Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов выявления генома энтеровируса и парвовирусов КРС

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов выявления генома энтеровируса и парвовирусов КРС"

На правах рукописи

00460Э^о

КОЧЕТКОВ Сергей Андреевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ЭНТЕРОВИРУСА И ПАРВОВИРУСОВ КРС

03.02.02 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир -2010

004605230

Работа выполнена в федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)

Научный руководитель -

доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Сухарев Олег Иванович, Российский университет Дружбы народов, г. Москва;

кандидат биологических наук Мудрак Наталья Станиславовна ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Ведущая организация -

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирская область)

Защита состоится «15» июня 2010 г. в 1200 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ«ВНИИЗЖ».

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте: М1р/Л«\лм.агпаЬ.ги.

Автореферат разослан « Л' » .. 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

А. П. Пономарев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания КРС наносят значительный экономический ущерб в странах с развитым скотоводством. Инфекционные энтериты привлекают внимание ученых и практиков вследствие их широкой распространенности, полиэтиологичносги, а также низкой профилактической и терапевтической эффективности проводимых мероприятий.

В настоящее время появляется все больше сообщений о том, что энтериты телят могут вызываться энтеровирусами, парвовирусами, вирусом диареи крупного рогатого скота, герпесвирусом, хламидиями, способными обуславливать заболевание самостоятельно, или в различных сочетаниях. Решение проблемы борьбы с этими болезнями осложняется преимущественно смешанной формой их течения. Нет сомнений, что одной из причин, порождающих трудности в борьбе с этими заболеваниями, является недостаток знаний об их этиологии, о свойствах агентов, их вызывающих, методах диагностики, профилактики и лечения.

Учитывая сходство в течение заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики. Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, реакция нейтрализации, не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность и чувствительность.

Несмотря на выше сказанное, до настоящего момента в Российской Федерации методы выявления и дифференциации для энтеровируса и парвовирусов КРС не разрабатывались.

Цепи и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка методов выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в биологических образцах с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования, а также изучения распространённости и генетического разнообразия данных вирусов на территории Центрального федерального округа Российской Федерации (ЦФО РФ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить первичную структуру исследуемых областей генома ранее изученных штаммов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1,2,3;

- разработать методы выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1,2,3с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования;

- установить первичную структуру и провести сравнительный анализ амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1,2,3;

- изучить возможность применения разработанных методов для выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в материалах от естественно инфицированных животных;

- изучить распространённость и генетическое разнообразие энтеровируса и парвовирусов КРС на территории РФ с помощью разработанных метода;

Научная новизна и теоретическое значение. Разработаны методы ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО) и метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в образцах вируссодержащего материала с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования.

Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей 5' -нетранслируемой области генома полевых изолятов энтеровируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры данных фрагментов генома энтеровируса КРС. Исследованы вероятные филогенетические отношения меиеду выявленными полевыми изолятами и ранее опубликованными последовательностями энтеровируса КРС. Впервые изучено распространение и генетическое разнообразие энтеровируса КРС, циркулирующего на территории РФ.

С использованием разработанного метода определены нукпеотидные последовательности фрагментов геномов полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленных на территории РФ, изучено их генетическое разнообразие. Изучение парвовирусов КРС 2, 3 в РФ проводилось впервые.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработаны:

- «Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции» (2008 г.). Методика предназначена для выявления генома энтеровируса КРС в патологическом материале от КРС;

- «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены ученым советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием

ВКО;

- метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 при помощи полимеразной цепной реакции и секвенирования;

- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов энтеровируса КРС, а также его филогенетические взаимоотношения;

- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и полевых изолятов парвовирусов КРС 1,2,3;

- результаты применения разработанных методов выявления генома указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных животных;

- результаты исследований распространенения и генетического разнообразия энтеровируса КРС на территории Центрального Федерального округа РФ с помощью разработанного метода;

- результаты исследования генетического разнообразия парвовирусов 1,2,3, обнаруженных в материалах от естественно инфицированных животных на территории РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2009 г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2007 - 2009 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, две из них опубликованы в журналах «Ветеринария» и «Ветеринарная патология», которые предусмотрены перечнем ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 126 источников, в том числе 14 на русском языке и 112 зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологические материалы. В работе использованы изоляты энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленные в полевых образцах, собранных на

территории Российской Федерации в 2006-2009гг. Также в работе использовали штаммы гетерологичных вирусов и инфекционных агентов, вызывающих заболевания со сходными клиническими признаками (энтеровирус свиней, парвовирус свиней, парвовирус собак, ротавирус КРС, респираторно-синцитиальный вирус КРС, инфекционный ринотрахеит КРС, парагрипп-3 КРС, вирус вирусной диареи КРС, коронавирус КРС).

Выделение суммарных нуклеиновых кислот (ДНК, РНК). Суммарную НК выделяли с помощью наборов реагентов для выделения «Пробоподготовка универсальная» (ДНК) и «Пробоподготовка РНК» (ООО «Биоком», г. Москва).

Выделение суммарной РНК с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО). В качестве ВКО использовали вирус инфекционной бурсальной болезни (ИББ) штамм Winterfield-2512. ВКО добавляли в исследуемую пробу на начальной стадии выделения РНК.

ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО. Для получения кДНК применяли реакцию обратной транскрипции, в которой на 3 мкл суммарной РНК наслаивали 20 мкп минерального масла и денатурировали прогреванием при 85°С в течение 2,5 мин., после чего быстро охлаждали на льду. В пробирку с денатурированной РНК добавляли реакционную смесь, содержащую 5 мкл пятикратного буфера для реакции обратной транскрипции, 2 мкл 10 мМ dNTP, по 1 мкл 10 пмоль праймеров EN1, EN5 (табл. 1) для синтеза кДНК фрагмента энтеровируса КРС и по 0,5 мкл 10 пмоль праймеров IS1, IS4 (табл. 2) для синтеза кДНК вируса инфекционной бурсальной болезни, 2,5 ед. обратной транскриптазы и деионизированную воду до конечного объема 25 мкл. Обратную транскрипцию проводили при температуре 42°С в течение 40 мин.

Полимеразную цепную реакцию проводили в два этапа («nested» ПЦР). Для проведения первой реакции амплификации к 3 мкл продуктов реверсии добавляли реакционную смесь, содержащую 10 мкл деионизированной воды, по 1 мкл 10 пмоль праймеров EN1/EN5, по 0.5 мкл 10 пмоль праймеров IS1/ IS4, 3 мкл 25 мМ MgCI2, 1 мкл 10 мМ dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 5мкл 5Х буфера для ПЦР. На поверхность реакционной смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Реакцию проводили при следующих температурных и временных режимах: 30 циклов при 94 °С - 30 с, 53 °С - 30 с , 72 °С - 30 с.

Для реамплификации использовали ту же реакционную смесь за исключением праймеров - EN2, EN4 (табл. 1) и IS2, IS3 (табл. 2). Реакцию проводили при

следующих температурных и временных режимах: 25 циклов при 94 °С - 30 с, 57 °С

- 30 с, 72 °С - 30 с.

ПЦР для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3. Для каждого из парвовирусов проводили отдельную реакцию в два этапа («nested» ПЦР). Реакционная смесь для всех вирусов, как в первой, так и во второй реакциях составлялась аналогично, за исключением праймеров (Табл. 3). Амплификацию и реамплификацию осуществляли в реакционной смеси объёмом 25 мкл следующего состава: 11 мкл денонсированной воды, по 1 мкл 10 пмоль прямого и обратного праймера, 3 мкл 25 мМ MgCfe, 1 мкл 10 мМ dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 5мкл 5Х буфера для ПЦР. К реакционной смеси добавляют 3 мкл раствора ДНК. На поверхность реакционной смеси наслаивают 20 мкл минерального масла.

Температурно-временные режимы: амплификация - 1 цикл, при 95 °С в течение 2 мин; 30 циклов, при 94°С-30 с, 50° С-30 с, 72°С-40 с; 1 цикл, при 72 °С в течение 5 мин; реамплификация - 25 циклов, при 95 0 С - 30 с, 60 0 С - 30 с, 72 сС

- 40 с; 1 цикл: при 72 °С в течение 5 мин.

Электрофорез в агарозном геле. Анализ продуктов амплификации проводили методом элекрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Очистка продуктов ПЦР. Амплифицированные в ПЦР фрагменты ДНК очищали с помощью набора реактивов «Wizard® PCR Preps DNA Purification System» (Promega) согласно методике производителя.

Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК и «ДНК. Секвенирование продуктов ПЦР осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.

Расчёт эпизоотологических показателей и статистическая обработка данных. Определение требуемого объёма выборки для проведения выборочного исследования популяции крупного рогатого скота РФ по оценке превалентности по заданным критериям осуществляли по методу Cannon и Roe (1982 г.). Данный метод позволяет с 95-99% достоверностью выносить заключение о статусе исследуемого объекта.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка метода ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС

с использованием ВКО Анализ нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС. Для

разработки метода ПЦР с целью выявления генома энтеровируса КРС были

g

проанализированы нуклеотидные последовательности, содержащиеся в компьютерной базе данных GenBank (www. ncbi.nlm.nih.gov). Анализ показал невозможность использования областей, кодирующих капсидные и некапсидные белки в качестве мишени для праймеров, по причине отсутствие областей, консервативных для всех штаммов энтеровируса КРС. В связи с этим, фрагмент 5' -нетранслируемой области генома был выбран в качестве мишени для ПЦР.

Выбор первичной структуры праймеров. После проведения сравнительного анализа первичной структуры выбранного фрагмента генома были сконструированы 6 праймеров, специфичных для данного вируса (табл.1).

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления _ генома энтеровируса КРС__

Наименование праймера Последовательность нуклеотидов Локализация праймеров *

ENI 5 GTА ССТ TTG TAC GCC TGT TTT -3 ' 66-86

EN2 5 ТСА AGC ACT ТСГ GTT ТСС СС -3 ' 270-289

EN3 5'- С АС ААС ССС AGT GGT AGC -3' 369-386

EN4 5'- GGA ТТА GCA GCA TTC ACG GC -3' 528-547

EN5 5'- GTC TGT ТСС GCC ТСС ААС ТГ -3' 598-617

EN6 5'- GTA GTC TGT ТСС GCC ТСС АА -3' 601-620

•соответствует нуклеотидной последовательности штамма энтеровируса К2577 (номер доступа в GenBank AF123432).

Оптимизация условий постановки ОТ ПЦР. Для увеличения чувствительности и специфичности ПЦР был разработан вариант «nested» ПЦР с двумя парами праймеров. Проверка различных комбинаций праймеров показала, что для обратной транскрипции и амплификации наиболее удачной оказалась комбинация праймеров EN1/EN5, для реамплификации - EN2/EN4.

В ходе работы были оптимизированы следующие параметры ОТ ПЦР: концентрации dNTP, ионов Мд2+ и праймеров, количество вносимой ДНК, температурно-временные режимы реакции.

На рис. 2 показана электрофореграмма продуктов реамплификации после проведения ОТ ПЦР.

ззк

242'

-279

M 1 2 M 3 4 5

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ОТ ПЦР энтеровируса КРС

Цифрами и буквами обозначены дорожки: 1 - полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/1; 2 - полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/2; 3 - полевой изолят Stavrovskiy/Vladimir/2006; 4 - полевой изолят Centralnoe/N.Novgorod/2008; 5 - вода (отрицательный контроль ПЦР); М - маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. Стрелками обозначены длины фрагментов п.н.

Специфичность разработанного метода проверили на материалах, содержащих гетерологичные вирусы, а также вирусы, вызывающие заболевания со сходными клиническими признаками. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.

В отсутствие аналогичных методов мы попытались провести сравнение разработанного нами метода, с методами, основанными на одношаговой «one-step» ПЦР и не предполагающими прямого выявления генома вируса в патологическом материале. Воспроизведенные нами методы, предложенные Theng-Theng Fong с соавт. (2005) и Knowles (2005), не выявляли наличие генома энтеровируса в пробах. Полученные результаты вынудили нас отказаться от дальнейшего использования ранее опубликованных методов.

Использование внутреннего контрольного образца при выявлении генома энтеровируса КРС. Для амплификации фрагмента генома ИББ была разработана система праймеров, фланкирующих фрагмент 185 п.н. (табл. 2).

ВКО добавляли в исследуемую пробу на стадии выделения РНК. Далее при составлении реакционных смесей добавляли соответствующие пары праймеров.

Таблица 2

Структура праймеров для амплификации фрагмента генома инфекционной _бурсальной болезни_

Наименование праймеров Первичная структура Локализация праймеров *

IS1 5'- ССТ ATO GAA GTG GGA CCT АСА TG -3' 580-602

IS2 5'- TAC ACT TTT GAG AGC АТС GCG -3' 681-701

IS3 5'- СТТ GAT GAC TTG AGG TTG ATT TTG -3' 842-865

1S4 5'- ACG TTA TTT GGG CTG TTG GAC -3' 1160-1180

'соответствует нуклеотидной последовательности инфекционной бурсальной болезни штамма Winterfield-2512 (номер доступа в GenBank AF083092).

Наличие ампликона ВКО, длиной 185 п.н. в реакционной смеси свидетельствовало о нормальном прохтоедении выделения РНК, реакций обратной транскрипции и амплификации, а также об отсутствия ингибиторов ПЦР (Рис 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ОТ ПЦР энтеровируса КРС с использованием ВКО

Цифрами и буквами обозначены дорожки: 1 - ВКО + полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/1; 2 - ВКО + полевой изолят stavrovskiy/Vladimir/2006; 3 - ВКО + полевой изолят centralnoe/N.Novgorod/2008; 4 - полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/2; 5 - ВКО; 6 - вода (отрицательный контроль ПЦР); М -маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. Стрелками обозначены длины фрагментов п.н.

Стоит отметить, что применение ВКО не влияло на чувствительность выявления генома энтеровируса КРС.

Применение ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС. В течение 2006-2009ГГ. было проанализировано 246 проб от животных различных возрастных групп из 70 хозяйств РФ. Энтеровирус КРС был выявлен в 16 пробах, при этом его обнаруживали в фекалиях, лёгких и носовых смывах. При наличии в тестируемом материале генома энтеровируса КРС проводили секвенирование продуктов ПЦР.

Сравнительный анализа первичной последовательности амплифицированных фрагментов и соответствующих участков геномов 20 опубликованных энтеровирусов КРС и 10 наиболее сходных энтеровирусов других видов животных и человека показал, что генетическая гомология между различными представителями вида энтеровируса КРС составляет 73-93%, между энтеровирусом КРС и энтеровирусами других хозяев - 50-59%, а между энтеровирусом КРС и выявленными нами полевыми изолятами - 75-95%. Это дало нам возможность идентифицировать выявленные нами агенты как энтеровирус КРС.

Стоит отметить, что наряду с энтеровирусом КРС в 50% проб одновременно выявляли другие инфекционные агенты (парвовирус КРС 1; парвовирус КРС 3; вирус инфекционного ринотрахеита; коронавирус КРС; вирус вирусной диареи КРС; ротавирус КРС; сМатус1ор11Па ресогит; раз1еиге11а тиНосйа; мапп11е1гша Иаето1уйса).

Исследование распространённости энтеровируса КРС в Центральном федеральном округе. Обследование 13 стад расположенных в 7 регионах страны, входящих в ЦФО (Московская, Владимирская, Тамбовская, Брянская, Белгородская, Тверская, Костромская области) показало, что стадная превалентность инфицирования энтеровирусом КРС телят весьма высока и составляет 61,5%. Индивидуальная превалентность среди всех обследованных животных составила 11,5%. В стадах, где был выявлен энтеровирус КРС, превалентность составила 18,8%.

Для 45 изолятов, выявленных в настоящем исследовании, были определены нукпеотидные последовательности амплифицированных фрагментов. Филогенетический анализ ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС с выявленными нами изопятами показал, что энтеровирусы КРС, циркулирующие на территории Российской Федерации, характеризуются высокой генетической гетерогенностью (Рис. 5). Генетическая гомология между данными изолятами варьировала от 74% до 99%.

маг/мо^км/гоов/г/г

Маг/Мс*кс»>Г2006/г/4 М»/Ммко««200в/г/ 1 маг/ммком/госют М»г1Моак»*200&2/Э ОгаМмксм/гООвИ 0г«/моако*>/200в Опялоюжжаал огв'Ммксм/гооаг Осе/Мсв(пУ*1200а4 маг/мдешт/гоо&но Маг/Мое кочу/200^1 Маг/Мо*ко«/200в/1 '1 Мвг/Ммшмлооап /2 «»»©в^огалетов'! Ку*/Ве1до<о<1/200в/1 /2 Ку*/Ве1д огой/гООвН /1

0 5в/9бля1эа<ьо*>« УО 20в>1 -эаг«мп« Кус№е1вого<У200»Э Кус/Ве1доге<1/г00а12/1

|_епМа<Ят1г/гос»2/1 1_еп/\Л»сИт*/г00&2/2

Каг/Ко« (от а/2008 Каг/Ко«1гота«ЮаЛ Ки/Кое(гот^200а/г ЗИу/КовИоттЯаом ЭП у/Кй«1гвта/200в/2Г2

б Ьу/Ксх(п)п1 а/200№2/1 Б Ьу/Ко«1п>та/200№ 1 в Ьу/Ков&опнЛООв/11 вьу Ктгота/гООв/1 /4 вЬу'Кмтта/гОО»!/: ЗЬу/Комгот«Л0С№1Я Б Лу/Ко«го та/ЗОС» 1« ЭА/Ьо<Ипе

Р387/Ве1Га«М>о*1г»е рэ ег/ьсМп«

>п» зв/аг/ьоук)«

О 1«3/9Б/Ьоч4п«

О 14/1(9№мч*п» внукомгота/гоое/з . 5^К«|гота/2а»ЗЛ ' IБ Ьу/КоМготв/200&0/3

вО 11В2 11/Ьо>*1в Е в-в2/Ьо»*»е омн/ъочм«

Р8 ааъо*1« 1СЛ4Ъо*пе \"3527Лк»Ип« РгУТатЬспугООв РПЛат1хМ2аоа'1 РгУТатЬоуггОСШ

J Рго/Вгу»п»к/2208 0|РгоУВ<уа1>»к/22ОаЛ 81Э0&Ь0У1п«

Рис.5. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС с выявленными нами

изолятами

Не менее важным и эпизоотически значимым фактом нашего исследования было то, что в 4 из 8 хозяйств регистрировали одновременное присутствие нескольких различных изолятов изучаемого вируса. При этом, в отдельных стадах, уровень различий между изолятами составлял 13%.

3.2. Разработка метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования

Анализ нуклеотидных последовательностей парвовирусов КРС 1, 2, 3.

Сравнительный анализ геномов парвовирусов КРС, принадлежащих разным родам,

продемонстрировал отсутствие консервативных для трех вирусов участков генома. Данное обстоятельство исключило возможность создания универсальных праймеров, позволяющих выявлять геном трех парвовирусов КРС одновременно в одной реакции.

Выбор первичной структуры праймеров, и оптимизация условий постановки ПЦР. Основной задачей нашего исследования было создание трех отдельных «nested» ПЦР, имеющих идентичные условия реакции и отличающихся лишь набором праймеров. В итоге были разработаны три группы праймеров (табл. 3).

Таблица 3

Нукпеотидные последовательности праймеров для выявления генома _парвовирусов КРС_

Реакция Наименование праимера Последовательность нуклеотидов (5'-3') Локализаци я праймеров Длина фрагмента, н.

Парвовирус КРС 1

Амплификация BPV1F1 5-САА GCA CAT CCA АТС AAC AG-3' 3674-3693» 486

BPV1R1 5'-GAT CAT TGT TGT AGA CGG TCC-3' 4139-4159«

Реамплифи -кация BPV1F2 5'-AAT TGA ACT GGC GAC TCG GTC C-3' 3744-3765* 305

BPV1R2 5-CCAGGT GTT GCC AGT CAT TAG GA-3' 4026-4048*

Парвовирус КРС 2

Амплификация BPV2F1 5'-CAA CAA ACT GCC AAA TAG GA-3' 1381-1400** 469

BPV2R1 5'-TCT TCT TGT TCT TGT TCC TCG-3' 1829-1849**

Реамплифи -кация BPV2F2 5'-GTA AGC TTT GTC С AC AAA AAA CCG C-3' 1572-1596** 214

BPV2R2 5'-AGC TTG TGT ATG GGA СТА CGT GCC-3' 1762-1785**

Парвовирус КРС 3

Амплификация BPV3F1 5'-GAG ATT TGC CCT ATG ATT GG-3' 370-389*** 505

BPV3R1 5-CTT CTT TTA GCG GGT GGC-3' 857-874***

Реамплифи -кация BPV3F2 5'-GTT GCC TGT GAT GCG TTC TGG-3' 423-443*** 384

BPV3R2 5-GCG GCG CTT AGG CTC GC-3' 790-806***

* соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 1 (номер в СепВапк N0.001540).

** соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 2 (номер в СепВапк N0 006259).

*** соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 3 (номер в СепВапк АР406967).

На рис. 6 показана электрофореграмма продуктов реамплификации после проведения полимеразной цепной реакции.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР парвовирусов КРС

Цифрами обозначены дорожки: 1 - ПЦР BPV1, отрицательный контроль ПЦР; 2 - ПЦР BPV1, полевой изолят Zarja/lvanovo/2008/1; 3 - ПЦР BPV1, положительный контроль ПЦР; 4 - ПЦР BPV2, отрицательный контроль ПЦР; 5 - ПЦР BPV2, полевой изолят OrlNiva/Orel/2008/1; 6 - ПЦР BPV2, положительный контроль ПЦР; 7 - ПЦР BPV3, отрицательный контроль ПЦР; 8 - ПЦР BPV3, полевой изолят Bugur/0renburg/2008/1; 9 - ПЦР BPV3, положительный контроль ПЦР; М - маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. (размер фрагментов маркера указан в п.н.).

Относительную аналитическую чувствительность разработанного нами метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 определяли сравнением с ранее опубликованными методами.

Для сравнения чувствительности выявления генома парвовируса КРС 1 использовали метод предложенный Сомковой С.Е. с соавт. (1999). При сравнении было показано, что данный метод обладает более низкой чувствительностью.

Сравнение чувствительности выявления генома парвовирусов КРС 2 и 3 не проводилось по причине того, что разработанных аналогичных методов, нами обнаружено не было. В настоящее время найдена единственная работа А11апс1ег с соавт. (2001) в которой опубликованы полные нукпеотидные последовательности парвовирусов КРС 2 и 3, а также приведены первичные структуры праймеров, специфичных данным последовательностям. Стоит отметить, что условия постановки ПЦР в работе не указаны.

По результатам проведенных экспериментов мы были вынуждены отказаться от использования праймеров, предложенных АПапс!ег с соавт. (по причине одновременной амплификации, как специфических, так и неспецифических фрагментов, затрудняющих анализ результатов.

Специфичность разработанного нами метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции была проверена на пробах, содержащих гетерологичные вирусы и вирусы, вызывающие заболевания со сходными клиническими признаками. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.

Применение ПЦР для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3. Разработанный метод был использован для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в патологическом материале, поступавшем для исследования в ФГУ ВНИИЗЖ в течение 2008 - 2009гг. Были исследованы 211 проб из 54 хозяйств РФ. Парвовирус КРС 1 был обнаружен в 13 пробах из 7 хозяйств, парвовирус КРС 2 - в 2 пробах из 1 хозяйства, парвовирус КРС 3 - в 14 пробах из 8 хозяйств. При этом парвовирусы обнаруживали в фекалиях, носовых смывах, легких, селезенке, кишечнике и сперме.

Для определения генетического родства среди выявленных нами изолятов для каждого из парвовирусов КРС был проведен филогенетический анализ (Рис. 7, 8). Исключением стали изоляты ПВ КРС 2, идентичные между собой.

Обе дендрограммы имеют вид, свидетельствующий о том, что на территории РФ циркулируют две генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 1 и две генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 3.

Kamenskoe/N.Novgo rod/2008/1 Kamenskoe/N. Novgorod/2008/2 Ka menskoe/N. Novaorod/2008/3 Kamenskoe/N.Novgorod/2008/4 Zarja/lvanovo/2008/1 Zarja/1vanovo/2008/3 Zarja/lvan ovo/2008/2 Rodina/Rostov/2008 OrlNiva/Orel/2008 Zarja/1vanovo/2008/4 I Centralnoe/N.Novgorod/2008 . 11 M14363/USA/bovine 7 | Prigorodnoe/Tambov/2008 у Abinanti/bovine L Predport/S.Peterburg/2009 -Canine minute virus

0.1

Рис. 7. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей парвовируса КРС 1 с выявленными нами

изолятами

^го1№уа/Мо$)<ен'/200Э/1 ^

го1№у«/Мо8ко\*/2009/2

- У*гьп«уо1д5к|у/Ту«г/2009

- Аг1«гт^а/Ва$Ьког1о$1ап/2008/2 ед га4/М<»коу*/2009/1

Zalanograd/Moskow/2009/2 Z»lanogr»d/Moskow/2009/3 Akkond/Chuvashiya/2008/1 97' Akkond/Chuvashjya/2008/2 L- Artamida/Bashkortost an/2008/1 - Bovine parvovirus 3 Efra mo vskaja/Tu la/2009 Bugur/Orenburg/2008/2 Bugur/0renburg/2008/1 Avto/N.Novgorod/2008 — Human parvovirus B19-Au

> Б

Рис 8. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованной нуклеотидной последовательности парвовируса КРС 3 с выявленными нами

изолятами

Результаты филогенетического анализа позволяют говорить о том, что с помощью разработанного нами метода возможно проводить дифференциацию парвовирусов, циркулирующих на территории РФ.

Стоит отметить, что в 70% случаев, наряду с парвовирусами, выявляли другие инфекционные агенты (парвовирус КРС 1; парвовирус КРС 2; энтеровирус КРС инфекционный ринотрахеит; коронавирус КРС; вирус вирусной диареи КРС ротавирус КРС; аденовирус КРС; герпесвирус КРС 4 типа; Mycoplasma bovis Chlamydophila pecorum; Pasteurella multocida; Mannheimia haemolytica). Отдельного внимания заслуживает факт одновременного выявления генома парвовирусов КРС 1 и 2 в одной из проб фекалий.

15

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО. Метод позволяет выявлять указанный возбудитель в патологическом материале, а также проводить внутренний контроль реакции, начиная со стадии выделения РНК.

2. Проведено исследование распространённости энтеровируса в стадах КРС Центрального федерального округа РФ. Показано что превалентность данного вируса среди стад ЦФО РФ составила 61,5 %. Индивидуальная превалентность среди всех обследованных животных составила 11,5 %. В стадах, где был выявлен энтеровирус КРС, превалентность составила 18,8%.

3. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома энтеровируса КРС. Сравнительный анализ выявленных изолятов показал, что энтеровирус КРС, циркулирующий на территории РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Генетическая гомология между данными изолятами варьировала от 74 до 99%.

4. Разработан метод выявления генома парвовирусов КРС 1,2,3с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования. Данным методом было исследовано 211 проб патологического материала. Парвовирус КРС 1 был обнаружен в 13 пробах, парвовирус КРС 2 - в 2 пробах, парвовирус КРС 3 - в 14 пробах. Изоляты парвовирусов КРС 2 и 3 были выявлены на территории РФ впервые.

5. Установлены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов выявленных парвовирусов КРС 1, 2, 3. Сравнительный анализ данных последовательностей с аналогичными фрагментами опубликованных последовательностей парвовирусов КРС показал: идентичность изолятов парвовирусов КРС 1 составила 96 - 100 %, парвовирусов КРС 2 составила 97%, парвовирусов КРС 3 составила 87 - 100%. Высокая идентичность изолятов парвовирусов подтверждает данные о консервативности генома парвовирусов.

6. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей установлено, что на территории РФ циркулируют 2 генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 1, одна из которых выявлена впервые, а также 2 генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 3, одна из которых выявлена впервые.

7. Геном энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 выявляли у животных всех возрастных групп. При этом энтеровирус обнаруживали в фекалиях, лёгких и

мазках из носа, парвовирусы обнаруживали в фекалиях, носовых смывах, легких, селезенке, кишечнике и сперме.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для использования в практической работе рассмотренные и одобренные Ученым советом, и утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» методики:

- «Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции»;

- «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции».

Полученные данные о нуклеотидных последовательностях энтеровируса КРС и парвовирусов КРС могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов.

6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выявление генома энтеровируса крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования / С. А. Кочетков, А. Е. Вечеров, С. А. Чупин, Л. Б. Прохватилова, В.А. Мищенко // Ветеринария. - 2009. -№10.-С. 53 - 56.

2. Распространение энтеровируса крупного рогатого скота на территории Центрального Федерального округа РФ / С. А. Кочетков, М.А. Шибаев, С. А. Чупин, Л. Б. Прохватилова, В.А. Мищенко II Ветеринарная патология. - 2009. - №4. - С. 17-20.

3. Кочетков С. А., Прохватилова Л. Б., Мищенко В. А. Разработка метода выявления парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Международная научно-практическая конференция молодых ученых. - Покров, 2009. -С. 102-106.

Подписано в печать 11.05.2010 г. Заказ № 5 Формат 60*90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 90 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочетков, Сергей Андреевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика семейства Picornaviridae.

1.2. Основные свойства энтеровирусов.

1.2.1. Строение вириона.

1.2.2. Физико-химические свойства энтеровируса КРС.

1.2.3. Структура и организация генома.

1.2.4. Вирусные протеины.

1.2.5. Репликация.

1.2.6. Антигенные свойства вируса и иммунитет при энтеровирусной инфекции.

1.2.7. Эпизоотологические данные.

1.2.8. Клинические признаки и патологоанатомические изменения.

1.3. Характеристика семейства Parvoviridae.

1.4. Основные свойства парвовирусов.

1.4.1. Строение вириона.

1.4.2. Физико-химические свойства.

1.4.3. Структура и организация генома.

1.4.4. Вирусные протеины.

1.4.5. Репликация парвовирусов.

1.4.6. Антигенные свойства.

1.4.7. Эпизоотологические данные.

1.4.8. Клинические признаки и патологоанатомические изменения.

1.5. Диагноз и дифференциальный диагноз энтеровируса и парвовирусов КРС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов выявления генома энтеровируса и парвовирусов КРС"

Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания КРС наносят значительный экономический ущерб в странах с развитым скотоводством. Инфекционные энтериты привлекают внимание ученых и практиков вследствие их широкой распространенности, полиэтиологичности, а также низкой профилактической и терапевтической эффективности проводимых мероприятий. В большинстве случаев заболеваемость молодняка очень высокая (около 100%), а смертность достигает 50%.

В последние годы достигнуты определенные успехи в изучении инфекционных заболеваний молодняка вирусной и бактериальной природы. Основными этиологическими агентами, вызывающими высокую заболеваемость и гибель телят, признаны ротавирусы и коронавирусы. Однако, по мере организации эффективных методов борьбы с одними болезнями, приобретают важное значение другие заболевания (7).

В настоящее время появляется все больше сообщений о том, что энтериты телят могут вызываться ротавирусами, коронавирусами, энтеровирусами (ЭВ), парвовирусами (ПВ), вирусом диареи крупного рогатого скота, герпесвирусом, хламидиями, способными вызывать заболевание самостоятельно, или в различных сочетаниях. Решение проблемы борьбы с этими болезнями осложняется преимущественно смешанной формой их течения. (70, 26, 103)

Высокая патогенность возбудителей данных заболеваний, их устойчивость во внешней среде, способность к персистенции в организме хозяина приводит к быстрому распространению этих болезней. Одной из причин, порождающих трудности в борьбе с этими заболеваниями, является недостаток знаний об их этиологии, о свойствах агентов, их вызывающих, методах диагностики, профилактики и лечения (7).

Учитывая сходство в течение заболевания, важную роль играет своевременная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики. Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, реакция нейтрализации не всегда обладают достаточной чувствительностью, а выделение в культуре клеток сопряжено со значительными временными затратами. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность и чувствительность. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов.

Не смотря на выше сказанное, до настоящего момента в Российской Федерации методы выявления генома энтеровируса и парвовирусов КРС не разрабатывались.

Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы.

Цели и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка методов выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в биологических образцах с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования, а также изучения распространённости и генетического разнообразия данных вирусов на территории Центрального федерального округа Российской Федерации (ЦФО РФ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить первичную структуру исследуемых областей генома ранее изученных штаммов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3;

- разработать методы выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования;

- установить первичную структуру и провести сравнительный анализ амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3;

- изучить возможность применения разработанных методов для выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в материалах от естественно инфицированных животных; изучить распространённость и генетическое разнообразие энтеровируса и парвовирусов КРС на территории РФ с помощью разработанных метода;

Научная новизна и теоретическое значение. Разработаны методы ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО и метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в образцах вируссодержащего материала с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования.

Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей 5' - нетранслируемой области генома полевых изолятов энтеровируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры данных фрагментов генома энтеровируса КРС. Исследованы вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами и ранее опубликованными последовательностями энтеровируса КРС. Впервые изучено распространение и генетическое разнообразие энтеровируса КРС, циркулирующего на территории РФ.

С использованием разработанного метода определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленных на территории РФ, изучено их генетическое разнообразие. Изучение парвовирусов КРС 2, 3 в РФ проводилось впервые.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработаны:

- «Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции» (2008г.). Методика предназначена для выявления генома энтеровируса КРС в патологическом материале от КРС;

- «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены ученым советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО;

- метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 при помощи полимеразной цепной реакции и секвенирования;

- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов энтеровируса КРС, а так же его филогенетические взаимоотношения;

- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3;

- результаты применения разработанных методов выявления генома указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных животных;

- результаты исследований распространенения и генетического разнообразия энтеровируса КРС на территории Центрального Федерального округа РФ с помощью разработанного метода;

- результаты исследования генетического разнообразия парвовирусов 1, 2, 3, обнаруженных в материалах от естественно инфицированных животных на территории РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2009 г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2007 - 2009 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, две из них опубликованы в журналах «Ветеринария» и «Ветеринарная патология», которые предусмотрены перечнем ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 126 источников, в том числе 14 на русском языке и 112 зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кочетков, Сергей Андреевич

4. ВЫВОДЫ

Л. Разработан метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО. Метод позволяет выявлять указанный возбудитель в патологическом материале, а также проводить внутренний контроль реакции, начиная со стадии выделения РНК.

2. Проведено исследование распространённости энтеровируса в стадах КРС Центрального федерального округа РФ. Показано что превалентность данного вируса среди стад ЦФО РФ составила 61,5 %. Индивидуальная превалентность среди всех обследованных животных составила 11,5 %. В стадах, где был выявлен энтеровирус КРС, превалентность составила 18,8%.

3. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'— нетранслируемой области генома энтеровируса КРС. Сравнительный анализ выявленных изолятов показал, что энтеровирус КРС, циркулирующий на территории РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Генетическая гомология между данными изолятами варьировала от 74 до 99%.

4. Разработан метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования. Данным методом было исследовано 211 проб патологического материала. Парвовирус КРС 1 был обнаружен в 13 пробах, парвовирус КРС 2 - в 2 пробах, парвовирус КРС 3 - в 14 пробах. Изоляты парвовирусов КРС 2 и 3 были выявлены на территории РФ впервые.

5. Установлены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов выявленных парвовирусов КРС 1, 2, 3. Сравнительный анализ данных последовательностей с аналогичными фрагментами опубликованных последовательностей парвовирусов КРС показал: идентичность изолятов парвовирусов КРС 1 составила 96 - 100 %, парвовирусов КРС 2 составила 97%, парвовирусов КРС 3 составила 87 — 100%. Высокая идентичность изолятов парвовирусов подтверждает данные о консервативности генома парвовирусов.

6. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей установлено, что на территории РФ циркулируют 2 генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 1, одна из которых выявлена впервые, а также 2 генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 3, одна из которых выявлена впервые.

7. Геном энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 выявляли у животных всех возрастных групп. При этом энтеровирус обнаруживали в фекалиях, лёгких и мазках из носа, парвовирусы обнаруживали в фекалиях, носовых смывах, легких, селезенке, кишечнике и сперме.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для использования в практической работе рассмотренные и одобренные Ученым советом, и утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» методики:

1 —« Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции»; «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции».

Полученные данные о нуклеотидных последовательностях энтеровируса КРС и парвовирусов КРС могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочетков, Сергей Андреевич, Владимир

1. Аянот П.К., Тимина A.M., Вечеров А.Е. Анализ нуклеотидной гомологии фрагмента гена VP2 полевых изолятов и референтных штаммов парвовируса крупного рогатого скота // Вестн. РАСХН. — 2002. № 5. - С. 75-77.

2. Вирусология Т. 2. Пер. с англ. / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа при участии Р. Ченока, Б. Ройзмана, Дж. Мелника, Р. Шоупа. М.: Мир, 1989.-С. 190-241.

3. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.Н. Соловьёв, Н.В. Фомина. М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 584-586.

4. Дудников С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики. Владимир: Демиург, 2004.

5. Инфекционная патология животных Т. 1 / под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьёва, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. М.: Академкнига, 2006. -С. 525-534.

6. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят / Х.З. Гаффаров, А.В. Иванов, Е.А. Непоклонов, А.З. Равидов // Казань: Фэн, 2002. С. 93-101.

7. Неполиомиелитные энтеровирусные инфекции: эпидемиология, характеристика энтеровирусов, клиника, диагностика, профилактика: метод, пособие / В.А. Лашкевич, С.Г. Дроздов, В.П. Грачев и др.; Федеральный центр Госсанэпиднадзора РФ. М., 2004.

8. Особенности парвовирусной инфекции крупного рогатого скота / В.А. Мищенко, Н.А. Ярёменко, А.А. Гусев и др. // Ветеринария. 2000. -№5.-С. 19-21.

9. Парвовирусы плотоядных и вызываемые ими болезни: монография / Н.А. Власов, В.И. Уласов, И.С. Черняева и др.. Ульяновск, 2000. -37 с.

10. Пономарев А.П., Узюмов B.JL, Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006.-С. 10-21.

11. Щербакова Т.Б. Иммуноферментная диагностика парвовирусной инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. . канд. вет. наук. -М, 1993.-21 с.

12. Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика: Методические указания МУ 3.1.1.213006. М., 2006.

13. Яруллин А.И. Разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. . канд. биол. наук. Казань, 2009. — 20 с.

14. A new serotype of bovine parvovirus / Y. Inaba, H. Kurogi, T. Omori, M. Matumoto // Jpn. J. Microbiol. 1973. - Vol. 17. - P. 85-86.

15. A protein covalently linked to poliovirus genome RNA / Y.F. Lee, A. Nomoto, B.M. Detjen, E. Wimmer // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74, N 1. - P. 59-63.

16. A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species / T. Allander, S.U. Emerson, R.E. Engle et al. // J. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98, N20.-P. 11609-11614.

17. Abad F.X., Pinto R.M., Bosch A. Survival of enteric viruses on environmental fomites // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60, N 10. -P. 3704-3710.

18. Adeno-associated virus general transduction vectors: Analysis of proviral structures / S.K. McLaughlin, P. Collis, P.L. Hermonat, N. Muzyczka // J. Virol, 1988.-Vol. 62.-P. 1963-1973.

19. Agbandje M., Parrish C.R., Rossmann M.G. The structure of parvoviruses // Semin. Virol. -1995. Vol. 6. - P. 299-309.

20. Abinanti F.R., Warfield M.S. Recovery of a hemadsorbing virus (HADEN) from the gastrointestinal tract of calves // Virology. 1961. - Vol. 14. - P. 288-289.

21. Atchison R.W., Casto B.C., Hammon W. Adenovirus-associated defective vims particles // Science. 1965. - Vol. 149. - P. 754-756.

22. Autonomous parvovirus LuIII encapsidates equal amounts of plus and minus DNA strands / R.C. Bates, C.E. Snyder, P.T. Banerjee, S. Mitra // J. Virol. -1984. Vol. 49. - P. 319-324.

23. Banerjee R., Dasgupta A. Interaction of picornavirus 2C polypeptide with the viral negative-strand RNA // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P. 26212627.

24. Barya M.A., Moll Т., Mattson D.E. Antigenic analysis of bovine enteroviruses through studies of kinetics of neutralization // Am. J. Vet. Res. 1967. - Vol. 28. - P. 1283-1294.

25. Bates R.C., Storz J. Host cell range and growth characteristics of bovine parvoviruses // J. Infect. Immunol. 1973. - Vol. 7, N 3. - P. 398-402.

26. Baxt В., Grubman M., Bachrach H. The relation of poly(A) length to specific infectivity of viral RNA: a comparison of different types of foot-and-mouth disease viruses // Virology. 1979. - Vol. 98. - P. 480-483.

27. Boege U., Ко D.S., Scraba D.G. Toward an in vitro system for picornavirus assembly: Purification of mengovirus 14S capsid precursor particles // J. Virol. 1986. - Vol. 57. - P. 275-284.

28. Caspar D.L., Klug A . Physical pri nciples in the construction of regular viruses // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1962. - Vol. 27. - P. 1

29. Cellular proteins required for adeno-associated virus DNA replication in the absence of adenovirus coinfection / Т.Н. Ni, W.F. McDonald, I. Zolotukhin et al. // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 2777-2787.

30. Cloning of the human parvovirus В19 genome and structural analysis of its palindromic termini / V. Deiss, J.D. Tratschin, M. Weitz, G. Siegl // Virology. 1990. - Vol. 175. - P. 247-254.

31. Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus / K.C. Chen, B.C. Shull, E.A. Moses et al. // J. Virol. 1986. -Vol. 60.-P. 1085-1097.

32. Cotmore S.F., Nuesch J.P., Tattersall P. In vitro excision and replication of 5' telomeres of minute virus of mice DNA from cloned palindromic concatemer junctions // Virology. 1992. - Vol. 190. - P. 365-377.

33. Cotmore S.F., Tattersall P. The autonomously replicating parvoviruses of vertebrates // Adv. Virus Res. 1987. - Vol. 33. - P. 91-174.

34. Covalentlinkage of a protein to a defined nucleotide sequence at the 5'-terminus of virion and replicative intermediate RNAs of poliovirus / J.B. Flanegan, R.F. Petterson, V. Ambros et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1977.-Vol. 74, N 3.-P. 961-965.

35. Crawford N.M., Baltimore D. Genome-linked protein VPg of poliovirus is present as free VPg and VPg-pUpU in poliovirus-infected cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80. - P. 7452-7455.

36. Dunne H.W., Huang C.M., Lin W.J. Bovine enteroviruses in the calf: an attempt at serologic, biologic, and pathologic classification // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1974. - Vol. 164. - P. 290-294.

37. Eigen M. Viral quasispecies. // Sci. Am. 1993. - Vol. 269, N 1. - P. 42.

38. Evidence for a single-stranded adenovirus-associated virus genome: Formation of a DNA density hybrid on release of viral DNA / J.A. Rose, IC.I. Berns, M.D. Hoggan, F.J. Koczot // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1969. -Vol. 64.-P. 863-869.

39. Fatal ulcerative and hemorrhagic typhlocolitis in a pregnant heifer associated with natural bovine enterovirus type-1 infection / U. Blas-Machado, J. T. Saliki, M. J. Boileau et al. // Vet. Pathol. 2007. - Vol. 44. -P. 110-115.

40. Fong T.-T., Griffin D.W., Lipp E.K. Molecular assays for targeting human and bovine enteric viruses in coastal waters and their application for library-independent source tracking // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol. 71.- P. 2070-2078.

41. Functional features of the bovine enterovirus 5'-non-translated region / R. Zell, K. Sidigi, A. Henke et al. / J. Gen. Virol. 1999. - Vol. 80. - P. 2299-2309.

42. Functional implications of the structure of the murine parvovirus, minute virus of mice // M. Agbandje-McKenna, A.L. Llamas-Saiz, F. Wang et al. //Structure. 1998.-Vol. 6.-P. 1369-1381.

43. Giachetti C., Semler B.L. Role of a viral membrane polypeptide in strand-specific initiation of poliovirus RNA synthesis // J. Virol. 1991. - Vol. 65.- P.2647-2654.

44. Girard M., Baltimore D., Darnell J.E. The poliovirus replicaiton complex: Sites for synthesis of poliovirus RNA // J. Mol. Biol. 1967. - Vol. 24. - P. 59-74.

45. Grubman M., Baxt В., Bachrach H. L. Foot-and-mouth disease virion RNA: studies on the relation between the length of its 3' poly (A) segment and infectivity // Virology. 1979. - Vol. 97. - P. 22-31.

46. Gur S., Tan T.N., Ozgiinliik I. Serological investigation of bovine enterovirus (BEV) type 1 and 2 in cattle in Aydin province // J. Pendik. Vet. Mikrobiyol. Derg. 2004. - Vol. 35, N 1-2. - P. 3-6.

47. Gur S.I., Yapkif О., Yilmaz A. Serological survey of bovine enterovirus type 1 in different mammalian species in Turkey // J. Zoonoses and Public Health. 2008. - Vol. 55, N2.-P. 106-111.

48. Halperen S., Eggers H.J., Tamm I. Evidence for uncoupled synthesis of viral RNA and viral capsids // Virology. 1964. - Vol. 24. - P. 36-46.

49. Hermonat P.L., Muzyczka N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. - P. 6466.

50. Herpes simplex virus types 1 and 2 completely help adenovirus-associated virus replication // R.M. Buller, J.E. Janik, E.D. Sebring, J.A. Rose // J. Virol. 1981.-Vol. 40.-P. 241-247.

51. Hogle J.M., Chow M., Filman D.J. Three dimensional structure of poliovirus at of 2.9A resolution // Science. 1985. - Vol. 229. - P. 1358-1365.

52. Holland J.J., De La Torre J.C., Steinhauer D.A. RNA virus populations as quasispecies 11 Curr. Top. Microbiol. Immunol.— 1992. — Vol. 176. P. 120.

53. Hruby D.E., Roberts W.K. Encephalomyocarditis virus RNA: variations in polyadenylic acid content and biological activity // J. Virol. 1976. - Vol. 19.-P. 325-330.

54. Huck R.A., Cartwright S.F. Isolation and classification of viruses from cattle during outbreaks of mucosal or respiratory disease and from herds with reproductive disorders / J. Сотр. Pathol. 1964. - Vol. 74. - P. 346-365.

55. Huck R.A., Woods D.W., Orr J.P. Isolation of a bovine parvovirus in the United Kingdom // Vet. Rec. 1975. - Vol. 96 . - P. 155 -156.

56. Integration of the adeno-associated virus genome into cellular DNA in latently infected human Detroit 6 cells / A.K. Cheung, M.D. Hoggan, W.W. Hauswirth, K.I. Berns // J. Virol. 1980. - Vol. 33. - P. 739-748.

57. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Режим доступа: http://www.ictvonline.org.

58. Intertypic genomic rearrangements of poliovirus strains in vaccines / N. Cammack, A. Phillips, G. Dunn et al. // Virology. 1988. - Vol. 167. - P. 507-514.

59. Isolation of bovine parvovirus type I in Australia / L.O. Wosu, R.H. Johnson, I. Goodchild, P. Bachman // Aust. Vet. J. 1978. - Vol. 55. - P. 199-200.

60. Isolation of picornavirus from feces and semen from an infertile bull / S.L. Weldon, J.L. Blue, R.E. Wooley, P.D. Lukert // J. Am. Vet. Med. Assoc. -1979.-Vol. 174.-P. 168-169.

61. Jacobson M.F., Baltimore D. Morphogenesis of poliovirus. I. Association of the viral RNA with coat protein // J. Mol. Biol. 1968. - Vol. 33. - P. 369378.

62. Jarvis T.C., Kirkegaard K. Poliovirus RNA recombination: Mechanistic studies in the absence of selection//EMBO J. 1992. - Vol. 11. - P. 31353145.

63. Johnson F.B. Parvovirus proteins // The Parvoviruses / ed. K.I. Berns. New York, 1983.

64. Kirkegaard K., Baltimore D. The mechanism of RNA recombination in poliovirus // Cell. 1986. - Vol. 47. - P. 433-443.

65. Knowles N. J. Genetic relationships between bovine enteroviruses in VP1 and 3Dpol / Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Pirbright, Woking, Surrey, UK. Режим доступа: http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ bev/knowlesbev2005.pdf

66. Knowles N.J., Barnett I.T. A serological classification of bovine enteroviruses // Arch. Virol. 1985. - Vol. 83. - P. 141-155.

67. Kotin R.M., Berns K.I. Organization of adeno-associated virus DNA in latently infected Detroit 6 cells // Virology. 1989. - Vol. 170. - P. 460-467.

68. Kunin C.M., Minuse E. The isolation in tissue culture, chick embryo and suckling mice of filtrable agents from healthy dairy cattle II J. Immunol. -1958.-Vol. 80.-P. 1-11.

69. Laughlin СЛ., Cardellichio C.B., Coon H.C. Latent infection of KB cells with adeno-associated virus type 2 // J. Virol. 1986. - Vol. 60. - P. 515524.

70. Ley V., Higgins J., Fayer R. Bovine enteroviruses as indicators of fecal contamination // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68, N 7. - P. 3455-3461.

71. Liggitt H.D., DeMartini J.C., Pearson L.D. Immunologic responses of the bovine fetus to parvovirus infection // Am. J. Vet. Res. 1982. - Vol. 43, N 8.-P. 1355-1359.

72. Lusby E., Fife K.H., Berns K.I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA // J. Virol. 1980. - Vol. 34. - P. 402-409.

73. MacNaughton M.R., Dimmock N. J. Poly adenylic acid sequences in rhinovirus RNA species from infected human diploid cells // J. Virol. 1975. -Vol. 16.-P. 745-748.

74. McPherson R.A., Rose J.A. Structural proteins of adenovirus-associated vims: Subspecies and their relatedness // J. Virol. 1983. - Vol. 46. - P. 523-529.

75. Molecular-based reclassification of the bovine enteroviruses / R. Zell, A. Krumbholz, M. Dauber et al. // J. Gen. Virol. 2006. - Vol. 87. - P. 375385.

76. Moll Т., Finlayson A.V. Isolation of cytopathogenic viral agent from feces of cattle // Science. 1957. - Vol. 126. - P. 401-402.

77. Muzyczka N. Berns К. I. Parvoviridae: The viruses and their replication // Fields' Virology / ed. D.N. Knipe, P.M. Howley. 4th ed. - Philadelphia, 2002. - Vol. 1. -P. 2327-2360.

78. Neutralizing antibody to human rhinovirus 14 penetrates the receptor-binding canyon / T.J. Smith, E.S. Chase, T.J. Schmidt et al. // Nature. -1996. Vol. 383. - P. 350-354.

79. Pallansch M.A., Roos R.P. Enteroviruses: polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses, and newer enteroviruses // Fields' Virology / ed. D.N. Knipe, P.M. Howley. 4th ed. - Philadelphia, 2001. - Vol. 1. - P. 723-775.

80. Parainfluenza-3 and bovine enteroviruses as possible important causative factors in bovine abortion / H.W. Dunne, S,M, Ajinkya, G.R. Bubash, LC. Griel // Am. J. Vet. Res. 1973.-Vol. 34.-P. 1121-1126.

81. Parvovirus infection of the bovine fetus: distribution of infection, antibody response, and age-related susceptibility / J. Storz, S. Young, E.J. Carrolbet al. // Am. J. Vet. Res. 1978. - Vol. 39, 7. - P. 1099-1102.

82. Picornavirales, a proposed order of positive-sense single-stranded RNA viruses with a pseudo T = 3 virion architecture // O. Le Gall, P. Christian, C.M. Fauquet et al. // Arch. Virol. - 2008. - Vol. 153, N 4. - P. 715-27.

83. Possible "immuno-protection" of the bovine parvovirus in the uterus: Preliminary communication / A.B. Bodine, C.F. Alberty, C.S. Buck et al. // J. Theriogenology. 1981.-Vol. 16, N2.-P. 201-206.

84. Racaniello V.R. Picornaviridae: The viruses and their replication // Fields' Virology / ed. D.N. Knipe, P.M. Howley. 4th ed. - Philadelphia, 2001. -Vol. 1. -P. 685-722.

85. Reyes G.R., Kim J.P. Sequence-independent, single-primer amplification (SISPA) of complex DNA populations / Mol. Cell Probes. 1991. - Vol. 5, N6.-P. 473-481.

86. Rhode S.L. Complementation for replicative form DNA replication of a deletion mutant of H-l by various parvoviruses // J. Virol. 1982. - Vol. 42. -P. 1118-1122.

87. Rhode S.L. trans-Activation of parvovirus P38 promoter by the 76K noncapsid protein / J Virol. 1985. - Vol. 55. - P. 886-889.

88. Rhode S.L., Paradiso P.R. Parvovirus genome: Nucleotide sequence of H-l and mapping of its genes by hybrid-arrested translation // J. Virol. 1983. — Vol. 45.-P. 173-184.

89. Rombaut В., Vrijsen R., Boeye A. New evidence for the precursor role of 14 S subunits in poliovirus morphogenesis // Virology. 1990. - Vol. 177. - P. 411-414.

90. Rossmann M.G. The canyon hypothesis. Hiding the host cell receptor attachment site on a viral surface from immune surveillance // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 14587-14590.

91. Rossmann M.G., Palmenberg A.C. Conservation of the putative receptor attachment site in picornaviruses // Virology. 1988. - Vol. 164. - P. 373382.

92. Simmonds P., Welch J. Frequency and dynamics of recombination within different species of human enteroviruses // J. Virol. 2006. - Vol. 80, N 1. — P. 483-493.

93. Smyth M. S., Martin J. H. Picornavirus uncoating // Mol. Pathol. 2002. -Vol. 55,N4.-P. 214-219.

94. Spahn G.J., Mohanty S.B., Hetrick F.M. Characteristics of hemadsorbing enteric (HADEN) virus // Can. J. Microbiol. 1966. - Vol. 12. - P. 653-660.

95. Spector D.H., Baltimore D. Requirement of З'-terminal polyadenylic acid for the infectivity of poliovirus RNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1974. -Vol. 71.-P. 2983-2987.

96. Srivastava A., Lusby E.W., Berns K.I. Nucleotide sequence and organization of the adeno-associated virus 2 genome // J. Virol. 1983. - Vol. 45. - P. 555-564.

97. Storz J. Bovine Parvoviruses // Vims Infections of Ruminants. -Amsterdam etc.: Elsevier Sci. Pub., 1990. Chap. 19. - P. 203-214.

98. Storz J., Bates R.C. Parvovirus infection in calves // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1973. - Vol. 163. - P. 884-886.

99. Storz J., Spears P. Pathogenesis of chlamydial polyarthritis in domestic animals: characteristics of causative agent //Ann. Rheum Dis. 1979. — Vol. 38,N 1. -P. 111-115.

100. Straus S.E., Sebring E.D., Rose J.A. Concatemers of alternating plus and minus strands are intermediates in adenovirus-associated virus DNA synthesis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 73. - P. 742-746.

101. Structure of a human common cold virus and functional relationship to other picornaviruses / M.G. Rossmann, E. Arnold, J.W. Erickson et al. // Nature. 1985.-Vol. 317.-P. 145-153.

102. Structure of a human rhinovirus complexed with its receptor molecule / N.H. Olson P R Kolatkar, M A Oliveira et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1993.-Vol. 90.-P. 507-511.

103. Structure of the 3' hairpin termini of four rodent parvovirus genomes: Nucleotide sequence homology at origins of DNA replication / C.R. Astell, M. Smith, M.B. Chow, D.C.Ward // Cell. 1979. - Vol. 17. - P. 691-703.

104. Genomic clones of bovine parvovirus: Construction and effect of deletions and terminal sequence inversions on infectivity / B.C. Shull, K.C. Chen, M. Lederman et al. //J. Virol. 1988. - Vol. 62. - P. 417-426.

105. Targeted integration of adeno-associated virus (AAV) into human chromosome 19 published erratum appears in / R.J. Samulski, X. Zhu, X. Xiao [et al. // EMBO J.- 1991 .-Vol. 10.-P. 3941; 1992.-Vol. 111. P. 1228.

106. Tattersall P. Replication of the parvovirus MVM. I. Dependence of virus multiplication and plaque formation on cell growth // J. Virol. 1972. - Vol. 10.-P. 586-590.

107. Tattersall P., Crawford L.V., Shatkin A.J. Replication of the parvovirus MVM. II. Isolation and characterization of intermediates in the replication of the viral deoxyribonucleic acid / J. Virol. 1973. - Vol. 12. - P. 1446-1456.

108. The 5'-terminal structures of poliovirion RNA and poliovirus mRNA differ only in the genome-linked protein VPg / A. Nomoto, N. Kitamura, G. Golin, E. Wimmer // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5345-5349.

109. The 5-untranslated regions of picornavirus RNAs contain independent functional domains essential for RNA replication and translation / J.B. Rohll, N. Percy, R. Ley et al. // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 43844391.

110. The canine minute virus (minute virus of canines) is a distinct parvovirus that is most similar to bovine parvovirus / D. Schwartz, B. Green, L.

111. Carmichael, C. Parrish // Virology. 2002. - Vol. 302, N 2. - P. 219-223.

112. The complete DNA sequence of minute virus of mice, an autonomous parvovirus / C.R. Astell, M. Thomson, M. Merchlinsky, D.C. Ward // Nucleic Acids Res. 1983. - Vol. 11. - P. 999-1018.

113. The crystal structure of coxsackievirus A9: new insights into the uncoating mechanism of enteroviruses / E. Hendry, H. Hatanaka, E. Fry et al. // Structure. 1999. -N 7. -P. 1527-1538.

114. The DNA of a minute virus of mice / L.V. Crawford, E.A. Follett, M.G. Burdon, D.J. McGeoch // J. Gen. Virol. 1969. - Vol. 4. - P. 37-46.

115. The most important infectious diseases of the bovine genital tract. Prevalence and incidence in north-eastern Italy / F.M. Cancellotti, G. Gagliardi, P. Dalvit, C. Turilli // 11th Conf. OIE Regional Commiss. Europe. -Vienna, 1984.-P. 231-241.

116. The nucleotide sequence of coxsackievirus A9: implications for receptor binding and enterovirus classification / K.H. Chang, P. Auvinen, T. Hyypia et al. // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70 - P. 3269-3280.

117. The three-dimensional structure of canine parvovirus and its functional implications / J. Tsao, M.S. Chapman, M. Agbandje et al. // Science. -1991.-Vol. 251.-P. 1456-1464.

118. The transcription profile of the bocavirus bovine parvovirus is unlike those of previously characterized parvoviruses / J. Qiu, F. Cheng, F.B. Johnson, D. Pintel // J. Virol. Vol. 81, N 21. - P. 12080-12085.

119. Tratschin J.D., Miller I.L., Carter B.J. Genetic analysis of adeno-associated virus: Properties of deletion mutants constructed in vitro and evidence for an adeno-associated virus replication function // J. Virol. 1984. - Vol. 51 . — P. 611-619.

120. Vincent J. Isolement in Algerie de quatre souches de parvovirus bovis // Ann. Inst. Pasteur. 1971.-Vol. 121.-P. 811-814.

121. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Eighth Report of the International Committe on the Taxonomy of Viruses / C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, L.A. Ball. NY: Acad. Press, 2005. - 1259 p.

122. Yogo Y., Wimmer E. Polyadenylic acid at the 3' terminus of poliovirus RNA//Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1972.-Vol. 68.-P. 1877-1882.