Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина

Филатова, Екатерина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина"

на правахру когтей

005059336

Филатова Екатерина Викторовна

БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРВОВИРУСА В19 ПРИ ОЦЕНКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРЕПАРАТОВ АЛЬБУМИНА И ИММУНОГЛОБУЛИНА

03.01.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

005059336

Работа выполнена на филиале Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации в городе Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио» и в Федеральном бюджетном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Новикова Надежда Алексеевна кандидат биологических наук Зубкова Наталия Васильевна

Официальные оппоненты:

Русанов Валентин Михайлович, д. м. н., профессор, заместитель главного врача по производству, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Станция переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы»

Карякин Александр Вадимович, д. б. н., профессор, заведующий лабораторией экспертизы, контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «29» мая 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России

Автореферат разослан __2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Зыбунова Елена Евгеньевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Альбумин и иммуноглобулины являются одними из основных белков крови, принимающих участие в обеспечении важнейших функций организма [Русанов В.М., 2004]. В связи с этим препараты альбумина и иммуноглобулина нашли широкое применение в медицинской практике. Использование альбумина и иммуноглобулина путем введения непосредственно в кровеносное русло предъявляет повышенные требования к безопасности, направленные на предотвращение вирусного инфицирования реципиентов препаратов крови.

Безопасность препаратов крови в отношении социально-значимых вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) хорошо изучена и подтверждена многолетней практикой клинического применения. Однако спектр инфекционных агентов, передающихся через кровь, постоянно расширяется. В настоящее время все большее внимание уделяется парвовирусу В19 (B19V).

Инфицирование B19V представляет опасность для беременных, лиц с иммунодефицитными состояниями и гематологическими заболеваниями, которые являются основными реципиентами крови и ее дериватов. Поражая клетки-предшественники эритроцитов, B19V может вызвать развитие тяжелой анемии и патологии во время беременности [Corcoran А., 2004]. В связи с этим в развитых странах активно ведутся комплексные исследования парвовируса В19, направленные на обеспечение безопасности препаратов крови.

Недостаточная изученность распространенности маркеров B19V среди доноров России, отсутствие знаний о молекулярно-генетических свойствах российских штаммов вируса и возможности их трансмиссии через препараты крови определили актуальность проблемы и явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель работы - комплексное исследование парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина, получаемых из плазмы крови доноров методом спиртового фракционирования.

Задачи исследования:

1. Определить частоту выявления генетических и серологических маркеров B19V в крови доноров.

2. Установить генотип выявленных штаммов B19V с использованием частичного секвенирования генома.

3. Определить частоту контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования.

4. Проследить изменение концентрации ДНК B19V и оценить уровень вирусной редукции по стадиям технологического процесса получения препаратов альбумина и иммуноглобулина из плазмы крови методом спиртового фракционирования в модельном эксперименте.

5. Исследовать препараты альбумина и иммуноглобулина, полученные на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», на содержание генетических и серологических маркеров B19V.

Научная новизна работы.

Получены новые данные о распространенности B19V среди доноров.

Впервые в России определены нуклеотидные последовательности NSl/VPlu области генома российских изолятов B19V, которые депонированы в GenBank/EMBL/DDBJ под номерами JQ518457-JQ518464, что расширяет международную базу нуклеотидных последовательностей генома B19V. Установлена принадлежность обнаруженных штаммов B19V к генотипу 1 субтипу 1а.

Впервые в России определена частота контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования отечественных производителей препаратов крови.

Впервые показано изменение концентрации ДНК B19V и оценен уровень вирусной редукции по стадиям технологического процесса получения лечебных препаратов альбумина и иммуноглобулина из плазмы крови доноров методом спиртового фракционирования.

Практическая значимость работы.

С участием автора составлены Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров» (утверждены и введены в действие приказом директора ФГБУ «ГИСК им. JI.A. Тарасевича» Минздравсоцразвития России от 21.07.2011 № 59-ОД ).

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут стать основой для пересмотра стратегии обеспечения вирусной безопасности в плане расширения спектра вирусных маркеров, обязательных для тестирования, не только при производстве препаратов крови, но и в отечественной трансфузионной медицине и Службе Крови России.

Основные положения. выносимые на защиту:

1. Генетические маркеры В19V генотипа 1 а выявлены у 1,0% доноров

крови.

2. Высокая частота выявления ДНК B19V в производственных пулах плазмы для фракционирования предполагает возможность контаминации готовых препаратов.

3. Спиртовое фракционирование вносит существенный вклад в редукцию B19V, но при отсутствии дополнительных стадий вирусной инактивации/элиминации не гаран тирует безопасность препаратов.

4. Исследованные партии препаратов альбумина и иммуноглобулина не содержат B19V, но риск трансмиссии данного патогена через препараты крови должен рассматриваться.

Апробаиия работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2013 г.);

заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»;

заседании Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 117 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 222 литературных источника, из них 214 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 6 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Работа выполнена в рамках научной тематики 06-2 «Обеспечение вирусной безопасности препаратов крови человека» филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использованы образцы сыворотки крови доноров (п=1000), производственных пулов плазмы для фракционирования (п=117), модельные пулы плазмы (п—20), содержащие B19V, полученные из них фракции (центрифугат А, осадки фракции II+III (А), Ш (Б), осадки иммуноглобулиновой фракции (В)) и готовые препараты альбумина и иммуноглобулина.

Проанализированы производственные серии препаратов «Альбумин, раствор для инфузий 10%» (п=82) и «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» (п=142), выпущенные на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «Имбио».

