Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства вирулентных штаммов вируса болезни Марека

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вирулентных штаммов вируса болезни Марека"

На правах рукописи

Чичерина Екатерина Александровна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА

БОЛЕЗНИ МАРЕКА

06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 з ¡1/4,1 2015

005568402

005568402

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)

Научный руководитель: Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных

наук, начальник отдела по болезням птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ»

Официальные оппоненты: Кушиир Анатолий Тимофеевич, доктор

ветеринарных наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии ГНУ ВНИИВВиМ

Россельхозакадемии

Ярыгина Елена Игоревна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», (ФГБОУ ВПО «МГАВМиБ»), заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» ФГБУ «ВГНКИ»

Защита состоится 16 июня 2015 г. В 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01. при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.arriah.ru ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир).

Автореферат разослан «/¿о» апреля 2015г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Кандидат биологических наук „Жбанова Татьяна Валентиновна

А

ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в 2-х формах: классической (с поражениями периферической и центральной нервной системы) и острой (с развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах).

Наиболее восприимчивы куры и особенно цыплята в первые 2 недели жизни [2, 12]. Ежегодно экономический ущерб от БМ оценивают в 1 - 2 млрд. долларов [12].

В 2011г. в разных странах с целью совершенствования профилактики и контроля был проведен опрос для оценки распространения болезни Марека. Отмечалось, что распространение БМ среди птиц различных направлений выращивания возросло с 2000 по 2010 гг. почти в 50% стран, принявших участие в опросе. Большинство этих стран находится в франкоговорящей части Африки, Восточной Европе, Восточной Азии и Южной Америке [10].

Лишь 18 стран (16%) указали на то, что всё большее распространение болезни Марека, вероятно, вызвано повышением вирулентности штаммов, в то время как основным объяснением являлись другие иммунодепрессивные болезни. В качестве наиболее вероятной причины снижения количества случаев болезни Марека в 49 странах (42%) называлось возросшее использование вакцины СУ1988/Ш5реп5. В США процент заболеваемости продолжал снижаться в течение последних 10 лет и достиг рекордного минимума в 2007г. (0.0008%) [10].

Методов лечения БМ не существует, в связи с чем борьба с заболеванием направлена на улучшение условий содержания, изоляцию молодняка птиц от источника инфекции, использование генетически устойчивых линий кур и, самое главное, на применение вакцинации [4].

На протяжении последних лет зарегистрированы вспышки БМ, вызванные высоковирулентными вирусами, в том числе в стадах вакцинированных птиц. Для профилактики болезни используют вакцины, изготовленные из штаммов трех серотипов вируса в различных комбинациях [4].

За последние годы отмечено повышение вирулентности возбудителя болезни Марека (ВБМ) [11, 13, 16]. Основная причина изменения патогенности вируса БМ заключается в мутациях специфических вирусных генов, изменяющих время индукции опухолей, снижающих скорость репликации in vitro и т.д. Данная эволюция ВБМ, возможно, является результатом иммунологического процесса, вызванного систематической поголовной вакцинацией, а также возможной рекомбинацией с другими вирусами [8]. Биологические свойства циркулирующих на территории Российской Федерации (РФ) вирулентных вирусов птиц остаются недостаточно изученными.

Все перечисленные вопросы являются актуальными для птицеводства и требующими своего решения, что послужило основной предпосылкой для изучения биологических свойств современных вирулентных изолятов ВБМ в РФ.

Поэтому целью наших исследований стало изучение биологических свойств новых вирулентных штаммов вируса, циркулирующих на территории РФ, и сравнение их с известными референтными штаммами.

1.2 Степень разработанности проблемы. Вопросам выделения изолятов ВБМ посвящены исследования отечественных авторов [3, 5], тем не менее в предыдущие годы определить и сравнить вирулентность штаммов не представлялось возможным из-за отсутствия соответствующих методик.

Оценкой вирулентности полевых изолятов в последнее десятилетие занимались в Лаборатории онкологических болезней птиц (ADOL, США), где был разработан «золотой стандарт». Это метод патотипирования вирусов болезни Марека, основанный на оценке способности полевых вирусов вызывать лимфо-пролиферативные изменения у птиц с различной степенью иммунной защиты против БМ. Было предложено использовать референтные вакцинные штаммы и полевые изоляты разной вирулентности для заражения генетически чувствительной к вирусу БМ линии птицы [9]. В ADOL для этих исследований использовали специально выведенную линию кур, чувствительную к ВБМ, что затрудняло широкое использование этого метода. В ГУ НИИ вирусологии им.

Д.И. Ивановского РАМН в методе патотипирования «Best Fit» также использовали восприимчивую птицу [2].

1.3 Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в изучении биологических свойств полевых изолятов ВБМ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать способы выделения полевых вирусов болезни Марека;

- подобрать чувствительную культуру клеток для репродукции полевых изолятов;

- изучить культуральные свойства изолятов;

- изучить патогенные свойства полученных изолятов на птице;

- оценить степень патогенности полевых вирусов болезни Марека в сравнении с референтным высоковирулентным штаммом ВБМ.

1.4 Научная новизна результатов исследования. В результате проведенных работ подобран способ выделения полевых изолятов вируса болезни Марека.

Получен новый российский вирулентный штамм «Vors-07», относящийся к 1 серотипу вируса болезни Марека.

Подобрана система культивирования полевых вирусов болезни Марека на примере штамма «Vors-07», и изучены его культуральные свойства.

Изучено патогенное действие штамма «Vors-07» и оценена степень его патогенности в сравнении с референтным штаммом «Md5» ВБМ.

1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования По результатам проведенных исследований предложен контрольный штамм «Vors-07». Проведено его депонирование в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ». В ходе выполнения научно-исследовательских работ по теме диссертации разработаны, комиссионно проверены, одобрены и утверждены ученым советом ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методики:

1. «Методические рекомендации по выделению высокопатогенных изолятов вируса болезни Марека».

2. «Методические указания по дифференциации вакцинных штаммов «3004» и «Шврепв» вируса болезни Марека серотипа 1 от полевых вариантов с помощью полимеразной цепной реакции».

3. «Методические рекомендации по определению титра антител к вирусу болезни Марека в сыворотках крови кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа».

Разработан комплект научной документации на контрольный штамм «Уоге-07» ВБМ.

1.6 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

- оптимальный способ первичного выделения полевых вирусов БМ;

- результаты сравнительной оценки чувствительности различных культур клеток для культивирования штамма «Уоге-07» ВБМ;

- культуральные свойства штамма «Уоге-07», инфекционная активность, размер фокусов, оптимальное время культивирования;

- сходство российского штамма «Уог8-07» с высоковирулентным референтным штаммом «М<15» по степени патогенности для цыплят.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающую систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающую и разрабатывающую методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов выделения полевых изолятов ВБМ из патматериала,

полученного от больной птицы, изучению их биологических и патогенных свойств.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 1, 3, 4, 5, 6 паспорта специальности.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов, подтверждается их статистической обработкой, рекомендованной С. Гланцем [1]. Материалы диссертационной работы были представлены на конференции, посвященной 50-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008 г., на XI Международном симпозиуме по БМ и герпесвирусам птиц в Берлине в 2012 г. и на ученых советах ФГБУ «ВНИИЗЖ» с 2007 по 2012гг.

1.9 Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.10 Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы, методы, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения. Список литературы включает 180 источников, в том числе 46 — на русском языке. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 7 таблицами.

1.11 Место выполнения работы. Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2006-2015 гг. на базе лаборатории профилактики болезней птиц (сектор культуральных вакцин) и референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.12 Личный вклад автора. Основной объем исследований выполнен автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены при консультативной и методической помощи сотрудников лаборатории профилактики болезней птиц и референтной лаборатории вирусных болезней птиц. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам, оказавшим методическую и консультативную помощь при выполнении отдельных разделов диссертационной работы.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы исследований

2.1.1 Вирусы и вируссодержащий материал.

2.1.1.1 Изолят вируса болезни Марека. В 2007 г. сотрудниками лаборатории профилактики болезней птиц на культуре клеток (КК) кожи СПФ-эмбрионов кур был получен изолят «Vors-07», относящийся к 1 серотипу ВБМ.

2.1.1.2 Штамм «Md5» ВБМ. Вирулентный штамм «Md5» 1 серотипа, полученный из коллекции «Collection of animal viruses and antisera, chlamidiae and rickettsiae» (США), адаптирован к культуре клеток кожи СПФ-эмбрионов кур, к 5 пассажу инфекционная активность составила 6,8x105 ФОЕ/см3, что соответствует 5,83 lg ТЦД/см3.

2.1.1.3 Штамм «3004» ВБМ. Производственный вакцинный штамм «3004» 1 серотипа, размноженный в КК ФЭК с инфекционной активностью 3,6х106 ФОЕ/см3.

2.1.1.4 Вакцина «Марек - 3». Вирусвакцину против БМ изготавливают на первичной КК ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. «Владимир»),

2.1.1.5 Вакцина «Бимарек». Вирусвакцину против БМ изготавливают на первичной культуре клеток ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. «Владимир») и вирус герпеса кур («SB-1»).

2.1.1.6 Вакцина «Тримарек». Вирусвакцину против БМ изготавливают на первичной культуре клеток ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. «Владимир»), аттенуированный штамм вируса БМ (шт. «3004») и вирус герпеса кур (шт. «SB-1»).

2.1.2 Куриные эмбрионы. Использовали 5-17 суточные эмбрионы СПФ-кур фирмы «Valo biomedia» (Германия).

2.1.3 Растворы и реактивы для культивирования клеток. Питательные среды, состоящие из равных частей сред 199, ИГЛА и 0,25% раствора ГЛАХ с добавлением 10% сыворотки КРС - для ростовой среды, и с добавлением 5% сыворотки КРС - для поддерживающей; 0,25% раствор трипсина и солевой раствор Хенкса.

2.1.4 Сосуды и аппараты. Лабораторное культивирование клеток и вируса проводили во флаконах емкостью 50 см3 фирмы Costar (США). Флаконы культивировали стационарно.

2.1.5 Лабораторная птица. Клинически здоровые цыплята, свободные от материнских антител. Исследования проводили на базе вивария ФГБУ «ВНИИЗЖ» в боксовых помещениях.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Приготовление культуры клеток. На различных этапах работы были использованы первичные культуры клеток почек, печени, кожи и ФЭК.

2.2.2 Культивирование вирусов болезни Марека. Культивирование вирусов проводили на культуре клеток и растущих куриных эмбрионах.

2.2.3 Определение инфекционного титра вируса. Определение титра ВБМ проводили на первично трипсинизированной культуре клеток ФЭК с использованием метода предельных разведений. Титр вируса вычисляли по Керберу в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД5о/см3.

2.2.4 Контроль на стерильность. Испытание на стерильность проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы биологического контроля стерильности».

2.2.5 Контроль отсутствия контаминации посторонними вирусами. Проводили на основе методических рекомендаций, утвержденных в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

2.2.6 Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования. Для определения генетической принадлежности вируса «Vors-07» использовали метод, основанный на определении полной последовательности гена Meq испытуемого штамма.

2.2.7 Вскрытие птицы и отбор проб. После внешнего осмотра птицы разрезали кожу от клоаки до входа трахеи в грудную клетку и снимали ее с конечностей. Вскрытие брюшной и грудной полости начинали с разреза брюшной стенки от клоаки вентрально и доводили его до конца грудной кости. Килевую

кость поднимали вверх и подрезали ножницами. Далее производили отбор пораженных участков необходимых органов.

2.2.8 Количественный анализ копий генома вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Выделение суммарной ДНК проводили методом сорбции на силикагеле с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб-50» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), согласно прилагаемому к нему протоколу. Постановку ПЦР-РВ проводили с помощью амплификатора Corbett research Real-Time PCR System (Rotorgene, Австралия), согласно протоколу SJ. Baigent et al. [7]. Количественный анализ копий генома ВБМ проводили согласно уравнениям линейной регрессии, отражающим зависимость полученного значения Ct от исходного количества вируса [6]:

IgT/v = (-0,253)Ct+9,990,

где IgT/v — прогнозируемое значение титра вируса в 0,1 см3;

Ct - количество циклов амплификации.

2.2.9 Статистическая обработка полученных результатов. При статистической обработке результатов исследований были использованы общепринятые методы, рекомендованные С. Гланцем [1], а также компьютерная программа Microsoft Office Excel.

2.3 Результаты собственных исследований 2.3.1 Выделение вирулентного изолята ВБМ из органов больной птицы различными способами

В 2007 г. в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из птицефабрики «Ворсменская» Нижегородской области поступила птица, с признаками БМ, такими, как парезы и параличи ног, крыльев, шеи, деформацией зрачка, депигментацией радужной оболочки. При вскрытии обнаруживали опухолевые поражения в сердце, печени, селезенке, яйцеводе.

Задача данного этапа исследований состояла в поиске оптимального способа выделения ВБМ из патматериала (печени, почек, яичников, селезенки) для последующего изучения его культуральных и биологических свойств.

Для этого использовали первичную культуру клеток кожи эмбрионов СПФ-кур и развивающиеся куриные эмбрионы. Испытали 3 способа выделения вируса с последующим сравнением результатов [4,12].

В первом способе суспензией, полученной из патматериала, заражали 12-суточные КЭ на ХАО. Проводили 3 последовательных пассажа, после чего полученным материалом заражали первичную культуру клеток кожи КЭ. Для обнаружения цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток также проводили 3 пассажа.

Второй вариант - с предварительным культивированием вируса в 5-суточные растущих КЭ, зараженных в желточный мешок (3 пассажа), после чего культивирование продолжали на КК КЭ в течение еще 3 пассажей.

Третий вариант - заражение первичной культуры клеток кожи КЭ вируссодержащей суспензией и культивирование вируса в течение 3 пассажей.

Проведенные работы по выделению инфекционного агента из патматериала показали следующее: при всех способах выделения вируса на первых двух пассажах в культуре клеток видимых цитопатических изменений не происходило. Через 144-168 часов культивирование приостанавливали, считая указанный временной отрезок как «слепой пассаж». Данный период соответствовал началу дегенеративных процессов в интактной КК. Инфицированный клеточный монослой снимали со стекла, концентрировали и переносили собранный материал во флаконы со свежеприготовленной КК.

При первых 2 способах вирусовыделения ЦПД вируса в культуре клеток не обнаружено и на 3 пассаже, вирус не выявлен и в ПЦР. При третьем способе выделения вируса на 3 пассаже через 72 часа при микроскопировании монослоя клеток появились видимые цитопатические изменения.

После каждого пассажа культивирования вируса полученный материал титровали в культуре клеток кожи и исследовали в ПЦР-РВ. Данные ПЦР и

титрования вируса в культуре клеток показали, что с использованием первых двух способов, а именно, с предварительным культивированием вируса т оуо, вирус не был выделен. Кроме этого, к их недостаткам следует отнести длительный период культивирования.

С использованием третьего способа удалось получить изолят «Уоге-07» вируса болезни Марека. Хотя в первых двух пассажах на культуре клеток ЦПИ не наблюдали, данные ПЦР демонстрировали, что геном вируса присутствует в пробах. Воспользовавшись уравнением для опосредованной оценки титра ВБМ 1 серотипа [6], используя при этом результаты ПЦР, рассчитали, что концентрация вируса (Т) на 1 и 2 пассаже была близка к значениям Т=2,9*105 и Т=3,9х10 ^ ТЦЦ50/см3, соответственно. Сопоставляя данные титрования материала 3 пассажа, установили, что результаты, указывающие на количество вируса, были близки по значению. А именно, титр вируса в КК Т=6,0ХЮ5 ТЦЦ5о/см3 статистически не имел различий (р<0,05) с величиной титра Т=б,9><105 ^ ТЦЦ50/см3, рассчитанной опосредованно. Полученные результаты показали, что из всех предложенных к изучению чувствительных систем оптимальной оказалась первичная культура клеток кожи КЭ.

Данные, полученные в результате проведенных работ, были использованы в разработанных и утвержденных «Методических рекомендациях по выделению высокопатогенных изолятов вируса болезни Марека».

В дальнейшем по утвержденным методическим рекомендациям проводили выделение полевых вирусов БМ от больной птицы привезенной из птицеводческих хозяйств Республики Мордовия (2009г.) и Краснодарского края (2014г.).

2.3.2 Контроль стерильности и отсутствия контаминации посторонними вирусами

Полученный изолят необходимо было проверить на наличие бактерий, грибов и микоплазм, и на контаминацию чужеродными вирусами.

В результате исследований установлено, что изолят «Уог5-07» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. Высевы культурального

штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всего срока наблюдения.

Методом ПЦР проводили исследование штамма на наличие посторонних геномов микроорганизмов-возбудителей болезней птиц: вирусов гриппа А птиц, ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного энцефаломиелита, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной анемии цыплят и реовируса, используя специфические праймеры.

В результате проведенных исследований установлено, что изолят «Vors-07» не контаминирован чужеродными вирусами.

2.3.3 Определение генетической принадлежности штамма с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования В результате сравнительного анализа последовательностей Meq подтверждена принадлежность исследованного изолят «Vors-07» к 1 серотипу вируса болезни Марека, представителем которого также является штамм «Md5».

При анализе последовательности гена Meq изолята «Vors-07» выявлены 4 нуклеотидных замены в позициях 395 н., 485 н., 501 н., 1145н. гена Meq, которые подтверждают оригинальность данного изолята.

2.3.4 Культивирование изолята «Vors-07» ВБМ в различных культурах клеток Литературные источники предлагают различные культуры для культивирования вируса болезни Марека [4, 14, 15]. Нашей задачей являлся подбор системы культивирования для полученных изолятов.

Изучена возможность культивирования изолята «Vors-07» ВБМ в первично трипсинизированной КК печени, почек, кожи и ФЭК. Для изготовления КК почек и печени были использованы КЭ в возрасте 17 сут, а для КК кожи и ФЭК — 12 сут.

При посеве ткани печени на твердый субстрат через 24 часа кроме гепатоцитов прикреплялись клетки соединительной ткани, которые при смене среды полностью удалялись. Поэтому в дальнейшем работы по культивированию клеток печени были приостановлены.

Таблица 1 - Результаты культивирования изолята «Уоге-07» ВБМ на различных культурах клеток

№ Культура клеток Культура клеток почек Культура клеток кожи

пассаж. фнбробластов эмбрионов кур куриных эмбрионов куриных эмбрионов

уровня Кол-во вируса* Инфекц.акт. ТЦД50/см3 Кол-во вируса* Инфекц.акт. ТЦД50/см3 Кол-во вируса* Инфекц.акт. ТЩЫсм3

1 1,0x105 0,9x104±0,11x10" 2,0x10" 2,2х104±0,09х10" 7,9x10" 7,1х104±0,12х10"

2 2,0x10" 2,1х10"±0,13х10" 0,6x10" 0,6х104±0,12x10" 1,2x10" ихЮ'лО.ЮхЮ"

3 7,9x10" 7,5х104±0,08хЮ" 0,1x10" 0,2х10"±0, 08x10" 1,0x106 1,0х106±0,цх106

4 2,0x105 1,8х105±0,15х105 0,5x10' о.бхю^о.одхю-1 1,6x106 1,9х106±0,07x10'

5 3,2x105 3,4хЮ5±0,Юх105 0,6x10' 0,6 х10'±0,09x10' 3,1x10" 3,5х106±0,14x10"

* - количество вируса, рассчитанное по данным ПЦР, ТЦЦ50/СМ

Результаты, представленные в таблице 1, демонстрируют, что в процессе пассирования вируса на исследуемых культурах клеток наблюдается постепенное увеличение титра вируса на КК кожи и ФЭК. Лучшие результаты получены с использованием КК кожи. Инфекционная активность вируса на 5 пассажном уровне составила 3,5х106 ^ тцц50/см3, что на один ^ ТЦД50/см3 выше, чем на культуре клеток ФЭК. Эти данные подтверждают результаты, полученные в ПЦР.

При проведении последовательных пассажей изолята «Уоге-07» вируса болезни Марека на культуре клеток почек наблюдали постепенное снижение концентрации вируса в исследуемом материале, что указывало на непригодность использования данной культуры клеток для размножения вируса.

Результаты, представленные в таблице 1, демонстрируют, что произошла адаптация изолята «Уоге-07» вируса болезни Марека к культуре клеток кожи. При проведении последовательных пассажей наблюдается постепенное накопление вируса от 7,1х104 ^ ТЦЦ5о/см3 до 3,5х106 ТЦЦ5о/см3 к пятому пассажу, что составляет 4,9 ^ ТЦЦ50/ см3 и 6,5 ^ ТТ ТД50/ см3, соответственно.

2.3.5 Культуральные свойства изолята «Уогя-07» Культуральные свойства изолята «Уог5-07» изучали на КК кожи КЭ. В качестве инфекционного материала использовали вируссодержащую суспензию.

Зараженную первичную культуру клеток кожи КЭ инкубировали при (38,5±0,5)°С в течение 5-7 суток. Через 72 часа культивирования при микроскопировании монослоя клеток появились видимые ЦПИ. Они представляли собой небольшие единичные очаги поражений в виде скоплений округлых клеток с деформированными мембранами.

Данные морфологические изменения обозначили как фокусы или бляшки. Культивирование вируса на 5 пассаже продолжали в среднем 144 часа, при этом каждые 24 часа проводили микроскопию и наблюдали за развитием инфекционного процесса в КК.

Рисунок - 1. Инфекционный процесс, обусловленный вирусом БМ, в первичной культуре клеток кожи СПФ-эмбрионов кур

Примечание: На рис. 1. А в качестве контроля представлена интактная монослойная культура клеток кожи СПФ-эмбрионов кур На рис. 1. Б показаны изменения клеточного монослоя под действием изолята «Vors - 07» ВБМ через 144 часа.

На рисунке 1 Б наглядно продемонстрирован инфекционный процесс в КК кожи, обусловленный ВБМ. На начальной стадии, через 72 часа после внесения вирусного материала, наблюдали единичные очаги поражений с четко очерченными границами. С течением времени количество обнаруживаемых фокусов возрастало. Уже через 144 часа после заражения фокусы представляли собой крупные агрегаты из инфицированных клеток монослоя.

Поскольку форма локальных поражений приближена к окружности, была сделана попытка измерения их диаметров. Определение данной количественной характеристики проводили на завершающей стадии культивирования при микрокопировании, используя окуляр с измерительной шкалой.

Полученные данные показали, что диаметры (D) фокусов находились в диапазоне от 25 до 100 мкм. Средний размер составил D±m=59±3,84 мкм.

2.3.6 Проявление патогенных свойств вирулентного изолята «Уогв-07»у невакцинированных цыплят

После адаптирования изолята «Уоге-07» к системе культивирования необходимо было оценить его патогенные свойства. Для того, чтобы позиционировать изолят как контрольный, необходимо было определить оптимальное время заражения птиц, когда клинические и патологические изменения проявляются наиболее ярко.

Целью данного раздела являлось изучение вирулентности изолята «Уоге-07» | вируса БМ на цыплятах различных возрастов при прямом их заражении.

Для проведения опыта сформировали две опытные и одну контрольную (по 10 голов) группы цыплят сут возраста. Испытания проводили по следующей схеме: 1 -ю опытную группу инфицировали в первые сут жизни, 2-ю - в возрасте 14 сут. Контрольная группа оставалась неинфицированной. Все три группы содержались в равных условиях, соответствующих зоогигиеническим нормам. За птицами вели ежесуточное наблюдение.

Начиная с 30 сут после заражения, в первой группе фиксировали гибель птицы. При вскрытии цыплят 1-й опытной группы наблюдали лимфоидные образования на печени, селезенка была серовато-бордового цвета и имела лимфомы разных размеров (рисунок А), почки увеличены в размере в 1,5 — 2 раза. На сердце под эпикардом обнаруживали множественные опухоли различной величины (рисунок Б).

Рисунок - 2. Множественные очаги лимфоидных опухолей в селезенке и сердце, индуцированные изолятом «Уог8-07

Гибель птицы в первой опытной группе составила 70%.

Падеж цыплят во второй группе наблюдали, начиная с 40 сут после заражения. При вскрытии цыплят обнаруживали множественные опухоли в тех же органах (печень, селезенка, сердце). Пораженные органы были бледны и увеличены в объеме вследствие их инфильтрации опухолевой тканью, что характерно для острой формы БМ. Гибель птицы во 2-й группе составила 40%.

Также следует отметить, что у птиц обеих опытных групп в период наблюдения регистрировали нарушение координации движений и истощение. При вскрытии птиц контрольной группы патизменений не наблюдали.

Таким образом, в результате проведённых испытаний отмечали клинические и патологоанатомические проявления острой формы болезни Марека птиц, что подтверждало патогенность изолята «Vors-07» для кур.

2.3.7 Проявление патогенных свойств вирулентных штаммов ВБМу вакцинированных цыплят

Были проведены исследования по сравнению патогенных свойств изолята «Vors-07» и референтного штамма «Md5» вируса болезни Марека в опытах на цыплятах, вакцинированных moho-, би- и трехвалентными вакцинами против БМ.

Шесть групп (по 20 голов) цыплят в суточном возрасте привили moho-, би-и трехвалентной вакцинами (по две группы), согласно инструкции. В возрасте 8 сут цыплят в этих группах инфицировали вирулентными вирусами БМ. Также были сформированы две группы цыплят (по 20 голов) для контроля вирулентного штамма «Md5» и изолята «Vors-07», зараженных в возрасте 8 сут.

Контрольная группа осталась невакцинированной и неинфицированной. Каждая опытная группа цыплят в продолжение всего опыта (120 сут) содержалась в одинаковых условиях. За птицами вели регулярное наблюдение. По завершении опыта была произведена эвтаназия цыплят

Полученные результаты демонстрировали (таблица 2), что изолят «Vors-07» вируса болезни Марека имеет высокую степень патогенности. В группе контроля вирулентного вируса, где цыплята были инфицированы изолятом «Vors-07», гибель птицы наблюдали с 30 сут после заражения. По завершении опыта у 70% цыплят в группе были обнаружены признаки болезни Марека.

Таблица 2 - Патогенность изолята «Уогс-07» БМ для вакцинированных

цыплят

Наименование Всего Пало в опыте, гол. Убито в конце опыта, гол. Всего

исследуемых групп использовано, гол. всего от БМ всего с признаками БМ случаев БМ, %

Контроль вирулептного вируса 20 10 4 10 10 70,0

3 серотип 20 8 4 12 - 20,0

2+Зсеротип 20 2 2 18 - 10,0

1+2+3 серотип 20 2 2 18 - 10,0

* - отрицательный результат

Таблица 3 - Патогенность штамма «М(15» ВБМ для вакцинированных птиц

Наименование Всего Пало в опьгге, гол Убито в конце опыта, гол. Всего

исследуемых групп использовано, гол. всего от БМ всего с признаками БМ случаев БМ, %

Контроль вирулентного вируса 20 6 6 14 10 80,0

3 серотип 20 6 2 14 6 40,0

3+2 серотип 20 4 2 16 2 20,0

1+2+3 серотипы 20 2 2 18 2 20,0

* - отрицательный результат

Полученные данные показали (таблица 3), что гибель цыплят, инфицированных высоковирулентным штаммом «Мс15» ВБМ в группе контроля вирулентного вируса, наблюдали с 30 сут после заражения, признаки болезни Марека отмечены у 80% цыплят в группе. При вскрытии цыплят также обнаруживали поражения печени, сердца, селезенки, бурсы. Все пораженные органы были увеличены и бледны вследствие их инфильтрации лимфоидной опухолевой тканью.

Однако у вакцинированной птицы при заражении вирулентными вирусами «Md5» и «Vors-07» болезни Марека через 8 суток после иммунизации не наблюдали явных клинических признаков.

При вскрытии были обнаружены патизменения внутренних органов, характерные для БМ, описанные выше. В группах птиц, вакцинированных моновалентной (3 серотип) вакциной и зараженных вирусами БМ «Vors-07» и «Md5», при вскрытии отмечали признаки болезни Марека у 20 % и 40 % цыплят, соответственно. В группах, вакцинированных би- (2+3 серотипы) и трехвалентной (1+2+3 серотипы) вакцинами и зараженных «Vors-07» и «Md5» - по 10 % и 20 % птиц, соответственно. Также болезнь проявлялась истощением, отставанием в росте, нарушением опорно-двигательной системы.

При вскрытии птицы в контрольной группе отклонений от физиологической нормы не обнаружено.

Полученные результаты показали, что по степени патогенности изолят «Vors- 07» близок к референтному высоковирулентному штамму «Md5», а заражение птиц в возрасте 8 сут является оптимальным при проведении экспериментов по определению вирулентности полевых изолятов болезни Марека и оценке эффективности вакцин.

2.3.8 Депонирование штамма «Vors-07»

В результате проведенных испытаний установлено, что штамм не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. Высевы ресуспендированного штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всего срока наблюдения.

По данным ПЦР, изолят «Vors- 07» содержал только геном ВБМ, т.е. не был контаминирован посторонними вирусами и микоплазмами.

Инфекционная активность изолята «Vors-07» при титровании в культуре клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур была не ниже 4,0 lg ТЦЦ50/см3.

В результате сравнительного анализа последовательностей гена Meq подтверждена принадлежность исследованного изолята «Vors-07» к 1 серотипу вируса болезни Марека, представителем которого является штамм «Md5».

При анализе последовательности гена Meq изолята «Vors-07» выявлены 4 нуклеотидных замены в позициях 395 н., 485 н., 501 н., 1145н. гена Meq, которые подтверждают оригинальность данного изолята.

В результате проведённых испытаний отмечали клинические проявления острой формы БМ птиц, что подтверждало высокую патогенность изолята «Vors-07».

При проведении репродукции в течение 3 последовательных пассажей в КК фибробластов СПФ-эмбрионов кур изолята «Vors-07» оставался стабильным, т.е. не снижал биологическую активность, титры были не ниже 4,0 lg ТЦД50/СМ3.

В итоге штамм «Vors-07» был депонирован в банк-музей Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» (справка о депонировании №41/154, от 09.04.2015 г.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Предложен способ изоляции высоковирулентных полевых вирусов болезни Марека, включающий первичное выделение вируса в культуре клеток кожи СПФ-эмбрионов кур.

2. Показано, что метод ПЦР позволяет установить наличие возбудителя при отсутствии цитопатических изменений в культуре клеток при первичных пассажах, и может быть использован для определения количества вируса в вируссодержащем материале.

3. На примере изолята ВБМ «Vors-07» показано, что культура клеток кожи является оптимальной системой для репродукции вируса по сравнению с другими испытанными культурами клеток (фибробластов, печени, почек эмбрионов кур).

4. Максимальную инфекционную активность штамма «Vors-07» (3,5х106 lg ТЦД/см3) получали при культивировании вируса на КК кожи в течении 5 пассажей. Размер специфических поражений (фокусов), вызванных штаммом «Vors-07», в культуре клеток составил в диаметре 59±3,84 мкм. Оптимальное время культивирования составило 144 ч.

5. Установлено, что штамм ВБМ «Vors-07» через 30 сут после заражения вызывает острую форму болезни Марека у невакцинированных цыплят,

зараженных в суточном возрасте, с летальностью 70 %, у зараженных в 14 сут -40%, что сопоставимо со степенью патогенности высоковирулентного референтного штамма «Md5», при заражении которым летальность в эти же сроки (30-60 сут) составляет 80 % и 50 %, соответственно.

6. Установлено, что у птиц, вакцинированных моновалентной вакциной (3 серотип) и зараженных штаммами «Vors-07» и «Md5», в течение 120 сут после заражения (срок наблюдения) отмечены признаки болезни Марека у 20 % и 40 % цыплят, соответственно. В группах, вакцинированных би- (2+3 серотипы) и трехвалентными (1+2+3 серотипы) вакцинами процент проявления неопластических изменений был ниже и составил 10 % и 20 % птиц, соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Культивирование штамма Md5 вируса болезни Марека на различных культурах клеток куриных эмбрионов / Е. В. Курненкова, Ш.К. Куляшбекова, Е.А. Кулакова [и др.] // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4(23). - С. 154-157.

2. Адаптация штамма Md5 вируса болезни Марека к культуре фибробластов эмбрионов кур / Е. А. Чичерина, Е. В. Курненкова, М. И. Шульпин [и др.] // Рос. вет. журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 73-74.

3. Проявление патогенных свойств штамма MD5 вируса болезни Марека у цыплят / Е.А. Чичерина, Ш.К. Куляшбекова, A.B. Борисов [и др.] // Ветеринарная патология. - 2010. - №2. - С. 38-41.

4. Проявление патогенных свойств штамма MD5 вируса БМ у цыплят / Е. А. Чичерина, Ш.К. Куляшбекова, A.B. Борисов [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, - 2010. - Т. 8. - С. 175-180.

5. Чичерина, Е. А. Локализация аттенуированного и вирулентного штаммов вируса болезни Марека серотипа 1 в организме / Е. А. Чичерина, М. И. Шульпин // Ветеринария сегодня. - 2012. - № 1. - С. 23-28.

6. Чичерина, Е.А. Сравнение патогенных свойств изолята «Vors - 07» и референтного вирулентного вируса болезни Марека штамма «Md5» / Е.А. Чичерина, В.Н. Ирза // Ветеринария Кубани - 2015. - № 3. - С. 3-5.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БМ - болезнь Марека ВБМ — вирус болезни Марека КРС — крупный рогатый скот КК - культура клеток КЭ — куриные эмбрионами

ПЦР-РВ - полимеразно-цепная реакция в реальном времени

ХАО — хориоаллантоиная оболочка

ЦПД — цитопатическое действие

ЦПИ — цитопатические изменения

СПФ — свободные от патогенной флоры

ФОБ — фокус образующие единицы

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур

ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц; Пер. с англ. под ред. Н. Е. Бузикашвили, Д.В. Самойлова. - М.; Практика, 1999. - 460 с.

2. Дудникова, Е.К. Патотипирование полевых изолятов вируса болезни Марека, выделенных на территории I5® в 2001-2005 гг. методом «Best fit» / E.K. Дудникова, С.Н. Норкина, Т.И. Алипер [и др.] // Вопросы вирусологии. -2009. -№1.- С. 36-41.

3. Коровин, Р.Н. Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных / Р.Н. Коровин // Современное состояние исследований в области эпизоотологии и иммунологии болезни Марека. -М., 1979. - С. 217-223.

4. Куляшбекова, Ш.К., Болезнь Марека / Ш.К. Куляшбекова, A.B. Борисов, В.В. Дрыгин - Владимир: Транзит-ИКС, 2008. - 214 е., ил.

5. Мазуренко, Н.П. Изучение некоторых герпесвирусов птиц и человека // Вирус рака и лейкоза.-М., 1974.-С. 171-182.

6. Соотношение величины инфекционного титра и интенсивности ПЦР для ВБМ / А.А. Пяткина, М.П. Шульпин, Ш.К. Куляшбекова [и др.] // Актуальные проблемы инновац. развития вет. науки и практики. Сборник науч. тр., посвящ. 105-летию ин-та / ТОО «КазНИВИ». - Казань, 2010. - Т. 56. - С. 285-289.

7. Absolute quantitation of Marek's disease virus genome copy number in chicken feather and lymphocyte samples using real-time PCR / Baigent S.J., Petherbridge L.J., Howes K. [et al.] // J. Virol. Meth. - 2005. - Vol. 123. - P. 53-64.

8. A recombinant field strain of Marek's disease (MD) virus with reticuloendotheliosis virus long terminal repeat insert lacking the meq gene as a vaccine against MD / S.Su, N. Cui,Y.Zhou [et al.] // Vaccine. - 2015. - Vol. 33. - P. 596-603.

9. Calnek, B.W., Pathogenesis of Marek's disease virus-induced local lesions. 2. Influence of virus strain and host genotype / B.W. Calnek, B. Lucio, K.A. Schat // Advances in Marek's Dis. Res. / ed. S. Kato, T. Horiuchi, T. Mikami, K. Hirai; Jap. Assoc. Marek's Dis. - Osaka, Japan, 1989. - P. 324-330.

10. Dunn, J.R., Current status of Marek's disease in the united states and worldwide based on a questionnaire survey / J. R. Dunn, I.M. Gimeno // Avian Dis. -2013, - Vol. 57, - P. 483-490.

11. Hildebrandt, E, Characterizing in vivo stability and potential interactions of a UL5 helicase-primase mutation previously shown to reduce virulence and in vivo replication of Marek's disease virus / E. Hildebrandt, J. Dunn, H.H. Cheng // Virus Res. - 2015.-Vol. 203.-P.l-3

12. Marek's Disease: An Evolving Problem / ed. F. Davidson, V. Nair. - London: Elsevier Acad. Press, 2004. - 212 p.

13. Pathogenic characteristics of Marek's disease virus field strains prevalent in China and the effectiveness of existing vaccines against them / Y.P. Zhang, Z.J. Li, K.Y. Bao [et al.] // Vet. Microbiol. - 2015. - Vol. 177. - № 1-2. - P. 62-68.

14. Schumacher, D. Generation of a permanent cell line that supports efficien growth of Marek's disease virus (MDV) by constitutive expression of MDV

glycoprotein E / D. Schumacher, B.K. Tischer, Y.-P. Teilke // J. Gen. Virol. - 2002. -Vol. 83. - P. 1987- 1992.

15. Studies on the etiology of Marek's disease. I. Propagation of the agent in cell culture / J.J. Solomon, R.L. Witter, K. Nazerian, B.R. Burmester// Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1968.-Vol. 127.-P. 173-177.

16. Wozniakowski, G., Molecular evolution of Marek's disease virus (MDV) field strains in a 40-year time period / G. Wozniakowski, A.E. Samorek-Salamonowicz // Avian Dis. -2014. - Vol. 58. - P. 550-557.

Подписано в печать 08.04.2015г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л.1 Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе фгбу «Федеральный центр охраны здоровья животных»