «Владимир» и ВГК штамма «SB-1», лиофилизированной вирусвакцины «Марекбройлер» из ВГИ штамма «Владимир» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Сосуды и аппараты. Для культивирования культуры клеток ФЭК и вирусов использовали роллерные сосуды из стекла емкостью 3 дм3 и площадью рабочей поверхности 800 см2, которые помещали в стеллажно-ярусный вращательный аппарат (8-12 об/ч), а также пластиковые флаконы фирмы «Corning» рабочей поверхности 25 и 75 см2, которые выдерживали в стационарных условиях.

Питательные среды, растворы и реактивы. Питательная среда, состоящая из равных частей сред 199, Игла и гидролизата лактальбумина на солевом растворе Хенкса (ГЛАХ); питательные среды фирмы «Sigma»: DMEM/F-12, Маккой-5А, L-15; сыворотка крови КРС; 0,25%-й раствор трипсина; 0,05 М Трис-HCl с 0,2 М NaCl; 0,1% твин-20; коммерческий антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG кур и субстрат пероксидазы фирмы «Synbiotics» (Франция); дистиллированная вода; сахарозофосфатный буфер с добавлением альбумина и глютамата натрия (СФГА); 2%-й забуференный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ).

Лабораторные животные. Суточные SPF-цыплята, цыплята-бройлеры.

Куриные эмбрионы. Использовали 10-12-суточных эмбрионов SPF-кур фирмы «Valo Biomedia» (Германия).

2.2 Методы исследований

Культивирование вируса. Культивирование вирусов проводили в первичной культуре клеток (КК) ФЭК при температуре (38,5±1)°С.

Определение инфекционной активности. Инфекционный титр вируса определяли по числу фокусообразующих единиц (ФОЕ) в монослое клеток ФЭК. Использовали метод последовательных десятикратных разведений вируссодержащей суспензии. Величину титра определяли по формуле (1):

T={[(b1+b2+...+bn)/n]xl0a}/V, (1) где Т - титр вируса, ФОЕ/см3; Ьь Ьг,... Ь„ - количество фокусов во флаконе; п -количество используемых флаконов; V - объем суспензии вируса, внесенный во флакон, ем3; а - показатель степени разведения вируесодержащего материала.

Иммунологические и серологические методы исследований. Для

определения вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови вакцинированных цыплят был применен а-вариант РН, описанный в руководстве по вирусологии [8, 9]. Индекс нейтрализации (ИН) определяли методом редукции бляшек по формуле (2):

ИН= lgTs.-lgTsi, (2)

где Ts- - титр вируса с отрицательной сывороткой; Tsi - титр вируса с исследуемой сывороткой.

Для выявления в сыворотке крови цыплят специфических антител применяли непрямой твердофазный вариант ИФА на планшетах с иммобилизованными культуральными антигенами ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» согласно «Методическим указаниям по выявлению и оценке титра антител к вирусу болезни Марека в сыворотках крови кур в непрямом иммуноферментном тесте», ФГБУ «ВНИИЗЖ» [3].

Для оценки состояния клеточного иммунитета гепаринизированную кровь цыплят исследовали в прямом капиллярном варианте PTMJI согласно методическим рекомендациям «Оценка способности миграции лейкоцитов in vitro и продукции фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов в крови» [5] с использованием культуральных антигенов ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир». Индекс миграции лейкоцитов вычисляли по формуле (3):

ML=(L0-L)/L0, (3)

где Lo - зона протяженности миграции лейкоцитов в смеси со средой 199 (контроль); L - зона протяженности миграции лейкоцитов в смеси со специфическим антигеном.

Обнаружение генома вируса в эпителии перьевых фолликул.

Материалом для исследований служили очины маховых перьев вакцинированных SPF-цыплят, содержимое которых исследовали методом ПЦР-РВ согласно «Методическим рекомендациям по выявлению генома вируса болезни Марека трех серотипов с помощью мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени» [2]. Объем единичной испытуемой пробы составлял 0,1 см3. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett research RealTime PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации (Ct).

Определение эффективности вакцинации. Эффективность вакцинации (Э) определяли методом контрольного заражения по формуле (4):

Э = (К-В)/Вх 100%, (4)

где К - количество цыплят с патологией БМ в контрольной группе; В - количество цыплят с патологией БМ в вакцинированной группе.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы обработки результатов и вычисления средних значений и стандартных ошибок выборок [1,4].

2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1 Культивирование вируса болезни Марека. Изучение влияния питательной среды на накопление вируса болезни Марека. Главной задачей при создании и производстве вакцин против БМ является получение наибольшего количества инфицированных клеток, поскольку вирус БМ обладает высокой степенью ассоциации с клеткой. Для культивирования вируса БМ в ФГБУ «ВНИИЗЖ» применяют среду, состоящую из равных частей среды 199, Игла и ГЛАХ. В работе была ичучена возможность применения синтетических коммерческих питательных сред, таких как DMEM/F-12, Маккой-5А, L-15 фирмы «Sigma», для репродукции ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с целью получения максимального выхода вируссодержащего материала.

Для этого культивирование вирусов проводили в КК ФЭК с посевной концентрацией 800 тыс. кл./см3 в пластиковых культуральных флаконах с площадью рабочей поверхности 75 см2. В качестве ростовых и поддерживающих сред использовали контрольную среду 199+Игла+ГЛАХ и опытные коммерческие среды. Доза заражения вирусом составляла Ю3ФОЕ на флакон. По окончании культивирования производили сбор вируссодержащих материалов в равных объемах (V=10 см3). Определяли концентрацию клеток и инфекционный титр вирусов. Оценивали количественные показатели концентрации инфицированных клеток относительно значений, полученных при использовании среды 199+Игла+ГЛАХ. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Накопление вирусов в культуре клеток ФЭК при стационарном культивировании (п=4)

Питательная среда ВГИ шт. «Владимир» ВБМ шт. «3004»

концентрация инфицированных клеток, млн.кл./см3 инфекционный титр, lgOOE/ем3 концентрация инфицированных клеток, млн.кл./см3 инфекционный титр, IgOOE/cM3

DMEM/F-12 7,42±0,36* 5,37±0,07 6,14±0,18 5,07±0,04

Маккоя-5А 6,74±0,27 5,21 ±0,05 5,29±0,49 4,95±0,06

L-15 5,38±0,24 4,66±0,08 4,57±0,49 4,63±0,05

199+Игла+ГЛАХ 5,8±0,29 4,99±0,09 4,89±0,52 4,92±0,06

- жирным шрифтом выделены значимые оценки.

Данные таблицы 1 показывают, что накопление вирусов в зависимости от использованной питательной среды происходило неодинаково. Достоверно высокие показатели конечной концентрации инфицированных клеток при культивировании ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» были получены при использовании питательной среды ОМЕМ/Р-12, что свидетельствует о преимуществе применения ее для культивирования вируса БМ перед другими вариантами.

Изучение параметров роллерного культивирования вируса болезни Марека. В дальнейшем были изучены и оптимизированы параметры роллерного культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» в КК ФЭК в условиях, приближенных к производственным, с применением среды ОМЕМ/Р-12.

В опытах изучили влияние посевной концентрации клеток ФЭК в диапазоне значений 0,65-1,3 млн./см5 на накопление вируса. Заражение производили не ранее чем через 48 часов после начала культивирования интактнои культуры в дозе 104 ФОЕ/см3 ВБМ штамма «3004». По окончании культивирования проводили сбор инфицированных клеток в равных объемах (У=10 см3), определяли концентрацию клеток и инфекционный титр вируса. Результаты исследований показаны в таблице 2.

Таблица 2 - Наконление вируса в культуре клеток ФЭК при разных посевных концентрациях (гГ=4)

№ варианта Посевная концентрация клеток, млн. кл./см3 Концентрация инфицированных клеток, млн. кл./см3 Инфекционная активность, \% ФОЕ/см3

1 1,3±0,08 20,43±0,30 6,83±0,05

2 1,0±0,02 18,87±0,39 6,90±0,07

3 0,8±0,03 16,23±0,29 6,46±0,05

4 0,65±0,03 13,68±0,28 5,80±0,07

Данные, представленные в таблице 2, иллюстрируют, что при использовании посевной концентрации клеток ФЭК, равной 1,0 млн. кл./см3, накопление вируса было максимальным. Однако, при испытании посевной концентрации 1,3 млн. кл./см3, выход инфицированных клеток был выше относительно применения других вариантов посевной концентрации клеток.

В связи с этим изучили влияние времени заражения интактной КК ФЭК на последующее накопление вирусов для двух посевных концентраций: 1,3 и 1,0 млн. кл./см3. Заражающая доза вирусов для всех вариантов была одинаковой.

При распространении ЦПД вируса на 70-80% монослоя осуществляли сбор вируссодержащего материала в равном объеме среды и приводили к одинаковому значению концентрации инфицированных клеток (8,0 млн. кл./см3). Полученные результаты отражены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние времени заражения интактной культуры клеток ФЭК на последующее накопление вирусов (п=4)

Посевная концентрация клеток ФЭК, млн. кл./см3 Время заражения интактной Инфекционная активность вируса, 1ё ФОЕ/см3

культуры, ч ВГИ шт. «Владимир» ВБМ шт. «3004»

24 6,62+0,09 6,16±0,11

1,3±0,07 48 6,59±0,11 6,12±0,07

72 6,45±0,08 5,27+0,10

96 5,58±0,08

24 6,18±0,06 5,98+0,07

1,0±0,08 48 6,60±0,08 6,18+0,09

72 6,65±0,09 6,21+0,04

96 6,59±0,06 6,16+0,08

- не исследовали

Представленные результаты (таблица 3) демонстрируют, что при использовании посевной концентрации 1,3 и 1,0 млн. кл./см3 максимальное накопление вирусов наблюдали при заражении интактной культуры через 24 и 72 ч после начала культивирования клеток, соответственно.

Таким образом, были определены оптимальные параметры роллерного культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с использованием питательной среды ВМЕМ/Р-12.

2.3.2 Оптимизация иммунизирующей дозы бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3». Принципиально важным и основным этапом исследования при конструировании поливалентных вакцин является подбор концентрации антигенов в составе препарата, от которого зависят наиболее важные характеристики, такие как иммуногенность, протективность и безвредность. В этой связи в работе испытали образцы бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3» с содержанием в одной прививной дозе:

1) 500 ФОЕ ВБМ штамма «3004» + 1000 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир»

2) 1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» + 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир»;

3) 1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» + 1000 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир»;

4) 2000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» + 2000 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир».

Изучение иммуногенности образцов бивалентной вирусвакцины. Под

иммуногенностью подразумевали формирование клеточного и гуморального иммунного ответа. Было сформировано 7 групп БРР-цыплят суточного возраста по 15 голов в каждой. Птиц групп №1-4 согласно вышеуказанной схеме внутримышечно по 0,2 см3 привили опытными образцами бивалентной вирусвакцины, группы птиц №5 и №6 были иммунизированы моновалентными вирусвакцинами «Марек-Я» и «Марек-3» в рекомендуемых прививных дозах (по 1000 ФОЕ). Цыплята группы №7 считались контролем чистоты эксперимента. Исследования проводили в сравнительном аспекте с 5 и 6 группами птиц.

Оценка напряженности клеточного иммунитета была основана на определении активности Т-лимфоцитов к антигенам ВБМ и ВГИ в динамике в РТМЛ по формуле (3). Затем вычисляли оценки контраста ((1МЬ) между индексами миграции лейкоцитов, полученными для групп птиц №5 и №6 (МЬШ) и таковыми показателями групп №1-4 (МЬ,), по формуле: (1МЬ; = МЬт - МЬ;. Результаты в виде средних оценок представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты оценки активности иммунокомпетентных клеток (п=5)

к антигену ВБМ штамма «3004»

Сутки Показатель контраста с!МЦ соответственно опытных групп МЬ„ в группе 5 (1000 ФОЕ ВБМ)

группа 1 (500 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 2 (1000 ФОЕ ВБМ + 500 ФОЕ ВГИ) группа 3 (1000 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 4 (2000 ФОЕ ВБМ + 2000 ФОЕ ВГИ)

14 -0,068±0,048 -0,532±0,052* -0,548±0,039 -0,600±0,028 0,140±0,020

28 0,098±0,057 -0,202±0,048 -0,106±0,027 -0,126±0,056 0,412±0,026

42 0Г306±0,048 -0,180±0,035 -0,02±0,022 0,116±0,026 0,464±0,026

к антигену ВГИ штамма «Владимир»

Сутки Показатель контраста с!МЬ| соответственно опытных групп МЬщ в группе 6 (1000 ФОЕ ВГИ)

группа 1 (500 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 2 (1000 ФОЕ ВБМ + 500 ФОЕ ВГИ) группа 3 (1000 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 4 (2000 ФОЕ ВБМ + 2000 ФОЕ ВГИ)

14 -0,194±0,035 -0,554±0,049 -0,508±0,078 -0,590±0,050 0,184±0,066

28 0,086±0,041 -0,226±0,072 -0,210±0,062 -0,140±0,078 0,374±0,023

42 -0,072±0,025 -0,324±0,049 -0,164±0,067 0,030±0,065 0,346±0,021

* - жирным шрифтом выделены позиции с достоверностью различий (р<0,05)

Из данных таблицы 4 следует, что выработка фактора, стимулирующего активацию иммунокомпетентных клеток к антигенам, у подопытных групп цыплят №1-4 происходила с различной интенсивностью. Начиная с 28 суток, в испытаниях с обоими антигенами у цыплят группы №2, привитой в дозе

1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» + 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир», прослеживалась более выраженная и активная тенденция к увеличению содержания фактора торможения миграции лейкоцитов в сравнении с остальными группами птиц, привитыми образцами бивалентной вирусвакцины.

Для изучения напряженности поствакцинального гуморального иммунного ответа в сыворотках иммунизированных групп цыплят определяли логарифмические титры антител в непрямом ИФА к антигенам ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир». Затем находили оценки контраста (с!) между титрами антител, полученными для групп №5 и №6 Тш) и таковыми показателями групп №1-4 Т;) по формуле: ^ Тт - ^ Результаты исследований в виде средних оценок отражены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты оценки гуморального иммунитета (п=5)

к антигену ВБМ штамма «3004»

Сутки Показатель контраста титров антител группе 5 (1000 ФОЕ ВБМ)

группа 1 (500 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 2 (1000 ФОЕ ВБМ + 500 ФОЕ ВГИ) группа 3 (1000 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 4 (2000 ФОЕ ВБМ + 2000 ФОЕ ВГИ)

14 0,22±0,02* -0,39±0,05 -0,47±0,05 -0,67±0,03 1,84±0,03

21 0,10±0,05 -0,22±0,07 -0,39±0,06 -0,35±0,07 1,99±0,05

28 -0,13±0,17 -0,29±0,04 -0,17±0,02 -0,20±0,05 2,14 ±0,05

35 -0,13±0,06 -0,37±0,07 -0,23±0,06 -0,22±0,08 2,11±0,05

42 0,89±0,06 -0,37±0,03 -0,28±0,06 -0,19±0,08 2,02±0,04

к антигену ВГИ штамма «Владимир»

Сутки Показатель контраста титров антител (1; ^Тга в группе 6 (1000 ФОЕ ВГИ)

группа 1 (500 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 2 (1000 ФОЕ ВБМ + 500 ФОЕ ВГИ) группа 3 (1000 ФОЕ ВБМ + 1000 ФОЕ ВГИ) группа 4 (2000 ФОЕ ВБМ + 2000 ФОЕ ВГИ)

14 -0,13±0,06 -0,26±0,05* -0,22±0,05 -0,42±0,05 2,46±0,06

21 -0,04±0,05 -0,28±0,03 -0,17±0,06 -0,44±0,05 2,43±0,04

28 -0,08±0,17 -0,37±0,04 -0,14±0,02 -0,29±0,04 2,44±0,03

35 -0,18±0,06* -0,65±0,04 -0,23±0,06 -0,27±0,07 2,40±0,05

42 -0,21±0,06 -0,63±0,05 -0,10±0,06 0,04±0,04 2,50±0,03

- жирным шрифтом выделены позиции с достоверностью различий (р<0,05)

Полученные результаты (таблица 5) показывают, что накопление вирусспецифических антител в организме птицы, привитой моновалентными вирусвакцинами и различными вариантами бивалентной вирусвакцины против БМ, также происходило неодинаково. Оценки контраста титров антител показали, что наибольший эффект был получен при иммунизации цыплят образцом бивалентной вирусвакцины, прививная доза которого содержала 1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» и 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир».

Изучение протективных свойств образцов бивалентной вирусвакцины. Для изучения заявленных опытных образцов бивалентной вирусвакцины на предмет протективности было сформировано 6 групп цыплят суточного возраста по 50 голов в каждой. Цыплята группы №1-4 в суточном возрасте были привиты экспериментальными образцами вирусвакцины, указанными выше. Через 7 суток вместе с невакцинированными цыплятами группы №5 их подвергли заражению внутримышечно высоковирулентным вирусом 1 серотипа штамма «Мс!5» в дозе ~103 ФОЕ. Цыплята группы №6 были отрицательным контролем опыта. Наблюдение за подопытной птицей продолжали в течение 60 суток после заражения, производили ежедневный осмотр за ее физиологическим состоянием. По истечении указанного срока вся птица была подвергнута декапитации и вскрыта для установления специфических патологоанатомических изменений, обусловленных вирулентным вирусом. С учетом результатов вскрытия, для каждой подопытной группы цыплят, привитой экспериментальными образцами бивалентной вирусвакцины, по формуле (4) вычислили эффективность вакцинации (таблица 6).

Таблица 6 — Эффективность вакцинации

№ группы (образцы вакцины) Пало голов в опыте Вскрыто птицы в конце опыта БМ, % Эффективно сть вакцинации, %

всего из них от БМ всего с признаками БМ

1 (500 ФОЕ «3004» + 1000 ФОЕ Владимир») 1 - 49 4 8 90,0

2(1000 ФОЕ «3004» + 500 ФОЕ «Владимир») - - 50 2 4 95,0

3 (1000 ФОЕ «3004» + 1000 ФОЕ Владимир») 3 - 47 5 10 87,5

4 (2000 ФОЕ «3004» + 2000 ФОЕ Владимир») 3 - 47 9 18 77,5

5 (контроль вируса) 8 8 42 32 80 -

6 (отриц. контроль) 3 - 47 - - -

В результате проведения опыта определили, что наибольший показатель эффективности вакцинации (95%) получен при использовании прививной дозы бивалентной вирусвакцины, содержащей 1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» и 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир». Таким образом, оптимальной иммунизирующей дозой бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3» является 1000 ФОЕ штамма «3004» ВБМ и 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир».

2.3.3 Изучение поствакцинальной иммунной реакции у цыплят, привитых вирусвакцинами против БМ. Одним из критериев эффективности вакцин является индукция ВНА, способных нейтрализовать вирус на этапе его проникновения до фиксации на клетках-мишенях. Поэтому была изучена динамика образования ВНА в организме цыплят, вакцинированных вирусвакциной «Маривак 1+3». Опыт проводили в сравнении с действием моновалентных вирусвакцин «Марек-3», «Марек-Я» и бивалентной вирусвакцины «Бимарек» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Поскольку ВБМ в бесклеточном состоянии нестабилен, изучали нейтрализующую активность антител к ВГИ штамма «Владимир». Исследования проводили по вышеописанной методике, согласно которой определяли ИН. По средним значениям ИН строили графики (рисунок 1). 1

о

О 7 14 21 28 35 сут 42 0 7 14 21 28 35 сут 42

О

О 7 14 21 28 35 СУ1 42 0 1 14 21 28 35 сут 42

Рисунок 1. Динамика гуморальной иммунной реакции цыплят, вакцинированных

против БМ

Распределение оценок (♦) индексов нейтрализации (ИН) соответственно времени (сут) после прививки 5РР-цыплят вирусвакцинами «Марек-3» (А), «Марек-Я» (Б), «Бимарек» (В), «Маривак 1+3» (Г). Сплошной линией показано распределение средних значений.

Представленные на рисунке 1 результаты свидетельствуют о том, что после введения цыплятам бивалентных и моновалентных вирусвакцин против БМ образование антител по группам происходило с неодинаковой интенсивностью. Для бивалентных вирусвакцин «Бимарек» и «Маривак 1+3» высокий уровень ВНА был отмечен уже на 7 сутки, где среднее значение ИН

ИН, 1д

ж 0.28_0,26_

■■У жШтЬЦ

V - Б

составило 0,631§ и 0,601§, а также на 28 сутки с ИН, равным 0,53^ и соответственно. В случае применения моновалентных вирусвакцин «Марек-3» и «Марек-Я» первый максимум был отмечен на 14 сутки со значением ИН 0,43^ и 0,25^.

На основании полученных результатов сделали вывод, что вирусвакцина «Маривак 1+3» в организме привитых цыплят на 7 сутки индуцирует интенсивное образование гуморальных вируснейтрализующих антител.

2.3.4 Изучение накопления вирусов БМ в перьевых фолликулах 8РР-цыплят. Одним из способов оценки качества вирусвакцин против БМ является определение уровня репликации вакцинного вируса в организме привитой птицы с помощью ПЦР-РВ, который свидетельствует о приживляемости агента в организме птицы. Для проведения исследований было сформировано 3 группы по 30 голов вРР-цыплят, вакцинированные в суточном возрасте вирусвакцинами «Маривак 1+3», «Марек-Я» и «Марек-3». Изучали в динамике накопление генетического материала ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» в перьевых фолликулах БРР-цыплят после прививки (рисунок 2).

-х-

ьи-*

'х -

—У —

Рисунок 2. Накопление геномов ВГИ и ВБМ в перьевых фолликулах цыплят после

прививки

Распределение циклов амплификации (СЦ штаммов «3004» ВБМ (х) и «Владимир» ВГИ (♦) соответственно времени (сут) после вакцинации ЭРР-цыплят вирусвакцинами «Маривак 1+3» (А), «Марек-Я» (Б), «Марек-3» (В). Количество (Й находится в обратной зависимости от концентрации генетического материала вируса.

При применении бивалентной вирусвакцины максимальное накопление генома ВГИ - (26,21 ±1,08)0, наблюдали на 12-13 сутки после прививки, а генома ВБМ - на 15-16 сутки в количестве (24,25±0,61)С1. В случае использования моновалентных вирусвакцин пик репликации ВГИ, равный (23,25+0,85)0, приходился на 13-14 сутки после вакцинации, а ВБМ был зарегистрирован на 15-16 сутки в количестве амплифицированной ДНК (24,44+0,38)0. При этом значения О, соответствующие максимальному накоплению генетического материала вирусов, полученные для группы птиц, привитых вирусвакциной «Маривак 1+3», не имели статистических различий с таковыми показателями групп, иммунизированных моновалентными вирусвакцинами.

Накопление ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» в перьевых фолликулах при совместном введении происходило постепенно и независимо друг от друга. При этом один вирус не подавлял репликации другого. Из этого следует, что ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» при их совместном введении не интерферируют между собой в месте репликации.

2.3.5 Определение безвредности бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3». Задача данного этапа исследований состояла в том, чтобы исключить возможность нанесения ущерба состоянию здоровья вакцинированной птице при использовании рекомендуемой прививной дозы предлагаемой бивалентной вирусвакцины. Для проведения испытания было сформировано 6 групп по 10 голов суточных невакцинированных цыплят-бройлеров с птицефабрики, благополучной по инфекционным болезням птиц. Цыплят групп №1-5 привили средней пробой вирусвакцины внутримышечно в объеме 0,2 см3 в области верхней трети внутренней стороны бедра, разведенной в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» в одно-, двух-, пяти-, десяти- и пятидесятикратной дозах. Цыплята группы №6 были интактны и служили контролем опыта. В течение 15 суток привитых птиц осматривали, при этом исключали неспецифичную гибель не более 2-х голов в опытных и контрольной группах в первые 24-48 ч.

В ходе опыта было установлено, что ни в одном случае инъекция испытуемых образцов не привела к развитию у привитой птицы заболевания. Случаев падежа или выраженного угнетения у вакцинированных птиц в связи с введением вирусвакцины также не отмечено. На основании полученных результатов было сделано заключение о безвредности вирусвакцины, используемой в исследуемых дозах.

2.3.6 Изучение стабильности бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3». Обоснование срока хранения. Одной из важных характеристик иммунобиологического препарата является его стабильность при хранении. Для проведения эксперимента были взяты компоненты вирусвакцины ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» с исходной концентрацией инфицированных клеток (Со) и инфекционной активностью (Т0) вирусов, равных 10,4 млн. кл./см3 и 6,0^ ФОЕ/см3 - для ВБМ, 8,0 млн. кл./см3 и 5,831ц ФОЕ/см3 - для ВГИ. Пробы хранили в жидком азоте при температуре (минус 196°С) в герметично запаянных ампулах в течение 36 месяцев. Через заданные интервалы времени (], мес) в образцах вирусных материалов определяли концентрацию клеток (С^) и инфекционный титр вируса (Т^).

В ходе опыта было установлено, что снижение концентрации инфицированных клеток в течение 36 месяцев хранения в жидком азоте несущественно и происходит в среднем на 12,9% и 8,8% - для ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», соответственно. Существенные потери (р<0,001) инфекционной активности в среднем на 0,05^ и 0,03^ ФОЕ/см3 ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», соответственно, обнаружены через 30 месяцев хранения. На основании вышеизложенного было определено, что бивалетная вирусвакцина «Маривак 1+3» из ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» стабильна в течение 24 месяцев от даты выпуска при хранении в жидком азоте (минус 196°С).

Изучение стабильности ресуспендированной вирусвакцины. Одним из недостатков живых вирусвакцин против БМ является их лабильность к факторам окружающей среды, особенно к температурному фактору, что крайне важно учитывать в процессе проведения профилактических мероприятий. В этой связи изучили скорость инактивации вакцинного вируса в разбавителе при различных температурных режимах. Для этого компонент вирусвакцины ВГИ штамма «Владимир» ресуспендировали в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Определили исходную величину инфекционного титра вируса (1§То). Затем образовали 3 опытных образца, которые выдерживали при трех температурных режимах 4, 22 и 37°С. Для каждой испытанной температуры исследовали связь между продолжительностью временного интервала экспозиции 0) и оценкой контраста (<у по отношению к исходному титру, вычисленной по формуле:

с^Т^-^То,

где -интервальная оценка инфекционного титра вируса (контраст);То - исходная величина инфекционной активности вируса;!^ - значение инфекционной активности, установленное через заданный временной интервал (]).

На основании полученных результатов строили регрессионные модели инактивации вируса (рисунок 3), отражающие связь величин ёТ, и продолжительности экспозиции вируссодержащего образца (])•

Рисунок 3. Инактивация клеточно-ассоциированного ВГИ в разбавителе при разных температурах экспозиции

Отмечены средние значения оценок контраста инфекционного титра вируса для испытанных температур соответственно времени экспозиции (], мин). Представлены линейные регрессионные модели (коэффициент детерминации К>0,95), где: 'с! -ожидаемая величина относительного снижения титра соответственно времени экспозиции в разбавителе 0).

На рисунке 3 видно, что скорость инактивации вируса возрастала по мере повышения температуры экспозиции. При сопоставлении оценок контраста, полученных для трех температурных режимов, относительно исходного значения инфекционного титра вируса установили существенность различий уже спустя 30 минут. Снижение титра произошло в среднем на 9%, 11% и 17% при температуре экспозиции 4, 22 и 37°С, соответственно, что следует учитывать при проведении процедуры вакцинации.

2.3.7 Результаты производственных испытаний вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3». Для обоснования широкого применения в птицеводстве вирусвакцины «Маривак 1+3», предназначенной для специфической профилактики БМ у птиц, были проведены испытания в условиях птицефабрик ОАО «Волжанин» (Ярославская обл.) на цыплятах яичного направления кросса «Хайсекс белый» и ОАО «Ворсменская» (Нижегородская обл.) на цыплятах кросса «Хайсекс коричневый» (таблица 7).

Таблица 7 — Результаты производственных испытаний бивалентной вирусвакцины «Маривак 1+3»

Птицефабрика Кол-во вакцинированных птиц Период наблюдений Пало голов Сохранность поголовья в среднем по хозяйству, % Сохранность поголовья, привитого вирусвакциной, %

всего с признаками БМ при вскрытии

ОАО «Ворсменская» 19480 210 117 - 98,2 99,50

ОАО «Волжанин» 110659 160 166 15 99,85 99,90

На основании проведенных производственных испытаний было установлено, что бивалентная вирусвакцина «Маривак 1+3» защищала более 99% вакцинированного поголовья птицы и может, таким образом, успешно применяться в птицеводческой индустрии для специфической профилактики БМ.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

3.1 Выводы:

1. Разработана бивалентная вирусвакцина против БМ из вируса штаммов «3004» и «Владимир» 1 и 3 серотипов. Доказана высокая эффективность вирусвакцины и ее безвредность в широких производственных испытаниях.

2. Изучено накопление ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» в культуре клеток ФЭК с применением различных синтетических коммерческих питательных сред. Наиболее эффективным для получения вирусного материала штаммов вируса БМ является использование питательной среды ОМЕМЛМ2.

3. Изучены параметры роллерного культивирования ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир» при использовании питательной среды ОМЕМ/Р-12, оптимальными являются посевная концентрация клеток 1,3 млн. кл./см3 и 1,0 млн. кл./см3 с последующим заражением вирусами культуры ФЭК через 24 и 72 часа, соответственно, после начала культивирования интактной культуры.

4. Определена иммунизирующая доза бивалентной вирусвакцины против БМ «Маривак 1+3». Доказано, что наиболее иммунногенным и протективным действием обладает прививная доза вирусвакцины, содержащая 1000 ФОЕ ВБМ штамма «3004» и 500 ФОЕ ВГИ штамма «Владимир».

5. Показано, что бивалентная вирусвакцина «Маривак 1+3» в организме привитых цыплят на 7 сутки после иммунизации индуцирует интенсивное образование гуморальных вируснейтрализующих антител.

6. Доказано отсутствие интерференции между ВБМ штамма «3004» и ВГИ штамма «Владимир», входящих в состав вирусвакцины «Маривак 1+3», в месте их репликации.

7. Определено, что бивалентная вирусвакцина «Маривак 1+3» стабильна в течение 24 месяцев хранения в жидком азоте (минус 196°С).

8. Инфекционный титр вируса в вирусвакцине, ресуспендированной в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», при температурных режимах 4, 22 и 37°С спустя 30 минут снижается на 9%, 11% и 17%, соответственно, что необходимо учитывать при проведении профилактических мероприятий против БМ.

3.2 Практические предложения. Полученные результаты исследований использованы при составлении нормативной документации на новый вакцинный препарат:

- Промышленный регламент на производство вирусвакцины против болезни Марека «Маривак 1+3»;

-СТО на вирусвакцину против болезни Марека «Маривак 1+3» (СТО 00495527-0231-2015);

- Инструкция по ветеринарному применению вирусвакцины против болезни Марека «Маривак 1+3».

3.3 Перспективы дальнейшей разработки темы. Одним из основных направлений разработки данной темы является массовое производство отечественной вакцины из вируса 1 и 3 серотипов с целью обеспечения эпизоотического благополучия птицеводческих хозяйств и расширения ассортимента средств специфической профилактики БМ в РФ.

Вторым аспектом является использование синтетической коммерческой питательной среды ОМЕМЛМ2 с целью снижения трудозатрат при производстве вирусвакцин против БМ и стандартизации производственного процесса.

В ходе исследований получены уравнения скорости инактивации вируса БМ при экспозиции вирусвакцины в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» для температурных режимов 4, 22 и 37°С, которые позволяют прогнозировать величину остаточной инфекционности агента в клеточно-ассоциированной вирусвакцине при проведении профилактических мероприятий.

4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВБМ - вирус болезни Марека

ВГИ - вирус герпеса индеек

SPF - свободные от патогенной флоры

КК ФЭК - культура клеток фибробластов эмбрионов кур

РН - реакция нейтрализации

PTMJI - реакция торможения миграции лимфоцитов ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР-РВ - полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени

5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Закс JI. Статистическое оценивание / Л. Закс - М.: Статистика, 1976. -598 с.

2. Методические рекомендации по выявлению генома вируса болезни Марека трех серотипов с помощью мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени / Д.Б. Андрейчук, Т.В. Ерошина, A.A. Козлов, И.А. Чвала; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2015. - 11 с.

3. Методические указания по выявлению и оценке титра антител к вирусу болезни Марека в сыворотках крови кур в непрямом иммуноферментном тесте / A.A. Пяткина, А.Э. Меныцикова, В.Н. Ирза, Ш.К. Куляшбекова; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2008. - 19 с.

4. Мисюк, Н.С. Корреляционно-регрессионный анализ / Н.С. Мисюк, A.C. Мастыкин, Г.П. Кузнецов. - М.: Медицина, 1975. - 192 с.

5. Оценка способности миграции лейкоцитов in vitro и продукции фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов крови у человека: Метод, рекомендации / Т.Н. Крымкина, Л.В. Ганковская, Е.В. Соколова [и др.]. - М., 1983. - 43 с.

6. Пат. 2199583 Российская Федерация, МПК А61К 39/255 (2006.01). Штамм №3004/№ 109 вируса болезни Марека для изготовления вакцинных препаратов / Баррос-Палома Е.В., Смоленский В.И., Куляшбекова Ш.К.; ФГУ «ВНИИЗЖ». -№2001121608/13; заявл. 31.07.2001; опубл. 27.02.2003.

7. Пат. 2336303 Российская Федерация, МПК C12N 1/00 (2006.01). Производственный штамм "Владимир" вируса герпеса индеек для изготовления вакцины против болезни Марека / Куляшбекова Ш.К., Борисов A.B., Баррос-Палома Е.В., Смоленский В.И.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - № 2007105785/13; заявл. 15.02.2007; опубл. 20.10.2008.

8. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1999. - 272с.

9. Melchior, Jr.F. Neutralization studies with marek's disease virus and turkey herpesvirus / Jr.F. Melchior, T.N. Fredrickson, R.E. Luginbuhl // Appl. Microbiol. -1973. - Vol. 26, №6. - P. 925-933.

6 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Влияние срока хранения на инфекционную активность клеточно-ассоциированного вируса болезни Марека / Е.Ю. Ханюкова, М.А. Шустова,

A.A. Пяткина, В.П. Мельников // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. -2015.-№1.-С. 13-15.

2. Гуморальный иммунный ответ цыплят, привитых бивалентными вакцинами против болезни Марека / Е.Ю. Ханюкова, М.А. Шустова,

B.Ю. Кулаков, A.A. Пяткина // Международный научный институт "Educatio": материалы X Междунар. науч.-практ. конф. "Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия". - Новосибирск, 2015. - №3(10). -

C. 44-46.

3. Ханюкова, Е.Ю. Влияние питательной среды на репродукцию вируса герпеса индеек в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур / Е.Ю. Ханюкова, М.А. Шустова, A.A. Пяткина // Ветеринария. - 2015. - №3. -С. 60-62.

4. Ханюкова, Е.Ю. Гуморальный иммунный ответ цыплят, привитых бивалентной и моновалентными вакцинами против болезни Марека / Е.Ю. Ханюкова, М.А. Шустова, В.Ю. Кулаков // Ветеринария и кормление. -2015.-№1,-С. 26-28.

5. Ханюкова, Е.Ю. Применение питательной среды Дульбекко DMEM/F12 Ham для культивирования вируса болезни Марека в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур / Е.Ю. Ханюкова, М.А. Шустова, Н.Е. Камалова // Ветеринария сегодня. - 2015. - №3. - С. 59-61.

6. Шустова, М.А. Изучение способов дезагрегации клеточного монослоя, инфицированного вирусом герпеса индеек / М.А. Шустова, Е.Ю. Ханюкова, A.A. Пяткина // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2015. - №2. -С. 17-20.

Подписано в печать 14.10.2015 г. Формат 60*90 1/16. Усл. печ. л.1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».