Выявление и количественное определение ДНК B19V проводили методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов с использованием коммерческой тест-системы «АмплиСенс Parvovirus B19-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

NSl/VPlu область генома В19V амплифицировали в «nested» варианте ПЦР с использованием оригинальной комбинации прайм еров. Нуклеотидные последовательности NSl/VPlu области ДНК B19V устанавливали методом частичного секвенирования генома с применением набора реагентов «ABI PRISM BigDay Terminator v.3.1» в автоматическом режиме на приборе ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems», США).

Для филогенетического анализа использовали нуклеотидные последовательности генома штаммов B19V (п=16), представленные в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ (М13178, FN295684, DQ225150, FN295731, FN295730, FN295635, FJ904121, FN825880, FN825878, FN295650, DQ357065, DQ357064, AY044266, AY903437, AY083234, NC_004295).

Выявление и количественное определение антител классов G (IgG) и М (IgM) к B19V проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «RIDASCREEN Parvovirus IgG» и «RIDASCREEN Parvovirus IgM» (R-Biopharm AG, Германия). При определении IgM образцы перед проведением теста обрабатывали адсорбентом IgG «RJDA G-Absorbens» (R-Biopharm AG, Германия).

Модельное фракционирование пулов плазмы, содержащих B19V, осуществляли по модифицированному методу Кона-Онкли в лабораторных условиях с использованием центрифуги с охлаждением «Optima L-90K» («Beckman Coulter», США). Пробы на анализ (осадки, центрифугаты, готовые продукты) отбирали в критических точках модельного процесса (рис. 1).

Рис. 1. Схема получения препаратов альбумина и иммуноглобулина по

модифицированному методу Кона-Онкли. 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8 - точки отбора проб.

Уровень вирусный нагрузки (УЬвіду) в исходной плазме, полученных фракциях и готовых препаратах определяли по формуле: УЪВ19У=У (т) х С,

где — уровень вирусной нагрузки, выраженный в копиях;

V (m) — объем (мл) или масса (г) материала, исходного или полученного на стадиях модельного фракционирования;

С - концентрация ДНК B19V в исследуемом материале (копий/мл (г)) или аналитическая чувствительность тест-системы, в случае получения отрицательного результата тестирования.

Фактор вирусной редукции (RF) устанавливали для каждой стадии технологического процесса относительно предыдущего этапа в соответствии с рекомендациями Европейского агентства по оценке медицинских продуктов [http://www.ema.europa.euy] по формуле:

RF= logip t

где RF — фактор редукции, VLbiw (1) — уровень нагрузки вирусной ДНК в материале с предыдущей стадии, VLBI9V (2) - уровень нагрузки вирусной ДНК в материале, полученном на исследуемой стадии.

Суммарный фактор вирусной редукции (RFv) определяли как сумму факторов, полученных для каждой анализируемой стадии фракционирования.

Статистическую обработку данных проводили с применением программного обеспечения Microsoft Excel. Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение 1 Выявление генетических и серологических маркеров парвовируса В19 в

крови допоров

Штаммы B19V характеризуются генетическим разнообразием. Выделяют три генотипа B19V (1-3) с субтипами. В связи с тем, что некоторые коммерческие тест-системы не способны выявлять ДНК B19V 2 и 3 генотипов, была проведена апробация набора реагентов «АмплиСенс Parvovirus B19-FL» с использованием референс-панели ВОЗ «lst WHO International Reference Panel for Parvovirus B19 genotypes for NAT based assays» (NIBSC code: 09/110), включающей в себя ДНК В19V 1-3 генотипов. Продемонстрировано, что

используемая тест-система способна идентифицировать В19У всех известных генотипов и может быть использована для решения поставленных задач.

Протестировано 1000 образцов сыворотки крови доноров. Частота выявления ДНК В19У составила 1,0%, что коррелировало с результатами, описанными в зарубежной литературе. Концентрация вирусного генома в ДНК-позитивных образцах варьировала от 1,0><103до 1,0*10б копий/мл.

ДНК-позитивные (п=10) и ДНК-негатвные (п=990) образцы иссследовали на присутствие антител классов БиМ (табл. 1).

ДО к В19У выявлены в 29,7% проб, не содержащих ДНК В19У. Специфические 1§М, указывающие на острую фазу инфекции, в представленной группе не обнаружены.

Таблица 1

Выявление антител к В19У в сыворотке крови ДНК-негативных и ДНК-

позитивных доноров

Группа образцов Количество образцов Частота выявления вирусспецифических антител

ДО І&М

Абс. % Абс. %

ДНК-позитивные 10 10 100,0 1 10,0

ДНК-негативные 990 294 29,7 0 0,0

Всего 1000 304 30,4 1 0,1

При изучении серологического профиля ДНК-позитивных образцов проведена оценка содержания специфических антител и уровня вирусной нагрузки (табл. 2).

Таблица 2

Оценка содержания специфических антител и уровня вирусной нагрузки в ДНК-позитивных образцах

Уровень вирусной нагрузки, копий/мл Кол-во образцов Частота обнаружения

IgG +/ IgM+ IgG +/ IgM -

Абс. % Абс. %

103-104 7 0 0,0 7 70,0

104-105 2 0 0,0 2 20,0

105-106 1 1 10,0 0 0,0

Всего 10 1 10,0 9 90,0

Было показано, что в девяти образцах (0,9% от общего количества исследованных проб) обнаружены только IgG к B19V, при этом концентрация вирусной ДНК в данных образцах не превышала 1,0х 105 копий/мл. В одной пробе (10,0% от количества ДНК-позитивных образцов) обнаружены также IgM, при этом серопозитивность по IgM коррелировала с более высоким уровнем вирусной нагрузки.

В серопозитивных образцах обеих групп был определен уровень IgG к B19V. Распределение полученных концентраций вирусспецифических антител представлено на рис. 2.

Средний уровень IgG в пробах, не содержащих вирусную ДНК, составил 27,5 МЕ/мл (95% CI (19,6-35,4) ME/мл), а в ДНК-позитивных - 107,3 МЕ/мл (95% CI (55,7-158,9) МЕ/мл). Таким образом, уровень IgG в ДНК-негативной группе был достоверно ниже, чем в ДНК-позитивной (р<0,0001).

Однако даже высокие титры специфических антител в трансфузионной единице не защищают от инфицирования серонегативных реципиентов при уровне вирусной нагрузки более 108 копий/мл [Doyle. S., 2006]. Кроме того, нет достаточной информации по оценке риска передачи B19V через отдельные ДНК-позитивные единицы трансфузии с уровнем вирусной нагрузки 1,0*104-1,0x106 копий/мл. Поэтому многие авторы признают, что наличие

потенциального риска, особенно для серонегативных реципиентов, оправдывает скрининг крови доноров на наличие ДНК B19V.

А.

101-200. МЕ/мл; 10,0%

более 200 МЕ/мл; 20,0%

31-50 МЕ/мл; 10,0%

7,8% fei.

101-200 б о лее 2 00 МЕ/мл; МЕ/мл; 4,4% -2,0%

11-30

МЕ/мл; 32,7%

Рис. 2. Распределение ДНК-позитивных (А) и ДНК-негативных образцов (Б) в зависимости от концентраций к парвовирусу В19.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, подтверждают необходимость принятия решения о целесообразности тестирования донорской крови на маркеры В19У с целью предотвращения гемотрансмиссивного инфицирования.

2 Определение генотипа и филогенетический анализ российских штаммов

парвовирусаВ19

В настоящее время количество исследований по изучению молекулярно-генетической структуры штаммов B19V, циркулирующих на территории Российской Федерации, ограничено. В связи с этим нами была проведена работа, направленная на установление и анализ нуклеотидных последовательностей генома штаммов B19V, выявленных в образцах сыворотки крови доноров, и определение их генотипа. Из-за недостаточного количества материала в двух пробах генотип B19V определен для 8 из 10 обнаруженных штаммов.

На основе установленных нуклеотидных последовательностей NSl/VPlu области генома B19V построено филогенетическое дерево с использованием программы MEGA v. 5.0 (рис. 3). Было продемонстрировано, что выявленные нами изоляты B19V относились к генотипу 1 субтипу 1а.

Дивергенция нуклеотидных последовательностей NSl/VPlu области генома выявленных штаммов и B19V генотипа 1 субтипа 1а не превышала 1,1%, а со штаммами субтипа lb находилась в диапазоне от 3,9 до 4,4%. В то же время различия нуклеотидных последовательностей исследуемых изолятов по сравнению с B19V генотипов 2 и 3 составили в среднем 9,3% (95% CI (8,7-10,1) %) и 10,7% (95% CI (9,6-11,6) %), соответственно.

Четыре исследуемых штамма (375/N.Nov/RU/2010, 550/N.Nov/RU/2010, 767/N.Nov/RU/2010 и 839/N.Nov/RU/2010) группировались внутри одного кластера и показали высокую гомологию (96,2-100,0%) со штаммами B19V, выявленными в России (RUS21), Кыргызстане (Bishkek 06-32), Южной Африке (V07/4630) и Эстонии (EST20). Остальные штаммы формировали другую группу, при этом изоляты 319/N.Nov/RU/2010 и 462/N.Nov/RU/2010 были на 95,9-100,0% гомологичны штаммам B19V, циркулирующим в Израиле (ISR-K) и Республике Беларусь (41631/Minsk_city.BLR/27.08), а изоляты 968/N.Nov/RU/2010 и 942/N.Nov/RU/2010 - штаммам из Германии (OsFr),

Республики Беларусь (41681/Minsk_city.BLR/35.08) и России (RUS12) с уровнем гомологии 100,0%.

100

41631/Minsk city .BLR/27.08 Беларусь FN825878\ 968/N.NOV/RU/2010 RUS12 Россия FN295730 OsFr Германия DQ225150 1— 942/N.Nov/RU/2010 319/N.Nov/RU/2010 ISR-K Израиль FN295684 41681/Minsk city .BLR/35.08 Беларусь FN825880 462/N.Nov/RU/2010 RUS21 Россия FN295731 Bishkek 06-32 Кыргызстан FN295635 V07/4630 Южная Африка FJ904121 EST20 Эстония FN295650 375/N.Nov/RU/20t0 550/N.Nov/RU/2010 767/N.Nov/RU/2010 839/N.Nov/RU/20I0 Pvbaua Канада М13178

Vnl 15 Вьетнам DQ357065~I

99|LaLi Финляндия AY044266 1 ^

I-IM-81 Германия AY903437J

-D91.1 Франция AY083234

löJ—

Jvnui Вьетнам иузз /иоз i Vnl47 Вьетнам DQ357064J

- V9 Франция NC004295 [ 3

0.01

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотадных последовательностей NSI AT lu области генома парвовируса В19.

При построении филогенетического дерева на основе анализа аминокислотных последовательностей белка NS1 и VPlu-области белка VP1 B19V, идентифицированные нами штаммы формировали три филогенетические линии (рис. 4).

968/N.Nov/RU/2010 942/N.Nov/RU/2010

41631/Minsk city .BLR/27.08 Беларусь FN825878

RUS12 Россия FN295730

OsFr Германия DQ225150

Pvbaua Канада M13178

ISR-K Израиль FN295684

41681/Minsk city.BLRy35.08 Беларусь FN825880

319/N.Nov/RU/2010

462/N.Nov/RU/2010

RUS21 Россия FN295731

Bishkek 06-32 Кыргызстан FN295635

V07/4630 Южная Африка FJ904121

EST20 Эстония FN295650

375/N.Nov/RU/2010

550/N.No v/RU/2010

767/N.Nov/RU/2010

839/N.Nov/RU/2010

0.001

Рис. 4. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей белка NS1 и VPlu-области белка VP1 штаммов парвовируса В19.

В результате проведенной работы установлено, что исследуемые штаммы B19V относились к генотипу 1 субтипу 1а, при этом на основе анализа нуклеотидных последовательностей выявлено формирование двух групп внутри генотипа 1а. Сравнение аминокислотных последовательностей показало разделение анализируемых штаммов на три филогенетические линии, которое соответствовало распределению по геногруппам, наблюдавшемуся при сравнении нуклеотидных последовательностей.

Установленные нуклеотидные последовательности фрагментов NSl/VPlu области генома B19V были депонированы в базе данных GenBank под номерами JQ518457-JQ518464, что позволило расширить базу данных нуклеотидных последовательностей штаммов B19V, циркулирующих на территории Российской Федерации.

3 Оценка частоты контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования

В настоящем исследовании было установлено, что в крови 1,0% доноров содержится ДНК B19V. Получение препаратов альбумина и иммуноглобулина предусматривает объединение плазмы от сотен-тысяч доноров в производственные пулы, что обуславливает возможность попадания в них B19V.

Протестировано 117 образцов котловых загрузок трёх отечественных производителей препаратов крови. Выявлено 93 пула (79,5%), содержащих ДНК B19V, при этом частота обнаружения контаминированных пулов плазмы варьировала от 66,7% до 83,3% в зависимости от производителя.

В ДНК-позитивных производственных пулах был определён уровень вирусной нагрузки. Распределение исследуемых пулов плазмы в зависимости от концентраций ДНК B19V представлено на рис. 5.

70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

63,4

21.5

5,4

3,2

5,4

менее 104-105 103-10б 106-107 107-108 более 104 10в Концентрация ДНК В19У, копий/мл

Рис. 5. Распределение производственных пулов плазмы в зависимости от концентрации ДНК В19У.

Было показано, что в 34 ДНК-позитивных производственных пулах (36,6% от количества контаминированных пулов) вирусная нагрузка превышала установленный для B19V уровень инфекционности, равный 104 копий/мл, при этом в 9,7% случаев концентрация ДНК B19V составила более 106 копий/мл и в 5,4% случаев - более 108 копий/мл.

Полученные в настоящем исследовании данные указывают на высокую частоту контаминации парвовирусом В19 плазмы для фракционирования, являющейся исходным материалом для получения препаратов альбумина и иммуноглобулина, однако присутствие в пулах вирусспецифических антител может снизить сё инфектогенность [Groeneveld К., 2003].

Для определения вирусспецифических IgG в котловых загрузках все образцы, в зависимости от содержания ДНК B19V, были разделены на 3 группы:

- группа I: ДНК-негативные (п=24);

- группа II: ДНК-позитивные с концентрацией ДНК B19V менее 104 копий/мл (п=59);

- группа Ш: ДНК-позитивные с концентрацией ДНК B19V более 104 копий/мл (п=34).

В группе I было выявлено 29,2% серопозитивных пулов, в группах II и III - 54,2% и 32,4%, соответственно (рис. 6).

При определении количественного содержания антител в серопозитивных производственных загрузках, было установлено, что средний уровень IgG к B19V в исследуемых группах был примерно одинаковым и составил 8,3 МЕ/мл (95% CI (7,5-20,0) МЕ/мл).

Анализ ДНК-позитивных пулов показал, что в 53,8% случаев вирусспецифические антитела не выявлялись. Возможно, это связано с тем, что IgG к B19V, обладающие нейтрализующей активностью, находятся в составе иммунных комплексов и не могут быть обнаружены методом ИФА.

группа I группа II группа III

□ 1аО- «120-

Рис. 6. Частота выявления антител к парвовирусу В19 в производственных пулах в зависимости от концентрации вирусного генома.

Присутствие свободных антител в ДНК-позитивных пулах не обязательно говорит о полной нейтрализации вируса, поэтому риск получения препаратов крови, контаминированных В19У, остаётся.

4 Исследование динамики изменения концентрации ДНК парвовируса

В19 и оценка уровня вирусной редукции по стадиям технологического

процесса

Высокая частота контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования (79,5%), установленная в настоящем исследовании, предполагает возможность попадания вируса в конечный продукт.

Процесс спиртового фракционирования является одним из основных этапов, обеспечивающих вирусную редукцию. Кроме того, современные технологии получения препаратов из плазмы крови доноров включают в себя стадии, направленные на инактивацию и/или элиминацию патогенов.

Для оценки влияния технологических воздействий на вирусную нагрузку при получении препаратов альбумина и иммуноглобулина было проведено модельное фракционирование пулов плазмы, содержащих ДНК B19V (п=20), по модифицированному методу Кона-Онкли в лабораторных условиях.

Исходная концентрация вирусной ДНК в модельных пулах составляла в среднем (8,31±0,17) logio копий/мл. В процессе фракционирования плазмы с помощью этанола наблюдалось распределение вируса между фракциями. Так на стадии отделения глобулинов от альбумина средняя концентрация ДНК B19V во фракции П+1П (осадок А) и фракции V (центрифугат А), полученных в процессе центрифугирования, составила (8,49±0,34) logio копий/г и (4,55±0,22) logio копий/мл, соответственно. При формировании осадка А1 концентрация ДНК B19V существенно не изменилась и составила (8,43±0,35) logio копий/г. На последующих стадиях фракционирования, было выявлено, что в осадке Б (фракция Ш) содержание ДНК B19V равнялось (8,60±0,26) logio копий/г, в то время как в осадке В (фракция IgG) концентрация ДНК B19V заметно снизилась и составила (4,36±0,26) logi0 копий/г.

Постоянное изменение объема или массы получаемых фракций за счет их разбавления или концентрирования в процессе фракционирования не позволяло адекватно оценить вирусную редукцию, которая может быть обеспечена той или иной стадией. В связи с этим нами был определен уровень вирусной нагрузки (VLb,9v) в каждой исследуемой фракции с учетом объема или массы материала и оценена динамика его изменения по стадиям технологического процесса. Результаты этих исследований представлены на рис. 7.

Было продемонстрировано, что фактор вирусной редукции для центрифугата А, являющегося целевой фракцией для производства альбумина, составил (3,52±0,30) log10, в то время как редуцирующий фактор для осадка А, полученного на этой же стадии, не превышал (1,19±0,39) logw.

Формирование осадка А1 также не привело к статистически значимому снижению вирусной нагрузки (р = 0,263). Однако на заключительной стадии

выделения ІцС (получение осадка В) редуцирующий фактор увеличился до (4,30±0,22) 1о210.

12 п

з 6

РР=(1,19±0,39)|од10

ЯР=(4,30±0,22)1од11,>

ЯР=(1,30±0,25)|од10

исходная осадок А осздокАІ осадок В иммуно

плазма глобулин

наименование фракции

12 ■ І ю-

ВА

а .2

і 4-

0 •

РР=(2,84±0,22)|од1(1

исходная плазма цетрифугат А альбумин

наименование фракции

Рис. 7. Динамика изменения уровня вирусной нагрузки В19У по стадиям получения иммуноглобулина (А) и альбумина (Б).

Установлено, что спиртовое фракционирование способно обеспечить снижение уровня вирусной нагрузки, но при отсутствии дополнительных стадий, направленных на инактивацию или удаление патогенов, не гарантирует безопасность препаратов.

При исследовании образцов фракции IgG после обработки гидроокисью алюминия и инкубации при низком значении pH (4,4 - 4,8) в течение 48 ч при 37°С было выявлено снижение вирусной нагрузки до недетектируем ого методом ПЦР уровня. Полученные результаты указывали на эффективность совокупности используемых стадий в обеспечении редукции B19V, что согласуется с работами зарубежных авторов. Суммарный фактор вирусной редукции, определённый в нашем исследовании при получении препарата иммуноглобулина, составил (6,98±0,17) logio-

При тестировании методом ПЦР образцов препарата альбумина после инкубации при 60°С в течение 10 ч ДНК B19V не была обнаружена. Применение пастеризации позволило обеспечить снижение вирусной нагрузки на данном этапе по отношению к стадии получения центрифугата А, при этом редуцирующий фактор составил (2,84±0,22) log10. Суммарный фактор редукции B19V от исходной плазмы до конечного продукта при получении альбумина достиг (6,36±0,17) logio-

Таким образом, с помощью модельного фракционирования пулов плазмы, контаминированных B19V, по модифицированному методу Кона-Онкли с использованием дополнительных стадий вирусной инактивации и элиминации были получены препараты альбумина и иммуноглобулина, свободные от ДНК B19V.

5 Исследование препаратов альбумина и иммуноглобулина на содержание генетических и серологических маркеров парвовируса В19

Для подтверждения эффективности используемой технологии в обеспечении безопасности в отношении B19V были исследованы методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени производственные серии препарата «Альбумин, раствор для инфузий 10%» (п=82) и препарата «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» (п=142), выпущенные на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству

бактерийных препаратов «ИмБио» в период с 2008 по 2010 гг. Несмотря на высокую частоту контаминации производственных загрузок плазмы для фракционирования, определённую в настоящем исследовании (79,5%), препаратов, содержащих ДНК B19V, не было выявлено.

При изучении препаратов иммуноглобулина был дополнительно оценен уровень IgG к B19V. Все исследуемые партии иммуноглобулина содержали антитела к B19V, концентрация которых варьировала от 23 до 162 ME/мл, при этом средний уровень вирусспецифических антител составил (77,9±33,6) МЕ/мл.

Способ получения альбумина и иммуноглобулина из плазмы крови доноров, применяемый на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», гарантирует безопасность данных препаратов в отношении B19V.

Однако существующие различия в методах производства, в параметрах процесса и в составе композиционных материалов, применяемых в качестве белковых протекторов, не позволяют экстраполировать полученные нами данные на технологии получения препаратов крови, используемые на других предприятиях. Поэтому для подтверждения безопасности в отношении B19V конкретного производства препаратов альбумина и иммуноглобулина необходима валидация процесса, в ходе которой будут оценены эффективность элиминации/инактивации вируса на основных технологических этапах.

Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют сказать, что для обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулина и альбумина в отношении B19V необходимо выполнение несколько условий, включая:

- разработку нормативных актов, регламентирующих процедуру скрининга доноров на маркеры парвовируса В19, и организацию скриниговых исследований доноров;

определение алгоритма входного контроля плазмы для фракционирования на маркеры B19V на предприятиях по производству препаратов крови;

использование для получения препаратов крови технологий, обеспечивающих эффективную элиминацию и инактивацию вирусов в процессе производства;

- валидацию производственных процессов получения препаратов крови с оценкой уровня редукции патогенов на основных технологических стадиях.

ВЫВОДЫ

1. Частота выявления ДНК парвовируса В19 среди доноров составила 1,0%. Концентрация вирусного генома в образцах сыворотки крови находилась в диапазоне от 1,0><103 до 1,0><10б копий/мл.

2. Антитела класса G к парвовирусу В19 выявлены в 29,7% и 100,0% случаев среди ДНК-негативных и ДНК-позитивных доноров, соответственно. Частота обнаружения вирусспецифических антител класса М среди ДНК-позитивных доноров составила 10,0%.

3. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента NSl/VPlu области генома восьми штаммов парвовируса В19. Показана принадлежность исследуемых штаммов к генотипу 1 субтипу 1а. Выявлено существование двух групп внутри генотипа 1а на основе анализа нуклеотидных последовательностей. Анализ аминокислотных последовательностей показал формирование трех филогенетических линий.

4. Определена частота контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования, которая составила 79,5%, при этом содержание вирусного генома превышало уровень инфекционности в 36,6% случаев.

5. Проведен анализ динамики изменения содержания ДНК парвовируса В19 по стадиям технологического процесса. Уровень редукции при получении

препаратов альбумина и иммуноглобулина составил (6,36±0,17) 1о§ю и (6,98±0,17) к^ю, соответственно. 6. Доказана безопасность в отношении парвовируса В19 препаратов «Альбумин, раствор для инфузий 10%» и «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения», выпускаемых на филиале ФГУП «НПО «Микроген» в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио». Исследование производственных серий показало отсутствие в препаратах генетических маркеров парвовируса В19. Уровень вирусспецифических антител в препаратах иммуноглобулина составил (77,9±33,6) МЕ/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Филатова, Е. В. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова, Н. А. Новикова, Л. Н. Голицына, К.В. Кузнецов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2010. -№5. — С. 67-70.

2. Филатова, Е. В. Оценка изменения концентрации ДНК парвовируса В19 при модельном фракционировании плазмы крови доноров / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова, Т. В. Короткова, С. А. Гальговская, В. В. Анастасиев // Гематология и трансфузиология. — 2011. — Т.56, № 3. — С. 10— 14.

3. Филатова, Е. В. Оценка безопасности производства препаратов альбумина в отношении парвовируса В19 / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова, Т. В. Короткова, С. А. Гальговская // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. - 2012. -№ 1(1). - С. 96 - 99.

II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских конференций:

1. Филатова, Е. В. Результаты тестирования сыворотки крови доноров на ДНК парвовируса В19 / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова // Актуальные вопросы

трансфузиологии и клинической медицины : материалы Всероссийской научно-практической конф., посвящ. 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» : тез. докл., Киров, 6-7 окт. 2010 г. - Киров, 2010. - С. 96-97.

2. Филатова, Е. В. Оценка частоты контаминации производственных пулов плазмы для фракционирования парвовирусом В19/ Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова // Молекулярная диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24-26 нояб. 2010 г. — Москва, 2010. - Т. 1. -С. 353-355.

3. Филатова, Е.В. Организация входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных препаратов из плазмы крови доноров / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова, И. С. Горлова, Н. А. Спиридонова, А. В. Казьянин, А. Б. Перевозчиков, Р. А. Волкова, М. С. Воробьева, JI. К. Лаптева, Н. В. Шалунова// Молекулярная диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24—26 нояб. 2010 г. — Москва, 2010. -Т. 5,-С. 105-106.

4. Филатова, Е. В. Секвенирование NSl/VPlu области генома штаммов парвовируса В19 / Е. В. Филатова, JI. Н. Голицына, Н. В. Зубкова, Н. А. Новикова // Биотехнология: состояние и перспективы развития : сб. тр. VII Московского международного конгресса, Москва 19-22 марта. 2013 г. — Москва, 2013. — Т. 2. — С.283-284.

Благодарность

Выражаю глубокую признательность и благодарность за помощь и поддержку при работе над диссертацией научным руководителям д.б.н., профессору Новиковой H.A. и к.б.н. Зубковой Н.В., а также зам. директора по науке филиала «ФГУП НПО «Микроген» в г. Нижний Новгород «НППБП «ИмБио» д.б.н., профессору Анастасиеву В.В., начальнику цеха гаммаглобулинов к.б.н. Коротковой Т.В., ведущему сотруднику лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций ФБУН «Нижегородский НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной» к.б.н. Голицыной Л.Н.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филатова, Екатерина Викторовна, Москва

Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству

бактерийных препаратов «ИмБио» !

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт им. академика

H.H. Блохиной» Роспотребнадзора

на правах рукописи i

Филатова Екатерина Викторовна

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

т— Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

О Новикова H.A.

кандидат биологических наук Зубкова Н.В.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................10

1.1 История открытия парвовируса В19.................................................................10

1.2 Таксономическая классификация, структура и организация генома парвовируса В19........................................................................................................11

1.2.1 Таксономия представителей семейства Parvoviridae....................................11

1.2.2 Структура вириона и организация генома.....................................................13

1.2.3 Генетическая вариабельность парвовируса В19..........................................17

1.3 Патогенез............................................................................................................20

1.3.1 Жизненный цикл и тропизм вируса...............................................................20

1.3.2 Культивирование парвовируса В19................................................................21

1.3.3 Цитопатология..................................................................................................22

1.3.4 Патогенез и иммунный ответ..........................................................................22

1.4 Клинические аспекты парвовирусной инфекции..........................................25

1.4.1 Проявления инфекции у здоровых лиц..........................................................25

1.4.2 Парвовирусная инфекция у лиц с иммуннодефицитными состояниями и гематологическими заболеванями...........................................................................27

1.5 Диагностика парвовирусной инфекции..........................................................28

1.6 Эпидемиология и трансмиссия........................................................................30

1.7 Парвовирус В19 и безопасность препаратов крови.......................................32

1.7.1 Распространенность парвовируса В19 среди доноров.................................32

1.7.2 Контаминация пулов плазмы и препаратов крови парвовирусом В19.......34

1.7.3 Основные способы получения лечебных препаратов из плазмы крови.....37

1.7.4 Основные производственные методы инактивации/элиминации патогенов и их эффективность в отношении парвовируса В19..............................................41

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................47

2.1 Исследуемый материал.....................................................................................47

2.2 Подготовка образцов для исследования.........................................................47

2.3 Выделение ДНК парвовируса В19...................................................................48

2.4 Выявление и количественное определение ДНК парвовируса В19............48

2.5 Получение фрагментов ДНК парвовируса В19 для секвенирования..........49

2.6 Секвенирование фрагментов ДНК парвовируса В19....................................50

2.7 Выведение аминокислотных последовательностей......................................50

2.8 Филогенетический анализ................................................................................50

2.9 Выявление и определение количественного содержания антител к парвовирусу В19........................................................................................................52

2.10 Модельное фракционирование контаминированных пулов плазмы...........52

2.11 Определение фактора вирусной редукции.....................................................56

2.12 Статистическая обработка результатов..........................................................56

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.........................58

3.1 Выявление генетических и серологических маркеров парвовируса В19 в крови доноров............................................................................................................58

3.2 Определение генотипа и филогенетический анализ российских штаммов парвовируса В19........................................................................................................65

3.3 Оценка частоты контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования.....................................................................73

3.4 Исследование динамики изменения концентрации ДНК парвовируса В19 и оценка уровня вирусной редукции по стадиям технологического процесса......78

3.5 Исследование препаратов альбумина и иммуноглобулина на содержание генетических и серологических маркеров парвовируса В19................................83

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................86

ВЫВОДЫ...................................................................................................................96

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................97

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат

ИГВВ - иммуноглобулин для внутривенного введения

ИФА - иммуноферментный анализ

ME - международная единица

н.о. - нуклеотидное основание

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

В19V - парвовирус В19

IgA - иммуноглобулин класса А

IgG - иммуноглобулин класса G

IgM - иммуноглобулин класса М

ITR - (inverted terminal repeats) - инвертированные терминальные повторы

kDa - килодальтон

NS1 - нестуктурный вирусный белок

ORF - (open reading frame) - открытая рамка считывания

PLA2 - фосфолипаза А2

RF - (reduction factor) - фактор редукции

SD-плазма - плазма, подвергнутая сольвент/детергентной обработке

SSCP - анализ конформационного полиморфизма одиночных цепей

VL - (viral load) - вирусная нагрузка

VP1 - капсидный вирусный протеин 1

VPlu - уникальная область вирусного протеина 1

VP2 - капсидный вирусный протеин 2

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Альбумин и иммуноглобулины являются одними из основных белков крови, принимающих участие в обеспечении важнейших функций организма [7]. В связи с этим препараты альбумина и иммуноглобулина нашли широкое применение в медицинской практике. Использование альбумина и иммуноглобулина путем введения непосредственно в кровеносное русло предъявляет повышенные требования к безопасности, направленные на предотвращение вирусного инфицирования реципиентов препаратов крови.

Инфицирование В19У представляет опасность для беременных, лиц с иммунодефицитными состояниями и гематологическими заболеваниями, которые являются основными реципиентами крови и ее дериватов. Поражая клетки-предшественники эритроцитов, В19У может вызвать развитие тяжелой анемии и патологии во время беременности [51]. В связи с этим в развитых странах активно ведутся комплексные исследования парвовируса В19, направленные на обеспечение безопасности препаратов крови.

Недостаточная изученность распространенности маркеров В19У среди доноров России, отсутствие знаний о молекулярно-генетических свойствах российских штаммов вируса и возможности их трансмиссии через препараты крови определили актуальность проблемы и явились основанием для проведения настоящего исследования.

Задачи исследования:

1. Определить частоту выявления генетических и серологических маркеров B19V в крови доноров.

2. Установить генотип выявленных штаммов B19V с использованием частичного секвенирования генома.

3. Определить частоту контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования.

Научная новизна работы:

Получены новые данные о распространенности B19V среди доноров.

Практическая значимость работы:

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетические маркеры B19V генотипа 1а выявлены у 1,0% доноров

крови.

3. Спиртовое фракционирование вносит существенный вклад в редукцию B19V, но при отсутствии дополнительных стадий вирусной инактивации/элиминации не гарантирует безопасность препаратов.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2013 г.);

заседании Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной.

Объем и структура диссертации:

По результатам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 История открытия парвовируса В19

Парвовирус В19 был открыт в 1975 году австралийским вирусологом А. Cossart при тестировании сыворотки крови на поверхностный антиген вируса гепатита В [152]. Название вируса происходит от номера сыворотки (№ 19) панели В, при исследовании которой методами встречного иммуноэлектрофореза и радиоиммунного анализа был получен аномальный результат. Электронная микроскопия выявила частицы диаметром 23 нм сходные с парвовирусом животных. Через 5 лет В19V был независимо открыт в Японии и получил название «Nakatani». При последующих исследованиях была установлена их идентичность [79].

В 1985 г. Международным комитетом по таксономии вирусов выявленные «парвовирус-подобные частицы» были названы В19 и отнесены к семейству Parvoviridae [42].

В 1980 году сообщалось об эпизоде незначительной лихорадки у двух солдат, в сыворотке которых при электронной микроскопии был выявлен B19V. В 1981 году этот вирус был ассоциирован с кратковременным апластическим кризом у больных серповидно-клеточной анемией. Через два года серологически была доказана связь детской болезни «инфекционная эритема» с B19V, который в настоящее время считается этиологическим агентом данного заболевания [79]. Позже были описаны другие синдромы, ассоциированные с B19V, такие как потеря плода во втором триместре беременности из-за вертикальной передачи вируса от матери, постинфекционная симметричная полиартропатия и артрит у взрослых. Хронические формы парвовирусной инфекции были выявлены при парциальной аплазии эритроцитов [86, 95, 108, 165].

1.2 Таксономическая классификация, структура и организация генома

парвовируса В19 1.2.1 Таксономия представителей семейства Parvoviridae

Классификация представителей семейства Parvoviridae основана на их морфологических и функциональных характеристиках. Парвовирусы, до открытия Circovirus и TT вируса, являлись самыми маленькими ДНК-содержащими вирусами, которые поражают клетки млекопитающих («parvum» (лат.) - маленький). Основываясь на способности вируса инфицировать клетки позвоночных и беспозвоночных животных, семейство Parvoviridae разделено, соответственно, на подсемейства Parvovirinae и Densovirinae.

Parvovirinae включает в себя 3 рода: Dependovirus, Parvovirus, Erythrovirus. В основе этого деления лежит анализ транскрипционных карт генома и способность вирусов к самостоятельной эффективной репликации [79]. Недавно Международным комитетом по таксономии вирусов с использованием филогенетического анализа из рода Parvovirus были выделены два самостоятельных рода: Amdovirus, включающий единственного представителя - возбудителя алеутской болезни норок, и Bocavirus, к которому относятся парвовирусы крупного рогатого скота (bovine parvovirus) и собак (canine parvovirus), давшие название роду, а также бокавирус человека, недавно обнаруженный в образцах из респираторного тракта (рис 1).

В настоящее время рассматривается возможность выделения в отдельный род Avetalvirus парвовирусов цыплят и индюков, а идентифицированный в плазме для фракционирования парвовирус 4 (PARV4) - в род Partetravirus [220].

B19V способен к автономной репликации, поэтому изначально был отнесен к роду Parvovirus. Однако из-за способности вируса селективно реплицироваться только в активно делящихся клетках, таких как клетки костного мозга, эмбриональные клетки и клетки-предшественники эритроцитов, В19V был классифицирован как представитель рода Erythrovirus,

к которому также относятся парвовирус обезьян, парвовирус макак-резус и свинохвостых макак [18].

парвовирус бурундуков,

Рис. 1. Таксономия подсемейства Рапюутпае.

1.2.2 Структура вириона и организация генома

Парвовирус В19 (или эритровирус В19) имеет простую структуру, включающую два белка, формирующих капсид (УР1 и УР2), и линейную однонитевую молекулу ДНК. Липидная оболочка отсутствует [57]. Зрелые инфекционные вирусные частицы имеют молекулярную массу 5,6хЮ6 Ба, из которых около 80% приходится на белки и около 20% - на ДНК. Плотность в градиенте хлористого цезия составляет 1,41 г/мл [76].

С помощью Х-лучевой кристаллографии определена икосаэдрическая структура вирусного капсида (Т=1), диаметр которого составляет 22-24 нм. Вирион образован 60-ю структурными субъединицами (капсомерами). На основной структурный белок УР2 с молекулярной массой 58 Ша приходится около 95% капсомеров. УР2 содержит домены связывания с клеточными рецепторами и корецепторами [18, 52, 79, 126, 201].

Минорный белок УР1 с молекулярной массой 84 Ша составляет около 5% капсидных протеинов [137]. Функции УР1 неизвестны, но наличие домена фосфолипазы А2 (РЬА2) предполагает его роль в проникновении вируса в клетку. РЬА2-домен содержит каталитический сайт и Са-связывающий домен, необходимые для энзиматической активности [14, 18, 126].

Структурные белки УР1 и УР2 являются результатом альтернативного сплайсинга матричной РНК. УР1 коллинеарен УР2, за исключением участка из дополнительных 227 аминокислот на Ы-конце белка УР1, названного УР1 уникальный регион (УР1и) [213]. Ранее сообщалось, что УР1и локализован, по крайней мере, частично, на поверхности вирусного капсида [132, 153]. Однако последние да

Информация о работе

Филатова, Екатерина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы