Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Штаммовая дифференциация изолятов вируса инфекционной бурсальной болезни, выделенных на территории России

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Штаммовая дифференциация изолятов вируса инфекционной бурсальной болезни, выделенных на территории России"

РГ6 ол

на правах рукопописи'

УДК б 19:616.476:578.2

ЩЕРБАКОВА Лидия Олеговна

ШТАММОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ИИФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.00.06 "Вирусология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Научный руководитель - Дрыгни Владимир Викторович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Научный консультант - Борисов Александр Владимирович, кандидат ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

- Узюмов Василий Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, профессор (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

- Смоленский Владимир Иванович, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ВГНКИ, г. Москва).

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ г. Покров).

Защита состоится " октября 1997 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120. 60. 01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Ученый секретарь диссертационного совета - В.А. Мищенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) - острое, высококонтагиозное заболевание, поражающее цыплят 2-15-недельного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду А vibirnavirits. семейства Birnaviridae (Brown, 1986). Инфекционную бур-сальную болезнь (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) регистрируют в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления, причем ИББ часто принимает характер энзоотии.

Высокая контагиозность, устойчивость вируса к действию факторов внешней среды и дезинфектантов, а также экономический ущерб, наносимый птицеводческим хозяйствам, делают ИББ серьезной проблемой для птицеводства многих стран мира, включая Россию.

Согласно данным эпизоотологического обследования в течение 1975-1996 годов ИББ подтвердили серологически во всех обследованных птицехозяйстиах России, а вирус выделили в 145, что указывает па широкое распространение инфекции.

До середины 80-х годов максимальный уровень смертности во время вспышек ИББ достигал 30%. В 1986 г. в Европе появились и начали быстро распространяться высоко вирулентные штаммы вируса, которые вызывали вспышки ИББ, характеризующиеся высоким уровнем смертности - до 70 % и выше. Наряду с прямыми потерями (гибель молодняка, снижение продуктивности, вынужденная выбраковка) заболевание представляет серьезную опасность вследствие развивающейся у инфицированных цыплят нммуносупрессии. Цыплята, перенесшие субклнннческую форму ИББ. не способны полноценно реагировать на применение вакцин против болезни Марека, Ньюкасла, инфекционного бронхита и др.

Проявление ИББ маскируется другими болезнями и физиологическими нарушениями. Только при типичном течении ИББ сравни-

тельно легко диагносцируется по клиническим и патологоанатомиче-ским признакам. Внезапное появление болезни, сопровождающееся диареей, высокая заболеваемость, быстрое распространение, зубчатая кривая смертности дают основание предположить наличие ИББ в хозяйстве. Подтверждением диагноза может быть обнаружение характерных изменений в фабрициевой сумке. На ранней стадии или при субклиническом течении болезни необходимы лабораторные исследования.

В настоящее время лабораторная диагностика ИББ включает: выделение вируса на куриных эмбрионах или в культуре ФЭК, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН и РДП, выявление антител в сыворотке крови в РН, РДП и ИФА, обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.

Появление антигенных вариантов вируса ИББ, а также высоко вирулентных штаммов, охарактеризованных с использованием панели моноклональных антител (МАТ) как классические, но тем не менее способных вызывать заболевание у вакцинированных птиц, определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых более эффективных средств диагностики и профилактики ИББ.

Совершенствование методов диагностики ИББ предполагает прежде всего повышение их чувствительности, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

Одним из перспективных направлений, способных решать эти задачи, является использование метода ПЦР, который основан на эн-зиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфических праймеров. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять не только инфекционный вирус, но и фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагмента генома, характеризующегося максималь-

ной вариабельностью, позволяют наиболее точно установить штаммо-вую принадлежность вируса.

Возможность применения метода ПЦР и сравнительного генетического анализа для идентификации вируса ИББ определяется степенью изученности вируса. Накопленные данные о первичной структуре генома ВИББ позволяют выявить высоковариабельный фрагмент ге-' нома, оптимизировать нуклеотидные последовательности фланкирующих этот фрагмент праймеров и разработать тест-систему для индикации и штаммовой дифференциации ВИББ. Цель и задачи исследования

Основная цель данного исследования заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ и изучении методами молекулярной биологии генетических взаимоотношений штаммов вируса ИББ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод индикации вируса ИББ в различных вируссодер-жащих образцах па основе ПЦР;

- на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Ур2 разработать метод идентификации вируса ИББ, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;

- провести анализ нуклсотндноп последовательности вариабельной области гена Ур2 полевых и вакцинных штаммов вируса ИББ;

- сравнить первичные структуры антигенно-значнмой области Ур2 полевых и вакцинных штаммов вируса ИББ.

Научная новизна исследования

Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена Ур2 46 изолятов вируса ИББ, выделенных на территории России в течение 1993-1997 гг., и 14 отечественных и зарубежных вакцинных штаммов. Выявлены генетические группы штаммов вируса ИББ. Определены особенности первичной структуры антиген-но-значимой области Ур2 российских изолятов и вакцинных штаммов

вируса ИББ и создан банк данных нуклеотидных н соответствующих аминокислотных последовательностей. Практическая значимость исследования

Разработан метод выделения, очистки и концентрирования ВИББ и вирусной дцРНК, позволяющий получать из 100 г фабрииис-

ч

вых сумок инфицированных птиц 5-7 мг вируса и соответственно около 0,5 мг вирусной дцРНК.

Разработан метод индикации ВИББ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих образцах в течение 4-6 ч.

Разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена Ур2, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию вновь выделенных изолятов ВИББ.

С использованием разработанного метода проведена идентификация 46 изолятов ВИББ, выделенных на территории России в 19931997 г., а также 14 отечественных и зарубежных вакцинных штаммов.

Разработанные методы выделения вирусной дцРНК, выявления и штаммовой дифференциации вируса ИББ одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, и в настоящее время используются для индикации и идентификации вируса ИББ. Публикация научных исследований

По теме научных исследований опубликовано 11 научных работ. Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г. Владимир (1995 г.), научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии" г. Москва (1996 г.), всемирном ветеринарном конгрессе в г. Иокогама (Япония. 1995 г.).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 115 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты .собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 160 источников. Работа иллюстрирована 17 рисунками и б таблицами. Положения выносимые на защиту

- метод выделения вируса ИББ;

- экспресс-методы индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ, основанные на амплификации в ПЦР, определении первичной структуры и сравнительном анализе фрагмента кДНК вариабельной области гена Vp2;

- первичная структура вариабельной области гена Vp2, изолятов вируса ИББ, выделенных на территории России в 1993-1997 г., отечественных и зарубежных вакцинных штаммов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Вирус ИББ.

В исследовании были использованы 46 полевых изолятов вируса ИББ, выделенных в течение 1993-1997 г., а также 14 вакцинных штаммов, использующихся на птицефабриках России. Выделние РНК

Выделение суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов проводили, используя модифицированный метод Chomczynski et al. (1987), с помощью набора реактивов RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, США).

Синтез комплементарной ДНК на вирионной РНК проводили по модифицированному методу Davis et al. (1990).

I

I

b !

ПЦР проводили в программируемом амплификаторе РТС-100 MinlCycler (MJ Research Inc, США). Продукты ПЦР очищали с помощью набора реактивов Magic™ PCR Preps DNA Purification K.it (Promcga. США). Секвенирование кДНК

Нуклеотидную последовательность вариабельной области гена Vp2 определяли методом прямого секвепирования амплифицированных фрагментов с помощью набора fmol DNA Sequencing System (Promega, США).

Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили, используя пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1.0

(N.J. Knowles, IFAN, Великобритания). ¡

!

I

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование профиля вариабельности геномного сегмента А вируса инфекционной бурсальнои болезни и теоретический расчет праймеров

Для определения участка генома, наиболее подходящего для штаммовой дифференциации вируса ИББ. было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей геномного сегмента А семи штаммов вируса ИББ серотипа I, опубликованных Европейским Биоинформационным Институтом (EMBL).

На основе выравнивания последовательностей с использованием ¡ программы "SQMAX" был построен профиль вариабельности ге- ; номного сегмента А вируса ИББ (рис. 1).

Рис. 1. Структура геномного сегмента А вируса ИББ и профиль вариабельности для 7 штаммов вируса, полученный последовательным сравнением соответствующих фрагментов длиной 150 н. с шагом 1 нуклео-тид. По оси абсцисс - номера нуклеотидов геномного сегмента А, по оси ординат - процент вариабельности. РЯ1, РИ.2. РЯЗ, РЯ4 указывают расположение праймеров.

В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей геномного сегмента А, в гене Ур2 выявлена область, характеризующаяся максимальной вариабельностью (45%), расположенная в центральной части гена Ур2 (750 - 1180 н.) и ограниченная с обоих концов консервативными участками.

В фрагменте Ур2, кодируемом этой областью гена, расположен основной конформационный эпитоп для вируснейтрализующих МАТ (Агас! « а!., 1987). Анализ последовательностей геномного сегмента А вариантов вируса ИББ показал, что антигенные отличия между штам-

мами определяются аминокислотными изменениями в данном вариабельном фрагменте Vp2 (Vakharia et al., 1994; Lana et al., 1992, Heine et al., 1991).

Таким образом, вариабельная область гена Vp2 (с 750 но 1180 п.), кодирующая основной конформаинонный эпитол, на наш взгляд является наиболее информативной для штаммовой дифференциации вируса ИББ и поиска потенциальных антигенных отличий штаммов.

В результате проведенного анализа последовательностей геномного сегмента А были выбраны две пары праймеров для ПЦР, гомологичные консервативным участкам, фланкирующим вариабельную область гена Vp2 (рис.1, табл.1.).

Внешние праймеры (PR1, PR4) использовали для амплификации, а внутренние (PR2, PR3) для реамплификации, в случае, если содержание вируса в пробе было достаточно низким, а также для секвенирова-ния амплифицированных фрагментов кДНК.

Таблица 1

Структура праймеров для амплификации вариабельной области

гена Vp2

Праимср Последовательность Длина Позиция па геноме ВИББ*

PR1 5'-GTATGTGAGGCTTGGTGACCC-3' 21 659 - 679 н.

PR2 5'-GTGACAGGCCCAGAGTCTAC-3' 20 730 -749 н.

PR3 5'-GATCCTGTTGCCACTCTTTC-3' 20 1194- 1213 н.

PR4 5'-CATGGCTCCTGGGTCAAATCG-3' 21 1295 - 1315 н.

""нумерация приведена по ВауШэ с соавт. (1990)

Выделение и очистка вируса инфекционной бурсальпой болезни

При разработке метода индикации ВИББ необходимо было подобрать условия выделения вируса ИББ для получения высокоочищен-ных и концентрированных препаратов вирусной дцРНК.

В результате сравнения различных способов экстракции и концентрирования был разработан метод выделения вируса ИББ из фаб-рнциевых сумок инфицированных кур, включающий гомогенизацию, 2-3 кратное замораживание-оттаивание гомогената, экстракцию вируса фреоном, осаждение через 30% сахарозную подушку, очистку в градиенте плотности СвС!, концентрирование вируса ультрацентрифугированием. Раработанная методика выделения и очистки вируса ИББ дает возможность с достаточно высокой воспроизводимостью получать из 100 г фабрициевых сумок инфицированных птиц 5-7 мг очищенного и концентрированного вируса.

Препараты очищенного концентрированного вируса ИББ использовались для выделения полноразмерной нативной дцРНК вируса ИББ, а также в качестве антигена в ИФА и для иммунизации животных с целью получения специфических сывороток (или глобулинов).

Амплификация кДНК вариабельной области гена Ур2 методом ПЦР

С использованием дцРНК, выделенной из концентрированного и очищенного вируса ИББ, был осуществлен подбор оптимального тем-пературно-временного режима для реакции обратной транскрипции и ПЦР, а также концентраций компонентов реакций. В дальнейшем разработанную методику примененяли для выявления ВИББ в различных вируссодержащих материалах.

В случае, если содержание дцРНК ВИББ в исходном материале, поступающем для исследования, было достаточно.низким, то, как правило, ПЦР проводили в два этапа. Первый- этап - амплификация с внешней парой праймеров (РИЛ, РЯ4). Если вирусспецифическая полоса (фрагмент кДНК размером 656 п.н.) не выявлялась, проводили второй этап - реамплификацию с внутренними праймерами (РИ.2 и РЯЗ). В результате синтезировался продукт размером 484 п.н.

I I

10 j

Разработанная методика была использована для индикации ВИББ в инфицированных культурах клеток ФЭК и куриных эмбрионах, фабрициевых сумках, печени, крови инфицированных птиц, об- j разцах вакцинных препаратов, кормовых смесях, использующихся на ' птицефабриках России. - ,

Определение п сравнительный анализ первичной структуры !

вариабельной области гена Vp2 изолятов вируса инфекционной г-

бурсальной болезни, выделенных на птицефабриках России в 1993-1997 г. \

1' !■

На основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней проводить идентификацию штаммов ВИББ. Метод был использован

I

для выявления спектра штаммов ВИББ, циркулирующих на птицефабриках России. Определена первичная структура вариабельной области гена Vp2 46 изолятов вируса ИББ, выделенных в 1993-1997 гг.

Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности вариабельной области гена Vp2 исследованных изолятов ! сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными EMBL.

На рис.2 представлена дендрограмма, отражающая генетические взаимоотношения между исследованными изолятами, высоко вирулентными (ВВ) штаммами CS89, 661, JY 86, 74/89А, выделенными в Великобритании, и DV86, выделенном в Нидерландах, а также классическими вирулентными (52-70 и STC) и вакцинными (PBG98 и Си-1) штаммами ВИББ.

На основе гомологии первичной структуры вариабельной области гена Vp2 можно выделить две основные группы изолятов. Наиболее многочисленная группа (40 изолятов) обладает большим сходством с высоко вирулентными (ВВ) европейскими штаммами. Десять входящих в эту группу изолятов по нуклеотидной последовательности полностью

идентичны штаммам .1У86 и 661, шесть изолятов имеют последовательности, аналогичные последовательности штамма ОУ8б, остальные 24 изолята имеют от 1 до 10 нуклеотидных отличий.

Еще более гомогенной эта группа представляется при сравнении аминокислотных последовательностей, так как около 70 % отмеченных выше нуклеотидных замен не приводят к замене аминокислот. 29 изолятов имеют аминокислотную последовательность, идентичную таковой высоко вирулентных штаммов С389, 74/89А. 661, ^У8б. и ОУ86. 9 изолятов отличаются по 1-2 аминокислотным остаткам (а.о.).

Вторую группу составляют четыре изолята, обладающие высокой степенью гомологии нуклеотидных последовательностей (около 98,5%) с вакцинными штаммами Си-1 и РВС98. В целом, две основные группы изолятов отличаются друг от друга по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям примерно на 7%.

Кроме изолятов, условно составляющих две основные группы, были выявлены 2 изолята (1ВОУЯР-05/94, 1ВОУЯР-08/96), имеющие ряд оригинальных замен в' вариабельной области гена Ур.2. Оба изолята выделены от птиц без клинических проявлений ИББ.

Максимальные отличия от всех изученных российских изолятов были выявлены у изолята 1ВОУКР-08/96. выделенного на птицефабрике "Бройлер" Иркутской области. Он имеет 16 уникальных нуклеотидных и 6 аминокислотных замен и отличается от 1 группы изолятов по 12 аминокислотным остаткам (а.о.), а от 2 группы по 11 а.о. Одновременно с изолятом 1ВОУЯР-08/96 на птицефабрике "Бройлер" Иркутской области был выявлен изолят 1ВОУК.Р-07/96. имеющий нуклео-тидную последовательность вариабельной области Ур2, идентичную таковой высоко вирулентных штаммов ВИББ. Таким образом, было показано, что на одной птицефабрике одновременно могут циркулировать штаммы вируса ИББ, относящиеся к разным генетическим группам.

-рад)

- 42/70

-1

8 7 6 5 4 3 2 1 0

Процсш нуклсотндных раллнчнй

Рнс.2 Дендрограмма, отражающая отношения между отечественными изолятами вируса ИББ, высоко вирулентными европейскими штаммами С589, 661, ЗУ 86, 74/89А и а также классическими вирулентными (52-70 и БТС) и вакцинными (РВ098 и С1Ы) штаммами ВИББ, установленные на основе гомологии нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена Ур2.

При исследовании проб, полученных с птицефабрики "Ворсменская" Нижегородской обл. с разницей со времени выделения 11 месяцев, первоначально был выявлен изолят (1ВОУЯР-01/96), близкий по своей структуре к вакцинным штаммам Си-1 и РВС98, а позд-

нее - изолят (IBDVRF-18/96), имеющий высокую степень гомологии с ВВ европейскими штаммами ВИББ.

Изоляты, имеющие структуру, идентичную или близкую к таковой европейских ВВ штаммов ВИББ, были выявлены в результате исследования патматерпала, полученного от птиц, вакцинированных препаратами на основе штаммов Gumboral, D78, Winterfleld, Bur 706. При исследовании проб, полученных с 3 птицефабрик, где применялся вакцинный штамм БГ, были выявлены два изолята, имеющие последовательности, идентичные вакцинному штамму БГ, и один изолят имел последовательность, идентичную таковой ВВ штамма 661.

Анализ вариабельной области гена Vp2 штаммов вируса инфекционной бурсальиой болезни, используемых для производства живых вакцин

Основным средством профилактики ВИББ является вакцинация. Применение на птицефабриках России и стран СНГ вакцин против ИББ. закупленных у ведущих зарубежных фирм Франции, Хорватии, Голландии, США, Германии и других стран, а также отечественных вакцин при соблюдении всех условий н сроков вакцинации не всегда обеспечивает эффективную защиту. Были зарегестрированы вспышки ИББ у вакцинированных птиц с высоким уровнем материнских антител [German с соавт. 1995]. Одной из причин неэффективности вакцинации могут быть различия антигенной структуры вакцинных и полевых штаммов ВИББ. Данное предположение было теоретически обосновано McFerran и соавт. [1980] и подтверждено исследованиями Jackwood и соавт. [1987], Snyder и соавт. [1988, 1990,1992].

С целью изучения генетической вариабельности вакцинных штаммов, а также для выявления точечных мутаций, способных повлиять на структуру конформационного эпитопа, была определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена Vp2 14 вакцинных штаммов и проведено сравнение соответствующих амино-

кислотных последовательностей вакцинных штаммов и российских ИЗОЛЯТОВ. I

В результате сравнительного анализа было показно, что вакцинные штаммы: Winterfield 2512 (Югославия и Италия) и PBG98 (Голландия) имеют идентичные последовательности вариабельной области гена Vp2. Идентичную структуру имеют также вакцинные штаммы ВНИВИП (Россия), UnivaxBD (США) и LZD228 (Франция и Голландия). Это позволяет предположить, что несмотря на разные названия вакцинных препаратов, они получены на основе одного и того же штамма или очень близких штаммов вируса ИББ.

В результате сравнения аминокислотных последовательностей вариабельной области Vp2 полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИББ было установлено, что из всех вакцинных штаммов только штамм БГ имеет структуру, наиболее близкую 1 группе изолятов. и отличается от них всего по 2-3 а.о. (рис.3).

IBDVRF-08/94 IBDVRF-01/94 IBDVRF-03/94 I3DVRF-07/94 IBDVRF-02/94 БГ/ Россия 223Е/Голланяия IBDVRF-05/94 1-65/ Израиль BURSХНЕ-2/США WINTERFIELD2512/Италия PBG93/ EMBL GUMBORAL ST/Франция BUR7Об/Франция UNIVAX/ США CU-1/ EMBL IBDVRF-10/95 IBDVRF-01/96 D-7 8/ Голландия IBDVRF-08/96

-с

8 7 6 5 4 3 2 11)

Процент аминокислотных различий

Рис.3. Дендрограмма, отражающая уровень отличии аминокислотных последовательностей вариабельной области Ур2 вакцинных и полевых штаммов вируса ИББ,

Группа близкородственных штаммов: PBG98, Winterfield 2512, ВНИВИП, UnivaxBD, L2D228. Gumboral СТ. Cu-1. Bur706 и D78 имеет структуру, близкую ко второй группе изолятов (IBDVRF-01/96, IBDVRF-10/95, IBDVRF-11/95 и IBDVRF-15/95). Штаммы Bursine-2 и 1-65 объединяются в отдельную группу. Штамм 228Е и изоляты IBDVRF-08/96 и IBDVRF-05/94 имеют структуру, отличающуюся от всех изученных вакцинных и полевых штаммов.

Поскольку неудачи вакцинации против ИББ могут быть обусловлены антигенными отличиями полевых изолятов и вакцинных штаммов, анализ аминокислотных замен, способных привести к изменению конформации основного эпитопа, представляет большой интерес.

Ранее проведенный сравнительный анализ последовательностей структурных белков антигенных вариантов ВИББ, способных вызывать заболевание у вакцинированных птиц, позволил выявить мутации, влияющие на изменение антигенных свойств вируса, и идентифицировать аминокислотные остатки, которые предположительно могут принимать участие в связывании вируснейтрализующих моноклональ-ных антител (МАТ) [Lana et al., 1992. Vakharia et al., 1994, Heine et al., 1991]. Большинство аминокислотных замен, приводящих к изменению антигенных свойств вариантов ВИББ, сосредоточены в центральной области Vp2 между 212-332 а.о., особенно в двух гидрофильных фрагментах 212-223 и 314-324 а.о. Vp2, локализованных по обе стороны вариабельной области Vp2 [Heine et al.,1991]. Было показано, что первый гидрофильный фрагмент стабилизирует конформашио эпитопа, а второй является определяющим для связывания МАТ.

В позиции 222, расположенной в первом гидрофильном фрагменте, у изолятов I группы (кроме 1BDVRF-02/94 и IBDVRF-07/94) и вакцинного штамма БГ произошла замена Pro-Ala; у вакцинных штаммов 228Е, Bursine-2 и 1-65 соответственно Pro-Ser (Pro 222 коррелирует со связыванием МАТ 179). Замена Pro-Ala, выявленная у высоко виру-

лентных (Bß) штаммов вируса ИББ, часто наблюдается в мутантах, избегающих нейтрализации антителами против PBG98 или D78 [Van der Berg et al., 1994, Brown et al., 1996]. В отличие от ВВ штаммов вируса эти мутанты всегда имеют дополнительные мутации во втором гидрофильном фрагменте. Вполне вероятно, что мутации в первом гидрофильном фрагменте являются компенсаторными и необходимы для стабилизации белковой структуры после мутаций во втором гидрофильном фрагменте.

His 253 коррелирует со связыванием МАТ 179. Замена в позиции 253 His, несущего положительный заряд, на нейтральный Gin у первой группы изолятов, БГ и 228Е приводит к уменьшению гидрофильных свойств и к изменению конформации белка на данном участке, что подтверждается теоретическими расчетами вторичной структуры с использованием метода Chou и Fasman [Chou, 1974].

Еще одна замена, которая предположительно может привести к изменению конформации, расположена в позиции 279. Y изолятов 1 группы и вакцинных штаммов Bursine-2 и 1-65 в данной позиции расположен отрицательно заряженный Asp, у PBG98 и Wintcrfield 2512 -нейтральный Thr, у БГ и 228Е - нейтральный Asn. Соседний Asn280 коррелирует со связыванием MAT В69. Остальные замены в гидрофобной части антигенного сайта являются консервативными и вряд ли вносят вклад в специфичность антител. Нельзя, тем не менее, исключить более тонкие конформационные изменения.

Для ВВ штаммов вируса ИББ не было описано четких антигенных отличий [Snyder, 1990; Van der Marel,1990, Oppling, 1991]. Тот факт, что они могут вызывать болезнь на фоне высокого уровня материнских антител, увеличивает вероятность того, что даже.незначительные изменения антигенной структуры могут играть роль в увеличении вирулентности [Brown, 1996].

Анализ генетической вариабельности вируса инфекционной бурсальной

болезни

С использованием результатов собственных исследований, а также данных ЕМВЬ, нами был создан банк данных, включающий 98 нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена Ур2 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных штаммов ВИББ. Анализ накопленных данных позволяет наиболее полно представить генетическую вариабельность вируса ИББ.

Графически генетические взаимоотношения между штаммами ВИББ представлены в виде дендрограммы (рис.4). В соответсвии с гомологией нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена Ур2 штаммы ВИББ разделились на несколько групп. Было показано, что нет четкой корреляции между разделением штаммов ВИББ на группы и географическим местом выделения, что, по всей видимости, связано с особенностями распространения заболевания.

Создание банка данных, включающего первичные структуры вариабельной области гена Ур2 штаммов ВИББ. выделенных в разных регионах а в разное время, позволяет проводить сравнение не только среди штаммов, циркулирующих на территории России, но и сравнивать их с штаммами, выделенными в других странах, что становится особенно важным, т.к. практика закупки племенной птицы у зарубежных фирм способствует быстрому распространению новых штаммов ВИББ на территории России.

Тот факт, что большинство российских изолятов имеют структуру вариабельной области Ур2, идентичную или близкую к таковой высоко вирулентных штаммов, выделенных в конце 80-х годов в Европе, позволяет предположить, что причиной вспышек ИББ в России являются штаммы вируса ИББ, первоначально занесенные в племенные хозяйства с импортированной птицей или яйцом.

í

-г1-

- £

— ( £

1-1-1-1-1-1-1-г-1-1-1-

14 и Ю 8 6 4

Процент нуклеолш; шх различий

I/ЯПОНИЯ СВР-1/ЯПОННЯ 10/ ЯПОНИЯ 11ШУНР-08/96 ВАРИАНТ. К/СШЛ ВАРИАНТ Е/США ВАРИАНТ О^США 1У.Г)22Я/ГОЛЛА11ДПЯ/19К8

оимвоклькт/ФРАПпия/!

\VINTURF1ELD 2512/1996

РПО-98

ИШУКР-01/96

Р2/1995

|ПГ>УИР.|5/95

Си-|/ГШ'МЛШ1>1

ШОУЯР*! 1/95

В иЮОб/ФРАНЦНЯ/1995

0-78/Г0ЛЛАНДИЯ РВ098НЕК0 STC/CШЛ КУЛПОНПЛ

52/70/ ВЕЛИКОБРИТАНИЯ 228Е/ ГОЛЛ.Л1Ь'1 ИЛ/1996 МВ-1Е/ЯПОНИЯ ИЖЕИТ-ИР/США В1тЬШ-2/США

1-65/ИЗРАИЛБ/1995 Ш1ЭУКР-05/94 1ВОУ11Р-01/94

74/89А/ВЕЛПКОБРПТЛНИЯ

ПЮУКР-07/96

1ВОУ11Р-11/96

СХ89/ВЕЛИК0БРИТАШШ

90-И/ЯП011НЯ

НШУКР-09/94

661/В ГШ И КО Б РИТАИ11Я

ШОУКР-14/95

.1У86/П ЕЛ И КО Б РИТАН11Я

тоуцр-оз/94

тПУКР-03/93

11ЮУКР-05/93

11ШУ11Р-01/93

ШОУКР-04/9Э

БГ/РОССИЯ

ШОУКР-07/94

1ППУКР-02/94

849У1)

002/73

Рис. 4. Дендрограмма, отражающая генетические взаимоотношения штаммов' ВИББ, построенная на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей штаммов ВИББ.

Таким образом, проведенный комплекс молекулярно-биологических работ позволил разработать метод индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ и изучить генетические взаимоотношения между изолятамн вируса ИББ, циркулирующими на птицефабриках России, отечественными и зарубежными вакцинными штаммами, что имеет большое значение в условиях сложной эпизоотической ситуации, сложившейся на птицефабриках России в последние годы.

Результаты изучения первичных структур полевых и вакцинных штаммов вируса ИББ свидетельствуют о том, что данное направление исследований представляет определенный интерес для эпизоотологии ИББ и является перспективным для изучения структурно-функциональной организации вируса ИББ.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения, очистки и концентрирования вируса ИББ и дцРНК вируса ИББ из фабрициевых сумок инфицированных птиц, инфицированных культур клеток и куриных эмбрионов.

2. Разработан метод индикации вируса ИББ на основе ПЦР. Показана возможность выявления в течение 4-6 часов фрагментов вирусного генома в различных вируссодержащих образцах: в крови и различных органах инфицированных кур, в инфицированных куриных эмбрионах, культурах клеток, кормовых смесях, контаминированных вирусом, и образцах вакцинных препаратов.

3. На основе прямого секвенирования, амплифицированной кДНК фрагмента гена Ур2 разработан метод идентификации вируса ИББ. Метод позволяет в течение 2-3 дней определить первичную структуру вариабельной области гена Ур2 и путем ее сравнения с

имеющимися в байке данных структурами других штаммов определить штаммовую принадлежность нзолята.

4. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гена Vp2 46 изолятов вируса ИББ, выделенных на территории России в течение 1993-1997 г., и 14 отечественных и зарубежных вакцинных штаммов.

5. Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов ВИББ, позволяющий проводить сравнительный анализ и идентификацию вновь выделенных изолятов. На основании проведенного анализа выявлены генетические группы штаммов ВИББ и показано, что распределение на группы не зависит от места выделения вируса.

6. В результате, сравнительного анализа вариабельной области Vp2 показано, что все исследованные изоляты принадлежат к 2 группам. Первая группа объединяет изоляты, имеющие структуру, идентичную или близкую к таковой высоко вирулентных европейских штаммов (CS89, 74/89А. 661, JY86 и DV86); вторая группа включает изоляты, имеющие высокую степень гомологии с близкородственными вакцинными штаммами PBG98, Си-1, Winterfield 2512, ВНИВИП, UnivaxBD, Gumboral, Bur706 и D78. Кроме того, выявлены два нзолята (1BDVRF-05/94, IBDVRF-08/96), имеющие оригинальную структуру вариабельной области Vp2, отличающиеся от всех изученных ранее штаммов вируса ИББ.

7. Установлено, что по первичной структуре основной антигеннозначнмой области из всех исследованных вакцинных штаммов штамм БГ наиболее близок к большинству отечественных изолятов и отличается от них по 2-3 а.о. Вакцинный штамм 228Е имеет отличия по 7 а.о., а остальные вакцинные штаммы отличаются более чем по 10 а.о.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В процессе выполнения научных исследований разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ следующие методики:

-"Методика выделения и оценки РНК вируса инфекционной бурсальной болезни кур ( ИББ )" - 22.12.94.

-"Методика выявления и дифференциации вируса Гамборо с использованием полнмеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов генов" - 22.12.94.

Кроме того, создан банк данных нуклеотидных' последовательностей вариабельной области гена VP2 отечественных и зарубежных изолятов и вакцинных штаммов вируса ИББ.

Разработанные методы используется для индикации ВИББ в различных вируссодержащих материалах и штаммовон дифференциации вновь выделенных изолятов ВИББ.

Список опубликованных по теме диссертации работ

1. Щербакова Л.О., Фалина Г.М., Борисов A.B., Дрыгин В.В. Выделение, очистка и концентрирование вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) II Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. -Владимир. - 1995. - С. 239.

2. Щербакова Л.О., Колосов С.Н, Щербаков A.B., Борисов A.B.. Дрыгнн В.В., Гусев A.A. Изучение изолятов вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), выделенных на территории России и стран СНГ в течение 1993-1994 г., методом прямого секвснпровання // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. - Владимир, - 1995.-С. 243

3. Щербакова Л.О., Щербаков A.B., Борисов A.B., Дрыгнн В.В. Условия выделения вирусспецифнческой РНК ВИББ для полимеразной цепной реакции II Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. -Владимир. - 1995. - С. 247.

4. Щербакова Л.О., Щербаков A.B., Борисов A.B., Дрыгни В.В. Использование ПЦР при постановке диагноза инфекционной бурсальной болезни птиц // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. - Владимир. - 1995.-С. 248.

5. Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Щербаков A.B., Дрыгнн В.В., Борисов A.B., Гусев A.A. Изучение антигенной вариабельности штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), использующихся в качестве вакцин // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. -Владимир. - 1995. - С. 237.

6. Мудрак Н.С., Оковытая Т.В., Щербакова Л.О., Федосеев К.Ю.. Борисов A.B. Оптимизация условии постановки ИФА для выявления антител к вирусу ИББ // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер, конф. ВНИИЗЖ. - Владимир. - 1995. - С. 245.

7. Щербакова Л.О., Борисов A.B., Дрыгнн В.В., Гусев A.A. Сравнение антигенно-значимой области Vp2 вакцинных штаммов и изолятов вируса ИББ, выделенных на территории России в 1993-1996 г // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии: Тез. док. -Москва. - 1996. - С. 94-95.

8. Щербакова Л. О., Борисов В. В., Дрыгнн В.В., Гусев A.A. Выявление вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) методом ПЦР в кормовых смесях, используемых на птицефабриках Российской Федерации // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии: Тез. док. - Москва. - 1996. - С. 94.

9. Щербакова Л. О., Борисов А. В., Дрыгнн В.В., Гусев A.A. Изучение вариабельности изолятов вируса ИББ, выделенных на

:з

птицефабриках России в 1993-1996 г. // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии: Тез. док.- Москва. -1996.-С. 95.

lO.Scherbakova L.O., Kolosov S.N., Scherbakov A.V.. Borisov A.V.. Drygin V.V., Gusev A.A. Studies on infectious bursal disease (IBD) virus isolates collected in territories of Russia and CIS-countries during 19931994 by direct sequencing // World Vet. Congr.: Abstr. - Yokohama, Japan. - 1995. - P. 263. 11.Scherbakova L.O., Kolosov S.N.. Scherbakov A.V., Drygin V.V.. Borisov A.V., Gusev A.A. Antigenic variability of infectious bursal disease virus (IBDV) strains used as vaccines // World Vet. Congr.: Abstr. - Yokohama, Japan. - 1995. - P. 153. '

Отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и научной информации ВНИИЗЖ Тираж 100 экз.