Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71-го типа на территории Российской Федерации

Ахмадишина, Людмила Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71-го типа на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71-го типа на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

ОІАіїса^и^-

Ахмадишина Людмила Васильевна

Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71 типа на территории Российской Федерации

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 ¿1113

Москва-2013

005543871

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Лукашев Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ФБУН «Санкт-Петербургский

Бичурина

Манна Александровна

научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», заведующая лабораторией

кандидат медицинских наук, ФБУН «Центральный

Подколзин

Александр Тихонович

научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет.

Защита диссертации состоится 27 декабря 2013 года в 14 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 001.026.01 при ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН по адресу: 142782, город Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км. Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН.

Автореферат разослан ноября 2013 года.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук

В.Н. Ляпустин

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Энтеровирус 71 типа (ЭВ71) является наиболее патогенным неполиомиелитным энтеровирусом человека. Энтеровирус 71 типа способен вызывать эпидемии ящуроподобного заболевания (ЯПЗ) сопровождающегося тяжелыми неврологическими осложнениями с летальным исходом. Наибольший риск тяжелого течения нейроинфекции отмечен у детей до 5 лет.

Основными эндемичными странами по заболеваемости ЭВ71-инфекцией являются страны Азиатско-Тихоокеанского региона (АТР). За последние 15 лет, вызванные ЭВ71, эпидемии ЯПЗ, протекавшего с поражением ЦНС, регистрировали в Малайзии, Тайване, в Сингапуре, Таиланде, Японии и во Вьетнаме. В Китае на протяжении 2007-2011 годов ежегодно регистрировали от 200 тысяч до нескольких миллионов больных ЯПЗ. Во время вспышек у части пациентов с ЯПЗ (от 100 до 900 случаев ежегодно) наблюдали развитие неврологических осложнений, таких как энцефаломиелит, спинальный полиомиелит, серозный менингит, приводивших к смерти. Основной причиной эпидемий ЯПЗ, сопровождавшегося поражением ЦНС и смертью пациентов в последние годы был ЭВ71 субгенотипа С4, который условно рассматривают как «азиатский» субгенотип. В странах АТР для надзора за ЭВ71 были выстроены эффективные санитарно-эпидемиологические службы, идет разработка лекарственных препаратов и вакцин.

В Европе в 1970-е годы произошли две вспышки ЭВ71 нейроинфекции, в 1975 году в Болгарии и в 1978 году в Венгрии. Во время вспышек были зарегистрированы десятки случаев смерти среди детей. За последние 35 лет на территории европейских стран было выявлено только 2 случая ЭВ71-нейроинфекции с летальным исходом и спорадические случаи инфекции, которые заканчивались выздоровлением. В основном, в Европе наблюдали бессимптомную циркуляцию вируса, определяемую по

наличию антител у здорового населения и по выделению ЭВ71 из материалов от людей. В Европе наблюдение за распространением ЭВ71 проводится в рамках общей программы по надзору за циркуляцией энтеровирусов. В соответствии с этой программой установлено, что в Европе циркулируют, так называемые «европейские» субгенотипы ЭВ71 -С1 и С2.

В России информация о циркуляции и эпидемиологии ЭВ71 отсутствует. Наблюдение за циркуляцией всех известных серотипов ЭВ в РФ происходит в рамках программы по надзору за искоренением полиомиелита и в рамках программы по надзору за неполиомиелитными энтеровирусами. Таким образом, непосредственного надзора за ЭВ71 в России не ведется. Учитывая эпидемиологическую ситуацию в отношении ЭВ71-заболеваемости в Китае, была очевидна необходимость проведения исследований по изучению циркуляции ЭВ71 на территории РФ, особенно на территории Хабаровского края, пограничного с Китаем.

Цель работы: изучение циркуляции и сероэпидемиологии энтеровируса 71 типа на территории Российской Федерации.

Задачи:

1. Изучить российские изоляты ЭВ71 и создать коллекцию штаммов ЭВ71 для их дальнейшего изучения.

2. Изучить филогенетические взаимоотношения российских и зарубежных изолятов ЭВ71 на основе анализа нуклеотидной последовательности генома, кодирующего белок УР1:

2.1. определить нуклеотидную последовательность генома, кодирующего белок \Ф1, для российских изолятов ЭВ71;

2.2.генотипировать российские штаммы ЭВ71;

2.3.проанализировать филогенетические взаимоотношения российских изолятов ЭВ71 в сопоставлении с последовательностями ЭВ71 из других стран, зарегистрированными в базе данных СепВапк.

3. Подобрать субгенотип ЭВ71 для реакции нейтрализации с целью изучения популяционного иммунитета среди здоровых детей до 5 лет.

4. Изучить сероэпидемиологию ЭВ71 в Российской Федерации путем исследования уровня нейтрализующих антител к ЭВ71 в сыворотках крови здоровых детей в возрасте 1-5 лет в шести регионах (Московская область, Ростовская область, Свердловская область, республика Тыва, Якутия, Хабаровский край).

Положения, выносимые на защиту

1. По данным вирусологического и серологического исследования установлено, что энтеровирус 71 типа широко распространен на территории РФ.

2. Показано, что доля серопозитивных лиц среди здоровых детей 1-2 лет в регионах Российской Федерации колебалась от 5% в Ростовской области до 20% в республике Тыва. Доля серопозитивных лиц среди детей от 3 до 5 лет варьировала от 22-25% в Московской, Свердловской и Ростовской области, до 41-45% в Якутии и Хабаровском крае, и до 83% в республике Тыва.

3. Максимальная доля серопозитивных лиц среди детей была выявлена в Якутии и республике Тыва, что может быть связано с различиями в социально-бытовых условиях проживания населения в разных регионах России. Также высокая доля серопозитивных лиц среди здоровых детей 35 лет наблюдалась в Хабаровском крае, что может быть обусловлено высокой интенсивностью контактов с Китаем.

4. Установлено, что с 2000 по 2010 год на территории РФ преобладали субгенотипы С1 и С2 ЭВ71, а в 2009 году был впервые выделен и с 2011 года доминирует субгенотип С4. По данным молекулярно-

эпидемиологического исследования имели место многократные заносы ЭВ71 в РФ. Наиболее близкородственные российским изолятам вирусы субгенотипов С1 и С2 выделены в Европе, субгенотипа С4 - в Китае.

5. В мае-июне 2013 года в Ростове-на-Дону произошла первая в России вспышка нейроинфекции, вызванная ЭВ71 субгенотипа С4.

Научная новизна работы

Показано, что в 2000-2010 годах в России преобладали субгенотипы С1 и С2 энтеровируса 71 типа, филогенетически наиболее близкие к европейским вариантам энтеровируса 71, а с 2011 доминировал субгенотип С4, филогенетически близкий к генотипам ЭВ71, циркулирующим в Китае.

Впервые выделен российский ЭВ71 штамм №13689 от случая острого вялого паралича в Москве, определена его полногеномная последовательность и создан рабочий банк вируса.

Впервые показано, что ЭВ71 широко циркулировал на территории Российской Федерации среди детей дошкольного возраста еще в 2007-2008 гг., однако первая вспышка ЭВ71-нейроинфекции среди детей была зарегистрирована только в 2013 году в Ростове-на-Дону.

Практическая значимость работы

Впервые получены российские изоляты ЭВ71, для них определена нуклеотидная последовательность полного участка генома, кодирующего белок УР1. Создана коллекция российских штаммов ЭВ71 для использования в качестве референсных штаммов при разработке диагностических тест-систем.

Определен уровень популяционного иммунитета среди населения в шести регионах Российской Федерации (Московская область, Ростовская область, Свердловская область, республика Тыва, Якутия, Хабаровская область).

Проведено молекулярно-эпидемиологическое изучение первой в России вспышки ЭВ71, возникшей в 2013 году в Ростовской области, и показано, что причиной вспышки были представители ЭВ71 субгенотипа С4.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на VII Всероссийской научной конференции «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010 г.), на международной конференции "Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, 2013), на Пятом европейском вирусологическом конгрессе (5'h European Congress of Virology, 2013, Lyon).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 93 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 105 источников. Диссертационная работа иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками.

Собственные исследования Материалы исследования

Впервые были исследованы 27 штаммов ЭВ71, выделенных на территории РФ и стран СНГ с 2000 по 2013 год. Материалы для изучения были любезно предоставлены Ивановой O.E. (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

На первом этапе работы были изучены 30 сывороток крови здоровых детей и 20 сывороток взрослых лиц из г. Хабаровск, использованные для подбора генотипа (штамма) ЭВ71 для исследования сероэпидемиологии ЭВ71 на территории РФ. Сыворотки были любезно предоставлены Троценко О.Е (ХНИИЭМ Роспотребнадзора).

Были исследованы 842 сыворотки крови здоровых детей в возрасте 15 лет из шести регионов РФ (Московская область, Ростовская область, Свердловская область, республика Тыва, Якутия, Хабаровский край) на наличие антител к ЭВ71 субгенотипа С2. Возрастные рамки выборки были определены исходя из того, что наиболее тяжелые осложнения и летальные исходы происходят именно среди детей 1-5 лет. Все изученные пробы сывороток крови здоровых детей были разделены на две группы в соответствии с возрастом детей: первая группа - дети 1-2 лет и вторая группа - дети 3-5 лет. Сыворотки крови детей были любезно предоставлены Михайловым М.И. (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

Также мы исследовали 151 сыворотку крови, полученную от здоровых детей в возрасте 1-14 лет из Хабаровска и Хабаровского края - города Комсомольск-на-Амуре, на предмет различия доли серопозитивных лиц среди населения городов Хабаровского края. Сыворотки были любезно предоставлены Троценко O.E. (ХНИИЭМ Роспотребнадзора).

Методы исследования.

Для типирования неполиомиелитных энтеровирусов при помощи молекулярного типирования была использована ПЦР полувложенного типа со специфическими праймерами к последовательности генома, кодирующей белок VP1 (метод Nix 2006). После получения результатов о типовой принадлежности вирусов были выбраны штаммы ЭВ71 и определена нуклеотидная последовательность фрагмента генома, кодирующего белок VP1 (891 нт). Для этого была использована ПЦР со

специфическими праймерами к последовательности генома, кодирующей белок VP1 (Табл. 1, 2).

Таблица 1. Последовательность праймеров для определения последовательности полного фрагмента генома ЭВ71, кодирующего белок УР1.

Название Последовательность

VP3F GCG ССС AAY АСА GCY TAY ATA ATA GCA

2AR TGG CGA GRT GRC GRT TRA CCA CTC T

Таблица 2. Программа ПЦР для определения нуклеотидной последовательности фрагмента генома ЭВ71, кодирующего белок УР1.

Температурный режим Длительность этапа ПЦР Количество циклов

95 °C 5 мин 1

95 °C 15 сек 40

55 °C 30 сек

72 °C 30 сек

72 °C 5 мин

Препаративный электрофорез проводили в 1% геле из легкоплавкой агарозы («Fermentas», low melting) на трис-ацетатном буфере. После электрофореза полосу геля, содержащую нужный фрагмент, вырезали. Ампликоны выделяли из агарозного геля при помощи набора «QIAquick» gel extraction kit (фирмы "Qiagen"). Определение нуклеотидной последовательности проводили при помощи реагентов BigDye 3 на секвенаторе Applied Biosystems 3100.

Затем были определены филогенетические взаимоотношения штаммов ЭВ71, изученных нами и доступных в GenBank, с использованием программы Mega 5.0.

Для определения наиболее подходящего генотипа ЭВ71 для изучения сероэпидемиологии, для определения доли серопозитивных лиц к ЭВ71 в

шести регионах РФ, а затем и доли серопозитивных лиц в Хабаровске и Комсомольске-на-Амуре была использована реакция нейтрализации инфекционности. Исследование проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным ВОЗ для определения антител к вирусу полиомиелита.

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась при помощи теста Фишера с использованием программы GraphPad Prizm 4.0.

Результаты и обсуждение Молекулярная эволюция ЭВ71.

Для 27 штаммов ЭВ71 из России и стран СНГ была определена нуклеотидная последовательность участка генома, кодирующего белок VP1. Из базы данных GenBank было выбрано по одной нуклеотидной последовательности в области генома VP1 каждого генотипа и по 1-2 последовательности, наиболее близких к изученным нами штаммам при анализе по нуклеотидной последовательности алгоритмом BLAST. Полученные штаммы ЭВ71 из РФ и СНГ выделены большим шрифтом, указаны страна и год выделения (Рис.1).

Таким образом, с 2000 по 2010 год на территории РФ циркулировали субгенотипы С1 и С2 ЭВ71, а в 2009 году был впервые выделен и с 2011 года доминирует субгенотип С4. Наиболее близкородственные российским изолятам вирусы субгенотипов С1 и С2 выделены в Европе, субгенотипа С4 - в Китае. Анализ филогенетических взаимоотношений штаммов ЭВ71, выделенных в РФ, указывает на многократные заносы вируса, вероятнее всего из стран Европы (генотипы С1 и С2) и из Китая (генотип С4). К сожалению, выборка ЭВ71, полученная за 10 лет наблюдения за случаями острого вялого паралича и серозного менингита в РФ и СНГ, весьма небольшая, и не позволяет оценить длительность циркуляции вируса в РФ после каждого заноса. Несомненно, что для достоверного анализа циркуляции ЭВ71 на территории РФ плотность энтеровирусного надзора должна быть увеличена как минимум на порядок.

,-34020 RUS 2009 P—45890 UKR 2012 fC4Í464 RUS 2011 L38555 KGZ 2010

.— AB524244 NLD ZOOS

Г,—46175 RUS 2013

.-H0676183 SBR 2010

tC 43959 RUS 2012

-HE573001 FRA 2010

■FN649262 SER 2007

L32896 RUS 2008

FN598767 FUA 2007 — F7824736 FRA 2008 FN598748 FRA 200«

r40190 RUS 2010 sf44858 RUS 2012

I-FN649259 SER 2007

f-31832 RUS 2008 l" 37731 UKR 2010

^Л_Нв676282 NLD 2010

-29256 RUS 2007

J—AM9395S5 SBR 1999 I—AF376108 AUS 1999 —AB524276 NLD 1999

EAF135950 USA 1998 AF135943 USA 1997

13689 RUS 2001

-AB213614 3PN 1998

kAF135947 AUS 1997 1-AF135948 AUS 1995

-A8213628 Л« 2001

-AY125966 KOR 2000

-AF135944 CAN 1991

WJ-AF376098 AUS 2000

I-HQ676233 LVA 2003

—AF376120 SGP 1998 __AM939594 SBR 2000

-27578 RUS 2007

-FN649248 SER 2003 -AB524188 NLD 2004 ,FN649264 SER 2008

.42404 AZE 2011

_I—AM490142 VNM 2005

SI-EF063152 TON 2006

AF286531 TON 1998 AB115493 CHN 2000 «5676189 JAP 2000

F3151502 THA 2008

mi-AS it

-A8U5491 CHN 2000

-AY465356 CHN 2003

HM21243B CHN 2009 -HM212449 CHN 2008

Ж Ш

2013

_________2013

42720 RUS 2013 34938 RUS 2009 -44854 RUS 2012 43374 RUS 2012 44724 RUS 2012 44987 RUS 2012

10766173 CHN 2008 3N205807 CHN 20И JS326302 CHN 2009 -SU366191 CHN 2009

1!r 42266 RUS 2011

«JÍ-3F937667 CHN 2010 ¡1-30804832 CHN 2010

1—41785 RUS 2011

-3N256068 CHN 2010 HQ694985 CHN 2008 30766131 CHN 2011

-42934 KAZ 2012 44213 UZB 2011

-AB204852 Brtr USA 1970

r—307 hí

-AF376073 MYS 1997

Рисунок 1 (напротив). Филогенетические взаимоотношения ЭВ71 при анализе 891 нт фрагмента генома ЭВ71, кодирующего белок VP1. Штаммы, полученные в России, Украине и странах СНГ, выделены большим шрифтом. Дерево построено по алгоритму Maximum Likelihood с моделью замен Tamura-Nei. Цифры в узлах дерева -процент из 1000 bootstrap-псевдорепликатов, поддерживавших данную группу.

Нидерланды ■■■■ ( В1 | Vs2 1 В2 I ' C1 I гег~ | , С1дг I ,

Англия I C1

Австрия "бПЯсд

Болгария BBI

Венгрия ■ В1

Норвегия ГСП

Финляндия Ш

Греция США И

Австралия вг I C1 daJ ^ ВС4

Китай lB2 g " со зн

Тайвань ИВ2 BMI^IMBS

Вьетнам Ml С5 |

Малайзия I 7С1

Сингапур Щ . s

Япония 1—0-55-43 —□-□ В%

Корея |сз

Индия 0D

Африка DV

Рисунок 2. Распространение субгенотипов ЭВ71 в странах Европы и Азиатско-Тихоокеанского региона (по данным МсМтп 2012).

Выбор генотипа ЭВ71 для исследования сероэпидемиологии.

Для реакции нейтрализации с целью определения уровня антител в крови обследуемых лиц были взяты прототипный штамм ЭВ71 ВгСг, выделенный в 1970 в США (генотип А), и современный российский штамм ЭВ71 13689 (субгенотип С2), выделенный в 2000 году в Москве. Всего на этом этапе было обследовано 30 сывороток здоровых детей в возрасте от 3 до 9 лет и 20 сывороток взрослых лиц в возрасте 50-75 лет (Табл. 3). Задачей первого этапа исследования было установить, какой штамм лучше подходит для дальнейшего изучения сероэпидемиологии ЭВ71 в РФ. Таблица 3. Уровень нейтрализующих антител к двум генотипам ЭВ71 среди здорового населения г. Хабаровск.

Вирус для реакции нейтрализации ЭВ71, генотип А, штамм ВгСг ЭВ71, субгенотип С2, штамм 13689

Возраст обследованных лиц Дети (3-9 лет) Взрослые (50-75 лет) Дети (3-9 лет) Взрослые (50-75 лет)

Количество сывороток крови 30 20 30 20

Количество сывороток крови с титром антител 8 или выше 17 19 17 19

Процент положительных образцов в группе 56,6 % 95% 56,6 % 95%

Среднее геометрическое титра антител у серопозитивных лиц, ^г(титр антител) 6,05 ± 1,7 (66) 5,5 ± 1,4 (45) 7,17 ± 1,7 (144) 4,2 ± 1 (18)

Доля серопозитивных лиц среди здоровых детей г. Хабаровска была одинакова к обоим штаммам ЭВ71. Доля серопозитивных среди здоровых взрослых лиц также была одинакова к двум исследованным штаммам. Это

позволяло продолжить изучение сероэпидемиологии на территории РФ с использованием любого из проверенных штаммов ЭВ71. Титр антител у пожилых лиц был выше к прототипному штамму ЭВ71, а среди детей средний титр оказался выше к современному штамму 13689. Таким образом, учитывая актуальность изучения сероэпидемиологии ЭВ71 именно среди детей и необходимость прогнозировать вероятность возникновения вспышек ЭВ71, вызываемых современными циркулирующими генотипами вируса, для дальнейшего изучения сероэпидемиологии у детей был выбран ЭВ71 субгенотипа С2 (штамм 13689).

Изучение доли серопозитивных к ЭВ71 лиц в регионах РФ.

В нашей работе было изучено всего 842 пробы сывороток крови здоровых детей в возрасте от 1 до 5 лет из шести регионов РФ. Все изученные пробы сывороток крови здоровых детей были разделены на две группы в соответствии с возрастом детей: первая группа - дети 1-2 года и вторая группа — дети 3-5 лет. Детей до 2 лет было обследовано 349 человек, а детей 3-5 лет - 493 человека. (Табл. 4).

Таблица 4. Наличие нейтрализующих антител к ЭВ71 у здоровых детей 1-5 лет из шести регионов РФ.

Возраст детей 1 -2 года 3-5 лет Всего 1 -5 лет

Количество обследованных детей в шести регионах РФ 349 493 842

Количество сывороток крови с титром антител 8 или выше 44 200 244

Процент положительных образцов в группе 13% 41% 29%

При сравнении количества серопозитивных лиц в разных возрастных группах доля серопозитивных была достоверно выше среди детей 3-5 лет (тест Фишера, р<0,0001) при отсутствии зарегистрированных случаев или

вспышек заболеваемости в РФ. Скорее всего, более высокая доля серопозитивных лиц среди детей 3-5 лет связана с началом посещения детьми дошкольных учреждений и более частым контактом с носителями ЭВ71 имеющими бессимптомное или легкое течение ЭВ71 инфекции. В общем, процент серопозитивных лиц среди здоровых детей в возрасте 1-5 лет во всех шести регионах в РФ составил 29% (Табл. 5).

Таблица 5. Уровень нейтрализующих антител к ЭВ71 среди здоровых детей 1-5 лет из европейской части России.

Московская область Ростовская область Свердловская область

Возраст, лет Позитивных /всего лиц % Позитивных /всего лиц % Позитивных /всего лиц %

1-2 6/54 11 3/67 5 10/53 19

3-5 19/82 23 17/76 22 20/79 25

Всего 1-5 25/136 18 20/143 14 30/132 23

Основными чертами сероэпидемиологии в европейской части России было наличие относительно низкой доли серопозитивных к ЭВ71 (субгенотип С2, штамм 13689) среди детей дошкольного возраста. Наблюдали отсутствие корреляции доли серопозитивных лиц с показателем среднемесячного дохода и плотностью населения, а так же с этническим составом в этих регионах РФ (Рис. 3).

Таблица 6. Уровень нейтрализующих антител к ЭВ71 среди здоровых детей в возрасте 1-5 лет из азиатской части России.

Республика Тыва Якутия Хабаровский край

Возраст, лет Позитивных /всего лиц % Позитивных /всего лиц % Позитивных /всего лиц %

1-2 11/54 20 7/50 14 7/71 10

3-5 70/84 83 36/88 41 38/84 45

Всего 1-5 81/138 59 43/138 31 45/155 29

В азиатских регионах была выявлена более высокая доля серопозитивных детей в возрасте 3-5 лет (Табл. 6). Возможно, что высокая доля серопозитивных лиц среди детей дошкольного возраста в азиатских регионах РФ обусловлена различиями в социально-бытовых условиях в разных регионах (в частности, в республике Тыва и Якутии), а также более интенсивными контактами с эндемичной территорией (Китаем) в Хабаровске. Зависимости количества серопозитивных лиц со среднемесячным доходом и плотностью населения также обнаружено не было.

Изучение сероэпидемиологии ЭВ71 у детей в Хабаровске, Комсомольске-на-Амуре.

В исследовании были определены доля серопозитивных лиц и титр нейтрализующих антител к ЭВ71 (субгенотип С2, штамм 13689) в

сыворотках крови, полученных от здоровых детей в возрасте 1-15 лет из г. Хабаровск и г. Комсомольск-на-Амуре (Табл. 7).

Таблица 7. Уровень антител к ЭВ71 у здоровых детей от 1 до 15 лет из г. Хабаровск и г. Комсомольск-на-Амуре.

Регион проживания детей Комсомольск-на-Амуре Хабаровск

Возраст обследованных лиц 1 -2 года 3-5 лет 3-5 лет 9-15 лет

Количество сывороток крови 44 27 27 53

Количество сывороток крови с титром антител 8 или выше 0 6 19 27

Процент положительных образцов в группе 0% 22% 70% 51 %

Среднее геометрическое титра антител у серопозитивных лиц, 1о§2 (разведение) 0 6,3 ±2 (76) 8,2 ±2 (286) 7,5 ± 1,6 (181)

В г. Комсомольск-на-Амуре антитела к ЭВ71 типа (субгенотипа С2, штамм 13689) отсутствовали у здоровых детей 1-2 лет, а у детей 3-5 лет доля серопозитивных лиц была 22% со средним геометрическим титра антител у серопозитивных детей равным 6,3 (76). Среди детей из Хабаровска в возрастной группе 3-5 лет была выявлена доля серопозитивных лиц 70%, со средним геометрическим титром антител 8,2 1о§2 (286), что выше показателей в группе 9-15 лет - 51 % серопозитивных лиц со средним титром антител 7,5 1о§2 (181). При сравнении двух изученных регионов Хабаровского края доля серопозитивных лиц среди детей 3-5 лет была достоверно выше в Хабаровске (тест Фишера, р<0,001). Возможно, что более высокие показатели доли серопозитивных лиц в Хабаровске связаны с большим количеством мигрантов из эндемичных по заболеваемости

Рисунок 3. Регионы сбора сывороток (закрашены на карте), количество обследованных сывороток, социально-экономические показатели регионов и доля серопозитивных лиц к ЭВ71 у детей 1-2 и 3-5 лет из шести регионов Российской Федерации. Штаммы, полученные от пациентов во время вспышки в Ростове-на-Дону обведены красным квадратом. Генотипы штаммов, выделенные в России, Украине и странах СНГ отмечены цветом в соответствии с расположением на филогенетическом дереве (Рис. 1).

13689 43959 41464 44724 42266 44987 43374 46175

Якутия Хабаровский край

50/88 0.3 26,5

71/84 1.7 21

93%

Ростовская Свердловская Тыва область область

67/76 42.3

53/79 22.1

54/84 1.8

96%

X:' X:'

Яр=0.11 Яр*0.07

Т:"* Т:—

Регион Московская область

Образцы сывороток крови 54/82 1-2/3-5 лет

Плотность г населения ,чел/км 10=-1

Средний месячный 23 7 доход, тыс. руб.

96%

Этническая группа В Азиатская Европейская Другая

Результаты д..

теста Фишера т:"'

Доля серопозитивных лиц

■ 1-2 года

■ 3-5 лет

ЭВ71 -инфекции стран в г. Хабаровск, находящимся на границе с Китаем, а не в г. Комсомольск-на-Амуре.

В целом, можно отметить, что ЭВ71 широко циркулирует на территории Хабаровского края, но не вызывает клинически заметных форм заболевания. Доля серопозитивных лиц в разных возрастных группах различалась в Хабаровске и Комсомольске-на-Амуре. Количество серопозитивных лиц было достоверно меньше в Комсомольске-на-Амуре, что может быть связано с удаленностью города на 235 км от границы с Китаем. Таким образом, различия в циркуляции вируса в городах Хабаровского края могут быть связаны с разницей в количестве лиц, приезжающих в Хабаровск и Комсомольск-на-Амуре из эндемичных по ЭВ71 инфекции регионов.

Вспышка ЭВ71 в Ростове-на-Дону.

Первая вспышка ЭВ71 инфекции на территории Российской Федерации произошла на территории Ростовской области, в городе Ростов-на-Дону в 20 !3 году. Во время вспышки было зарегистрировано 78 случаев ЭВ71 инфекции, из них 25 человек с неврологическими осложнениями (менингит) и один ребенок погиб. Интересно отметить, что в этом регионе РФ была выявлена наименьшая из 6 обследованных областей доля серопозитивных лиц в группе 1-2 года (5% против 15% в среднем в других областях, р<0,05). Как показало молекулярно-эпидемиологическое расследование, причиной вспышки нейроинфекции был ЭВ71 субгенотипа С4 (Рис. 4).

-№286531 Ш 1998

94р АВ115493 СЖ 2000 Г1—№676189 1АР 2000

П-17151502 ТНА 2008

и-АВ115491 ОМ 2000

АУ465356 ™ 2003

_ ЦМ313Л5Я ГШ 5(У10

Рисунок 4. Часть филогенетического дерева (Рис. 1), описывающая филогенетические взаимоотношения штаммов ЭВ71 субгенотипа С4. Штаммы, полученные от пациентов во время вспышки в Ростове-на-Дону в мае-июне 2013 года, обведены красным прямоугольником.

В рамках программы ВОЗ по эрадикации полиомиелита происходит подтверждение отсутствия циркуляции дикого вируса полиомиелита на территории России и стран СНГ путем выявления и типирования вирусов в исследуемом материале. Для идентификации ЭВ используются пулы лошадиных сывороток, позволяющие идентифицировать в том числе и ЭВ71. В случае наличия ЭВ71 в изучаемом образце, молекулярно-

I—Л*|205807 СЖ 2011 —7(2326302 СЖ 2009

_ГСИ«<.101 зпло

Надзор за циркуляцией ЭВ71 в России.

биологическими методами определяется его генотип. Таким образом, надзор за циркуляцией ЭВ является побочным результатом программы по эрадикации полиомиелита в РФ. При этом вследствие низкой цитопатогенности части штаммов ЭВ71 данная система не является оптимальной для надзора за ЭВ71.

В 2009 г. была утверждена программа «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполно) инфекции», в рамках которой проводится наблюдение за циркуляцией ЭВ в РФ. Дифференцировка на типы ЭВ выполняется только в отдельных случаях, и конкретно циркуляция ЭВ71 не регистрируется. Кроме того, участие лабораторий в этой программе добровольное, и некоторые территории остаются неохваченными при исследовании эпидемиологии ЭВ вообще, и ЭВ71 в частности. Таким образом, непосредственного надзора за ЭВ71 в России не ведется.

Результаты данного исследования (широкая циркуляция вируса, регулярные заносы из других стран, разная доля серопозитивных детей в разных регионах и даже в разных городах одной области, появление вспышек нейроинфекции в 2013 г.) указывают на необходимость увеличения эффективности надзора за ЭВ71 как минимум на порядок.

Эпидемиологическая обстановка по ЭВ71 в РФ и в мире.

Различная эпидемиология ЭВ71 инфекции в Европе и странах Азиатско-Тихоокеанского региона может быть обусловлена как внутренними (генетическая предрасположенность), так и внешними факторами. К внешним факторам можно отнести плотность населения, средний месячный доход и другие социально-экономические условия проживания.

Изученные нами регионы РФ значительно различаются по географическому положению, этническому составу населения и

социально-экономическим условиям. Таким образом, у нас была уникальная возможность изучить возможное влияние ряда факторов на сероэпидемиологию ЭВ71. Максимальная доля серопозитивных лиц среди здоровых детей 3-5 лет (83%) была выявлена в республике Тыва (Рис. 4). В Якутии доля серопозитивных лиц была 41% среди здоровых детей 3-5 лет. В Европейских регионах РФ (Московская, Ростовская и Свердловская области) серопозитивность ЭВ71 была значительно ниже (22-25%). Таким образом, можно предполагать, что различия в социально-культурных условиях проживания населения или генетические различия между преобладающими этническими группами населения оказали влияние на бессимптомную инфекцию ЭВ71. Высокие показатели доли серопозитивных лиц в Хабаровске (45%) можно объяснить высоким уровнем трансграничной миграции населения Китая в Россию. Таким образом, максимальная доля серопозитивных лиц к ЭВ71 среди детей 3-5 лет наблюдалась в регионах с отличиями в социально-культурных условиях проживания населения и высокой интенсивностью контактов с Китаем (Хабаровский край).

Выводы

1. По данным вирусологического и серологического исследования энтеровирус 71 типа широко распространен на территории РФ.

2. Доля серопозитивных лиц среди здоровых детей 1-2 лет в регионах Российской Федерации колебалась от 5% в Ростовской области до 20% в республике Тыва. Доля серопозитивных лиц среди детей от 3 до 5 лет варьировала от 22-25% в Московской, Свердловской и Ростовской области, до 41-45% в Якутии и Хабаровском крае, и до 83% в республике Тыва.

4. С 2000 по 2013 год на территории РФ циркулировали субгенотипы С1 и С2 ЭВ71, а в 2009 году впервые выделен и с 2011 года доминирует субгенотип С4. По данным молекулярно-эпидемиологического исследования имели место многократные заносы ЭВ71 в РФ. Наиболее близкородственные российским изолятам вирусы субгенотипов С1 и С2 выделены в Европе, субгенотипа С4 - в Китае.

5. В мае-июне 2013 года в Ростове-на-Дону произошла первая в России вспышка менингоэнцефалита, вызванная ЭВ71. Молекулярно-эпидемиологическое изучение выявило, что возбудителем вспышки был ЭВ71 субгенотипа С4, отличавшийся на 1,8-2% нуклеотидной последовательности в области генома УР1 от вирусов, выделенных в Китае в 2010-2011 гг.

Публикации, содержащие основные научные результаты диссертации:

1. Королева Г.А., Лукашев А.Н., Худякова (Ахмадишина) JI.B., Мустафина А.Н., Лашкевич В.А. Энцефаломиелит, вызываемый энтеровирусом типа 71 у детей // Вопросы вирусологии. - 2010. -№ 6. - С. 4-10.

2. Лукашев А.Н., Иванова O.E., Худякова (Ахмадишина) JI.B., Морозова Н.С. Социально-экономическая значимость энтеровирусной инфекции и ее роль в структуре инфекционной патологии в мире // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №5. - С. 113-120.

3. Лашкевич В.А., Королева Г.А., Лукашев А.Н., Кармышева В.Я., Мустафина А.Н., Худякова (Ахмадишина) Л.В., Шумилина Е.Ю.. Энтеровирус типа 71: ящуроподобное заболевание, энцефаломиелит, острый отек легких И Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2011. -№6. - С. 38-47.

4. Ахмадишина Л.В., Иванова O.E., Еремеева Т.П., Троценко O.E., Лукашев А.Н. Сероэпидемиология энтеровируса 71 типа на территории Хабаровского края // Современные проблемы науки и образования. - 2013. — № 5. — Режим доступа: www.science-education.ru/lll-10590 - № гос. регистрации 0421200037.

5. Ахмадишина Л.В., Королева Г.А., Иванова O.E., Троценко O.E., Михайлов М.И., Лукашев А.Н. Сероэпидемиология и молекулярная эпидемиология энтеровируса 71 типа в мире и в Российской Федерации // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013. - №6. -С. 112-116.

Подписано в печать 26 ноября 2013 года Объем:. 1,0 усл. п.л Тираж: 100 экз. Заказ № 470 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, Москва, пр-т Вернадского, 39 тел. 8(495)363-78-90, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ахмадишина, Людмила Васильевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

ИМЕНИ М.П. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

ШОГН / С-577/. УТ4-и I ии Л т

Ахмадишина Людмила Васильевна

Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71 типа на территории Российской Федерации

03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Лукашев А.Н.

МОСКВА-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................9

1.1. Общая характеристика энтеровирусов............................................................................9

1.1.1. Классификация энтеровирусов..................................................................................9

1.1.2. Структура и физико-химические свойства вириона энтеровирусов....................10

1.1.3. Структура и реализация генома энтеровирусов и энтеровируса 71 типа............12

1.1.4. Жизненный цикл энтеровирусов.............................................................................13

1.2. Клинические особенности энтеровирусной инфекции................................................16

1.3. Клинические особенности ЭВ71 инфекции..................................................................17

1.4. Сероэпидемиология и молекулярная эпидемиология ЭВ71 в мире...........................21

1.5. Современные методы детекции и идентификации ЭВ................................................39

1.6. Предпосылки для данного исследования......................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................41

2.1. Использованные штаммы ЭВ71 для реакции нейтрализации....................................41

2.2. Использованные клеточные линии для реакции нейтрализации...............................41

2.3. Сыворотки людей для реакции нейтрализации............................................................42

2.4. Референс-сыворотки для реакции нейтрализации.......................................................42

2.5. Условия проведения реакции нейтрализации и определение титра нейтрализующих антител к ЭВ71..................................................................................43

2.6. Источники информации о среднем доходе, о численности представителей различных этнических групп и о плотности населения в регионе.............................43

2.7. Определение статистической значимости разницы уровней серопозитивности......44

2.8. Штаммы ЭВ71, выделенные в России и странах СНГ и взятые для исследования филогенетических взаимоотношений...........................................................................44

2.9. Определение нуклеотидной последовательности части фрагмента генома энтеровирусов, кодирующего белок УР1.....................................................................45

2.10. Определение нуклеотидной последовательности полного фрагмента генома ЭВ71, кодирующего белок УР1.....................................................................................47

2.11. Электрофорез ПЦР продуктов.....................................................................................49

2.12. Определение нуклеотидной последовательности......................................................49

2.13. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей.......................................50

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ....................................................................................50

1. Результаты молекулярно-биологического исследования штаммов ЭВ71, изолированных на территории Российской Федерации и стран СНГ........................50

2. Изучение состояния популяционного иммунитета к ЭВ71 у здорового населения Российской Федерации...................................................................................................55

2.1.1. Выбор генотипа ЭВ71 для выполнения серологических исследований..............55

2.1.2. Изучение уровня антител к ЭВ71 (субгенотип С2 штамм 13689) у здоровых детей от 1 до 5 лет на территории Российской Федерации (в шести регионах РФ).....56

3. Изучение сероэпидемиологии ЭВ71 у детей в г. Хабаровск и Комсомольск-на-Амуре................................................................................................................................65

4. Вспышка энтеровируса 71 типа в Ростове-на-Дону.....................................................67

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................70

ВЫВОДЫ...............................................................................................................78

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................80

Список сокращений

CAV - коксаки А вирус CBV - коксаки Б вирус Е-эховирус

IRES - internal ribosomal entry site, внутренний сайт посадки рибосомы

PV - вирус полиомиелита

RD - линия клеток рабдомиосаркомы человека

ак - аминокислота

АТР - Азиатско-Тихоокеанский регион ГА - герпангина нт - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область

ОВП - синдром острого вялого паралича

ОТ - реакция обратной транскрипции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РН - реакция нейтрализации инфекционности

РНК - рибонуклеиновая кислота

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота ЭВ71 -энтеровирус 71 типа ЭВИ - энтеровирусная инфекция ЯПЗ - ящуроподобное заболевание

Введение

Основными эндемичными странами по заболеваемости ЭВ71-инфекцией являются страны Азиатско-Тихоокеанского региона (АТР). За последние 15 лет вызванные ЭВ71, эпидемии ЯПЗ, протекавшего с поражением ЦНС, регистрировали в Малайзии, Тайване, в Сингапуре, Таиланде, Японии и во Вьетнаме. В Китае на протяжении 2007-2011 годов ежегодно регистрировали от 200 тысяч до нескольких миллионов больных ЯПЗ. Во время вспышек у части пациентов с ЯПЗ (от 100 до 900 случаев ежегодно) наблюдали развитие неврологических осложнений, таких как энцефаломиелит, спинальный полиомиелит, серозный менингит, приводивших к смерти. Основной причиной эпидемий ЯПЗ, сопровождавшегося поражением ЦНС и смертью пациентов в последние годы был ЭВ71 субгенотипа С4, который условно рассматривают как «азиатский» субгенотип. В странах АТР для надзора за ЭВ71 были выстроены эффективные санитарно-эпидемиологические службы, идет разработка лекарственных препаратов и вакцин.

материалов от людей. В Европе наблюдение за распространением ЭВ71 проводится в рамках общей программы по надзору за циркуляцией энтеровирусов. В соответствии с этой программой установлено, что в Европе циркулируют, так называемые «европейские» субгенотипы ЭВ71 -С1 и С2.

В России информация о циркуляции и эпидемиологии ЭВ71 отсутствует. Наблюдение за циркуляцией всех известных серотипов ЭВ в РФ происходит в рамках программы по надзору за искоренением полиомиелита и в рамках программы по надзору за неполиомиелитными энтеровирусами. Таким образом, непосредственного надзора за ЭВ71 в России не ведется. Учитывая эпидемиологическую ситуацию в отношении ЭВ71-заболеваемости в Китае, была очевидна необходимость проведения исследований по изучению циркуляции и сероэпидемиологии ЭВ71 на территории РФ, особенно на территории Хабаровского края, пограничного с Китаем.

Задачи:

1. Изучить российские изоляты ЭВ71 и создать коллекцию штаммов ЭВ71 для их дальнейшего изучения.

2.1.определить нуклеотидную последовательность генома, кодирующего белок УР1, российских изолятов ЭВ71;

2.2.генотипировать российские штаммы ЭВ71;

Научная новизна

1. Было показано, что в 2000-2010 годах в России преобладали субгенотипы С1 и С2 ЭВ71, филогенетически наиболее близкие к европейским вариантам вируса, а с 2011 доминировал субгенотип С4, филогенетически близкий к вирусам из Китая.

2. Впервые выделен российский ЭВ71 штамм №13689 от случая острого вялого паралича в Москве, определена его полногеномная последовательность и создан рабочий банк вируса.

3. Впервые показано, что ЭВ71 широко циркулировал на территории Российской Федерации среди детей дошкольного возраста, однако первая вспышка ЭВ71 инфекции была зарегистрирована только в 2013 году в Ростове-на-Дону.

Научно-практическая значимость работы

1. Впервые получены российские изоляты ЭВ71, определена их нуклеотидная последовательность полного фрагмента генома, кодирующего белок УР1. Создана коллекция российских штаммов ЭВ71

для использования в качестве референсных штаммов при разработке диагностических систем.

2. Определен уровень популяционного иммунитета среди населения в шести регионах Российской Федерации (Московская область, Ростовская область, Свердловская область, республике Тыва, Якутия, Хабаровская область).

3. Проведено молекулярно-эпидемиологическое изучение первой в России вспышки ЭВ71, возникшей в 2013 году в Ростовской области, и показано, что причиной вспышки были представители ЭВ71 субгенотипа С4.

Глава 1. Обзор литературы

1.1.Общая характеристика энтеровирусов

1.1.1. Классификация энтеровирусов

Род Enterovirus относится к семейству Picornaviridae. Название рода было обусловлено преимущественной репликацией вируса в пищеварительном тракте. По современной классификации, определенной Международным комитетом по таксономии вирусов, энтеровирусы (ЭВ) человека подразделяют на 4 вида: Human enterovirus А, В, С, D (Табл.1). К одному виду относят типы энтеровирусов, различающиеся менее, чем на 30% нуклеотидной последовательности в неструктурной области генома и рекомбинирующие между собой. Каждый из видов ЭВ подразделяется на типы исходя из серологических свойств и разницы нуклеотидной и аминокислотной последовательности области генома VP1 [87].

Таблица 1. Классификация энтеровирусов человека [95].

Tnn/CepoTnn

Human enterovirus A HEV-A Coxsackievirus A 2-8, 10, 12, 14, 16

Human enterovirus 71, 76, 89-92, 114

Human enterovirus B HEV-B Coxsackievirus A 9

Coxsackievirus B 1-6

Echovirus 1-7, 9, 11-21, 24-27, 29-33

Human enterovirus 69, 73-75, 77-88, 93, 97, 98, 100, 101, 106, 107

Human enterovirus C HEV-C Coxsackievirus A 1, 11,13,17,19-22,24

Human enterovirus 95, 96, 99,102,104,105, 109, 113, 116

Poliovirus 1-3

Human enterovirus D HEV-D Human enterovirus 68, 70, 94, 111

Энтеровирус 71 типа - один из серотипов вида НЕУ-А. ЭВ71 подразделяется на 13 субгенотипов (А, В0-В5, С1-С5, Б) исходя из различия нуклеотидной последовательности в области генома УР1 [7; 62; 79]. Сходство генома энтеровирусов одного серотипа в области УР1 составляет не менее 75% нуклеотидной последовательности [87]. Вирусы в пределах одного субгенотипа ЭВ71 имеют сходство 92% нуклеотидной последовательности, а вирусы разных генотипов схожи на 78-83% нуклеотидной последовательности [62]. Между разными генотипами ЭВ71 существует выраженный антигенный перекрест [23; 77].

1.1.2. Структура и физико-химические свойства вириона энтеровирусов

Вирион энтеровирусов представляет собой икосаэдр диаметром около 30 нм. Капсид ЭВ состоит из 60 протомеров, каждый из которых содержит по одной копии четырех белков: УР1, УР2, УРЗ, и УР4 (Рис. 1). Симметрия вириона (Т) псевдо 3, это означает что один протомер образован тремя разными белками, но морфологически эти белки похожи, поэтому Т = псевдо 3. Белок УР4 полностью скрыт внутри капсида и не участвует в антигенных взаимодействиях. Антитела образуются ко всем поверхностным белкам к УРЗ, УР2 и немного больше к УР1. На поверхности вириона можно выделить пятиугольное возвышение звездчатой формы, образованное пятью белками УР1, окруженное, каньоном, который является сайтом связывания с клеточным рецептором [92].

К- 200Й Svviii Institute o< Bic

Рисунок 1. Структура вириона энтеровируса (Swiss institute of bioinformatics, 2008).

Энтеровирусы отличаются от всех остальных вирусов семейства Picornaviridae рядом физических свойств, таких как плавучая плотность в хлориде цезия и стабильность в слабых кислотах. Вирионы кислотоустойчивы и сохраняют инфекционность при рН ниже 3,0. Эта способность необходима при прохождении через желудок к месту репликации вируса в кишечнике. Биофизические особенности и цитолитический цикл жизни вируса влияют на многие аспекты патологии ЭВ, пути передачи и эпидемиологические особенности. Инфекционный вирус относительно чувствителен к дезинфектантам, широко распространенным в лаборатории, таким как 70% этанол, изопропанол, соединениям четвертичного аммония. Вирус нечувствителен к растворителям, таким как эфир и хлороформ, из-за отсутствия липидной оболочки, стабилен в присутствии многих детергентов при комнатной температуре. Формальдегид, глютаральдегид, сильные кислоты, гипохлорит натрия инактивируют энтеровирусы. Концентрация, рН и время контакта влияют на степень инактивации этими компонентами [92].

Энтеровирусы относительно термостабильны, но меньше, чем вирус гепатита А. Большинство ЭВ легко инактивируется при 42°С, катионы сульфата магния могут повышать стабильность вириона, так что он

остается практически неизменным при 50°С. Чувствительность к

небольшому подъему температуры дает возможность использовать пастеризацию для инактивации ЭВ [14].

1.1.3. Структура и реализация генома энтеровирусов и энтеровируса 71 типа

Геном энтеровирусов (Рис. 2) представлен одноцепочечной полиаденилированной моноцистронной РНК позитивной полярности длиной около 7,4 тысяч нт [92]. С 5"НТО генома энтеровируса ковалентно связан белок VPg (virion protein, genome linked). Также в состав 5'НТО входит структура, необходимая для инициации трансляции, внутренний сайт посадки рибосомы - IRES (internal ribosome entry site).

После области IRES идет одна открытая рамка считывания. В состав З'НТО входит поли(А) хвост длиной до 200 нт [92]. Перечисленные свойства и признаки генома характерные для большинства энтеровирусов.

После проникновения в клетку вирусный геном способен к трансляции полипротеина, который разрезается собственными протеазами 2А и ЗС на три белковых предшественника. Область генома Р1 кодирует структурные белки VP1, VP2, VP3 и VP4. Область генома Р2 кодирует белки 2А, 2В, 2С. Белок 2А обладает протеазной активностью, а также необходим для инициации синтеза «-» цепи РНК. Белок 2В вовлечен в синтез вирусной РНК на ранних этапах, он выполняет функции виропорина, образуя поры для прохождения вируса через клеточную мембрану. Белок 2С высококонсервативен и выполняет функции хеликазы во время синтеза РНК, необходим для раскручивания двухцепочечных структур при репликации РНК.

Область генома РЗ включает в себя последовательность, кодирующую четыре белка: ЗА, ЗВ, ЗС и 3D. О функциях белка ЗА известно немного: экспериментально доказано, что внесение мутаций в гиброфобный конец белка приводит к образованию вируса с дефектом репликации. Участок генома ЗВ кодирует белок VPg, который играет роль праймера для

репликации РНК. Белок ЗС обладает протеазной активностью и разрезает полипептид между областями генома Р2 и РЗ. Белок ЗО является РНК-зависимой-РНК-полимеразой.

Некоторые предшественники белков имеют собственные функции. Так, белок 2ВС участвует в вирусной репликации, а ЗСЭ имеет протеазную активность. Функции ЗСО изучены не до конца, одной из них является способность заякоревать VPg белок в мембране для праймирования во время синтеза РНК [92].

IRES

Р2

VP4 VP2 VP3 -►ч-><— VPl j 2A 126 j 2C |зА VPg Р3ГСО -► RdRp

Potyprotein

1ABCD 2ABC шшшиш^шшя 3ABCD

1АВС ID 2A 2BC ЗАВ 3CD

VPO 1С 2B 2C Изв ЗС 3D

1А [18 !

Alternative cleavage ЗС Г 3D

Рисунок 2. Структура генома энтеровирусов. [44]. Схема разрезания полипептида на 11 белков. Белок VPg, прикрепленный к 5vHTO, область внутренней посадки рибосомы (IRES), полипептид, полиаденилированная З^НТО РНК.

1.1.4. Жизненный цикл энтеровирусов

Жизненный цикл вирусов начинается с присоединения к рецептору инфицируемой клетки. После связывания с рецептором на клеточной поверхности происходит серия структурных изменений в вирусном капсиде и формируются поры на клеточной мембране, через которые вирусная РНК проникает в цитоплазму клетки (этап 1 на рис.3). Затем происходит раздевание вируса (этап 2 на рис.3). Реплик

Информация о работе

Ахмадишина, Людмила Васильевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.02

Диссертация

Молекулярная эволюция и сероэпидемиология энтеровируса 71-го типа на территории Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы