Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома

Голицына, Людмила Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. М.П. ЧУМАКОВА

На правах рукописи

ГОЛИЦЫНА Людмила Николаевна

ОБНАРУЖЕНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ

ЭНТЕРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА 5'-НТР ГЕНОМА

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук

Новикова Надежда Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Мошков Андрей Евгеньевич; кандидат биологических наук Еремеева Татьяна Петровна

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский

институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Минздрава России

Защита состоится: « АО » . ЫЛОкА 2003 г. в ¿0 час. на заседании диссертационного совета Д 001.026.01. при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782 Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Автореферат разослан:« /Л ¡мал 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.А. Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека (сем. Ргсогпаут-dae, род ЕМептгш), характеризуются иммунологическим и генетическим многообразием. Подавляющее большинство энтеровирусов человека являются патогенными, вызывая заболевания, полиморфные по клиническим проявлениям (полиомиелит, нейропатии, серозный менингит, миокардиты, гастроэнтерит, респираторные заболевания, конъюнктивиты и т.д.) и различные по тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения, некоторые из них имеют тенденцию к эпидемическому распространению. Установлена этиологическая связь энтеровирусной инфекции с патологией матери, плода и ребенка [Ворошилова М.К., 1979, Златковская Н.М., 1976, Лозовская Л.С., 1994, Львов Д.К., 1997].

Значимость энтеровирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления, а при расшифровке случаев групповой заболеваемости - и типирования возбудителя. Множество иммунологических типов энтеровирусов, различная чувствительных клеточных культур к отдельным представителям рода предопределяют длительность и трудоемкость традиционных методов выявления энтеровирусов и делают актуальной разработку новых подходов к решению проблемы обнаружения и дифференциации энтеровирусов. Прогресс молекулярной биологии и открытие принципов полиме-разной цепной реакции (ПЦР) дали возможность разработки альтернативных экспрессных, высокочувствительных и специфичных методов обнаружения энтеровирусов в клиническом материале и объектах внешней среды, что расширяет методическую базу эпидемиологического надзора за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов и вирусов полиомиелита.

Цель исследования: Разработать комплексный метод выявления и дифференциации РНК энтеровирусов и охарактеризовать особенности циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода на современном этапе.

Задачи исследования:

1. С использованием компьютерных программ провести сравнительный анализ известных нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека.

2. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК энтерови-русов в различных биологических субстратах.

3. Провести разработку метода ПДРФ-дифференциации 5'-НТР генома энтеровирусов человека.

4. С использованием типовых штаммов энтеровирусов человека и РНК энтеровирусов, выделенных от больных, охарактеризовать ББСР-типы 5'-НТР генома. Оценить возможность применения ЗБСР-типирования кДНК генома энтеровирусов в эпидемиологической практике.

5. Определить частоту обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейроинфекциями, охарактеризовать гетерогенность энтеровирусов, циркулировавших в Н. Новгороде в 1999-2002 гг.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработаны оригинальные методические подходы для выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, основанные на анализе одного и того же участка 5'-нетранслируемого региона генома (5'-НТР генома):

- впервые подобрана серия олигонуклеотидных праймеров, позволяющая проводить выявление РНК энтеровирусов человека методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы по 5'-НТР генома.

- впервые подобран и применен на практике оригинальный набор ре-стриктаз для анализа методом полиморфизма длины рестриктных фрагментов (ПДРФ) 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы II с целью идентификации генетических маркеров полиовирусов вакцинного происхождения. Новизна предложенного способа выявления и дифференциации энтеровирусов подтверждена патентом на изобретение №2189396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000.

- впервые в России дана характеристика БВСР-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека. Показаны многообразие ЗБСР-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека и возможность использования в качестве эпидемиологического маркера.

- впервые комплексное исследование 5'-НТР генома энтеровирусов было применено при расшифровке групповых заболеваний. Установлена роль энтеровирусов в возникновении 3-х групповых заболеваний ОКИ.

Предложенный комплекс методов обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека (ПЦР, ПЦР-ПДРФ и ПЦР-ЗБСР) был применен

в совместной работе с вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области при обследовании больных с подозрением на энте-ровирусную инфекцию и анализе проб сточных вод с очистных сооружений Нижегородской области. Полученные результаты использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.

Внедрение результатов исследования в практику

Методические рекомендации № 2001/121 «ПЦР-ПДРФ выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека». Утверждены МЗ РФ 31.05.2001 г.

Методические рекомендации «Энтеровирусные инфекции. Этиоло-к гия, клиника, диагностика и профилактика». Утверждены Департамен-

том здравоохранения Нижегородской области в 2000 г.

Основные положения, выносимые на защиту

* 1. Комплекс оптимизированных приемов, включающий бесфеноль-

ную экстракцию РНК из разнообразного вируссодержащего материала, детекцию РНК методом ОТ-ПЦР с помощью сконструированных прай-меров, комплементарных консервативным участкам 5'-НТР генома, обеспечивает надежное выявление энтеровирусов человека в пробах от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектах внешней среды с одновременным типированием на две 5'-НТР гено-группы.

2. Профиль ПДРФ и ББСР-тип 5'-НТР генома энтеровирусов являются штаммовыми признаками и могут быть использованы в качестве эпидемиологических маркеров.

3. Территория Нижнего Новгорода в 1999-2002 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции и разнообразием генетических вариантов нейротропных энтеровирусов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций (аналитика, диагностика, техника, экономика)», проходившем в рамках Национальных дней Рос-сии-99 (Москва, 12-14 октября 1999 г.).

Материалы диссертации обсуждались на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной МЗ РФ и проблемных научно-практических семинарах института.

I i i

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Ни- 1

жегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика ,

И.Н. Блохиной 25 февраля 2003 г. '

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 262 литературных источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной МЗ РФ в качестве фрагмента договора № 737/096/015 «Совершенствование средств и методов эпидемиологического надзора за актуальными вирусными инфекциями (полиомиелит, энтеро- ротавирусные заболевания и вирусные гепатиты)» отраслевой научно-исследовательской программы МЗ РФ № 737 «Снижение инфекционной заболеваемости в условиях социально-экономического неблагополучия».

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использованы образцы фекалий, носоглоточных смывов, спинномозговой жидкости (СМЖ), сыворотки крови, собранные от 280 пациентов с подозрением на энтеровирусную нейроинфекцию, госпитализированных в инфекционные стационары Н.Новгорода, и 74 пробы сточных вод с очистных сооружений Н.Новгорода и Нижегородской области и концентрированных с использованием водопроницаемых пакетов с адсорбентом согласно рекомендаций [Иванова O.E., 2000 г.]. Материал от больных и пробы сточных вод поступали в вирусологическую лабораторию ЦГСЭН в Нижегородской области в 1999-2002 гг. и исследовались в рамках договора о творческом сотрудничестве.

Исследованы материалы от 22 больных и 21 контактного лица, собранных при расшифровке групповых заболеваний ОКИ.

Также в работе использовали 42 типовых штамма неполиомиелит-ных энтеровирусов (Коксаки А 7, 9, 13, 18; Коксаки В 1-6; ECHO 1-9, 11-20, 24-33, энтеровирусы 68-71); шт. SA 11 ротавируса обезьян, шт.

HAS 15 вируса гепатита А; вакцинные штаммы полиовирусов Sabin 1-3 были предоставлены вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области.

Анализ нуклеотидных последовательностей геномных РНК вирусов, собранных в базах данных DDBJ/EMBL/GenBank, подбор и оценку праймеров для специфичной детекции РНК энтеровирусов, составление рестриктных карт проводили с использованием программ "Primer-Master 1,0" (Япония), "Clustal X" ,"OHgo 4,0", "MicroGeni" (США).

Выделение РНК энтеровирусов из биопроб осуществляли по способу [Мейхи, 1988] в собственной модификации или с использованием фенол - хлороформенной депротеинизации [Маниатис Т., 1984].

Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью ревертазы M-MLV фирмы "Promega" (США) в течение 30 мин при 42°С. Полиме-разную цепную реакцию проводили в смеси, содержащей, 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.8), 50mM КС1, 1,5 мМ MgCl2, 1,0 % Triton Х-100, по 0,2 мМ каждого из дНТФ, 1 е.а./мкл Tag-полимеразы, по 0,1 мкМ прямого и обратного олигонуклеотидного праймера в режиме (94°С 30 с; 60°С 30 с; 72°С 30 с) х 35 для 1 раунда ПЦР и (94°С 30 с; 65°С 30 с; 72°С 30 с) х 25 для 2 раунда ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в фирме «Литех», Москва.

Рестрикцию кДНК эндонуклеазами Ava I, Ava II, Alu I, Bam HI, Cla I, Nco I, Pvu II, Sma I («Promega», США) проводили в объеме 20 мкл согласно инструкции по применению. Продукты ПЦР и рестрикции анализировали методом электрофореза в 1,5-2,0 % агарозном геле.

Постановку SSCP осуществляли в ПААГ согласно рекомендациям [Heneine W., 1995; Palacio А. 1999] в системе буферных растворов Лэммли [LaemmliU., 1970].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

> 1. Унификация метода ОТ-ПЦР для выявления и дифферен-

циации энтеровирусов человека.

К началу наших исследований было известно, что самой высококонсервативной областью генома энтеровирусов является 5'-НТР, кроме того, в результате филогенетического анализа этой области генома эн-теровирусы человека были разделены на 2 геногруппы [раЫ1ипс1, 1995; Нуур1а, 1997; Роугу, 1994]. В тоже время, не было предложено варианта постановки ОТ-ПЦР, позволяющего дифференцировать энтеровирусы

на две геногруппы. В связи с этим на первом этапе работы были подобраны олигонуклеотидные праймеры, с помощью которых можно проводить специфичную ОТ-ПЦР для детекции РНК всех энтеровирусов человека, и праймеры, позволяющие определять принадлежность энтеровирусов к той или иной геногруппе. Такая дифференциация может быть полезным инструментом для ориентации в многообразии типов энтеровирусов и являться первым шагом в генотипировании вирусных изоля-тов. С использованием программы С1иэ1а1 X был проведен сравнительный анализ 48 нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов человека 27 серотипов, собранных в базах данных ООЕШЕМВЬ/ОепВапк. Подобрана серия олигонуклеотидных прайме-ров, которые представлены в табл. 1.

Таблица 1

Последовательности и расположение в геноме энтеровирусов __предложенных праймеров _

Праймер Последовательность позиция*

EvRl 5 '-caccggatggccaatccaa-3' 639-621

EvR2 5 '-attgtcaccataagcagcca-3' 600-577

EvFl 5 '-ggtacctttgtgcgcctgtttt-3' 65-86

EvIF2 5 '-agatcaggtagatgagtcaccg-3' 313-334

EvIIF2 5 '-gcgttgcgctcagcactcaacccc-3' 278-301

* Позиции праймеров указаны по геному полиовируса Sabin 1, для праймера EvIF2 по геному энтеровируса 71.

С помощью EvRl, EvFl, EvR2 в "полугнездовом" варианте ПЦР можно синтезировать фрагмент кДНК всех энтеровирусов человека длиной 534 п.н., размер ампликона которой удовлетворяет требованиям ПДРФ. В "гнездовом" варианте ПЦР с применением набора праймеров EvRl и EvFl для 1-го раунда и EvR2, EvIF2 и EvIIF2 для 2-го раунда, будут синтезироваться кДНК всех энтеровирусов человека и, одновременно, дифференцироваться на 2 геногруппы (Рис. 1). Праймер EvIF2 является специфичным в отношении геногруппы I (ЭВ I), включающей вирусы Коксаки А 7, 9 и 16, вирусы Коксаки В 1-6 , все йирусы ECHO, энтеровирусы 69 и 71 (размер фрагмента 291 п.н.), праймер EvIIF2 - в отношении геногруппы II (ЭВ II), включающей полиовирусы, вирусы

Коксаки А 13, 18, 21 и 24, энтеровирусы 68 и 70 (размер фрагмента 321 п.н.). Такая дифференциация энтеровирусов с одновременным их обнаружением предложена нами впервые.

Рис. 1. Амплификация фрагмента генома энтеровирусов в «nested» варианте ПЦР. 1,9- ДНК фага Ус Pvu II; 2 - Sabin 1; 3 - Коксаки А 13:4- энтеровирус 70: 5 - Коксаки ВЗ; 6 - Коксаки А 9; 7 -ECHO 11; 8 - энтеровирус 71; 10 - РНК ротавируса человека; 11 - РНК ВГА

Специфичность подобранных олигонуклеотидных праймеров была проверена на прототипных штаммах вирусов, представленных в разделе «Материалы и методы». В результате "полугнездовой" ПЦР с использованием праймеров ЕуШ, ЕуР1 и ЕуЯ2 выявлялись РНК энтеровйрусов человека и не выявлялись РНК параэховирусов, ВГА и ротавирусов. что свидетельствовало о специфичности сконструированных праймеров. В варианте "гнездовой" ПЦР с парой праймеров Еу112-Еу1Р2 специфично амплифицировались кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВ I, с парой ЕуЯ2-Еу11Р2 - кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВ II.

С целью оптимизации метода пробоподготовки материалов для исследования методом ПЦР мы провели сравнительный анализ выявляемое™ РНК энтеровирусов в пробах от больных и концентратах сточных вод с использованием традиционного фенол-хлороформенного способа экстракции нуклеиновых кислот (НК) и высокосолевого способа, рекомендованного Мейхи для экстракции НК вирусов, в собственной модификации. В модельном опыте соотношение ПЦР-положительных проб, контаминированных минимальным количеством вируса (0,01 ТСГО50), при солевом и фенол-хлороформенном способе обработки составляло 10:9. Частота обнаружения энтеровирусов методом ОТ-ПЦР при тестировании фекалий, СМЖ, сыворотки крови и носоглоточных смывов от 88 больных не отличалась достоверно в зависимости от способа экс- *

тракции РНК. Полученные результаты свидетельствуют, что солевой способ очистки РНК энтеровирусов не менее эффективен, чем классический с фенол-хлороформенной депротеинизацией, но менее трудо- Ч ёмок и безопасен, и позволяет выявлять РНК в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах и концентратах сточных вод.

Таким образом, представленные результаты апробации разработанного нами варианта ОТ-ПЦР свидетельствуют, что этот метод в комплексе с оптимизированным способом высокосолевой экстракции РНК позволяет эффективно проводить обнаружение РНК энтеровирусов человека в различных пробах от больных с одновременной дифференциацией на две 5'-НТР геногруппы.

2. ПЦР-ПДРФ анализ 5'-НТР генома энтеровирусов человека.

С использованием программы "МюгоСеш" были составлены рест-риктные карты фрагментов кДНК 5'-НТР генома 48 штаммов энтеровирусов человека, амплифицируемых с использованием предложенных нами праймеров. Сравнительный анализ рестриктных карт позволил установить, что профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома, полученные путем обработки одними и теми же рестриктазами, могут совпадать у энтеровирусов разных серотипов и в тоже время, могут быть различными у штаммов, принадлежащих одному серотипу. Это свидетельствует, что профиль ПДРФ кДНК 5'-НТР генома не пригоден для определения се-ротипа энтеровируса, но может быть использован как штаммовый признак. В связи с этим мы ограничили задачу наших исследований, связанных с рестриктных анализом, разработкой вариантов ПДРФ для идентификации кДНК 5'-НТР генома вакцинных и диких полиовирусов. Поскольку энтеровирусы человека формируют по 5'-НТР генома 2 ге-

ногруппы, а идентификация геногруппы упрощает ориентацию в многообразии энтеровирусов, первым этапом дифференциации изолятов энтеровирусов на геногруппы была выбрана ПЦР с группо-специфичными праймерами: EvIF2 и EvIIF2, и общим праймером -EvR2. Сайты рестриктаз были идентифицированы как на КДНК534, получаемой в результате «полугнездовой» ПЦР, так и на кДНК32|, синтезируемой в процессе «гнездового» варианта ПЦР.

В результате анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека, относящихся к геногруппе II, были подобраны ре-стриктазы Alu I, Ару I, Asu II, Ava I, Ava И, BamH I, Bfa I, Cía I, Hae II, ^ Hga I, Hha I, Hph I, Mlu I, Mly I, Nci I, Neo I, Nru I, Nsp BII, PflM I, Pvu

II, Sma I, Sty I, Tsp 5091, Xma I, с помощью которых можно идентифицировать генетические маркеры вакцинных и родственных им полиови-русов, а также маркеры, свойственные нейровирулентум предшествен-9 никам вакцинных полиовирусов.

Анализ кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов генофуппы II методом ПДРФ, реализуемый при использовании малого набора рестриктаз, был проверен на кДНК вакцинных штаммов Сэйбина. Показано что, рест-риктазы Ava I, Bam Н I, Neo I специфично гидролизуют кДНК генома полиовируса Sabin 1; Ava I, Cla I, Sma I - кДНК генома полиовируса Sabin 2; Neo I, Pvu II — кДНК генома полиовируса Sabin 3. Рестриктаза Alu I специфично гидролизует кДНК всех трех вакцинных полиовирусов, при этом для кДНК полиовируса каждого типа получается свой, отличающийся от других профиль ПДРФ. Рестриктаза Ava II не гидролизует кДНК вакцинных полиовирусов, но узнает кДНК диких предшественников полиовирусов Sabin 1 и Sabin 2 и может быть использована для определения реверсий у дериватов этих вирусов. Экспериментальные профили кДНК 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов Sabin совпали с теоретически рассчитанными (рис. 2).

Разработанный способ ПДРФ применили для анализа 8 фрагментов кДНК, чья принадлежность к энтеровирусам геногруппы II была установлена типированием методом ПЦР 119 РНК энтеровирусов. Четыре ' из них были обнаружены в пробах неврологических больных и четыре в

концентратах сточных вод. В результате ПДРФ-анализа было идентифицировано происхождение от вакцинных полиовирусов кДНК 5'НТР I генома 5-ти изолятов энтеровирусов геногруппы II (табл. 2). При иссле-

довании тех же проб вкультуре ткани Нер-2, проведенных параллельно в вирусологической лаборатории ЦГСЭН, полиовирусы были выделены только в 3 случаях, при этом тип вируса совпадал с типом вакцинного

вируса, определенным методом ПДРФ кДНК 5'НТР генома. Тип и происхождение остальных трех изолятов энтеровирусов геногруппы II не были выяснены. Профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома этих энтеровирусов не были характерны для штаммов Sabin и их диких предшественников. что позволяет отнести их к неполиомиелитным энтеровирусам.

А)

М Ваш HI Alu I Ava I Cla I Nco I Pvu II Sma I

Рис. 2. Рестриктный анализ кДНК 5'-НТР генома изолятов энтеровирусов геногруппы II А) кДНК534 генома энтеровируса из пробы 1/00 (дериват Sabin 2); Б) кДНК;з4 генома изолята 47/00 (дериват Sabin 3)

Таблица 2

Типирование изолятов энтеровирусов геногруппы II методом ПДРФ

Per. № изолята Источник выделения Рез-т исслед-я в к/тк Исследуемый фрагмент Профили ПДРФ* Происхождение 5'-НТР генома изолятЬ

Bin HI Alu 1 Ava Ava II Chi Nco I Pvu II Stna 1

46/99 Фекалии больного серозным менингитом Вирус не выделен 321п.н. ни 120 нр нр ни нр нр ни Не установлено

47/00 Фекалии больного с нейропатией Полиовирус 3 534 п.н. нр 180 120 100 60 нр ни нр 410 120 420 110 нр Sabin 3

56/00 Фекалии больного с нейропатией Вирус не выделен 321 п.н. ни 180 140 нр ни ни 130 100 90 нр ни Не установлено

70/00 СМЖ больного серозным менингитом Не исследо вался 321 п.н. нр 180 140 нр нр нр 230 90 нр ни Не установлено

1/00 Сточная вода Вирус не выделен 534 п.н. нр 380 160 300 230 ни 380 160 нр нр 300 230 Sabin 2

108/01 Сточная вода Вирус не выделен 321 п.н. нр 120 100 60 нр 'ни нр 210 120 220 100 нр Sabin 3

9/02 Сточная вода Полиовирус 3 534 п.н. нр 180 120 100 60 нр ни Ф 410 120 420 110 нр Sabin 3

109/02 Сточная вода Полиовирус 1 534 п.н. 380 160 240 160 120 нр нр нр 320 210 нр нр Sabin 1

*- указан приблизительный размер фрагментов кДНК, определенный визуально с помощью маркера молекулярных масс

Таким образом, проведенное исследование показало возможность применения разработанного нами способа ПДРФ как для характеристики изолятов полиовирусов, выделенных в культуре ткани, так и для идентификации последовательностей, характерных 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов, непосредственно после обнаружения РНК природного энтеровируса в исследуемой пробе методом ОТ-ПЦР. Также эти исследования позволили показать преимущественную циркуляцию на территории Н.Новгорода энтеровирусов неполиомиелитной гено-группы I. Все исследованные изоляты идентифицированных полиовирусов имели генетические характеристики 5'-НТР генома штаммов Сэйбина.

3. SSCP-анализ кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов

Другим молекулярно-генетическим методом, позволяющим проводить дифференциацию и сравнительную характеристику штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, является метод конформацион-ного полиморфизма одиночных нитей (SSCP - от англ. single strand conformation polymorphism). Этот метод основан на различной электрофо-ретичекой подвижности однонитевой ДНК в неденатурирующем ПААГ, которая обусловлена конформационным полиморфизмом одиночных нитей, вызванным нуклеотидными заменами. Мы применили технологию SSCP для анализа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы I с целью оценки гетерогенности циркулирующих вариантов энтеровирусов.

На первом этапе было проведено изучение SSCP-профилей 42 про-тотипных штаммов энтеровирусов. Установлено широкое разнообразие SSCP-профилей кДНК генома энтеровирусов (рис. 3). Практически все проанализированные штаммы энтеровирусов имели свои картины распределения одиночных нитей кДНК 5'-НТР-генома. Исключение составили штаммы вируса ECHO 4 и вируса ECHO 7, энтеровируса 71 и вируса ECHO 29, SSCP-профили фрагмента генома которых, соответственно, попарно были идентичны.

Для изучения стабильности 5'-НТР генома штаммов энтеровирусов, принадлежащих одному серотипу были проанализированы кДНК 3-х '

штаммов вируса ECHO 6: прототипного 3314/1213, и двух, выделенных в Нижнем Новгороде в 1981 и 1999 гг. Установлено, что SSCP-профили \

кДНК всех 3-х вирусов были различны, что свидетельствовало об изменении первичной структуры 5'-НТР генома в процессе длительной циркуляции. Полученные нами результаты, свидетельствующие, что SSCP-

тип 5'-НТР генома энтеровирусов не является серотипспецифичным признаком и не может быть использован дляидентификаиии серотипа. подтвердили исследования других авторов ^¡аГакав N. 2001]. Это может быть объяснено естественной изменчивостью, которая является результатом мутаций или межтиповых внутримолекулярных рекомбинаций, происходящих во время циркуляции энтеровирусов среди населения. Полученные результаты свидетельствуют, что специфичность ББСР-типа 5'-НТР генома энтеровирусов, также как и ПДРФ-профиля, не может распространяться дальше штамма.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 3. SSCP-профили кДНК прототипных штаммов энтеровирусов. 1-Е6,2 - Е9,3 - Е24,4 - Е25, 5 - Е28,6 - Е29,7 - Е30, 8 - Е32,9 - ЕЗЗ; 10 - э/в 71. 11 - Коксаки А 9, 12 - Коксаки А13

Рис. 4. ввСР-профили 5'НТР-генома штаммов вируса Коксаки В 6. 1 - 7847; 2 - 7953; 3 - 8014; 4 - 8220; 5-8221.

Возможность использования ББСР-типа энтеровируса как стабильного признака штамма подтвердилась экспериментальным фактом: ББСР-профили кДНК 5-ти штаммов вируса Коксаки В 6, выделенных от больных с разными клиническими проявлениями энтеровирусной инфекции в Нижнем Новгороде в течение одного сезона, были идентичны (рис. 4). Кроме того, ББСР- профили фрагментов кДНК энтеровирусов, выделенных из различных проб от одного больного также характеризовались единообразием.

Метод ПЦР-ББСР-типирования, был применен для анализа энтеровирусов геногруппы I, выявленных при расшифровке 2-х групповых заболеваний (групповое заболевание ОКИ с респираторными симптомами в медицинском училище г. Н. Новгорода в 1999 г. и вспышка ОКИ в детском летнем лагере в 2002 г.). Высокая частота обнаружения энтеровирусов у заболевших и контактных лиц, идентичность ББСР-профилей кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, выявленных внутри каждой группы заболевших, дали основание полагать, что этиологической причиной данных заболеваний была энтеровирусная инфекция. Кроме того, единообразие профилей кДНК указывало на единый источник инфекции - больного (Рис. 5) При этом БЗСР-типы у вирусов, вызвавших эти вспышки, различались, что свидетельствовало о том, что каждое групповое заболевание было вызвано энтеровирусами разных штаммов. При изучении эпиднеблагополучия в санатории Нижегородской области был установлен значительный полиморфизм 88СР - профилей фрагментов кДНК энтеровирусов, обнаруженных у 13 из 15 обследованных по показаниям и в пробе питьевой воды. При этом БЗСР-тип энтеровируса. выявленного в воде, совпал с ББСР-типом, который был идентифицирован у энтеровирусов, выявленных у 3-х человек. Полученные результаты указывали на источник инфекции - загрязненную воду.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 5. ББСР-профили к ДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, обнаруженных у больных и контактных лиц при расшифровке вспышки ОКИ

Таким образом, при изучении возможности применения метода ББСР для генотипирования энтеровирусов человека было установлено, что БЭСР-профиль анализируемого нами участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека является стабильным признаком штамма и может быть использован в качестве эпидемиологического маркера при оценке гетерогенности вирусных изолятов и расшифровке вспышек заболеваний энтеровирусной природы.

4. Характеристика особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода в 1999-2002 гг.

Разработанные методы анализа 5'-НТР генома энтеровирусов человека, были применены при изучении особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов в Нижнем Новгороде в период 1999-2002 гг.

Оптимизированный «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР с использованием праймеров ЕуШ, ЕуР1, ЕуЯ2, Еу1Р2 и Еу11Р2 в комплексе с высокосолевым способом пробоподготовки применили для обнаружения РНК энтеровирусов в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах неврологических больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Всего было исследовано 688 проб. Частота обнаружения РНК энтеровирусов в фекалиях составила 22,73 %, в СМЖ - 17,73 %, в носоглоточных смывах -11,81 %, в сыворотках крови 10,93 %. Показательно, что достаточно часто РНК энтеровирусов выявлялась в сыворотках крови. Известно, что выделение энтеровирусов из сывороток крови на клеточных культурах мало эффективно вследствие образования иммунных комплексов с нейтрализующими антителами. При ПЦР исследовании этот лимитирующий фактор не действует, благодаря чему результативность выявления энтеровирусов у больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию методом ОТ-ПЦР может быть повышена путем включения сывороток крови в спектр анализируемых биопроб.

жена только в одной из проб: в фекалиях в 35,00 %, в СМЖ -30,00 %, в сыворотке крови - 8,33 %, реже в носоглоточных смывах - 3,33 %. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности комбинирования разных типов биопроб при обследовании больных на энтеровиру-сы. В нашем случае выявляемость энтеровирусов при исследовании четырех биопроб повысилась почти в 2 раза по сравнению с исследованием только фекалий и в 2,5 раза - с СМЖ.

В период с 1999 по 2002 гг. с использованием метода ОТ-ПЦР было обследовано 280 неврологических больных, госпитализированных в инфекционные стационары г. Н. Новгорода с диагнозом: серозный менингит, менингоэнцефалит и энцефалит, нейропатии (полинейропатия, полинейрорадикулопатия, мононейропатия, неврит лицевого нерва). При комплексном исследовании различных биопроб РНК энтеровирусов была обнаружена у 94 больных (33,57 %). Частота обнаружения энтеровирусов у больных с различной нейропатологией колебалась в значительных пределах: при нейропатиях - 13,1 %, при энцефалите и ме-нингоэнцефалите - 15,8 %, при серозном менингите - 45,2 %. Полученные результаты частоты обнаружения энтеровирусов при разных формах нейроинфекций соответствуют многочисленным многолетним данным наблюдения за энтеровирусными инфекциями, в результате которых было установлено, что серозный менингит является одним из наиболее частых клинических проявлений энтеровирусной инфекции.

Спорадические случаи асептического серозного менингита (АСМ) стали регистрироваться в г. Горьком (сейчас г. Нижний Новгород) начиная с 60-х годов. С точки зрения роли энтеровирусов в возникновении АСМ в г. Горьком М.В. Троицкой был изучен период 1976-1988 гг. [Троицкая, 1989]. Представляло научный и практический интерес охарактеризовать динамику заболеваемости АСМ и роль энтеровирусов в её возникновении на современном этапе с применением разработанных нами молекулярно-генетических методов.

Для анализа многолетней динамики заболеваемости АСМ были привлечены официальные данные аналитического отдела городского центра СЭН по Н. Новгороду (рис. 6). Анализ 27 летних данных показал относительно низкий уровень заболеваемости АСМ. Начиная с 1976 г. выраженные подъёмы заболеваемости АСМ наблюдались в 1987 г. (6,4 °/ооооо), 1989 г. (14,0 °/ооооо) и 1998 г. (6,3 °/ооооо) (Рис. 5). В исследованный нами период времени (1999-2002 г.) максимальный подъём заболеваемости серозным менингитом наблюдался в 2000 г. (5,0 °/ооооо)- При этом,

средняя частота обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом составляла 56,5 %, достигая в июле-августе 74 %.

ЭбС 250

200

100

150

^ <1 4> •<> # ф Ф * ф 4> « # # ф 4> Ф <р * 4> <(> ф # ^

АСМ - • - ЭВСМ

Рис. 6. Многолетняя динамика заболеваемости АСМ в Нижнем Новгороде

Динамика интенсивности эпидпроцесса серозного менингита с подтвержденной энтеровирусной инфекцией за 4-х летний период абсолютно повторяла динамику регистрируемой заболеваемости АСМ, что может свидетельствовать о ведущей роли энтеровирусов в возникновении этого заболевания в Н. Новгороде.

Все РНК энтеровирусов, обнаруженные в пробах больных серозным менингитом (п=91), были типированы с использованием ПЦР. Установлено, что большинство изолятов энтеровирусов (96,6 %) принадлежали геногруппе неполиомиелитных энтеровирусов по 5'-НТР генома. В пробах от двух больных (3,4 %) были идентифицированы энтеровирусы геногруппы И, в состав которой входят полиовирусы. В результате ПДРФ-анализа кДНК изолятов энтеровирусов геногруппы II генетических маркеров полиовирусов выявлено не было.

подъёма заболеваемости ACM в 2000 г. преобладал (62,5 %) один гено-вариант. В предыдущем 1999 г. этот вариант энтеровируса был обнаружен только в одном случае. Это дало основание полагать, что подъём заболеваемости серозным менингитом был связан с формированием штамма энтеровируса с повышенной нейровирулентностью.

Проведенная характеристика SSCP-типов кДНК 5'-НТР генома эн-теровирусов, выявленных у неврологических больных, позволила определить значение SSCP-типирования при анализе спорадической заболеваемости энтеровирусными инфекциями, которое заключается в изучении гетерогенности энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и выделении доминирующего типа с целью его последующей характеристики.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы был разработан комплексный метод, в котором выявление и дифференциация энтеровирусов осуществляются путем анализа одного и того же участка 5'-НТР генома. Этот комплекс методов включает: выявление РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР в широком наборе биопроб с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы; идентификацию генетических маркеров вакцинных полиовирусов методом ПДРФ; оценку гомогенности или гетерогенности изолятов энтеровирусов методом SSCP. На основе анализа частоты обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейропатиями, многолетней динамики заболеваемости АСМ и оценки гетерогенности энтеровирусов показана низкая активность циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода в 1999-2002 гг. Эффективность разработанных методов, подтвержденная при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектов внешней среды, расшифровке групповых заболеваний энтеровирусной природы и анализе гетерогенности циркулирующих энтеровирусов, позволяет рекомендовать данный способ обнаружения и дифференциации энтеровирусов для применения в практике вирусологических исследований.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и апробирован в практике эпиднадзора унифицированный метод амплификации кДНК 5'-НТР генома, позволяющий одновременно выявлять и дифференцировать РНК энтеровирусов человека на 2 геногруппы.

2. Предложен метод высокосолевой очистки РНК, эффективный при выявлении энтеровирусов в фекалиях, СМЖ, носоглоточных смывах, сыворотке крови.

3. На основе анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека подобран оригинальный набор рестриктаз (Ava I, Ваш Н I, Neo I для Sabin 1, Ava I, Alu I, Cía I, Sma I для Sabin 2, Alu I, Neo I, Pvu II для Sabin 3) для идентифицикации 5'-HTP генома вакцинных полиовирусов методом ПДРФ.

4. Показана штаммовая специфичность SSCP-типа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов и возможность использования его в качестве эпидемиологического маркёра. С использованием ПЦР-БЗСР-типирования установлена роль энтеровирусов в возникновении трех групповых заболеваний ОКИ в Нижегородской области.

5. Из 280 пациентов с подозрением на вирусную нейроинфЪкцию РНК энтеровирусов методом ОТ ПЦР обнаружена: при нейропатиях в 13,1 % случаев, при энцефалите и менингоэнцефалите - 15,8 %, при серозном менингите - 45,2 % случаев.

6. Установлено, что территория Нижнего Новгорода в 1999-2000 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции нейротропных энтеровирусов. Показана генетическая неоднородность неполиомиелит-ных энтеровирусов, обнаруженных у больных с нейропатологией и формирование доминирующего генетического варианта, определившего подъём заболеваемости серозным менингитом в 2002 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голицына JI.H., Альховский С.В., Новикова Н.А. Молекулярно генетические подходы в диагностике энтеровирусных инфекций. //Матер. Научн. конф.:Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика.Санкт-Петербург. 21-22апреля 1999 г. - Санкт- Петербург. - 1999. - С.173-174.

2. Голицына JI.H., Новикова Н.А. Выявление энтеровирусов методом ПЦР. //Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - № 11.-С.12.

3. Голицына J1.H., Новикова Н.А., Калашникова Н.А. Выявление РНК представителей рода Enterovirus в биопробах с использованием ПЦР.

//Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Научн. конф. поев. 90-летию М.П. Чумакова. - М. - 1999г. - С.20.

4. Голицына JT.H., Новикова H.A., Калашникова H.A., Домбровская J1.K. Диагностика энтеровирусных инфекций методом ОТ-ПЦР. //Матер.научн.конф. "Естеств.факторы защиты в проф. и леч. эколо-гич. обусл. заб.". Н. Новгород, окт. 1999.- Н. Новгород. - 2000. -С.65.

5. Голицына J1.H., Новикова H.A., Епифанова Н.В. Дифференциация энтеровирусов на основе анализа 5-НТР генома. //В сборнике "Фундамент и прикл. пробл. медиц. биотехнол.", Москва, 25-26 апреля, 2000 г. - М. - 2000. - С. 33-34.

6. Голицына JI.H., Епифанова Н.В., Куприянова Н.В Федорова О.Ф., Новикова H.A. SSCP-типирование кДНК генома энтеровирусов. //Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва. - 2002. - Т. 3. - С. 244.

7. Голицына JI.H., Новикова H.A., Домбровская J1.K., Княгина О.Н., Новиков Д.В, Аркова Т.А. Оценка разработанного «nested» варианта ПЦР при выявлении энтеровирусов у больных. // Вопросы вирусологии. 2002.-№ 5. - С. 41-43.

8. Голицына JI.H., Новикова H.A., Епифанова Н.В., Домбровская JI.K., Княгина О.Н. Применение ПЦР-RFLP и ПЦР-SSCP анализа РНК энтеровирусов в практике эпидемиологических исследований. //Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сб. тез. 4-й Всероссийской научно-практической конференции. - Москва. - 2002. -С. 206-207.

9. Голицына JI.H., Новикова H.A. Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов. Патент на изобретение № 2189369, приоритет от 27.10. 2000.

Подписано в печать 07.05.2003. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл.-печ. л. 1. Заказ 5%Ь . Тираж 100.

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского Лицензия № 18-0099 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

* 1 О 6 3 6

2.О03 - Л

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голицына, Людмила Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Характеристика энтеровирусов.

2. Энтеровирусы в патологии человека.

3. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2. 1. Нуклеотидные последовательности геномных РНК пикорнавирусов.

2. 2. Штаммы вирусов.

2. 3. Исследуемый материал.

2. 4. Приготовление воды, свободной от РНКаз.

2. 5. Экстракция РНК энтеровирусов.

2. 6. Олигонуклеотидные праймеры.

2.7. Постановка реакции обратной транскрипции.

2.8. Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. 9. Электрофорез ДНК.

2.10. Анализ кДНК энтеровирусов методом ПДРФ. t 2.11. Постановка SSCP.

2. 12. Статистический анализ результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3. 1. Унификация метода ОТ-ПЦР для выявления и дифференциации энтеровирусов человека.

3.1.1. Сравнительный анализ 5'-НТР генома энтеровирусов.

3.1.2. Оценка специфичности разработанных вариантов

3.1.3. Оценка метода солевой очистки биопроб.

I 3.2. ПЦР-ПДРФ анализ 5'-НТР генома энтеровирусов человека.

3. 2. 1. Разработка схемы ПДРФ - дифференциации энтеровирусов.

3. 2. 2. Типирование изолятов энтеровирусов методом ПДРФ.

3.3. SSCP-анализ кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов.

3. 4. Характеристика особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Нижнего Новгорода в 1999-2002 гг.

3.4. 1. Обнаружение энтеровирусов у больных с нейроинфекцией.

3. 4. 2. Характеристика энтеровирусных серозных менингитов в Нижнем Новгороде.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома"

Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека (сем. Picornaviridae, род Enterovirus), характеризуются иммунологическим и генетическим многообразием. Подавляющее большинство энтеровирусов человека являются патогенными, вызывая заболевания, полиморфные по клиническим проявлениям (полиомиелит, нейропатии, серозный менингит, миокардиты, гастроэнтерит, респираторные заболевания, конъюнктивиты и т.д.) и различные по тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения, некоторые из них имеют тенденцию к эпидемическому распространению. Установлена этиологическая связь энтеровирусной инфекции с патологией матери, плода и ребенка [7, 12, 22, 23, 25, 44].

Значимость энтеровирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления, а при расшифровке случаев групповой заболеваемости - и типирования возбудителя. Множество иммунологических типов энтеровирусов, различная чувствительных клеточных культур к отдельным представителям рода предопределяют длительность и трудоемкость традиционных методов выявления энтеровирусов и делают актуальной разработку новых подходов к решению проблемы обнаружения и дифференциации энтеровирусов. Прогресс молекулярной биологии и открытие принципов ПЦР дали возможность разработки альтернативных экспрессных, высокочувствительных и специфичных методов обнаружения энтеровирусов в клиническом материале и объектах внешней среды, что расширяет методическую базу эпидемиологического надзора за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов и вирусов полиомиелита.

Задачи исследования:

2. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК энтеровирусов в различных биологических субстратах.

3. Провести разработку метода ПДРФ-дифференциации 5'-НТР генома энтеровирусов человека.

4. С использованием типовых штаммов энтеровирусов человека и РНК энтеровирусов, выделенных от больных охарактеризовать SSCP-типы 5'-НТР генома. Оценить возможность применения SSCP-типирования фрагментов кДНК генома энтеровирусов в эпидемиологической практике.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработаны оригинальные методические подходы для выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, основанные на анализе одного и того же участка 5'-НТР генома: впервые подобрана серия олигонуклеотидных праймеров, позволяющая проводить выявление РНК энтеровирусов человека методом ОТ-ПЦР с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы по 5'-НТР генома. впервые подобран и применен на практике оригинальный набор рестриктаз для анализа методом ПДРФ 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы II с целью идентификации генетических маркеров полиовирусов вакцинного происхождения. Новизна предложенного способа выявления и дифференциации энтеровирусов подтверждена патентом на изобретение №2189396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000. впервые в России дана характеристика SSCP-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека. Показаны многообразие SSCP-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека и возможность использования в качестве эпидемиологического маркера. впервые комплексное исследование 5'-НТР генома энтеровирусов было применено при расшифровке групповых заболеваний. Установлена роль энтеровирусов в возникновении 3-х групповых заболеваний ОКИ.

Предложенный комплекс методов обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека (ПЦР, ПЦР-ПДРФ и ПЦР-SSCP) был применен в совместной работе с вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и анализе проб сточных вод с очистных сооружений Нижегородской области. Полученные результаты использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.

Внедрение результатов исследования в практику.

Методические рекомендации «Энтеровирусные инфекции. Этиология, клиника, диагностика и профилактика». Утверждены Департаментом здравоохранения Нижегородской области в 2000 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс оптимизированных приемов, включающий бесфенольную экстракцию РНК из разнообразного вируссодержащего материала, детекцию РНК методом ОТ-ПЦР с помощью сконструированных праймеров, комплементарных консервативным участкам 5'-НТР генома, обеспечивает надежное выявление энтеровирусов человека в пробах от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектах внешней среды с одновременным типированием на две 5'-НТР геногруппы.

2. Профиль ПДРФ и SSCP-тип 5'-НТР генома энтеровирусов являются штаммовыми признаками и могут быть использованы в качестве эпидемиологических маркеров.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций (аналитика, диагностика, техника, экономика)», проходившем в рамках Национальных дней России-99 (Москва, 12-14 октября 1999 г.).

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной 25 февраля 2003 г.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Голицына, Людмила Николаевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан и апробирован в практике эпиднадзора унифицированный метод амплификации к ДНК 5'-НТР генома, позволяющий одновременно выявлять и дифференцировать РНК энтеровирусов человека на 2 геногруппы.

3. На основе анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека подобран оригинальный набор рестриктаз (Ava I, Bam Н I, Nco I для Sabin 1, Ava I, Alu I, Cla I, Sma I для Sabin 2, Alu I, Nco I, Pvu II для Sabin 3) для идентифицикации 5'-HTP генома вакцинных полиовирусов методом ПДРФ.

4. Показана штаммовая специфичность SSCP-типа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов и возможность использования его в качестве эпидемиологического маркёра. С использованием ПЦР-SSCP-типирования установлена роль энтеровирусов в возникновении групповых заболеваний ОКИ в Нижегородской области.

5. Из 280 пациентов с подозрением на вирусную нейроинфекцию РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР обнаружена: при нейропатиях в 13,1 % случаев, при энцефалите и менингоэнцефалите -15,8 %, при серозном менингите - 45,2 % случаев.

6. Установлено, что территория Нижнего Новгорода в 1999-2002 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции нейротропных энтеровирусов. Показано преобладание энтеровирусов неполиомиелитной 5'-НТР-геногруппы, их генетическая неоднородность и формирование доминирующего генетического варианта.

118

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Значимость энтеровирусов в патологии человека обусловлена их широкой распространённостью, способностью вызывать острые и хронические заболевания, различающиеся по клиническим проявлениям и тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения и имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что определяет необходимость своевременного выявления и идентификации энтеровирусов, оценки их вирулентных свойств и уровня циркуляции среди населения.

В конце 80-х гг. XX века при исследованиях генома энтеровирусов стали использовать метод ОТ-ПЦР. Наибольшее практическое применение получили способы выявления РНК энтеровирусов человека с использованием универсальных праймеров, впервые позволившие проводить диагностику энтеровирусной инфекции, удовлетворяющую запросам клиники. Однако, при проведении эпидемиологических исследований простого обнаружения вирусов недостаточно, необходим дифференциальный анализ. Особую значимость типирование энтеровирусов приобретает при наблюдении за циркуляцией полиовирусов. В этом случае имеют значение не только определение серотипа полиовируса, но и идентификация его происхождения от дикого или вакцинного полиовируса, оценка степени изменчивости дериватов вакцинных полиовирусов. При расшифровке случаев групповой заболеваемости необходимы дифференциация и оценка гетерогенности штаммов энтеровирусов.

На момент начала нашей работы в большинстве имевшихся в научной литературе сообщений о молекулярно-генетических методах типирования энтеровирусов описывались способы идентификации РНК методом ОТ-ПЦР с помощью типоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, что не удобно для ориентации в типовом многообразии энтеровирусов. Публикации о применении ОТ-ПЦР в комплексе с другими молекулярными методами для дифференциации и типирования энтеровирусов были единичными. В России публикации об опыте применения молекулярно-генетических методов в лабораторной диагностике энтеровирусных инфекций касались генотипирования только полиовирусов.

Целью настоящего исследования являлась разработка унифицированного комплексного метода, с помощью которого выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека могут быть осуществлены путем анализа одного и того же фрагмента вирусного генома, а также характеристика особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н Новгорода с применением разработанных методических подходов.

На первом этапе работы были подобраны олигонуклеотидные праймеры, с помощью которых можно проводить специфичную амплификацию в ОТ-ПЦР РНК всех энтеровирусов человека. К началу наших исследований было известно, что самой высококонсервативной областью генома энтеровирусов является 5'-НТР, кроме того, в результате филогенетического анализа этой области генома энтеровирусы человека были разделены на 2 геногруппы. Классификация энтеровирусов человека на 2 геногруппы на основе последовательности 5'НТР генома послужила основанием для подбора праймеров, позволяющих определять принадлежность энтеровирусов к той или иной геногруппе, что может быть полезным инструментом для ориентации в многообразии типов энтеровирусов и являться первым шагом в генотипировании вирусных изолятов. В результате сравнительного анализа 48 нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов человека 27 серотипов, собранных в базах данных DDBJ/EMBL/GenBank, с использованием программы Clustal X нами подобрана серия олигонуклеотидных праймеров: EvFl, EvRl, EvR2, EvIF2, EvIIF2. С помощью EvRl, EvFl, EvR2 в "полугнездовом" варианте ПЦР можно синтезировать фрагмент кДНК всех энтеровирусов человека длиной 534 п.н., размер ампликона которой удовлетворяет требованиям ПДРФ. В "гнездовом" варианте ПЦР с применением набора праймеров EvRl и EvFl для 1-го раунда и EvR2, EvIF2 и EvIIF2 для 2-го раунда, будут синтезироваться кДНК всех энтеровирусов человека и, одновременно, дифференцироваться на 2 геногруппы. Праймер EvIF2 является специфичным в отношении геногруппы I, включающей вирусы Коксаки А 7, 9 и 16, вирусы Коксаки В 1-6 , все вирусы ECHO, энтеровирусы 69 и 71 (размер фрагмента 291 п.н.), праймер EvIIF2 - в отношении геногруппы II, включающей полиовирусы, вирусы Коксаки А 13, 18, 21 и 24, энтеровирусы 68 и 70 (размер фрагмента 321 п.н.). Такая дифференциация энтеровирусов с одновременным их обнаружением предложена нами впервые.

Специфичность подобранных олигонуклеотидных праймеров была проверена на прототипных штаммах вирусов Коксаки А 7, 9, 13, 18, Коксаки В 1-6, ECHO 1-9, 11-20, 24-27, 29-33, энтеровирусов 68-71, полиовирусов 1-3 шт. Sabin, параэховирусов 1 и 2, ВГА шт. HAS 15, ротавируса шт. SA-11. В результате "полугнездовой" ПЦР с использованием праймеров EvRl, EvFl и EvR2 амплифицировались РНК энтеровирусов человека и не амплифицировались РНК параэховирусов, ВГА и ротавирусов, что свидетельствовало о специфичности сконструированных праймеров. В варианте "гнездовой" ПЦР с парой праймеров EvR2-EvIF2 специфично амплифицировались кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВ1, с парой EvR2-EvIIF2 - к ДНК энтеровирусов геногруппы ЭВП.

С целью оптимизации метода пробоподготовки материалов от больных для исследования методом ПЦР мы провели сравнительный анализ выявляемое™ РНК энтеровирусов в биологических жидкостях с использованием традиционного фенол-хлороформенного способа экстракции НК и высокосолевого способа, рекомендованного Мейхи для экстракции НК вирусов, в собственной модификации. В модельном опыте соотношение ПЦР-положительных проб, контаминированных минимальным количеством вируса (0,01 TCID50), ПРИ солевом и фенол-хлороформенном способе обработки составляло 10 : 9. Частота обнаружения энтеровирусов методом ОТ-ПЦР при тестировании одних и тех же биопроб от 88 больных не отличалась достоверно в зависимости от способа экстракции РНК. Полученные результаты свидетельствуют, что солевой способ экстракции РНК энтеровирусов не менее эффективен, чем классический с фенол-хлороформенной депротеинизацией, и позволяет выявлять РНК в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах и концентратах сточных вод.

Таким образом, представленные результаты апробации разработанного нами варианта ОТ-ПЦР для выявления РНК всех энтеровирусов человека свидетельствуют, что этот метод в комплексе с оптимизированным способом высокосолевой экстракции РНК эффективен при тестировании различных биопроб от больных: фекальных проб, СМЖ, носоглоточных смывов, сывороток крови.

На следующем этапе наших исследований была проведена разработка методов дифференциации энтеровирусов по 5'-НТР генома. Анализ рестриктных карт последовательностей кДНК 5'НТР генома 48 шт. энтеровирусов человека, построенных с помощью программы MicroGeni, показал, что профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома, полученные путем обработки одними и теми же рестриктазами, могут совпадать у энтеровирусов разных серотипов и в тоже время, могут быть различными у штаммов, принадлежащих одному серотипу.

На основании полученных данных был сделан вывод, что профиль ПДРФ к ДНК 5'-НТР генома может быть использован как штаммовый признак энтеровируса, но не пригоден для определения серотипа. В связи с этим мы ограничили задачу наших исследований, связанных с рестриктных анализом, разработкой вариантов ПДРФ для идентификации кДНК 5'-НТР генома вакцинных и диких полиовирусов. Поскольку энтеровирусы человека формируют по 5'-НТР генома 2 геногруппы, а идентификация геногруппы упрощает ориентацию в многообразии энтеровирусов, первым этапом дифференциации изолятов энтеровирусов на геногруппы была выбрана ПЦР с группо-специфичными праймерами: EvIF2 и EvIIF2, и общим праймером -EvR2. Сайты рестриктаз были идентифицированы как на КДНК534, получаемой в результате «полугнездовой» ПЦР, так и на КДНК321, синтезируемой в процессе «гнездового» варианта ПЦР.

В результате анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека, относящихся к геногруппе II, были подобраны рестриктазы Alu I, Ару I, Asu II, Ava I, Ava II, BamH I, Bfa I, Cla I, Hae II, Hga I, Hha I, Hph I, Mlu I, Mly I, Nci I, Nco I, Nru I, Nsp BII, PflM I, Pvu II, Sma I,Sty I, Tsp 5091, Xma I, с помощью которых можно идентифицировать генетические маркеры вакцинных и родственных им полиовирусов, а также маркеры, свойственные нейровирулентым предшественникам вакцинных полиовирусов.

Анализ кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы II методом ПДРФ, реализуемый при использовании малого набора рестриктаз, был проверен на кДНК вакцинных штаммов Сэйбина. Рестриктазы Ava I, Bam Н I, Nco I специфично гидролизовали кДНК генома полиовируса Sabin 1; Ava I, Cla I, Sma I - кДНК Sabin 2; Nco I, Pvu II - кДНК Sabin 3. Рестриктаза Alu I специфично гидролизовала кДНК всех трех вакцинных полиовирусов, при этом для кДНК полиовируса каждого типа получался свой, отличный от других профиль ПДРФ. Экспериментальные профили кДНК 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов Sabin совпали с теоретически рассчитанными. Рестриктаза Ava II не гидролизует кДНК вакцинных полиовирусов, но узнает кДНК диких предшественников полиовирусов Sabin 1 и Sabin 2 и может быть использована для определения реверсий у дериватов этих вирусов.

Новизна разработанного способа дифференциации энтеровирусов методом ПДРФ защищена патентом [Патент на изобретение №2189396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000]

Разработанный способ ПДРФ применили для анализа 8 ампликонов, чья принадлежность к энтеровирусам геногруппы II была установлена типированием методом ПЦР 119 РНК энтеровирусов. Четыре из них были обнаружены в пробах неврологических больных и 4 в концентратах сточных вод. В результате ПДРФ-анализа было идентифицировано происхождение от вакцинных полиовирусов кДНК 5'НТР генома 5-ти изолятов энтеровирусов геногруппы II. При исследовании тех же проб в культуре ткани Нер-2, проведенных параллельно в вирусологической лаборатории ЦГСЭН, полиовирусы были выделены только в 3 случаях, при этом тип вируса совпадал с типом вакцинного вируса, определенным методом ПДРФ кДНК 5'НТР генома. Тип и происхождение остальных трех изолятов энтеровирусов геногруппы II не были выяснены. Профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома этих энтеровирусов не были характерны для штаммов Sabin и их диких предшественников, что позволяет отнести их к неполиомиелитным энтеровирусам.

Таким образом, проведенное исследование показало возможность применения разработанного способа ПЦР-ПДРФ как для сравнительной характеристики изолятов полиовирусов, выделенных в культуре ткани, так и для идентификации последовательностей, характерных для 5' -НТР генома вакцинных полиовирусов, непосредственно после обнаружения РНК природного энтеровируса в исследуемой пробе методом ОТ-ПЦР. Также эти исследования позволили показать преимущественную циркуляцию на территории Н.Новгорода энтеровирусов неполиомиелитной геногруппы I. Все исследованные изоляты идентифицированных полиовирусов имели генетические характеристики 5'-НТР генома штаммов Сэйбина.

Результаты идентификации 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов методом ПДРФ предоставлялись в областной центр ГСЭН в Нижегородской области и использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.

Другим молекулярно-генетическим методом, позволяющим проводить дифференциацию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, является SSCP-метод. Мы применили технологию SSCP для анализа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы I с целью оценки гетерогенности циркулирующих вариантов энтеровирусов.

На первом этапе было проведено изучение SSCP-профилей 42 прототипных штаммов энтеровирусов. В результате было установлено широкое разнообразие SSCP-профилей кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов. Практически все проанализированные штаммы энтеровирусов имели свои картины распределения одиночных нитей кДНК 5'-НТР-генома. Исключение составили штаммы вируса ECHO 4 и вируса ECHO 7, энтеровируса 71 и вируса ECHO 29, SSCP-профили которых, соответственно, попарно были идентичны.

Для изучения стабильности 5'-НТР генома штаммов энтеровирусов, принадлежащих одному серотипу были проанализированы кДНК 3-х штаммов вируса ECHO 6: прототипного 3314/1213, и двух, выделенных в Нижнем Новгороде в 1981 и 1999 гг. SSCP-профили кДНК всех 3-х вирусов были различны, что свидетельствовало об изменении первичной структуры 5'-НТР генома в процессе длительной циркуляции. Полученные нами результаты, нашедшие подтверждение в исследованиях других авторов, свидетельствуют, что SSCP-тип 5'-НТР генома энтеровирусов не является серотипспецифичным признаком и не может быть использован для идентификации серотипа. Это может быть связано с естественной изменчивостью, которая является результатом мутаций или межтиповых внутримолекулярных рекомбинаций, происходящих во время циркуляции энтеровирусов среди населения. Полученные результаты свидетельствуют, что специфичность SSCP-типа 5'-НТР генома энтеровирусов, также как и ПДРФ-профиля, не может распространяться дальше штамма.

Возможность использования SSCP-типа энтеровируса как стабильного признака штамма подтвердилась экспериментальным фактом: SSCP-профили к ДНК 5-ти штаммов вируса Коксаки В 6, выделенных от больных с разными клиническими проявлениями энтеровирусной инфекции в Нижнем Новгороде в течение одного сезона (1981 г.), были идентичны.

Метод SSCP, с оптимизированными условиями постановки электрофореза (для продуктов ОТ-ПЦР с использованием подобранных праймеров), был применен для анализа РНК энтеровирусов геногруппы I, выявленных при расшифровке 2-х групповых заболеваний (групповое заболевание ОКИ с респираторными симптомами в медицинском училище г. Н. Новгорода в 1999 г. и вспышка ОКИ в детском летнем лагере в 2002 г.). высокая частота обнаружения энтеровирусов у заболевших и контактных лиц, идентичность SSCP-профилей кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, выявленных внутри каждой группы заболевших, дала основание полагать, что этиологической причиной данных заболеваний была энтеровирусная инфекция. Кроме того, единообразие профилей кДНК указывало на единый источник инфекции - больного. При этом SSCP-типы у вирусов, вызвавших эти вспышки, различались, что свидетельствовало о том, что каждое групповое заболевание было вызвано разными энтеровирусами. При изучении эпиднеблагополучия в санатории Нижегородской области был установлен значительный полиморфизм SSCP - профилей энтеровирусов, обнаруженных у 13 из 15 сотрудников пищеблока и в пробе питьевой воды. При этом SSCP-тип энтеровируса, выявленного в воде, совпал с SSCP-типом, который был идентифицирован у энтеровирусов, выявленных у 3-х человек. Полученные результаты указывали на источник инфекции - загрязненную воду.

Таким образом, при изучении возможности применения метода SSCP для генотипирования энтеровирусов человека было установлено, что SSCP-профиль анализируемого нами участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека является стабильным признаком штамма и может быть использован в качестве эпидемиологического маркёра при оценке гетерогенности вирусных изолятов и расшифровке вспышек заболеваний энтеровирусной природы.

Оптимизированный «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР с использованием праймеров EvRl, EvFI, EvR2, EvLF2 и EvIIF2 в комплексе с высокосолевым способом пробоподготовки применили для обнаружения РНК энтеровирусов в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах неврологических больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Всего было исследовано 688 проб. Частота обнаружения РНК энтеровирусов в фекалиях составила 22,73 %, в СМЖ - 17,73 %, в носоглоточных смывах -11,81 %, в сыворотках крови 10,93 %. Показательно, что достаточно часто РНК энтеровирусов выявлялась в сыворотках крови. Известно, что выделение энтеровирусов из сывороток крови на клеточных культурах мало эффективно вследствие образования иммунных комплексов с нейтрализующими антителами. При ПЦР исследовании этот лимитирующий фактор не действует, благодаря чему результативность выявления энтеровирусов у больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию методом ОТ-ПЦР может быть повышена путем включения сывороток крови в спектр анализируемых биопроб.

Для того, чтобы оценить влияние тестирования расширенного спектра биопроб на выявляемость энтеровирусов при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию, были проанализированы данные обнаружения РНК энтеровирусов в разных материалах от 60 больных серозным менингитом с положительным результатом ПЦР-исследования у которых были взяты четыре пробы: фекалии, СМЖ, сыворотка крови и носоглоточный смыв. Частота обнаружения РНК энтеровирусов у этих больных в фекалиях составляла 51,67 ± 6,45 %, в СМЖ - 40,00 ± 6,32 %, в носоглоточных смывах 21,67 ± 5,32 %, в сыворотке крови 18,33 ± 5,00 %. РНК энтеровирусов в ряде случаев была обнаружена только в одной из проб: в фекалиях в 35,00 %, в СМЖ -30,00 %, в сыворотке крови - 8,33 %, реже в носоглоточных смывах -3,33 %. Таким образом, результаты нашей работы свидетельствуют о целесообразности комбинирования разных типов биопроб при обследовании больных на энтеровирусы. В нашем случае выявляемость энтеровирусов при комбинированном исследовании четырех биопроб повысилась почти в 2 раза по сравнению исследованием только фекалий и в 2,5 раза - с СМЖ.

В период с 1999 по 2002 гг. с использованием метода ОТ-ПЦР было обследовано 280 неврологических больных, госпитализированных в инфекционные стационары г. Н. Новгорода с диагнозом: серозный менингит, менингоэнцефалит и энцефалит, нейропатии (полинейропатия, полинейрорадикулопатия, мононейропатия, неврит лицевого нерва). При комплексном исследовании различных биопроб РНК энтеровирусов была обнаружена у 94 больных (33,57 %). Частота обнаружения энтеровирусов у при нейропатиях - 13,1 %, при энцефалите и менингоэнцефалите - 15,79 %, при серозном менингите - 45,2 %. Полученные результаты частоты обнаружения энтеровирусов при разных формах нейроинфекций соответствуют многочисленным многолетним данным наблюдения за энтеровирусными инфекциями, в результате которых было установлено, что серозный менингит является одним из наиболее частых клинических проявлений энтеровирусной инфекции.

Спорадические случаи асептического серозного менингита (АСМ) стали регистрироваться в г. Горьком (сейчас г. Нижний Новгород) начиная с 60-х годов. С точки зрения роли энтеровирусов в возникновении АСМ в г. Горьком М.В. Троицкой был изучен период 1976-1988 гг. Представляло научный и практический интерес охарактеризовать динамику заболеваемости АСМ и роль энтеровирусов в её возникновении на современном этапе с применением разработанных нами молекулярно-генетических методов.

Для анализа многолетней динамики заболеваемости АСМ были привлечены официальные данные аналитического отдела городского центра СЭН по Н. Новгороду. Анализ 27 летних данных показал относительно низкий уровень заболеваемости АСМ. Начиная с 1976 г. выраженные подъёмы заболеваемости АСМ наблюдались в 1987 г. (6,4 0/00ооо), 1989 г. (14,0 °/ооооо) и 1998 г. (6,3 °/ооооо)- В исследованный нами период времени (1999-2002 г.) максимальный подъём заболеваемости АСМ наблюдался в 2000 г. (5,0 %оооо). При этом, средняя частота обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом составляла 56,5 %, достигая в июле-августе 74 %.

Все РНК энтеровирусов, обнаруженные в пробах больных серозным менингитом (п=91), были типированы методом ПЦР. Установлено, что

Все РНК энтеровирусов, обнаруженные в пробах больных серозным менингитом (п=91), были типированы методом ПЦР. Установлено, что большинство изолятов энтеровирусов (96,6 %) принадлежат I геногруппе (неполиомиелитных) энтеровирусов по 5'-НТР генома. В пробах от двух больных (3,4 %) были идентифицированы энтеровирусы геногруппы II, в состав которой входят полиовирусы. В результате ПДРФ-анализа кДНК изолятов энтеровирусов геногруппы II генетических маркеров полиовирусов выявлено не было.

С целью изучения разнообразия циркулирующих вариантов энтеровирусов кДНК генома энтеровирусов геногруппы I, обнаруженных у больных серозным менингитом, были проанализированы методом SSCP. Зарегистрировано 22 SSCP-5'HTP типа, что свидетельствовало о генетическом полиморфизме циркулирующих энтеровирусов. В период подъёма заболеваемости АСМ в 2000 г. преобладал (62,5 %) один геновариант. В предыдущий 1999 г. этот вариант энтеровируса был обнаружен только в одном случае АСМ. Это дало основание полагать, что подъём заболеваемости серозным менингитом был связан с формированием штамма энтеровируса с повышенной нейровирулентностью.

Проведенная характеристика SSCP-типов кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, выявленных у неврологических больных, позволила определить значение SSCP-типирования при анализе спорадической заболеваемости энтеровирусными инфекциями, которое заключается в изучении гетерогенности энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и выделении доминирующего типа с целью его последующей характеристики.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы был разработан комплексный метод, в котором выявление и дифференциация энтеровирусов осуществляются путем анализа одного и того же участка 5'-НТР генома. Этот комплекс методов включает: выявление РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР в широком наборе биопроб с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы; идентификацию генетических маркеров вакцинных полиовирусов методом ПДРФ; оценку гомогенности или гетерогенности изолятов энтеровирусов методом SSCP. На основе анализа частоты обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейропатиями, многолетней динамики заболеваемости серозным менингитом и оценки гетерогенности энтеровирусов показана низкая активность циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода в 1999-2002 гг. Эффективность разработанных методов, подтвержденная при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектов внешней среды, расшифровке групповых заболеваний энтеровирусной природы и анализе гетерогенности циркулирующих энтеровирусов, позволяет рекомендовать данный способ обнаружения и дифференциации энтеровирусов для применения в практике вирусологических исследований.

117

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голицына, Людмила Николаевна, Нижний Новгород

1. Агол В. И., Гаврилин Е. В., Kew О. М. и др. Молекулярная эпидемиология полиомиелита. // Актуал. Пробл. Мед. Вирусол.: мат. научн. конф., поев. 90-летию со дня рожд. М.П. Чумакова, Москва, 23-25 ноября 1999 года. -М. 1999. - С. 12.

2. Агол В. И. Помехоустойчивость вирусов. // Мол. биол. 1998. - том. 32, № 1. - С.54-61.

3. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Дьяконова О.В., Лазюк Д.Г. Роль энтеровирусов в заболеваниях сердца. // Актуал. Пробл. Мед. Вирусол.: мат. научн. конф., поев. 90-летию со дня рожд. М.П. Чумакова, Москва, 23-25 ноября 1999 года. М. - 1999. - С.13.

4. Белецкая Т.С., Самойлович Е.О., Короткова Е.А. и др. Мутационная и рекомбинационная изменчивость вакцинных полиовирусов, изолированных в Беларуси (1960-1999г.). // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - №1. С.:24 - 30.

5. Бочаров Е.Ф., Ерман Б.А., Фомин В.М. и др. Энтеровирусная инфекция. Новые аспекты. Новосибирск, 1990. - 223 С.

6. Вирусология. Методы: Пер. с англ. // Под ред. Б. Мейхи,- М.: Мир,1988. 344 С.

7. Ворошилова М.К. Энтеровирусные инфекции человека. М.: Медицина, 1979. - 360 С.

8. Гендон Ю.З. Прекращение циркуляции диких штаммов вируса полиомиелита среди популяции как принципиальное условие сертификации искоренения полиомиелита. //Вопр. Вирусол. 2000. - №5. - С.43-44.

9. Детекция ротавирусов человека с использованием электрофоретического анализа нуклеиновых кислот (ЭФАНК). Методические рекомендации. Нижний Новгород, 1994.

10. Землянская С.В. Роль энтеровирусов в этиологии дилятационной кардиомиопатии // Актуал. пробл. клин, и эксперим. кардиол.: Тез. докл. регион, научн. конф. студ. и мол. учен, с междунар. представительством, Киев, 2-5 апр.,1991. Киев, 1991. - С.70.

11. Златковская Н.М. Энтеровирусные заболевания у детей. М.: Медицина, 1976. - 192 С.

12. Кипшидзе Н.Н. Дилатационная кардиомиопатия следствие вирусного миокардита? // Кардиология. - 1989. - Том.29, №11. - С.75-79.

13. Когут Е.П., Наговицина Е.Б., Баглай И.А., и др. Врожденная гипотрофия плода один из показателей антенатальной вирусной инфекции. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. - Екатеринбург. - 1993. -С.127-134.

14. Королева Г.А., Лашкевич В.А., Денисова Е.В., и др. Энтеровирусная персистентная инфекция глаза у обезьян (постувеитный синдром).// Вопр. вирусол. 1998. - № 5. - С.204-216.

15. Кортев А.И., Донцов Г.И., Власова Э.В. Энтеровирусная инфекция /менингеальная форма/ у взрослых города Свердловска. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Свердловск. - 1985. - С. 90-93.

16. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсионных заболеваний. Пер. с англ./Под ред. Э. Леннета и н. Шмидт. М.: Медицина, 1974. - 775 С.

17. Лашкевич В.А., Королёва Г.А., Терешкина Н.В. и др. Сверхострый летальный некроз печени у обезьян, инфицированных высокопатогенными вариантами энтеровирусов (вирусы ECHO 11 и ECHO 19) // Вопр. вирусол. -1996. №5. - С. 198-206.

18. Липская Г.Ю., Черкасова Е.А., Иванова О.Е., Дроздов С.Г. Генотипирование диких штаммов вируса полиомиелита, изолированных натерритории России и СНГ в 1987-1995гг. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. 1998. - № 5. - С.70-74.

19. Лозовская JI.C., Ермакова М.К., Менемчиадис Г.И., и др./ Хроническая врожденная коксакивирусная инфекция и её участие в этиологии аллергических болезней, выявляемых у детей.// Вопросы вирусологии. 1999. - № 6. - С.268-272.

20. Лозовская Л.С., Коноплева Т.Н., Хелленов Э.А., Шумская Е.А. Патология матери, плода и ребенка, связанная с вирулентными энтеровирусами, передающимися вертикально.// Педиатрия. 1998. - № 4. -С.11-16.

21. Лозовская Л.С., Осипов С.М., Зубкова И.В., Соболева В.Д. Значение вертикальной передачи энтеровирусов группы Коксаки в этиологии врожденных иммунодефицитных состояний.// Вопр. вирусол. 1997. - № 7. -С.175-179.

22. Лозовская Л.С., Шумская Е.А., Мухитдинова З.А. и др. Значение смешанной врожденной вирусной инфекции в антенатальной и перинатальной патологии человека. // Вопр. вирусол. 1994 - № 2. - С.74-77.

23. Львов Д.К. Роль вирусов в патологии желудочно-кишечного тракта. // Вопр. Вирусол. 1997. - № 6. - С.244-248.

24. Метод сбора и концентрирования кишечных вирусов из воды с помощью водопроницаемых пакетов с адсорбентом. Методические рекомендации. Москва, 2000.

25. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. // Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М.: Мир, 1984.

26. Наговицына Е. Б., Когут Е.П., Сиротина З.В., и др. Значение антенатальной вирусной инфекции в этиологии врожденных кардитов у детей.

27. Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Екатеринбург. - 1993. -С.134-140.

28. Новые подходы к лабораторной диагностике полиовирусных инфекции: меморандум совещания ВОЗ.//Бюлл. ВОЗ. 1992,- Т. 70, № 1. - С. 23-29.

29. Саулите В., Конычева В., Эглите В. и др. Диагностика энтеровирусных инфекций. // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, т. 2. М. - 2002. - С. 258.

30. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П., Лаврова И.К., Дроздов С.Г. Штаммоспецифические антитела к диким вирусам полиомиелита как показатель циркуляции этих вирусов на обследуемой территории. // Журн. микробиол. эпидемиол. вирусол. 1997. - № 6. - С.25-30.

31. Сэйбиль В. Б. Две проблемы, возникающие на завершающем этапе ликвидации полиомиелита. // Вопр. вирусол. 2000. - 5. - С. 45-47.

32. Сэйбиль В. Б. Как завершить ликвидацию полиомиелита. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 2. - С. 107-113.

33. Сербии В.И. Клинические варианты, особенности течения и результаты лечения дилятационной кардиомиопатии у детей. // Педиатрия. -1998.-№4.-С.59-58.

34. Слободенюк А.В., Глинских Н.П., Мальчиков И.А., и др. Изучение этиологии внутриутробных вирусных инфекций. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Екатеринбург. - 1993. - С.77-82.

35. Троицкая М.В. Коксаки В инфекция по материалам вирусологических исследований. // Автореферат канд. дисс. М., 1986.

36. Трофимова М.Г., Евстафьева О.А., Бенедиктова Н.Я., и др. Метод получения эритроцитарного полиовирусного иммунодиагностикума для РНГА и РТНГА. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Екатеринбург. -1993. - С.110-115.

37. Трофимова М.Г., Евстафьева О.А., Бенедиктова Н.Я., и др. Изучение чувствмтельности полиовирусного иммунодиагностикума в экспериментально-лабораторных условиях. // Там же. С. 115-120.

38. Трухан Д.И. Состояние гуморального иммунитета к вирусам Коксаки В при заболеваниях поджелудочной железы. // Вопр. Вирусол. 2001. - №2. -С.33-36.

39. Трухан Д.И., Архангельская Э И., Якубовская С.Г., и др. Хронический панкреатит и Коксаки В вирусная инфекция. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. - Екатеринбург. - 1993. - С.123-125.

40. Трухан Д.И., Архангельская Э И., Якубовская С.Г., и др. Противовирусные антитела и особенности клинического течения инсулинзависимого сахарного диабета. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Екатеринбург. - 1993. - С. 125-127.

41. Утницкая О.С., Ерман Б.А., ВенедиктоваН.Я., Колотвинова Е.Г. Биологические особенности штаммов Вируса Коксаки ВЗ, выделенных от больных серозным менингитом. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Свердловск. - 1989. - С.78-83.

42. Хрущева Н.А., Строкова Н.Д., Хаймин В.М. и др. Маркеры вирусного инфицирования при почечной патологии у детей. // Вирусные инфекции. Сборник научных трудов. Екатеринбург. -1993. - С. 120-123.

43. Черкасова Е.А., Липская Г.Ю., Белова Г.И., и др. Обнаружение штаммов вируса полиомиелита в природных изолятах и их идентификация с помощью полимеразной цепной реакции. // Молек. генетика микробиол. вирусол.,. 1996. - № 2. - С.25-32.

44. Широбоков В.П. Роль вирусов Коксаки В в патогенезе нестабильной стенокардии. // Актуал. пробл. мед. вирусол.: мат. научн. конф., поев. 90-летию со дня рожд. М.П. Чумакова, Москва, 23-25 ноября 1999 года. М. - 1999. -С.55.

45. Широбоков В.П., Ншолаенко I. В., Копаниця J1.B. и др. Панель моноклональних антитш для внутршнотипово! дифференциацп полюв1руЫв II типу. // Миеробюл. журн. 1997. - Е.59, № 6. - С. 27-35.

46. Экология энтеровирусов. // Бондаренко В.И., Гирин В.Н., Григорьева Л.В. и др. К.: Здоровья, 1988. - 168 С.

47. Abe О., Kimura Н., Minakami Н. Outbreak of gastroenteritis caused by echovirus type 6 in an orphanage in Japan. // J. Infect. 2000. - V.41(3), Nov. -P.285-286.

48. Abzug M.G.,Loefffelholz M., Rotbart H.A. Diagnosis of neonatal enterovirus infection by poiimerase chain reaction. // J. Pediatrics. 1995. - V.126, № 3. - P.447-450.

49. Agol V. I. The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. // Adv. Virus Res. 1991. - V.40. -P. 103-180.

50. Ahmed A., Brito F., Goto C. et. al. Clinical utility of the poiimerase chain reaction for diagnosis of enteroviral meningitis in infancy. // J. Pediatr. 1997. -V.131, N. 3. -P.393-397.

51. Alexander R., Lamb D., White D. et. al. 'RETCIF': a rapid, sensitive method for detection of viruses, applicable for large numbers of clinical samples. // J. Virol. Met. 2001. - V. 97. - P. 77-85.

52. Amvrosieva TV, Titov LP, Mulders M. et.al. / Viral water contamination as the cause of aseptic meningitis outbreak in Belarus. // Cent. Eur. J. Public. Health. -2001. Vol. 9 (3),Aug. - P. 154-157.

53. Andino, R., Rieckhof, G. E., and Baltimore, D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of polio virus RNA. // Cell. -1990. V.63.-P. 369-380.

54. Andino, R., Rieckhof, G. E., Achacoso, P. L., and Baltimore, D. Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNP complex formed around 5'-end of viral RNA. // Cell. 1993.-N. 12.-P. 3587-3598.

55. Andreoletti L., Bourlet Т., Moukassa D et. al. Enterovirus can persist with or without active replication in cardac tissue of patients with end-stage ischemic or dilated cardiomiopathy. // J. Infect. Dis. 2000. - V. 172, N. 4. - P.1222-1227.

56. Arens M. Methods for serotyping and molecular comparison of human viral genomes. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - V. 12, N. 14. - P. 612-626.

57. Arnold E., Luo M., Vriend G. et. al. Implication of the picornavirus capsid structure for poliprotein processing. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84, Jan.-P. 21-25.

58. Arola A., Santti J., Ruuskanen O., Halonen P., Hyypia T. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. // J. Clin. Microbiol. 1996. - N. 2. - P. 313-318.

59. Arola A., Kallajoki M., Ruuskanen O., Hyypia T. Detection of enteroviral RNA in end-stage dilated cardiomiopathy in children and adolescents. // J. Med. Virol. 1998. - V. 56, N. 4. - P.364-371.

60. Bailly, J.-L., A. M. Borman, H. Peigue-Lafeuille, and К. M. Kean. Natural isolates of ECHO virus type 25 with extensive variations in IRES sequences and different translational efficiencies. // Virology. 1996. - V.215. - P. 83-96.

61. Barton DJ, O'Dorrnell В J, Flanegan JB. 5' cloverleaf in poliovirus RNA is a cis-acting replication element required for negative-strand synthesis. // EMBO J. -2001. V.20, Mar 15, N.6. - P.1439-1448.

62. Basso N.G.S., Fonseca M.E.F., Garcia A.G.P. et. al. Enterovirus isolationfrom fetal and placental tissues. // Acta Virol. 1990. - V. 34, N. 1. - P.49-57.

63. Bellmunt A., May G., Zell R., Pring-AkerblomP. Et. al. Evolution of poliovirus type I during 5.5 years of prolonged enteral replication in an immunodeficient patient. // Virology. 1999. - V. 265, N. 2. - P. 178-184.

64. Bendig J.W.A., Brien P.S.O., Muir P. et. al. Enterovirus sequences resembling Coxsackievirus A2 detected in stool and spleen from a girl with fatalmyocarditis. // J. Med. Virol. 2001. - V.64. - P. 482-486.

65. Berger M.M, Kopp N., Vital C. Detection and cellular localization ofenterovirus RNA sequences in spinal cord patients with ALS. // Neurology. 2000. 1. V.54, N.l. P.20-25.

66. Bourlet Li Y., Andreolettu L., Mosnier J.F. et. al. Enteroviral capcid protein VP1 is present in myocardial tissues from some patients with myocarditis or dilated cardiomyopathy. // Circulation. 2000. - V. 101, N. 3. - P.231-234.

67. Brown B. A., Kilpatrick D. R., Oberste M. S., Pallansch M. A. Serotypespecific identification of enterovirus 71 by PCR. // J. Clin. Virol. 2000. - V. 16, N. 2, Apr.-P. 107-112.

68. Brown В.A. and Pallansch M.A. Complete nucleotide sequence of enterovirus 71 is distinct from poliovirus. // Virus Res. 1995. - V.39, N. 2-3. -P.195-205.

69. Buonagurio D.A., Coleman J.W., Patibandla S.A. et. al. Direct detection of Sabin poliovirus vaccine strains in stool specimens of first-dose vaccines by sensitive reverse transcription-PCR method. // J. Clin. Microbiol. 1999. - N. 2. - P. 283-289.

70. Саго V., Gulliot S., Delpeyroux F., Crainic R. Molecular strategy for 'serotyping' of human enteroviruses. // J. Gen. Virol. 2001. - V.82, N. 1. - P. 7991.

71. Mc Carthy F.M., Smith G.A. and Mattick J.S. Molecular characterization of Australian bovine enteroviruses. // Vet. Microbiol. 1999. - Vol. 68 (1-2). - P. 7181.

72. Caceres V. M. and Sutter R. W. Sabin monovalent oral polio vaccines: review of past experiences and their potential use after polio eradication. // Clin. Infect. Dis. 2001. - V. 33, N. 156,August. - P. 531-541.

73. Chambon M., Archimbaund C., Bailly J.L., et. al. Circulation of enteroviruses and Persistence of Meningitis Cases in the Winter of 1999-2000. // J. Med. Virol. -2001. V.65. -P.340-347.

74. Chang K.H., Auvinen P., Hyypia T. and Stanway G. The nucleotide sequence of coxsackievirus A9: implications for receptor binding and enterovirus classification. // J. Gen. Virol. 1989. - V.70, N.12. - P.3269-3280.

75. Chehadeh W., Weill J., Vantyghem M.C., et.al. Increased level of interferon-alpha in blood of patients with insulin-dependent diabetes mellitus: relationship with coxsackievirus В infection. // J. Infect. Dis. 2000. - V. 181, N. 6. - P.1929-1939.

76. Chimenti C., Calabrese F., Thiene G. Inflammatory left ventricular microaneurysms as a cause of apparently idiopathic ventricular tachyarrhythmias. //

77. Circulation.-2001,-V. 104, N. 2. P.168-173.

78. Chow K.C., Lee C.C., Lin T.Y. et. al. Congenital enterovirus 71 infection: A case study with virology and immunohistochemistry. // Clin. Infect. Dis. 2000. -V. 31(2), Aug.-P.509-512.

79. Chu P.-Y., Lin K.-H., Hwang K.-P. et. al. Molecular epidemiology of enterovirus 71 in Taiwan. // Arch. Virol. 2001. - V.146. - P. 589-600.

80. Coller B.G., Chapman N.M., Beck M. et. al. Echovirus 22 is an atypical enterovirus. // J. Virol. 1990. - N.6. - P. 2692-2701.

81. Dahllund L., Nissinen L., Pulli T. et. al. The genome of echovirus 11. // Virus Res. 1995. - V.35, N. 2. - P.215-222.

82. У 92. Davydova J., Pavcuvweit S., Crombach M. et. al. Detection of viral andbacterial protein in endomiocardial biopsies of patients with inflammatory heart muscle disease? // Herz. 2000. - V. 25, N. 3. - P. 233-239.

83. McDermott BM Jr, Rux AH, Eisenberg RJ, et. al. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. // J. Biol. Chem. 2000. -V.275 (30), Jul. 28. -P. 23089-23096.

84. Dorner A.J., Dorner L.F., Larsen G.R. et. al. Identification of the initiation site of poliovirus poliprotein synthesis. // J. Virol. 1982. - V.61. - P. 986-991.

85. Dunn JJ, Chapman NM, Tracy S, Romero JR. Genomic determinants of cardiovirulence in coxsackievirus B3 clinical isolates: localization to the 5' nontranslated region. // J. Virol. 2000. - V.74, N.10. - P.4787-4794.

86. Dunn J.J., Romero J.R., Wasserman R., Rotbart H.A. Stable enterovirus 5'nontranslated region over a 7-year period in a patient with agammaglobulinemia and chronic infection. // J. Infect. Dis. 2001. - V.182. - P. 298-301.

87. Earle J.A., Skuce R.A., Fleming C.S., et. al. The complete nucleotide sequence of a bovine enterovirus. // J. Gen. Virol. 1988. - V.69, N. 2. - P.253-263.

88. Egger D., Pasamontes L., Ostermayer M., Bienz K. Reverse transcription multiplex PCR for differentiation between polio- and enteroviruses from clinical and environmental samples. // J. Clin. Microbiol. 1995. -N. 6. - P. 1442-1447.

89. Ellis R.W. / Infection and coronary heart disease. // J. Med. Microbiol. -1997. V.46, N.7. - P.535-539.

90. Foray S, Pailloud F, Thouvenot D, et. al. Evaluation of combining upper respiratory tract swab samples with cerebrospinal fluid examination for the diagnosis of enteroviral meningitis in children. // J. Med. Virol. 1999. - V.57, N.2. - P.193-197.

91. Friedrich F. Molecular evolution of oral poliovirus vaccine strains during multiplications for global eradication of poliovirus. // Acta Virol. 2000. - V. 44, N. 4. - P. 109-117.

92. Fujioka S., Kitamura Y., Ukimura A., et. al. Evaluation of viral infection in the myocardium of patients with idiopathic dilated cardiomiopathy. // J. Am. Coll. Cardiol. 2000. - V.36, N. 6. - P. 1920-1926.

93. Gavrilin G.V., Cherkasova E.A., Lipskaya G.Y. et. al. Evolution of circulating wild poliovirus and of vaccine-derived poliovirus in an immunodeficient patient: a unifying model. // J. Virol. 2000. - N.8. - P. 7381-7390.

94. Ghazi F., Hughes P.J., Hyypia Т., Stanway G. /Molecular analysis of human paraecho virus type 2 (formerly echovirus 23).// J. Gen Virol. 1998. - V. 79, N. 11. - P. 2641-2650.

95. Giraud P., Kopp N., Lina В., Chazot G. Amiotrophic lateral sclerosis: a role for enteroviruses.? // Rev. Neurol.(Paris). 2000. -V.156, N. 4. -P. 352-356.

96. Gjoen K.V., Bruu A.L. Specific detection of Coxsackie viruses A by the polimerase chain reaction. // Clin. Diagn. Virol. 1997.-V. 8, N.3. - P. 183-188.

97. Glass R.I., Bresee J., Jiang B. Gastroenteritis viruses: an overview. // Novartis. Found. Symp. 2001. - V. 238. - P. 5-19.

98. Glimaker M., Abebe A., Johansson B. Detection of enteroviral RNA by polimerase chain reaction in faecal samples from patients with aseptic meningitis. // J. Med. Virol. 1992. - V.38, N.l. - P. 54-61.

99. Gratsch Т.Е. and Righthand V.F. Construction of a recombinant cDNA of echovirus 6 that established a persistent in vitro infection. // Virology. 1994. - V. 201, V. 2.-P. 341-348.

100. Grumbach I.M., Heim A., Vonhof S. Coxsackievirus genome in myocardium of patients with arritmogenic right ventricular dysplasia/cardimyophaty. // Cardiology. 1998. - V.89, N.4. - P. 241-245.

101. Gulliot S., Саго V., Cuervo N. et. al. Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. // J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 84348443.

102. Halim S., Ramsingh Al. A point mutation in VP1 of Coxsackievirus B4alters antigenicity. // Virol. 2000. - V. 269, Mar. - P. 86-94.

103. Heim A., Gmmbach I., Hake S. et. al. Enterovirus heart disease of adults: a persistent, limited organ infection in the presence of neutralizing antibodies. // J. Med.Virol. 1997. - V. 53, N. 3. - P. 196-204.

104. Heneine W., Switzer W.M., Bush M. et.al. Molecular sybtyping of human T-cell lymfotropic virus type 2 by single-strand conformation polymorphism analysis. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Dec. - P. 3260-3263.

105. Herold J., Andino R. Poliovirus requires a precise 5' end for efficient y positive-strand RNA synthesis. // J. Virol. 2000. - V.74, Jul., N.14. - P. 6394-6400.

106. Higgins D.G. and Sharp P.M. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. // Gene. 1988. - Vol. 73. - P. 237-244.

107. Huang C.C., Liu C.C., Chang Y.C. et. al. Neurologic complication in children with enterovirus 71 infection. // N. Engl. J. Med. 1999. - V.341 (13), Sep.23. - P. 936-942.

108. Huby-Chilton F., Beveridge I., Gasser R.B., Chilton L.B. Single-strand conformation polymorphism analysis of genetic variation in Labiostrongyl slongispiclaris from kangaroos. // Electrophoresis. 2001. - V. 22. - P. 1925-1929.

109. У 122. Hughes P.J., Evans D.M., Minor P.D. et. al. The nucleotide sequence of atype 3 poliovirus isolated during a recent outbreak of poliomyelitis in Finland. // J. Gen. Virol. 1986. - V. 67, N. 10. -P. 2093-2102.

110. Hughes P.J., North С., Jellis C.H. et. al. The nucleotide sequence of human rhinovirus IB: molecular relationships within the rhinovirus genus. // J. Gen. Virol. -1988.-Vol. 69 (Ptl).-P. 49-58.

111. Hughes P.J., North C., Minor P.D. and Stanway G. The complete nucleotide sequence of coxsackievirus A21. // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70 (Pt 11). - P. 2943-2952.

112. Hyypia Т., Horsnell C., Maaronen M. et. al. A distinct picornavirus group identified by sequence analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. - V.89. - P. 88478851.

113. Inoue Т., Suzuki T. and Sekiguchi K. The complete nucleotide sequence of swine vesicular disease virus. // J. Gen. Virol. 1989. - V. 70, N. 4. - P. 919-934.

114. Jackson, R. J., Howell, M. Т., and Kaminski, A. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA translation. // Tends. Biochem. Sci. 1990. - V. 15. -P. 477-483.

115. Jenkins O., Booth J.D., Minor P.D. and Almond J.W. The complete nucleotide sequence of coxsackievirus B4 and its comparison to other members of the Picornaviridae. // J. Gen. Virol. 1987. - V. 68, N. 7. - P. 1835-1848.

116. Johansen L.K., Morrow C.D. The RNA encompassing the internal ribosome entry site in the poliovirus 5' nontranslated region enhances the encapsidation of genomic RNA. // Virology. 2000. - Vol. 273(2), Aug 1. - P. 391-399.

117. Johansen L.K., Morrow C.D. Inherent instability of poliovirus genomes containing two internal ribosome entry site (IRES) elements supports a role for the IRES in encapsidation. // J. Virol. 2000. - Vol. 74 (18), Sep. - P. 8835-8842.

118. Joki-Korpela P., Roivanen M., Lankinen H. et. al. Antigenic properties of human paraechovirus 1. // J. Gen. Virol. 2000. - V.81, N.7. - P. 1709-1718.

119. Juhela S., Hyoty H., Roivainen M. T-cell responses to enterovirus antigens in children with type 1 diabetes. // Diabetes. 2000. - V.49, N. 8, - P. 1308-1313.

120. Kandolf R., Hofschneider P.H. Viral heart disease. // Springer-Semin. * Immunopatol. 1989. - V.ll, N.l. - P. 1-13.

121. Kawamura N., Kohara M., Abe S. et. al. Determinants in the 5' noncoding Region of Poliovirus Sabin 1 RNA that influence the attenuation phenotype. // J. Virol. 1989. -N. 3. - P. 1302-1309.

122. Kearney M.T., Cotton J.M., Richardson P.J., Shan A.M. Viral myocarditis ^ and dilated cardiomiopathy: mechanisms, manifestations, and management. //

123. Postgrad. Med. J. 2001. - V. 77, Jan. - P. 4-10.

124. Kilpatrick, D. R., B. Nottay, C.-F. Yang e. al. Group-specific identification of poliovirus by PCR using primers containing mixed-base or deoxyinosine residues at positions of codon degeneracy. // J. Clin. Microbiol. 1996. - N. 12. - P. 29902996.

125. Kim G.R., Lee J.S., Jung Y.T., et. al. Nucleotide sequencing of apart of the 5'-noncoding region of echovirus type 9 and rapid virus detection during the acute phase of aseptic meningitis. // Arch. Virol. 1997. - V.142. - P.853-856.

126. Kitamura N.B., Semler P.G., Rothberg G.R. et. al. Primary structure, gene organization and polypeptyde expression of polio virus RNA. // Nature (London). -1981,-V. 291.-P. 547-553.

127. Klemetti P., Hyoty H., Roivainen M. Relation between T-cell responses to glutamate decarboxylase and coxsackievirus B4 in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. // J. Clin. Virol. 1999. - V.14 (2), Oct. - P. 95-105.

128. Klump W.M., Bergmann I., Muller B.C. et. al. Complete nucleotide sequence of infectious Coxsackievirus B3 cDNA two initial 5' uridine residues are regained during plus-strand RNA synthesis. // J. Virol. 1990. - V. 64, N. 4. - P. 1573-1583.

129. Knowlton K.U., Jeon E.S., Berkley N. et. al. A mutation in the puff region of VP2 attenuates the myocarditic phenotype of an infectious cDNA of the Woodruff variant of coxsackievirus B3. //J. Virol. 1996. -V. 70, N.ll. - P. 7811-7818.

130. Konen O., Rathaus V., Bauer S. t. al. Progressive liver calcifications in neonatal coxsackievirus infection. // Pediatr. Radiol. 2000. - V. 30, N. 5. - P. 343345.

131. Kraus W., Zimmermann H., Zimmermann A. et. al. Infectious cDNA clones of echovirus 12 and a variant resistant against the uncoating inhibitor rhodanine differ in seven amino acids. // J. Virol. 1995. - V. 69, N. 9. - P. 5853-5858.

132. Krumbholz A., Dauber M., Henke A. et.al. Sequencing of porcine enterovirus groups II and III reveals unique features of both virus groups. // J. Virol. -2002.-June.-P. 5813-5821.

133. Kuan M.M. Detection and rapid differentiation of human enteroviruses following genomic amplification. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V.35, N.10. - P. 2598-2601.

134. Kuge S. and Nomoto A. Construction of viable deletion and insertion mutants of the Sabin strain of type 1 polio virus. Function of the 5' noncoding sequence viral replication. // J.Virol. 1987. - V. 61. - P. 1478-1487.

135. Kukreja A., Maclaren N.K. Current cases in which epitope mimicry is considered as a component cause of autoimmune disease: immune-mediated (type 1) diabetes. // Cell. Mol. Life. Sci. 2000. - V.57, N.4. - P.534-541.

136. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P. 680-685.

137. La Monica N., Meriam C. and Racaniello V.R. Mapping of sequences required for mouse neurovirulence of Poliovirus type 2 Lansing. // J. Virol. 1986. -V. 57.-P. 515-525.

138. Lee W.M., Wang W. and Rueckert R.R. Complete sequence of the RNA genome of human rhinovirus 16, a clinically useful common cold virus belonging to the ICAM-1 receptor group. // Virus Genes. 1995. - V. 9 (2). - P. 177-181.

139. Lindberg A.M., Johansson S. and Anderson A. Echovirus 5: infectious transcripts and complete nucleotide sequence from uncloned cDNA. // Vims Res. -1999.-V. 59, N. 1.-P. 75-87.

140. Lindberg A.M. and Polacek C. Molecular analysis of the prototype coxsackievirus B5 genome. // Arch. Virol. 2000. - V.145, N. 2. - P. 205-221.

141. Lindberg A.M., Stalhandske P.O. and Petterson U. Genome of coxsackievirus B3. // Virology. 1987. - V. 156, N. 1. - P.50-63.

142. Liu C.C., Tseng H.W., Wang S.M. et. al. An outbreak of enterovirus 71 infection in Taiwan, 1998: epidemiologic and clinical manifestation. // J. Clin Virol. -2000. V. 17, N. l.-P. 23-30.

143. Liu H.M., Zheng D.P., Zhang L.B. et. al. Molecular evolution of a type 1 wild-vaccine poliovirus recombinant during widespread circulation in China. // J.Virol. 2000. - V. 74, N. 12.-P. 11153-11161.

144. Martin J., Dunn G., Hull R. et. al. Evolution of the Sabin strain of type 3 poliovirus in an immunodeficient patient during the entire 637-day period of virus excretion. // J. Virol. 2000. - N. 4. - P. 3001-3010.

145. Martin J., Ferguson G.L., Wood D.J. and Minor P.D. The vaccine origin of the 1968 epidemic of type 3 poliomyelitis in Poland. // Virology. 2000. - V. 278, N.l. - P. 42-49.

146. Martino T.A., Tellier R., Petric M. et. al. The complete consensus sequence of coxsackievirus B6 and generation of infectious clones by long RT-PCR. // Virus Res. 1999. - V.64, N. 1. - P. 77-86.

147. Mc Minn P., Lindsay K., Perera D. et. al. Phylogenetic analysis of enterovirus 71 strains isolated during linked epidemic in Malaysia, Singapore, and Western Australia. // J. Virol. 2001. - N. 8. - P. 7732-7738.

148. Melchers Willem J.G., Zoll J., Galama Jochem M.D. Persistence of enteroviruses in dilated cardiomyopathy: Determination by PCR. // J. Cell. Biochem. -1991. Suppl.l5e.-P. 89.

149. Melnick J.L. Enteroviruses: Polioviruses, coxsakieviruses, echoviruses and newer enteroviruses. // In "Virology". Edited by B. N. Fields, Eds. Raven Press. New York. 1990. -2nd ed. - P. 549-605.

150. Mena I., Fischer C., Gebhard J.R. et. al. Coxsackievirus infection of the pancreas: evaluation of receptor expression, pathogenesis, and immunopathology. // Virology. 2000 . - V.271 (2), Jun. - P. 276-288.

151. Meqdam M. M., Khalousi M.M., Al-Shurman A. Enteroviral meningitis in Northern Jordan: prevalens and association with clinical findings. // J. Med. Virol. -2002. -V. 66. P. 224-228.

152. Minor P.D. Eradication of polio by vaccination. 11 Virol. 2000. - Vol. 268. -P. 231-232.

153. Minor P.D. The molecular biology of poliovaccines. // J. Gen. Virol. -1992.-V.73.-P. 3065-3077.

154. Minor P. D., Schild G. C., Bootman J. Location and a primary structure of a major antigenic site for poliovirus neutralization. // Nature. 1983. - Vol. 304. - P. 674-679.

155. Muir P., Kammerer U., Korn K. et. al. Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements. The European Union Concerted Acting on Virus Meningitis and Encephalitis. // Clin. Microbiol. Rev. 1998. - V. 11, N. 1. - P. 202-227.

156. Muir P., Ras A., Klapper P.E., et. al. Multicenter quality assessment of PCR methods for detection of enterovirus. // J. Clin. Microbiol. 1999. - N. 5. - P. 14091414.

157. Najarian R., Caput D., Gee W. et. al. Primary structure and gene organization of human hepatitis A virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985. - V. 82.-P. 2627-2631.

158. Nairn C., Clements G.B. A study of enterovirus isolation in Glasgow from 1977 to 1997. //J. Med. Virol. 1999. - V. 58. - P. 304-312.

159. Newcombe J., Dyer S., Blackwell L. et.al. PCR-Single-Stranded Conformational Polymorphism Analysis for Non-Culture-Based Subtyping of Meningococcal Strains in Clinical Specimens. // J. Clin. Microbiol. 1997. - July. -P. 1809-1812.

160. Nomoto A. N., Kitamura F., Golini F. and Wimmer. The location of the polio genome protein in viral RNA and its implication for RNA synthesis. // Nature (London). 1997. -V. 268. P. 208-213.

161. Oberste M.S , Maher K., Kilpatrick D.R., Pallansch M.A. Molecular Evolution of the Human Enteroviruses: Correlation of Serotype With VP1 Sequence and Application to Picornavirus Classification. // J. Virol. 1999. - V.73, N. 3 - P. 1941-1948.

162. Oberste M.S., Maher K. and Pallansch M.A. Molecular phylogeny of all human enterovirus serotypes based on comparison of sequences at the 5' and of the region encoding VP2. // Virus. Res. 1998. - V. 58 (1-2), Nov. - P. 35-43.

163. Oberste M.S., Maher K. and Pallansch M.A. Complete sequence of echovirus 23 and its relationship to echovirus 22 and other human enteroviruses. // Virus Res. 1998. - V. 56, N. 2. - P. 217-223.

164. Otonkoski Т., Roivainen M., Vaarala O. et. al. Neonatal Type I diabetes associated with maternal echovirus 6 infection: a case report. // Diabetologia. 2000. - V.43, N.10. - P. 1235-1238.

165. Palacio A., Duran-Vila N. Single-strand conformation polymorphism ^ (SSCP) analysis as a tool for viroid characterization. // J. Virol. Meth. 1999. - У.11.-P. 27-36.

166. Palasios P.G., Cisterna D., Freire M.C., Cello J. RT-nested PCR for the detection of enterovirus in biological samples from patients with suspected enteroviral infections. // Rev. Argent. Microbiol. 2000. - V.32, N. 4. - P. 165-72.

167. Palmenberg A. C. Picornaviral processing: some new ideas. // J. Cell. Biochem. 1987. -V. 33. - P. 191-198.

168. Pancuweit S., Portig I., Eckchardt H. Prevalence of viral genome in endomiocardial biopsies from patients with inflammatory heart muscle disease. // Herz. 2000. - V. 25, N. 3. - P. 221-226.

169. Pauscchinger M., Doerner A., Kuechl U. Enteroviral RNA replication in the myocardium of patients with left ventricular dysfunction and clinically suspected myocarditis. // Circulation. 1999. - V. 99, N. 7. - P. 889-895.

170. Peigue-Lafeuille H., Croquez N., Laurichesse H. et. al. Enterovirus meningitis in adults in 1999-2000 and evaluation of clinical management. // J. Med. Virol. 2002. - V. 67. - P. 47-53.

171. Pelletier, J., and Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. // Nature. -1988.-V. 334.-P. 320-325.

172. Pelletier J. Kaplan G., Racaniello V. R., Sonenberg N. Translational efficiency of poliovirus mRNA: mapping inhibitory c/.s-acting elements with the 5' noncoding region. // J. Virol. 1988. -V. 62, No. 7. - P. 2219-2227.

173. Pevear D.C., Oh C.K., Cunningham L.L. et. al. Localization of genomic regions specific for attenuated, mouse-adapted poliovirus type 2 strain W-2. // J. Jen. Virol. 1990. -V. 71. - P. 43-52.

174. Petitiean J., Kopeca H., Freymurth F. et. al. Detection of enteroviruses in endomiocardial biopsy by molecular approach. // J. Med. Virol. 1992. - V.l, N. 2. -P. 76-72.

175. Pilipenko E.V., Gmyl A.P., Maslova S.V. et. al. Procaryotic-like cis elements in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. // Cell. 1992. - V. 68. - P. 119-131.

176. Pinto G.G.A., Da Silva G.B.N., Ferreira E.M. et. al. Congenital ECHO virus infection morphological and virological study of fetal and placental tissue. // J. Patol. - 1990. - V.160, N.2. - P. 123-127.

177. Pollard S.R., Dunn G., Cammack N. et. al. Nucleotide sequence of aneurovirulent variant of the type 2 oral poliovirus vaccine. // J. Virol. 1989,- N. 11. p. 4949-4951.

178. Portolani M., Pecorari M., Pietrosemoli P. Outbreak of aseptic meningitis by echo 4: prevalence of clinical cases among adults. // New Microbiol. 2001. - V. 24,N. l.-P. 11-15.

179. Poyry Т., Hyypia Т., Horsnell C. et. al. Molecular analysis of coxsackievirus 16 reveals a new genetic subgroup of enteroviruses. // Virology. -1994.-V. 202.-P. 982-987.

180. Poyry Т., Kinnunen L., Hovi Т., Hyypia T. Relationships between simian and human enteroviruses. // J. Gen. Virol. 1999. - V. 80. - P. 635-638.

181. Pulco P. R., Khatib R., Barientes S et. al. Detection of all 6 Coxsackievirus serotypes by polimerase chain reaction. // J. Cell. Biochem. 1991. - Suppl. 15. - P. 197.

182. Racaniello V.R., Baltimore D. Molecular cloning of poliovirus cDNA and determination of the nucleotide sequence of the viral genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78, N. 8. - P. 4887-4891.

183. Read S.J., Kurtz J.B. Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by single multiplex PCR assay. // J. Clin. Microbiol. -1999. N. 11.-P. 1352-1355.

184. Reetoo K.N., Osman S.A., Illavia S.J. et. al. Development and evaluation of quantitative-competitive PCR for quantitation of coxsackievirus B3 RNA in experimentally infected murine tissues. // J. Virol. Meth. 1999. - V. 82. - P. 145156.

185. Reina J., Ballesteros F., Munar M. et. al. Evaluation of different clinical samples and cell lines in the isolation of enterovirus in pediatric patients., // Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 2000. - V.18, N. 3. - P. 116-119.

186. Rivera V. M., Welsh J. D., and Maizel J. V. Comparative sequence analysis of the 5* noncoding region of the enteroviruses. // Virology. 1988. -V. 165. - P. 42-50.

187. Robinson C.C., Willis M, Meagher A. et. al. Impact of rapid polymerase chain reaction results of management of pediatric patients with enteroviral meningitis. // Pediatr Infect. Dis. 2002. - V. 21. - P. 283-286

188. Roivanen M., Viik-Kajander M., Palusuo T. Infections, inflammation and risk of coronary heart disease. // Circulation. 2000. - V.101, N. 3, Jan. - P. 252257.

189. Rotbart H.A. Enzymatic RNA amplification of the enteroviruses. // J. Clin. Microbiol. 1990. - N. 3. - P. 438-442.

190. Rotbart H.A., Kinsella J.P., Wasseman R.L. Persistent enterovirus infection in culture-negative meningoencephalitis: demonstration by enzymatic RNA amplification. // J. Infect. Diseases. 1990. - V.161, N. 4. - P.787-791.

191. Rueckert R. R. and Wimmer E. Systematic nomenclature of picomavirus proteins. // J. Virol. 1984. - V. 50. - P. 957-959.

192. Rueckert R. R. Picornaviridae: the viruses and their replication. // In "Virology". Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley. Philadelphia: Lippincott-Raven. Press 1996. - P. 609-654.

193. Ryan M.D., Jenkins О., Hughes P.J. et. al. /The complete nucleotide sequence of enterovirus type 70: relationships with other members of the Picornaviridae. // J. Gen. Virol. 1990. - V. 71, N. 10. - P. 2291-2299.

194. Samuel D., Megson В., Strang M., Appleton H. A microtitre plate method for isolation and typing of poliovirus using a blue-cell ELISA. / J. Virol. Methods. -2000. -V. 90 (2), Nov. P. 125-133.

195. Savolainen C., Hovi Т., Mulders M.N., et. al. Molecular epidemiology of echovirus 30 in Europe: succession of dominant sub lineages within a single major genotype. //Arch. Virol. -2001. V. 146. - P. 521-537.

196. Schmidtke M., Selinka H., Heim A. et. al. Attachment of coxsackievirus B3 variants to various cell lines: mapping of phenotypic differences to capsid protein VP1. // Virology. 2000. - V. 275, N. 1. - P. 77-88.

197. Schneider- Schaulies J. Cellular receptors for viruses: links to tropism and pathogenesis. //J. Gen. Virol. 2000. - V.81. -P. 1413-1429.

198. Shen S., Desselberger U., Mc Kee T.A. The development of an antigen capture polimerase chain reaction assay and type human enteroviruses. // J.Virol. Methods-1997. V. 65, N. l.-P. 139-144.

199. Siafakas N., Geogopoulou A., Markoulatos P. Molecular detection and identification of an enterovirus during an outbreak of aseptic meningitis. // J. Clin. Labor. Anal. 2001. - V. 15. - P. 87-95.

200. Sole M.J., Butany J.W., Chia W.K. et. al. Detection of enterovirus RNA in myocardial biopsies from patients with myocarditis and cardiomyopathy using gene amplification by polimerase chain reaction. // Circulation. 1990. - V. 82, N. l.-P. 8-16.

201. Stanway G., Cann A.J., Hauptmann R. et. al. The nucleotide sequence of poliovirus type 3 Leon 12ajb comparison with poliovirus type 1. // Nucl. Acid. Res.1983. -V. 11, N. 16. P. 5629-5628.

202. Stanway G., Hughes P.J., Mountford R.C. et. al. The complete nucleotide sequence of a common cold virus: Human rhinovirus 14. // Nucleic Acids Res.1984. -Y.12. P. 7859-7875.

203. Stanway G., Joki-Korpela P., Hyypia T. Human paraechoviruses-biology and clinical significance. //Rev. Med. Virol. 2000. - V. 10, N.l. - P. 57-69.

204. Straub Т. M., Pepper I. L., Abassadegan M., Gebra C. A method to detect enteroviruses in sewage sludge-amended soil using the PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, N. 3. - P. 1014-1017.

205. Supanaranond K., Takeda N. and Yamazaki S. The complete nucleotide sequence of a variant of Coxsackievirus A24, an agent causing acute hemorrhagic conjunctivitis. // Virus Genes. 1992. - V. 6, N. 2. - P. 149-158.

206. Svitkin Y.V., Maslova S.V., Agol V.I. The genomes of attenuated and virulent poliovirus strains differ in their in vitro translation efficiencies. // Virology.1985.-V. 147.-P. 243-252.

207. Takeda N., Kuhn R. J., Yang C. F. et. al. Initiation of poliovirus plus-strand RNA synthesis in a membrane complex of infected HeLa cells. // J. Virol. 1986. -V. 60, N. 1, Oct. - P. 43-53.

208. Terletskaia-Ladwig E, Metzger C, Schalasta G, Enders G. A new enzyme immunoassay for the detection of enteroviruses in faecal specimens. // J. Med. Virol. 2000. -V. 60,N. 4. -P. 439-445.

209. Teterina N.L., Egger D., Bienz K. et.al. / Requirements for assembly of poliovirus replication complexes and negative-strand RNA synthesis. // J. Virol. -2001. V. 75, Apr., N. 8. - P. 3841-3850.

210. Thompson S. R., Sarnow P. Regulation of host cell translation by viruses and effects on cell function. // Current Opinion in Microbiol. 2000. - V. 3. - P. 366370.

211. Thoren A., Robinson A., Maquire T. et. al. Two-step PCR in retrospective diagnosis of enteroviral viremia. // Scand. J. Infect. Diseases. -1992. V. 24, N.2. -P. 137-141.

212. Toyoda H., Nicklin M. J. H., Murray M. G. et. al. A second Virus encoded proteinase involved in proteolytic processing of poliovirus poliprotein. // Cell. -1986. -V. 45, N. 6. P. 761-770.

213. Toyoda H., Kohara M., Kataoka et. al. Complete nucleotide sequences of all three poliovirus serotype genomes: Implication for relationship? Gene function and antigenic determinants. // J. Mol. Biol. 1984. - V. 174. - P. 561-585.

214. Trallero G., Casas I., Tenorio A. et. al. Enteroviruses in Spain: virological and epidemiological studies over 10 years (1988-97). // Epidemiol. Infect. 2000. -V. 124 (3), Jun. -P. 497-506.

215. Trono D., Andino R., Baltimore D. An RNA sequence of hundreds of nucleotides at the 5' end of poliovirus RNA is involved in allowing viral protein synthesis. // J. Virology. 1988. - N. 7. - P. 2291-2299.

216. Trono D., Pelletier J., Sonenberg N., Baltimore D. Translation in mammalian cells of a gene linked to the poliovirus 5' noncoding region. // Science. -1988. V. 241, Jul. - P. 445-448.

217. Tsai H.P., Kuo P.H., Liu C.C., Wang J.R. Respiratory viral infections among pediatric inpatients and outpatients in Taiwan from 1997 to 1999. // J. Clin. Microbiol. 2001,-V. 39,N.1.-P. 111-118.

218. Vance L.M., Moscufo N., Chou M., Heinz B.A. Poliovirus 2C region functions during encapsidation of viral RNA. // J. Virol. 1997. - V. 71, N. 11. - P. 8759-8765.

219. Vreugdenhil G.R., Schloot N.C., Hoorens A. et. al. Acute onset of type I diabetes mellitus after severe echovirus 9 infection: putative pathogenic pathways. Clin. Infect. Dis. 2000. - V.31(4), Oct. - P. 1025-1031.

220. Wang Y.M., Ray S.C., Laeyendecker O. Et. al. Assessment of hepatitis С virus sequence complexity by electro phoretic mobilities of both single- and double-strand DNAs. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Oct. - P. 2982-2989.

221. Weiss L.M., Movahed L.A., Billingham M.E., Cleary M.L. Detection of coxsackievirus B3 in myocardial tissues by the polymerase chain reaction. // American Journal of Pathol. 1991. - V. 138, N. 2. - P. 497-503.

222. Wells V. R., Plotch S. J., DeStefano J. J. Determination of the mutation rate of poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. // Virus. Res. 2001. - Vol. - 74 (12), Apr.-P. 119-132.

223. Why H. Enteroviruses and myocarditis. // Br. J. Hosp. Med. 1995. - V. 53,N. 9. -P. 430-434.

224. Willian S., Tracy S., Chapman N. et. al. Mutations in a conserved enteroviral RNA oligonucleotide sequence affects positive strand viral RNA synthesis. // Arch. Virol. 2000. - V.145, N.10. - P. 2061-2086.

225. Wood D.J., Hull B. L20B cells simplify culture of polioviruses from clinical samples.// J. Med. Virol. 1999. - V. 58, N. 2. - P. 188-192.

226. Yan J.-J., Su I.-J., Chen P.-F. et. al. Complete Genome Analysis of Enteroviruses 71 Isolated from an Outbreak in Taiwan and Rapid Identification of

227. Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 by RT-PCR. // J. Med. Virol. 2001. - V. 65, N. 2. -P. 331-339.

228. Yang C.F., De Lina, Holloway B.P. et. al. Detection and identification of > vaccine-related polioviruses by the polymerase chain reaction. // Virus Research.1991.-V. 20.-P. 159-179.

229. Zhang G., Wilsden G., Knowles N.J. and Mc Cauley J.W. Complete nucleotide sequence of a coxsackie B5 virus and its relationship to swine vesicular disease virus. //J. Gen. Virol. 1993. -V. 74 (Pt 5). - P. 845-853.

230. Zimmermann H., Eggers H.J., Zimmermann A., Kraus W. and Nelsen-Salz B. Complete nucleotide sequence and biological properties of an infectious clone of prototype echovirus 9. // Virus Res. 1995. - V. 39, N. 2-3. - P. 311-319.

231. Zimmermann H., Eggers H.J. and Nelsen-Salz B. Molecular cloning and sequence determination of the complete genome of the virulent echovirus 9 strain Barty. // Virus Genes. 1996. - V. 12, N. 2. - P. 149-154.У

Информация о работе

Голицына, Людмила Николаевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2003
ВАК 03.00.06

Диссертация

Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы