Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование лабораторной диагностики краснухи в условиях проведения массовой вакцинопрофилактики

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование лабораторной диагностики краснухи в условиях проведения массовой вакцинопрофилактики"

На правах рукописи

Гафаров Рамиз Рафикович

Совершенствование лабораторной диагностики краснухи в условиях проведения массовой вакцинопрофилактики

03.02.02 - Вирусология 14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 НОЯ 2014

005554400

Москва-2014

005554400

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор биологических наук

Юминова Надежда Васильевна

кандидат медицинских наук Марданлы Сейфаддин Гашим оглы

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, заведующий

лабораторией детских вирусных инфекций ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Лаврентьева Ирина Николаевна

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Мамаева Тамара Алексеевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «18» декабря 2014 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, мал. Казенный пер., д.5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, мал. Казенный пер., д.5А; www.instmech.ru

Автореферат разослан «_» октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук С

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Заболеваемость краснухой на территории Российской Федерации в последние годы приобрела стойкую тенденцию к снижению. Решающим фактором в снижении заболеваемости явилась начатая в 2002 году и, активно реализуемая в настоящее время, Программа по элиминации приобретенной постнатальной краснухи и снижению заболеваемости врожденной краснухой до показателя 1 на 100000 живых новорожденных. Отраженная в Национальном календаре профилактических прививок РФ стратегия вакцинации против краснухи (приказ Минздрава РФ № 3375 от 18.12.97) показала свою эффективность (Юминова Н.В. с соавт., 2011). В большинстве субъектов РФ двукратной вакцинацией в настоящее время охвачено не менее 95% детей дошкольного возраста, что соответствует рекомендациям ВОЗ.

В то же время, по результатам серомониторинга населения и ввиду регистрации новых вспышек заболеваемости, на 60-й сессии Европейского комитета ВОЗ была изменена планируемая дата полной элиминации кори и краснухи на контролируемых территориях с 2010 на 2015 год. В основном, случаи заболевания краснухой в последние годы связаны с завозом вируса из регионов, в которых массовая вакцинация против этой инфекции не проводится. В 2012 г в России был отмечен рост заболеваемости краснухой (Материалы регионального совещания по совершенствованию эпидемиологического надзора за корью и краснухой, г. Таганрог, 12-13 сентября 2012 г., г. Благовещенск, 30-31 октября 2012 г.).

Было показано, что в условиях проведения массовой вакцинации против краснухи происходит изменение типичной эпидемической картины заболевания, эффективность и достоверность эпидемиологических методов диагностики существенно снижаются (Говорухина М.В., 2008). По данным отечественных исследователей, до 50% случаев краснухи протекают в субклинической форме и при отсутствии указаний на контакт с больными (Потарская Е.В., 2009). В этих условиях, подтверждение диагноза «краснуха» методами серологической диагностики становится обязательным. Проводимые в группах риска сероэпидемиологические исследования позволяют сформировать объективную картину состояния популяционного иммунитета к

краснухе, оценивать эффективность вакцинации и достоверно прогнозировать эпидемиологическую ситуацию. В настоящее время, для лабораторной диагностики краснухи широко применяется иммуноферментный анализ (ИФА). Используемые в лабораториях коммерческие иммуноферментные тест-системы (ИФТС) имеют различный дизайн. Критерии оценки результатов также различаются. Материалы отчетов о сравнительных испытаниях, проведенных лабораторной сетью ВОЗ Европейского региона свидетельствуют о том, что в зависимости от используемой ИФТС, при исследовании контрольных панелей сывороток результаты анализа значительно варьируют (Stambos V., 2011). Вопросы стандартизации отечественных ИФТС, использующихся для выявления антител к вирусу краснухи, изучены недостаточно.

Известно, что выявление IgG-антител к ВК не всегда гарантирует защиту от инфекции. Так, в одном из исследований случаев СВК в США, из 21 беременных 71% ранее имели антитела к ВК, а 43% - были провакцинированы против краснухи (Lee S.H., 1992). Поэтому для оценки иммунного статуса к вирусу краснухи используют понятие «условно защитный титр антител». Обоснование оптимального уровня защитного титра — один из актуальных вопросов лабораторной диагностики.

Повышение эффективности лабораторной диагностики синдрома врожденной краснухи (СВК) в России, несомненно, остается важной задачей. Во многом это связано с тем, что клиническая диагностика СВК представляет определенные трудности, в частности, классическая триада Грегга при СВК в настоящее время практически не встречается (Мокова Н.М., 2009), краснуха у беременных зачастую протекает бессимптомно. В то же время, при проведении направленных исследований уровень выявляемое™ случаев СВК увеличивается многократно (Мокова Н.М., 2009). При исследовании материалов от погибших плодов на маркеры краснушной инфекции показано, что среди погибших врожденная краснуха встречается в 10 раз чаще, чем среди живых детей из группы риска (Рогушина H.JL, 2010).

Один из основных лабораторных критериев инфекции краснухи - наличие специфических IgM-антител. В то же время, в условиях спорадической заболеваемости краснухой наиболее частая диагностическая ошибка связана с ложноположительными результатами при определении IgM-антител. Показано,

что ИФТС, использующие «непрямой метод», при выявлении IgM-антител к вирусу краснухи не обеспечивают необходимого уровня специфичности (Кривицкая В.З., 2010; Майкова Е.М., 2009). Исследования зарубежных авторов свидетельствуют о высокой диагностической эффективности выявления противокраснушных IgM-антител с помощью ИФТС, в основе которых лежит метод «захвата», а также с помощью автоматизированных диагностических комплексов, использующих для детекции принципы иммунофлуоресценции или иммунохемилюминесценции (Portella G., 2010 Tipples G.A., 2004). Эффективность применения вышеупомянутых тест-систем в РФ требует дополнительного изучения.

Цель it задачи исследования

Целью настоящего исследования было повышение совершенствование лабораторной диагностики краснухи на основе использования методов иммуноферментного анализа в условиях проведения Программы ликвидации эндемичной краснухи и снижения уровня заболевания СВК до уровня менее 1 на 100000 живых новорожденных. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать ИФТС для количественного определения в сыворотке крови IgG к вирусу краснухи, соответствующую признанным в рамках системы ВОЗ диагностическим стандартам.

2. Разработать ИФТС для определения IgM-антител к вирусу краснухи, основой эффективности которой служит «ловушечный» метод ИФА.

3. С помощью разработанной иммуноферментной тест-системы провести оценку коллективного иммунитета к вирусу краснухи среди различных групп населения Москвы и Московской области.

4. Установить характер корреляции при определении уровня IgG-антител к вирусу краснухи в сыворотке крови с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы и диагностикума для выявления антител к вирусу краснухи методом РТГА.

5. Провести сравнительный анализ эффективности различных тест-систем, при определении IgM-антител к вирусу краснухи в условиях спорадической заболеваемости.

Научная новизна и практическая значимость

1. Получены новые данные о состоянии популяционного иммунитета к вирусу краснухи на территории Московской области.

2. Разработанная ИФТС для количественного определения ^С к вирусу краснухи позволяет проводить серомониторинг в условиях решения задачи элиминации эндемичной краснухи.

3. Разработанная ИФТС для выявления ^М к вирусу краснухи может быть использована в качестве аналога сертифицированных зарубежных тест-систем.

4. Получены новые данные по оценке уровня «защитного титра» антител против краснухи с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы для количественного определения 1§С к вирусу краснухи и метода РТГА.

5. Получены новые данные по оценке диагностической значимости используемых в РФ тест-систем для выявления ^М к вирусу краснухи.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанные иммуноферментные тест-системы для определения ^О и ^М к вирусу краснухи успешно прошли Лабораторно-клинические испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, используются в исследовательской практике и в учреждениях здравоохранения. Практическая ценность и новизна работы подтверждены получением 2-х патентов на полезную модель.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная иммуноферментная тест-система для определения к вирусу краснухи позволяет проводить количественную оценку ^С к вирусу краснухи с высоким уровнем корреляции по отношению к тест-системам, зарекомендовавшим себя в международной лабораторной практике.

2. Среди пациентов детских стационаров присутствует значительная доля лиц (15-20%), серонегативных к вирусу краснухи.

3. Среди беременных и женщин детородного возраста на территории Московской области наблюдается от 8% до 10% серонегативных и с уровнем

к вирусу краснухи ниже «условно защитного титра», подверженных риску реинфекции.

4. Уровень к вирусу краснухи в разработанной тест-системе ИФА-Краснуха-^й коррелирует с уровнем антител к вирусу краснухи в РТГА.

5. Разработанная на основе метода "захвата" иммуноферментная тест-система ИФА-Краснуха-IgM обладает высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяет оценивать титр антител.

6. Выявление IgM-антител к вирусу краснухи в условиях спорадической заболеваемости требует обязательного подтверждения дополнительными методами, такими как выявление низкоавидных антител и иммуноблотинг.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни детей: диагностика, лечение, профилактика» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); III Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», (г. Санкт-Петербург, 2010 г.).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН 19 июня 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 3 — в журналах, входящих в Перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК, 2 патента РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 248 источников, содержит 12 таблиц и 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Материалы и методы исследования

Диссертационная работа выполнялась на базе лаборатории детских вирусных инфекций ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Материалы:

В данном исследовании были использованы:

- клинические материалы, полученные в 2007-2013 гг. в различных регионах РФ с участием специалистов (эпидемиологов и вирусологов).

Сыворотка крови людей (в количестве 950 образцов) до проведения исследований хранилась при температуре 4°-8°С не более 5 дней. При необходимости более длительного хранения до исследования сыворотки хранились при температуре минус 40°С.

- препараты антигена вируса краснухи штамма HPV-77 (Biokit, Microbics), полученные путем культивирования в культуре клеток Vero и последующей очистки при помощи ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы.

- конъюгаты антител к у-цепям иммуноглобулина человека, меченные пероксидазой хрена, (Сорбент-лтд, Россия); Jackson (США)

- антитела моноклональные к ц-цепям имммуноглобулина человека (Sifin) Германия, «Верта» (Россия).

- международный стандарт человеческих антител к вирусу краснухи RUBI-1-94 (NIBSC, Лондон).

- отраслевой стандартный образец антител класса IgG к вирусу кори и вирусу краснухи - ОСО 42-28-393-07.

- сероконверсионная панель сывороток крови к вирусу краснухи - SCP-003 (ВЮМЕХ).

- донорская плазма крови - СПК г. Орехово-Зуево

Методы:

Определение концентрации белка по методу Брэдфорда

Для измерения концентрации белка в препаратах антигена вируса краснухи была применена модификация оригинального метода (Bradford М.М., 1976). В качестве реакционной емкости использовались лунки планшета для иммунологических реакций (Nunc, Дания). 150 мкл реактива Брэдфорда смешивали с 75 мкл испытуемой пробы. Измерения оптической плотности проводили при длине волны 620 нм с использованием фотометра фирмы Sunrise (Тесап).

Определение концентрации пероксидазы хрена

Проводили спектрофотометрическим методом, исходя из того, что для 1% раствора пероксидазы хрена при длине оптического пути 1 см A403 „м =22,75 и А28о нм =7,3 (Ishikawa Е. et al., 1983). Измерения проводили с использованием спектрофотометра СФ-46.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакцию проводили с использованием диагностикума краснушного сухого для РТГА производства ФГУ НИИЭМ им. Пастера (г. Санкт-Петербург). В качестве гемагглютинина использовали свежие эритроциты голубей, полученные по стандартной методике (Методические указания по исследованию сывороток в РТГА на антитела к вирусам краснухи и кори. Москва, 1978).

Иммуноферментный анализ

В работе были использованы следующие тест-системы: Векто-Рубелла-IgG, Векто-Рубелла-IgM производства ЗАО Вектор-Бест (Россия); ДС-ИФА-анти Rubella-G, ДС-ИФА-анти-ЯиЬе11а-0-Авидность производства НПО Диагностические системы (Россия); ИФА-Краснуха IgG, ИФА-Краснуха IgM производства ЗАО ЭКОлаб (Россия); Rubella-IgG-Human (Германия); Rubella-IgG-Euroimmun (Германия). Процедура анализа проводилась в соответствии с инструкцией по применению набора. Измерения оптической плотности проводили при длине волны 450 нм с использованием ИФА-фотометра «Sunrise» фирмы Тесап (США).

Электрофорез в полиакриламидном геле

Проводили по описанной ранее методике (U.K. Laemmli, 1970), с использованием комплекта оборудования «ProteanCell» фирмы Biorad. Использовали двухфазный гель с содержанием акриламида в концентрирующем геле 4%, в разделяющем геле - 11%. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 110В в течение 70 мин. Окрашивание белковых полос проводили с помощью Coomassie G-250. Для контроля процесса разделения белков и идентификации полученной картины электрофореза использовали окрашенный белковый маркер фирмы Fermentas (Литва). Полученные результаты регистрировали с помощью планшетного сканера 2448ТА ProII (Mustek).

Вестерн-нммуноблотинг

Проводили по общепринятой методике (Towbín Н. et al., 1979). После предварительно проведенного электрофореза в нередуцирующих условиях, осуществляли электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Biorad) в камере Hoefer. Контроль эффективности переноса проводили с помощью красителя Ponseau S (Sigma). Для выявления вирусспецифических IgG

использовали антивидовой конъюгат с щелочной фосфатазой (Sigma, США). Полученный иммунный комплекс выявляли с помощью комбинированного индикаторного раствора TNB (Kementec) Для регистрации результатов иммуноблотинга использовался планшетный сканер 2448ТА ProII (Mustek). Статистические методы и программное обеспечение Контроль параметров валидации иммуноферментных ТС и количественную оценку результатов проводили с помощью программы Magellan 5.0. Статистическую обработку данных проводили с помощью методов параметрического анализа с использованием программы Statistica 6.0. Для проведения корреляционного анализа и оценки степени параллелизма кривых титрования использовали статистическую программу PARALINE «Паралайн», разработанную главным метрологом ГИСК им. JI.A. Тарасевича В.Г. Петуховым. Программа зарегистрирована в Реестре программ для ЭВМ (номер свидетельства 2006612065, дата поступления заявки — 18 апреля 2006 года). Принцип работы программы основан на статистическом методе «параллельных линий», являющемся разновидностью дисперсионного анализа. 2. Результаты собственных исследований и их обсуждение 2.1. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения IgG к вирусу краснухи.

На первом этапе работы был проведен выбор оптимального препарата антигена вируса краснухи для дальнейшего использования в иммуноферментном анализе. После предварительного изучения литературных данных, были исследованы антигены вируса краснухи штамма HPV-77, полученные в фирме Biokit (Испания) и Microbix (Канада). Для оценки белкового спектра препаратов проводился электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли. С целью оценки специфической активности указанные препараты антигена ВК были протестированы в реакции иммуноблотгинга. Для идентификации вирусспецифических белков были использованы стандартные препараты антител к вирусу краснухи: RUBI-1-94 (NIBSC), ОСО 42-28-393-07, а также моноклональные антитела к гликопротеину Е1 вируса краснухи. Наибольшую иммунологическую активность и наименьшую неспецифическую реакцию показал препарат ВК фирмы Biokit. Он был использован в дальнейшей

работе для получения иммуносорбента и для получения специфического пероксидазного конъюгата.

Для получения иммуносорбента антиген вируса краснухи с концентрацией 1 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе вносили по 100 мкл в лунки планшета. Планшеты инкубировали в течение 20-24 ч. при температуре 4°-8°С. Для блокировки оставшихся свободными центров насыщения и снижения неспецифического связывания в лунки планшетов вносили 1% раствор БСА в 0,1 М трис-буферном растворе рН 7,4 и затем инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч. Содержимое лунок планшетов удаляли и далее проводили лиофильную сушку в течение не менее 3 часов. Планшеты герметично упаковывали в пакеты из алюминиевой фольги в атмосфере очищенного азота. Активность полученного иммуносорбента сохранялась на протяжении не менее 2-х лет (собств. данные). Для подтверждения специфичности положительного сигнала был использован метод связывания сывороточных антител при добавлении в реакционную смесь антигена вируса краснухи. Для этого проводилась предварительная инкубация в течение 30 мин. при температуре 37°С. При этом наблюдалось снижение оптического сигнала в ИФА не менее чем на 50%, что подтверждало специфичность взаимодействия антител с иммуносорбентом.

Для определения оптимального режима инкубации при проведении ИФА были исследованы следующие варианты:

1) при комнатной температуре, 2) при температуре 37°С.

Инкубация при температуре 37°С показала более низкую специфичность, чем при комнатной температуре. При комнатной температуре максимальная дискриминация положительных и отрицательных сывороток достигалась после 80 мин. инкубации. Рабочим режимом был выбран 30 мин. при комнатной температуре. При таком режиме активность положительной сыворотки составляла 80% от максимальной. Таким образом, был выбран оптимальный режим инкубации при сохранении достаточного высокого уровня чувствительности и воспроизводимости результатов. Инкубация при комнатной температуре не требует дополнительного оборудования в виде термостата. Лабораторно-клинические испытания тест-системы, проведенные в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва) с использованием препарата антител к вирусу

краснухи и кори ОСО 42-28-393-07 (Мотузова Е.В., 2009) показали правильность определения концентрации IgG к вирусу краснухи, высокую внутрисерийную и межсерийную воспроизводимость (коэффициент корреляции не превышал 8%).

2.2. Количественная оценка уровня IgG к вирусу краснухи в сыворотке крови с использованием иммуноферментных тест-систем отечественных и зарубежных производителей.

Для проведения сравнительного исследования были выбраны следующие зарегистрированные в РФ иммуноферментные тест-системы: Векторубелла-IgG (НПО Вектор-Бест, Россия), ИФА-Краснуха-IgG (ЗАО ЭКОлаб, Россия), ДС-антиРубелла-IgG (НПО Диагностические системы, Россия), EuroimmunRubella-IgG ( Euroimmun GmBH, Германия), Human-antirubella-IgG (Human GmBH, Германия). Указанные ИФТС имеют отличия в формате проведения реакции, природы используемого на твердой фазе антигена, методе учета результатов. Основные параметры тест-систем представлены в таблице 1. В то же время все они предназначены для количественного учета вирусспецифических IgG на основе международного стандартного образца антител к вирусу краснухи (RUBI-1-94) и имеют в своей основе так называемый «непрямой» метод ИФА.

Таблица 1. Характеристика тест-систем для количественной оценки к вирусу краснухи

Наименование тест-системы Характеристика антигена Метод учета результатов Диапазон измерений (МЕ/мл)

1. Векторубелла-IgG Rubella virus Расчетная формула от 10

2. ИФА-Краснуха-IgG Rubella virus Калибровочный график 10-200

3. ДС-антиРубелла-IgG Рекомбинант. белки Калибровочный график 10-160

4. EuroimmunRubella-IgG Rubella virus Калибровочный график 10-150

5. Human-antirubella-IgG Rubella virus Калибровочный график 10-100

В ходе работы были изучены образцы сывороток крови беременных женщин, предоставленные диагностическими лабораториями Москвы и Московской области. Образцы хранились до исследования при температуре минус 30°С не более 6 мес. Иммуноферментный анализ проводили в соответствии с инструкциями по применению наборов в условиях контролируемого эксперимента. Полученные результаты были статистически обработаны с использованием программы 81аЫ51:1°са 6.0. На первом этапе тестировались 380 сывороток с использованием наборов №1, 2, 3. При проведении предварительной качественной оценки [цв к вирусу краснухи было получено 100% совпадение результатов во всех трех тест-системах. Далее была проведена количественная оценка уровня ^О в положительных образцах. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Количественная оценка серопозитивных образцов к вирусу

краснухи

Наименование тест-системы Среднее значение ДО (МЕ/мл) Стандартное отклонение (в) Кол-во образцов

1. Векторубелла-^Ст 381 69 349

2. ИФЛ-Краснуха-^О 92 60 349

3. ДС-антиРубелла-^О 126 48 349

Далее слабоположительные образцы из данной выборки с концентрацией ^О в диапазоне 10-30 МЕ/мл (по меньшей мере, хотя бы в одной из тест-систем) тестировались повторно с использованием наборов № 1, 2, 3, 4, 5. Полученные результаты представлены в таблице 3. Проведенные исследования свидетельствуют о значительном влиянии конструктивных особенностей тест-систем на получаемые результаты. Наиболее сопоставимые результаты были получены между тест-системами № 2 и № 5, а также между тест-системами № 3 и № 4. Тест-система № 1 относительно остальных тест-систем показала более высокие значения концентрации (в 2-6 раз). Следует отметить, что расхождения в оценке уровня вирусспецифических ^О имеют наибольшую диагностическую значимость при исследовании слабоположительных

сывороток, принадлежащих пациентам «группы риска» в отношении возможности реинфекции краснухи.

Таблица 3. Количественная оценка слабоположительных образцов к вирусу краснухи____

Наименование тест-системы Среднее значение (МЕ/мл) Стандартное отклонение (в) Кол-во образцов

1. Векторубелла-1§0 123,9 69,3 44

2. ИФА-Краснуха-^в 20,1 6,8 44

3. ДС-аншРубелла-1«0 50,5 25 44

4. Еиго1ттипКиЬе11а-1аО 64 7,5 44

5. Нитап-апПшЬеПа-^О 29,2 10,4 44

При лабораторном обследовании беременная женщина с уровнем антител ниже «защитного титра» может быть ошибочно оценена как защищенная от реинфекции и не требующая дальнейшего наблюдения (или ревакцинации). При массовых сероэпидемиологических обследованиях существует вероятность искажения реальной картины состояния коллективного иммунитета к вирусу краснухи и тенденций его изменения.

2.3. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения ^М-антител к вирусу краснухи

При разработке дизайна тест-системы в качестве основы был использован следующий вариант метода «захвата»: на твердой фазе сорбированы антитела к тяжелым цепям иммуноглобулина человека, с ними связываются ^М антитела, находящиеся в исследуемом образце. Далее, с вирусспецифическими антителами связывается конъюгат - антиген вируса краснухи, меченый пероксидазой хрена. Полученный иммунный комплекс выявляется при помощи индикаторного раствора, использующего в качестве хромогена тетраметилбензидин.

Реализованный в тест-системе вариант метода «захвата» отличается методической простотой, технологичностью и обеспечивает высокую чувствительность и специфичность анализа.

Для получения иммуносорбента были предварительно исследованы несколько препаратов моноклональных и поликлональных антител к тяжелым цепям иммуноглобулина человека. Для дальнейшей работы использовались мышиные моноклональные антитела к IgM человека фирмы Sifin (Германия). Этот препарат обеспечивал максимальную чувствительность и специфичность при выявлении IgM человека. Рабочая концентрация антител при нанесении на планшет составила 5 мкг/мл. В качестве буферного раствора был использован 0,01 М PBS, рН 7,0-7,5. Планшеты инкубировали в течение 20-24 ч. при температуре 4°-8°С. Для снижения неспецифического связывания с твердой фазой в лунки планшетов вносили 0,01М трис-буферный раствор рН 7,0 с добавлением 15% фетапьной сыворотки крупного рогатого скота и затем инкубировали при температуре 25 °С в течение 2 ч. Блокирующий раствор удаляли и проводили лиофильную сушку планшетов в течение не менее 3 часов. Планшеты герметично запаивали в фольгу в атмосфере очищенного азота. Активность полученного иммуносорбента сохранялась стабильной на протяжении 2 лет и более (собств. данные).

Для получения вирусного конъюгата был использован перийодатный метод (Seppanen Н., 1990). Антиген вируса краснухи в концентрации 0,5 мг/мл был помечен пероксидазой корня хрена (Sigma). Рабочее разведение конъюгата находилось в пределах 1/100-1/300. При этом индекс позитивности сывороток от больного краснухой, вакцинированного против краснухи, составил соответственно 16 и 10, что говорит о высокой степени дискриминации положительных и отрицательных образцов. Лабораторно-клинические испытания тест-системы, проведенные в ГИСК им JI.A. Тарасевича, показали ее высокую чувствительность, специфичность, воспроизводимость результатов и корреляцию с аналогичными тест-системами (Мотузова Е.В., 2009).

2.4. Определение порогового уровня IgG и IgM к вирусу краснухи с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем

Одним из важнейших методических вопросов при разработке новых ИФТС является установление значения «порогового уровня», разделяющего

дифференцировать положительные и отрицательные результаты. Эффективность тест-системы во многом зависит от того, возможно ли с ее помощью с высокой степенью достоверности разграничить области отрицательных и положительных значений в изучаемой популяции. Если значительное количество образцов попадает в так называемую «серую зону», это затрудняет интерпретацию результатов и приводит к дополнительным трудозатратам. Для оценки распределения уровня ^в-антител к вирусу краснухи были исследованы 310 сывороток различных групп населения: доноры крови, беременные, дети. Результаты исследования доноров представлены на рис 1.

30 25 20

« <0

Ю10

20

Рис.1. Распределение уровня ^О к вирусу краснухи в сыворотках крови доноров

Исследование показало, что популяции серонегативных и серопозитивных образцов формируют два множества с выраженным минимумом между ними. Область значений положительных образцов формирует распределение, близкое к нормальному с выраженным максимумом в диапазоне 100-125 МЕ/мл. В области серой зоны (10-20 МЕ/мл) находилось не более 3% от исследованных сывороток, что вполне согласуется с проведенными ранее исследованиями.

1.|||||

<1 1,0-2,0 2,0-3,0 3,0-4,0 4,0-5,0 5,0-6,0 >6,0

1Р(индекс позитивности)

Для определения порогового уровня IgM к вирусу краснухи было исследовано 190 сывороток лиц, не имевших в анамнезе указаний на контакт с заболевшими краснухой и отсутствием эритематозов. В качестве порогового уровня была принята средняя оптическая плотность образцов плюс три стандартных отклонения, (р>0,99). При установленном пороговом уровне были протестированы 22 образца, предварительно положительные на IgM к вирусу краснухи не менее чем в 2 различных тест-системах, и 26 сывороток от вакцинированных лиц, до вакцинации серонегативных к вирусу краснухи. Во всех сыворотках были выявлены IgM-антитела к вирусу краснухи, что подтверждает высокий уровень чувствительности разработанной ТС.

2.5. Сравнительная оценка диагностической значимости выявления IgM к вирусу краснухи с помощью иммунофермеитиых тест-систем в условиях спорадической заболеваемости

Для исследования использовались сыворотки лиц с предварительным клиническим диагнозом «краснуха?». Сыворотки были получены в лабораторно-диагностических центрах г. Москвы в 2011-2013 гг. Сыворотки были протестированы на наличие IgM-антител с помощью автоматизированного диагностического комплекса Architect-Rubella-IgM (Abbott) и в ИФТС ИФА-Краснуха-IgM. В качестве подтверждающей методики использовали выявление низкоавидных IgG-антител к вирусу краснухи с помощью ИФТС ДС-ИФА-анти-КиЬе11а-С-Авидность. После инкубации сывороток с иммуносорбентом в лунки планшета добавляли диссоциирующий раствор и определяли наличие низкоавидных антител, вычисляя «индекс авидности». Выявление IgM-позитивной сыворотки с индексом авидности IgG-антител ниже 40% считалось критерием, соответствующим стадии первичной инфекции краснухи. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таким образом, среди IgM-положительных образцов в тест-системе Architect-Rubella-IgM, низкоавидные IgG-антитела были выявлены в 32% случаев. Среди IgM-положительных образцов в тест-системе ИФА-Краснуха-IgM, низкоавидные IgG-антитела были выявлены в 52% случаев.

В остальных случаях полученные результаты могут свидетельствовать о стадии реинфекции (персистирующей) краснухи или же требуют дополнительных лабораторных исследований. В условиях спорадической

заболеваемости краснухой диагностическая значимость обнаружения 1§М-антител требует дополнительного изучения. Для получения достоверного клинико-лабораторного заключения необходимо использование комплекса подтверждающих диагностических методов.

Таблица 4. Сравнительная оценка диагностической значимости выявления 1§М-антител к вирусу краснухи

Наименование Тест-системы Кол-во образцов Низкоавидные ДО (ИА<40%) Высокоавидные ДО (>40%) Отрицат. ДО

АгсИкесЬ ЯиЬе11а-^М 84 27 46 11

ИФА-Краснуха-1вМ 50 26 17 7

Примечание: ИА - индекс авидности

2.6. Изучение напряженности противокраснушного иммунитета на территории Московской области

Исследовались образцы сывороток детей и подростков в возрасте до 16 лет. Полученные образцы до момента исследования хранились не более 5 дней при температуре 2-8°С. Всего было исследовано 202 образца. Обследованные сыворотки были разделены на возрастные группы, учитывающие календарь прививок против краснухи. Образцы с содержанием специфических выше 10 МЕ/мл считались положительными, ниже 10 МЕ/мл - отрицательными. По результатам исследований наиболее высокий уровень серонегативных образцов был выявлен в группе от 3 мес. до 1 года (см. табл. 5). Наиболее высокие значения уровня антител к вирусу краснухи наблюдались в возрастной группе старше 13 лет.

Полученные результаты позволяют подтвердить эффективность принятой в РФ расширенной схемы иммунизации. Уровень неиммунной прослойки среди детей, получивших вторую дозу вакцины, значительно снижается. Наиболее защищенной оказывается группа старше 13 лет. В то же время, среди детей, получивших однократную дозу вакцинации, сохраняется возможность распространения краснухи ввиду сохранения значительной (21%) неиммунной

прослойки. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости углубленного анализа эффективности вакцинопрофилактики.

Таблица 5. Уровень серопревалентности детей к вирусу краснухи в зависимости от возраста

1 -я группа 2-я группа: 3-я группа:, 4-я группа: 5-я группа

Возраст новорожденные до 3 мес от 3 мес до 1 года от 2 до 6 лет от 7 до 13 лет старше 13 лет

Количество образцов(п) 39 38 40 45 40

Количество серонегативных(%) 13% 82% 21% 15% 6%

Для изучения степени защищенности женщин детородного возраста были исследованы образцы сывороток от беременных в первом триместре беременности, а также от женщин с различными гинекологическими заболеваниями (г. Электрогорск, городская больница). Полученные образцы исследовались в тот же день, или хранились до исследования не более 3 мес. при температуре минус 45° С. Всего было исследовано 65 образцов.

Среди обследованных женщин количество серонегативных составило 10,7 %. Причем, среди серопозитивных 2 образца имели уровень антител в диапазоне от 10 до 15 МЕ/мл. Согласно рекомендациям ВОЗ, подобные пациенты не защищены от повторного инфицирования вирусом краснухи. Наиболее высокие средние значения уровня антител (более 100 МЕ/мл) наблюдались среди женщин до 1990 года рождения.

Полученные результаты позволяют сделать вывод об актуальности скрининга ^О-антител к ВК среди женщин, планирующих беременность с целью решения вопроса о необходимости дополнительной иммунизации, поскольку в данной когорте населения уровень серопревалентности к вирусу краснухи может не достигать значений, обеспечивающих эпидемическое благополучие.

2.7. Исследование серопревалентности к вирусу краснухи среди пациентов детской клинической больницы

В условиях спорадической заболеваемости циркуляция ВК возможна в коллективах (группах) с невысокой серопревалентностью (Оапоуаго-НоШ(1ау М.С., 2000). Нами было проведено исследование иммунного статуса к ВК среди пациентов Детской городской клинической больницы им. Святого Владимира (табл. 6). С помощью ИФТС «ИФА-Краснуха-^в» была проведена оценка уровня 1§0 к вирусу краснухи в 444-х образцах сыворотки крови, полученных в 2013-2014 гг. от детей в возрасте до 16 лет с различной патологией.

Таблица 6. Исследование иммунного статуса к вирусу краснухи среди пациентов Детской ГКБ им. Святого Владимира (г. Москва)

положительные отрицательные пороговые

п 323 81 20

% 77.3 18,2 4,5

Примечание: п - количество образцов Положительные сыворотки - уровень ^О >25 МЕ/мл Отрицательные сыворотки - уровень <10 МЕ/мл Пороговые сыворотки - уровень 10 МЕ/мл < < 25МЕ/мл

Таким образом, среди обследованных суммарная доля серонегативных лиц и с уровнем антител к вирусу краснухи ниже условно защитного титра составила 22,7%. Коллективы с таким уровнем серопревалентности могут быть чувствительными к вирусу краснухи. Состояние иммунного статуса к ВК среди пациентов детских стационаров, несомненно, требует дальнейшего внимательного исследования.

2.8. Сравнительная оценка методов ИФА и РТГА при определении ^в-антител к вирусу краснухи

Как известно, с помощью метода ИФА выявляется суммарная иммунологическая активность антител, которая может отличаться от биологической активности антител. Являющиеся «золотым стандартом» в диагностике краснухи реакция нейтрализации в культуре клеток и реакция торможения гемагглютинации оценивают биологическую активность вирусспецифических антител. При сравнительной оценке методов РТГА и ИФА было отмечено, что наибольшая корреляция двух методов наблюдается при тестировании серонегативных сывороток и образцов с титром в РТГА 40 и

выше. Образцы с титром антител в РТГА 10-20 показывают наибольшее расхождение с методом ИФА (Cleary T.G., 1978). Определенные отличия могут быть связаны с тем, что метод ИФА выявляет антитела ко всем структурным белкам вириона (El, Е2 и С). В то же время, известно, что антитела к нуклеокапсиду обнаруживаются в течение лишь нескольких месяцев после инфекции. Длительный постинфекционный иммунный ответ обеспечивают антитела к гликопротеинам Е1 и Е2 (Nates S.V., 1989).

Способ обоснования оптимального уровня условно защитных антител определенным образом влияет на фактическую оценку состояния популяционного иммунитета. В странах Европейского региона, как правило, применяется уровень 15 МЕ/мл, в США оптимальным защитным уровнем принят 10 МЕ/мл (Skendzel L.P., 1996). В РФ, для метода ИФА, в свое время был рекомендован уровень защитного титра, равный 25 МЕ/мл (МУ 3.1.2.117702 от 21.11.2002 г). Поскольку РТГА общепризнана в качестве «золотого стандарта» при оценке иммунного статуса к вирусу краснухи, была поставлена задача определить уровень защитных антител в ИФА относительно этого метода. Для проведения сравнительных исследований в ИФА и РТГА были отобраны 3 группы сывороток в количестве 67 образцов с различным уровнем IgG к ВК: отрицательные, пороговые (10-25 МЕ/мл) и слабоположительные (2550 МЕ/мл). При тестировании сывороток в ИФТС «ИФА-Краснуха-IgM» все сыворотки были IgM отрицательны. Образцы были зашифрованы и протестированы в РТГА с помощью антигенного краснушного диагностикума (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург). Результаты представлены на рис. 2.

180 160 140 g 120 £ юо £ 80 5 60 40 20 0

Рис. 2. Уровень ^С к вирусу краснухи в сыворотках крови при исследовании в РТГА и методом ИФА

0 10 20 30 40 50 60 70

IgG МЕ/мл

При обработке результатов был получен невысокий уровень корреляции (Я2 = 0,75) при условии, что зависимость носит линейный характер.

При сопоставлении средних значений РТГА в диапазоне титров 10-160 и соответствующих им средних значений уровня в ИФА была получена высокая корреляция результатов на основе нелинейной зависимости (Рис. 3).

60

_ 50 с: £

Тг 40 2

й 30 ее

=г 20 х о

* ю

о

1

Рис. 3. График зависимости результатов ИФА и РТГА при тестировании антител к вирусу краснухи

Проведенные преобразования позволили с высокой вероятностью соотнести титры антител в РТГА и уровень ^О в ИФА на заданном диапазоне концентраций. Коэффициент корреляции результатов составил 0,955. Условно защитному титру антител в РТГА в ИФТС «ИФА-Краснуха-1§С» соответствует расчетный уровень равный 20 МЕ/мл.

Выводы:

1. Разработана иммуноферментная тест-система для количественной оценки уровня к вирусу краснухи в сыворотке и плазме крови, стандартизованная на основе международного образца антител к вирусу краснухи 1ШВ1-1-94.

2. Проведена сравнительная оценка применяемых в РФ иммуноферментных тест-систем для определения [§0 к ВК отечественного и зарубежного производства. Показана необходимость унификации отечественных ИФТС.

3. Впервые в РФ разработана иммуноферментная тест-система для выявления IgM к вирусу краснухи в сыворотке и плазме крови на основе метода «захвата» с использованием меченого антигена ВК. Показаны ее высокая чувствительность и специфичность относительно ИФТС на основе «непрямого метода».

4. Проведена оценка диагностической значимости выявления IgM к вирусу краснухи методом ИФА в условиях спорадической заболеваемости населения РФ.

5. Изучена напряженность иммунитета к ВК среди групп риска на территории Московской области. Показано, что у 10% женщин, серопозитивных к вирусу краснухи, уровень IgG-антител ниже протективного, допускающий возможность реинфекции. Среди детей, получивших однократную дозу вакцинации (в возрасте от 2 до 6 лет), количество лиц, серонегативных к ВК составило 20%, что допускает возможность рециркуляции вируса в этой группе населения.

6. Проведены сравнительные исследования методов РТГА и ИФА для уточнения уровня условно защитного титра к вирусу краснухи. Показана высокая корреляция результатов ИФТС «ИФА-Краснуха-IgG» и метода РТГА при определении IgG-антител к вирусу краснухи (R2=0,955). Установлено, что условно защитному титру антител к вирусу краснухи в РТГА соответствует уровень IgG-антител 20 МЕ/мл в ИФА.

7. При исследовании пациентов Детской городской клинической больницы Святого Владимира (г. Москва) в возрасте до 16 лет установлено, что 18,2% из них являются серонегативными к вирусу краснухи, у 4,5% детей уровень IgG к ВК ниже условно защитного титра. Показано, что подобные коллективы чувствительны к инфекции краснухи.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Гафаров, P.P. Опыт применения иммуноферментной тест-системы для количественного определения IgG к вирусу краснухи / P.P. Гафаров, Н.В. Юминова, В.В. Зверев // Труды международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». - Санкт-Петербург. - 2010. - С. 53.

2. Гафаров, P.P. Мониторинг иммунологического статуса к вирусу краснухи на территории Московской области / P.P. Гафаров, Н.В. Юминова, В.В. Зверев // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 2. - № 3. - С. 67.

3. Юминова, Н.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паротита и краснухи: задачи, проблемы и реалии / Н.В. Юминова, Е.О. Контарова, Н.В. Балаев, С.В. Артюшенко, H.A. Контаров, Н.В. Россошанская, Е.С. Сидоренко, P.P. Гафаров, В.В. Зверев // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2011.-№4(59).-С. 40-44.

4. Гафаров, P.P. Сравнительная оценка иммуноферментных тест-систем для количественного определения IgG к вирусу краснухи / P.P. Гафаров, Н.В. Юминова, Н.В. Балаев, В.В. Зверев // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2012. - № 5(66). - С. 41-43.

5. Марданлы, С.Г. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи / С.Г. Марданлы, Е.А. Амелина, P.P. Гафаров // Клиническая лабораторная диагностика. — 2012. - №5. - С.46-48.

6. Патент на полезную модель №134328. RU. МПК G01N33/53. Тест-набор для иммунологического анализа антител класса М на наличие возбудителей инфекций TORCH-группы / Марданлы С.Г., Помазанов В.В., Гафаров P.P. и др. - Заявка №2013132886, 17.07.13. Опубл. 10.11.2013. Бюл. № 31.

7. Патент на полезную модель №134329. RU. МПК G01N33/53. Тест-набор для иммунологического анализа антител класса G на наличие возбудителей инфекций TORCH-группы / Марданлы С.Г., Помазанов В.В., Гафаров P.P. и др. - Заявка № 2013132887, 17.07.13. Опубл. 10.11.2013. Бюл. № 31.

Подписано в печать 28.10.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 4925-10-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39