ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ

Лаврентьева, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ"

На правах рукописи

ЛАВРЕНТЬЕВА Ирина Николаевна

ШТАММ «ОРЛОВ -Д» ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2009 г

1 8 <ШН 2999

003473468

На правах рукописи

ЛАВРЕНТЬЕВА Ирина Николаевна

ШТАММ «ОРЛОВ-Д» ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2009 г

Работа выполнена в ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспойдент РАМН

Жебрун Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, академик РАМН

Зверев Виталий Васильевич Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Пашкевич Василий Андреевич ■ Доктор медицинских наук, профессор Подчерняева Раиса Яковлевна

Ведущее учреждение:

ФГУН «Московский научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии им. Г,Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « » июня 2009 года в Ю часов на заседании, диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им; М. П. Чумакова РАМН (142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ на 2005 -2010 г.г. определяет борьбу с врожденной краснухой (ВК) в числе приоритетов и предусматривает элиминацию эндемичной краснухи и снижение заболеваемости ВК в странах региона до уровня менее 1 случая на 100 тыс. живых новорожденных (целевая программа «Здоровье для всех в XXI веке»), В странах, где достигнут высокий охват населения профилактическими прививками против краснухи, эта задача успешно решается [Best, Banatlava, 2006].

В Российской Федерации иммунизация против краснухи детей первого -второго года жизни введена в календарь профилактических прививок приказом МЗ РФ от 27.12.97 г. № 375. В связи с отсутствием отечественной вакцины, прививки проводятся зарубежными препаратами, зарегистрированными в установленном порядке [Бектемиров, 2004]. Их действующим началом является вакцинный штамм Wistar RA27/3 (автор - S. A. Plotkin).

В настоящее время, согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 30.10.2007 г. № 673, плановой иммунизации подлежат дети в возрасте 12 месяцев, 6 лет и девочки 13 лет; дополнительной - в рамках реализации Национального проекта в области здравоохранения -все дети от 1 до 17 лет не болевшие, не привитые или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18-25 лет, не болевшие и не привитые ранее. С 1999 г., когда был зарегистрирован максимальный уровень заболеваемости краснухой (399,0 на 100 000 населения), этот показатель снизился более чем в 10 раз (21,7 на 100 000 населения в 2007 г.), что, в целом, свидетельствует об эффективности вакцинопрофилактики инфекции.

В то же время, специфическая профилактика краснухи в России связана с рядом проблем и вопросов, которые требуют изучения.

В Государственном докладе «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (2007 г.) Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г. Огапценко констатируется, что регламентированный ВОЗ 95 % уровень охвата ревакцинирующими прививками в стране не достигнут. Среди заболевших краснухой наметилась тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста. Как отмечает Г.Г. Оншценко,

отсутствие отечественной вакцины сдерживает охват прививками всех подлежащих вакцинации контингентов.

Изолированный на территории Российской Федерации вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов» (автор - В.Н. Мешалова) был получен в г. Ленинграде под руководством академика A.A. Смородинцева в 70-ые годы XX века и депонирован в ГКМВ в 1979 г. Клинические испытания экспериментальных серий вакцины, созданной на его основе, показали высокую иммуногенную активность (100 % сероконверсий в группе серонегативных привитых, СГТ AT - 8,1 lgi), низкую реактогенность препарата (1 % клинических реакций средней тяжести) [Мешалова и др., 1979]. В 1995 г., в рамках реализации Федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика» (руководитель программы - A.A. Ясинский), вакцинный штамм «Орлов» был восстановлен нами до исходных показателей биологической активности, сертифицирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича как вакцинный и получил наименование «Орлов-B» [Лаврентьева и др., 2003 г].

В большинстве стран, где осуществляется специфическая профилактика краснухи, преобладает циркуляция вирусов первой генетической линии, к которой принадлежит и вакцинный штамм Wistar RA27/3. Россия определена экспертами ВОЗ, как единственная территория с эндемичным распространением вирусов генотипа 2с [WHO, Wkly epidemiol. report, 2005]. Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира [Десятскова, 1974., Зверев и др. 2002], филогенетические изменения вируса под прессом коллективного иммунитета представляются возможным событием и создают потенциальную угрозу возникновения его дрейфовых вариантов со значимыми мутационными изменениями генома, как это отмечено, в частности, в отношении вакцинных полиовирусов в ходе реализации программы ликвидации полиомиелита живой оральной вакциной [Облапенко, 2003, Ошпценко и др., 2008].

Однако в отечественной научной литературе до последнего времени не было работ, посвященных изучению адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции; а таюке - определению генетической принадлежности штамма «Орлов-B». Не было работ по определению генетической близости между современными штаммами и изолятами вируса краснухи, циркулирующими на территории РФ, и вакцинными штаммами, полученными более 30 лет тому назад. Не проводилась сравнительная генетическая характеристика отечественного и зарубежного вакцинных штаммов вируса краснухи. Решение этих вопросов представляет не

только научный интерес, по и имеет непосредственное отношение к эффективности и безопасности специфической профилактики краснухи па территории Российской Федерации.

Штамм «Орлоп-В» получен на первичной культуре клеток П11К. Использование в качестве тканевого субстрата в производстве вакцины первично-трипсинизированных клеточных культур усложняет технологию получения вакцины, затрудняет стандартизацию качественных характеристик конечного продукта, повышает себестоимость препарата. Более экономичным, технологичным, стабильным по биологическим свойствам клеточным субстратом для производства МИБП являются полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток человека, рекомендованные экспертами ВОЗ для производства, в частности, вакцины против краснухи [Серия технических докладов ВОЗ, №28,1989].

При проведении в России массовой иммунизации детского населения и селективной вакцинации взрослых, существенное значение приобретает экономическая составляющая кампании. Использование для профилактики краснухи отечественного препарата, полученного па диплоидной линии клеток человека, позволило бы; ориентировочно, спизигь затраты только на дополнительную иммунизацию населения в рамках реализации национального проекта «Здоровье» в 1,7 раза и сэкономить около 187 млн. рублей. При проведении плановой иммунизации экономия составила бы около 64 млн руб. ежегодно (в ценах 2008 г.). Экономическое преимущество такого препарата определяет актуальность разработки, так как его внедрение будет способствовать повышению охвата прививками всех декретированных контингентов и совершенствованию профилактики СКВ.

Вместе с тем, адаптация вируса к иной системе клеток-продуцентов может сопровождаться мутациями вирусного генома с изменением молекулярно-генетических свойств полученного варианта. Для оценки пригодности более технологичного варианта вакцинного вируса необходимо определить его генетическую стабильность in vitro, а также, в опытах in vivo -сохранность основных биологических свойств, характеризующих штаммы для живых вакцин: специфическую и иммунологическую безопасность; специфическую активность.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности настоящего исследования и служит основанием для получения варианта эндемичного для России вакцинного штамма вируса краснухи, адаптированного к более технологичному тканевому субстрату, и его всестороннего изучения.

Цель работы:

Создание на основе вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» кандидат в вакцинный штамм и определение возможности его использования для профилактики краснухи на территории России.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный генетический анализ вакцинных штаммов вируса краснухи и современных штаммов и изолятов вируса.

2. Определить возможные филогенетические изменения вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции.

3. Оценить чувствительность ряда диплоидных линий клеток к вирусу краснухи и получить вариант исходного вируса краснухи, адаптированный к диплоидной культуре клеток «М-22» (штамм «Орлов-Д»).

4. Провести сравнительный генетический анализ штаммов \Vistar 11А27/3 и «Орлов-Д».

5. Оценить возможность использования диплоидной культуры клеток «М-22» в качестве тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи.

6. Изучить генетические изменения вируса краснухи в процессе атгенуации в культуре клеток ППК и при его адаптации к диплоидной линии клеток «М-22». ;

7. Исследовать в опыте на обезьянах макака-резус специфическую безопасность штамма «Орлов-Д», включая контагиозность.

8. Определить в испытаниях на обезьянах макака-резус специфическую и протективную активность штамма «Орлов-Д».

9. Изучить влияние иммунизации препаратом из штамма «Орлов-Д» на показатели врожденного иммунитета обезьян.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования:

Впервые получены новые знания:

- о генетической принадлежности вакцинного штамма «Орлов-В», о генетических маркерах, характеризующих ослабленные варианты вируса краснухи;

- о более тесном генетическом родстве штамма «Орлов-В» и российских изолятов вируса краснухи, чем это присуще штамму \Мэ1аг 11А27/3;

- об адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции;

В холе исследования получен новый вариант вакцинного штамма «Орлов», адаптированный к более технологичному тканевому субстрату - штамм «Орлов-Д». Впервые проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов «Орлов-Д» и 11А27/3 и установлены различия между штаммами в высоко консервативной области белка Е1, отвечающей за поливалентную иммуногенную активность вируса.

Впервые разработаны технологические подходы к получению живой ат-тенуированной краснушной вакцины на основе штамма «Орлов-Д» и диплоидной культуры клеток кожно-мышечных фибробластов человека «М-22».

Впервые в эксперименте получены сведения о специфической безопасности штамма вируса краснухи «Орлов-Д», включая отсутствие контагиозных свойств, а также данные о высоких показателях его иммуногенной активности и протективности, не уступающие по этим критериям препарату сравнения -штамму \Vistar 11Л27/3; доказана иммунологическая безопасность штамма. Эти результаты являются научным обоснованием перспективности использования штамма «Орлов-Д» для профилактики краснухи в России.

Практическая значимость:

Получение нового аттенуированного штамма для живой вакцины против краснухи и разработка способа получения вакцины на технологичном тканевом субстрате создает реальные предпосылки для получения вакцины против краснухи на основе эндемичного для России штамма вируса, что будет способствовать совершенствованию профилактики краснухи и СВК на территории Российской Федерации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм \Vistar ЛА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.

2. Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттеиуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасовича

для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины.

3. Агтенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е]. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре кл'сток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность.

4. Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака -резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.

Внедрение результатов исследования в практику:

1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В». Депонирован в ГКМВ (№ 2326 от 04.04.1995 г.); свидетельство об аттестации штамма в ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 01 -33/8 от 29.03.95 г.

2. Штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Депонирован в ГКМВ (№ 2347 от

29.12.1998 г.).

3. Штамм вируса краснухи «Лебедев». Депонирован в ГКМВ (№ 2365 от 17.12.2004 г.).

4. Изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края. Депонированы в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (№№ ЕШ0064- ЕШ0075 от 21.04.07 г.).

5. Патент на изобретение РФ № 2081912 «Вакцинный штамм вируса краснухи Орлов-В». Приоритет от 22.05.1995 г.

6. Патент на изобретение РФ №2173344 «Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи». Приоритет от

28.06.1999 г.

7. Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной краснушной вакцины. Рассмотрена и одобрена Ученым Советом ФГУ «Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» (протокол № 10 от 14.11.2001г.) и утверждена директором Института 14.11.2001 г.

Апробация работы и публикации:

Основные результаты исследовательской работы доложены и обсуждены на 18 научных форумах и конференциях: на юбилейной конференции НИИЭМ им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 1995 г.) ; на Международной конференции «XXXI Dani preventive medicine» (Nis, 1997 г.), на Международной конференции «Modern Vaccinology»» (г. Уфа, 1996 г.); на II Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г.Санкт-Петербург, 1998 г.); на Международной конференции «XXXII Dani preventive medicine» (Nis, 1998 г.), на научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.); на Международной научной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.); на научно-практической конференции «Вакцинопрофилакгика в XXI веке (Пермь, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г. Пермь, 2003 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Адлер,

2006 г.); на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Адлер,

2007 г.); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2007 г.); на Международном конгрессе «48й Annual Meeting of the Eurohean Society for Pediatric Research» (г. Прага, 2007 г.), на Международном Российско-Норвежском семинаре «Совершенствование системы эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики врожденной краснухи» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.); на 3 заседаниях Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Санкт- Петербург, 2003, 2005, 2007 г.г.); на заседапии Ученого Совета ГУ ЙПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (Московская область, 2007 г.).

Диссертационная работа была апробирована на заседании проблемной комиссии по вирусологии (25.09.08 г.) и заседании Ученого Совета (02.10.08 г.) ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.

Научные положения, изложенные в диссертации, опубликованы в 31 печатной работе в период с 1995 по 2008 г.г., включая монографию «Краснуха»

(Пермь - Санкт-Петербург - Москва, 2002), аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо- Западном федеральном округе России. Закономерности и особенности эпидемического процесса в

современный период» (СПб., 2007) и 8 работ в журналах, которые рекомендованы ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. По материалам исследования получено два патента РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 328 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 297 работ, из них 113 отечественных и 184 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование выполнено в ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора с 1995 по 2007 гг. в комплексе с ООО диагностический центр научно-производственная фирма (НПФ) «Хеликс» (г. Санкт-Петербург), ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» (г. Пермь); ГУ НИМП РАМН (г. Адлер-Сочи).

В работе использованы следующие группы вирусов:

1. Варианты вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов», полученные в ходе его аттенуации в культуре клеток ППК. Использованы 14, 17, 23 пассажи вируса в указанной культуре клеток. Штаммы получены из коллекции музейных вирусов лаборатории детских вирусных инфекций ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.

2. Вакцинные штаммы вируса краснухи:

- \Vistar Г1А27/3 (в составе вакцины КиШуах);

«Орлов» (36 пассажей в культуре клеток ППК; получен из ГКМВ, г. Москва);

«Орлов-В» - получен нами проведением трех дополнительных пассажей штамма «Орлов» в культуре клеток ППК. Всего штамм «Орлов-В» прошел 39 пассажей в указанной культуре клеток.

3. Штамм вируса краснухи «Лебедев», выделенный нами в 2001 г. от ребенка с СВК на перевиваемой культуре клеток ВНК-21; в работе использован 3-4 пассаж вируса в указанной культуре клеток.

4. В ходе работы получен аттенуированный штамм вируса краснухи «Орлов-

Д».

5. Вакцинные штаммы вируса кори J1-16, вируса эпидемического паротита Л-3.

6. Вирусы ВВС, ВБН,ВЭМ.

Образцы крови, полученные на территории Пермского края в период 1999 - 2005 гг., от 13 пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом «краснуха».

Первичные (ППК), диплоидные (ДКЛЧ, ДКПЧ, «М-22»), перевиваемые (RK-13, ВНК-21, Vero, L-41, СПЭВ) культуры клеток.

Лабораторные животные: 130 беспородных взрослых и новорожденных мышей, 44 морские свинки, 75 взрослых и 1-3 дневных кроликов породы «Шиншилла», 35 обезьян макака-резус.

Для проведения исследования применялись вирусологические, молекулярно-биологические, иммунологические, морфологические, гистологические методы исследования.

Определение биологической (инфекционной) активности вирусов проводили титрованием на культуре клеток, используя десятикратные разведения образцов ВСЖ. Учет результатов производили по прямому ЦПД вируса на клетки или в реакции интерференции с рабочей дозой ВВС. Конечную концентрацию вирусов определяли по методу Рида и Менча.

Молекулярно-генетические исследования проводили на базе диагностического центра ООО НПФ «Хеликс». Для выделения РНК из сыворотки крови больных или из лиофилизированного штамма вируса краснухи использовали набор реагентов «Рибо-сорб», производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва) в соответствии с инструкцией по применению.

Для проведения реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) использовали набор реагентов «Revert Aid™ First Stand cDNA Síntesis Kit» (Fermentas); реакцию проводили по стандартной схеме. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР. Для проведения ПЦР были подобраны 3 группы праймеров: 1. Для сравнительного генотипирования штаммов «Орлов-В», «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 была использована пара праймеров, полностью фланкирующих ген El и дающих амппификат размером 1443 п. о. (с 8292 по

9653 н): Forward: 5'- CAC TCA AGC ACC TGT CCC C- 3'; Reverse: 5' - GCA CAG CAA GCG AGT AAG C- 3'. 2. Для генотипировашя штаммов и изолятов вируса краснухи был использован участок гена El размером 739 п.о. (с 8731 по 9469 н ), полученный в результате амплификации с другой пары праймеров: Forward: 5'- ТСТ GGG CTG TCA ACG ССТ ACT ССТ - 3'; Reverse: 5' - АТС CAC TCG GGT ATT TCG - 3'. 3. Для сравнительного генотипирования пассажных вариантов штамма «Орлов» - 14 пар праймеров, амплификаты которых суммарно перекрывают весь геном Rubella (9755 п.о.) (таблица 1).

Таблица 1

Последовательности праймеров, использованных для секвенирования генома

вируса краснухи

№ Последовательность Т * (°С) Размер продукта (НК)

1 2 3 4

1 CGGACCTCGCTTAGGACTC 58 778

2 CCGGCAGGACTTGGTAGAT

3 CACGCATCTACCAAGTCCTGC 61 678

4 GCACGGTGTCCAAGTGGC

5 ACCTGGATCGTCCACGCAG 65 641

6 GGCAGGTCACGCACCGAGA

7 CTCGGTGCGTGACCTGCC 63 769

8 CGCAGCAGACCAGCCGTAG

9 GCTGGTCTGCTGCGGAGTC 62 701

10 GCACCCGGCACTCGTGTAG

11 TACACGAGTGCCGGGTGC 63 719

12 GCGAGCGGTTTCGTCAGC

13 ATCAAGAACGCCGCCACC 64 716

14 TCTTGGGCCTCGGGGATG

15 CCGCACTCTGGAGGAGCT 58 704

16 TGGCGTTGGTGGTGTAATG

17 GGTGGCAGGCCCATTACA 60 762

18 TTAGTCGGCGTCGTGGAGA

19 CACGACGCCGACTAACGC 61 669

20 GCCCAGGTTGGTGAAATGC

21 TCACCAACCTGGGCACCC 66 723

22 CGGCGGTCGTGGAGTTCG

23 GCCGGCCTCAATGACAGC 62 649

24 CGCACGAGACATCAGTGGG

25 AGATCCCCACTGATGTCTCG 59 766

26 ATCCACTCGGGCATTTCG

27 AGTGCGGACTCCACATACG 57 718

28 GGGCAAGAACCTCATCTAGG

* Т0 - температура отжига

Последовательности праймеров группы 1, 2 и 3 были использовали для секвенирования соответствующих амплификатов.

ПЦР проводили по стандартной методике, адаптированной к соответствующей паре праймеров. Программа проведения ПЦР: 95° С - 3 мин + {94 0 С - 30 сек; 60 ° С - 30 сек; 72 0 С - 45 сек } х 35 циклов + 72 0 С - 5 мин. Амплификацию проводили на приборе «Терцик» (ДНК-Технология). Секвенирование в 4,25% полиакриламидном геле - на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 («Applied Biosystems», США) с использованием реагентов «BigDye™ Terminator Kit v.2.0» (Appliied Biosystems) Полученные хромотограмлш анализировали с помощью программы Chromas 2.3 «Technelysium Pty Ltd» (Австралия). Для построения филогенетического древа вируса краснухи использовали компьютерную программу MrBayes З.1., в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005). Для определения степени эволю1(ионпой близости штаммов и изолятов вируса краснухи использовали показатель генетической дивергенции, который складывался из доли нуклеотидных замен между образцами (%) и индекс генетической близости, который рассчитывали, используя эволюционную модель случайных нуклеотидных замен [Kimura, 1980J. Межгрупповые генетические различия определяли, используя внутригрупповые консенсусные последовательности. Для анализа мутационных изменений генома штамма «Орлов» в процессе аттенуации в качестве референс-препарата использована референс-последовательность NC 001545 [Dominguez et al, 1990]. Для оценки генетических различий между вакцинными штаммами вируса краснухи Wistar RA27/3 и «Орлов-Д» использовали компьютерную программу «Vector NTI 10.0» (Invirtogen USA).

Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» проводили на базе ГУН НИИМП РАМН (г. Адоер-Сочи).

Контроль специфической безопасности штаммов вируса краснухи проводили определением остаточной нейровирулентности при ишрацеребральном заражении серонегативных к краснухе обезьян макака-резус. Перед началом эксперимента животных погружали в глубокий наркоз, который достигался внутримышечным введением 10% раствора гексенала из расчета 1,0 мл на 1,0 кг массы животного. Вируссодержащий материал вводили в зрительный бугор каждого полушария головного мозга в дозе, 10000 ТЦД5о/0,5 мл. Клиническое наблюдение за обезьянами проводили 30 суток, в течение которых отмечали наличие или отсутствие клинических симптомов поражения центральной нервной системы. По истечении периода клинического

наблюдения у животных брали пробы крови для определения в сыворотке вирусспецифических AT, после чего умерщвляли под глубоким гексеналовым наркозом, проводили аутопсию, морфологическое и гистологическое исследование тканей ЦНС и других внутренних органов обезьян.

Специфическую активность штаммов вируса краснухи определяли по критериям:

1. Иммуногенная активность — формирование вирусспецифических AT через 28 суток после однократного внутримышечного введения серонегативным к краснухе обезьянам препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 прививочной дозе для человека - не менее 1000 ТЦД5о/0,5 мл. Определение титров AT проводили в РТГА, используя «Диагностикум краснушный антигенный сухой для РТГА» производства ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией по применению препарата.

2. Протективная активность - устойчивость иммунизированных животных к трехкратному интраназальному заражению патогенным штаммом вируса краснухи «Лебедев» в дозе 10000 ТЦД50/0,5 мл. Группу контроля при этом составляли не иммунизированные, серонегативные к краснухе обезьяны, зараженные по той же схеме. Развитие вирусемии регистрировали в ПЦР, исследуя сыворотки крови животных на разных сроках после заражения. Для выделения вирусной РНК использовали набор реагентов «АмплиСенс Rubella-302» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Контагиозность штаммов вируса краснухи оценивали после 28 суток тесного контакта (нахождение в одной клетке) иммунизированных и не иммунных макаков, определяя у последних наличие вирусспецифических AT.

Интерфероновый статус и параметры клеточного иммунитета обезьян определяли, исследуя гепаринизированную кровь, взятую из локтевой вены животных; а- и у- ИФН получали in vitro, используя различные индукторы (ВБН, Con-А). Титрование полученных цитокинов проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, маркированных «для работы с культурой клеток» с 24-часовой культурой монослоя клеток-мишеней СПЭВ против 100 цитопатических доз индикаторного вируса (ВЭМ). Параметры клеточного иммунитета определяли в тесте розеткообразования эритроцитов барана, меченых моноклональными антителами против различных субпопуляций лимфоцитов, а также против маркеров молекул HLA-DR. Использовали диагностический набор «Диагностикумы стабильные на основе

моноклональных антител» Витебского государственного медицинского института в соответствии с инструкцией. Все манипуляции с обезьянами проводили после в/м введения раствора калипсола из расчета 0,1 мл на 1 кг массы тела животного.

Статистическая обработка материала проведена методами параметрической и непараметрической статистики [Зайцев, 2003] с использованием t-критерия Стьюдента для определения значимости различий между явлениями. Разность результатов считали статистически достоверной при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании проведенных исследований сформулированы и представлены к защите четыре основные положения:

ПЕРВОЕ ПОЛОЖЕНИЕ Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RA27/3. Ващинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.

На первом этапе работы представлялось важным определить генетическую принадлежность современных изолятов вируса краснухи, выделенных на территории России; их генетическую близость к вакцинным штаммам Wistar RA27/3 и «Орлов-В», полученным в 70-ые годы XX века.

Для этого, на оспове нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е1 размером в 739 и.о. (с 8731 по 9653 и.), в соответствии с рекомендациями ВОЗ по генотипированию «диких» штаммов вируса краснухи [WHO, Wkly epiod. Report, 2005] был проведен филогенетический анализ 13 изолятов вируса краснухи, идентифицированных на территории Пермского края в период с 1999 по 2005 гг. SLM17Perm-1999, SLM1 lPerm-2000, SLM13Perm-2000, SLM14Perra-2000, SLM16Perm-2000, SLM12Perm-2003, SLM3Perm-2003, SLM7Perm-2002, SLM8Perm-2002, SLM5Perm-2004, SLM9Perm-2004, SLM6Perm-2005, SLM15Perm-2005, а также упомянутых выше вакцинных штаммов вируса краснухи. В анализе использовали также имеющиеся в коллекции GenBank последовательности 4 штаммов вируса краснухи, циркулировавших в России в 1967- 1997 гг.. По результатам исследования все изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края, а также вакцинный штамм «Орлов-

В» и 4 российские штамма, выделенные в период 1967 - 1997 гг., отнесены к генотипу 2с (рис. 1).

Штамм Wistar RA27/3 отнесен к генетической линии 1. В ходе генетического анализа этого штамма было получено совпадение его положения в филогенетическом древе с установленным номером в GenBank, что подтверждает достоверность полученных результатов. Индекс генетической близости между современными изолятами вируса краснухи и вакцинными штаммами «Орлов-B» и Wistar RA27/3 составил 0,74 и 0,99 соответственно. Эти показатели свидетельствуют о более тесном генетическом родстве , современных изолятов вируса, выделенных на территории Западного Урала, российских изолятов более раннего периода выделения с вакцинным штаммов «Орлов-B», чем со штаммом Wistar RA 27/3.

Полученные результаты коррелируют с данными ВОЗ, которая определяет РФ как территорию с эндемичной циркуляцией вирусов краснухи генотипа 2с [WHO, Wkly Epidemiol. Ree., 2005]. Своего рода уникальность вирусов краснухи генотипа 2с, связанная с их эндемичным распространением в России, может являться обоснованием, наряду с экономическим преимуществом, целесообразности использования в РФ вакцинного штамма, выделенного на данной территории.

Группой ученых [Frey et al., 1998, Zheng et al. 2003] было высказано предположение о том, что возрастающая изменчивость штаммов вируса краснухи является следствием введения в практику широкомасштабной вакцинации в разных странах мира. Очевидно, что надзор за краснушной инфекцией должен предусматривать наблюдение за эволюцией вируса в период вакцинопрофилактики. С этой целью были исследованы изоляты вируса краснухи,- выделенные на территории Пермского края, где, вакцинопрофилактика краснухи проводится с 1995 г. За десятилетний период в крае были использованы две стратегии: селективной вакцинации девушек и женщин репродуктивного возраста; массовой вакцинации детей 1-2 года жизни.

В ходе исследования была выявлена низкая популяционная изменчивость современных изолятов по отношению к референс-штаммам вируса краснухи, которая варьировала в интервале 0 - 1 %. Также несущественными оказались генетические различия между изолятами вируса краснухи, полученными в период селективной иммунизации на фоне эпидемического подъема заболеваемости (1999 - 2000 гг. и 2003 г.) и в межэпидемический период 2003 г. - показатель генетической дивергенции не превышал 0,6 - 2% (р > 0,05).

Рис. 1. Генетическая характеристика изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории Пермского края в 1999-2005 гг. Изоляты: 5-8ЬМ5Регт-2004, 6-8ЬМ6Регт-2005, 7-5ЬМ7Регт-2002, 8-8ЬМ8Регт-2002, 9-БЬМ9Регт-2004, П-БЬМ! ]Регт-2000, 12-8ЬМ12Регга-2003, 13-8ЬМ13Регш-2000, 14-8ЬМ14Регт-2000, 15-8ЬМ15Регт-2005, 16-ЬМ16Регш-2000, 17-8ЬМ17Регт-1999. Референсные штаммы генного банка -АУ 247015, АУ 247016, АУ 247017, АУ 247019 (Россия, 1967-1997 гг.). Вакцинные штаммы вируса краснухи: «Орлов-В»; М^аг ИА27/3 в составе вакцины Е-шНуах.

Напротив, массовая туровая иммунизация детей 1—2 года жизни в течение 4-х лет применения, при пороге привитости, равном 460,0 на 1000 детского населения (рассчитан на все население г. Перми в возрасте от 1 до 17 лет) привела к достоверному увеличению показателя генетической дивергенции с 1,15% в 2000 - 2002 гг. до 3,14 % в 2004 - 2005 гг. (г = 0,76; t = 4,58 р<0,01 значимость F = 0,08, вероятность 92,0% р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о воздействии вакцинопрофилактики краснухи на свойства взаимодействующих популяций макро- и микроорганизмов, и ее влиянии на биологический фактор эпидемического процесса; и, тем самым, корреспондируются с предположением Т. Frey и др. о влиянии специфической профилактики на генетическую дивергенцию вируса краснухи. Выявленные нуклеотидные замены в гене Е1 под влиянием вакцинации не были значимыми, ни в одном случае не вызвали изменения аминокислотного состава белка Е1, но дальнейшие исследования по воздействию вакцин, используемых при прививках, на молекулярно-генетические и фенотипические свойства вируса краснухи представляют несомненный научный и практический интерес.

В соответствии с задачами исследования, следующий этап работы был связан с получением варианта вакцинного гитамма «Орлов» - штамма «Орлов-Д».

Для получения штамма «Орлов-Д» первоначально была проведена работа но определению способности различных видов диплоидных линий клеток эмбриона человека поддерживать репродукцию вируса краснухи. В экспериментах были использованы: 4 линии клеток ДКЛЧ - 175/312, 275/6, 776/14, 780/25; 3 линии клеток ДКПЧ - 882/25, 1182/12, 1182/8. В числе других, была использована линия диплоидных клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека, «М-22», любезно предоставленная автором линии, профессором JI.JI. Мироновой (получена на уровне 19 пассажа). Максимальный уровень инфекционной активности вируса (4,9 -5,3 lg ТЦЦ50/мл), в 10 раз превышавший показатель его репродукции в клетках 111 Ж, регистрировали при использовании фибробластов легкого эмбриона человека (линии клеток ДКЛЧ); минимальный: 3,1-3,2 lg ТЦДзо/мл - в клетках фибробластов почки эмбриона человека (линии клеток ДКПЧ). Линия клеток «М-22» занимала промежуточное положение по чувствительности к вирусу краснухи. Тем не менее, средние показатели инфекционной активности вируса в клетках ППК и «М-22» практически совпадали и составили 3,9 lg ТЦЦ50/мл и 4,2 lg ТЦД50/мл, соответственно.

Неоспоримым преимуществом линии клеток «М-22» перед другими исследованными линиями является наличие банка посевных клеток «М-22», сертифицированного в ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Это обстоятельство определило дальнейший ход исследования, в котором в качестве тканевого субстрата для разработки способа получения вакцины против краснухи была использована линия диплоидных клеток человека «М-22».

В ходе получения нового варианта штамма «Орлов» адаптация вируса к иному тканевому субстрату не потребовалась: стабильный уровень репродукции, стабильный rct4o ±-фенотип регистрировали с первого по десятый пассаж вируса в клетках «М-22». Этот факт определил возможность получения нового штамма «Орлов-Д» проведением одного дополнительного пассажа вакцинного вируса в диплоидной линии клеток.

Далее был проведен сравнительный генетический анализ штаммов Wis tar RA27/3 и полученного аттенуированого штамма «Орлов-Д». Анализ проводили по полной протяженности гена El (1443 п.о.) и кодируемого им полипептида, так как именно гликопротеид El является наиболее иммунологически важным структурным белком вируса краснухи [Chayne et al., 1992]. В ходе исследования выявлено, что доля нуклеотидных замен в структуре гена El исследованных штаммов составляет 6,7%. Треть нуклеотидных замен (34,3%) явилась значимой, определила различия в аминокислотном составе белка £1 между штаммами. Наиболее важными представляются различия, установленные в высоко консервативной области белка El, а именно на участке от 208 до 239 аминокислотного остатка. В указанной области белка El штамма «Орлов-Д» определяется аминокислотная последовательность, практически идентичная таковой у многих «диких» и аттенуированных штаммов вируса краснухи: Therien, Judith, М-33, HPV77 [Chay et al., 1992, Domingues et al., 1999, Yao et al., 1999]. Тогда как, согласно данным литературы [Zheng et al., 1989] и полученным результатам, в указанном сайте белка El штамма Wistar RA27/3 регистрируется замена У(тирозин)—> H (гистидин). Значимость данного участка белка El для реализации иммуногенности вируса краснухи была показана в работе [Jerry et al., 1993] по получению пяти синтетических пептидов, полностью перекрывающих протяженность полипептида El, и моноклональных антител к ним. В отличие от четырех других, антитела к данному участку молекулы El (пептид SP15) нейтрализовали в ИФА как все другие пептиды, так и вирус краснухи в целом.

Выявленные различия исследованных штаммов «Орлов-Д» и \Vistar ]*А27/3 в высоко консервативном участке молекулы Е1, ответственном за поливалентность иммуногенной активности вируса, свидетельствуют о возможном преимуществе применения штамма "Орлов-Д" для профилактики краснухи в условиях популяционной изменчивости возбудителя краснухи. Полученные результаты послужили дополнительным основанием для разработки способа получения вакцины против краснухи на основе диплоидной линии «М-22»и штамма «Орлов-Д».

ВТОРОЕ ПОЛОЖЕНИЕ

Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных теток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины.

Выбор в качестве тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи диплоидной линии клеток человека обусловлен следующим: полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток в стадии активного роста обладают стабильным кариотипом, легко культивируются, формируются в банки посевных и производственных клеток, позволяют получить конечный продукт с стандартизованными характеристиками; рекомендованы экспертами ВОЗ для производства МИБП, вводимых людям и используются для получения вакцинных препаратов. Наиболее известная из них - диплоидная линия фибробластов кожи и мышц эмбриона человека, штамм \Vistar 38, - является субстратом для получения вакцины против краснухи, кори и ряда других вакцин.

Возможность использования диплоидной линии клеток «М-22» в производственных целях оценивали, согласно действующему нормативному документу, МУ «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (М., 1989 г.), регламентирующему порядок аттестации и использования диплоидных линий клеток.

Учитывая ограниченный срок жизни диплоидных клеточных линий и разные периоды жизнедеятельности (становления, активного роста, старения), чувствительность линии «М-22» к вирусу оценивали в диапазоне 20-41 пассаж культуры клеток, то есть в диапазоне культивирования производственной культуры. Заражение проводили в стационарных условиях при МИ=0,01 ТЦДзо/кл. Средние результаты шести экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Чувствительность клеток «М-22» к штамму «Орлов-Д» в зависимости от количества пассажей диплоидной линии

Количество пассажей культуры клеток «М-22» Инфекционная активность вируса (1йТЦД5(/0,5 мл) через ... суток после инфицирования

6 10 14

20 4,0 4,4 4,2

22 3,8 4,3 4,5

25 4,0 4,1 4,5

29 3,9 4,5 4,3

31 4,0 4,2 4,2

35 4,0 3,8 3,5

41 3,0 3,3 2,5

Эксперименты показали, что на протяжении минимум 15-ти последовательных пассажей (с 20-го по 35-ый) линия клеток «М-22» обеспечивает стабильный уровень репродукции штамма «Орлов-Д», что является важным критерием пригодности клеточной культуры для ее использования в производственных целях.

Принимая во внимание преимущество использования единого тканевого субстрата для получения ассоциированных препаратов, и, в частности, трехкомпонентной вакцины корь-паротит-краснуха, была определена чувствительность диплоидной линии клеток «М-22» к вакцинным штаммам вируса кори Л-16 и вируса эпидемического паротита (ЭП), Л-3. Средние показатели инфекционной активности, полученные в пяти наблюдениях, представлены в таблице 3. Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности диплоидной линии клеток «М-22» к репродукции обоих

вакцинных штаммов. Стабильный уровень репродукции как вируса кори, так и вируса ЭП сохранялся в диапазоне с 20 по 35 пассаж культуры клеток.

Таблица 3

Чувствительность клеток «М-22» к вакцинным штаммам вирусов кори и ЭП в зависимости от количества пассажей диплоидной линии

Количество пассажей Культуры клеток «М-22» Инфекционная активность ТЦД 5о/0,5 мл) вакцинных штаммов вирусов

кори, Л-16 ЭП,Л-3

20 4,0 4,0

22 5,5 4,2

25 5,5 4,5

29 6,0 5,0

31 6,0 5,0

35 5,5 4,7

41 3,5 3,2

Поскольку применение диплоидных линий клеток в производстве МИБП основано на использовании банков клеток-продуцентов, важным условием пригодности клеточного субстрата для производственных целей является устойчивость клеточных пулов к криоконсервации. Для оценки диплоидной линии клеток «М-22» по данному критерию, клетки 20, 23, 27 пассажа подвергались глубокому замораживанию при температуре - 70 0 С. Биологические свойства восстановленных после криоконсервации пулов клеток оценивали по индексу пролиферации и уровню инфекционной активности штамма «Орлов-Д» в клетках «М-22». Результаты экспериментов представлены в таблице 4 и свидетельствуют о сохранении биологических свойств линии клеток в заданных условиях.

Таблица 4

Устойчивость диплоидной линии клеток «М-22» к криоконсервации

Количество пассажей культуры клеток Индекс пролиферации Средняя инфекционная активность вируса (^ТЦД5о/0,5 мл)

20 3 4,0

23 3 4,1

27 3 4,1

Для определения параметров репродукции штамма «Орлов-Д» в указанном тканевом субстрате проводили сравнительное изучение динамики репродукции вируса краснухи в диплоидной культуре клеток «М-22» и первичной культуре клеток ПШС при использовании оптимальной МИ, равной 0,01 ТЦД5о/клетка. Средние показатели репродукции вируса краснухи в указанных культурах клеток, представлены на рисунке 2.

Й 0 3 сут 5 сут 7 сут 10 сут 13 сут 15 сут 18 сут 20

Рис.2 Репродукция шгамма "Орлов-Д" в культурах клеток ППК и М-22 (20 пассаж)

Инфицирование вирусом краснухи клеток ППК характеризовалась выраженным цитодеструкпяшым действием вируса на клетки, что завершалось круглоклеточной дегенерацией клеточного пласта через 15-18 суток после заражения и снижением количества инфекционных вирусных частиц до концентрации 3,0 ТЦД5о/0,5 мл. Репродукция штамма «Орлов-Д» в культуре клеток «М-22» не сопровождалась лизисом клеток и характеризовалась более интенсивной динамикой накопления инфекционных вирусных частиц. В период с 5-ых по 18-ые сутки после инфицирования клеток «М-22» каждые 2-3 суток удавалось получить полезные вирусные сборы с инфекционной активностью не менее 3,5 ^ ТЦД5о/0,5 мл. В целом,

ОВС, полученный при соединении в одну производственную емкость полезных вирусных сборов, при заражении культуры клеток «М-22» в два раза превышал соответствующий объем, полученный при использовании первичной/культуры ГГПК при равном количестве зараженных клеток ППК и «М-22». Характер репродукции вируса в клетках-продуцентах оказывал влияние на содержание белка в ВСЖ, полученной с первичных и диплоидных клеток: в ОВС, полученных при инфицировании первичной клеточной культуре ППК, его количество достигало 500 - 780 мкг/мл; при инфицировании диплоидных клеток «М-22» - от 100 до 230 мкг/мл.

В условиях промышленного производство вакцины сохранение биологической активности вакцинного и производственного штамма на протяжении длительного периода времени имеет важное значение. Для определения устойчивости вариантов вакцинного штамма «Орлов» к условиям длительного хранения проводили контроль инфекционной активности лиофилизированных препаратов из штаммов «Орлов-В» и «Орлов-Д». Препараты хранили при температуре минус 20 0 С в течение десяти (штамм «Орлов-Д») - тринадцати (штамм «Орлов-В») лет. Инфекционную активность обоих вариантов штамма «Орлов» определяли ежегодно титрованием 2 -3 ампул лиофилизированных препаратов в перевиваемой культуре клеток ЮС-13. За время наблюдения не отмечали существенных (более чем на 0,5 1§ ТЦД5О/0,5мл) колебаний инфекционной активности вирусов.

Таким образом, чувствительность клеток «М-22» к полученному варианту штамма «Орлов» аналогична чувствительности клеток ППК, к которой был адаптирован исходный вирус; указанная диплоидная линия клеток способна поддерживать стабильный уровень инфекционной активности штамма «Орлов-Д» на протяжении не менее пятнадцати пассажей линии в фазе активного роста; клетки устойчивы к криоконсервации. Характер репродукции штамма «Орлов-Д» в клетках «М-22» позволяет получить удвоенное количество полезных вирусных сборов с содержанием остаточного белка в конечном продукте в 4-5 раз меньшим, чем при использовании первичной культуры клеток. Полученный на диплоидной линии клеток «М-22» штамм «Орлов-Д» характеризуется стабильными показателями инфекционной активности на протяжении 10 лет хранении при температуре - 20 0 С (срок наблюдения). Клетки «М-22» поддерживают также репродукцию вирусов кори и эпидемического паротита. Наличие банка посевных клеток «М-22» и перечисленные выше факторы создают условия для многолетнего производства препарата.

В целом, полученные результаты характеризуют диплоидную линию клеток «М-22» как пригодную (по изученным параметрам) для использования в качестве тканевого субстрата в производстве моно- и ассоцированных вакцин для профилактики краснухи.

ТРЕТЬЕ ПОЛОЖЕНИЕ

Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена El. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность.

Учитывая, что процесс производства живой вакцины предусматривает многократное культивирование вакцинного вируса в тканевом субстрате (вакцинный штамм—> производственный штамм—> посевной вирус—* серия вакцины), контроль генетической стабильности атгенуированного вируса в процессе культивирования в системе клеток-продуцентов - необходимый этап оценки его пригодности для использования в качестве вакцинного штамма.

Известно, что даже единичные пассажи вируса в иной системе хозяйских

клеток могут привести к гиператгенуации или реверсии патогенных свойств вакцинного штамма [Бойчук и др. 1968, Жилова и др. 1969].

Для понимания значимости тех или иных изменений вирусного генома при адаптации вируса к иной системе клеток хозяина, необходимо иметь сведения о том, какие именно нуклеотидные и аминокислотные замены приводят к изменению уровня вирулентности вируса для человека. Наиболее адекватной моделью для такого рода исследований являются так называемые «промежуточные варианты» вакцинных штаммов с документированным уровнем реактогенности для людей, полученные в ходе атгенуации исходных вирусов.

При получении вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» клиническим испытаниям на волонтерах были подвергнуты шестнадцатый («Орлов»-16) и тридцать шестой пассаж вируса («Орлов»-36) в культуре клеток ППК. Первый из испытанных вариантов («Орлов»-16) вызывал 30% клинических реакций средней тяжести. Снижение реактогенных свойств штамма до допустимого нормативным документом уровня (2% клинических реакций средней тяжести) было достигнуто проведением дополнительных 20 пассажей вируса в той же системе клеток [Мешалова и др., 1979]. Для определения генетических маркеров атгенуации штамма «Орлов» были

использованы промежуточные варианты, полученные после проведения 14, 17, 23 пассажей выделенного от больного «дикого» вируса в первичной культуре клеток ППК и вакцинный штамм «Орлов-В» (39 пассажей вируса в ППК). Из таблицы 5 видно, что в процессе атгенуации вируса, между 15 и 17, а также 18 и 23 пассажем произошли незначимые замены нуклеотидного состава гена, кодирующего неструктурный белок NS1: С —► G. А также, между 18 и 23 пассажем, значимые замены в структуре гена El. Последнее событие привело к замене в структуре поверхностного белка El (пятьдесят седьмой аминокислотный остаток) V —> I (валин на изолейцин).

Таблица 5

Нуклеотидные и аминокислотные замены в структуры вириона вариантов вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов»

№ нуклеотида /ген **AA замены № пассажа штамма «Орлов» в культуре клеток ППК /нуклеотидные замены

14 17 23 39

728MatPetl - С С т Т

3854MatPetl - С т т т

8419 El V-I С с т Т

9186 El с с т Т

9342 El - с с_ G G

* порядковый номер нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена определялся по референс-последовательности N0 001545; ** аминокислотное замещение в белке Е1

Полученные результаты свидетельствуют о том, что замена в структуре белка Е1: валин —> изолейцин (57 АА -остаток) привела к полной атгенуации реакгогенного (30% клинических реакций средней тяжести) варианта вируса и получению ареакгогенного вакцинного штамма «Орлов». Значимые замены нуклеотидов в процессе атгенуации штамма «Орлов» были определены только в гене, кодирующем поверхностный гликопротеин Е1. Исходя из этого, сравнение двух вариантов штамма «Орлов» - вакцинного штамма «Орлов-В» и штамма «Орлов-Д» - было проведено по нуклеотидной последовательности гена Е1. В анализе использован штамм «Орлов-Д» после проведения пяти дополнительных пассажей в культуре клеток «М-22», т.к., согласно рекомендациям ВОЗ, культивирование вируса от вакцинного штамма до серии

вакцины не должно превышать пяти пассажей в клетках-продуцентах [WHO. Technical Report Series, 1988].

При секвенировании амшшфикатов, полученных в результате фланкирования нуклеотидной последовательности гена Е1 (1443 и.о.), была выявлена полная идентичность нуклеотидных последовательностей обоих вариантов. Генетическая стабильность штамма «Орлов-Д» при многократном (не менее 5 пассажей) культивировании в диплоидной линии клеток «М-22» была подтверждена также стабильным rctio±- фенотипом штамма «Орлов-Д» на уровне 1-го, 5-го и 10-го пассажа вируса в культуре клеток «М-22».

Полученные результаты характеризует штамм «Орлов-Д» как генетически стабильный и пригодный для производства вакцины.

ЧЕТВЕРТОЕ ПОЛОЖЕНИЕ Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака-резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.

Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» проведено на базе ГУН НИИ медицинской приматологии РАМН, г. Адлер-Сочи. Методология проведения доклинических испытаний новых МИБП представлена в нормативном документе «Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов» (СП 3.3.2.561. — 96) и использована в данном разделе исследования. Выбор в качестве лабораторной модели макаков-резусов обусловлен тем, что приматы и, в частности, низшие приматы -единственный вид лабораторных животных, у которых можно моделировать инфекционный процесс, вызванный вирусом краснухи, сходный с таковым у человека по показателям продолжительности инкубационного периода и вирусовыделения, наличия вирусемии, динамики формирования вирусспецифических антител. В исследовании использованы клинически здоровые животные в возрасте 3-5 лет, массой 4 - 5 кг, самцы. Перед началом эксперимента обезьяны были выделены из стада, изолированы, обследованы на отсутствие заболеваний вирусными гепатитами, SIV-инфекцией герпетическими инфекциями, туберкулезом; карантипированы в течение 45 суток.

Согласно СП 3.3.2.561 -96, (п. 5.1.7.) в опыте использованы препараты сравнения однонаправленного действия: краснушная вакцина Rudivax (производства Санофи-Пастер, Франция), действующее начало препарата -

вакцинный штамм \Vistar ИА27/3 и отечественный вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В».

Исследование штамма «Орлов-Д» включало определение: специфической безопасности (определение остаточной пейровирулентности, контагиозности); специфической активности (определение иммуногенной и протективной активности); иммунологической безопасности.

Для контроля остаточной нейровирулентности в опыте были использованы 10 серонегативных к краснухе обезьян, каждая из которых была заражена одним из трех препаратов: штаммом «Орлов-Д» - обезьяны №№ 33639, 33551, 33669, 332И; № 33421; штаммом «Орлов-В» - обезьяны №№ 33364, 33213, 33736, 33830; штаммом \Vistar 11А27/3 (в составе вакцины ЯиШуах) - обезьяна № 33776. Заражение, вскрытие, морфологическое и гистологическое исследование органов и тканей обезьян проведено проф. Л.А. Яковлевой.

Исследуемый материал вводили интрацеребрально в область зрительных бу1ров обоих полушарий головного мозга. По окончании периода клинического наблюдения у животных брали образцы крови для определения антител к вирусу краснухи, после чего животных умерщвляли под глубоким гексеналовым наркозом, производили аутопсию и гистологическое исследование тканей ЦНС, региональных лимфатических узлов, легкого, печени, селезенки

На протяжении периода клинического наблюдения у инфицированных животных ни в одном случае не отмечали пареза конечностей, парушения типичных движений (прыжки, лазанье, захват предметов), координации; не отмечали также патологических реакций на внешние раздражители, каких-либо других нарушений со стороны ЦНС, нарушения аппетита и сна. При пальпировании мышц конечностей в спокойном состоянии и при сгибании-разгибании ни в одном случае не отмечали нарушения мышечного тонуса. Тремор и гиперкинезы не регистрировали.

Морфологическое исследование. На вскрытии мозговых оболочек, а также ткани головного и спинного мозга с поверхности и на разрезе, как и при осмотре серозных полостей и внутренних органов грудной и брюшной полости, никаких патологических изменений обнаружено не было. Также не было обнаружено заметных следов в области трепанации черепа, за исключением одного случая (макак № 33830), в котором в теменной области правой половины имелось припаивание оболочек мозга к внутреннему апоневрозу черепа.

Гистологическое исследование включало в себя исследование тканей: головного мозга - передняя центральная извилина, задняя центральная извилина, зрительный бугор, продолговатый мозг; спинного мозга - шейное и поясничное утолщение. А также лимфатических узлов: затылочных задне-шейных, подчелюстных. Тканей легкого, печени, селезенки.

В тканях головного и спинного мозга патологических изменений в нейронах и глиальных клетках в исследованных областях выявлено не было. Нервные клетки имели четкие контуры, светлое пузырьковидное ядро с крупной центрально расположенной нуклеолой и отчетливые глыбки нисслевского вещества в цитоплазме. В нервной ткани головного и спинного мозга, а также в их оболочках каких-либо признаков воспаления или гиперемии не обнаружено. У половины животных (№№ 33830, 33551, 33211, 33639, 33736) были обнаружены признаки умеренной активации подчелюстных лимфатических узлов, а также ткани селезенки (№№ 33669, 33830, 33551, 33213, 33736), в основном в В-клеточном звене (увеличение размеров и количества лимфоидных фолликулов; преобладание бластных элементов -цешробластов и иммунобластов и увеличение количества митозов). В тканях печени и легкого ни в одном случае никаких патологических изменений не обнаружено.

При исследовании сывороток крови обезьян в РТГА с 4 ГАЕ краснушного антигенного диагностикума было установлено, что у всех обезьян, зараженных вакцинными штаммами вируса краснухи, через 30 суток после инфицирования, определялись вирусспецифические антитела в титрах от 1:160 до 1:1280.

Исходя из критериев, изложенных в нормативном документе, а именно: отсутствие у всех подопытных животных клинических проявлений поражения ЦНС; отсутствие вирусспецифических поражений нейронов и глиальных клеток при гистологическом исследовании тканей головного и спинного мозга; выработка вирусспецифических АТ не менее чем у 80% интрацеребрально зараженных животных, и на основании полученных результатов, можно сделать заключение об отсутствии остаточной нейровирулентности штамма вируса краснухи «Орлов-Д». Аналогичные результаты получены в отношении препаратов сравнения. Образование вирусспецифических антител у 100% интрацеребрально зараженных животных, подтверждает факт их инфицирования штаммами вируса краснухи.

Иммуногениую активность штамма «Орлов-Д» оценивали по двум показателям: количеству сероконверсий и напряженности поствакцинального

иммунитета б ответ на однократную иммунизацию вакцинным препаратом в дозе, составляющей не менее одной прививочной дозы для человека, то есть не менее 1000 ТДД50. Параллельно проводили контроль контагиозных свойств исследуемого вируса.

В опыте были использованы 23 серонегатавных к краснухе обезьяны, разделенные на три группы, каждая из которых была иммунизирована: препаратом, из штамма «Орлов-Д» - 12 обезьян (№№ 34411, 36481, 34455, 34766, 36157, 34654, 35108, 35095, 34815, 34057; 32834, 32937); препаратом из штамма «Орлов-В» - 4 обезьяны (№№ 33385, 33309, 32923, 33238); вакциной КиШуах (У»^ ЯА27/3) - 3 обезьяны ( №№ 33719, 33730, 34469). Для контроля контагиозности штамма «Орлов-Д» были использованы 3 серонегативные обезьяны, каждая из которых па протяжении 28 суток наблюдения находилась в одной клетке с привитым животным.

В ходе эксперимента установлено, что однократная иммунизация сопровождалась 100% сероконверсией. В то же время, по окончании периода наблюдения (28 суток) в сыворотке крови контактных животных специфические антитела не определялись, что свидетельствует об утрате контагиозных свойств штаммом «Орлов-Д». Напряженность иммунитета во всех трех группах привитых животных характеризовалась высокими показателями: титры антигемагппотипинов регистрировали на уровне 1: 160 и выше. При этом СГТ АТ во всех трех группах привитых практически совпадала (таблица 6).

Таблица 6

Показатели напряженности иммунитета у животных, привитых вакцинными штаммами вируса краснухи

Вводимый материал Инфекционная активность препарата СГТ титров АТ в обратных величинах/^

«Орлов-Д» 3,5 ^ ТЦД50/0,5 мл 1:388/ 8,57

«Орлов-В» 3,3 ТЦД50/0,5 мл 1:362/8,49

\У*5(агБ.А27/3 4,1 ТЦЦ5О/0,5 мл 1:388/8,57

У 5 привитых животных удалось оценить поствакцинальный иммунитет спустя 4 года после иммунизации (период наблюдения). Уровень антигемагпотининов составлял, в основном, 1: 80, (в одном случае 1:40) и существенно превышал защитный титр антител (1 : 20).

Протективную активность определяли в группе из 13 животных, иммунизированных: штаммом «Орлов-Д» - 8 макаков (№№ 34411, 36481, 34455, 34815, 34654, 35108, 35095, 36157); штаммом «Орлов-В» - 2 макака (№№ 33385, 33309); штаммом ЭД^аг 11А 27/3 (в составе вакцины Яцсйуах) - 3 макака (№№ 33719, 33730, 34469). Группу контроля составили 6 серонегативных к краснухе животных, которым патогенный штамм вводили по той же схеме, что и иммунизированным обезьянам. Поскольку низшие приматы переносят краснушную инфекцию в бессимптомной форме, наличие инфекционного процесса определяли по развитию у зараженных животных вирусемии, которую регистрировали в ПЦР в интервале от 4 до 24 суток после инфицирования. Результаты представлены в таблице 7 и свидетельствуют о том, что иммунизация как штаммом «Орлов-Д», так и препаратами сравнения защитила животных от проникновения вируса в кровяное русло; в то время как в контрольной группе обезьян в ответ на заражение патогенным штаммом "Лебедев" в 100% случаев в период с 4-7 по 17-20 сутки регистрировалась вирусемия, что свидетельствует о развитии краснушной инфекции.

Таблица 7

Выявление РНК вируса краснухи (в ПЦР) в сыворотке крови обезьян после заражения патогенным штаммом вируса

Количество обезьян (номер) Вакцинный штамм Наличие РНК* вируса в сыворотке крови через ... суток после заражения патогенным штаммом вируса краснухи

4 7 11 14 17 20 24

2 Орлов-В - - - - - - ■ -

8 Орлов-Д - - - - - - -

3 11А27/3 - - - - - - -

1/34089 н/и** ± ± + + + + -

1/33559 н/и - + + + ± - -

1/32763 н/и - + + + ± ± -

1/32985 н/и ± + + + ± ± -

1/35595 н/и - + + + + + -

1/35194 н/и ± ± ■ + + + - -

* « + » более 1000 копий/мл; « ± » 100 - 1000 копий/мл; «-» менее 100 копт /мл

** - не иммунизировали

В целом, полученные результаты характеризуют штамм «Орлов-Д» как атгенунрованный вирус с высокой специфической активностью, не менее выраженной, чем у препаратов сравнения - вакцинных штаммов Wistar RA27/3 и «Орлов-В».

Определение иммунологической безопасности штамма проводили, контролируя изменения в системе иммунокомпетентных клеток иммунизированных животных. Согласно нормативному документу, неспецифическое влияние вакцинного препарата на иммунную систему должно удовлетворять следующим требованиям:

продолжительность изменений иммунологических показателей не должна превышать 45 дней с момента введения вакцины;

- изменение величины показателя численности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток не должны отличаться более чем в 1,5 раза от исходных показателей и аналогичного показателя в группе, получавшей плацебо и обследованной в те же сроки (СП 3.3.2.561 - 96, п. 12.2.4.).

Влияние иммунизации па факторы клеточного иммунитета и уровень ИНФ изучали в группе из 9 животных: 5 - привитых штаммом «Орлов-Д» (№№ 34455, 35108, 35095, 34411, 36157); 2 - штаммом Wistar RA 27/3 (№№ 34469,34467); 2 - контрольные обезьяны: №№ 36481,34766 (группа плацебо).

Количественные характеристики CD-антигенов (АГ) подсчитывали до иммунизации, через 7, 14, 28 и 45 суток после введения препаратов. Значительные колебания исходных величин каждой субпопуляции лимфоцитов у опытных и контрольных животных не позволили провести статистическую обработку результатов. Тем не менее, спустя 7-28 суток после иммунизации у всех привитых животных определилась тенденция к активации натуральных киллеров (CD-16); маркеров В-клеточного звена иммунитета (CD-19, CD-22), ответственных за выработку специфических антител; маркеров молекул ГКГ (HLA-DR). Так, в отдельных случаях количество натуральных киллеров (CD-I 6) повышалось в 3 - 4 раза (№№ 34467, 34469), количество CD-I 9 АГ превышало исходные показатели в 8 раз (№ 35095), CD-22 - в 10 раз (№ 34411), HLA-DR - в 4-6 раз (№№ 34455, 34411, 34467, 34469). Что касается маркеров молекул Т-клеточного звена иммунитета, то первичная встреча с вирусным антигеном не оказала существенного влияния на уровень Т-лимфоцитов, но привела, по-видимому, к премированию Т-клеток, о чем можно судить по активации маркеров молекул ГКГ (HLA-DR), принимающих участие в этом процессе. Через 45 суток после иммунизации количественные показатели активности иммунокомпетентных клеток возвращались к исходным

величинам и не отличались от них более чем в 1,5 раза. ИФН-статус определяли регистрацией уровня а-ИФН, у- ИФН. Уровень цитокинов контролировали до иммунизации, через 14 и 28 суток после нее. Через 14 суток после вакцинации у всех иммунизированных животных, включая обезьян, получивших препарат сравнения, отмечали не продолжительное 4-8- кратное снижении уровня а- и у-ИФН. Исходный их уровень восстанавливался к 28 суткам после введения препарата.

Иммунологические сдвиги в системе врожденного иммунитета в контрольной группе не иммунизированных обезьян не наблюдались.

В целом, результаты свидетельствуют о иммунологической безопасности штамма «Орлов-Д».

Таким образом, доклиническое изучение полученного в ходе работы аттенуированного вируса краснухи показало (в пределах использованных методов), что по отсутствию остаточной нейровирулентности для приматов; высокой специфической активности, отсутствию контагиозности; иммунологической безопасности, не уступающим по вышеозначенным критериям препаратам сравнения, штамм «Орлов-Д» пригоден для получения на его основе вакцины против краснухи.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный филогенетический анализ современных взолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории Пермского края, вакцинных штаммов «Орлов-B», Wistar RA27/3 и четырех штаммов вируса краснухи, выделенных на других территориях России в 1967- 97 г.г. показал, что российские штаммы относятся к одной генетической группе и идентифицированы как вирусы генотипа 2с; вакцинный штамм Wistar RA27/3 относится к вирусам Rubella 1 генетической линии. Установлено более тесное генетическое родство между российскими изолятами и иггаммом «Орлов-В» по отношению к штамму Wistar RA27/3: индекс генетической близости составляет 0,74 и 0,99, соответственно.

2. Массовая иммунизация против краснухи детей 1-2 года жизни, проведенная на территории Пермского края вакциной Rudivax (действующее начало - вакцинный штамм Wistar RA27/3) оказала влияние на биологический фактор эпидемического процесса. Создание коллективного иммунитета в группе детей младшего возраста при пороге привитости, равном 460,0 на 1000 детского населения в течение четырех лет применения вакцины вызвало достоверное увеличение генетической дивергенции

изолятов вируса краснухи (коэффициент корреляции г = 0,76; (= 4,58; р<0,01) с 1,15% (2000 - 2002 гг.) до 3,14 % (2004 - 2005 гг.) (р<005).

3. Диплоидные линии клеток фибробластов легкого, почек, кожно-мышечного лоскута эмбриона человека обеспечивают репродукцию вируса краснухи. Чувствительность диплоидной линии клеток кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» к вакцинному штамму «Орлов-В» соответствует чувствительности первичной культуры клеток ПГПС, к которой адаптирован указанный штамм. Средние показатели инфекционной активности вируса в первичной (ППК) и диплоидной («М-22») культурах клеток составляют 3,9 % ТЦДо/мл и 4,2 ТЦД50/МЛ, соответственно.

4. Проведением одного дополнительного пассажа штамма «Орлов-В» в диплоидной линии клеток «М-22» получен аттенуировашшй штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Репродукция штамма «Орлов-Д» не требует адаптации вируса к данному тканевому субстрату: инфекционную активность, равную 4,0 - 4,2 % ТЦД5(/мл, стабильный гсЬщ ± фенотип регистрировали с первого по десятый пассаж вируса в указанной культуре клеток.

5. Сравнительный генетический анализ штаммов Wistar 11А27/3 и «Орлов-Д» выявил, что доля нуклеотидкых замен в структуре гена Е1 исследованных штаммов составляет 6,7 %. При этом 34,3 % из них является значимыми, обуславливают различия в структуре поверхпостного глико-протеина Е1. Наиболее важным различием между штаммами является замена в положении 208 аминокислоты тирозин (штамм «Орлов-Д») на гистидин (штамм ИА 27/3) в высоко консервативном участке молекулы Е1.

6. Диплоидная линия клеток «М-22» - тканевой субстрат, не требующий специальных условий культивирования, устойчива к криоконсервации; характеризуется стабильной чувствительностью к вирусу краснухи на протяжении длительного периода жизнедеятельности клеток в фазе их активного роста (20 -35 пассаж линии клеток). Линия «М-22» поддерживает также репродукцию вакцинных штаммов вируса кори Л-16 (4,0-6,0 1д ТЦД50/0,5 мл) и вируса эпидемического паротита Л-3 (4,0 -5,0 ТЦД5о/0,5 мл).

мкг/мл) при равном количестве инфицированных клеток. Лиофилизированный штамм «Орлов-Д» характеризуется стабильной биологической активностью (3,4 - 3,8 ТЦД50/0,5 мл) в условиях хранения при температуре - 20° С на протяжении 10 лет наблюдения. Это обстоятельство, а также наличие баша посевных клеток «М - 22» может обеспечить многолетнюю потребность в вакцине против краснухи на территории РФ.

8. Снижение реактогенности штамма «Орлов» с 30% до 2% клинических реакций средней тяжести в процессе аттенуации вируса в первичной культуре клеток ППК сопровождается заменой в положении 57 белка Е1 аминокислоты валин на изолейцин. Штамм «Орлов-Д» характеризуются стабильностью структуры гена Е1 при культивировании в культуре клеток «М-22» на протяжении минимум 5 пассажей вируса в указанной линии клеток.

9. В доклиническом изучении на обезьянах макака-резус установлено, что штамм «Орлов-Д не обладает остаточной нейровирулентностыо, контагиозностыо и по параметрам специфической безопасности соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам для живых противовирусных вакцин.

10. Однократное введение серонегативным к краснухе обезьянам макака-резус препарата из штамма «Орлов-Д» с инфекционной активностью 1000 ТЦД 50/0,5 мл вызывает 100% серокоиверсии и формирование вирусспецифических антител в высоких титрах (в РТГА 1 .160 - 1 : 1280 ). Препарат из штамма «Орлов-Д» обладает протективпостыо, защищает иммунизированных животных от заражения патогенным вирусом краснухи (штамм «Лебедев»); характеризуется иммунологической безопасностью: продолжительность изменения активности иммунокомпетентных клеток и интерферонового статуса под влиянием вакцинации не превышает 45 суток после введения препарата. По изученным параметрам штамм «Орлов-Д» не уступает препаратам сравнения - вакцинным штаммам вируса краснухи «Орлов-В» и 11А27/3.

11. Полученные результаты свидетельствуют о возможности получения живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов-Д» и диплоидной линии клеток «М- 22» и целесообразности ее применения на территории с эндемичной циркуляцией вируса краснухи генотипа 2с.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Вакцинопрофилактика краснухи/ И.Н. Лаврентьева // Журпал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1996. - № 1. - С. 37 - 45.

2. Этиология и профилактика краснухи / И. Н. Лаврентьева // Краснуха. Синдром Врожденной краснухи. Информационный сборник Pasteur Merieux Connaüght. - М. - СПб., 1997. - С. 5 -17.

3. Вакцинопрофилактика краснухи. Анализ зарубежного опыта / И.Н. Лаврентьева // Матер. VII съезда всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997,- С. 104-105. -^Усовершенствование методов определения биологической активности вирусов кори, паротита и краснухи в моно- и ассоциированных препаратах / И.Н. Лаврентьева, Л.Ю. Тарос, Л.П. Сухобаевская, Е.А. Николаева // Матер. VII Съезда всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М.,1997.-С. 105 - 106.

5. Характеристика альтернативной клеточной культуры для производства моно- и ассоциированных вакцин против детских вирусных инфекций / И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, Л.Ю. Тарос, Н.Б. Румель И Матер. VII съезда всероссийского науч-прахт-общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-М.Д 997,- С. 106- 107.

6. Краснуха в России: стратегия и тактика вакцинации / В.В. Семериков, Л.И Мельчукова, А.Я. Колобов, В.Ф. Попов, И.Н. Лаврентьева // Матер. VII съезда всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,- М., 1997.-С. 139- 140.

v 7. Эпидемиологический надзор за краснухой в Санкт-Петербурге /A.A. Соболевская, О. В. Парков, И.Н. Лаврентьева, В, П. Рыбков, С.С. Вашукова / Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. Н Междунар. конфер. - СПб., -С. 25.

8. Изучение чувствительности диплоидных линий клеток человека к вирусам кори, паротита и краснухи для совершенствования технологии производства детских противовирусных вакцин / И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, Л.Ю. Тарос, Н.Б. Румель, Л.Ф. Литвинчук //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: матер. П Междунар. конфер. - СПб., 1998. - С. 49.

9. Разработка отечественной вакцины против краснухи / И.Н. Лаврентьева // вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика: Матер, науч. конфер. с международ, участием, посвященной 200-летию BMA. -СПб, 1999. - С. 223.

10. Вакцинопрофилактика краснухи. Стратегия и тактика/ И.Н. Лаврентьева, В.В. Семериков // Вакцинопрофилактика в XXI веке: матер, науч-прак. конф. Западно- Уральского региона. - Пермь, 2000 г. - С. 35 - 37,

11. Rubella in Russian Federation epidemiological feature and control measures to prevent the Congenelal rubella syndrome/V.V. Semericov, I.N. Lavrentyeva, V.F. Popov//Epidemiol, infect. - 2000. - v. 125. - 359 - 366 p.

12. Эпидемиологический надзор и контроль за краснушной инфекцией / В.В. Семериков, И.Н. Лаврентьева // Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее: матер, науч. конференции, посвященной 80-летию академика В.Д.Белякова. - СПб., 2001 - С. 92- 93;

13. Краснуха / В.В Семериков, H.H. Лаврентьева, В.К. Таточенко, Л.Л. Нисевич, И.В. Фельдбшом. - Пермь - СПб- М., 2002. - 175 с.

14. О перспективах развития вакцинопрофилактики краснухи /В.В. Семериков, И.Н. Лаврентьева, И.В. Фельдблюм // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы: Матер. 3-ей международ, конф., посвященной 80-летию института имени Пастера. - СПб., 2003 г. - С. 34.

15. Штаммы вируса краснухи для живой аттенуированной вакцины / И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, В.З. Агрба, Л.А. Яковлева, ЮЛ. Радюкевич,

A.Б. Жебрун // Эпидемиология и вакцинопрофилактика,- 2003. - № 4.- С. 7 -10.

16. Краснуха: Направления эпидемиологического надзора и профилактики/

B.В. Семериков, И.Н. Лаврентьева, И.В. Фельдблюм // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всерос. науч. конф., посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед».- Пермь., 2003 г.- С.73 - 76.

17. Результаты доклинического изучения вариантов вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» для получения живой аттенуированной вакцины /

И. Н. Лаврентьева, Л.А. Яковлева, В.В. Семериков // Пермский медицинский журнал. - 2005. - № 1. - С. 78 - 81.

18. Актуальные вопросы и перспективы специфической профилактики краснухи в России/ И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, А.Б. Жебрун // Теоретические и практические аспекты элиминации кори: сб. научных трудов к 145-летию со дня рождения Г.Н. Габричевского. - М., 2005. - С. 61-65.

19. Обезьяны макака-резус как модель для доклинического изучения вакцинных штаммов вируса краснухи/ И.Н. Лаврентьева, А.Б. Жебрун, В;3. Агрба, Л.А. Яковлева // Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях: Матер. Всерос. науч. конф. - Сочи-Адлер, 2006. - С. 38 - 43.

20. Доклиническое изучение вариантов вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» / И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, В.З. Агрба, Л.А. Яковлева, A.B. Семенов // Биопрепараты. - 2006. - № 1. - С. 19 - 22.

21. Laboratoire des infections infantiles virales / I. Lavrcnieva, L. Soukhobaevskaya, A. Antipova / Rapport D'Activé des departments de recherché en 2006 - 2007. - Institut Pasteur de Saint-Peterbourg., 2007. - P. 43 - 47.

22. Доклиническое изучение вакцинных штаммов вируса краснухи / И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, В.З. Агрба, Л.А. Яковлева, А. Б. Жебрун // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения российской Федерации: материалы IX съезда Всерос. научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., Санэпидемиа., 2007. -Т.2. - С. 151 - 152.

23. Влияние иммунизации против краснухи на формирование специфических и неспецифических факторов иммунитета в опыте на обезьянах макака-резус / И.Н. Лаврентьева, А.Б.Жебрун, Л.П. Сухобаевская, В.З. Агрба, Д.Д. Карал-Оглы//Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах: Материалы междунар. научн. конф. - Сочи - Адлер, 2007,- С.86 - 94.

24. Генетическая характеристика вируса краснухи в период вакцинопрофилактики/ И. Н. Лаврентьева, В. В. Семериков// в кн.: Инфекционная заболеваемость в Северо- Западном федеральном округе России. Закономерносга и особенности эпидемического процесса в современный период. - СПб., 2007. - С. 33 - 37.

25. Молекулярно-биологические механизмы аттенуации вируса краснухи / И.Н. Лаврентьева, A.B. Марков // Вестник Российской военно-медицинской академии.- 2008.- №2:-С. 112- 113.

26. Краснуха в России: изменчивость возбудителя в период вакцинопрофилактики инфекции /И.Н. Лаврентьева, В.В. Семериков, А.Б. Жебрун, И.В. Фельдблюм, A.B. Марков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 3. - С. 26-31.

27. Молекулярно-биологические свойства аттенуированных штаммов вируса краснухи / И.Н. Лаврентьева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 4. - С. 55 - 59

28.. Поствакцинальный иммунитет при иммунизации против краснухи штаммом Орлов-Д» в эксперименте / И.Н. Лаврентьева, В.В. Семериков, В.З. Aip6a, Л.П. Сухобаевская, А.Ю. Антипова // Пермский медицинский журнал. - Пермь. - 2008, - № 4.-С. 68-75.

29. Генетические маркеры аггенуации вируса краснухи / И. Л. Лаврентьева, A.B. Марков, Л.П. Сухобаевская, A.IO. Антипова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. IV-ой Междунар. конф. Института им. Пастера. - СПб., 2008.-С. 17.

30. Генетическая стабильность вируса краснухи при адаптации к новой системе клеток / И.Н. Лаврентьева, A.B. Марков, Л.П. Сухобаевская, AM. Мартынова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. IV-ой Международ, конф. Института им. Пастера. - СПб., 2008. - С. 18.

31. Изменчивость возбудителя краснухи в период вакцинопрофилактики краснушной инфекции / В.В. Семериков, И.Н. Лаврентьева, A.B. Марков // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов; Материалы Всеросс. науч.-практ. Конф., посвященной 110-летаю филиала ФГУП «НПО Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - Пермь, 2008. - С. 46 - 48.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту, доктору медицинских наук, члену-корреспонденту РАМН, профессору А .Б. Жебруну за вдею настоящей работы. Глубокую благодарность рецензентам -доктору медицинских наук, профессору СЛ. Мукомолову, доктору медицинских наук А.Ж. Василенко. Сердечная благодарность - руководителю лаборатории клеточных культур ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова, доктору медицинских наук, профессору Л.Л. Мироновой. Искреннюю благодарность выражает автор замесгагеяю директора ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова по научной работе, доктору биологических наук H.A. Юминовой. Особую признательность - директору НИИМП, академику РАМН Б.А. Лапину и сотрудникам института: доктору медицинских наук, профессору В. 3. Агрба, доктору медицинских наук, профессору Л.А. Яковлевой. Автор благодарит также зав. кафедрой эпидемиологии Пермской медицинской академии им. Вагнера, доктора медицинских наук, профессора И. В. Фельдблюм, главного эпидемиолога-эксперта ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае», доктора медицинских наук В.В. Семерикова; заместителя директора по инновационным проектам Санкт-Петербургского диагностического центра ООО НПФ «Хеликс», А.В.Маркова, заместителю главного врача клиники ФГУН НИИДИ ФМБА, кандидату биологических наук А. В. Семенову. Особая благодарность - сотрудникам лаборатории детских вирусных инфекций ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.

СПИСОК СОКРАЩЕ1ШЙ

ВИК-21 - перевиваемая культура клеток почки сирийский хомяка С-цигозия ......

в - гуапин

1,-41 - перевиваемая культура клеток костного мозга человека, больного лейкемией

Ж-13 - перевиваемая культура клеток почки кролика ..Уего - перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки Т - тимин АГ-антиген АТ - антитело

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВСЖ - вируссодержащая жидкость

ВБН-вирус болезни Ныокасла

ВВС - вирус везикулярного стоматита

ВЭМ-вирус эпцефаломиокардита мышей

ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля

ГКМВ - Государственная коллекция музейных вирусов

ДКЛЧ - диплоидные клетки фибробластов легкого эмбриона человека

ДКПЧ - диплоидные клетки фибробластов почки эмбриона человека

ИИФ - интерферон

МИ множественность инфицирования

МИШ - медицинские иммунобиологические препараты

МУ - методические указания..

НИЙЭМ - научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

НИНМП - научно-исследовательский институт медицинской приматологии ОВС - объединенный вирусный сбор П.о - пара оснований

ППК - первично-трипсипизированная культура клеток почки кролика

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

СПЭВ - перевиваемая культура клеток почки свиньи

ТЦЦ50 - пятпдесяшпроцентная тканевая цитонатогенная доза

ЦНС - центральная нервная система

1ЩД - цитопатогенное действие

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Лаврентьева, Ирина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ВИРУС КРАСНУХИ: МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ВАКЦИНЫ НА ЕГО ОСНОВЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Морфология, структурно-функциональная организация генома.

1.2. Чувствительность клеточных культур и лабораторных животных к вирусу краснухи.

1.3. Антигенная и генетическая характеристика вируса краснухи.

1.4. Лабораторные методы определения вирусных антигенов и специфических антител.

1.5. Влияние стратегии вакцинации против краснухи на эпидемический процесс и профилактику СВК.

1.5.1. Эпидемиологические особенности краснухи в довакцинальный период.

1.5.2. Врожденная краснуха.

1.5.3. Эффективность профилактики СВК в зависимости от стратегии вакцинации.

1.6. Штаммы вируса краснухи для живой аттенуированной вакцины.

1.7. Моно- и ассоциированные препараты для профилактики краснухи

1.8. Вакцинный штамм «Орлов».

Введение Диссертация по биологии, на тему "ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ"

Актуальность.

Значимость краснухи в России в современных условиях обусловлена повсеместным распространением инфекции и высоким тератогенным действием вируса, его способностью формировать врожденные дефекты развития, которые завершаются смертельным исходом или инвалидностью [70, 71, 72, 78]. Наиболее эффективным способом профилактики краснухи, в том числе и врожденной, является вакцитюпрофилактика [91,177].

Стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ на 2005 -2010 г.г. предусматривает элиминацию эндемичной краснухи и снижение заболеваемости врожденной краснухой в странах региона до уровня менее 1 случая на 100 тыс. живых новорожденных (целевая программа «Здоровье для всех в XXI веке»).

Иммунизация против краснухи в Российской Федерации введена в календарь профилактических прививок приказом МЗ РФ от 27.12.97 г. № 375. В настоящее время, согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 30.10.2007 г. № 673, плановой иммунизации подлежат дети в возрасте 12 месяцев, 6 лет и девочки 13 лет; дополнительной - все дети от 1 до 17 лет не болевшие, не привитые или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18 — 25 лет, не болевшие и не привитые ранее.

С 1999 г., когда был зарегистрирован максимальный уровень заболеваемости краснухой (399,0 на 100 ООО населения), этот показатель снизился более чем в 10 раз (21,7 на 100 000 населения в 2007 г.), что, в целом, свидетельствует об эффективности вакцинопрофилактики краснухи.

Тем не менее, в Государственном докладе «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (2007 г.) Главного государственного санитарного врача РФ констатируется, что регламентированный ВОЗ 95 % уровень охвата ревакцини-рующими прививками в стране не достигнут. Среди заболевших краснухой наметилась тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста. Как отмечает Г.Г. Оншценко, отсутствие отечественной вакцины сдерживает охват прививками всех подлежащих вакцинации контингентов [78].

Кроме того, несмотря на снижение затрат, связанных с заболеваемостью краснухой (в период 1999 - 2001 гг. они составили 1218, 2 млн. рублей), в настоящее время сохраняется существенный экономический ущерб, обусловленный инфекцией: 8 945 тыс. рублей в 2007 г. [59, 107, 108].

В связи с отсутствием отечественной вакцины, специфическая профилактика инфекции осуществляется зарубежными препаратами, зарегистрированными в установленном порядке [7].

Действующим началом всех зарубежных моно- и ассоциированных вакцин для профилактики краснухи является вакцинный штамм Wistar

RA27/3 (автор - S. А. Plotkin), который относится к вирусу Rubella первой генетической линии (клайд 1). В большинстве стран, где осуществляется специфическая профилактика краснухи, преобладает циркуляция вирусов той же генетической линии. В то же время в Китае, Индии, Корее, России циркулируют вирусы второй генетической линии (клайд 2) [293]. Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира [25, 34], филогенетические изменения вируса под прессом коллективного иммунитета представляются возможным событием и создают потенциальную угрозу возникновения его дрейфовых вариантов со значимыми мутационными изменениями генома.

Так, при реализации программы ликвидации полиомиелита живой оральной вакциной были установлены изменения генома вакцинных вирусов и приобретение ими в ряде случаев признаков, присущих «диким» вирусам полиомиелита [11].

Несмотря на то, что, начиная с 1999 - 2000 г.г. охват прививками против краснухи подлежащих контингентов населения постоянно повышается (в первую очередь за счет своевременной вакцинации детей 1-2 года жизни), в отечественной научной литературе до последнего времени не было работ по изучению влияния коллективного иммунитета к краснухе на молекулярно-генетические и фенотипические свойства циркулирующих штаммов.

В ряде стран (Япония, Китай) для иммунизации населения против краснухи с успехом используются национальные вакцины, полученные из эндемичных для этих территорий штаммов [116]. Россия определена экспертами ВОЗ, как единственная территория с эндемичным распространением вирусов генотипа 2с [282]. Установление генетической близости между эпидемическими изолятами вируса краснухи и вакцинным штаммом \Vistar КА27/3, который входит в состав всех зарубежных краснупшых вакцин, зарегистрированных на территории России, сравнительная генетическая характеристика отечественного и зарубежного вакцинных штаммов - решение этих задач имеет непосредственное отношение к эффективности и безопасности специфической профилактики краснухи на территории Российской Федерации. Можно предположить, что использование для вакцинации против краснухи в России эндемичного для данной территории атгенуированно-го штамма было бы предпочтительнее с точки зрения генетической стабильности вакцинного вируса.

С учетом этих обстоятельств, разработка препаратов, полученных из эндемичных для территории России штаммов, не уступающих зарубежным вакцинам по критериям специфической безопасности и эффективности, является актуальной проблемой и, по предварительным расчетам, даст значительный экономический эффект.

В 1979 г. в Государственную коллекцию музейных вирусов был депонирован вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов» (автор - В.Н. Ме-шалова), выделенный в г. Ленинграде от больного с манифестной формой инфекции и аттенуированный в первично-трипсинизированной культуре клеток почки кролика (ЛПК). Клинические испытания экспериментальных серий вакцины, созданной на его основе, показали высокую иммуногенную активность и низкую реактогенность препарата [67]. Однако в силу ряда причин вакцина против краснухи не была внедрена в производство.

В 1995 г., в рамках реализации Федеральной целевой программы «Вак-цинопрофилактика», штамм «Орлов» был восстановлен нами до исходных показателей биологической активности проведением трех дополнительных пассажей в культуре клеток ППК, сертифицирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и получил наименование «Орлов-В» [50].

Более экономичным и технологичным клеточным субстратом для производства МИБП, вводимых людям, являются полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток человека, рекомендованные экспертами ВОЗ для производства, в частности, вакцины против краснухи [96].

При проведении в России массовой, по сути, иммунизации детского населения и селективной вакцинации взрослых, существенное значение приобретает экономическая составляющая кампании. Использование для профилактики СВК отечественного препарата, полученного на экономичном и контролируемом тканевом субстрате (диплоидная линия клеток человека), позволило бы, ориентировочно, снизить затраты только на дополнительную иммунизацию населения в рамках реализации национального проекта «Здоровье» в 1,7 раза и сэкономить около 187 млн. рублей.

Вместе с тем, адаптация вируса к иной системе клеток-продуцентов может сопровождаться host-range мутациями вирусного генома с изменением молекулярно-биологических свойств полученного варианта. Контроль генетической стабильности вируса существенно облегчается, если известны генетические маркеры, характеризующие ослабленные варианты вируса.

Для оценки пригодности более технологичного варианта вакцинного вируса, не менее важно определить в опытах in vivo сохранность основных биологических свойств, характеризующих штаммы для живых вакцин: специфическую и иммунологическую безопасность; специфическую активность.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности получения нового варианта вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов-В», адаптированного к более технологичному тканевому субстрату и определения в молекулярно-биологических исследованиях возможности применения полученного аттенуированного вируса для профилактики краснухи на территории Российской Федерации.

Цель исследования:

Создание на основе вакцинного штамма «Орлов» кандидата в вакцинный штамм и определение возможности его использования для профилактики краснухи на территории России.

Задачи исследования:

2. Определить возможные филогенетические изменения вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции.

4. Провести сравнительный генетический анализ штаммов \Vistar ЯА27/3 и «Орлов-Д».

6. Изучить генетические изменения вируса краснухи в процессе аттенуа-ции в первичной культуре клеток ППК и при его адаптации к диплоидной линии клеток «М-22».

9. Изучить влияние иммунизации препаратом из штамма «Орлов-Д» на показатели врожденного иммунитета обезьян.

Научная новизна:

Впервые получены новые знания:

- о генетической принадлежности вакцинного штамма «Орлов-В»

- об адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопро-филактики инфекции;

- о генетической стабильности/изменчивости вируса краснухи в процессе его аттенуации или адаптации к тканевому субстрату, отличному от исходной системы клеток-хозяина;

- о специфической безопасности штамма вируса краснухи «Орлов-Д»;

- о влиянии иммунизации против краснухи штаммом «Орлов-Д» на показатели врожденного и адаптивного иммунитета в эксперименте. Впервые разработаны:

- технологические подходы к получению живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов-Д» и диплоидной культуры клеток кожно-мышечных фибробластов человека «М-22».

Практическая значимость:

Внедрение результатов исследования в практику:

1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В». Депонирован в Государственную коллекцию музейных вирусов (депонент ГКВ 2326 от 04.04.1995 г.); свидетельство об аттестации штамма в ГИСК им. Л.А. Тарасевича №0133/8 от 29.03.95 г.

2. Штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Депонирован в Государственную коллекцию музейных вирусов (депонент ГКВ 2347 от 29.12.1998 г.).

3. Штамм вируса краснухи «Лебедев». Депонирован в Государственную коллекцию музейных вирусов (депонент ГКВ 2365 от 17.12.2004 г.).

5. Патент на изобретение РФ № 2081912 «Вакцинный штамм вируса краснухи Орлов-В». Приоритет от 22.05.1995 г.

6. Патент на изобретение РФ № 2173344 «Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи». Приоритет от 28.06.1999 г.

7. Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной краснуш-ной вакцины. Рассмотрена и одобрена Ученым Советом ФГУ «Санкт

Петербургский НИИЭМ имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» (протокол № 10 от 14.11.2001г.) и утверждена директором Института 14.11.2001 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вакцинный пггамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RA27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.

2. Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ПГЖ, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. JI.A. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснуш-ной вакцины.

3. Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е1. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность. 4. Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака-резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Лаврентьева, Ирина Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный филогенетический анализ современных изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории Пермского края, вакцинных штаммов «Орлов-B», Wistar RA27/3 и четырех штаммов вируса краснухи, выделенных на других территориях России в 1967- 97 г.г. показал, что российские штаммы относятся к одной генетической группе и идентифицированы как вирусы генотипа 2с; вакцинный штамм Wistar RA27/3 относится к вирусам Rubella 1 генетической линии. Установлено более тесное генетическое родство между российскими изолятами и штаммом «Орлов-B» по отношению к штамму Wistar RA27/3: индекс генетической близости составляет 0,74 и 0,99, соответственно.

3. Диплоидные линии клеток фибробластов легкого, почек, кожно-мышечного лоскута эмбриона человека обеспечивают репродукцию вируса краснухи. Чувствительность диплоидной линии клеток кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» к вакцинному штамму «Орлов-В» соответствует чувствительности первичной культуры клеток ППК, к которой адаптирован указанный пггамм. Средние показатели инфекционной активности вируса в первичной (ППК) и диплоидной («М-22») культурах клеток составляют 3,9 lg ТЦД50/МЛ и 4,2 ТЦД50/мл, соответственно.

4. Проведением одного дополнительного пассажа штамма «Орлов-В» в диплоидной линии клеток «М-22» получен аттенуированный штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Репродукция штамма «Орлов-Д» не требует адаптации вируса к данному тканевому субстрату: инфекционную активность, равную 4,0 - 4,2 lg ТЦД50/МЛ, стабильный rctio ± фенотип регистрировали с первого по десятый пассаж вируса в указанной культуре клеток.

5. Сравнительный генетический анализ штаммов Wistar RA27/3 и «Орлов-Д» выявил, что доля нуклеотидных замен в структуре гена Е1 исследованных штаммов составляет 6,7%. При этом 34,3 % из них является значимыми, обуславливают различия в структуре поверхностного гликопротеина Е1. Наиболее важным различием между штаммами является замена в положении 208 аминокислоты тирозин (штамм «Орлов-Д») на гистидин (штамм Wistar RA 27/3) в высоко консервативном участке молекулы Е1.

6. Диплоидная линия клеток «М-22» - тканевой субстрат, не требующий специальных условий культивирования, устойчива к криоконсервации; характеризуется стабильной чувствительностью к вирусу краснухи на протяжении длительного периода жизнедеятельности клеток в фазе их активного роста (20 -35 пассаж линии клеток). В этом же диапазоне культивирования линия «М-22» поддерживает репродукцию вакцинных штаммов вирусов кори Л-16 (4,0 -6,0 ^ТЦД50/0,5 мл) и эпидемического паротита Л-3 (4,0 - 5,0 1ёТЦД50/0,5 мл).

7. Репродукция штамма «Орлов-Д» в диплоидной линии клеток «М-22» не сопровождается цитодеструктивным действием вируса на клетки, характеризуется более интенсивной динамикой формирования инфекционных вирусных частиц по отношению к его репродукции в первичной культуре клеток ППК. Указанные особенности позволяют получить удвоенный объем вакцинного препарата с более низким содержанием белка (100 -230 мкг/мл) по сравнению с препаратом, полученном на первичных клетках ППК (500780 мкг/мл) при равном количестве инфицированных клеток. Лиофилизиро-ванный пггамм «Орлов-Д» характеризуется стабильной биологической активностью (3,4 - 3,8 ^ ТЦД50/0,5 мл) в условиях хранения при температуре - 20° С на протяжении 10 лет наблюдения. Это обстоятельство, а также наличие банка посевных клеток «М - 22» может обеспечить многолетнюю потребность в вакцине против краснухи на территории РФ.

8. Снижение реактогенности штамма «Орлов» с 30% до 2% клинических реакций средней тяжести в процессе атгенуации вируса в первичной культуре клеток ПГЖ сопровождается заменой в положении 57 белка Е1 аминокислоты валин на изолейцин. Штамм «Орлов-Д» характеризуются стабильностью структуры гена Е1 при культивировании в культуре клеток «М-22» на протяжении минимум 5 пассажей вируса в указанной линии клеток.

9. В доклиническом изучении на обезьянах макака-резус установлено, что штамм «Орлов-Д не обладает остаточной нейровирулентностью, кон-тагиозностью, и по параметрам специфической безопасности соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам для живых противовирусных вакцин.

10. Однократное введение серонегативным к краснухе обезьянам макака-резус препарата из штамма «Орлов-Д» с инфекционной активностью 1000 ТЦД 50/0,5 мл вызывает 100% сероконверсии и формирование вирус-специфических антител в высоких титрах (в РТГА 1 : 160 - 1 : 1280 ). Препарат из штамма «Орлов-Д» обладает выраженной протективностью, защищает иммунизированных животных от заражения патогенным вирусом краснухи (штамм «Лебедев»); характеризуется иммунологической безопасностью: продолжительность изменения активности иммунекомпетентных клеток и интерферонового статуса под влиянием вакцинации не превышает 45 суток после введения препарата. По изученным параметрам штамм «Орлов-Д» не уступает препаратам сравнения - вакцинным штаммам вируса краснухи «Ор-лов-В» и Wistar RA27/3.

Заключение

Требования, предъявляемые к вакцинным препаратам хорошо известны. Вакцины должны обладать следующими качествами:

- быть безвредны для организма человека (или животного);

- наряду с утратой патогенности, должны сохранять иммуногенность, то есть, способность вызывать выраженный иммунный ответ и формировать длительную (на протяжении нескольких лет) иммунологическую память;

- субстрат, на котором готовится вакцинный препарат, должен быть безопасен для человека (или животного);

- вакцины должны сохранять стабильность биологических свойств, быть экономичными в производстве.

На сегодняшний день накоплен огромный опыт конструирования иммунобиологических препаратов. За прошедшие два столетия вакцины претерпели большие изменения, пройдя путь от цельновирионных живых аттенуированных и убитых (инактивированных) времен Луи Пастера до современных генно-инженерных и синтетических препаратов. Получены рекомбинантные, субъединичные и синтетические (пептидные) вакцины против ряда наиболее актуальных вирусных инфекций (грипп, вирусные гепатиты, корь и др.) [20, 79, 188]. Проводятся эксперименты по конструированию нуклеиновых вакцин, препаратов на основе иммуностимулирующих комплексов против против гриппа, кори, ВИЧ и других инфекций [35, 61, 140]. Б.Ф. Семеновым и В.В. Зверевым (2007 г.) сформулирована концепция быстрой иммунологической защиты от патогенов, суть которой в стимуляции системы врожденного иммунитета с помощью препаратов, несущих консервативные, присущие только микроорганизмам молекулярные структуры (лиганды) [90].

Для профилактики вирусных инфекций, которые не контролируются методами специфической вакцинопрофилактики, применяются антивирусные препараты и иммуномодуляторы на основе интерферона и его индукторов [28,44].

Тем не менее, »сивые аттенуированные вакцины не утратили своего значения. Принцип получения таких вакцин - ослабление патогенных свойств возбудителя серийными пассажами в отличной от естественного хозяина системе живых клеток - то есть аттенуация вируса за счет возникающих в этом случае host-range мутаций. В результате были получены уникальные по своим свойствам вакцинные штаммы, которые, репродуцируясь в организме привитого, стимулируют все факторы иммунного ответа, включая секреторные антитела и систему врожденного иммунитета.

Такие вакцины экономичны; технологический процесс не требует применения дорогостоящего оборудования или реактивов.

Что касается предложенного нами способа получения вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов-Д» и диплоидной линии клеток «М-22», дополнительная экономия денежных средств достигается в этом случае за счет исключения из технологической цепочки получения первично-трипсинизированной культуры клеток. Ориентировочная расчетная стоимость одной дозы вакцины против краснухи, полученной по предложенному нами методу, составит 27 руб. (в ценах 2008 г.). Использование отечественной вакцины для плановой вакцинации против краснухи в РФ позволило бы экономить около 62 млн. руб. ежегодно.

Помимо экономического, существенным преимуществом штамма «Орлов-Д» является его генетическая близость циркулирующим на территории Росии изолятам, принадлежность атгенуированного и «диких» штаммов вируса краснухи к одному генотипу.

Целесообразность использования для профилактики инфекций эндемичных для той или иной территории инфекционных агентов была подчеркнута, в частности, А.Б. Беловым (2008 г.) [8].

Кроме того, в ходе исследования показана (в пределах использованных методов) безвредность, иммуногенность, протективность, стабильность генетических и биологических свойств штамма «Орлов-Д». Субстрат, на котором он получен - диплоидная линия клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека, «М-22» - тщательно охарактеризован, оценен в отношении безопасности применения при аттестации указанной линии в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

В целом, результаты исследования свидетельствуют о перспективности использования штамма «Орлов-Д» как кандидата в вакцинные для профилактики краснухи на территории Российской Федерации.

Выдающийся русский гигиенист Ф.Ф. Эрисман в 1875 году писал: ".История дает нам надежду, что благодаря всеобщему распространению образования, улучшению социальных условий и развитию науки удастся все более и более оттеснить на задний план господствующие эпидемические болезни, а может быть, и вовсе освободить от них род челолвеческий".

Более чем столетие спустя другой выдающийся российский ученый, В.Л. Черкасский (2003 г.) отметил, что «.Проблема ликвидации инфекций оказывается гораздо более сложной, чем это представлялось в шестидесятые годы XX века, когда здравоохранение и эпидемиологическая наука считали реальной быструю ликвидацию целого ряда инфекций.».

Действительно, опыт ликвидации, в частности, полиомиелита, программа ликвидации кори и профилактики СВК демонстрируют справедливость этого высказывания. Адаптационная изменчивость микроорганизмов в период специфической профилактики инфекционных болезней выдвигает все новые задачи в области надзора и контроля за инфекциями.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Лаврентьева, Ирина Николаевна, Москва

1. Алыитейн, А.Д. Вирусная инфекция клеток и клеточных популяций / А. Алыптейн // Общая вирусология: М. Медицина, 1982. Т.1. - С. 260 -291.

2. Анджапаридзе, О.Г. Краснуха / О.Г. Анджапаридзе, Г.И. Червонский. -Москва., 1975. 102 с.

3. Анджапаридзе, О.Г. Сероэпидемиология краснухи в СССР / О.Г Анджапаридзе, Р.Г. Десятскова, Г.И. Червонский и др.// Вопросы вирусологии. 1972. - Т. 4. - С. 402 - 158.

4. Анджапаридзе, О.Г. Изучение иммунитета к краснухе среди женщин детородного возраста / О.Г. Анджапаридзе, Г.И. Червонский, Р.Г. Десятскова // Специфическая профилактика кори: сб. науч. трудов. Л., 1970.-С. 274- 275.

5. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л., 1962. - С.

6. Бектемиров, Т.А. Успехи вакцинопрофилактики кори, краснухи и эпидемического паротита за рубежом / Т.А. Бектемиров // Вакцинация. -2006.-Т. 4 (46).-С. 4-5.

7. Бектемиров, Т.А. Мировой опыт иммунопрофилактики краснухи / Т.А. Бектемиров // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики: информационный бюллетень. 2004. - № 6 (36). - С. 3 - 4.

8. Белов А.Б. Эпидемиологическая интерпретация антигенного разнообразия и его динамики у возбудителей инфекционных агентов / Б А. Белов // Вестник Российской военно-медицинской академии. -2008.- №2(22) С. 35-39.

9. Бест, Д. М. Краснуха / Д. М. Бест // Врожденные перинатальные и неонатальные инфекции. Пер. с анг. -М., 2000. С. 192 - 204.

10. Биология вирусов животных / Б. Феннер, С. Мак Ослин, С. Миме и др.: пер. с англ. М.: Мир, 1977. - Т.2 - с. 63.

11. Бичурина, М.А. Итоги сертификации ликвидации полиомиелита на территориях Северо-Западного федерального округа России: аналитический обзор / М.А. Бичурина, Л.В. Лялина, Н.И. Романенкова, Н. Р. Розаева. Спб., 2003. - 80 с.

12. Бойчук, Л.М. Общие закономерности аттенуации вируса кори / Л.М. Бойчук, A.A. Смородинцев, Л.Ю. Тарос // Проблема ликвидации кори: сб. трудов НИИЭМ им. Пастера. Л., 1968. - с. 11.

13. Брико, Н.И. Критерии оценки эффективности вакцинации / Н.И. Брико // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики: информационный бюллетень. 2000. - Т. 6. - С. 3 - 5.

14. Васильева, Г.А. Разработка ассоциированного препарата против кори и паротита / Г.А Васильева, Е.А. Слатин // Детские вирусные инфекции:тр. НИИЭМ им. Пастера. -Л., 1979. Т. 53. - С. 84 - 89.

15. Вирусология: Пер. с англ. / под ред. Б. Филда, Д. Найпа. М.: Мир, 1989.- Т. 2.-С. 343-360.

16. Гендон, Ю.З. Массовая вакцинопрофилактика гриппа у детей как главный фактор борьбы с эпидемиями гриппа / Ю.З. Гендон // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007,- № 4,- С. 78 - 85.

17. Гендон, Ю.З. Генетика вирусов человека и животных / Ю.З. Гендон. М.: Наука. Гендон Ю.З. Генетика вирусов человека и животных / М.: Наука, 1967.-343 с.

18. Десятскова, Р.Г. Лабораторная диагностика краснухи / Р.Г. Десятскова, H.H. Мальцева, С.Л. Ведунова, М.С. Рахимова // Краснуха. Синдром врожденной краснухи: информационный сборник. — М,- СПб: Pasteur MerieuxConnaught, 1997. -С. 17-24.

19. Десятскова, Р.Г. Краснуха: биология вируса, сероэпидемиология и перспективы вакцинопрофилактики в СССР: автореф. дисс. . д-ра мед. наук / Р.Г. Десятскова. М., 1978. - 48 с.

20. Десятскова, Р.Г. Сравнительное изучение антигенных связей между штаммами вируса краснухи в обычной и кинетической РТГА / Р.Г. Десятскова//Вопросы вирусологии. 1974,- №2 - С. 165 - 169.

21. Детская смертность (тенденции, причины и пути снижения)/ Под ред. A.A. Баранова, В.Ю. Альбицкого М., 2001. - С. 21 - 95.

22. Ершов, Ф.И. Новое поколение препаратов для профилактики вирусных инфекций / Ф.И. Ершов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2007. № 4 С. 100 - 103.

23. Жебрун, А. Б. Проблемы контроля инфекционных заболеваний / А. Б. Жебрун, Лялина Л.В. СПб.: «Русь», 2003 - С. 205.

24. Заргарьянц, А.И. Актуальность вакцинопрофилактики краснухи / А. И. Заргарьянц, Т. С. Селезнева, Н.С. Титова, М.В. Сухинин и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002.-№3,- С. 16 — 20.

25. Зайцев, В.М. Прикладная медицинская статистика / В.М. Зайцев, В.Г. Лифляндский, В.И. Маринкин // СПб: Фолиант, 2003. 432 с.

26. Зверев, В.В. Изменчивость штаммов вируса краснухи, циркулирующих в г. Москве / В.В. Зверев, Р.Г. Десятскова, В.Р. Ярулин и др. //

27. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: сб. науч. тр. РМАПО ГОУ ВУМЦ МЗ РФ. М., 2002. - Выпуск 5. - С. 154- 158.

28. Зверев, В.В. Корь. Молекулярная генетика возбудителя, эпидемиология, специфическая профилактика / В. В. Зверев, С.Г. Маркушин, Н.В. Юминова. Санкт- Петербург: Издательство С.-Петербургского университета, 2004. - 109 с.

29. Зенг ДЛ (Zheng D.-P.) Особенности генотипов вируса краснухи, циркулирующих в России / D. P. Zheng, В.Р. Ярулин, В.В. Зверев, Ю.Ю. Ильясов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2005,- №6.-С. 19-23.

30. Иммунопрофилактика инфекционных болезней. Экономическая эффективность вакцинопрофилактики. МУ. 3.3. 1878 04 - М., 2004. -18 с.

31. Иммунопрофилактика 2005 / Под ред. В.К. Таточенко, H.A. Озерецковского. - М., 2005. - С. 61 - 65.

32. Инфекционная заболеваемость в Северо-Западном регионе России: аналитический обзор / Под ред. А.Б. Жебруна. СПб.: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.- 1998. - С. 13-15.

33. Канторович, P.A. Эпидемиологические и иммунологические исследования краснухи на севере СССР / P.A. Канторович // Вопр. вирусол. 1980. - №2.-С. 191-195.

34. Канторович, Р. А. Врожденная краснуха в СССР / P.A. Канторович, Н.И. Воеводина, Э.А. Телешевская //Материалы бюллетеня ВОЗ. 1979. -Т. 57.-С. 445-452.

35. Киселев О.И. Новые подходы к конструированию антивирусных препаратов. / О.И. Киселев, Э.Г. Деева, A.B. Слита // Экология человека. 1999.- №4.-С. 18-20.

36. Краснуха. С.С. Семериков, И.Н. Лаврентьева, В.К. Таточенко, Л.Л. Нисевич, И.В. Фельдблюм // Пермь СПб.- Москва, 2002. - 174 с.

37. Краснуха и синдром врожденной краснухи в развивающихся странах: выбор стратегии по контролю (Расширенная программа иммунизации, глобальная консультативная группа) / EPI GAG. Анталия, Турция. — 1991.- 15 С.

38. Краснуха и синдром врожденной краснухи: информационный сборник. -М,- СПб.: Pasteur Merieux Connaugth. 1997. - 64 с.

39. Краснуха: протокол лечения и программа профилактики / О повышении эффективности диагностики, лечения и профилактики краснухи: информационное письмо МЗ РФ № 13-01/8-96 от 29.09.1997,- М, 1997.- 6 с

40. Лаврентьева, И.Н. Штаммы вируса краснухи для живой аттенуированной вакцины / И. Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, В.З Агрба и др.// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. - № 4 (11). - С. 7 - 10.

41. Лаврентьева, И.Н. Чувствительность клеточных культур к вирусам гриппа А различной вирулентности: автореф. дисс. . канд. мед. наук / И. Н. Лаврентьева Л., 1986 - 21 с.

42. Лазикова, Г.Ф. Проблемы плановой вакцинопрофилактики краснухи в Российской Федерации / Г.Ф Лазикова, Е.Б. Ежлова, А.А. Ясинский, И.В.Михеева // Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей: матер, конгресса. СПб. - 2005. - С. 101 - 102.

43. Лапин, Б.А. Итоги и перспективы медико-биологических исследований на приматах / Б.А. Лапин // БЭБИМ. 1996. - Т. 122. - №9.- С. 245-256.

44. Лопухин, Ю.М. Этико-правовые основы проблемы стволовых клеток и «терапевтического клонирования» / Ю.М. Лопухин // Медицинская кафедра, 2002 №2 - С. 116 - 120.

45. Лыткина, И.Н. Применение живых ассоциированных вакцин для профилактики кори, эпидемического паротита и краснухи: автореф. дис.канд. мед. наук / И.Н. Лыткина. М., 2001. - 23 с

46. Медицинская вирусология / под ред. А.М. Королюка, В.Б. Сбойчакова // СПб.: Элби-СПб., 2002. С. 63 - 68.

47. Мельников, С.Я. Коревые вакцины: новые направления, новые стратегии С.Я. Мельников //Вопр. вирусологии. 1996. - № 2. - С. 35 -41.

48. Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами. Л., 1975. - 43 с.

49. Методические указания: Аттестация перевиваемых клеточных линий субстратов производства и контроля медицинскихиммунобиологических препаратов: РД 42-28-10-89. М.: МЗ СССР, 1989. -33 с.

50. Методы контроля медицинских иммунологических препаратов, вводимых людям. МУК 4.1/4.2.588-96. М.: Минздрав России, 1998 г. -118с.

51. Мешалова, В.Н. Опыт получения и атгенуации краснушного штамма «Орлов» / В.Н. Мешалова // Респираторные вирусные инфекции: тр. НИИЭМим. Пастера-Л., 1973. Т. ХЬП. - С. 137 - 143.

52. Мешалова, В.Н. Краснушная инфекция в детских коллективах / В.Н. Мешалова, А.К. Русанова // Острые вирусные инфекции у детей: сб. научн. тр. Л., - 1981. - С. 128-132.

53. Мешалова, В.Н. Прививочные свойства краснушной вакцины из штамма «Орлов» / В.Н. Мешалова, Е.А. Жукова, А.Н. Степанов, Е.А. Брусина // Детские вирусные инфекции.: тр. института Пастера. Л., 1979. - Т.53. - С.112 - 115.

54. Михеева И.В. Иммунострукгура к краснухе детей второго года жизни / И.В. Михеева, И.Н. Лыткина, К.И. Чекалина и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: сб. науч. тр. РМАПО ГОУ ВУМЦ МЗ РФ. М., 2002. - Выпуск 5. С. 209 - 211.

55. Нисевич, JI.JI. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети / JI.JI. Нисевич, А.Г. Талалаев, JI.H. Каск и др. // Вопросы современной педиатрии. 2002. - № 4. - С. 9 - 13.

56. Нисевич, Л.Л. Значение различных вирусных инфекций в не вынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смертности /Л.Л. Нисевич, А.Г. Талалаев, Л.Н. Каск // Педиатрия. -1999.- № 1. С. 1-10.

57. Нисевич, Л.Л. Клинические проявления врожденной краснухи / Л.Л. Нисевич, Е.В. Бахмут, A.M. Миракилова // Педиатрия. 1992. - № 10.- С. 6-11.

58. Нисевич, Л.Л. Роль вируса краснухи в развитии внутриутробной патологии новорожденных. / Л.Л. Нисевич, Е.В. Бахмут, // Вопр. охраны материнства и детства . 1992. - Т. 9. - С. 25 - 29.

59. Нифонтова, АН. Изучение биологических свойств и условий производственного обогащения вируса краснухи: автореф. дис. . канд. мед. наук / А.И. Нифонтова Л. - 1974. - 23 с

60. Носков, Ф.С. Изучение прививочных свойств краснушного атгенуированного штамма «Орлов» / Ф.С. Носков, В.Н. Мешалова, Ал. А. Смородинцев // Отчет НИИЭМим. Пастера о НИР №68.- № Гос. регистации 78058118. Л., 1979. - 16 с.

61. Носов, С.Л. Краснуха: Руководство по инфекционным болезням у детей М., 1980.-С. 196-206.

62. Общая и частная вирусология / под ред. В.М. Жданова, С.Я. Гайдамович. М.: Медицина, 1986. - т. 2. - С. 49 - 95.

63. Оншценко, ГГ. Тетравакцина новый подход к предотвращению пандемии гриппа / ГГ. Оншценко, В.В. Зверев, АВ. Кашинский и др. // Журнал микробиологии; эпидемиологии и иммунобиологии, 2007,- № 4.- С.15-19.

64. Оншценко, Г.Г. От редакции / Г.Г. Оншценко // Вакцинация. 2006. -4 (46).-С. 2-3.

65. Оншценко, Г.Г. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2001 году / Г.Г. Оншценко // Государственный доклад. Москва. - 2002. - 160 с.

66. Перечень отечественных и зарубежных вакцин против кори, эпидемического паротита и краснухи, зарегистрированных в Российской Федерации // Вакцинация. 2006. - Т. 4 (46) - С. 9.

67. Петрова И.Д. Клиническое, серологическое и молекулярно-биологическое исследование краснухи в Новосибирске в 2006 году/ И.Д. Петрова Е.В. Казаева, Е.М. Малкова и др. // Инфекционные болезни. 2007. - № 3. - С.16 - 19.

68. Попов, В.Ф. Иммунологическая эффективность новой паротитно-коревой вакцины в практике здравоохранения России / В. Ф. Попов, В.

69. М. Колышкин, Н.В. Юминова и др .//Ликвидация и элиминация инфекционных болезней прогресс и перспективы: материалы междун. конгресса- СПб, 2003. - С. 12.

70. Ратнер, Г.Б. Периодичность и сезонность детских инфекций в Московской области / Г.Б. Ратнер // Детские инфекции: тр. ин-та эпидемиол., микробиол., инфекционных болезней им. Мечникова. М., 1951. - Выпуск 5. - С.279 - 286.

71. Руководство по организации эпидемиологического надзора за корью и врожденной краснушной инфекцией в Европейском регионе ВОЗ/ Женева. 2003.-80 С.

72. Русанова, А.К. Эпидемиологическая характеристика краснухи в условиях крупного города: автореф. дис. . канд. мед. наук / А.К. Русанова. Л, - 1981. - 15 с.

73. Санитарные правила: Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов /СП 3.3.2.561 -96. М.: Минздрав России, 1998. 127 с.

74. Сейбиль, В.Б. Коллективный иммунитет к полиомиелиту у взрослого населения и его влияние на ликвидацию этой инфекции /В.Б. Сейбиль, Л.П. Малышкина, И.К. Лаврова, В. Ф. Ефимова // Вопросы вирусологии.- 2007.- Т. 3.-С. 44-47.

75. Семенов, Б.Ф. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов / Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - № 4. — С. 93 - 100.

76. Семенов, Б.Ф. Новые положения концепции вакцинопрофилактики детских инфекций / Б.Ф. Семенов // Аллергология и иммунология. -2002. № 3. - С. 380 - 384.

77. Семенов, В.М. Диагностика краснушной инфекции у беременных женщин / В.М. Семенов, К.С. Азаренок, Т. И. Дмитриченко, С. В.

78. Жаворонок // Лаб. дело. 1999. - Т. 6. - С. 69 - 72.

79. Семериков, В.В. Оптимизация системы эпидемиологического надзора и контроля за краснушной инфекцией: автореф. дис. . докт. мед наук. -Пермь. 2007. - с.47.

80. Семериков, В.В. Серологический мониторинг как основа эпидемиологического надзора за краснушной инфекцией: автореф. дис. канд. мед. наук / В.В.Семериков. Пермь, 1995. - 18 с.

81. Семериков В.В. Сероэпидемиологические исследования в системеэпидемиологического надзора за краснухой / В.В. Семериков, А.Я. Колобов, Ю.П. Рыкушин и др. //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: матер, междунар. конф. СПб., 1995. - С. 25.

82. Серия технических докладов ВОЗ. № 28. Женева, 1980. - 127 с.

83. Слатин, Е. А. Опыт крупносерийного производства живой ассоциированной паротитно-коревой вакцины / Е. А. Слатин, Г.А. Васильева, С.Г. Пейсель и др.// Детские вирусные инфекции: тр. НИИЭМ им. Пастера. -Л., 1979. Т. 53. - С. 89 - 94.

84. Смородинцев, A.A. Опыт изучения живой вакцины против краснухи в ассоциации с живыми вакцинами против кори и паротита / A.A. Смородинцев, М.Н. Насибов, Н.В. Яковлева и др. // Бюллетень ВОЗ.1971.- Т.42.-№2.-С. 287- 292.

85. Таточенко, В.К. Политика ВОЗ в отношении вакцинации против краснухи / В.К. Таточенко // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики: информационный бюллетень. -М.,1999. — Т. 1. -С. 8.

86. Филатов, H.H. Социально-гигиенический мониторинг и эпидемиологический надзор в условиях Москвы / H.H. Филатов, И.Л.Шаханина, Н.И. Брико. М., 2001. - С. 146 - 151.

87. Цвиркун, О.В. Характеристика эпидемического процесса краснушной инфекции на современном этапе / О.В. Цвиркун, О.О. Чава, А. Г. Герасимова, Е.Б. Ежлова // Теоретические и практические аспекты элиминации кори: сб. науч. тр. М., 2005. - С. 157-159.

88. Цилинский, Я. Я. Общая и частная вирусология. М.: Медицина, 1982. - Т. 1.-С. 248.

89. Червонский, Г.И. Некоторые вопросы сероэпидемологии и вакцинопрофилактики краснухи: автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1971.-25 с.

90. Шаханина, И. А. Стандартные величины экономического ущерба,наносимого инфекционными болезнями / И.А. Шаханина, JI.A. Осипова // Эпидемиология инфекционных болезней. 2005. - № 4. - С. 20-24.

91. Экономическая эффективность вакцинопрофилактики. Методические указания. МУ.3.3.1878-04.М., Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. 2004. - 24 с.

92. Юминова, Н.В. Комбинированные вакцины против кори, краснухи и эпидемического паротита / Н.В. Юминова // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики: информационный бюллетень. 2006. - Т. 6. - С. 7-9.

93. Юминова, Н.В. Диагностика краснухи в Российской Федерации / Н.В. Юминова // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики: информационный бюллетень. 2004. - Т. 6 (36). - С. 3 - 6.

94. Юминова, Н. В. Научные основы совершенствования вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита: автореф. дисс. . д-ра биолог, наук / Н. В. Юминова. М., 1998. -44 с. 1

95. Яшина, J1.H. Анализ геномов изолятов вируса краснухи из двух вспышек 2004 2006 гг. в Западной Сибири / Л.Н. Яшина, Г.И. Тюников, И.Д. Петрова и др.// Вопросы вирусологии. - 2000. - № 2 - с. 16 - 19.

96. Badilla, X. Fetal risk associated with rubella vaccination during pregancy / X. Badilla, A. Morise, A. Avila-Aguego, et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. -2007. V. 26 (9). - P. 830 - 835.

97. Banatlava, J. E. Rubella / J. E. Banatlava, D.W. Brown // Lancet. 2004. -V. 363.- P. 1127-1137.

98. Beach, M. D. Rubella virus infection depended С and p32 protein related/ M. D. Beach, Т. C. Hodman // J. Virol. 2000. - V. 74. P. 5569 - 5576.

99. Bernasconi, E. Cell surface expression of functional rubella virus El glycoprotein by addition of a GPI anchor / E. Bernasconi, N. Fasel, R. Wittek // J. Cell Science, 1996. V. 109. - P. 1195 - 1201.

100. Best, J. M. Rubella virus srtains show no major antigenic differences / J. M. Best, A. Thompson, J.R. Nores, O'Shea, J. E. Banatvala // Intervirology. -1992. V. 34. - P. 164 - 168.

101. Best, J. M. Rubella vaccines: past, present and future/ J. M. Best // Epidemiol. Infect. 1991. - V.107. - P. 17 - 30.

102. Best J. M., Banatlava J.E. In: Principles and Practice of Clinical Virology.- 1990.- P. 337-374.

103. Best, J. M. Congenital Rubella Affecting in Infant Whose Mother Had Rubella Antibodies before Conception./ J. M. Best, G. Harcount, J. E. Banatlava // Brit. Med. J. 1981. - V. 282. - P. 1235 - 1244.

104. Bloom, B.R. Vaccine Visions and Their Global Impact / B.R. Bloom, R. Widdus // Nature Medicine. Vaccine Supplement. 1998. - Vol. 4. - P. 480- 484.

105. Blouse, L. E. Rubella Screening and Vaccination Program for U. S. Air Force Trainees: an Analysis and Findings / L. E. Blouse, G. D. Lathrop, H.

106. J. Dupuy, R. J. Ball // Am. J. Publ. Health. 1982. - V. 72. - P. 280 - 283.

107. Bohn, E.M. The Generation of detective interfering virus particles / E. M. Bohn, D. Van Alstyne //Virology. 1981. - V.l 11. - P. 549 -554.

108. Bonatti, S. Restricted initiation of protein synthesis on the potentially polycitronic Sindbis virus 42S RNA / S. Bonatti, N. Sonenberg, A.J. Shatkin , D. Cancedda // J. Biol. Chem. 1980. - V. 255. - P. 11473 - 11477.

109. Boshia, T.Y. Nucleotide sequence analysis of a major antigenic domain of the glycoprotein of 22 rubella virus isolates / T.Y. Boshia, J.M. Best, K.M. Corbett, J.E. Banatlava, W.G. Starkey // J. Gen Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 2523-2530.

110. Boshia, T. J. PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples / T. J Boshia, K. M. Corbett, S. O'Shea, J. E .Banatlava and J. M. Best // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33 (3) - P. 1075 - 1079.

111. Brabdling-Bennett, A.D. Serological response to revaccination with two rubella vaccines/A.D. Brabdling-Bennett, S. Jackson, B. Halstead et al. //Am. J. Dis. Child. 1976. - V. 130. - P. 1081 - 1084.

112. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for detection rubella virus antibody / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248 - 254

113. Buzas, K. Rubella virus infection dysregulatates the pattern of p63 expression / K. Buzas, A. Miczak, M. Degre, K. Megyeri //APMIS 2004. -V. 112.-№10.-P. 656-662.

114. Centers for Disease Control. Revised ACIP recommendation for avoiding pregnancy after receiving a rubella-containing vaccine. MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 2001. - V. 50. - 1117 p.

115. Chaye, H. H. Localization of the virus neutralising and hemagglutinin epitopes of El glycoprotein of rubella virus/ H. Chaye, P. Chong, B. Tripet, B. Brush , S. Gillam // Virology. 1992. - V. 189. - P. 483 - 492.

116. Chaye, H.H. Cellurar and humoral immune responses to rubella virus structural proteins El, E2 and C / H.H. Chaye, C.A. Mauracher, A.J. Tingle, S. Gillam // J.Clin. Virol. 1992. - V. 30,- № 9. - P. 2323 - 2329.

117. Chen, M. H. Rubella virus capsid protein modulates viral genome replication and virus infectivity / M. H. Chen, J. P. Icenogle // J.Virol. -2004,- V. 78,- №8.-P. 4314-4322.

118. Cherry, J.D. The «new» Epidemiology of Measles and Rubella / J. D. Cherry // Hosp. Practice. 1980. - V. 15. - P. 49 - 57.

119. Coombes, B.C. Erett evasive maneuvers bacterial proteins to avoid innate immune responser / B.C. Coombes, Z. Y. Vaide, B. Finlay // Carrent. Biol., 2004.- V. 14.- P. 856- 867.

120. Cooray, S. Improved RT-PCR for diagnosis and epidemiological surveillance of rubella / S. Cooray, L. Warrener, L. Jin // J.Clin. Virol. -2006. V. 35 (1). - P. 73 - 80.

121. Cooper, L.Z. Congenital Rubella in the United States. In: Krugman S. Gershon A.A. (eds), Infections of the Fetus and New-born Infant // Progress in Clinical and Biological Research, New York: Alan R. Liss., 1975.-V. 3.-P. 1-21.

122. Cooper, L.Z. Clinical Manifestations of Postnatal and Congenital Rubella / L.Z. Cooper, S. Krugman // Arch. Ophthalmol. 1967. - V. 77. - P. 434- 439.

123. Corboba, P. Neutralizing monoclonal antibody to the El glycoprotein epitope of rubella virus mediates virus arrest in vero cells / P.Corboba, S. Grutadauria, C. Cuffini, M. Zapata // Viral. Immunol. 2000. - V. 13 (1). -P. 83-92.

124. Cradock-Watson, J.E. Laboratory diagnosis of rubella: past, present and future // Epidemiol. Infect. 1991. - V. 107. - P. 1 - 17.

125. Gradok-Watson, J.E. Fetal infection resulting from maternal rubella after first trimester of pregency/ J.E. Gradok-Watson, M. K. Ridehalgh, M. J. Anderson, J.R. Patisson // J.Hyg (London). 1980. - V. 85. - P. 381 -391.

126. Cremer, N. E. Improved Serological Diagnosis of Rubella / N. E. Cremer, S. J. Hagens, R. Fukuchi // J. Clin. Microbiol. 1983. - V. 18. -P. 743 -744.

127. Crowder, M. Rubella Susceptibility in Young Women of Rural East Texas: 1980 and 1985 / M. Crowder, H. L. Higgins, J,J. Frost // Tex. Med. 1987. - V. 83. - P. 43 - 47.

128. Curts, F.T. Control of rubella and congenital rubella syndrome (CRS) in developing countries, part 1: burden of disease from CRS./ F.T. Curts, S. E. Robertson, R. Samuel, J. L. Diaz-Ortega // Bull. World Health Organ. -1997.-V. 75.-P. 55-68.

129. Cusi, M. G. Immune responses to wild and vaccine Rubella / M. G. Cusi, R. Metelli, P.E. Valensin // Arch Virol. 1989. - V. 106. - P. 63-72.

130. Dales, L. G. An Outbreak of Congenital Rubella / L. G. Dales, J. Chin // West. J. Med. 1981. - V. 135. -P. 266-270.

131. Davidkin, I. Vaccine-induced Measles Virus Antibodies After Two-Doses of Combined Measles, Mumps and Rubella Vaccine: a 12-Year Follow-up in Two Cohorts /1. Davidkin, M. Valle // Vaccine. 1998. - V. 16- P. 2052-2057.

132. Dominguez, C. Sequence of the genome RNA of rubella virus: evidence for genetic rearrangement during togavirus evolution / C. Dominguez, C. Y. Wang, T. K. Frey // Virology, 1990. № 177. - P. 225 - 238.

133. Dorfmann, S. F. Rubella Susceptibility among Prenatal and Family Planning Clinic Population / S. F. Dorfmann, C. H. Jr. Bowers // Mt. Sinai J. Med. 1985. - V. 52. - P. 248 - 252.

134. Doster, S. W. Measles and Rubella: Our remaining Responsibilities / S. W. Doster, H. C. Stetler, W. A. Orenstein, et al. //Am. J. Publ. Health. -1983.- V. 73.-P. 490-492.

135. Enders, G. Fetal Infections. In: Prenatal- and Geburtsmedizim: DCM Drug Center. 1998. - P. 76-82.

136. Forng, R. Y. Mutations in the retinoblastoma protein-binding LXCXE motiv of rubella virus putative replicase affect virus replication / R.Y. Forng, C.D. Atreya// J. Gen. Virol. 1999- V. 80.-P. 327-332.

137. Forng, R.Y. Identification of the Rubella Virus Nonstructural Proteins/ R. Y. Forng and T. K. Frey // Virology. 1995. - V. 206. - P. 843 - 853.

138. Freestone, D.S. General Review of clinical trials of rubella vaccines/ D.S Freestone // Postgrad Med. J. 1972. - July: suppl. 3. - P. 30 - 34.

139. Frey, T. K. Molecular biology of rubella virus / T.K. Frey // Adv. Virus Res. 1994. - V. 44. - P. 69 - 160.

140. Fundamental Virology // Chief Edition B. N. Fields, D.M. Knipe , N.Y., 1989.- V.2.-P. 344-346.

141. Furesz, J. A Micro Tissue 124 Culture Test for Titration and Neutralization of Rubella virus/ J. Furesz, P. Moreau, W.A. Varosli// Can. J. Microbiol.- 1969. V. 15.- P. 67 - 71.

142. Galazka, A. Rubella in Europe / A. Galazka // Epidemiol. Infect. 1991. -V. 107.- P. 43-54.

143. Garbutt, M. Secretion of Rubella Virions and virus- like particles in cultural epithelial cells / M. Garbutt, H. Chan and T. C. Horban // Virology.-1999.- V. 261.-P. 340-346.

144. Garbutt, M. Role of rubella virus domains in assembly of virus-like particles / M. Garbutt, L. M. Law, H. Chan and T.C. Horban //J. Virol. 1999.-V. 73.-P. 3524-3533.

145. Gradok-Watson, J.E. Fetal infection resulting from maternal rubella after first trimester of pregency/ J.E. Gradok-Watson, M. K. Ridehalgh, M. J. Anderson, J.R. Patisson // J.Hyg (London). 1980. - V. 85. - P. 381 - 391.

146. Gregg, N. M. Congenital Cataract Following German Measles in the Mother/ N. M. Gregg // Trans. Ophthal. Soc. Australia. 1941. - V. 3. - P. 35-46.

147. Halonen, P.E. Rubella hemagglutinin prepared with alkaline extraction of virus grown in suspension culture of BHK 21 cells/ P.E. Halonen, J.M. Ruan, J.A. Steward // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). 1967. - V. 125. - P. 162-167.

148. Harcourt, G. C. HLA antigen and responses to rubella vaccination/ G. C. Harcourt, J. M. Best, J. E. Banatlava, L.A. Kennedy // J. Hyg. (Lond.) -1979.-V. 83.-P. 405-412.

149. Helenius, A. Alphavirus and flavivirus glycoproteins: structures and functions /Cell. 1995.- V. 81,- P. 651 -653.

150. Hemmila, I. Time-resolved fluorometric immunoassays /1. Hemmila, G. Lanthanides // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1988. - V. 48. - P. 389 - 400.

151. Herrmann, K. L. Rubella in the United States / K.L. Herrmann. // Epidemiol. Infect. 1991. - V.107. - P. 55-61.

152. Hofmann, J. Phylogenetic analysis of rubella virus including new genotype I isolates /J. Hofmann, M. Renz, S. Meyer, A. von Haeseler, U.G. Liebert // Virus Res. 2003. - V. 96. - P. 123 - 128.

153. Horban, T. C. Processing and intracellular transport of rubella virus structural proteins in COS cells / T. C. Horban, M. L. Lundstrem, S. Gillam//Virology.- 1990.-V. 78.-P. 122-133.

154. Horstmann, D.M. Rubella: The Challenge of its Control / D.M. Horstmann //Rev. Infect. Dis. 1971. - № 123. - P. 640 - 654.

155. Horstmann, D. M. The use of primates in experimental viral infections-rubella and the rubella syndrome / D. M. Horsmann // Ann. N.Y. Asad. Sci. 1969. - V. 162. - P. 594 - 597.

156. Horban, T. C. Processing and intracellular transport of rubella virus structural proteins in COS cells / T. C. Horban, M. L. Lundstrem, S. Gillam // Virology. 1990.-V. 78.-P. 122-133.

157. Ho-Terry, L. Diagnosis of fetal rubella virus infection by polymerase chain reaction / L. Ho-Terry, G.M. Terry, P. Londesborough // J. Gen.Virol.- 1990.-V. 71.- P. 1607-1611.

158. Horvant, L. Rubella antibody screening / L. Horvant, W. Lebar // Abstr. Annu. Meet. Soc. Microbiol. 87-th Atlanta; Washington, 1987. P. 364

159. Hudson, P. Evaluation of 15 commercial enzyme immunoassays for the detection of rubella-specific IgM / P. Hudson, P. Morgan-Capner // Clin. Diagn Lab. Immunol. 1996. - V. 5. - P. 21 - 26.

160. Huppertz, H. E .Susceptibility of normal human joint tissue to viruses/ H. E. Huppertz, N. P. Nancy, J. K. Chantler // Rheumatol. 1991. -V.18. - P. 699-704.

161. Hyoty, H. The role of viruses in human diabetes / H. Hyoty, K.W.Taylor // Diabetologia. 2002. - V. 45. - P. 1353 - 1361.

162. Huygelen, C. Attenuation of rubella virus by serial passage in primary rabbit kindey cell culture . H Experiments in animals / C. Huygelen, J. Peetermans // Arch, fur Virusforsch. 1967. - V. 21. - P. 357 - 365.

163. Ingalls, T.N. Rubella: Epidemiology, Virology and Immunology / T.N. Ingalls, S.A. Plotkin, H.M. Meyer, P.D. Parkman // Am. J. Med. Sci. 1967,- V.253.-P. 349- 373.

164. Institute of Medicine. Adverse Effects of combination rubella vaccines. Washington: National Academy Press, 1991 113 P.

165. Jerry, S. An Antibody- and Synthetic Peptide-Defmed Rubella Virus El Glycoprotein Neutralization Domain / S. Jerry, E. Sukholutsky, W. Moore, Lovett, M. McCarthy, B. Adame // J. Virol., 1993. № 78. - P. 961 - 968.

166. Katow, S. Molecular epidemiology of rubella by nucleotide sequences of the rubella virus El gene in three East Asian Countries / S. Katow, H. Minahara, M. Fukushima, Y. Yamaguchi // J. Infect. Dis. 1997. - V. 176.- P. 602- 616.

167. Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences / M. Kimura // J. of Molecular Evolution. 1980. - V. 16. - P. 111 - 120.

168. Koboyashi, N. Agar-Disc Neutralization Test for Rubella Virus /N. Koboyashi, H. Shibuta, M. Matiimoro // Japan J. Microbiol. 1973. - V. 17,- P.313-316.

169. Koplan, J. P. An Update on the Benefits and Costs of Measels and Rubella Immunization / J.P. Koplan, C.C. White //In: Proceedings of the Symposium «Conquest of Agents that Endager the Brain», Baltimore: Maryland., 1982. P. 28-29.

170. Krochu, E.E. Epidemiological Aspects of Rubella / E.E. Krochu // Epidemiol. Infect. 1972. - V. 1. - P. 267 - 270.

171. Kujala, P. Intracellular Distribution of Rubella Virus Nonstructural Protein 150 / P. Kujala // J. Virol. 1999. - V. 73. - № 9. - P. 7805 -7811.

172. Laboratory investigation of rubella: PHLS monograph series no 16. London: Public Healht Laboratory Service. 1982. - P. 189.

173. Lee, J. Y. Localization of rubella virus core particles in vero cells / J. Y. Lee, J. A. Marshall, D. S. Bowden// J. Virol. 1999. - V. 265 (1). - P. 110-119.

174. Liang, Y. Mutational analysis of rubella virus nonstructural polyprotein and its cleavage products in virus replication and RNA synthesis / Y. Liang, S. Gillam //J. Virol. 2000. - V. 74 (11). - P. 5133 - 5141.

175. Liang, Y. Rubella virus nonstructural protein protease domains involved in trans- and cis-cleavage activities / Y. Liang, J. Yao, S. Gillam // J. Virol. 2000. - V. 74 (12). - P. 5412 - 5423.

176. Lieberman, E. Premarital Rubella Screening in Rhode Island / E. Lieberman, G.A. Faich. P.R. Simon, R.J. Mullan // JAMA. 1981. - V. 245. - P. 1333-1335.

177. Lim, K.O. Brain dysmorphology in adult with congenital rubella plus schizophrenia like symptoms/ K.O. Lim, D.M. Beal, R. L. Harvey, T. Myers, B. Lane, E.V. Sullivan, W. Faustman, A. Pfefferbaum // Biol. Psychiatry. 1995. - V. 37. - P. 764 - 776.

178. Lindegren, M. L. Update: Rubella and Congenital Rubella Syndrome, 1989 -1999 / M. L. Lindegren, L. J. Fehrs, S. C. Hadler, A.R. Hinman // Epidemiol. Rev. 1991. - V. 13. - P. 341 - 348.

179. Marr, L.D. Expression of the rubella virus nonstructural protein OFR and demonstration of proteolytic processing / L.D Marr, C. Y. Wang and T.K. Frey // Virology - 1994. - V.198. - P. 586 - 592.

180. Mastromarino, P. Role of membrane phospholipids in the Vero cell surface receptor for rubella virus / P. Mastromarino, L. Cioe, S. Rieti, N. Orsi // Med. Microbiol. Immunol. 1990. - V. 179. - P. 105-114.

181. Menser, M.A. Rubella High Incidence of Defect in Children Concidered Normal at Birth / M.A. Menser, J. M. Forrest // JAMA. - 1974. -V. l.-P. 123 - 126.

182. Menser, M.A. Persistence of Virus in Lens for Three Years after Prenatal Rubella / M.A Menser, J.D. Harley, R. Hertzberg et al.//Lancet. -1967. V. 2 (7512). - P. 387 - 388.

183. Meurman, O. H. Time- Resolved Fluoroimmunoassay: a New Test for Rubella antibody / O. H. Meurman, I. A. Hemmalia, T. N.-E. Lovgren, P. E. Halonen // J. Clin. Microbiol. 1982. - V. 16 (5). - P. 920 - 925.

184. Morgan-Capneret, L. Hesketh.// Commun. Dis. Rep. CDC Rev. 1997. -V. 7.-P. 26-32.

185. Miller, E. Antibodies to Measles, Mumps and Rubella in UK Children 4 After Vaccination with Different MMR Vaccines / E. Miller, P. Morgan-Capner, T.Forsey, M. Rush // Vaccine. 1995. - V. 13 (9). - P. 799 - 802.

186. Miller, C.L. Rubella in Developing World / C. L. Miller // Epidemiol. Infect. 1991.-V. 107.-P. 63-68.

187. Miller, E. Measles, Mumps and rubella: Present and future immunization/ E. Miller // Hoi. Pub. Hlth. 1988. - V. 102. - P. 315 -327.

188. Miller, E. Consequences of Confirmed Maternal Rubella at Successive Stage of Pregnancy / E. Miller, J.E. Cradock Watson, T.M. Pollok // Lancet. - 1982. - V. 2. - P. 781 - 784.

189. Mitchell, L.A. HLA-DR Class II association with rubelles vaccine induced joint manifestations / L.A. Mitchell, A.J. Tingle, L. McWilliam et al. // J. Infect. Dis. 1998. - V. 177. - P. 5 - 12.

190. Modlin, J. E. Surveillance of Congeninal Rubella Syndrome 1969 -1973 / J. E. Modlin, A. D. Brandling Bennett // Rev. Infect. Dis. - 1974. -V. 130. -P. 316-318.

191. Morgan-Capner, P. Rubella / P. Morgan-Capner // In: Jeffries D.J., Hudson C.N. (eds), Viral Infections in obstetrics and gynecology. London: Arnold., 1999. -P. 15-32.

192. Morgan-Capner, P. In: ELISA in the Clinical Microbiology Laboratory // Am. J. Publ. Health., Laboratory Service (London). -1990.- V. 19. P. 49-60.

193. Morgan-Capner, P. Detection of rubella specific IgM in vaccination/ Morgan-Capner, P. J. Hodgson, M.N. Hamblin et al.// Lancet. 1985 - V. l.-P. 244-246.

194. Nakhasi, H. Rubella virus: mechanism of attenuation in the vaccine strain (HPV77) / H. Nakhasi, D. Zheng, L. Callahan et all // Virus Res., 1989.- №13.-P. 231-243.

195. Neri, P. Structure and antigen activity of rubella-El glycoprotein synthetic peptides / P. Neri, M. Corti, L. Lozzi, P. Valensin // Biopolimers, 1991.- №31.-P. 631 -635.

196. Norrby, E. Rubella virus / E. Norrby // Virol. Monogr. 1994. - V. 7.- P. 115-174.

197. Ojala, K. Expression and trafficking of fluorescent viral membrane proteins in baculovirus-transduced BHK cells / K. Ojala, P. Tikka, L. Kautto, P. Kapyla, V. Maijomaki, C. Oker-Blom // J. Biotechnology. -2004. V. 114 (1-2). - P. 165 - 175.

198. Oker-Blom C. Baculovirus polyhedron promoter-directed expression of rubella virus envelope glycoproteins, El and E2, in Spodoptera frugiperda cells / C. Oker-Blom, R. F. Petterson, M. D. Summers //Virology. 1989-V. 172(1).-P. 82-91.

199. O'Shea, S. A lymphocyte transformation assay for the diagnosis of congenital rubella / S. O'Shea, J. M. Best, J. E. Banatlava // J. Virol. Methods. 1992. - V.37. - P. 139 - 147.

200. O'Shea, S. Persistence of rubella antibody 8 to 18 years after vaccination/ O'Shea, J.M. Best, J.E. Banatlava, W.C. Marshall // Brit. Med. J. -1981. V.288. -P.1043 - 1049.

201. Pappas, C. L. Evaluation of cis-acting elements in the rubella virus subgenomic RNA that play a role in its translation / C. L. Pappas, W. P. Tzeng, T. K. Trey //Arch Virol. 2006. - V. 151. - P. 327 - 346.

202. Parkman, P.D. Prospects for a mbella-virus vaccine/P.D. Parkman, H.M. Mever. // Progr. Med. Virol. 1969. - V. 11. - P. 80 - 160.

203. Parkman, P.D. Attenuatted rubella virus I. Development and Laboratory characterization / P.D. Parkman, H. M. Meyer, B. L. Kirschtein // N. Engl. J. Med. 1966. - V. 275. - P. 579 - 574.

204. Peuvot, J. A. Are the fussion processes involved in birth. Life and death of the cell depending on tilted insertion of peptides into membranes? / J. A. euvot, L. Schanck, L. Linds, and R. Brasseur // J. Theoretic Biol. 1999. -V. 198.- №2,- P. 173-181.

205. Plotkin, S. A. A new attenuated rubella virus grown in human fibroblasts: evidence for reduced nasopharyngeal excretion / S. A. Plotkin, J. Farquhar, M. Katz, T. H. Ingalls //Am. J. Epidemiol. 1967. - V. 86. - P. 468 - 477.

206. Pope, D. The detection of defective interfering rubella virions by amodified hemadsornsion technique / D. Pope, E. Bohn, D. Alstyne // Clin. Invest. Med. 1983. V. 6. - P. 79-83.

207. Popov, V.F. Epidemiological, Microbiological and Clinical Problems of Aerosol and Intestinal Infection / V.F. Popov // Immunogen. 1996. - V. 1. -P. 21-24.

208. Popov, V.F. Preparation for Specific Prophylactics and Diagnostics of Measles, Parotitis and Rubella / V.F. Popov, T.N. Junasova, O.P. Kaplunova et al.//Vopr. Virusol. 1993. - № 2. - P. 29

209. Preblud, S. R. Some Issues Relating to Rubella Vaccine/ S. R. Preblud // JAMA. 1985. - V. 254. - P. 253 - 256.

210. Proceeding of the international Conference of Rubella Immunization. -Am. J. Dis. Child. 1969. - P. 118.

211. Reef, S.E. The changing epidemiology of rubella in the 1990s: on the verge of elimination and new challenges for control and prevention/ S.E. Reef, T. . Frey, K. Theall, E. Abernathy, C. L. Burnett, J. Icenogle // JAMA. 2002. -V. 287,- P. 464-472.

212. Rice, C.M. Isolation and characterization of the hydrophobic COOH-terminal domains of the sindbis virion glycoproteins / C.M. Rice, J. R.

213. Bell., M. W. Hunkapiller., E. G. Strauss // J. Mol. Biol. 1982. - V. 154(2).- P. 355-378.

214. Robinson, J. Congenital Rubella after Anticipated Maternal Immunity: Two Cases and Review of Literature / J. Robinson, M. Lemay, W. L. Vandry // Pediatr. Infect. Dis. 1994. - V. 9. - P. 812 - 815.

215. Roossier, E. Absence of cell-mediate immunity to rubella virus 5 years after rubella vaccination IE. Roossier, P.H. Phipps, J.R. Polley, T. Webb //Can. Med. Assoe J. 1977. - V. 116. - P. 481 -484.

216. Rudnicka, H. Rozizka Pok /H. Rudnicka// Przegl. Epidemiol. 1986. -V. 40 (l).-P. 40-43.

217. Schalk, J. Potency estimation of measles, mumps and rubella trivalent vaccine with quantitative PCR infectivity assay / J. Schalk, C. de Vries, P. Jongen // Biologicals. 2005. - V. 33 (2). - P. 71 - 79.

218. Schiff, G.M. Challenge with rubella virus after loss of detectable vaccine-induced antibody/ G.M. Schiff, B. S. Young, G. M. Stefanovic et al // Rev. Infect. Dis. 1985. - V.7 (suppl 1) - P. 157 - 163.

219. Schmidt, N. J. Antigen of rubella virus / N. J. Schmidt, E.N. Lennette // J. Clin. Lab. Med. 1966. - V. 68. - P. 502 - 509.

220. Semerikov, V. V. Ways to Prevent Maternal and Perinatal Morbility / V. V Semerikov, N.W. Visnitsky, A. I. Lukina // Perm. Public. Medical. Academy. -Perm, 1991.-P. 76-78.

221. Shendsel, L. P. Rubella immunity defining the level of protective antibody /

222. Am. J. Clin. Pathol. 1996. - V. 5. - P. 21 - 26.

223. Sheridan, E. Congenital rubella syndrome: a risk in immigrant population / Sheridan, C. Aitken, D. Jeffries, M. Hirst, P. Thayalasekaran. // Lancet. -2002.-V. 359.-P. 674-675.

224. Shishido, A. Development of attenuated rubella virus vaccines in Japan / Shishido, M. Ohtawara // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1976. - V. 29. - P. 227 -253.

225. Skendz, L.P. Rubella immunity: level of protective antibody / L.P. Skendz // Am. J. Clin. Pathol. 1996. - V. 106. - P. 170 - 174.

226. Slater, P. Absence of an Association Between Rubella Vaccination and Arthritis in Underimmune Pastpartum Women / P. Slater, T. Ben-Zvi, A. Fogel, M. Ehrenfield, S. Ever-Hadani // Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 1529 - 1532.

227. Smith, A. Deafness and hearing impairment in Congenital Rubella Syndrome (CRS). Presented at the 5th Meeting of the WHO Steering Committee on Epidemiology and Field Research, 4-5 may, Geneva. 1999.

228. Spinder, R. S. Stereotaxic Atlas of Monkey Brain Macaca Mulatta/ R.S. Spinder, C. Lee // University of Chicago Press, Chicago, USA 1961. - 287 c.

229. Spuance, S.L. Reccurrent joint symptoms in children vaccinated with HPV77DK12 rubella vaccine/ S.L. Spuance, L. E. Klock, A. Bailey, J.R. Ward, C.B. Smith. //J. Pediatr.- 1972. V. 3 (80). - P. 413 - 417.

230. Stanleu, A. Rubella Vaccine. Second Edition / A. Stanleu, S.APlotkin // Vaccine. Philadelphia: W.B. Saunders Compani, 1999. - P. 303 - 328.

231. Stehr Green, P. A. Evidence Against Increasing Rubella Seronegativity Among Adolescent Girls / P.A. Stehr - Green, S.L. Cochi, S.R. Preblud, W.A. Orenstein // Am. J. Publ. Health. - 1990. - V. 80. - P. 88.

232. Strauss, J.H. The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution / J.H. Strauss and E. G. Strauss // Microbiol. Rev. 1994. - V. 8. - P. 491 -562.

233. Suomolainen, M. The E2 signal sequence of rubella virus remains partof the capsid protein and confers membrane association in vitro / M. Suomolainen, H. Garoff, M. D. Naron // J. Virol. 1990. - V. 64. - № 11.-P. 5500-5509.

234. Terry, G.M. A bio-engineered rubella El antigen / G.M. Terry., L. Ho-Terry, P. Londesborough, R. Rees // Arch. Virol. 1989. - V. 104. - № 1-2. -P. 63-75.

235. Terry, G. M. Localization or rubella El epitopes / G.M. Terry, L. Ho-Terry, K.R. Rees // Arch. Virol., 1988. № 98. - P. 189 - 107.

236. Terry, L. Rubella virus polypeptides / L. Ho- Terry, A. Cohen // Arch. Virol. 1982. - V. 72 (1-2). - P. 47 - 54.

237. Thompson, A. Grown of rubella virus in a glass bear propagator / A. Thompson, G. Davis, J. M. Best, J. P. Whiteside //J. Virol. Methods. 1989. -V. 25.-№ 1,-P. 443-454.

238. Thompson, G.R. Intermittent artriths following rubella vaccination./ G.R Thompson., J.J. Weiss, J.L. Shills, R.G. Brackett//Am. J. Dis. Child. 1973.1. V. 125.-P. 526-530.

239. Tzeng, W.P. Analysis of rubella virus capsid protein-mediated enhancement of replication and mutant rescue/ W.P. Tzeng, J.D. Matthews, T.K.Frey//J.Virol.- 2006.-V. 80.- №8.- P. 3966- 3974.

240. Tzeng, W. P. C-El fuzion protein synthesized by rubella virus D1 RNAs maintained during serial passage / W. P Tzeng, T. K Trey // Virology. -2006. V. 356.-P. 198-207.

241. Tzeng, W.P. Rubella virus capsid protein modulation of viral genomic and subgenomic RNA synthesis / W. P. Tzeng, T. K. Frey // Virology. -2005. V. 337. - №2.-P. 327-334.

242. Usonis, V. Comparative Study of Reactogenicity and Immunogenicity of New and Established Mesles, Mumps and Rubella Vaccines in Heathy Children / V.Usonis, V. Bakasenas, K. Chitour, R. Clemens // Infection. -1998.- V. 26 (4). -C. 222-226.

243. Vaananen, P. Effect of low level immunity on response to live rubella virus vaccine/ P.Vaananen, P. Makela, A. Vaheri.// Vaccine. 1986. - V. 4. -P. 5 - 8.

244. Vaheri, A. Grown of the rubella virus in BHK21 cells. 1. Virus production and infectivity assays / A. Vaheri, W. D. Sedwick, S. A. Plotkin // In: Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). 1967. - V. 125. - P. 1086 - 1092.

245. Vyse, A.J. An RT-PCR assay using oral fluid samples to direct rubella virus genome for epidemiological surveillance / A. J. Vyse, L. Jin // Mol. Cell

246. Probes. 2002. - V.16 (2). - P. 93 - 97.

247. Wang, X. Rescue of rubella virus replication-defective mutants using vaccinia virus recombinant expressing rubella virus nonstructural proteins / X. Wang, Y.Liang, S. Gillam // Virus Res. 2002. - 86. - P. 111 - 122.

248. Waxham, M. A model of organization of rubella virus / M. Waxham, J. Wolinsky// Virology. 1983. - V. 126. - P. 194 - 203.

249. White, C.C. Benefits, Risk and Costs of Immunization for Measles, Mumps and Rubella /C.C. White, J.D. Koplan, W.A. Orenstein // Am. J. Publ. Health. 1985. - V. 75 (7). - P. 739 - 744.

250. World Health Organization. Global distribution of measles and rubella genotypes update // Wkly. Epidemiol. Rec. - 2006. - V. 81 (51/52).1. P. 474-479.

251. World Health Organization. Manual for the Laboratory Diagnosis of Measles and Rubella Virus Infection. Second Edition. Geneva, 2006. -100 p.

252. World Health Organization. Standartization of The Nomenclature for Characterization of Wild-Type Rubella Viruses. // Wkly. Epidemiol. Rec. -2005.- V. 80,- P.125-132.

253. World Health Organization. Accelerated control of rubella and prevention of congenital rubella syndrome. Brazil. // Wkly Epidemiol. Rec. 2002. - V. 77.-P. 169-175.

254. World Health Organization. Preventing Congenital Rubella Syndrome. // Wkly. Epidemiol. Rec. 2000. - V. 75. - P. 289 - 296.

255. World Health Organization. Technical Report Series. 1988. - V. 771. -P. 101 -102.

256. Yao, J. Mutational analysis, using a full-length rubella virus CAN clone, of rubella virus El transemembrane and cytoplasmic domains required virus release / J.Yao, S. Gillam // J.Virol. 1999. - V.73. - P. 4622 -4630.

257. Yang, D. Effect of mutation in the Rubella Virus El Glycoprotein on El -E2 Interaction and Membrane Fusion Activity ID. Yang, D. Hwang, Z. Qiu, S. Gillam// J. Virol., 1998. V. 74. - P. 8747 - 8755.

258. Yam, H. Persistence of vaccine induced immune responses to rubella comparison with natural infection/ H. Yarn, K. Zaho, G. Yinxiang, H. // Rev. Infect. Dis. 1985. - V. 7 (suppl. 1). - P. 79 - 85.

259. Zheng, D.P. Global Distribution of Rubella Virus Genotypes / D.P. Zheng, K. Teryl, T.K. Frey // Emerg. Infect. Dis 2003. - V. 9. - № 12. - P.23 1530.

260. Zheng, D. Nucleotid sequence of the 24S sub genomic messenger RNA ot a vaccine strain (HPV77) of rubella virus: comparison with a wild-type strain (M33) / D. Zheng, L. Dickens, T. Lu, L. Nakhasi // Gene, 1989. № 82.-P. 343-349.

261. Zhehg, D.P. Characterization of genotype II Rubella virus strains / Zheng D.P., Zhou Y. M., Zhao K., Han Y.R., Frey T.K. // Arch. Virol., 2003. -V.148.-P. 1835- 1850.

262. Zhou, Y. Genomic analysis of diverse rubella virus genotypes / Y Zhou //

263. J. Gen. Virol., 2007. № 88 - P. 932 - 41. 297. Zimmerman, RK. Ethical analyses of vaccines grown in human cell strains derived from abortion: arguments and Internet search / R. K. Zimmerman // Vaccine, 2004. - V.22. - P. 4238 - 4244.

Информация о работе

Лаврентьева, Ирина Николаевна
доктора медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ"

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Лаврентьева, Ирина Николаевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Лаврентьева, Ирина Николаевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Лаврентьева, Ирина Николаевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ШТАММ "ОРЛОВ – Д" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология