ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА ОТ ЭНТЕРОВИРУСОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА

Жигалева, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА ОТ ЭНТЕРОВИРУСОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА ОТ ЭНТЕРОВИРУСОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА"

На правах рукописи УДК 619: 616.98:587.835.11:616-076

ЖИГАЛЕВА Ольга Николаевна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА ОТ ЭНТЕРОВИРУСОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03,00,06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 2005

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском НАУЧНО-) [сследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии российской академии сельскохозяйственных наук (гну ВНШ1ВВИМ РОССЕЛЬХОЗакадЕМИII),

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Цыбанов Содком Жамьянович

Балышев Владимир Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Рыбаков Сергей Сергеевич Пономарев Виктор Николаевич

Ведущее учреждение - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической пром ышлекносп I Россельхозакадемни.

Защита диссертации состоится « 23 » июня 2005 г. заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел7 факс: (09243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ,

Автореферат разослан к^.Р.» .... ¿$¿#^...2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук - уковД В.Я.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы.

Болезнь Тешена (энтеровнрусный энцефаломиелит свиней) - это болезнь, поражающая поросят и приносящая значительный ущерб свиноводству. Впервые она была описана в 1929 году в Чехословакии. В 1970 г. инфекция была занесена в СССР [Романенко В, В., 1974].

Эпизоотическая обстановка по болезни Тешена в России осложнилась в середине 90-х годов несмотря на проводимые ветеринарной службой мероприятия, направленные на ликвидацию очагов инфекции. Заболевание было зарегистрировано в Смоленской, Орловской, Воронежской и Брянской областях, а также в Белоруссии, Украине и Молдавии [Бузун А,И. 1998, Коломьшев A.A., 2000].

Возбудитель болезни относится к роду Teschovtrus, семейства Pieornaviridae [Dauber М.,2001].

Сложность борьбы с этой болезнью обусловлена тем, что вирус болезни Тешена (ВБТ) имеет тесное антигенное родство с энтеров и ру сам и свиней и сходные клинические признаки течения болезни, что затрудняет дифференциацию этих возбудителей.

В частности, энцефаломиелиты у свиней, кроме вируса болезни Тешена, вызывают энтеровирусы свиней 8, 9 и 10 серотипов. В то же время ряд штаммов вируса болезни Тешена не вызывают характерных для данной болезни признаков, являясь слабовирулентными [EdingtonN.,1972],

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и их рестрикционный анализ, дополняя серологические методы диагностики ВБТ: внрусовыделение на чувствительной культуре клеток, реакция нейтрализации, иммунофлюоресцентный анализ и ИФА, открывает новые возможности для совершенствования методов идентификации и дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Одним из перспективных

направлений диагностики заболевания является разработка набора препаратов, основанного на использовании ПЦР с последующим рестрикционным анализом и секвеиированием ам пли ко нов,

В связи с вышеизложенным, разработка методов дифференциации вируса болезни Тешена от полевых изолятов энтеровирусов свиней имеет важное эпизоотологнческое и диагностическое значение, а поэтому является актуальной.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы является дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа генома.

В соответствии с поставленной целью необходимо решить следующие задачи;

- подобрать специфичные прайм еры для амплификации различных участков генома энтеровирусов свиней и вируса болезни Тешена, оптимизировать условия проведения ПЦР;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов свиней в пробах органов от инфицированных животных;

• провести тип и рован не штаммов и изолятов методом ПЦР и реакцией нейтрализаци и;

- разработать способ дифференциации различных штаммов и полевых изолятов вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе ПЦР и рестрикционного анализа ПЦР продуктов.

1.3. Научная новизна работы:

- на основе результатов рестрикционного анализа продуктов ПЦР, комплементарных участку гена РНК-полимеразы (ЗБ), разработан метод дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней;

метод ПЦР с применением праймеров, комплементарных гену УР[ позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов

свиней;

при проведении рестрикцио иного анализа продуктов ПЦР вариабельного участка гена \Ф1 выявлены отличия в последов аггел ьн остях нуклеотидов между штаммами «Та1Гап» и «Копга^се», а также «Навля-96» и «Закарпатский» вируса болезни Тешена;

- показана гомология последовательностей нуклеотлдов штамма «Навля-9б» и полевых изолятов ВБТ, выделенных на территории РФ;

- проведена паспортизация штаммов «Молдавский» и «Смоленский» вируса болезни Тешена, которые депонированы в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РОСС ЕЛ ЬХОЗ А К А Д ЕМИ.

1.4. Практическая значимость

«Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов методом ПЦР» и «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР» позволяют обнаруживать РНК этих вирусов в инфицированных культурах клеток, пробах органов зараженных свиней и фекалий. Данный метод может быть включен в схему диагностики болезни,

Рестрикционный анализ ПЦР продукта амплификации консервативного участка гена РНК - полимеразы позволяет проводить дифференциацию вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней.

Рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного вариабельному участку гена \'Р1, позволяет дифференцировать референс-штамм «Та1Гап» вируса болезни Тешена.

Депонированные в коллекции микроорганизмов института штаммы «Молдавский» и «Смоленский» вируса болезни Тешена используют в ГНУ ВНИИВВиМ при проведении НИР и текущих диагностических исследований,

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

- результаты испытания наборов препаратов на основе полимеразиой цепной реакции для выявления РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов

свиней с использованием праПмеров, комплементарных различным областям их геномов;

- специфичность ПЦР при идентификации различных штаммов энтеровирусов свиней и болезни Тешена, выделенных из патологических материалов;

- дифференциация различных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена методами ПЦР и рестрикционного анализа.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2001-2004 гг. в ГНУ ВНИИВВиМ в соответствии с плановыми заданиями НИР Россел ьх озакадем и и (темы: 01.01.02., 01.01.03., 01.02.03.).

1.6. ЛкчныА вклад соискателя Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Раздел «Разработка набора препаратов для идентификации энтеровирусов свиней с помощью ПЦР» был выполнен совместно с к.б.н. Пантюшенко М.С., к.б.н. Балашовой Е.А., к.в.н. Андреевой О.Н,

1.7. Апробация диссертации ■■ публикации

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ, международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2003 г.), международной научно-практической конференции «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 2004 г.).

1.8. Публикации по работе

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в материалах научно-практических конференций: ВНИИВВиМ (Покров, 2003, 2004 г.), ВНИИЗЖ (Владимир, 2004 г.), НИИ ФХМ МЗ РФ (Москва, 2002 г.), ВНИТИБП (Щелково, 2005 г.).

1.9. Объем Ii структура работы Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литералуры, содержащий 139 отечественных и зарубежных источников, приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 12 рисунками.

2, СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы и методы В работе использованы: культуральный вирус болезни Тешена (шт. «Закарпатский», «Навля-96», «Konratice», «Talfan», «T-SO»), энтеровирусы свиней 9-го (шт. «V-13»), 10-го (шт. «А-1») серотипов, гетерогенные вирусы (вирус болезни Ауески шт. «БУК», вирус трансмиссивного гастроэнтерита, шт. «Горский 95», вирус классической чумы свиней шт. «JlK-ВНИИВВиМ»), а также полученные нз лаб. ««Диагностики» пробы органов инфицированных подсвинков и полевые изсшяты, поступившие во ВНИИВВиМ в 1999 - 2003 гг.

Идентификацию вируса болезни Тешена проводили в реакции нейтрализации согласно «Временным методическим указаниям по лабораторной диагностике болезни Тешена». Дифференциацию изолятов ВБТ проводили с использованием сывороток на шт. «Закарпатский» и «Навля», которые получали из коллекции микроорганизмов ВНИИВВиМ.

Ферменты - AMV- и M-MLV обратная транскриптаза, Taq-полимераза фирм «Promega», США; «Fermentas», Литва; рестриктазы «Fermentas», Литва; «Сибэнзим», Россия. Выделение суммарной РНК осуществляли с помощью гу ан ид ин-тио ци аната (Chromczynski et.all), а также с помощью наборов реактивов: фирм «Рибозоль», Россия, «RNA gents Total RNA Isolation System» (Promega, США), « Trizol reagents» (Gibco BRL, США).

Для синтеза кДНК и последующей ПЦР в качестве праймеров

использовали олигонуклеотнды длиной 19-30 нуклеотидов, комплементарные последовательностям различных участков генома вируса болезни Тешена.Внрусную РНК денатурировали нагреванием до 80°С и гибридизовали с 20 рМ каждого праймера, транскрибировали 40 мин при 37° С в 20 мкл, содержащих 10 единиц обратной транскриптазы M-MLV.

Раствор кДНК (5 мкл) а модифицировал и в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 рМ каждого праймера, 2,5 тМ смеси dNTP, Юх буфер (10 тМ Трис HCl pH 8.5, 50 mM KCl, 2,0 -3,0 mM MgCl2 ), 2,5 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в термоциклере «Touch Down» Hybaid-Рестрикционный анализ ПЦР продуктов проводили с использованием различных ферментов рестрикции. Продукты расщепления ДНК разделяли электрофорезом в п ол и а к рилам и дном геле.

Компьютерный анализ и сравнение первичных нуклеотидных последовательностей, расчет ол и го нуклеотидов осуществляли с использованием пакетов прикладных программ «DNASIS». Расчет вероятных схем спаривания праймеров проводили по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с применением соответствующих энергетических правил по программе «OL1GO».

2.2.Результаты собственных исследований 2.2.1. Отработка метода выделения РНК вируса болезни Тешена

Для выделения РНК вируса болезни Тешена из лизата инфицированных клеток, проб фекалий и органных материалов использовали фенольно - детергентный метод, «Trizol reagents», а также денатурируют и й буфер, содержащий 4M гуанидин-тиоционат(ГТЦ).

При сравнительной оценке методов получения суммарной РНК установлено, что оптимальными способами является выделение РНК из монослоя инфицированных клеток и органного материала при помощи «Trizol reagents» и денатурирующего буфера с ГТЦ. Показано существенное преимущество выделения РНК с использованием денатурирующего буфера с

ГТЦ, обеспечивающего больший выход вирусной РНК и отличающегося меньшей трудоемкостью. В дальнейшей работе мы использовали при выделении РНК этот метод.

2.2.2. Разработка «Набора препаратов для нленти фи кацик энтеровирусов свиней с помощью пол и мера зной цепной pea кип и» 2.2.2.1. Оптимизация постановки ПЦР Основными задачами этого этапа исследований являлись подбор специфических праймеров, оптимизация условий постановки ПЦР, оценка специфичности и чувствительности метода.

Для идентификации энтеровирусов свиней использовали 6 пар олигонуклеотидов, комплементарных гену неструктурного белка РНК-полимеразы (3D), ПЦР продукты имели размеры 300, 375, 441, 478, 515, 552 п.о. В результате амплификации кДНК с этими праймерами были получены ПЦР продукты рассчитанных размеров.

В процессе оптимизации условий постановки ПЦР были опробованы различные режимы амплификации, буферные системы, концентрации ионов Mg и dNTP. Оптимальными параметрами амплификации РНК вируса болезни Тешена с различными праймерами являются следующие: концентрация ионов магния в реакционной смеси 3 тМ, рН буферного раствора 8,5, Режимы: 5 циклов (денатурация 95сС-2 мин; отжиг 55°С- 1 мин, синтез при 72°С — 1 мин); следующие 30 циклов (денатурация 95°С — 45 сек, отжиг 50-55°С —40 сек, синтез при 72°С-40 сек); конечный цикл-72°С-5 мин.

В результате проведенных исследований с шестью парами праймеров, были выбраны две - наружная (d8+dl2) и внутренняя (d10+d12), фланкирующие ПЦР-продукты размерами 552 и 375 п.о. Показано, что в отличие от других олигонуклеотидов с этими праймерами получены более четкие ПЦР продукты на матрице РНК энтеровирусов свиней и вируса болезни Тешена при температуре отжига 55°С.

2.2.2.2. Определение специфичности метода ПЦР При проверке специфичности пол и ме раз ной цепной реакции с указанными прайм ерами в качестве матриц были использованы препараты РНК энтеровирусов свиней и ВБТ, а так же различных РНК- и ДНК-содержащих гетерологичных вирусов, выделенных из кул ьту ральн о го вируссодержащего материала (вируса болезни Ауески, шт. «БУК»; классической чумы свиней, шт. «ЛК- ВНИИВВиМ»; трансмиссивного гастроэнтерита, шт. «Горский- 95»), табл.1.

Таблица 1

Результаты определения специфичности ПЦР с праймерами, комплементарными гену 30

п=6

Образцы вирусного материала Прайм еры а8 + <112 Прайм еры <!10+<П2 Выделение вируса в культуре клеток

Культуральный материал

ВБТ (шт. «ТаКал») + + +

ВБТ )шт. «Копга(1се») + + +

ВБТ (шт.«Навля-96»> + + +

ВБТ {шт. «Закарпатский») + + +

ВБТ(шт«Т-80») + + +

Энтеровирус свиней (шт. «А-1») + + +

Энтеровирус свиней (шт. «У-13») + + +

Органный материал

Поджелудочная железа ( шт. «Навля-96») - + +

Головной мозг ( шт. «Навля-96») - + -

Тостый отд. кишечника ( шт. «Навля-96») - + +

Фекалии ( шт. «Навля-96») - + -

Контрольные образцы

Головной мозг здорового подсвинка - - -

Поджелудочная железа здор. подсвинка - - -

Тостый отдел кишеч. здор. подсвинка - - -

Вирус КЧС - - -

Вирус ТГС - - -

Вирус болезни Ауески - - -

Клеточная культура ПТП - - -

Примечание: «+» -результат положительный, «-» - результат отрицательный

Результаты исследований показали, что использование наружных (с!8+с112) и внутренних (с!10+(!12) праймеров позволяет специфически обнаруживать РНК энтеровирусов свиней и ВБТ в пробах культурального материала

После определения специфичности метода полимеразной цепной реакции в пробах культурального вируссодержащего материала были проведены исследования по выявлению РНК энтеровирусов свиней и ВБТ в пробах патологического материала. Показано, что продукты амплификации при использовании в качестве матриц препаратов РНК и ДНК других вирусов свиней (КЧС, ТГС, Ауески) не выявлены. Также не обнаружены продукты ПЦР при использовании РНК, экстрагированной как из проб органов здоровых подсвинков, так и из неинфнцированных клеток ПТП.

По результатам выделения вируса от экспериментально зараженных подсвинков, было установлено, что метод выделения вируса болезни Тешена из проб органного материала в культуре клеток был менее чувствительным (3 последовательных пассажа) по сравнению с ПЦР. Из представленных в табл.1 результатов видно, что в культуре клеток энтеровирус обнаруживали только в пробах поджелудочной железы и толстом отделе кишечника.

Таким образом, рассчитанные нами праймеры, комплементарные гену неструктурного белка ЗР, позволяют идентифицировать энтеровирусы свиней и ВБТ. В результате проведенных исследований по отработке режимов и условий проведения ПЦР нами разработан «Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР». Специфичность набора подтверждена межлабораторными комиссионными испытаниями (Акт от 10 июля 2003 г.). «Методические указания по выявлению РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР» утверждены директором института.

2.23. Изучение культуральных свойств полевых изолятов вируса болезни Тешена

С 1999 г. по 2003 г. в ГНУ ВНИИВВиМ из хозяйств Смоленской,

Орловской, Тульской областей и Республики Молдова поступил патматериал

- пробы головного мозга, из которых в перевиваемой культуре клеток тести кул поросенка (ПТП) на уровне 3-го пассажа был выделен

и идентифицирован возбудитель болезни Тешена. ЦПД проявлялось через 96

— 120 часов после инфицирования, накопление вируса составляло 3,0 - 3,75 ]g ТЦЦ 5о,см3. Идентификацию возбудителя проводили в реакции нейтрализации. Выделенные нзоляты получили условное обозначение «Смоленский», «Орловский», «Тульский» и «Молдавский». Были проведены исследования по адаптации этих изолятов и к другим перевиваемым культурам клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК), почки поросенка (ППК) для получения культу рал ьного вируса с высокой активностью.

Указанные полевые нзоляты культивировали в течение 6-ти последовательных пассажей в культурах клеток ПСГК, ППК, ПТП, выращенных на чашках Карреля и клинских матрасах. Результаты этих опытов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Накопление вируса БТ при пассажах в культурах клеток.

п=4

№ Изоляты, штаммы ВБТ Титр вируса <1е ТЦД {о,™)

ПСГК ПТП ППК

3 пас. 4 пас. 6 пас. 3 пас. 4 пас. 6 пас. 3 пас. 4 пас. 6 пас.

1 «Молдавский» 3,25 5,0 6,5 3,0 6,0 6,0 3,0 6,0 6,0

2 «Смоленский» 4,0 6,5 8,5 3,5 6,25 8,0 3,5 6,0 7,0

3 «Орловский» 4,0 6,0 9,0 3,5 6,25 8,75 3,5 6,5 7,0

4 «Тульский» 3,5 6,5 7,5 3,75 6,25 8,0 3,25 5,5 6,75

5 «Закар патски й » 8,75 9,0 9,25 8,0 8,25 8,5 6,0 5,5 7,5

6 «Навля-96» 8,0 8,0 8,75 8,25 8,5 8,5 7,0 7,0 7,5

Примечание: в качестве исходных в опытах использовали штаммы «Закарпатский» и «Навля-96» 28-го и 10-го пассажей в культуре клеток ПСГК, соответственно.

Было показано, что в наиболее высоких титрах изученные изоляты размножались в культурах клеток ПСГК и ПТП. Изоляты «Смоленский» и (Юрловский» обладали инфекционной активностью сопоставимой с накоплением в этих культурах штаммов «Закарпатский» и «Навля». Накопление вируса у изолятов «Молдавский» и «Тульский» в исследуемых культурах клеток составляло 6,0 — 7,5 |£ТЦЦ ^см1 При этом в культурах клеток, зараженных изолятом «Молдавский», ЦПД проявлялось на 24 — 36 часов позднее.

Необходимо заметить, что в культуре клеток ППК изоляты, как и штаммы «Закарпатский» и «Навля-96» накапливались в более низких титрах - до 6,0 - 7,5 ^ТЦД 5п,-см5

2.2.5. Типизация изолятов ВБТ в реакции нейтрализации Учитывая имеющиеся сведения об антигенных различиях штаммов «Закарпатский» и «Навля-96» в реакции нейтрализации (РН) [Середа А.Д. с соавт., 2000 г.], были проведены аналогичные исследования с изолятами «Молдавский», «Тульский», «Смоленский», «Орловский»,

Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (1000 ТЦД $0/см3) и разведениями референс -сывороток. Специфические в и рус нейтрализующие референс - сыворотки, на штаммы «Закарпатский» и «Навля-96», получали из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, Результаты опытов суммированы в табл. 3,

Данные, представленные в табл.3, показывают, что специфическая сыворотка, полученная на штамм «Навля-96», нейтрализовала все изоляты вируса, а так же референс - штаммы в разведении 1: 128. В то же время, специфическая сыворотка, полученная на штамм «Закарпатский», нейтрализовала гетерогеный вирус и изоляты «Смоленский», «Орловский», «Тульский», «Молдавский» в разведении 1 : 128, а гомологичный штамм «Закарпатский» в разведении 1 : 512, Полученные данные свидетельствуют о

серологическом соответствии изучаемых изолятов со штаммом «Навля-96» и их отличии от штамма «Закарпатский».

Таблица 3

Результат постановки РН с изучаемыми изолятами

п=5

№ Изоляты и шггаммы ВБТ Разведения референс сывороток к ВБТ

на шт. «Закарпатский» на шт. «Навля-96»

1/ 64 1/ 128 1/ 256 1/ 512 1/ 1024 ]/ 2048 1/ 32 1/ 64 ]/ 128 1/ 256 ]/ 512 1/ 1024

1 «Смоленский» - - + + + + + + + + + + + + + + + + :: :: + + + + + + + + + -+■ + +

2 «Орловский» "" "" + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +-+ + + + + +

3 «Тульский» + + + +■ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

4 «Молдавский» - - + + + + + + + + + + + + +- +■ + + * ~ - + + + + + + + + + + + +

5 «11авля-9б» + + + + + + + + + +■ + + + + + + + + + + + + + + + + + +

6 «Закарпатский» + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: {- -) - ЦПД отсутствовало; (+ +) - наличие 1ДПД

С учетом полученных результатов были паспортизированы и заложены в музей микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы «Молдавский» и «Смоленский». В последующем эти и другие штаммы и изоляты были использованы при проведении дальнейшей работы по идентификации их методом ПЦР,

2.2.6. Разработка «Набора препаратов для выявления РНК вируса

болезни Тешена методом полнмеразной цепной реакции» На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома семейства Р|сотау|Г1(1ае в качестве мишени был выбран ген структурного белка V?!, который отвечает за синтез вируснейтрализующих антител и содержит как вариабельные, так и консервативные участки.

Были подобраны две пары праймеров (наружные- Е49+Е52 и внутренние- Е50+Е51), фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о., комплементарные нуклеотидным последовательностям штамма «Копга!юе»,

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальная концентрация ионов магния в реакционной среде составила 2,5 тМ, значение рН буферного раствора 8,5, а температура отжига обоих праймеров, специфичных для вируса болезни Тешена, составила 50°С.

Проверка специфичности метода ПЦР показала, что использованные в работе п рай меры, комплементарные вариабельным областям гена V?! вируса болезни Тешена, гибридизпровались с РНК всех исследованных штаммов и полевых изолятов вируса БТ, выделенной из культурального и органного материалов (табл.4).

Таблица 4

Результаты определения специфичности ПЦР с праймерами, комплементарными гену \Ф1

п=6

№ Образцы Наружные праймеры Внутренние праймеры Титр вируса ТЦЕЦо/См'

1 ВБТ шт. «Навля-96» + + 7,5

2 ВБТ шт. «Закарпатский» + + 8,5

3 ВБТ шт. «КопгаНсе» + + 8,0

4 ВБТ шт. «Та1 Гап» + + 6,25

5 Изолят «Смоленский» + + 7,75

6 Изолят «Орловский» + + 6,5

7 Изолят «Тульский» + + 7,25

8 Изолят «Молдавский» + + 6,0

9 Подж. железа (шт. «Навля-96») + + 4,5

10 Головной мозг(шт. «Навля-96») - + 2,0

11 Толст.отд. кишечника(шт. «Навля-96>: + + 3,75

12 Фекалии - + 3,5

13 Энтеровирус свиней шт,«А-1» - - 7,25

14 Энтеровирус свиней шт, «\МЗ» - - 8,0

Примечание:«+»-РНК обнаружена,«-»- РНК не обнаружена.

Полученные ПЦР продукты имели размеры 560 и 260 п.о. н соответствовали рассчитанным значениям. При этом различий в молекулярной массе ам пли ко нов, полученных на матрицах разных препаратов вируса болезни Тешена, не выявлено. Отмечено, что данные праймеры не гибридизировались с РНК близкородственных энтеровирусов свиней.

Для определения порога чувствительности метода готовили 10-кратные разведения вируса БТ (штамм «Закарпатский»), полученного в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка, с исходным титром 8,5 Ig TLUWcm3, и анализировали в ПЦР с наружными и внутренними прайме рам и. Разработанная нами методика позволила стабильно обнаруживать в пробах вируссодержащего материала РНК вируса БТ (штамм «Закарпатский») при концентрации возбудителя 10 ТЦД Vcm3,

Разработанный набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена использовали для изучения персистенцин вируса в органах и тканях экспериментально инфицированных крыс. С этой целью крыс заражали перорально, путём скармливания кусочков ободочной кишки от подсвинка, павшего с клиническими признаками болезни Тешена. Для инфицирования крыс использовали 2 грамма материала с активностью 5,75 lg ТЦД ях/СМ*. На протяжении всего срока наблюдения (60 суток) каких- либо отклонений от нормального клинического состояния у крыс не наблюдали. Через определенные интервалы времени крыс убивали, отбирали пробы различных органов и выявляли наличие вируса болезни Тешена в культуре клеток ПТП и методом ПЦР.

Результаты выделения вируса из проб внутренних органов крыс, заражённых вирусом БТ, а так же средние значения титров выделенного вируса представлены в табл. 5, Полученные данные свидетельствуют, что по данным ви русо выделения вирус БТ присутствует в организме экспериментально заражённых крыс на 2-е сутки после заражения в лёгких,

почках, тонком и толстом отделах кишечника, что также подтверждается и методом ПЦР.

Таблица 5

Результаты в и русо выделения из проб органов крыс, заражённых перорально вирусом болезни Тешена, в культуре клеток и ПЦР

п=4

Испытуемый материал Результаты вирусов ыделення на культуре клеток ПТП ТЦД5Шсм'> и методом ПЦР

2-е сутки после заражения 14-е сутки после заражения 60-е сутки после заражения

В культуре клеток ПЦР В культуре клеток ПЦР В культуре клеток ПЦР

Лёгкие + (1,8±0,5) + - + - -

Почки + (2,7±0,1) + + (1,3±0,01) + - +

Селезёнка - - - - - -

Печень - - - - - -

Головной мозг - - - - - -

Тонкий отд. кишечника + (3,6±0,2) + + - -

Толстый отд. кишечника + (4,2±0,1) + + (2,2±0,1) + - +

Примечание; «- »- отрицательный результат ; «+» - положительный результат.

На 14-е сутки после заражения крыс ВБТ обнаруживали в культурах

клеток лишь в пробах почек и толстого отдела кишечника, а при помощи ПЦР вирусную РНК продолжали выявлять в лёгких и тонком отделе кишечника. На 60-е сутки после заражения вирус БТ в культуре клеток не обнаруживали ни в одном из исследованных органов, в то время как с помощью ПЦР вирусную РНК обнаруживали в почках и толстом отделе кишечника. В селезёнке, печени, головном мозге инфицированных крыс, а также в пробах органов интактных крыс ВБТ вирус болезни Тешена не обнаруживали методом ПЦР в культуре клеток.

Таким образом, в результате подбора режима и условий проведения ПЦР нами разработан «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни

Тешена методом ПЦР». Чувствительность и специфичность набора подтверждена межлабораторными комиссионными испытаниями (акт от 21 марта 2005 г.). Составлены методические указания по выявлению РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР, которые утверждены директором института.

2.2.7. Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровнрусов свиней методом реетрикциоиного анализа

Целью данного этапа работы явилась дифференциация ВБТ от энтеровнрусов свиней посредством проведения рестрикшюнного анализа ПЦР продуктов (праймеры dlO+d 12, размер 375 п.о.), комплементарных гену РНК - полимеразы вируса БТ. Отбор ферментов рестрикции проводили на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена РНК- полимеразы вируса БТ, выполненного при помощи пакета программ DNASIS, Было использовано несколько эндонуклеаз, имеющих сайты рестрикции в этом гене: Drall, Dral, EcoRV, EcoRJI, Aval, Mspl, Seal, BamHI, Hindlll, Sail, Pstl

В результате проведенных исследований нами были отобраны несколько рестриктаз, пригодных для дифференциации ВБТ от энтеровнрусов свиней. При расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о. эндонуклеазой Pstl было обнаружено, что фрагменты генома вируса БТ разделялись на два фрагмента размерами 75 и 300 п.о, в то время как у штаммов энтеровнрусов свиней эти два фрагмента имели другие размеры - J 75 и 200 п.о.

Таким образом, эндонуклеаза Pstl при расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о., комплементарных гену РНК-поли мер азы, полученных на матрице культу рал ьных и органных материалов, позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровнрусов свиней.

2.2.8. Дифференциация штаммов и полевых пзолятов вируса болезни

Тешена

Для дифференциации различных штаммов вируса БТ нами использовано

два подхода: применение штаммоспецифической ПЦР, на основе праймеров, комплементарных вариабельному участку вируса БТ, и рестрикционный анализ ПЦР продуктов.

Для проведения штаммоспецифической ПЦР нами были взяты ранее рассчитанные прайм еры (Е49-Е52), комплементарные нуклеотидным последовательностям гена VPI штаммов «Kon rat ¡ce», а также вновь рассчитанные две пары праймеров, комплементарные нуклеотидным последовательностям гена VPI штамма «Talfan», фланкирующие ПЦР продукты размером 796 и 327 п.о.

В результате электрофоретического анализа было установлено, что с помощью праймеров (Е49-Е52), фланкирующих ПЦР продукты размером 560 п.о., при температуре отжига 55°С, можно дифференцировать штаммы вируса болезни Тешена (табл. 6).

Таблица 6

Результаты дифференциации штаммов и полевых изолятов ВБТ при

различных температурах отжига праймеров (Е49-Е52)

п=5

№ Название штаммов и изолятов Результаты ПЦР

50° С 55° С

1 ВБТ шт. «Закарпатский» + -

2 ВБТ шт. «Talfan» + -

3 ВБТ шт. «Навля-96» + +

4 ВБТ шт. «Konratice» + +

5 Полевой изолят «Смоленский» + +

6 Полевой изолят «Тульский» + +

7 Полевой изолят «Орловский» +■ +

8 Полевой изолят «Молдавский» + +

Примечание: «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат.

Эти праймеры гибрид изо вались с РНК штаммов «Навля-96», «Konratice», а также с РНК полевых изолятов вируса болезни Тешена, но не в заи м оде й сто вал и с РНК штаммов «Закарпатский и «Talfan», что свидетельствует о различии нуклеотидных последовательностей у данных штаммов.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что полевые изоляты, циркулирующие в нашей стране в последние годы, имеют родство со штаммами «Навля-96» и «Konratice».

При использовании праймеров (Е49-Е50), комплементарных последовательностям гена VPI (шт. «Konratice») при температуре отжига 50ПС на матрице некоторых образцов получали ПЦР продукты разного размера, которые приведены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты дифференциации штаммов с праймерами, комплементарными гену VP1 шт. «Konratice» ___п=3

№ Штаммы и изоляты ВБ Размеры ПЦР продуктов

1 Штамм «Закарпатский» 600 п.о.

2 Штамм «КопгаНсе» 804 п.о.

3 Полевой изолят «Смоленский» 700 п.о.

4 Полевой изолят «Тульский» 870 п.о.

5 Штамм «Навля-96» -

6 Штамм «Та1£ап» -

7 Изолят «Орловский» -

8 Изолят «Молдавский» -

Примечание: «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат.

Из данных, представленных в табл.7, видно, что при данной температуре отжига с использованием этих праймеров ПЦР продукты не

были получены при амплификации штаммов «Навля-96», «Та1Гап» и полевых изолятов «Орловский», «Молдавский». Данные праймеры позволяют проводить дифференциацию штаммов по размеру их ПЦР продуктов.

При амплификации фрагментов генома разных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена с п рай мера ми (Е25-Е26 и Е27-Е28), комплементарных последовательностям гена УР1 (штамма «Та1Гап») при температуре отжига 50°С были выявлены только два штамма «Та1Гап» и «Закарпатский», (табл. 8).

Таблица 8

Результаты выявления РНК штаммов вируса болезни Тешена методом

ПЦР с праймерами, рассчитанными по шт. «Та I fan»

п=5

Кг Штаммы и изоляты ВБТ Праймеры (Е25+Е26) (796 п.о.) Праймеры (Е27+Е28) (327 п.о.)

1 Шт. «Навля-96» - -

2 Шт. «Закарпатский» + +

3 Шт. «Коп rati се» - -

4 Шт. «Talfan» + +

5 Изолят «Смоленский» - -

6 И золят «Орловский» - -

7 Изолят «Тульский» - -

8 Изолят «Молдавский» - -

Примечание: «+» -РНК определена, «-» - РНК не определена.

Таким образом, в процессе работы было показано, что праймеры, комплементарные вариабельным областям гена структурного белка \Ф1, при амплификации с температурой отжига праймеров 50° - 55° С позволяют

проводить дифференциацию штаммов «Навля-96» и «Закарпатский», а также штаммов «Konratice» «Talfan».

2.2.9. Рестри кино иным анализ продуктов ПЦР вируса БТ

Целью данного этапа работы было проведение рестрикционного анализа ПЦР продуктов размером 560 п.о. (праймеры Е49+Е52) для дифференциации штаммов ВБТ.

В результате проведенных исследований было установлено, что из использованных нами ферментов Apyl, BamHI, Mval, BstI, Eco47III, Ddel, Hael эндонуклеаза BamHI расшепляла ПЦР продукты штаммов «Навля-96», «Закарпатский», «Konratice» и полевых изолятов на два фрагмента размерами 300 и 200 п.о., а участок гена VPI шт. «Talfan» на три фрагмента размерами 200, 190, ПОп.о.

При расщеплении ПЦР продуктов вышеуказанных штаммов рестриктазой Mval были выявлены по два фрагмента у тех же образцов, что и при работе с эндонуклеазой BamHI, но других размеров: 400 и 100 п.о. ПЦР продукт штамма «Talfan» расщеплялся на три фрагмента размерами 300, 160, 100 п.о. Установлено, что наиболее подходящими ферментами рестрикции, позволяющими дифференцировать штамм «Talfan» от других штаммов ВБТ являются рестриктазы BamHI, Mval, Другие рестриктазы не имеют сайтов рестрикции у этих штаммов в данном участке гена VPI. Полученные данные свидетельствует о том, что рестрикционный анализ продуктов амплификации возбудителя болезни Тешена с помощью подобранных рестриктаз позволяет дифференцировать штамм «Talfan» от других штаммов вируса болезни Тешена,

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработаны наборы препаратов на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов свиней с использованием праймеров, комплементарных различным областям их геномов. Проведена оценка чувствительности и специфичности ПЦР при

идентификации различных штаммов энтеровирусов свиней и болезни Тешена, выделенных из проб органов инфицированных животных. Показана возможность дифференциации различных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена методами ПЦР и рестрикционного анализа.

3. ВЫВОДЫ

1. На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома вируса семейства Picomoaviridae в качестве мишени для ПЦР выбран участок гена неструктурного белка РНК-полимеразы (3D). Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием наружных (d8-dl2) и внутренних праймеров (dlO-dl2), позволяющие при температуре отжига 55"С выявлять РНК энтеровирусов свиней 9-го, 10-го серотипов и вируса болезни Тешена.

2. По результатам рестрикционнго анализа, эндонуклеазой рестрикции PstI ПЦР продукта размером 375 п.о. участка гена РНК- пол и меразы, можно дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов свиней 9-го и 10-го серотипов.

3. Подобраны праймеры, комплементарные вариабельному участку гена VPI, фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о., которые позволяют проводить идентификацию возбудителя болезни Тешена,

4. Праймеры, комплементарные вариабельному участку гена VPI вируса болезни Тешена, при температуре отжига 55° С взаимодействуют с нуклеотидными последовательностями штаммов «Konratice», «Навля-96» и полевых изолятов вируса болезни Тешена, выделенных на территории Тульской, Смоленской и др. областях и не взаимодействуют со штаммами «Talfan» и «Закарпатский».

5. Рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного вариабельному участку гена VР 1,эндону кл еазам и рестрикции BamHI и Mval позволяет проводить дифференциацию штамма «Talfan» от других штаммов вируса болезни Тешена.

б. Проведенная типизация полевых изолятов - «Смоленский», «Орловский», Тульский», «Молдавский», выделенных в 1999-2003 гг. на территории России и Республики Молдова, методом ПЦР и в реакции нейтрализации свидетельствует об их серологическом соответствии штамму «Навля-96», относящемуся к 1 -му подтипу вируса болезни Тешена.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1, «Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР», «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР» могут быть включены в схему лабораторных исследований при диагностике энтеровирусных инфекций свиней.

2. Метод рестрикционного анализа ПЦР продуктов, комплементарных участку гена РНК — полимеразы, с использованием эндонуклеазы Pstl, позволяет проводить дифференциацию вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Данный метод может быть включен в схему лабораторных исследований при диагностике вируса болезни Тешена.

3, ПЦР при повышенной температуре отжига праймеров, а также рестрикционного анализа ПЦР продуктов участка гена VP1 вируса болезни Тешена могут быть использованы для дифференциации штаммов «Навля», «Закарпатский», «Konratice» и «Talfan»,

4. Паспортизированные штаммы «Молдавский» (ннв.№ 2454) и «Смоленский» (инв.№ 2524) 1-го подтипа ВБТ, депонированы в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и могут быть использованы при проведении НИР и диагностических исследований.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Андреева О,Н., Кадетов., Жигалева О.Н, Контроль полноты инактивации вируса при изготовлении инактивированной культуральной эмульгированной вакцины против болезни Тешена И Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Между нар. Науч.- практ.

конф., посвящ, 45 — летию интитута, 24 — 26 сентября 2003 г. — Покров, 2003. — 4.2. - С. 503-505.

2. Выявление РНК вируса болезни Тешена с помощью ПЦР / Пантюшенко М.С., Жигалева О.Н., Андреева О.Н., Цыбанова В.А., Стрижаков A.A., Копытов В.О, // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 45 — летию интитута, 24 - 26 сентября 2003 г. - Покров, 2003. - 4.2. - С. 454 - 457.

3. Вирусные болезни диких диких кабанов / Жигалева О.Н. // Болезни диких животных: Труды Междунар. науч.- практ. конф., 28 — 30 сентября 2004, — Покров, 2004. - С. 239 - 243.

4. Выявление и штаммовая дифференциация вируса болезни Тешена методом ПЦР / Жигалева О.Н., Андреева О.Н., Балашова Е.А. // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Материалы Междунар, науч.- практ. конф. Молодых ученых, 24 — 26 марта

2004. - Владимир, 2004. - С. ПО- 113.

5. Сравнительная оценка методов обнаружения вируса болезни Тешена в пробах патологического материала / Андреева О.Н., Пантюшенко М.С., Жигалева О.Н., Стрижаков A.A., Цыбанова Л.Я. // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Тез. Докл. 4-й Всерос. Науч. - практ. конф., 22 -24 октября 2002 г. - М., - С. 316-318.

6. Дифференциация штаммов вируса болезни Тешена методом ПЦР. Жигалева О.Н., Балашова Е. А. , Цыбанов С.Ж., Балышев В.МУ/ «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», поев, 35- летню института, 26-27 мая 2005 г. - Щелково,

2005.- С. 216-219.

UJcà \С.А ■

/ V ,

. , (о - teu . />i-ûuù

РС? 5 !/-v - & у -, Л» ' -

/4¿? i--" о: - '

" .*•' ' ' ' ^ /• .'./Y- и/Г

■ ->. ■ ■ .-.v.- /

'О'* ^

! • I, к. ' \ -

... / .. - ' - ■ ' '

¿- • . , « ,>/■■ ■ ■ ■ ■, / /; ' ' '" • . У" '