Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Значение лабораторной диагностики краснушной и парвовирусной инфекций в период элиминации краснухи

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Значение лабораторной диагностики краснушной и парвовирусной инфекций в период элиминации краснухи"

На правах рукописи

4

АНТИПОВА Анастасия Юрьевна

ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КРАСНУШНОЙ И ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ В ПЕРИОД ЭЛИМИНАЦИИ КРАСНУХИ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з ОКТ 2013

Санкт-Петербург 2013

005534143

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Лаврентьева Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Борисова Татьяна Константиновна кандидат медицинских наук Россошанская Надежда Васильевна

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург

Защита состоится « 24 » октября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук (105064, Москва, пер. Малый Казенный, д. 5а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук (105064, Москва, пер. Малый Казенный, д. 5а)

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В 2005 г. Европейское региональное бюро ВОЗ разработало стратегический план по элиминации эндемичной кори и краснухи, предупреждению врожденной краснушной инфекции (ВКИ) (менее 1 случая на 100 ООО живых новорожденных) к 2010 г. (ВОЗ, 2003). Национальная программа по ликвидации кори и краснухи действует и в РФ. Реализация указанного плана в регионе продлена до 2015 г. в связи с ухудшением эпидемической ситуации по кори в ряде европейских стран (ВОЗ, 2010; Rogalska J., 2010).

После реализации Национального проекта «Здоровье» (2006-2007 гг.) в РФ отмечается стойкое снижение заболеваемости краснухой, которая характеризуется в настоящее время как спорадическая. В этих условиях повышается значимость лабораторного подтверждения диагноза.

Вследствие сходства клинических проявлений болезни, одной из нозологических форм, требующих проведения дифференциальной диагностики с краснухой, является парвовирусная инфекция (инфекционная эритема) (Тихонова Н. Т., 2004; Hübschen J.M., 2009; Васильев В.В., 2011). Заболевание имеет и самостоятельную медицинскую и социальную значимость, связанную с тератогенным действием возбудителя — PV В19.

Вместе с тем, в настоящее время в РФ нет регистрации парвовирусной инфекции (ПВИ), неизвестны истинные масштабы ее распространенности, не разработан алгоритм лабораторной диагностики, единичны сведения о циркулирующих генотипах патогена.

Изложенное свидетельствует о необходимости лабораторного подтверждения всех случаев заболеваний, обусловленных вирусом краснухи и парвовирусом В19. Совершенствование лабораторной диагностики указанных заболеваний, изучения превалентности ПВИ в структуре инфекционной заболеваемости, определение циркулирующих генотипов вируса краснухи и PV В19 - актуальная задача отечественного здравоохранения, способствующая элиминации кори и краснухи и других экзантемных инфекций в России. С,

Цель работы: совершенствование лабораторной диагностики краснуш-ной и парвовирусной инфекций и определение генотипов вируса краснухи и РУ В19, циркулирующих в Северо-Западном федеральном округе России. Задачи исследования

1. Проанализировать заболеваемость краснухой на территориях округа в период с 2002 по 2011 гг. в условиях вакцинопрофилактики этой инфекции.

2. Провести лабораторное обследование больных с первичным диагнозом «краснуха» с целью выявления изолятов вируса краснухи.

3. Проанализировать частоту лабораторного подтверждения диагноза «краснуха» в условиях спорадической заболеваемости этой инфекцией.

4. Изучить частоту обнаружения антител (АТ) класса ^М к РУ В19 у больных с экзантемными заболеваниями на территориях Северо-Западного федерального округа.

5. Проанализировать возможности применения методов ПЦР и ИФА для лабораторной диагностики парвовирусной инфекции.

6. Провести филогенетический анализ геновариантов РУ В19, циркулирующих на территории Северо-Западного федерального округа России.

Научная новизна. Впервые получены знания о циркуляции в СевероЗападном федеральном округе генотипа 1А парвовируса В19, о распространенности ПВИ на территориях округа, в том числе в группе риска (беременные женщины). Установлен генотип изолята вируса краснухи, выделенного в Санкт-Петербурге в 2011 г.

Научная и практическая значимость. Ретроспективный анализ заболеваемости краснухой и охвата первичной и ревакцинирующей прививками вСЗФО за десятилетний период (2002-2011 гг.) подтверждает эффективность специфической профилактики краснушной инфекции. Лабораторно установленный случай импорта вируса краснухи в СЗФО из Китая, наряду с результатами других исследований, свидетельствует о вытеснении эндемичного для РФ генотипа 2С в период спорадической заболеваемости краснухой. Рост количе-

ства ошибок первичной диагностики краснухи доказывает необходимость лабораторного подтверждения диагноза в каждом случае.

Предложена схема лабораторной диагностики ПВИ с интерпретацией результатов, которая может быть использована для определения заболеваемости инфекцией и повышения качества медицинской помощи. Полученные сведения о генотипах PV В19 необходимы для надзора за парвовирусной инфекцией.

Доказана значимость лабораторной диагностики краснушной и парвовирусной инфекций для совершенствования эпидемиологического надзора за экзантемными инфекциями; расшифрованы вспышки парвовирусной инфекции на территориях СЗФО (Кронштадт, Ленинградская область). Внедрение результатов исследования в практику

1. Нуклеотидная последовательность гена El изолята вируса краснухи Sankt Petersburg RUS 1366, выделенного в г. Санкт-Петербурге в 2011 г., депонирована в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (accession number: JX171315).

2. Нуклеотидные последовательности генов 8 изолятов парвовируса В19, выделенных на территориях СЗФО в 2010-2011 гг., депонированы в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (accession number: JX435809, JX644426 - JX 644432).

3. Аналитический обзор. Краснуха: эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика в условиях спорадической заболеваемости. — СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2010. - 68 с.

4. Аналитический обзор. Результаты сертификации территорий СевероЗападного федерального округа на отсутствие циркуляции эндемичного вируса кори. - СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2012 . - 60 с.

5. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. / Под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - Т. 2, разделы: Вирус краснухи, Парвовирус В19. - С. 663-665, 706—708.

6. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики медико-биологического факультета СЗГМУ им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург). Положения, выносимые на защиту

1. В результате специфической профилактики заболеваемость краснухи снизилась до уровня спорадической. В этих условиях возросло количество ошибок клинической диагностики краснухи.

2. Парвовирусная инфекция (инфекционная эритема) составляет существенную долю ошибок клинической диагностики краснухи, широко распространена на территориях Северо-Западного федерального округа. При этом значительная доля женщин репродуктивного возраста не имеет ^в-антител против РУ В19.

3. Для лабораторного подтверждения диагноза «парвовирусная инфекция» методами ПЦР и/или ИФА существенное значение имеет время получения клинического материала от начала заболевания.

4. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов РУ В19, выделенных на территориях Северо-Запада РФ, позволил отнести их к генотипу 1А.

Личное участие автора. Планирование, выполнение исследования, анализ и статистическая обработка данных, представленных в работе, осуществлялись лично автором. Секвенирование изолята вируса краснухи проведено в ННМЦ по надзору за корью и краснухой (Москва), изолятов РУ В19 - в лаборатории молекулярной иммунологии и сероэпидемиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследовательской работы доложены и обсуждены на пяти всероссийских съездах и конференциях: на Всероссийской конференции «Вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития» (г. Пермь, 28 октября 2010 г.); на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации «Достижение науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федера-

ции» (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.); на Всероссийской научно-практической on-line конференции «Охрана здоровья населения промышленных территорий» (г. Пермь, 15-20 июня 2011 г.); на научно-практической конференции «Инновационные подходы в решении проблем гигиенической безопасности», посвященной 120-летию ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (г. Мытищи, 20-21 сентября 2011 г.); на международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 г.).

Научные положения, изложенные в диссертации, опубликованы в 14 печатных работах, включая национальное руководство, два аналитических обзора и пять статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, описания использованных материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает 290 источников, из них 79 отечественных и 211 — иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнялась с 2009 г. по июнь 2012 г. в аккредитованной ВОЗ субнациональной вирусологической лаборатории СПбРЦ по надзору за корью и краснухой в НИИЭМ имени Пастера с использованием иммунологических, молекулярно-генетических, эпидемиологических и статистических методов.

Клинические образцы были получены с 11 территорий СЗФО. Исследованы: 1881 образец сыворотки крови, из них 1381 образец от больных с экзан-темными заболеваниями и/или с клиническими диагнозами «краснуха»

и «корь», 500 образцов от здоровых лиц разного возраста и пола, в том числе 184 образца от беременных женщин, а также образцы смывов из ротоглотки 40 больных с клиническим диагнозом «краснуха».

Эпидемиологический анализ заболеваемости проведен по пространственной характеристике, возрасту, прививочному статусу. Использована форма № 2 федерального государственного статистического наблюдения «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях». Сведения о прививках получены из формы № 6 федерального государственного статистического наблюдения «Сведения о контингентах детей и взрослых, привитых против инфекционных заболеваний».

Иммуноферментный анализ. IgM- и IgG-антитела к вирусам определяли с помощью лицензированных тест-систем: «ИФА-KpacHyxa-IgM-cupture», «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» (ООО «ЭКОлаб-Центр», Россия); «ВектоКорь IgM» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия); «recomWELL Parvovirus В19 IgM», «recomWELL Parvovirus B19 IgG» (MICROGEN GmbH, Германия) в соответствии с инструкциями.

Молекулярно-генетические исследования. Методом ПЦР выявляли генетический материал вирусов с помощью диагностических наборов (производство ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции. Для выделения РНК Rubella virus из ротоглоточных смывов использовали комплект «Рибо-сорб»; «РЕВЕРТА-L» AmpliSens - для реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и «АмплиСенс®ЯиЬе11а virus-Eph» - для амплификации кДНК. Для выделения ДНК PV В19 из ротоглоточных смывов и сывороток крови использовали «ДНК-сорб-АМ» AmpliSens, с помощью набора «AMramCeHC®Parvovirus B19-FL» выделенную ДНК амплифицировали.

Генотипирование вируса краснухи выполнено согласно рекомендациям ВОЗ. Секвенирование проводилось по участку гена Е1, 739 п.о. (с 8731 по 9469 нк). Амплификация осуществлялась на приборе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия); по программе: 95°С - 3 мин + {94°С - 30 с; 60°С - 30 с; 72°С - 45 с} х 35 циклов +72°С - 5 мин, с парой праймеров (таблица 1).

Таблица 1. Последовательности праймеров вируса краснухи

Праймеры Первая пара (5'-3') Вторая пара (5'-3')

Прямой CACTCAAGCACCTGCCCCC TCTGGGCTGTCAACGCCTACTCCT

Обратный CACAGCAAGCGAGTAAGC ATCCACTCGGGTATTTCG

Амплификаты разделялись в 1% агарозном геле.

Секвенирование проводили в 4,25% полиакриламидном геле на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 («Applied Biosystems», США) с использованием реагентов «BigDye™ Terminator Kit v.2.0» («Applied Biosystems») по схеме: {96°C - 30 с; 50°C - 15 с; 60°C - 4 мин} x 25 циклов. Хроматограммы анализировали с помощью программы Chromas 2.3 «Technelysium Pty Ltd» (Австралия).

Филогенетическое дерево изолятов вируса краснухи построено согласно рекомендациям ВОЗ (компьютерная программа MrBayes 3.1).

Выделение ДНК PV В19 проводили из образцов с наибольшей вирусной нагрузкой («РИБО-преп», согласно инструкции). ПЦР осуществляли по стандартной методике (Маниатис Т., 1984) в термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по схеме: 95°С - 15 мин + {95°С - 30 с; 60°С - 30 с; 72°С - 45 с} х 35 циклов + 72°С - 10 мин. Были подобраны последовательности праймеров (производство «Синтол», Россия) (таблица 2). Продукты ПЦР очищали по стандартной методике (Маниатис Т., 1984); качество очистки проверялось в 1,5% агарозном геле.

Генотипирование PV В19 проводили по локусу NSl-VPlu, включающему фрагмент неструктурного гена NS1 и уникальную область структурного гена VP1, длиной 994 п.о.

Таблица 2. Последовательности праймеров парвовируса В19

Праймеры 5'-3'* Blast NCBI, 5'-3'

Прямой CAATTGTCACAGACACCAGTA CCCGCGCTCTAGTACGCCCA

Обратный ACTTAGCCAGTTGGCTATACCT TTGCGGGGGCCCAGCTTGTA

Примечание:* источники: Hübschen J., 2009; Yermalovich М.А., 2012.

Секвенирующую реакцию проводили согласно инструкции к набору GenomeLabTMDTCS - Quick Start Kit (Beckman Coulter Inc., США) с первой парой праймеров в трех повторениях на термоциклере «Rotor-Gene». Очистку выполняли как описано ранее.

Секвенирование проводили на приборе Beckman Coulter GX 8000 с программами LFR-1 и LFR-Iong согласно инструкциям производителя.

Филогенетический анализ был выполнен с использованием программы «phylogeny» в режиме онлайн на сайте http://www.phylogeny.fr (Guindon S., 2003; Dereeper А., 2008; Dereeper А., 2010; Chevenet F„ 2006).

Статистические расчеты средних показателей, стандартного отклонения, стандартной ошибки выполняли с использованием электронных таблиц MS Excel 2007. Применяли параметрические и непараметрические методы (критерий Стьюдента, х-квадрат, критерий Манна-Уитни), расчеты выполняли с помощью компьютерной программы «Biostat» для Windows, версия 4.03. Показатель р < 0,05 является приемлемой границей статистической значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика заболеваемости и охват прививками против краснухи в СЗФО за период с 2001 по 2011 гг.

В 2001—2002 гг. в РФ наблюдался очередной эпидемический подъем заболеваемости с показателями: в РФ - 396,0 на 100 тыс. населения, в СЗФО — 460,0 на 100 тыс. населения (рисунок 1).

Период 2003—2005 гг. характеризовался естественным после подъема снижением заболеваемости краснухой в округе до уровня 98,4-112,9 на 100 тыс.

В 2006 г. показатель заболеваемости в СЗФО оказался существенно ниже, чем в среднем по стране: 56,7 против 93,1 на 100 тыс. населения соответственно, и продолжил снижаться.

годы

[—РФ-СЗФО

Рисунок 1. Заболеваемость краснухой в Российской Федерации и СЗФО в 2002-2011 гг.

В 2011г. в регионе зарегистрированы 19 случаев краснухи (показатель 0,14 на 100 тыс. населения) на трех территориях: Вологодская и Ленинградская области, Санкт-Петербург. Распространения инфекции в очагах не было.

В 2002 г. уровень охвата своевременной вакцинацией детей 24 мес. в СЗФО был на 20% ниже, чем в среднем по РФ, и составлял 68,6%. В 2006 г. на всех территориях СЗФО первичную прививку против краснухи впервые получили более 95% подлежащих иммунизации детей. Уровень охвата ревакцинацией детей 6 лет в это же время не превышал 0,11 и 0,12% в РФ и СЗФО соответственно.

В результате реализации Национального проекта «Здоровье» в 20062007 гг., охват прививками против краснухи декретированных контингентов на всех территориях СЗФО существенно увеличился. С 2007 г. в регионе прививаются своевременно более 98% детей 24 мес.; с 2010 г. - более 95% детей 6 лет. Среди лиц 13 и 17 лет в 2007 г. было привито 28,8% и 20,4% соответственно; в 2011 г. показатель привитости этих контингентов вырос до 69,8% и 83,5% соответственно, однако достичь рекомендованного ВОЗ уровня (95% и выше) в данных возрастных группах за анализируемый период времени не удалось.

Таким образом, существенное снижение заболеваемости краснухой на территориях округа связано, прежде всего, с ростом показателей охвата первичной вакцинацией и ревакцинацией детей 24 месяцев и 6 лет соответственно.

2. Генетическая характеристика изолята вируса краснухи, выделенного в Санкт-Петербурге в 2011 г.

В сыворотках крови и смывах из ротоглотки больных, поступивших в ГУЗ «Санкт-Петербургская городская инфекционная больница № 30» с клиническим диагнозом «краснуха», в одном из 30 случаев диагноз был подтвержден лабораторно методами ИФА (IgM-AT в сыворотке крови) и ПЦР. Из ротоглоточного смыва больного был получен изолят Sankt Petersburg RUS 1366, который по результатам генотипирования отнесен к 1Е генотипу и близкородственен штаммам, циркулирующим в Китае. Проведенное эпидемиологическое расследование показало, что заболевший приехал из КНР в Санкт-Петербург 04.03.11 г. и 14.03.11 г. заболел краснухой. Очаг инфекции не получил распространения. Был доказан факт импортирования штамма вируса краснухи Sankt Petersburg RUS 1366 из Китая.

Таким образом, эпидемический процесс краснухи в СЗФО в условиях вакцинопрофилактики этой инфекции существенно изменился. После реализации в РФ Национального проекта в сфере здравоохранения заболеваемость краснухой в СЗФО характеризуется как спорадическая. Собственные результаты и данные других исследователей (Тюников Г.И., 2007; Шульга C.B., 2010; Бузицкая Ж.В., 2012) подтверждают факт вытеснения эндемичного для России генотипа 2С штаммами вируса краснухи первой генетической группы.

На этапе элиминации инфекции особое значение приобретает лабораторное обследование больных с экзантемными инфекциями для верификации диагноза «краснуха».

3. Частота лабораторного подтверждения диагноза «краснуха» при обследовании больных с экзантемными заболеваниями

Установлено, что среди лиц с экзантемными заболеваниями (п = 773), обследованными в лаборатории СПбРЦ, за период 2010-2012 гг. доля подтвержденных случаев краснухи последовательно снижалась с 5,9±1,4% в 2010 г. до 3,6±1,1% в 2011 г. и 1,25±0,9% в 2012 г. Среди больных с первичным диагнозом «краснуха» наблюдалась аналогичная тенденция: доля лиц с подтвержденной краснушной инфекцией составила в 2010 г. 12,1±3,3%, в 2011 г. - 9,5±2,9%; в 2012 г. — 7,5±2,7%.

И напротив: лабораторно подтвержденная краснуха выявлялась у больных с другими первичными диагнозами (рисунок 2). По данным СПбРЦ по надзору за корью и краснухой, в 2005 г. 60% случаев ошибок первичной диагностики составила «корь», 22% - «аллергодерматит», 8% — «псевдотуберкулез», 5% - «токсикодермия». По нашим данным, в 2011 г. первичный диагноз «корь» был установлен только в 14% случаев. Преобладали: «ОРВИ и другие диагнозы» — 43%, «токсикодермия» - 29%, «аллергодерматит» - 14%.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости лабораторного подтверждения диагноза «краснуха» в каждом случае.

2005 г.

2011 г.

□ корь □ аллергодерматит ■ токсикодермия О псевдотуберкулез Ш ОРВИ и другие диагнозы

Рисунок 2. Структура первичных диагнозов у больных с лабораторно подтвержденным диагнозом «краснуха» в 2005 и 2011 гг.

4. Значимость ПВИ в лабораторной диагностике краснухи, распространение парвовирусной инфекции на территориях СЗФО

4.1. Частота обнаружения антител класса к РУ В19 у больных с экзантемными заболеваниями

Ретроспективно в сыворотках крови, отрицательных на корь и краснуху, определяли ^М-АТ к РУ В19. С 2009 по 2012 гг. 1§М-АТ к вирусу кори были обнаружены в 148 из 1461 (10,1±0,3%), к вирусу краснухи в 48 из 1383 (3,5±0,5%), а к РУ В19 - в 95 из 465 (20,4±1,9%) исследованных образцов. При этом выявлено существенное количество ошибок клинической диагностики парвовирусной инфекции (таблица 3).

Таблица 3. Частота выявления ^М-антител к парвовирусу В19 в сыворотках крови больных с различными первичными диагнозами (2009-2012 гг.) (абс.)

Предварительный диагноз 2009 г. 2010 г. 2011 г. 2012 г. Всего

п РУ В19 п РУ В19 п РУ В19 п РУ В19 п 1еМ+ РУВ19/ % М±т

Краснуха 18 0 57 14 22 2 50 28 147 44/29,9±3,8

Корь 0 0 3 0 10 0 1 0 14 0/-

Парвовирусная инфекция, инфекционная эритема 0 0 1 1 2 2 7 5 10 8/80

ОРВИ, ОРЗ 15 1 14 0 13 1 22 5 64 7/10,9±3,9

Другие инфекции 5 0 17 1 16 4 11 5 49 10/20,4±5,8

Всего инфекционных 38 1 92 16 63 9 91 43 284 69/24,3±2,6

Аллергическая сыпь, крапивница 26 2 49 7 31 6 8 3 114 18/15,8±3,4

Токсикодермия 5 0 11 0 4 0 0 0 20 0/-

Другие неинфекционные 5 1 20 2 9 0 13 5 47 8/17,0±5,5

Всего неинфекционных 36 3 80 9 44 6 21 8 181 26/14,4±2,6

Итого абс. 74 4 172 25 107 15 112 51 465 95

% М±т 5,4±2,6 14,5±2,7 14,0±3,4 45,5±4,7 20,4±1,9

За четыре года диагноз «парвовирусная инфекция/инфекционная эритема» был установлен только 10 больным и подтвердился в восьми случаях. 1§М-АТ к РУ В19 были обнаружены у больных с первичным диагнозом «краснуха» в 29,9±3,8% случаев, с клиническими диагнозами «ОРВИ», «иерсиниоз», «ветряная оспа», «вирусная экзантема», «скарлатина» в 15,0±3,4% образцов. В группе инфекционных заболеваний ^М-АТ к РУ В19 обнаруживались в 24,3±2,6% случаев. В 27,3% случаев при первичной диагностике ПВИ расценивали как не инфекционное заболевание, что могло способствовать распространению инфекции.

4.2. Распространение ПВИ па территориях СЗФО

Положительные на ^М-АТ к РУ В19 образцы выявлены на 9 из 11 территорий округа, исключая НАО и Новгородскую область (таблица 4).

Таблица 4. Выявление ^М-антител к РУ В19 в сыворотках крови больных с экзантемными заболеваниями на территориях СЗФО (2009-2012 гг.)

Год Территория 2009 2010 2011 2012 Всего

п РУ В19 п 1вМ+ РУ В19 п ^МІРУ В19 п РУ В19 п из них [§М+ РУ В19/ % М±га

Республика Карелия 4 0 4 1 1 0 13 8 22 9/40,9±10,7

Республика Коми 6 0 16 2 4 0 4 1 30 3/10,0±5,6

Архангельская область 6 0 13 0 14 5 1 0 34 5/14,7±6,2

Вологодская область 7 0 18 1 9 0 14 6 48 7/14,6±5,1

Калинингр адская область 9 2 17 7 7 4 3 0 36 13/36,1±8,0

Лениигр адская область 12 1 28 8 22 1 17 5 79 15/18,9±4,4

Мурманская область ] 0 9 0 4 0 6 3 20 3/15,0

Новгородская область 1 0 5 0 10 0 11 0 27 0/-

Псковская область 3 0 3 0 3 1 1 0 10 1/10,0

Санкт-Петербург 25 1 58 6 33 4 42 28 158 39/24,7±3,4

Ненецкий автономный округ 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0/-

Итого абс. 74 4 172 25 107 15 112 51 465 95

% М±ш 5,4±2,6 14,5±2,7 14,0±3,4 45,5±4,7 20,4±1,9

Частота обнаружения положительных проб варьировала от 40,9±10,7% в Республике Карелия до 10% в Республике Коми и Псковской области. В Санкт-Петербурге доля лиц с 1§М-ЛТ к РУ В19 составила 24,7±3,43%.

Результаты свидетельствуют о широком распространении ПВИ в регионе.

4.3. Серопревалентность парвовирусной инфекции среди беременных женщин на отдельных территориях СЗФО

Учитывая, что при ПВИ основной группой риска являются беременные женщины, тестировали 184 сыворотки крови беременных, полученные с двух территорий СЗФО: Санкт-Петербурга и г. Вологды (таблица 5).

Таблица 5. Определение 1аО-ашител к РУ В19 в сыворотках крови беременных женщин, проживающих на некоторых территориях СЗФО

Возраст, лет Количество исследованных образцов Из них IgG+ к PV В19

абс. % М±т

18-25 67 29 43,3±6,05

26-35 77 51 66,2±5,39

36-45 40 19 47,5±7,89

Итого 184 99 53,8±3,68

Около 50% обследованных женщин имели ^в-АТ к РУ В19, однако в каждой возрастной группе выявлено от 33,8 до 56,7% серонегативных к РУ В19 лиц. Наибольшую долю восприимчивых к инфекции лиц выявили среди женщин 18-25 лет.

4.4. Расследование вспышек парвовирусной инфекции Нами было проведено расследование двух вспышек экзантемной инфекции: в г. Кронштадте (2009 г.) и в Ломоносовском районе Ленинградской области (2012 г.). В первом случае заболели И курсантов 11—13 лет. В Ленинградской области выявлено 33 заболевших, из них 18 детей 7-16 лет (54,5%) и 9 детей 3-6 лет (27,3%). В обоих случаях заболевшим был установлен первичный диагноз «краснуха», который был заменен на лабораторно установленный - «парвовирусная инфекция» (^М-АТ кРУ В19). Очаги инфекционной

эритемы были зарегистрированы также в Республике Карелия (2010 г.) и в Архангельской области (2011 г.). Кроме того, в 2012 г. в Санкт-Петербурге был выявлен случай врожденной парвовирусной инфекции.

Результаты, полученные на данном этапе исследования, подчеркивают важность лабораторного подтверждения диагноза «парвовирусная инфекция» в каждом случае экзантемного заболевания.

5. Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции

В работе по определению оптимальной схемы диагностики использовали два лабораторных метода: ПЦР и ИФА, учитывая при этом особенности клинических проявлений ПВИ (Нее§агё Е.О., 2002).

Методом ПЦР ДНК РУ В19 была выделена в 51,3±5,6% проб: в 7 из 30 ротоглоточных смывов (23,3±7,9%) и в 34 из 50 сывороток крови (68,0±6,6%). В течение первой недели от начала высыпаний ДНК вируса выявлена в 74,3±7,4%, а с 8 по 14 день - в 60,0±16,3% исследованных проб. Два положительных образца были получены на 23-25 день после появления сыпи. Диагноз «врожденная парвовирусная инфекция» был установлен ребенку спустя 40 дней от рождения.

В 33 сыворотках крови больных с макуло-папулезной сыпью определяли три маркера инфекции: ^М- и ^С-АТ и ДНК. Один маркер - ДНК РУ В19 -был обнаружен в крови беременной женщины без сыпи на 5 сутки с начала заболевания дочери (клинический диагноз «краснуха»). На 3-14 сутки с появления сыпи в пробах больных были определены: один маркер (1§М+) — в 21%, два маркера (1§М+ и - в 21%, три маркера ДНК+) -

в 52,6% случаев. Из числа исследованных 11 проб не содержали маркеры инфицирования, а в трех образцах определены только 1§0-АТ.

Можно заключить, что целесообразность использования методов ПЦР или ИФА определяется временем получения клинических образцов больного от начала заболевания. Предложена следующая схема лабораторной диагностики ПВИ: от контакта с другим экзантемным больным до появления клинических симптомов - ПЦР; первые 7—9 дней с момента появления симптомов и/или об-

ращения к врачу — ПЦР и определение антител класса ^М; спустя 10-14 дней от появления сыпи - определение 1§М- и ^С-АТ (в динамике) и ПЦР. Отсутствие в сыворотке крови лабораторных маркеров ПВИ (^М- и ^в-АТ, ДНК вируса) свидетельствует о восприимчивости к РУ В19, наличие только ^С-АТ -о перенесенном ранее заболевании.

Интерпретация результатов лабораторного исследования представлена в таблице 6 и не включает группу риска. Клинико-лабораторное обследование беременной женщины, контактной по ПВИ, необходимо проводить в динамике.

Таблица 6. Обнаружение маркеров парвовирусной инфекции в различные фазы инфекционного процесса

№ ДНК РУВ19 АТРУВ19 АТРУВ19 ДО Интерпретация результатов

1 - - - Организм восприимчив к инфекции

2 + - - Начальная стадия инфекции. Необходимо повторное исследование сыворотки крови через 10-14 дней на 1§М- и [§0-аптитсла кРУВ19

3 + + ± Острая парвовирусная инфекция

4 ± ± + Недавно перенесенная парвовирусная инфекция, прогредиентная форма. Необходимо повторное исследование сыворотки крови через 10—14 дней на 1{*М- и 1§0-аититела кРУВ19

5 - - + Перенесенное ранее заболевание

6. Выделение и генотипирование нуклеотидных последовательностей изолятов парвовируса В19

В 2010-2011 гг. получены восемь последовательностей локуса N51 -УР1 и: образцы 28.12, 47.12, 54.12 — из Санкт-Петербурга; 57.12 — из Республики Коми; 39.12 - из Калининградской области; 71.12, 73.12 и 78.12 - из очага ПВИ в Архангельской области. Образец 28.12 выделен из ротоглоточного смыва, остальные — из сывороток крови. Все последовательности депонированы в ОепВапк и им присвоены номера 1X435809,1X644426 - 1X644432.

Для построения филогенетического дерева (рисунок 3) получены нуклео-тидные последовательности штаммов РУ В19 из СепВапк.

,8L9927225_PMeiiL.WOW28439

.gi_S9242.'87JsoiiU«_BN59.3_|cnolype_3b

_Л2535302_Р91. IjjeiiotvpOb - gi_2S91 695Ul_siram_NGA36122 -gi_l IS60J.128_i$olati_Gh305l_gciwype_3a

gijl 7957913_LaU -g»_211 04SA5_AS_etaK_c2

sU

»¡_2963I5610JK2 L47716276_Berlin_$en<*ype_2 •62IOS7.i»olale_ßStt)J

j* ,— ?!І_Ш 1 IOT3_isolaie_Vn t і 5_g<tnoty pe_IB

I gi_86211067Jsotat<_Vn 147_getH)ly[V_ 1В -gi_50845448

- gi_2S 13.31429_straiii_B 19V»/LUX/28,01_ 1

- .ri_33.3375_sb_M Î3I7S.1JJ19-Au_8in«ype_lA *gL296315646_OT j«i_U03615J4tr\t>viru>_BI9

gi_2<î6433943_sirain_CAfiN.RiA_3a09

- gi J>R916№5_»train_RUS21 gL4t»2534j;iyltu'ovinis_BI4_j»<;iiotyr«_!A jiï_35M57872JHuman_paf\'Ovini»_B!9

198J4649_KUI .gt_2963155S3_RK gî_5670171 _stiain_HV_gen<*ype_JA в ) 169417_strai n JSR-I.

f-aL?: >gL2l aï 29

HumEift_piirvoviru^_B і 9_isol;ite_57J 2 Huimn_pan'Oviru»_B 19_iso late_54.12

• Hurran_parvovîrusJ3 l9Jsota«_39.J2 - Hunum_parvovirus_B 19Jsolate_2S, 12 Human _purvoviruü_B 1 9_ім>1ам_73. 12 Hujiian_p;irvovim.s_ß [ 9_bolate„71.12 Hujmn_purvovtrus__B 19_i>alatg„47, і 2

ïLB» 169546_suain J< U S10 gi_2S9l69549_slrjin.RUSl 1 5t_2X9169465_sirain_LUX20

ÎÏ_2S 1331393_stram Ji 19 Vs,'ORIï5u.tJ2_ l

0.04

Рисунок 3. Филогенетическое дерево изолятов парвовируса человека В19, основанное на участке генома NSl-VPlu (994 нк)

Известные в настоящий момент генотипы маркированы на рисунке: 1А — М13178, IB - DQ357064, 2 генотип - AY064476, ЗА - Gh3051, ЗВ - DQ408303 (Corcoran С., 2010; Hübschen J.M., 2009; Yermalovich М.А., 2012).

Все восемь генетических вариантов РУ В19 близкородственны друг другу и принадлежат генотипу 1А, как и варианты РУ В19, выделенные ранее в РФ. Геновариант из Республики Коми 54.12 является близкородственным израильскому 1БК-Ь ^N295685.1), что может быть связано с импортированием инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в период с 2002 по 2011 гг. заболеваемость краснухой в Северо-Западном федеральном округе снизилась до уровня спорадической, что обусловлено высоким (более 95%) уровнем охвата своевременной вакцинацией и ревакцинацией, достигнутым к 2010 г. на всех территориях округа.

2. Установлено, что выделенный в 2011 г. в Санкт-Петербурге изолят вируса краснухи относится к генотипу 1Е и является импортированным из КНР.

3. Доказано, что в условиях спорадической заболеваемости частота лабораторного подтверждения диагноза «краснуха» последовательно снижалась как у больных с первичным диагнозом «краснуха»: с 12% в 2010 г. до 7,5% в 2012 г., так и у больных с экзантемными заболеваниями: с 5,9% в 2010 г. до 1,25% в 2012 г.

4. Установлена необходимость проведения дифференциальной лабораторной диагностики краснухи и парвовирусной инфекции.

5. Впервые показано, что парвовирусная инфекция широко распространена и выявлена в20,4±1,9% случаев на 9 территориях Северо-Западного региона; характеризуется очаговой и вспышечной заболеваемостью, однако 46,2% обследованных беременных женщин восприимчивы к заражению РУ В19.

6. Определено, что при лабораторном обследовании больных, подозрительных на парвовирусную инфекцию, использование ПЦР и/или ИФА определяется временем, прошедшим от контакта или начала заболевания.

7. Впервые установлено, что нуклеотидные последовательности восьми изоля-тов парвовируса В19, циркулирующих на территориях Северо-Западного федерального округа в 2010-2011 гг., относятся к генотипу 1 А.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. БичуринаМ.А. Проблемы диагностики краснухи на современном этапе / М.А. Бичурина, И.Я. Каплун, Т.Н. Москалева, И.В. Крылова, А.Ю. Анти-пова, В.А. Качнов // Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций: тр. Всерос. науч. конф., 19—20 ноября 2009 года.— СПб., 2009.-С. 99-100.

2. Бичурина М.А. К вопросу о совершенствовании диагностики краснухи у лиц с экзантемными заболеваниями / М.А. Бичурина, А.Ю. Антипова, Т.Н. Москалева, В.А. Качнов // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: материалы междунар. конф; под ред. А.Б. Жебруна. - СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010.-С. 49.

3. Лаврентьева И.Н. Эпидемиологический и вирусологический надзор за краснухой в условиях спорадической заболеваемости / И.Н. Лаврентьева, Л.В. Лялина, М.А. Бичурина, А.Ю. Антипова, H.A. Смирнова // Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации: тр. Третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8—10 декабря 2010 года). — СПб., 2010.-С. 87.

4. Бичурина М.А. Краснуха: эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика в условиях спорадической заболеваемости: аналитический обзор/ М.А. Бичурина, Л.В.Лялина, И.Н.Лаврентьева, Н.В. Железнова, А.Ю. Антипова, Ж.В. Терентьева, H.A. Смирнова, Н.Т. Тихонова, Т.А. Мамаева, А.Г. Герасимова, О.В. Цвиркун, Т.Н. Москалева, C.B. Шульга, М.А. Наумова, Н.С. Кущ, Н.В. Тураева. - СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2010.-68 с.

5. Антипова А.Ю. Вирус краснухи и его тератогенное действие. Патогенез, клиника, диагностика, профилактика синдрома врожденной краснухи. Сообщение 1. Вирус краснухи: молекулярно-биологические свойства/ А.Ю. Антипова // Инфекция и иммунитет. — 2011. — Т. 1, № 1. — С. 23-28.

6. Антипова А.Ю. Выявление парвовирусной инфекции среди больных экзантемными заболеваниями, лабораторно обследованными на корь и краснуху / А.Ю. Антинова // Охрана здоровья населения промышленных территорий: Всерос. науч.-практ. on-line конф. (г. Пермь, 15-20 июня 2011 года). - Режим доступа: http://fcrisk.ru/forums/node/85.

7. Антипова А.Ю. Значимость лабораторной диагностики экзантемных вирусных инфекций / А.Ю. Антипова // Здравоохранение Российской Федерации. —201 1. — № 5. - С. 50—51. — (Материалы науч. конф., посвященной 120-летию ФНЦ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана).

8. Антипова А.Ю. Распространение парвовирусной инфекции в СевероЗападном федеральном округе России / А.Ю. Антипова, И.Н. Лаврентьева,

М.А. Бичурина, Л.В.Лялина, Ф.Р. Кутуева// Журнал инфектологии. -2011. - Т. 3, № 4. - С. 44-48.

9. Антипова А.Ю. Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции в системе эпидемиологического надзора за экзантемными заболеваниями / А.Ю. Антипова, И.Н. Лаврентьева, М.А. Бичурина, A.B. Семенов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012. — № 2 (63). - С. 26-29.

10. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. / Под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. -Т. 2, разделы: Вирус краснухи, Парвовирус В19. - С. 663-665, 706-708.

11. Лаврентьева И.Н. Парвовирусная инфекция в Северо-Западном федеральном округе России: распространение и лабораторная диагностика в системе надзора за краснухой / И.Н. Лаврентьева, М.А. Бичурина, А.Ю. Антипова // Материалы съезда ВНПОЭМП. - М.: 2012. - С. 323-325.

12. Спиридонова Л.А. Вспышка парвовирусной инфекции в Северо-Западном федеральном округе России / Л.А. Спиридонова, А.Ю. Антипова, И.Н. Лаврентьева, М.А. Бичурина // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, № 3. — С, 665-668.

13. Бичурина М.А. Результаты сертификации территорий Северо-Западного федерального округа на отсутствие циркуляции эндемичного вируса кори: аналитический обзор / М.А. Бичурина, Л.В. Лялина, Н.В. Железнова, О.И. Канаева, А.Ю. Антипова, Е.В.Тимофеева. - СПб.: ФБУН НИИЭМ имени Пастера, 2012. - 60 с.

14. Лялина Л.В. Влияние двукратной иммунизации на заболеваемость корью, эпидемическим паротитом и краснухой в Северо-Западном федеральном округе России / Л.В. Лялина, Ж.В. Терентьева, М.А. Бичурина, А.Ю. Антипова // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, № 4. - С. 753-756.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток АТ - антитела

ВКИ - врожденная краснушная инфекция ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ИФА — иммуноферментный анализ КДД - клинико-диагностическая лаборатория НАО — Ненецкий автономный округ

НИИЭМ — научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии нк — нуклеотид

ННМЦ - Национальный научно-методический центр ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция п.о. - парные основания ПВИ — парвовирусная инфекция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СВК - синдром врожденной краснухи

СЗФО - Северо-Западный федеральный округ

СПбРЦ - Санкт-Петербургский Региональный центр

ФБУН - федеральное бюджетное учреждение науки

ЦРБ - центральная районная больница

CDC - Centers for Disease Control

NCBI - National Center for Biotechnology Information

PV B19 - Human parvovirus В19, парвовирус В19

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность администрации ФБУН НИИЭМ имени Пастера за предоставленную возможность выполнить данное исследование; научному руководителю, д.м.н. И.Н. Лаврентьевой за идею настоящей работы и знания, полученные в ходе ее выполнения; д.м.н., профессору С.Л. Мукомолову и к.м.н. Н.И. Романенковой за тщательное рецензирование исследования. За содействие в выполнении диссертационной работы автор благодарит сотрудников ФБУН НИИЭМ имени Пастера: д.м.н. М.А. Бичурину; д.м.н. Л.В. Лялину; к.м.н. A.B. Семенова; к.б.н. Н.В. Железнову, Ю.В. Останкову. Искренняя благодарность автора коллективу лаборатории детских вирусных инфекций за постоянную поддержку.

Подписано в печать 16.09.2013. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ № 545.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии «Ком-Принт». 197046, Санкт-Петербург, Петроградская наб., 34. Тел./факс: (812) 635-68-24

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антипова, Анастасия Юрьевна, Санкт-Петербург

Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

На правах рукописи

04201361542 ^ л

АНТИПОВА Анастасия Юрьевна

ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КРАСНУШНОЙ И ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ В ПЕРИОД ЭЛИМИНАЦИИ КРАСНУХИ

03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Лаврентьева Ирина Николаевна

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 5

ГЛАВА 1. ВИРУС КРАСНУХИ И ПАРВОВИРУС В19; КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТРИСТИКА И ДИАГНОСТИКА ОБУСЛОВЛЕННЫХ ИМИ ИНФЕКЦИЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......... 11

1.1. Вирус краснухи и парвовирус В19; их тератогенное действие........ 11

1.2. Характеристика эпидемического процесса краснухи

и парвовирусной инфекции в РФ и в мире................................. 23

1.3. Лабораторная диагностика краснушной

и парвовирусной инфекций................................................... 26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................... 38

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ И ОХВАТ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМИ ПРИВИВКАМИ ПРОТИВ КРАСНУХИ В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ В ПЕРИОД С 2002 ПО 2011 гг.................................................................. 43

3.1. Характеристика заболеваемости краснухой на территориях

СЗФО за десятилетний период............................................... 43

3.2. Уровень охвата первичной иммунизацией и ревакцинирующей прививкой против краснухи в СЗФО с 2002 по 2011 гг.

и мониторинг иммунитета к краснухе в индикаторных группах населения......................................................................... 47

3.3. Характеристика генотипов вируса краснухи, циркулирующих

в России до 2005 г. и в 2009-2011 гг....................................... 53

ГЛАВА 4. ЗНАЧИМОСТЬ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В ПЕРИОД СПОРАДИЧЕСКОЙ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ КРАСНУХОЙ .... 58

4.1. Организация лабораторного обследования больных

с экзантемными заболеваниями в СЗФО................................... 58

4.2. Частота лабораторного подтверждения диагноза «корь»

и «краснуха» при обследовании больных с экзантемными заболеваниями................................................................... 60

ГЛАВА 5. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ................................ 65

5.1. Частота обнаружения антител класса ^М к парвовирусу В19

у больных с экзантемными заболеваниями на территориях СЗФО...... 65

5.2. Серопревалентность парвовирусной инфекции среди

беременных женщин на отдельных территориях СЗФО................ 69

5.3. Вспышки парвовирусной инфекции в СЗФО.............................. 70

ГЛАВА 6. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ PV19, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ................................................................................. 75

6.1. Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции в системе надзора за экзантемными инфекциями..................................... 75

6.2. Молекулярно-генетическая характеристика геновариантов парвовируса В19, изолированных на территориях СЗФО

в 2010-2011 гг.................................................................... 79

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ............88

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 108

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ПОСТНАТАЛЬНОЙ КРАСНУХИ И ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ............................................. 141

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ИЗОЛЯТОВ PVB19.................................................................. 142

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДРЕВО ШТАММОВ ВИРУСА КРАСНУХИ, ВЫДЕЛЕННЫХ В СНГ В 2004-2009 гг........... 145

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток AT - антитела

ВКИ - врожденная краснушная инфекция ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ИФА - иммуноферментный анализ КДЛ - клинико-диагностическая лаборатория НАО - Ненецкий автономный округ

НИИЭМ - научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии нк - нуклеотид

ННМЦ - Национальный научно-методический центр

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

п.о. - парные основания

ПВИ - парвовирусная инфекция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СВК - синдром врожденной краснухи

СЗФО - Северо-Западный федеральный округ

СПбРЦ - Санкт-Петербургский Региональный центр

ФБУН - федеральное бюджетное учреждение науки

ЦРБ - центральная районная больница

CDC - Centers for Disease Control

NCBI - National Center for Biotechnology Information

PV В19 - Human parvovirus В19, парвовирус В19

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

В 2002 г. Европейское региональное бюро ВОЗ разработало и внедрило региональный стратегический план предупреждения кори, который ставил своей целью элиминацию кори и предупреждение врожденной краснушной инфекции (ВКИ) в Европейском регионе к 2010 г. С учетом того, что краснуха является менее контагиозным заболеванием, чем корь, и большинство стран региона используют комбинированные вакцины для профилактики этих инфекций, в 2005 г. был принят новый стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ, задачами которого являлись элиминация эндемичной кори, эндемичной краснухи, предупреждение ВКИ (менее 1 случая на 100 000 живых новорожденных) к 2010 г. [61].

В соответствии с планами ВОЗ, была разработана национальная программа ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 г. [53, 59, 67].

В связи с ухудшением эпидемической ситуации по кори в странах Европы, реализация плана элиминации кори, краснухи и профилактики синдрома врожденной краснухи в Европейском регионе продлена до 2015 г. [45, 240]. При этом стратегический план ВОЗ строится на применении как минимум двухдозовой тактики иммунизации - первичной вакцинации и последующей ревакцинации [6].

В Российской Федерации иммунизация против краснухи детей первого-второго года жизни введена в календарь профилактических прививок приказом МЗ РФ от 27.12.97 г. №375, а ревакцинирующая прививка детей 6 лет и иммунизация девочек 13 лет - в 2001 г. (приказ МЗ РФ 27.06.2001 г. № 229).

Выраженные качественные и количественные изменения в развитии эпидемического процесса краснухи произошли в процессе реализации Национального проекта «Здоровье» (2006-2007 гг.), в рамках которого, помимо плановой, дополнительной иммунизации подлежали дети от 1 до 17 лет, не бо-

левшие, не привитые или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18-25 лет, не болевшие и не привитые ранее. Реализация проекта предполагала обеспечение двухдозовой вакцинацией в первую очередь детского населения страны.

После реализации Национального проекта отмечается устойчивое снижение заболеваемости краснухой в России до показателя 0,24 на 100 ООО населения в 2011 г. Начиная с 2007 г. случаи краснухи не регистрируются на ряде территорий РФ. Так, в 2009 г. число таких территорий достигло 30,1%, а на 49,4% территорий показатель заболеваемости был менее 1,0 на 100 000 населения. Крупные очаги и вспышки заболевания не регистрируются, начиная с 2006 г. В 2010 г. из 471 очага краснухи в РФ 96,4% не имели распространения; число заболевших на один очаг составило 1,04 [30].

В целом заболеваемость краснухой в России в настоящее время характеризуется как спорадическая. Существенно изменился генетический пейзаж циркулирующих на территории России штаммов вируса краснухи [30].

Кроме того, наряду с резким снижением заболеваемости, увеличилось число случаев ошибочной первичной диагностики краснушной инфекции [33].

Одной из нозологических форм, требующих проведения дифференциальной диагностики с краснухой, является парвовирусная инфекция (инфекционная эритема) [65]. Возбудитель инфекции - парвовирус человека В19 (РУ В19) широко распространен в мире [174]. Большое значение в патогенезе инфекции имеет способность вируса размножаться в эмбриональных тканях (печени, селезенке, а также клетках сердца и кишечника плода). При заражении беременной женщины РУ В19 риск поражения плода достигает 30% в период с 10 до 28 недель гестации [8].

Инфекционная эритема как заболевание с выраженным тератогенным действием вируса представляет собой важную, но малоизученную проблему отечественного здравоохранения. В настоящее время нет регистрации парвовирусной инфекции (ПВИ) в РФ; неизвестны истинные масштабы ее распространенности, единичны сведения о циркулирующих на территории России генотипах РУ В19.

Изложенное свидетельствует о необходимости лабораторного подтверждения всех случаев заболеваний, обусловленных вирусом краснухи и парво-вирусом В19, об актуальности изучения превалентности ПВИ в структуре инфекционной заболеваемости. Совершенствование лабораторной диагностики указанных заболеваний, определение циркулирующих генотипов вируса краснухи и РУ В19 - актуальная задача отечественного здравоохранения, способствующая успешной реализации программы элиминации кори и краснухи в России.

Цель исследования

Совершенствование лабораторной диагностики краснушной и парвови-русной инфекций и определение генотипов вируса краснухи и РУ В19, циркулирующих в Северо-Западном федеральном округе России.

Задачи исследования

1. Проанализировать заболеваемость краснухой на территориях округа в период с 2002 по 2011 гг. в условиях вакцинопрофилактики этой инфекции.

2. Провести лабораторное обследование больных с первичным диагнозом «краснуха» с целью выявления изолятов вируса краснухи.

3. Проанализировать частоту лабораторного подтверждения диагноза «краснуха» в условиях спорадической заболеваемости этой инфекцией.

4. Изучить частоту обнаружения антител (АТ) класса ^М к РУ В19 у больных с экзантемными заболеваниями на территориях Северо-Западного федерального округа.

5. Проанализировать возможности применения методов ПЦР и ИФА для лабораторной диагностики парвовирусной инфекции.

6. Провести филогенетический анализ геновариантов РУ В19, циркулирующих на территории Северо-Западного федерального округа России.

Научная новизна

Впервые получены знания о циркуляции в Северо-Западном федеральном округе генотипа 1А парвовируса В19, о распространенности ПВИ на территориях округа, в том числе в группе риска (беременные женщины). Получены новые знания о генотипе изолята вируса краснухи, выделенного в Санкт-Петербурге в 2011 г.

Научная и практическая значимость

Ретроспективный анализ заболеваемости краснухой и охвата первичной и ревакцинирующей прививками в СЗФО за десятилетний период (2002-2011 гг.) подтверждает эффективность специфической профилактики краснушиой инфекции. Лабораторно установленный случай импорта вируса краснухи в СЗФО из Китая, наряду с результатами других исследований, свидетельствует о вытеснении эндемичного для РФ генотипа 2С в период спорадической заболеваемости краснухой. Рост количества ошибок первичной диагностики краснухи доказывает необходимость лабораторного подтверждения диагноза в каждом случае.

Предложена схема лабораторной диагностики ПВИ с интерпретацией результатов, которая может быть использована для определения заболеваемости инфекцией и повышения качества медицинской помощи. Полученные сведения о генотипах PV В19 необходимы для надзора за парвовирусной инфекцией.

Доказана значимость лабораторной диагностики краснушной и парвовирусной инфекций для совершенствования эпидемиологического надзора за эк-зантемными инфекциями; расшифрованы вспышки парвовирусной инфекции на территориях СЗФО (Кронштадт, Ленинградская область).

Внедрение результатов исследования в практику

1. Нуклеотидная последовательность гена El изолята вируса краснухи

Sankt-Petersdurg RUS 1366, выделенного в г. Санкт-Петербурге в 2011 г.;

депонирована в коллекцию Международного генетического банка

Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (accession number JX171315).

2. Нуклеотидные последовательности генов 8 изолятов парвовируса В19, выделенных на территориях СЗФО в 2010-2011 гг., депонированы в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (accession number: JX435809, JX644426 - JX 644432).

3. Аналитический обзор. Краснуха: эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика в условиях спорадической заболеваемости. - СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2010. - 68 с.

4. Аналитический обзор. Результаты сертификации территорий СевероЗападного федерального округа на отсутствие циркуляции эндемичного вируса кори. - СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2012. - 60 с.

5. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство / T. II под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова // разделы: Вирус краснухи. Пар-вовирус В19. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - с. 663-665, с. 706-708.

6. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики медико-биологического факультета СЗГМУ им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В результате специфической профилактики заболеваемость краснухи снизилась до уровня спорадической. В этих условиях возросло количество ошибок клинической диагностики краснухи.

2. Парвовирусная инфекция (инфекционная эритема) составляет существенную долю ошибок клинической диагностики краснухи, широко распространена на территориях Северо-Западного федерального округа. При этом значительная доля женщин репродуктивного возраста не имеет IgG-антител против PV В19.

3. Для лабораторного подтверждения диагноза «парвовирусная инфекция» методами ПЦР и/или ИФА существенное значение имеет время получения клинического материала от начала заболевания.

4. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов РУ В19, выделенных на территориях Северо-Запада РФ, позволил отнести их к генотипу 1А.

ГЛАВА 1. ВИРУС КРАСНУХИ И ПАРВОВИРУС В19; КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ДИАГНОСТИКА ОБУСЛОВЛЕННЫХ ИМИ ИНФЕКЦИЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус краснухи и парвовирус В19; их тератогенное действие

1.1.1. Вирус краснухи; морфология, структурно-функциональная организация генома

Впервые Rubella virus был выделен в 1962 г. независимо двумя группами ученых - P.D. Parkman с сотрудниками, Т.Н. Weller и F.A. Neva [189], с 1970 г. отнесен к семейству Togaviridae, является единственным представителем рода Rubivirus [32, 58, 266].

Зрелый вирион, молекулярной массой 52-60 х 10б (MDa) и диаметром около 60-70 нм, состоит из сферического экосаэдрического нуклеокапсида 40 нм в диаметре (Т= 3), образованного капсидным белком (С) [111], одетым однослойной оболочкой (8-10 нм). [46, 91, 267]. Оболочка содержит фосфолипиды и холестерол мембраны хозяйской клетки и встроенные вирусные гликопротеи-ны El и Е2, которые образуют пепломеры с шипами длиной 5-8 нм [150].

Однонитевой несегментированный инфекционный, положительно направленный РНК-геном, протяженностью от 9600 нк (с константой седимета-ции 38-40 S, молекулярной массой 3200-3800 kDa) [189], включает 5'-нетранслируемую область (UTR) - р150 (метилтрансфераза - белок X - цис-теиновая протеаза) - р90 (хеликаза - репликаза) - соединительную нетрансли-руемую область (JR) - С - Е2 - El - нетранслируемую область (UTR) - 3' и имеет 2 открытые рамки считывания (ORF) [32, 150]. Геном кодирует 3 структурных (El, Е2, С) и 2 неструктурных белка.

Проникновение в клетку происходит путем эндоцитоза в период от 30 минут до 3 часов [120, 150, 230]. Рецептором для вириона на клеточной поверхности, предположительно, является молекула убиквитина [189, 202]. В адгезии участвуют фосфолипиды и гликолипиды.

Репродукция вируса краснухи осуществляется в цитоплазме. На базе модифицированных лизосом (цитопатических вакуолей) образуются «реплика-тивные комплексы» вируса краснухи [188, 203] и формируется «вирусная фабрика» [146] из шероховатого эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи и митохондрий.

Репликация инициируется без помощи клеточных энзимов [146, 191]; репликативный цикл в культуре клеток ВНК-21 составляет 12-15 часов с латентным периодом 8-12 часов [263]. В процессе репродукции образуются несколько видов РНК: 40S, 24S, 21S и 19-20S [189]. Функции двух последних (21S и 19-20S) в настоящее время неизвестны.

С 5'-ORF транслируется предшественник неструктурных белков (Р200), который обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, осуществляет синтез «-» нити РНК и разрезается на полипептиды Р150 и Р90 [87, 187, 192, 218]. Белки Р150 и Р90 обеспечивают транскрипцию [87, 187, 191, 218]; кроме того Р90 [191] взаимодействует с ретинобластомным клеточным протеином и с хозяйской цитрон-К-киназой, которая регулирует клеточный цикл и останавливает его сразу после S-фазы [87, 147, 148, 201].

С З'-ORF в виде 24S субгеномной РНК (1,2 х ю3 kDa) считывается предшественник структурных белков Р110, в порядке NH2-C-E2-E1-COOH [92, 93, 118, 119, 151, 168, 200, 225, 255, 261], который в эндоплазматическом ретикулуме разрезается на С, El и Е2 [92, 118, 151, 168, 262, 255].

Капсидный С белок, состоящий из 300 а.о., с молекулярной массой, равной 30-38 kDa, является негликозилированным, фосфорили