Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка эффективности вакцинопрофилактики краснухи на территории РФ

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Оценка эффективности вакцинопрофилактики краснухи на территории РФ"

На правах рукописи

Баласв Николай Владимирович

Оценка эффективности вакцинопрофнлактики краснухи на территории РФ

03.02.02 -Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 МАП Ш

Москва-2013

005059392

005059392

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Юминова Надежда Васильевна Контаров Николай Александрович

Официальные оппоненты:

Кузин Станислав Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории неспецифической профилактики инфекционных заболеваний

Костинов Михаил Петрович доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН, заведующий лаборатории вакцинопрофилактики и иммунотерапии аллергических заболеваний

Ведущая организация:

ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «23» мая 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН

Автореферат разослан «2^апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы

Значимость краснухи в России обусловлена широким распространением инфекции, высокой контагиозностью. Краснуха во время беременности может привести к мертворождению, самопроизвольным выкидышам, а также возникновению синдрома врожденной краснухи плода, для которого характерно формирование пороков развития и инвалидизация в последующем. Все вышеперечисленное подтверждает целесообразность научных исследований и необходимость надзора за этой инфекцией.

Всемирная организация здравоохранения относит краснуху к инфекциям, которые могут быть ликвидированы с помощью активной иммунизации. Опыт реализации Расширенной программы иммунизации (РПИ) Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) доказал эпидемиологическую и экономическую эффективность вакцинопрофилактики. Глобальная ликвидация натуральной оспы и успехи региональных программ ликвидации полиомиелита позволили поставить перед европейским здравоохранением цель элиминации краснухи.

Стратегическим планом европейского бюро ВОЗ установлен срок элиминации кори, малярии и краснухи к 2015 году в европейском регионе. В рамках национального плана по борьбе с краснухой на территории РФ с 2001 года проводится широкомасштабная вакцинация против краснухи детского населения, которая привела к значительному снижению заболеваемости, в связи с этим была отмечена тенденция к увеличению доли взрослых среди заболевших. Ситуация осложняется за счет увеличения количества мигрантов, иммунизация которых представляет определенные трудности. Для достижения благополучия в отношении СВК удельный вес восприимчивых к краснухе женщин детородного возраста не должен превышать 7 %. Снижение числа восприимчивых к краснухе возможно путем проведения вакцинопрофилактики (Юминова Н.В., Зверев В.В. и др., 2012). Важным аспектом эпидемиологического надзора за краснухой является объективная оценка эффективности вакцинации, которая возможна только при проведении серомониторинга популяционного иммунитета и мониторинга качества вакцинопрофилактики. Наиболее эффективным и простым способом проведения серологического надзора является постановка ИФА. Поэтому важно иметь

высокочувствительные и высокоспецифичные отечественные тест-системы для определения антител класса М и в в период элиминации краснухи на территории РФ. Высокая медицинская и социальная значимость краснухи определила цели и задачи исследования.

Цель исследования

Совершенствование методов эпидемиологического, вирусологического и серологического надзора за краснухой на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района Московской области.

Задачи исследования

1. Получение изолятов вируса краснухи от пациентов с подозрением на краснушную инфекцию на территории г. Москвы и МО, их характеристика по специфической активности.

2. Изучение взаимодействия вакцинного штамма «Орлов» вируса краснухи с Са2+-активируемыми-С1—каналами клеток харовых водорослей с целью определения физиологической активности и безопасности действия на ионные каналы и клеточную мембрану.

3. Проведение сравнительного анализа отечественных иммуноферментных тест-систем для определения и IgM антител к вирусу краснухи.

4. Изучение иммунного статуса с учетом возрастных и половых особенностей, выявление групп риска по заболеваемости краснухой на территории Российской Федерации.

5. Выявление детей с синдромом врождённой краснухи (СВК).

6. Проведение эпидемиологического надзора за краснухой на территории Российской Федерации, г. Москвы и контролируемых территорий Московской области.

7. Проведение математического анализа заболеваемости краснухой в Российской Федерации и на контролируемой территории Московской области.

Научная новизна

Получены 10 изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории МО и охарактеризованы по специфической активности.

Впервые оценён механизм молекулярной внутриклеточной сигнализации отечественного штамма вируса краснухи «Орлов» при взаимодействии с ионными каналами харовых водорослей.

Отобраны оптимальные отечественные тест-системы для определения антител классов М и б к вирусу краснухи с показателями чувствительности и специфичности более 95%.

В результате проведенного исследования были определены группы риска по заболеваемости краснухой, определена доля серонегативных людей на территории г. Москвы и Московской Области (МО). Были выявлены три ребенка с СВК.

Проведен ретроспективный анализ заболеваемости краснухой с 2001 по 2011 гг. на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района МО. Построена математическая модель заболеваемости краснухой с использованием метода ШБ - анализа и модифицированной модели Вольтерра-Лотки, которые позволили установить устойчивый характер в снижении заболеваемости.

Практическая значимость

Получены и охарактеризованы 10 изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории МО.

Предложен новый биологический объект - клетки харовых водорослей для изучения механизмов внутриклеточной сигнализации при взаимодействии вируса краснухи с клеткой.

Сравнительное исследование отечественных и зарубежных наборов реагентов для ИФА подтвердило высокий процент совпадений результатов по тестам специфичности и чувствительности между ними и позволило предложить тест-системы ЭКОЛаб -^Ми^ в производства РФ, как наиболее оптимальные, для проведения мониторинга за популяционным иммунитетом к краснухе на территории РФ.

В результате проведенных исследований с помощью математического анализа заболеваемости краснухой на территории РФ и отдельных регионов было показано зависимое от вакцинации снижение заболеваемости данной инфекцией, которая носит апериодический (экспоненциальный) характер.

Полученные результаты могут быть применены медицинскими организациями, участвующими в оказании бесплатной медицинской помощи, при организации профилактических и диагностических мероприятий.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008), на конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на третьей международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010), на всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний» (Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась 26 апреля 2012 г. на научной конференции отдела вирусологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук. Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, из них в 2 журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы работы изложены на 107 страницах и состоят из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, глав собственных результатов исследований, выводов, списка литературы - 115 источников (отечественных и зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 29 рисунками.

Собственные исследовании

Материалы и методы Вирусы. С целью изучения взаимодействия вируса с Са2+-активируемыми - СГ-каналами

была использована вируссодержащая жидкость (ВСЖ), из культуры клеток,

инфицированных штаммом «Орлов», с инфекционным титром 5,2 lg ТЦД5о/мл. ВСЖ

добавляли к клеткам харовых водорослей в двукратных разведениях, начиная с 20 мкл и

до 100 мкл.

Ведение клеточных культур. Клеточные линии почки кролика (RK-13) и почки хомяка (ВНК-21) культивировали в среде ДМЕМ ("Gibco", США) с добавлением 10 %-ой фетальной сыворотки крупного рогатого скота ("Gibco", США) при 37°С. Для выделения вируса использовали 4-5 - суточные культуры, выращенные во флаконах площадью 75 см2. Средняя концентрация клеток составляла (1,6± 0,02)*103 кл/мл. При подозрении на бактериальное загрязнение исходные материалы подвергались стерилизующей фильтрации через фильтры "Миллипор" диаметром 0,20 мкм.

Выделение вируса из носоглоточных смывов. Монослой клеток отмывали троекратно бессыворточной средой и вносили по 0,4 мл исследуемого материала, инкубировали 60 мин при температуре 34°С, после чего добавляли 2 мл поддерживающей среды, состоящей из ДМЕМ ("Gibco", США), 2% бычьего сыворточного альбумина (БСА) ("Sigma", США), 1 М раствора HEPES ("Sigma", США) и 40 мкг/мл гентамицина сульфата ("Gibco", США). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 34 °С в течение 7-8 суток. На 3-5 -е сутки одну из пробирок замораживали при -70°С, вторую использовали для ОТ-ПЦР на присутствие вируса в образцах.

Титрование вируса краснухи. Титрование вируса краснухи проводили в перевиваемых культурах клеток RK-13 и ВНК-21. Инфекционный титр по ЦПД определяли по методу Рида-Менча . Кинетику изменения инфекционного титра наблюдали в течение 7 суток. Определение вируса краснухи в ОТ-ПЦР. РНК вируса краснухи была выделена из мазков или культуральной жидкости с помощью тест-системы "РИБО-сорб" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия); кДНК была синтезирована в 20 мкл смеси для реакции обратной транскрипции на комплекте реагентов "PEBEPTA-L" (ФГУН ЦНИИЭ

7

Роспотребнадзора, Россия) со случайных гексонуклеотидов (60 мин при температуре 45°С) Для денатурации реакционную смесь прогревали 5 мин при 95° С. РНК вируса краснухи выявляли в ПЦР с использованием наборов "АмплиСенсЯиЬеНа virus" и «АмплиСенс® Rubella vims" (ФГУН ЦНИИЭРоспотребнадзора, Россия). Постановка ПЦР осуществлялась на амплификаторе "Терцик" (ДНК-технология) с активным регулированием (по раствору в пробирке). Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной кДНК.

Электронная микроскопия. Для анализа методом электронной микроскопии были накоплены вирусы краснухи на культуре RK-13. Частицы округлой и продолговатой формы в осадке культуральной жидкости, сконцентрированной с помощью ультрацентрифугирования. Материал для электронно-микроскопического исследования брали до заражения (контроль), спустя 24, 48 и 72 часа, 4 и 6 суток после заражения вирусом краснухи. Клетки фиксировали 1 час в 2,5% растворе глютаральдегида ("Sigma", Германия) на какодилатном буфере ("Sigma", Германия), постфиксировали 1% раствором осмиевой кислоты ("Sigma", Германия), обезвоживали и заливали в эпонаралдит ("Sigma", США). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме "Ultracut" ("Reihert-Jung", Германия) и после контрастирования уранилацететом ("Sigma", Германия) и цитратом свинца ("Sigma", Германия) изучали в электронном микроскопе "JEM-1011" ("JEOL", Япония). Электронно-микроскопические исследования проводили сотрудники ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России к.б.н. Сироткин А.К., к.б.н. Прочуханова А.Р.

Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции. Препараты для прямой иммунофлуоресценции готовили из осадка клеток RK-13, инфицированных вирусом краснухи. Для этого 5 мкл инфицированной и неинфицированной клеточной взвеси наносили на подготовленные предметные стекла в виде тонких круглых пятен диаметром 50 - 80 мм. Предметные стекла с клеточными пятнами высушивали при комнатной температуре и фиксировали охлажденным (- 20° С) 70 % этиловым спиртом в течение 20 -30 минут. Затем стекла отмывали от этилового спирта ФБР №2 (ФГУН НПО "Микроген",

РФ) и подсушивали при комнатной температуре. На подготовленные таким образом клеточные пятна наносили по 30 мкл мышиных моноклональных антител к структурному белку Е1 вируса краснухи (получены в лаборатории гибридных клеточных культур ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН зав. лабораторией д.м.н. Нагиевой Ф.Г.), конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) ("Sigma", Германия). Раствор конъюгата содержит дифференцирующую краску Эванс голубой ("Sigma", Германия). Реакцию учитывали на флуоресцентном микроскопе "Optica" (Италия) при длине волны 510-550 нм. В инфицированных клетках выявляли флуоресцирующие фокусы в виде светящихся яблочно-зеленым цветом клеток при отсутствии свечения в неинфицированных клетках.

Перфузия клетки и удаление тоиопласта. Нативная клетка харовой водоросли размещалась в пазы трех секционной камеры из фторопласта. Затем клетка подсушивалась на воздухе для уменьшения внутриклеточного давления. После этого концы клетки, выходящие в боковые отсеки, обрезали и клетку перфузировали соответствующими растворами. Один отсек заполняли перфузионным раствором (ПР) с Са-хелатирующим агентом EGTA (раствор-EG-nP), имеющий состав, (в мМ): 3 EGTA, 15 KCH3SO4, 280 сахарозы, 20 HEPES/KOH, рН 7,2. Центральный отсек камеры заполняли раствором ИПВ ( искусственной прудовой водой). Для поддержания осмотического равновесия добавляли в раствор ИПВ 180 мМ сахарозы и буфер-1мМ HEPES/NaOH, рН 7,2. Противоположный отсек заполняли Са-содержащим раствором (Са-ПР) по ионному составу идентичному раствору EG-ПР, но с заменой хелатора EGTA на ионы Са2+. Тип и концентрация токозадающего аниона (А") в растворе Са-ПР варьировал в зависимости от условий задачи. В качестве основного токозадающего аниона использовали СГ, и для уменьшения амплитуды развивающегося тока большой плотности использовали заменители иона СГ: метилсульфат и сульфат-ион. Состав раствора Са-ПР (в мМ): 0,05 EGTA, 0,5 СаС12,10 А-, 280 сахарозы, 20 HEPES-KOH, рН 7,2, об удалении тонопласта судили по значению потенциала покоя (ПП) и величине сопротивления мембраны. Заполнение отсеков рабочей камеры проводили таким образом, чтобы в клетке оставался раствор EG-ПР. Скорость протока раствора в клетке составляла 5-10 мкм/с.

Фиксация напряжения на мембране. Измерения переходного тока, вызванного изменением напряжения на мембране, проводили в режиме фиксации напряжения на выделенном участке клетки длиной 2 мм по классической четырехэлектродной методике (Cole К. S. 1968). Для фиксации напряжения на мембране использовали специальный усилитель Dagan 8500 (США). В качестве управляющего и регистрирующего устройства использовали компьютер с платой ЦАП/АЦП DataTranslation DT2801A и Lcard 1250. Для мониторинга эксперимента использовали специализированный пакет программ BioQest и Pclamp 6.

Клинический материал. В работе было исследовано 845 сывороток крови, полученных от разных групп населения. 10 носоглоточных смывов полученных от детей с подозрением на краснушную инфекцию.

Иммуноферментный анализ. В работе были использованы отечественные и зарубежные тест системы: "ЭКОлаб-Краснуха-IgG", ЗАО ЭКОлаб, Россия; "ЭКОлаб-Краснуха- IgM", ЗАО ЭКОлаб, Россия; "ВектоРубелла-^С-стрип", ЗАО Вектор Бест, Россия; "ВектоРубелла-^М-стрип", ЗАО Вектор Бест, Россия; "BCM-Diagnostics-IgG", ВСМ Diagnostics, USA; "BCM-Diagnostics-IgM", ВСМ Diagnostics, USA. Все тест-системы лицензированы в России. В качестве хромогена во всех системах используется 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ).

Оценка специфичности и чувствительности отечественных ИФТС. Чувствительность рассчитывалась как отношение числа положительных результатов в исследуемой тест-системе к числу положительных результатов в системе сравнения, умноженное на 100%. Специфичность рассчитывалась как отношение числа отрицательных результатов в исследуемой тест-системе к числу отрицательных результатов в системе сравнения, умноженное на 100%.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью методов параметрической статистики: t-критерий Стьюдента и критерий Фишера-Снедекора. Нормальность распределения величин оценивали по критерию Шапиро-Уилка, для величин распределенных ненормально применяли критерий Манна-

Уитни. Все необходимые расчеты проводили с помощью пакета программы '^айвйса 6.0".

Результаты и обсуждения

Выбор оптимальной клеточной культуры для размножения вируса краснухи

Первым этапом выбора оптимальной клеточной культуры было выявление в образцах сывороток крови, полученной от инфицированных детей, вируса краснухи с помощью метода прямой иммунофлуоресценции.

Рисунок 1.

Иммунофлуоресценция вируса краснухи в культуре клеток 11К-13

На рис. 1 видна четко выраженная флуоресценция инфицированных клеток, детектируемых с помощью моноклональных антител к структурному белку Е1 вируса краснухи в зеленой области спектра. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что в 10 исследуемых образцах присутствовал вирус краснухи, в контроле культуры клеток ЯК-13 флуоресценция отсутствовала.

С целью получения изолятов вируса краснухи осуществляли подбор оптимальной для размножения вируса клеточной культуры. Вирус из носоглоточных смывов был инокулирован в две клеточные культуры: ЯК-13 и ВНК- 21, для определения чувствительности клеточных линий ВНК-21 и ЮС-13 к вирусу краснухи. Для проведения исследования проводили заражение пробирок с формированным монослоем клеток десятикратными разведениями вируса краснухи (в концентрации от цельного до 10"5). Начиная с 4-х суток после заражения, по одной пробирки зараженной каждым

разведением вируса замораживали при -70°С для исследования методом ОТ-ПЦР. Результаты исследования приведены на рисунке 2. Исходя из рисунка, можно заключить, что наибольшей чувствительностью к размножению вируса краснухи, обладала клеточная культура ЯК-13, в которой на седьмые сутки после инфицирования выявляли генетический материал вируса краснухи в разведении 1:1 ООО, для клеточной культуры ВНК-21 на те же сутки положительные результаты были получены для неразведенного вируса. В связи, с чем можно заключить, что клеточная культура ЯК-13 является наиболее оптимальной для размножения вируса краснухи.

Рисунок 2.

Кинетика изменения относительного количества РНК (50 О) выделенного изолята вируса краснухи в зависимости от разведения вируса на клеточных культурах ВНК-21 и И К-13

Кривая 1 -клеточная линия ВНК-21 в десятикратном разведении, кривая 2-клеточная линия ВНК-21 с цельным вирусом, кривые 3-6 -клеточные линии ЯК-13 в разведениях

10"3, 10"2, 10"' и цельный вирус.

В связи с тем, что культура клеток ВНК-21 оказалась нестабильной и не выдерживала наблюдения в течение 10 дней, то в дальнейшем для размножения вируса краснухи использовали клеточную культуру Г1К-13. Следующим этапом нашего исследования было количественное определение титра вируса краснухи по ЦПД.

Рисунок 3.

Кинетика увеличения инфекционного гитра по ЦПД вируса краснухи в культуре

клеток И К-13

Кривые 1-10 - номера образцов.

На рисунке 3 представлена кинетика изменения инфекционного титра вируса краснухи по ЦПД. Из полученной зависимости видно достоверное увеличение инфекционного титра вируса краснухи. Размножение вируса в культуре клеток ЯК-13 было подтверждено также методом электронной микроскопии.

Изучение взаимодействия вируса краснухи с ионными каналами

Изучение механизма взаимодействия вируса краснухи с Са2+-активируемыми хлорными каналами харовых водорослей, являющихся практически идентичными тем же каналам животных клеток, с целью выявления механизмов внутриклеточной сигнализации и функционального состояния клеток после взаимодействия с вирусом . В наших исследованиях было выявлено увеличение времени инактивации (0 хлорного тока Са'1-активируемого хлорного канала при двукратном увеличении количества добавляемой вируссодержащей жидкости (рис. 4).

Рисунок 4.

Изменение времени инактивации Са2+ - активируемых С1- - каналов

1600

? 1400

1200

1000

в

$ 600

400

У1Ю

>

а

0 1 2 3 4 5 6

Номер опыта

Замедление кинетики инактивации хлорного тока указывает на взаимодействие поверхностных белков вируса краснухи с канальными белками, по всей видимости, за счет электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Поскольку вирус краснухи имеет диаметр порядка 80 нм, что значительно больше диаметра пор клеточной стенки (порядка 10,8-12,0 нм) харовых водорослей, поверхностные вирусные белки взаимодействуют с ионными каналами, по всей видимости, после частичного втягивания вириона через пору. Данный тип взаимодействия может являться новым типом взаимодействия с растительными белковыми структурами и указывает также на невозможность размножения оболочечных вирусов в растительной клетке из-за отсутствия слияния вируса клеточной мембраной растительной клетки. В дальнейшем было изучено взаимодействие вируса краснухи с клеточной мембраной клетки харовой водоросли посредством внутриклеточной перфузии клеток вируссодержащей жидкостью, В результате полученных данных не было выявлено взаимодействие вируса с клеточной мембраной, так как ток утечки и сопротивления мембраны клетки изменялись в пределах ошибки.

Таким образом, изучение возможных механизмов внутриклеточной сигнализации вируса краснухи штамм Орлов, показало, что активируя внутриклеточную сигнализацию клетки, вирус вызывает увеличение времени инактивации каналов и не влияет на

порообразование в мембранах клетки, что косвенно подтверждает безопасность данного отечественного штамма как вакцинного.

Выбор оптимальной отечественной иммуноферментной тест системы для определения и 1^0 к вирусу краснухи

Выбор оптимальной иммуноферментной тест-системы для определения антител класса в к вирусу краснухи крайне важен как для научных целей, так и для практического здравоохранения, поскольку определение защитного титра антител позволяет оценить эффективность проводимой вакцинации, выявить наиболее уязвимые группы населения, а также крайне необходим при планировании беременности. В результате исследования был проведен сравнительный анализ двух отечественных ("Эколаб-Краснуха-^ С' и "ВектоРубелла - ^ С') и одной зарубежной ("BCM-Diagnostics-IgG", США) иммуиоферментных тест-систем для определения 1^0 к вирусу краснухи (табл. 1,2). Были проанализированы 135 сывороток, полученных от населения МО. При этом 87 сывороток было получено от мужчин и женщин, ранее болевших краснухой, 27 сывороток от детей в возрасте от 1 года до 2-х лет, непривитых и неболевших краснухой, 10 подростков, двукратно привитых против краснухи, остальные 11 сывороток были получены от людей с неизвестным прививочным анамнезом.

Таблица 1.

Сравнение ИФТС "Эколаб-Краснуха-^ С и "ВектоРубелла С'по тестам чувствительности и специфичности (р<0,05)

Название тест-системы Чувствительность, % Р-критерий Специфичность, % р-критерий

"Эколаб-Краснуха-^С 100% 0,227 (различия незначимы) 98,4 0,135 (различия незначимы)

"ВектоРубелла-12.0" 99,1% 94,5

Таблица 2.

Сравнение ИФТС "BCM-Diagnostics-IgG" и ИФТС "Эколаб-Краснуха-1«С;"по

чувствительности и специфичности (р<0,05)

Название тест-системы Чувствительность, % И-критерий Специфичность, % И-критерий

"Эколаб-Краснуха-^О" 100% 0,136 (различия незначимы) 98,4 0,045 (различия незначимы)

"ВСМ-О^шшез- 100% 97,1

Проведенный сравнительный анализ ИФТС "ВСМ-ОишюяПсз-^О", "Эколаб-Краснуха-^С' и "ВектоРубелла-^С' показал, что все три тест-системы обладают приемлемыми диагностическими параметрами. При этом все три тест-системы показали достаточную чувствительность за исключением одного случая, когда тест-системы "Эколаб-Краснуха-^С и "ВСМ^а^оз&з-^С" показали положительный результат, а тест-система "ВектоРубелла-^С - отрицательный результат (табл. 1,2). Далее был проведен корреляционный анализ титров антител в МЕ/мл к вирусу краснухи для трех тест-систем. Из полученных зависимостей можно заключить, что наибольшая корреляционная связь определялась (коэффициент корреляции Пирсона г=0,97) для ИФТС "Эколаб-Краснуха-^С и "ВСМ^а^оБЙсз-^О" в отличие от ИФТС "Эколаб-Краснуха-^С и "ВектоРубелла-^С (коэффициент Пирсона, г=0,96).

Выбор оптимальной тест-системы для определения антител класса М важен для лабораторного подтверждения краснухи, особенно среди групп риска. Из литературных данных известно, что тест-системы сконструированные по принципу захвата антител обладают более высокими параметрами специфичности по сравнению с тест-системами сконструированными по принципу непрямого ИФА. Проведено сравнительное исследование двух отечественных тест-систем "Эколаб-Краснуха-^М" и "ВектоРубелла-^М", и одной зарубежной -"ВСМ-О^поэ^сз-^О", при этом тест-системы "Эколаб-Краснуха-^М" и "ВСМ^а^ОБЙсз-^М" сконструированы по принципу захвата антител, а тест-система "ВектоРубслла-1§М" по принципу непрямого ИФА (табл.3,4). Были

исследованы 140 сывороток, причем 78 сывороток от больных с клиническим диагнозом краснуха, 15 сывороток от больных с клиническим диагнозом корь, 17 сывороток от здоровых доноров, и 26 сывороток от доноров страдающих системными коллагенозами, из них 10 от больных ревматоидным артритом.

Таблица 3.

Сравнение ИФТС "Эколаб-Краснуха-^М" и ИФТС "ВектоРубелла-^М" по

чувствительности и спеши шчности (р<0,05)

Название тест-системы Чувствительность, % |-'-критерий Специфичность, % Р-критерий

"Эколаб-Краснуха-^М" 100% 1,845 (различия значимы) 98,3 2,000 (различия значимы)

"ВектоРубелла-18М" 76,3 77,1

Таблица 4.

Сравнение ИФТС "Эколаб-Красиуха-^М" и ИФТСВСМ-ШацповИсэ-Г^М" по

Название тест-системы Чувствительность,% Р- критерий Специфичность, % Р-критерий

"Эколаб-Краснуха-^М" 100% 0,045 (различия незначимы ) 98,3 0,045 (различия незначимы)

"ВСМ-0'|а£П05('1С5- 1еМ" 99,2 98,1

Таким образом, в результате проведенного исследования было показано, что наилучшими диагностическими параметрами обладают тест-системы "Эколаб-Краснуха-^М" и "ВСМ-01ацпоз1к5-1§М. Более низкая чувствительность и специфичность тест-системы "ВектоРубслла-1цМ", по всей видимости, обусловлена перекрестным реагированием с ревматоидным фактором сыворотки крови, что снижает достоверность полученных результатов.

4. Оценка коллективного иммунитета к краснухе, проведение ретроспективного эпидемиологического исследования, математического моделирования на территории РФ, г. Москвы и Московской области.

Изучение коллективного иммунитета имеет важное значение, особенно в перио элиминации краснухи и СВК на территории РФ. Исследование коллективног иммунитета позволяет выявить наиболее уязвимые слои населения, создать группы риска оценить эффективность вакцинопрофилактики. Для оценки популяционного иммунитет против краснухи у детей, подростков, молодых мужчин и женщин в возрасте до 25 лет н территории Люберецкого района МО в 2009 году, был проведен серологически мониторинг на выявление антител класса О к вирусу краснухи (таблица 5.). При это наибольший процент серонеганивных людей относился к возрастной группе 23-25 лет 19,7%, что создает реальную угрозу возникновения вспышки заболеваемости среди это группы населения и возможности инфицирования беременных. Второй группой п количеству серонегативных оказалась группа детей в возрасте 3-4 лет. Высокий процен серонегативных среди детей этой группы (12,5%) связан с отсутствием ревакцинации, чт свидетельствует о неполной эффективности однократной вакцинации.

Таблица 5

Напряженность иммунитета к краснухе у привитых разных возрастных групп Люберецкого района в 2009 году.

Возрастные Число обследо- Положи- Отрицательные Сомни- % серонега-

группы ванных тельные тельные тивных

Абс. % Абс. % Абс. %

3-4 года 148 130 87,5 18 12,5 0 0 12,5

9-10 лет 82 73 88,7 8 9,7 1 1,6 11,3

15-17 лет 181 171 94,4 10 5,6 0 0 5,6

23-25 лет 157 124 79 31 19,7 2 1,2 20,9

Всего 568 498 87 67 12,2 3 0,7 12,9

Также были исследованы сыворотки 174 детей в возрасте от 1 месяца до 1 года на содержание антител класса в к вирусу краснухи. В результате было показано, что начиная с 5 месяцев, у более 80% детей отсутствовали вирусспецифические антитела класса О. В связи с этим возникает опасность возникновения вспышки заболеваемости краснухой в этой возрастной группе с возможным вовлечением в эпидемический очаг серонегативных лиц, особенно женщин детородного возраста.

Следующим этапом исследования явилось выявление детей с СВК. Выявление детей с СВК имеет большое значение для ребенка, так как знание этиологии порока развития может улучшить прогноз и исход заболевания, а также для практического здравоохранения, поскольку дети с СВК могут выделять вирус краснухи до двух лет, что может явится причиной инфицирования серонегативных людей.

Следующим этапом было проведение иммуноферменшого анализа сывороток, полученных от детей в возрасте от 5 месяцев до 2-х лет, находившихся на лечении в детской больнице им. Св. Владимира с различными пороками развития. При изучении анамнеза у матерей было выявлено, что ранее краснухой болели 80 матерей, были привиты 7 матерей из неболевших, у остальных прививочный анамнез отсутствовал.

В результате проведенного исследования сыворотки, полученные в 2007 году от трех детей, оказались серопозитивными. Также было проведено исследование на антитела класса при этом все три сыворотки оказались серопозитивными. В дальнейшем была проведена ОТ-ПЦР этих сывороток, в результате во всех трех образцах была выявлена РНК вируса краснухи. Полученные нами результаты подтвердили, что в годы роста и высокого уровня заболеваемости краснухой (2002 - 2006г.) на территории Российской Федерации количество детей с СВК было значительно больше, чем заявлялось официальной статистикой ( в год от 2-х до 9 случаев СВК).

Следующим этапом исследования было изучение заболеваемости краснухой и анализ охвата профилактическими прививками. Для оценки числа заболевших краснухой и охвате населения прививками были собраны статистические данные по ежемесячной заболеваемости краснухой населения РФ, г. Москвы и Люберецкого района (форма 2.), за

период 2002 -2010 гг. и данные об охвате населения вакцинацией (форма 6.) в период с 2006 по 2010 гг. (рис. 5 а,б,в).

Рисунок 5 а,б,в

Многолетняя динамика заболеваемости краснухой на территории РФ (а), г.Москвы (б) и Люберецкого района МО (в)

(а)

(б)

1Ш

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 200Э 2010 Годы

л 600 .

8

¡1

|| ж) 5 з

5 " юо

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Годы

Как видно из графиков, в последние годы заболеваемость краснухой значительно снизилась по сравнению с 2002 годом на всей территории РФ. В 2010 году показатель заболеваемости краснухой на территории РФ составил 0,39, что более чем в 70 раз было ниже, чем в 2002 году. При изучении возрастной структуры заболеваемости на территории РФ и г. Москвы и Люберецкого района МО, было выявлено, что, начиная с 2003 года, наметилось резкое снижение заболеваемости на всей территории РФ, что связано с началом вакцинации. С 2008 года абсолютная заболеваемость взрослых и детей практически выровнялась. Началось смещение заболеваемости в старшие возрастные группы, что может привести к угрозе инфицирования женщин детородного возраста. Такая же ситуация отмечается и на территории г. Москвы.

На территории Люберецкого района, несмотря на общее снижение заболеваемости, в 2007 году был отмечен подъем заболеваемости, в основном болели дети в возрасте 5 лет, посещающие детские дошкольные учреждения, что указывает на отсутствие достаточной иммунной прослойки в этой возрастной группе. Подъем заболеваемости среди детей в возрасте 5 лет связан с недостаточной эффективностью однократной вакцинации.

При изучении заболеваемости среди однократно и двукратно привитых были выявлены достоверные различия (р<0,05) между двумя этими группами. В 2007 году во время подъема заболеваемости на территории Люберецкого района МО среди однократно привитых показатель заболеваемости составил 2,6 (90 случаев заболевания), а среди двукратно привитых 0,6 (5 случаев заболевания). Высокий показатель заболеваемости среди однократно привитых связан с более низкой эффективностью однократной вакцинации, поэтому применение двудозовой вакцинации является наиболее эффективной мерой по сравнению с однократным введением вакцины.

При анализе уровня охвата профилактическими прививками против краснухи детского населения Люберецкого района МО и РФ было выявлено, что начиная с 2006 года охват профилактическими прививками против краснухи на территории РФ, оказался более 98%, и своевременность первой вакцинации составила более 98%. Был проанализирован уровень охвата второй дозой профилактической прививки против краснухи у детей в возрасте 14 лет на территории Люберецкого района МО и РФ. В результате проведенного анализа уровень охвата второй прививкой на территории РФ увеличился на 63,1%, а на территории Люберецкого района МО на 53%, при этом показатель привитости на территории РФ составил в 2010 году 93,83% . (таблица 6). Но, несмотря на это, уровень охвата второй дозой вакцины не достиг 95%, что в будущем может привести к возникновению вспышек заболевания.

Таблица 6.

Уровень охвата профилактическими прививками против краснухи подростков 14 лет в течение 2006 по 2010 гг. на территории РФ

Годы Однократно привитые, % Двукратно привитые, % Привитость, %

2006 78,2 14,42 70,67

2007 96,5 27,63 89,17

2008 98,5 44,34 91,73

2009 99,3 62,02 92,9!

2010 99,3 77,48 93,83

С целью анализа и прогнозирования заболеваемости краснухой на территории Российской Федерации, г. Москвы и Люберецкого района Московской области был проведен математический анализ с использованием метода R/S анализа с расчетом коэффициента Херста и модели Вольтера-Лотки (H.A. Контаров и др., 2010)

Для расчета коэффициента Херста был проведен анализ заболеваемости краснухой на территории Российской Федерации с 1978 по 2010 гг., а также была проанализирована заболеваемость в г. Москве и Люберецком районе МО за период с 2002 по 2010 гг.

HJäR/s) Ut/2) (1Х

где Н - коэффициент Херста, R-размах, S-стандартное отклонение, t-число лет.

В результате для всей территории РФ был получен коэффициент Херста равный 0,81, 0,84 - для г. Москвы, 0,83 - для Люберецкого района МО. Исходя из значений коэффициента Херста, можно сделать вывод об устойчивости снижении заболеваемости на территории России, г. Москвы и Люберецкого района МО.

С целью определения коэффициента затухания (?) колебательного процесса снижения заболеваемости краснухой была использована система дифференциальных уравнений:

где —и — - скорости изменения числа восприимчивых и инфицированных членов Л Л

популяции соответственно, Р -частота контактов, V -скорость поступления в популяцию восприимчивых, У -скорость убыли инфицированных (величина обратная инкубационному периоду).

Поскольку, значение коэффициента затухания равно 0,8, снижение заболеваемости имеет черты апериодического процесса Проведен качественный анализ системы дифференциальных уравнений модели Вольтера-Лотки, в результате был получен фазовый портрет типа устойчивого узла, что указывает на переход затухающего колебательного процесса снижения относительной заболеваемости краснухой к апериодическому (экспоненциальному).

Данная модель не учитывает процессы миграции инфицированных в исследуемую популяцию. Таким образом, проведенный нами ретроспективный анализ заболеваемости и привитости населения, серомониторинг популяционного иммунитета в различных возрастных когортах, методы математического моделирования показали, что тактика вакцинопрофилактики краснухи должна включать меры по снижению уровня серонегативных людей в группах риска и дополнительного охвата их прививками против этой серьёзной вирусной инфекции.

Выводы

1. Из носоглоточных смывов больных детей в культуре клеток ЯК-13 и методом ОТ-ПЦР выделены и охарактеризованы по специфической активности 10 изолятов вируса краснухи.

2. С помощью методов титрования вируса краснухи в культуре клеток, электронной микроскопии и ОТ-ПЦР показано, что наиболее оптимальной клеточной культурой для размножения вируса краснухи является линия клеток ЯК-13.

3. Проведено изучение возможных механизмов внутриклеточной сигнализации вируса краснухи после взаимодействия с Са2+-активируемые-С1_канапами клеток харовых водорослей. Показана активация внутриклеточной сигнализации клетки, в результате чего происходит увеличение времени инактивации каналов и отсутствует порообразование в мембранах клеток.

4. По результатам сравнительного анализа отечественных и зарубежных тест-систем, можно заключить, что наилучшими диагностическими показателями (чувствительность и специфичность) обладает отечественная тест-система «ЭКОлаб - ^ М и ^ О» для выявления противокраснушных антител.

5. В результате проведенного серологического исследования населения Люберецкого района МО были выявлены группы риска по заболеваемости краснухой. В группы риска вошли дети в возрасте до года и когорта людей молодого возраста (23-25 лет), где процент серонегативных составил 20,9%. В результате проведенных ОТ-ПЦР и серологических исследований было выявлено три случая синдрома врожденной краснухи у детей в возрасте до 1,5 лет.

6. Проведено ретроспективное эпидемиологическое исследование, осуществлён математический анализ Я/Б-анализ с расчетом коэффициента Херста заболеваемости на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района МО. В результате была выявлена трендовость в снижении заболеваемости краснухой.

7. С помощью качественного анализа модели «хищник-жертва» показано увеличение коэффициента затухания колебательного процесса с переходом к экспоненциальному характеру снижения заболеваемости краснухой на всей территории РФ.

8. На основании анализа статистических данных заболеваемости краснухой среди всего населения РФ, был выявлен недостаточный охват повторной вакцинацией, что может приводить к увеличению заболеваемости в когорте однократно привитых.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Бадаев Н.В., Юминова Н.В., Контаров H.A., Контарова Е.О., Зверев В.В. Диагностика синдрома врождённой краснухи в современной клинической практике. Ж. Инфектологии. 2009,Т.1, №2, стр.10.

2. Балаев Н.В., Юминова Н.В., Контаров H.A., Контарова Е.О., Зверев В.В. Диагностика синдрома врождённой краснухи в клинической практике Ж. Инфектологии, т.2, № 3, 2010, с. 49.

3. Юминова Н.В., Контарова Е.О., Контаров H.A., Артюшенко C.B., Балаев Н.В., Сидоренко Е.С., Россошанская Н.В., Зверев В.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паротита и краснухи: задачи, проблемы и реалии. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011, № 4 (59), с. 40-44.

4. Балаев Н.В., Контаров H.A., Контарова Е.О., Юминова Н.В., Зверев В.В. Оценка эффективности вакцинопрофилактики краснухи с помощью математического моделирования. Ж. Инфектологии, т. 3, № 3, 2011, с. 29-30.

5. Балаев Н.В., Юминова Н.В.. Контаров Н.В., Контарова Е.О.,Зверев В.В. Сравнительная характеристика отечественных ИФТС для выявления Ig M к вирусу краснухи с зарубежными аналогами., там же, с. 30.

6.. Гафаров Р.Р, Юминова Н.В., Балаев Н.В., Зверев В.В. Сравнительная оценка иммуноферментных тест-систем для количественного определения иммуноглобулинов G к вирусу краснухи. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012, №5(66), с. 41-43.

Подписано в печать 19.04.2013 г. Формат 60x90 1/16 Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 12843. Объем: 1,0 усл. пл.

Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балаев, Николай Владимирович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова" Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201356916

Балаев Николай Владимирович

Оценка эффективности вакцинопрофилактики краснухи на территории

РФ

03.02.02 -вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д. б. н. Н.В. Юминова к. б. н. H.A. Контаров

Москва- 2013 год

Оглавление

На правах рукописи...........................................................................................................1

Введение...............................................................................................................4

Глава 1.................................................................................................................10

Обзор литературы..............................................................................................10

1.1.1. Морфология вируса краснухи......................................................................10

1.1.2. Антигенные варианты вируса краснухи................................................14

1.1.3. Клиническая картина острой краснухи..................................................15

1.1.4. Синдром врожденной краснухи..................................................................18

1.1.5. Выбор оптимальной стратегии вакцинопрофилактики краснухи.............................................................................................................................22

1.2.1. Лабораторные методы подтверждения диагноза краснухи...........26

1.2.2. Серологические методы диагностики краснухи.................................30

1.2.4. Иммуноферментный анализ.........................................................................31

1.2.5. Сравнительный анализ зарубежных иммуноферментных

тест-систем для определения антител к вирусу краснухи.........................34

1.3.1. Метод локальной фиксации напряжения (пэтч-кламп)..................37

Глава 2.................................................................................................................49

Материалы и методы.........................................................................................49

2.1. Вирусы........................................................................................................................49

2.2. Ведение клеточных культур.............................................................................49

2.3. Выделение вируса из сывороток крови......................................................49

2.4. Титрование вируса краснухи...........................................................................50

2.5. Определение вируса краснухи в ОТ-ПЦР................................................50

2.6. Электронная микроскопия...............................................................................51

2.7. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции.........................51

2.8. Перфузия клетки и удаление тонопласта..................................................52

2.9. Фиксация напряжения на мембране............................................................53

2.10. Сыворотки крови................................................................................................54

2.11. Иммуноферментный анализ..........................................................................54

2.13. Статистическая обработка результатов...................................................55

Глава 3.................................................................................................................56

Результаты и обсуждения.................................................................................56

3.1.1. Выбор оптимальной клеточной культуры для размножения

вируса краснухи.............................................................................................................56

3.2.1. Изучение взаимодействия вируса краснухи с ионными

каналами............................................................................................................................61

3.3.1. Выбор оптимальной отечественной ИФТС для определения IgM и IgG к вирусу краснухи..................................................................................64

3.3.2.Выбор оптимальной отечественной иммуноферментной тест-системы для определения антител класса в к вирусу краснухи...........64

3.3.3.Выбор оптимальной отечественной иммуноферментной тест-системы для определения антител класса М к вирусу краснухи...........68

3.4.1. Оценка коллективного иммунитета к краснухе на территории г. Москвы и Московской области................................................70

3.4.2. Выявление детей с синдромом врожденной краснухи (СВК).......73

3.4.3. Проведение ретроспективного эпидемиологического мониторинга заболеваемости краснухой и охвата населения вакциной против краснухи на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района МО...........................................................................................75

3.4.4. Анализ охвата профилактическими прививками против

краснухи населения Люберецкого района МО и РФ....................................84

3.5.1. Математический анализ заболеваемости краснухой на

территории РФ................................................................................................................87

Список литературы............................................................................................94

Введение

Значимость краснухи в России обусловлена широким распространением инфекции, высокой контагиозностью, способностью инфицировать плод и формировать врожденные пороки развития, приводящие к инвалидизации. Краснуха во время беременности может привести к мертворождению, самопроизвольным выкидышам, а также возникновению синдрома врожденной краснухи плода, для которого характерно формирование пороков развития и инвалидизация в последующем. Все вышеперечисленное подтверждает целесообразность научных исследований и необходимость надзора за этой инфекцией.

Всемирная организации здравоохранения относит краснуху к инфекциям, которые могут быть ликвидированы с помощью активной иммунизации. Опыт реализации Глобальной программы иммунизации Всемирной организации здравоохранения доказал

эпидемиологическую и экономическую эффективность вакцинопрофилактики. Глобальная ликвидация натуральной оспы и успехи региональных программ ликвидации полиомиелита позволили поставить перед европейским здравоохранением цель элиминации краснухи.

Стратегическим планом Европейского бюро ВОЗ установлен срок элиминации кори, малярии и краснухи к 2015 году в Европейском регионе. В рамках национального плана по борьбе с краснухой на территории РФ с 2001 года проводится широкомаштабная вакцинация против краснухи, которая привела к значительному снижению заболеваемости, в связи с этим была

отмечена тенденция к увеличению доли взрослых среди заболевших. Ситуация осложняется за счет увеличения количества мигрантов, иммунизация которых представляет определенные трудности. Для достижения этого удельный вес восприимчивых к краснухе женщин детородного возраста не должен превышать 7 % (91). Снижение числа восприимчивых к краснухе возможно путем проведения вакцинопрофилактики (110-113). Важным аспектом

эпидемиологического надзора за краснухой является объективная оценка эффективности вакцинации, которая возможна только при проведении серомониторинга (91,93). Наиболее эффективным и простым способом проведения серологического надзора является проведение иммуноферментного анализа (ИФА). Поэтому очень важно иметь высокочувствительные и высокоспецифические отечественные тест-системы для определения антител класса Мийв период элиминации краснухи на территории РФ. Высокая медицинская и социальная значимость краснухи, сложность предупреждения заражения беременных женщин, наличие инаппарантных форм заболевания, при которых сохраняется риск инфицирования плода, отсутствие сведений о распространенности синдрома врожденной краснухи определили цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось совершенствование методов эпидемиологического, вирусологического и серологического надзора за краснухой на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района Московской области.

Задачи исследования

1. Получение изолятов диких циркулирующих штаммов вируса краснухи на территории г. Москвы и МО, их характеристика по специфической активности.

2. Изучение взаимодействия вакцинного штамма Орлов вируса

л I _

краснухи с Са -активируемыми-С1 каналами клеток харовых водорослей с целью определения физиологической активности и безопасности действия на ионные каналы и клеточную мембрану.

3. Проведение сравнительного анализа отечественных иммуноферментных тест-систем для определения и ^М антител к вирусу краснухи.

4. Изучение иммунного статуса с учетом возрастных и половых особенностей, выявление групп риска по заболеваемости краснухой на территории Российской Федерации.

5. Выявление детей с синдромом врождённой краснухи (СВК).

6. Проведение эпидемиологического надзора за краснухой на территории Российской Федерации, г. Москвы и контролируемых территорий Московской области.

7. Проведение математического анализа заболеваемости краснухой в Российской Федерации и на контролируемой территории Московской области.

Научная новизна

Получены 10 изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории МО и охарактеризованы по специфической активности.

Впервые оценён механизм молекулярной внутриклеточной сигнализации отечественного штамма вируса краснухи Орлов при взаимодействии с ионными каналами харовых водорослей.

Отобраны оптимальные отечественные тест-системы для определения антител классов М и О к вирусу краснухи с показателями чувствительности и специфичности более 95%.

В результате проведенного исследования были определены группы риска по заболеваемости краснухой, определена доля серонегативных людей на территории г. Москвы и Московской Области (МО). Были выявлены три ребенка с СВК.

Проведен ретроспективный анализ заболеваемости краснухой с 2001 по 2011 гг. на территории РФ, г. Москвы и Люберецкого района МО. Построена математическая модель заболеваемости краснухой с использованием метода Я/Б - анализа и модифицированной модели Вольтерра-Лотки, которые позволили установить устойчивый характер в снижении заболеваемости.

Практическая значимость

Получены охарактеризованы 10 изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории МО.

Предложен новый биологический объект - клетки харовых водорослей для изучения механизмов внутриклеточной сигнализации при взаимодействии вируса краснухи с клеткой.

Сравнительное исследование отечественных и зарубежных наборов реагентов для ИФА подтвердило высокий процент совпадений результатов по тестам специфичности и чувствительности

между ними и позволило предложить тест-системы ЭКОЛаб -^Ми ^ в производства РФ, как наиболее оптимальные, для проведения мониторинга за популяционным иммунитетом к краснухе на территории РФ.

В результате проведенных исследований с помощью математического анализа заболеваемости краснухой на территории РФ и отдельных регионов было показано зависимое от вакцинации снижение заболеваемости данной инфекцией, которая носит апериодический (экспоненциальный) характер.

Полученные результаты могут быть применены медицинскими организациями, занимающимися оказанием бесплатной медицинской помощи, при проведении профилактических и диагностических мероприятий.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008), на конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на третьей международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010), на всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний» (Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась 26 апреля 2012 г. на научной конференции отдела вирусологии ФГБУ «Научно-исследовательский

институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук. Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, из них в 2 журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы работы изложены на 107 страницах и состоят из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, глав собственных результатов исследований, выводов, списка литературы -115 источников (отечественных и зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 29 рисунками.

Глава 1 Обзор литературы

1.1.1. Морфология вируса краснухи.

Вирус краснухи относится к РНК-содержащим вирусам семейства Т^аушс1ае рода КиЬЫгиз. Вирионы представлены сферическими частицами диаметром около 60 нм (рис. 1).

Рисунок 1.

Вирус краснухи, штамм Орлов.

Молекулярная масса вириона составляет 3500 кДа. Плавучая плотность в градиенте сахарозы -1,19 г/см3(100), на поверхности вириона имеются пепломеры длиной 6-8 нм. Липопротеидная оболочка состоит из холестерина и фосфолипидов. Нуклеокапсид икосаэдрической формы диаметром около 30 нм, содержащий

вирусную РНК. В состав вириона входят три вирусспецифических полипептида: два обол очечных гликопротеина Е1 и Е2 и негликозилированный С-белок (82,84). В состав нуклеокапсида входят молекулы капсидного С-белка, связанные с геномной РНК.

Геном вириона представлен одной молекулой несегментированной РНК протяженностью 9960 нуклеотидов, молекулярная масса РНК 3200-3800 кДа. РНК вируса краснухи является матричной и обладает инфекционными свойствами, в цикле репликации служит для создания дочерних копий. На 3 -конце молекулы вирусной РНК находится ро1у(А)-последовательность, 5'-конец кепирован 7-метилгуазонином (18)

Геном вируса краснухи кодирует также два неструктурных белка-МБР 1 и №Р2 (15). Белок Е1 является гемагглютинином и содержит 481 аминокислотный остаток. В составе белка Е1 имеются три эпитопа, индуцирующих образование вируснейтрализующих и гемагглютинирующих антител (17,20). Белок Е2 содержит один эпитоп, индуцирующий образование вируснейтрализующих антител (12,19). Капсидный С-белок играет существенную роль в репликации вирусного генома (77).

Интеграция вируса в клетку происходит путем эндоцитоза . Так же описан и другой механизм интеграции с помощью особых пептидных сегментов, которые представляют собой ассиметрические амфипатические альфа-спирали, способные встраиваться в плазматические мембраны клеток в наклонном состоянии. По мнению I. Решю1 и соавторов (57) наклонные пептиды дестабилизируют плазматическую мембрану, что приводит к слиянию вируса и клетки.

Первым этапом репликации вируса является репликация вирусного генома, который представлен +нитью РНК. Геномная РНК содержит две открытые рамки считывания: 5 -проксимальная рамка считывания, которая кодирует неструктурные белки и 3'-проксимальная, кодирующая структурные белки. В клетках, зараженных вирусом краснухи, определяются два вида однонитчатых РНК: 49S, идентичная вирионной и 26 S, которая является промежуточной (38,78). 49-+-РНК связывается с рибосомами и транслируется с образованием неструктурных белков, она также может связываться с репликативным комплексом и транскрибироваться с образованием новых минус-цепей матрицы, и связываться с капсидными белками для упаковки в нуклеокапсид. Когда количество инициирующих комплексов ограничено, связующий участок для синтеза 26S-PHK может конкурировать с участком для инициации 49S-PHK и ограничивать к нему доступ. Продукт трансляции 49S- РНК полипептид-предшественник неструктурных белков р200, он подвергается процессингу при помощи папаиноподобной протеазы, с расщеплением на pi50 и р90 (56,35). Нерасщепленный р200 необходим для синтеза минус нити РНК, а продукты его расщепления р150 и р90 обеспечивают синтез плюс нити РНК.

Гены, кодирующие основные структурные белки, расположены на субгеномной 26S-PHK в направлении 5 -3 в следующем порядке: ген капсидного белка, ген белка Е2, ген белка El(82). При трансляции 26S-PHK образуется полипептид-предшественник структурных белков р110, который процессируется с образованием капсидного белка С и полипептида-предшественника белков El и Е2. В опытах in vitro

показано, что расщепление полипептида-предшественника Е2-Е1 требует сигнального пептида Е2, микросомальных мембран и последовательностей, расположенных за проксимальной половиной сигнальной последовательности Е1 (40).

Сборка вирусных нуклеокапсидов происходит в цитоплазме и связана внутриклеточными мембранами и аппаратом Гольджи (82). В сборке вирусных частиц принимают участие и поверхностные белки вируса краснухи, по мере их созревания происходит их продвижение по цитоплазме клетки от мембраны эндоплазматического ретикулума через аппарат Гольджи к плазматической мембране клетки-хозяина. Кроме того, как стало известно, в составе белков Е1 и Е2 имеются эндоплазматические трансмембранные домены, содержащие внутриклеточные сдерживающие сигналы (12). При делеции или замене указанных доменов белка Е1 прекращается секретирование вирионов вируса краснухи, а в случае аналогичной ситуации в отношении трансмембранного домена белка Е2 не происходит прикрепление структурных белков к аппарату Гольджи, что также исключает формирование зрелых вирионов (21). На конечном этапе почкования вируса происходит сборка структурных компонентов вириона. При этом гликопротеиды собираются на поверхности клетки, а нуклеокапсиды находят их и связываются с ними. В процессе почкования часть цитоплазматической мембраны становится липидсодержащей оболочкой вириона (60,43).

Выход инфекционных вирусных частиц с апикальной поверхности инфицированных клеток может с