Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2"



РОМАНОВСКАЯ-РОМАНЬКО Екатерина Андреевна

БЕЗОПАСНОСТЬ, ИММУНОГЕПНОСТЬ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА A/II5N1 С УДАЛЕННЫМИ ФАКТОРАМИ ПАТОГЕНПОСТИ: БЕЛКАМИ NS1 И PB1-F2

Специальность 03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Санкт-Петербург - 2011

005004786

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии

Научный руководитель: доктор биологических наук

Егоров Андрей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Бичурина Майна Александровна

доктор биологических наук Ипанова Валерия Тимофеевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских

наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Защита диссертации состоится «23» декабря 2011 года в чгкООшш. на заседании Диссертационного совета Д.001.043.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоиразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоиразвития России.

Автореферат разослан «1?№» ноября 2011 г.

Ученый секретарь ' ^ кандидат медицинских наук

Диссертационного совета /У/ Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Основной задачей, поставленной ВОЗ в глобальном плане подготовки к борьбе с гриппом и защиты от пандемий, является создание коллекции вакцинных штаммов, которые, в случае наступления пандемической ситуации, могут быть немедленно востребованы для производства вакцины (ВОЗ, 2005). Вирус гриппа птиц H5N1 сохраняет высокий пандемический потенциал, так как продолжает активно циркулировать в популяциях домашних птиц, вызывая вспышки заболевания с высоким уровнем смертности среди людей. >

При подготовке к пандемии живые аттенуированные вакцины имеют ряд преимуществ, связанных с возможностью их интраназального введения, способностью формировать местный иммунный ответ и обеспечивать широкий спектр защиты против дрейфовых вариантов вируса гриппа (Rudenko et al., 1996; Belshe et al., 2007).

Новым направлением в создании эффективных и безопасных живых гриппозных вакцин является использование рекомбинантных вирусов с укороченным или удаленным NS1 белком (delNSl) - антагонистом системы интерферонов первого типа (Egorov A. et al., 1998; Garcia- Sastre et al., 1998). Вследствие отсутствия экспрессии белка NS1, такие штаммы теряют способность к полноценной репликации в ИЛФ-компстснтпых организмах, но могут накапливаться до высоких титров в ИФН-дефицитных системах таких, как клеточная линия Vero, разрешенная для производства вакцин (Talon et al., 2000; Romanova J et al., 2009). Неспособность delNSl вирусов к репродукции в клетках респираторного тракта обеспечивает высокий уровень безопасности вакцины, полученной на основе штаммов с удаленной генетической последовательностью, кодирующей белок NS1. В то же время, delNSl вакцинные вирусы являются достаточно иммуногенными из-за повышенной продукции цитокинов в месте аппликации вакцины. Высвобождение цитокинов таких, как интерфероны первого типа, стимулирует местный иммунитет слизистых оболочек носа, опосредованный секреторными антителами класса IgA, цитотоксический, а также системный В- и Т- клеточный иммунный ответ, обеспечивая перекрестную защиту без использования адъювантов (Ferko et al., 2004; Stasakova J. et al., 2005).

Результаты доклинических исследований delNSl вакцинных кандидатов против эпидемических вирусов гриппа A. (H1N1, H3N2) и В продемонстрировали их безопасность и профилактическую эффективность на экспериментальных моделях мышей, хорьков и приматов (Wressnigg et al., 2009; Nakowitsch et al., 2011). Перспективность использования delNSl гриппозных вакцин у людей была показана в ходе I фазы клинического исследования моновакцины на основе штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (Wacheck et al., 2010).

Разработка H5N1 вакцинных кандидатов с укороченным NS1 сегментом генома является новым подходом к созданию живых аттенуированных пандемических гриппозных вакцин.

Цель исследования. Разработка вакцинных кандидатов против высокопатогенного вируса гриппа A/H5N1 на основе вирусных штаммов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1. Задачи исследования

1. С помощью методов • «обратной генетики» получить рекомбинантные вакцинные штаммы вируса -гриппа A/H5N1 различных клайдов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl).

2. Охарактеризовать рекомбинантные H5N1 delNSl вакцинные штаммы in vitro по следующим параметрам: репродуктивность на культуре клеток Vero, генетическая стабильность и антигенные свойства.

3. Оценить безопасность H5N1 delNSl вакцинных штаммов на моделях мышей и приматов при интраназальном введении.

4. Оценить иммуногенные и протективные свойства H5N1 delNSl вакцинных штаммов при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей и приматов.

5. Изучить влияние удаления фактора патогенности - белка PB1-F2 на безопасность, иммуногенную активность и протективные свойства delNSl вакцинных штаммов.

Научная новизна работы

С помощью методов «обратной генетики» впервые были получены вакцинные штаммы с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl), относящиеся к различным клайдам вируса гриппа A/H5N1. Впервые получены данные о способности H5N1 вакцинных штаммов к эффективному росту на культуре клеток Vero и их генетической стабильности при длительном пассировании. Получена новая информация о безопасности и иммуногенной активности delNSl вакцинных кандидатов при применении у животных. Впервые показаны кросс-протективные свойства delNSl штаммов в отношении различных антигенных вариантов вируса гриппа A/H5N1. Показана возможность повышения иммуногенной активности delNS 1 вирусных штаммов путем дополнительной модификации генома, приводящей к отсутствию экспрессии вирусного белка PB 1-F2 - фактора ингибирования системы интерферонов.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований было показано, что использование штаммов вируса гриппа A/H5N1, имеющих делецию последовательности, кодирующей белок NSI (delNSl), в качестве интраназальной вакцины может служить перспективным подходом в решении задач разработки нового поколения пандемических противогриппозных вакцин. Результаты, полученные в ходе проведенных доклинических исследований, были использованы для проведения клинического исследования I фазы вакцинного кандидата VN1203 delNSl на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа A/H5N1, имеющие делецию геномной последовательности, кодирующей . - белок NS1, являются генетически стабильными при длительном пассировании на культуре клеток Vero и обладают высоким уровнем репродуктивной активности.

2. H5NldelNSl вакцинные штаммы обладают аттенуированным фенотипом и являются безопасными при интраназальном применении у мышей и приматов.

3. Интраназальная иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами приводит к формированию кросс-реактивного иммунного ответа и обеспечивает защиту от инфекции, вызванной вирусами гриппа A/H5N1 различных клайдов.

4. Отсутствие экспрессии белка PB1-F2 - антагониста системы интерферонов -не снижает ростовых характеристик и приводит к увеличению безопасности и иммуногенной активности H5N1 delNSl вакцинного штамма.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Реассортантные вирусные штаммы получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях лично автором. Экспериментальное заражение приматов высокопатогенным вирусом гриппа A/H5N1 выполнено сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ» - «ВЦ». Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме «Emerging diseases: tick-transmitted and influenza» (Новосибирск,

2007), на Международной конференции «Preparedness to the influenza pandemic — an international outlook» (Санкт-Петербург, 2007), на Ежегодной отчетной конференции по международному европейскому проекту «Fluvacc» (Вена,

2008), на Международной вирусологической конференции Retroscreen «Medical, Scientific and Historical Lessons from the Great Avian (H1N1) "Spanish" Influenza Pandemic of 1918: The 90th Anniversary» (Лондон, 2008), также представлены на Международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009), ежегодной международной конференции «Options for the Control of Influenza VII» (Гонконг, 2010), второй международной конференции «Fundamental and applied problems of medical primatology» (Сочи, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 10 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация. изложена на 128 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 28 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов,

выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 195 источников на русском и английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки и вирусы. В работе использовали культуру клеток Vero (Европейская Коллекция Клеточных Культур, любезно предоставлены компанией ГринХиллзБиотехнология, Австрия), адаптированную к росту в бессывороточной среде. В качестве модели интерферон-компетентных клеток были использованы культуры клеток MDCK (банк клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России) и А549 (Европейская Коллекция Клеточных Культур). Вакцинные вирусные штаммы и реассортантные штаммы, используемые для моделирования гриппозной инфекции, были получены путем трансфекции клеток Vero набором из 8 двунаправленных экспрессионных плазмид, кодирующих заданные геномные сегменты (Pleschka et al., 1996; Hoffmann et al., 2000). Вирус гриппа А/утка/Сингапур/2/97 (H5N3) [Duck/Sing], из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, культивировали в 11 -дневных РКЭ. Культивирование высокопатогенного штамма А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили на 9-10-дневных РКЭ в филиале ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ».

Инфекционную активность вирусов определяли методом предельных разведений и методом образования бляшек под агаровым покрытием. Титрование вируссодержащего материала проводили на культурах клеток Vero, MDCK или РКЭ, рассчитывали по методу Рида и Менча (1938) и выражали в ^ЭИД50 или ТИД50 или БОЕ (бляшкообразующих единиц) в мл. Лабораторные животные. Исследования выполнены согласно "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003). В работе были использованы самки белых беспородных мышей в возрасте 6-8 недель (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН, Ленинградская область) , самцы мышей линии С57Ы/6 в возрасте 6-8 недель (питомник лабораторных животных «Charles River», Германия) и самцы яванских макак (Macaca fascicularis) в возрасте 4-6 лет (НИИ медицинской приматологии РАМН, г.Сочи).

Иммунизация и экспериментальное заражение животных. Мышам под легкой эфирной анестезией вводили интраназально 50 мкл культуральной или аллантоисной жидкости с известным содержанием вакцинных (Ю2'0-106'3ТИД5о) или заражающих вирусов (102О-105'3 ТИД50). Иммунизацию и заражение приматов проводили под наркозом (кетамин-ксилозин), вводя интраназально 500мкл культуральной или аллантоисной жидкости с известным содержанием вакцинного или заражающего • вируса. Животные контрольных групп при иммунизации получали эквивалентный объем культуральной жидкости или фосфатного буферного раствора, не содержащих вируса.

Иммунологические методы. Наличие антигемагглютинирующих антител определяли в сыворотках- иммунизированных и контрольных животных в реакции торможения гсмагглютинации (РТГА) с использованием 0,5%

куриных или 1% лошадиных эритроцитов. Наличие нейтрализующих антител определяли в сыворотках иммунизированных и контрольных, животных в реакции микронейтрализации (РМН) вируса гриппа на культуре клеток Vero с использованием в качестве первых антител моноклинальных антител к белку NP вируса гриппа А (0.125 мкг/мл; Chcmicon, США). В качестве вторых антител использовали поликлональные анти-мышиные IgG антитела козы (0.25 мкг/мл; KPL, США), конъюгированные с пероксидазой хрена. Иммуиоферментный анализ (ИФА) для выявления вирус-специфических антител классов IgG и IgA определяли в образцах сывороток и носовых смывов опытных животных. Использовали рекомбинантный гемагглютинин, соответствующий вирусу А/Вьетнам/1203/04 II5N1 (0.5 мкг/мл). HS-специфические IgG или IgA в зависимости от эксперимента выявляли с помощью анти-мышиных антител козы IgG, IgGl, IgG2a или IgA (Rockland, Германия), конъюгированных с пероксидазой хрена. Молекулярпо-гепетические методы.

Выделение РНК. Выделение вирусной РНК производилось с помощью набора «QIAGEN Rneasy TotalTM RNA Isolation Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для предотвращения попадания РНКаз из внешних источников рабочую поверхность обрабатывали с помощью RNAse Zap (Ambion, США). ^

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для определения наличия вирусной РНК в пробе обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР осуществляли с использованием коммерческого диагностического набора АмплиСенс «Influenza virus A/H5N1 FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя в режиме реального времени на приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Для определения длины геномного сегмента NS из изолятов, выделенных от иммунизированных животных, ОТ проводили в реакционной смеси, где в качестве праймеров были использованы шестичленные олигонуклеотиды, синтезированные случайным образом. Для получения фрагментов кДНК с геномной РНК вирусов, изолированных от иммунизированных животных, были использована пара праймеров, позволяющая оценить размер NS геномного сегмента: 5'NS-l 5'-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3' и 3'NS-826 5'-

CGAGAAAGTTCTTATCTCTTGCTC-3'. Для скрининга вирусов, имеющих полноразмерных NS сегмент генома, была использована пара праймеров: 5'NS-l 5'-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3' и 3'NS-205 5'-CACGTGTGGCTGTCTCGATGT С-3'. Данная пара праймеров выявляла только полноразмерные NS сегменты генома, поскольку область отжига праймера 3'NS-205 у delNSl штаммов была делетирована в результате удаления геномной последовательности белка NS1. Для секвенирования участка НА, включающего нуклеотидную последовательность основного сайта расщепления, были использованы универсальные Н5 праймеры: H5uniF -5 ' А АС АСС AACTGTC А ААСТСС и H5uniR - 5'TTGACCTTATTGGTGACTCC.

Детекцию продукта ПЦР проводили в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Секвеиированис проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США). Статистическую обработку данных проводили с помощью тестов непараметрических критериев Манна-Уитни с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 6.0 для Windows. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднегеометрические титры (СГТ) и ошибка среднего (О .С.).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение H5N1 delNSl вакцинных штаммов

Вакцинные вирусные штаммы были получены путем трансфекции клеток Vero набором из 8 плазмид, в каждую из которых была клонирована кДНК одного из восьми вирусных геномных сегментов (Hoffmann et al., 2000). Полноразмерные последовательности генетических сегментов были синтезированы на основе последовательностей, полученных из базы данных GeneBank, и клонированы в двунаправленную экспрессионную плазмиду pHW_2006 в компании Geneart AG (Регенсбург, Германия). Вирусные штаммы были сконструированы на основе вакцинного штамма IVR-116, рекомендованного ВОЗ для производства вакцин, и содержали гены НА, NA и M (5:3 реассортанты) или только НА и NA (6:2 реассортанты) от штаммов вируса гриппа A/H5N1.

В процессе клонирования в геномном сегменте NS delNSl вакцинных штаммов была делетирована генетическая последовательность, кодирующая белок NS1, что, однако, не отражалось на способности данных вирусов образовывать мРНК белка NS2 (NEP).

Полиосновный сайт расщепления НА RERRRKKR/GLF, характерный для высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1, во всех штаммах был заменен на трипсинозависимую последовательность TETR/GLF, типичную для непатогенных Н5 вирусов (Horimoto et al., 2006).

Для иммунизации животных были получены следующие штаммы: [VN1203delNSl] - 5:3 реассортант вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1, клайд 1), рекомендованного ВОЗ для создания пандемических вакцин; [Kurg delNSl] - 6:2 реассортант вируса гриппа А/курица/Курган/05/2005 (H5N1, клайд 2.2). Также был получен штамм delNSl [Kurg full], имеющий все геномные сегменты от вируса гриппа. А/Курган/05/2005 (H5N1, клайд 2.2).

Для того, чтобы проанализировать влияние такого фактора патогенности, как белок PB1-F2, на свойства delNSl штаммов, были получены два 6:2 реассортанта вируса А/курица/Курган/5/05 на основе вируса 1VR-116 [Kurg delNSl] и [Kurg wtNSdelF2], Благодаря введению трех стоп-кодонов в нуклеотидную последовательность PB1-F2 (T153G, Т222А, G291A) и замене первого метионина на треонин эти вирусы не были способны экспрессировать функциональный белок PB1-F2 (knockout мутанты). При этом один из

реассортантов [Kurg delNSdelF2] обладал удаленной генетической последовательностью белка NS1 и был использован в качестве вакцинного кандидата, а второй [Kurg wtNSdelF2] — имел полноразмерный сегмент генома NS и, соответственно, сохранял такой фактор патогенности, как белок NS1.

Для экспериментального заражения животных использовали 6:2 реассортанты на основе вируса IVR.-116 с полноразмерным NS1 геном, содержащие НА и NA от вирусов гриппа A/H5N1 А/Вьетнам/1203/04 (клайд1) [VN1203 wtNS], А/Гонконг/213/03 (клайд 1) [НК213 wtNS], А/Индонезия/5/05 (клайд 2.1) [IND05 wtNS] и А/курица/Курган/5/05 (клайд 2.2) [Kurg wtNS], Наличие полноразмерного белка NS 1 позволяло этим вирусам реплицироваться в респираторном тракте животных. Характеристика использованных в исследовании штаммов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа A/H5N1,

использованных в исследовании

Название штамма Реассортация с IVR-116 Удаление последовательности NSI Экспрессия РВ1-Р2

VNJ203delNSl 5:3 есть нет

Kurg delNSl 6:2 есть нет

Kurg delNSdelF2 6:2 есть есть

Kurg full - есть нет

Kurg wtNSdeIF2 6:2 нет есть

Kurg wtNS 6:2 нет нет

VN1203 wtNS 6:2 нет нет

HK213 wtNS 6:2 нет нет

IND05 wtNS 6:2 нет нет

Все вирусные штаммы были получены и культивировались исключительно на сертифицированной клеточной линии Vero, разрешенной для производства вакцин.

Ростовые характеристики и генетическая стабильность II5N1 delNSl вакцинных кандидатов

В ходе исследования было показано, что delNSl штаммы вируса гриппа A/H5N1 могут успешно продуцироваться на ИНФ-дефектной культуре клеток Vero до высоких титров. Вакцинный вирус VN1203delNSl был способен расти до 108'5 ТИД5()/мл, при этом ростовые показатели не снижались ростовых показателей при длительном пассировании на культуре клеток Vero (12 пассажей).

Для вакцинного штамма VN1203delNSl была продемонстрирована высокая генетическая стабильность при длительном пассировании на культуре клеток Vero. Секвенирование генов НА, NA и М вакцинного штамма VN1203delNSl после 8 пассажей на культуре клеток показало отсутствие мутаций в данных генах. Кроме этого, для штамма VN1203delNSl было

продемонстрировано сохранение при пассировании (12 пассажей) на культуре Vero всех генетических (удаление генетической последовательности белка NS1, модификация сайта расщепления НА, 6:2 реассортация со штаммом IVR-116) и фенотипических (неспособность штамма delNSl образовывать бляшки на культуре клеток в отсутствии трипсина) маркеров аттенуации.

Также было показано, что в процессе пассирования и накопления (8 пассажей) вирусного штамма VN1203delNSl сохраняются антигенные свойства, характерные для исходного штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1, клайд 1).

Безопасность H5N1 delNSl вакцинных штаммов на моделях мышей и приматов

Безопасность и безвредность применения H5N1 delNSl вакцинных штаммов в качестве вакцинных кандидатов была продемонстрирована на различных моделях животных: беспородных мышах, мышах линии С57Ы/6 и яванских макаках.

Однократная и двукратная интраназальная иммунизация мышей delNSl вакцинными штаммами VN1203delNSl (в дозе Ю5'7ТИД50 на животное), Kurg delNSl(Ю6,0 ТИД50 на животное), Kurg delNSdelF2 (1060 ТИД50 на животное) и Kurg full (105 ТИД50 на животное) не приводила к снижению массы тела и развитию каких-либо клинических симптомов у животных. Для 6:2 рекомбинантных вакцинных штаммов (VN1203delNSl, Kurg delNSl и Kurg delNSdelF2) было показано отсутствие репликации в респираторном тракте мышей. Для вакцинного кандидата Kurg full, обладающего всеми сегментами генома от вируса А/Курган/5/05 (delNSl), на 2 день после иммунизации у 3-х животных из 6-и вакцинный вирус был выявлен в низком титре (<1,5 1§ТИД5(/мл) в гомогенатах легких.

Одно- и двукратная интраназальная иммунизации приматов вакцинным штаммом VN1203delNSl (в дозе Ю7'5ТИД50 на животное) также была безопасна и не приводила к развитию каких-либо клинических симптомов заболевания, изменению метаболических показателей крови или снижению массы тела животных. Выделение вакцинного вирусного штамма VN1203delNSl из носовых смывов иммунизированных животных в минимальных количествах имело место лишь на ранних сроках после иммунизации. Через 24 часа после иммунизации вирус был выделен из носовых смывов 3-х из 12-и вакцинированных животных в титре <2,0 ^ТИД50/мл. Через 72 часа после иммунизации у всех подопытных животных из респираторного тракта вирус не выделялся. Для всех штаммов, изолированных из респираторного тракта макак, методами ОТ-ПЦР и секвенирования была показана сохранность всех факторов аттенуации (удаленная генетическая последовательность белка NS1, модификация сайта расщепления и реассортация с вирусом IVR-116), присущих вакцинному штамму delNSl. Случаи изолирования вируса из носовых смывов яванских макак могут быть либо следствием выживания вакцинного вируса при высокой дозе иммунизации (107,5 ТИД50 на животное), либо продуктом первого абортивного цикла репликации. На 5 день после

иммунизации яванских макак методом ОТ-ПЦР было показано отсутствие вирусной РНК как в отдаленных органах (мозг, селезенка, печень), так и в месте аппликации вакцины (слизистая носа, легкие).

Полученные данные подтверждают аттенуированный фенотип H5N1 delNSl штаммов и позволяют сделать заключение о безопасности вакцинных кандидатов.

Иммуногешюсть и профилактическая эффективность H5N1 delNSl вакцинных штаммов на моделях мышей и низших приматов

Дальнейшие исследования показали, что, несмотря на абортивный цикл репликации в организме иммунизированных животных, H5N1 delNSl вакцинные штаммы являются иммуногенными и приводят к формированию кросс-протективной защиты у животных.

Для оценки иммуногенных свойств вакцинного штамма VN1203delNSl мышей иммунизировали двукратно с интервалом 3 недели, в дозе 105'3 ТИД50 на животное. Системный антительный ответ был изучен через 21 день после первой и повторной вакцинации. Было. показано, что после однократной иммунизации уровень антигемагглютинирующих антител оказывается низким, несмотря на высокий уровень сывороточных вирус-специфических IgG, выявленных методом ИФА. Так, в РТГА, с использованием куриных эритроцитов, в сыворотках мышей после однократной вакцинации штаммом VN1203deINSl антител выявлено не было, а после повторной иммунизации были обнаружены значительные титры антител против антигенов VN1203wtNS (СГТ=35,7) и HK213wtNS (СГТ=71,5), которые принадлежат к вирусам гриппа A/H5N1, клайд 1. Однако антитела к штамму IND05, который относится клайду 2.2 вирусов гриппа A/H5N1, не были выявлены даже после повторной иммунизации. Однако, использование метода ИФА для определения сывороточных Н5-специфических IgG, показало наличие высокого уровня вирус-специфических антител у мышей уже после однократной вакцинации (СГТ=2940) и значительное увеличение титра (р<0.0001) после повторной иммунизации штаммом VN1203delNSl (Рис.1).

20

15

10

• -•--Рис.1. Уровень Н5 вирус-

• • • специфических сывороточных 1цС у ааа мышей после однократной и

двойной иммунизации вакцинным штаммом У1Ч120311е^51 (по данным ИФА). Индивидуальные титры "" сывороточных Н5 специфических

(отдельные символы) выражены как

|_1____1о§2, СГТ представлены

у ^1203(1с|\81 горизонтальными линиями для каждой

Контроль ] иммушинция 2 иммунизация группы. * - р<0.0001 (критерий

Манна-Уитни).

Значительно более высокие титры сывороточных антител в ИФА по сравнению с данными РТГА связаны с тем, что данный вакцинный штамм вызывает развитие широкого спектра Н5 специфических антител, из которых лишь часть обладает направленностью к сайту, отвечающему за агглютинацию. Следует отметить, что использование эритроцитов лошади в РТГА для оценки иммунного ответа, вызванного H5N1 delNSl вакцинными штаммами, полученными на основе штамма А/курица/Курган/5/05 (Kurg delNSl и Kurg delNSdelF2), показали наличие антигемагглютинирующих антител к гомологичному антигену у мышей уже после однократной иммунизации (СГТ=56 и 68, соответственно).

Кросс-реактивность вакцинного кандидата VN1203deINSl была показана на модели яванских макак в ряде иммунологических тестов. Животные были вакцинированы двукратно с интервалом 4 недели, в дозе 107'5 ТИД50 на животное. Антительный ответ был изучен на 28 день после первой и 21 день после повторной иммунизаций. Однократная иммунизация вакцинным кандидатом VN1203delNSl вызывала формирование сывороточного антительного ответа к гомологичному штамму H5N1 клайд 1 у 100% животных, что было подтверждено как в РТГА (СГТ=48,5), так и в реакции микронейтрилизации (СГТ=194,5). Сероконверсия к H5N1 штаммам клайда 2 после однократной иммунизации по результатам РМН была показана для 60% животных при использовании в качестве антигена вирусного штамма IND05 wtNS (СГТ=18,2) и у 70% животных при использовании Kurg05 wtNS (СГТ=64,6). Повторная вакцинация приводила к увеличению уровня сывороточных антител как к вирусам гриппа A/H5N1 клайда 1 А/Вьетнам/1203/2004 (РТГА СГТ=225; РМН СГТ=847,6), так и штаммам, принадлежащим к клайду 2. Так, после повторной вакцинации 100% животных приобрели нейтрализующие антитела к H5N1 вирусам клайда 2.1 [IND05 wtNS] СГТ=70,2 и клайда 2.2 [Kurg05 wtNS] СГТ= 87,5 (Рис.2).

Анализ Н5-специфических антител в сыворотках макак в РТГА через 7 месяцев после вакцинации штаммом VN1203de!NSl показал, что титр сывороточных антител к гомологичному штамму А/В ьетнам/1203/04 сохранялся у всех животных (100%) и СГТ составлял 27,8.

Формирование секреторных антител было изучено у макак после однократной и двойной иммунизации вакцинным штаммом VN1203delNSl. Для этого в носовых смывах, собранных через 4 недели после первой иммунизации и 3 недели после повторной, был определен уровень Н5-специфических антител класса IgA. Было показано, что титры секреторных IgA антител в носовых смывах привитых обезьян увеличиваются после первой иммунизации, однако, достоверное увеличение титров (р<0,05) наблюдается у животных только после двукратной иммунизации, увеличиваясь относительно первоначального уровня в 8 раз.

VN1203/04

«>t ч ii

-3E-

«3«)

• ••

цммушндшш imminiiumiu

CL 6-

a

4.

2-

VN 1203/04

«c»©

-se-

i 2 1И1МЧ11И11Ш111 IhniMllliíUUtU

Kurg/5/05 *

oooo

с

С С I)

«cc

l 4H H 2-

I\ui'"/5/05

ООО

oo

t'>€! С

Д

11М>т111ШЦШ1 ll>ni%Mlltlltllltl

|ШМ> lili lauim 114 Myiiitiamiu

oooo cooboo

IND05

*

c«> С! с с

-icr

В

• ••

"i"

ДО 1 2

um«j шпации шшчншацни

ot

Z 6-

«гГ. Cu

аз 4-c-

£ 2-

IND05

•••••

mi 1л1(ня mi m un l.iiiiim

Рис. 2. Титры сывороточных антител после однократной и двойной нммунизаций яванских макак вакцинным кандидатом VN1203delNSl (по данным РТГА и РМН). Индивидуальные титры антител выражены как log2, СГТ представлены горизонтальными линиями для каждой группы. Результаты РТГА с использованием эритроцитов лошади сывороток макак с антигеном VN1203 wtNS(A), Kurg05 wtNS (Б), INDOS wtNS (В); результаты РМН сывороток макак с антигеном VN1203 wtNS (Г), Kurg05 wtNS (Д), IND05 wtNS (Е). * - р<0.01 (критерий Манна-Уитни).

Профилактическая. эффективность H5N1 de INS 1 вакцинных штаммов была продемонстрирована на двух моделях животных, мышах и приматах, при моделировании гриппозной инфекции.

Протективное действие однократного применения вакцинного кандидата VN1203delNSl на мышах (в дозе 105'3 ТИД50 на животное) выражалось в ускоренном клиренсе заражающего вируса из легких при моделировании экспериментальной . гриппозной инфекции. Двукратная вакцинация обеспечивала кросс-протективную защиту животных против инфекции вирусами гриппа A/H5N1, принадлежащими к различным клайдам (клайд 1-VN1203wtNS, НК213 wtNS и клайд 2 - IND05 wtNS) подтипа H5N1 и вируса гриппа А подтипа H5N3 [Duck Sing] (таблица 2).

Таблица 2

Уровень репликации вирусов в легких мышей, иммунизированных 115 вакцинным

штаммом VN1203delNSl

Группа вакцинации (Ы-число особей в группе) 3 дня после заражения 5 дней после заражения

Заражающий вирус Число защищенных А животных Средний титр Б вируса Число защищенных животных Средний титр вируса

Контроль (N=48) VN1203 wtNS HK2I3 wtNS 0/6 0/6 4.9±0.2 5.2±0.2 0/6 0/6 4.4±0.2 4.5±0.3

1ND05 wtNS 0/6 4.0±0.1 0/6 3.7±0.3

Duck Sing 0/6 4.1±0.3 0/6 4.5±03

УМ203(1е1№1 Однократная вакцинация (N=48) VN1203 wtNS HK213 wtNS IND05 wtNS 2/6 3/6 1/6 2.6±0.5 В 3.0±0.6В 2.9±0.3 В 6/6 5/6 5/6 <1.5 В 1.6±0.4В 1.6±0.4В

Duck Sing 2/6 2.0±0.4 В 6/6 <1.5В

Двукратная вакцинация (N=48) VN1203 wtNS HK2I3 wtNS IND05 wtNS 6/6 6/6 6/6 <1.5 В <1.5 В <1.5 3 6/6 6/6 6/6 <1.5 В <1.5 в <1.5 В

Duck Sing 6/6 <1.5 В 6/6 <1.5 В

д ---——--■—--

Мыши с вирусной нагрузкой в тканях легких <1.5 ^ ТИД5ц/мл считались защищенными. Титры представлены в ^ ТИД50/МЛ 10% суспензии гомогената ткани ±О.С. для группы из 6 животных. в Достоверное отличие от группы контроля, р<0,01 (критерий Манна-Уитни)

Профилактическая эффективность вирусного штамма УШ2(Ше1Ы81 была изучена у приматов через 7 месяцев после двукратной иммунизации. Исследование выполнено в филиале ФГУ "48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ" - "ВЦ". Животных заражали высокопатогенным вирусом гриппа Н5Ы1 А/курица/Ку рган/02/05 (клайд 2.2) в дозе 107'°ЭЛД5о (50%

эмбриональных летальных доз), антигенно отличным от вакцинного штамма \/М1203с1еГЫ51, принадлежащего к вирусам гриппа А/Н5Ы1 клайду 1.

На модели приматов было показано, что двукратная иммунизация вакцинным кандидатом УМ1203с1е1Ы81обеспечивает высокую степень защиты при заражении высокопатогенным штаммом • вируса гриппа Л/Н5Гч11/курица/Курган/02/05, что выражалось в снижении титра патогенного вируса, выделенного из респираторного тракта, более легкой степени тяжести заболевания и достоверно менее выраженных поражениях тканей легких при патологоанатомическом обследовании привитых животных по сравнению с интактными животными (р<0,001-0,05) (таблица 3).

Таблица 3

Анализ тяжести течения инфекционного процесса у яванских макак, зараженных вирусом гриппа А/курнца/Курган/2/05

Группа Повышение температуры (кол-во животных) Выделение вируса из носовых смывов (кол-во животных) Защитная эффективность иммунизации при экспериментальной гриппозной инфекции Клиническое течение заболевания

Контрольная 2 из 4 4 из 4 0% Тяжелое

Опытная (двукратная вакцинация УШ2<Ше1№1) 0 из 4 2 из 4 67,5% Легкое

В целях изучения влияния иммунизации вакцинным кандидатом УЫ1203с1е1Ы81 на тяжесть течения заболевания у инфицированных животных проводили ежедневно рейтинговую оценку (в баллах) степени выраженности в образцах крови следующих показателей: количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, изменения в лейкоцитарной формуле крови, изменение гематокрита и тромбокрита, гемоглобина, изменение ферментативной активности АсАТ, АпАТ, изменение концентрации мочевины и креатинина. По этим показателям производили подсчет и вычисляли индекс тяжести заболевания (ИТ), который представлял собой совокупность параметров основных жизненных и метаболических показателей состояния организма, и выражался в условных единицах (УЕ). По перечисленным признакам рассчитывали также коэффициент защитного действия, и соответствующие уровни значимости влияния вакцинного штамма УМ1203с1е1Ы81 на течение инфекционного процесса в течение всего срока наблюдения. При вычислении ИТ по изученным показателям при значении ИТ <0,50 УЕ диагностируют норму; при ИТ=0,51- 0,80 УЕ - легкую степень тяжести; при ИТ=0,81 - 0,95 УЕ - среднюю степень тяжести; при ИТ>0,96 УЕ - тяжелую степень.

У животных контрольной группы инфекционный процесс имел легкую (25%), среднюю (25%) и тяжелую формы (50%), в то время, как у всех иммунизированных животных по гематологическим и биохимическим

показателям была диагностирована норма. Защитная эффективность иммунизации в отношении экспериментальной гриппозной инфекции по метаболическим показателям для яванских макак, иммунизированных интраназально вакцинным вирусом VN1203delNSl, в среднем составила 67,5% с высокой степенью достоверности (р<0,001-0,05).

Полученные в данном исследовании результаты демонстрируют способность H5N1 delNSl вакцинных кандидатов индуцировать кросс-протективный H5N1 специфический иммунный ответ на различных моделях животных.

Удаление фактора патогснностн PB1-F2 из delNSl вакцинного штамма: влияние на репродуктивные свойства, безопасность, иммуногенность и профилактическую эффективность

К настоящему моменту известно, что одним из факторов патогенности вирусного штамма, обуславливающего повышенную вирулентность в организме хозяина, является способность вируса экспрессировать белок РВ1-F2, который кодируется альтернативной рамкой считывания в геномном сегменте РВ1. Исследования последних лет продемонстрировали, что белок PB1-F2 выполняет функцию антагониста системы ИНФ (Varga et al., 2011). Также было показано, что в геноме подавляющего большинства эпидемических и пандемических вирусов 20 века присутствует полноразмерный белок PB1-F2, a knockout молекулярно-генетическими методами открытой рамки считывания PB1-F2 в вирусных штаммах приводило к снижению вирулентности последних для мышей (Zamarin et al., 2006).

Поскольку было показано, что вакцинный штамм Kurg full, хотя и в низком титре, но был изолирован из респираторного тракта мышей, а штамм VN1203delNSl - из респираторного тракта приматов, то, для обеспечения большей безопасности delNSl вакцинного штамма, с помощью методов «обратной генетики» в геном вакцинного штамма ввели дополнительную модификацию, приводящую к отсутствию экспрессии белка PB1-F2. В результате введения 3-х стоп-кодонов в открытую рамку считывания PB1-F2 у такого штамма была блокирована транскрипция мРНК белка PB1-F2.

Изучение влияния способности экспрессировать белок PB1-F2 на вирулентность вакцинного штамма было проведено косвенно на основании сравнения штаммов Kurg wtNSdelF2 и Kurg wtNS. Поскольку эти штаммы кодировали полноразмерный белок NS1, они были способны реплицироваться в респираторном тракте животных, что позволило изучить вирулентность вирусных штаммов при отсутствии белка PB1-F2. Было показано, что вирусный штамм Kurg wtNSdelF2 является менее патогенным для мышей, что выражалось в достоверно более низком уровне вирусной нагрузки в тканях верхнего дыхательного тракта животных. Уровень летальности у мышей, зараженных штаммом Kurg wtNSdelF2, был ниже, чем в группе Kurg wtNS, однако, эти отличия были статистически недостоверными (Рис.3).

■ ■ "Ojk. ° о о о о о

А А ■ МНИ •

• Kurg wtNS ér Kurg wlNSdelF2 О Контроль

t? S

o 3 V)

H * u

1

» Kurg wtNS A- Kurg wtNSdelF2

7 8 9 10 И II 13 14 День исследования

1 3 5

День исследования

Рис. 3. Сравнение вирулентности реассортаитных штаммов вируса гриппа A/H5N1 способных или неспособных экспрсссировать белок PB1-F2. (А) Динамика смертности мышей, зараженных вирусными штаммами Kurg wtNS н wtNSdelF2. Животные (по 15 мышей в группе) были заражены в одинаковой дозе (1063 ТИД5о/животное). (Б) Динамика вирусной нагрузки в верхних дыхательных путях мышей, зараженных вирусными штаммами Kurg wtNS и wtNSdelF2. Животные (по 18 мыши в группе) были заражены в одинаковой дозе (105'7ТИД5(>/животное). Каждая точка представляет собой среднее значение вирусной нагрузки в тканях верхних дыхательных путей в группе из 6 животных. * -достоверное различие, критерий Манна-Уитни (р<0,05).

Следует отметить, что отсутствие синтеза белка PB1-F2 не снижало ростовые характеристики delNS 1 вакцинных штаммов на культуре клеток Vero, а на ранних сроках даже обеспечивало некоторое преимущество. Так, при анализе кривых роста вирусов Kurg delNS 1 и Kurg delNSdelF2 при низкой множественности заражения клеточного монослоя (М01=0,001 и 0,0001) было показано, что на сроке 24 часа после инфицирования штамм Kurg delNSdeIF2 имеет достоверно более высокие титры (р<0,05), в 6 раз превышающие титры вируса Kurg delNS 1.

Сравнительное изучение иммуногенности delNS 1 вакцинных штаммов, способных или не способных экспрессировать белок PB1-F2, было проведено при однократной иммунизации мышей вакцинными штаммами Kurg delNS 1 и Kurg delNSde!F2. Было показано, что иммунизация вакцинным штаммом Kurg delNSdelF2, лишенным такого фактора патогенности, как РВ1-F2, приводила к формированию достоверно более высокого уровня сывороточных антител подкласса IgGl (р<0,05) по сравнению со штаммом Kurg delNS 1. Это свидетельствует о более выраженном иммунном ответе, опосредованном клетками Тх2, в случае применения вакцинного штамма Kurg delNSdelF2 (Рис.4).

О

,дд

АД

л!л .сю

. Л ...

о

СЮ ОО А

оо д

схх> оо д —

-ф— А^Л О

оо дд о д

д

оо

(1еШ<1е1К2 сИЖ <1е1№с1е1К2

однократная иммунизация

днукратная иммунизация

однократная иммунизация

двукратная иммунизация

Рис. 4. Уровень Н5 вирус-специфических сывороточных антител подклассов и 1й(!2а после одпократной п двойной иммунизации вакцинными штаммами Киг^05 (1е№81 и Киг^05 <1е^ 8(1с1Г2 (по дачным ИФА). Каждый символ обозначает значение титра антител у отдельного животного, горизонтальная черта - средний геометрический титр (СГТ) для группы из 7 животных. * - р<0,05 (критерий Манпа-Уитни).

Профилактический эффект однократной иммунизации вакцинным штаммом Ки^ с!еМ8с1е1Р2 (105'4ТИД5О на животное) был более выражен по сравнению со штаммом Киг§ с1е1К81 (105'5 ТИД50 на животное). Так, при применении высокой заражающей дозы патогенного вируса А/Н51Ч1/курица/Курган/3/05 (50 МДЦ50 на животное), летальность (16%) наблюдалась только в группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом Киг§ с!еМ81, в то время как в группе Кигц с!е1Ы8с1е1Р2 гибели животных отмечено не было (Рис.5). Использование критерия Фишера, однако, не показало достоверности различий между группами, поэтому в данном случае можно говорить только о тенденции усиления профилактической эффективности. При более низких дозах патогенного вируса А/Н5Ы1/курица/Курган/3/05 (10 МЛД50) 100% животных в обеих группах Киг£ с!еГЫ81 и Киг§ с1е1Н8<1е1Р2 были защищены от летальной инфекции. А

в Контроль В К.П1 delNS Й Киге М^сИП

4 5 День

© Контроль ^^

В КпгЕ <1,1МЧ \

А Кигц ас1ММс1Г2 — д —г

14 Дгнь

21

Рис. 5. Динамика изменения массы тела (А) н смертности (Б) мышей после заражепия высокопатогенпым вирусом А Н51Ч1. Животные были однократно иммунизированы вирусами Ки^ delNS 1 или Ки^ delNSdeIF2 в одинаковой дозе. Все группы животных бьши инфицированы вирусом А/1151Ч1/курица/Курган/3/05 (50 МЛД50).

Результаты, проведенных исследований позволяют заключить, что использование рекомбинантных аттенуированных H5N1 delNSl вакцинных штаммов в качестве пандемической противогриппозной вакцины может явиться эффективным средством профилактики гриппозной инфекции. При этом модификация генома delNSl штамма, приводящая к отсутствию белка PB1-F2 (одного из факторов ингибирования системы ИНФ), не влияет на ростовые характеристики, улучшает иммуногенность и демонстрирует тенденцию к увеличению профилактической эффективности delNSl вакцинного штамма.

ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа А подтипа H5N1, имеющие делецию геномной последовательности, кодирующей белок NSI, являются генетически стабильными и способны расти до высоких титров (8,5 ^ТИД50) на культуре клеток Vero.

2. Интраназальная иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1. delNSl вакцинными штаммами является безопасной и не приводит к развитию клинических симптомов инфекции.

3. Иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами приводит к формированию перекрестно-реагирующих антител к различным клайдам вируса гриппа A/H5N1 и защищает животных от инфицирования различными антигенными вариантами вируса гриппа A/H5N1.

4. Отсутствие экспрессии белка PB1-F2 - антагониста системы интерферонов - в delNSl вакцинном штамме не приводит к снижению его ростовых показателей и повышает иммуногенную активность штамма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Romanova J., Krenn В. М.,. Wolschek М, Ferko В., Romanovskaja-Romanko Е., Morokutti А-> Shurygina А--Р-, Nakowitsch S., Ruthsatz Т., Kiefmann В., Konig U., Bergmann M., Sachet M.,-Balasingam S., Mann A., Oxford J., Slais M., Kiselev O., Muster Т., and Egorov A. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal ANSI H5N1 influenza vaccine// PLoS One.- 2009,- V. 4(6):e5984.

2. Roethl E., Gassner M., Krenn B.M., Romanovskaya-Romanko E.A., Seper H., Romanova J., Nakowitsch S„ Sturlan S., Wolschek M., Sirotkin A., Kiselev O., Muster Т., Egorov A. Antimycotic-antibiotic amphotericin В promotes influenza virus replication in cell culture//Journal of Virology.- 2011,- Vol.85 N21,-P.l 1139-11145. .

3. Krenn B.M., Egorov A., Romanovskaya-Romanko E., Wolschek M., Nakowitsch S., Ruthsatz Т., Kiefmann В., Morokutti A., Humer J., Geiler J., Cinatl J., Michaelis M., Wressnigg N., Sturlan S., Ferko В., Batishchev O.V., Indenbom

A.V., Zhu R., Kastner M., Hinterdorfer P., Kiselev O., Muster Т., Romanova J. Single HA2 mutation increases the infectivity and immunogenicity of a live attenuated H5N1 intranasal influenza vaccine candidate lacking NSl.//PLoS One.-2011,- V.6(4):el8577.

4. Романовская-Романько E.A., Ferko В., Вышемирский О.И., Романова Ю.Р., Krenn В., Muster Т., Грудинин М.П., Лапин Б.А., Егоров А.Ю., Киселев О.И. Доклинические исследования интраназальной живой гриппозной H5N1 вакцины с удаленным NS1 геном//Вопросы вирусологии.-2011.-№5.-(в печати).

Патент: US61/227, 638, подан 22.06.2009. "Новые дефектные по репликации

вирусы гриппа" Изобретатели: Е. Романовская-Романько, О. Киселев, М.

Wolschek, B.Ferko, М. Thomas, А. Егоров.

Тезисы:

1. Романовская-Романько Е.А., Ferko В., Вышемирский О.И., Романова Ю.Р., Грудинин М.П., Лапин Б.А., Егоров А.Ю., Киселев О.И. Оценка безопасности и иммуногенности H5N1 живой гриппозной вакцины с удаленной NS1 открытой рамкой считывания на модели яванских макак (Масаса fascicularis). Материалы II Международной конференции «Fundamental and applied problems of medical primatology». Сочи. 7-11 Августа, 201 l.C. 183-193.

2. Шурыгина A.C., Стукова M.A., Ерофеева М.К., Охапкина Е.А., Евграфов

B.Д., Максакова В.Л., Поздеев В.К., Романовская-Романько Е.А., Войцеховская Е.М., Вакин B.C., Васильева А.А., Кривицкая В.З., Романова Ю.Р., Егоров А.Ю., Киселев О.И. Вакцины нового поколения: клиническое исследование, пандемической H5N1 delNSl гриппозной вакцины. Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. 28-30 Марта, 2011. С.415.

3. Egorov A., Krenn B.M., Matrosovich M., Matrosovich Т., Romanovskaya-Romanko E., Wolschek M., Nakowitsch S., Ruthsatz Т., Wressnigg N., Sturlan S., Humer H., Kiselev O., Muster Т., Romanova J. Acidic conditions of the nasal passageway restrict the replication of highly pathogenic H5Nl influenza viruses. Abstract book of «Options for the Control of Influenza VII». China, Hong Kong SAR. 3-7 September, 2010.P.367. •

4. Romanovskaya-Romanko E., Wolschek M., Krenn B.M., Romanova J., Ferko В., Muster Т., Egorov A., Gambarian A., Krasilnikov I., Kiselev O. Deletion of PB1-F2 protein contributes to a higher protection efficacy of the H5N1 live vaccine candidate. Abstract book of «Options for the Control of Influenza VII». China, Hong Kong SAR. 3-7 September, 2010. P.441.

5. Стукова M.A., Ерофеева M.K., Охапкина E.A., Максакова В.Л., Поздеев В.К., Романовская-Романько Е.А., Шурыгина А.-П.С., Войцеховская Е.М., Кривицкая В.З., Романова Ю.Р., Егоров А.Ю., Киселев О.И. Клиническое исследование I фазы пандемической H5N1 DELNS1 гриппозной вакцины: оценка безопасности и эффективности. Материалы международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения». Санкт-Петербург. 28-29 Октября, 2009. С. 52.

6. Романовская-Романько Е.А., Егоров А.Ю. и Киселев О.И.. Вакцинные штаммы с удаленным фактором патогенности PB1-F2. Материалы международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения». Россия, Санкт-Петербург. 28-29 Октября, 2009. С.37.

7. Krenn В. М., Romanova J., Wolschek М., Ferko В., Romanovskaja-Romanko Е., Morokutti A., Shurygina А.-P., Nakowitsch S., Ruthsatz Т., Bergmann M., Balasingam S., Mann A., Oxford J., Slais M., Kiselev O., Muster Т., and Egorov A. Preclinical Evaluation of Replication-deficient Intranasal ANSI H5N1 Influenza Vaccine. Abstract book of International Conference Retroscreen: «Medical, Scientific and Historical Lessons from the Great Avian (H1N1) "Spanish" Influenza Pandemic of 1918:The 90th Anniversary». London. 10 November, 2008. P.278.

8. Романовская-Романько E.A., Егоров АЛО., Романова Ю.Р., Илисавский С.С., Киселев О.И. Оценка иммуногенности и эффективности живой гриппозной H5N1 вакцины на модели экспериментальной инфекции у мышей. Материалы международная научно-практическая конференция, посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности НЦБ МОН РК «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития». Республика Казахстан, г.Алматы. 19-21 мая, 2008, С. 470.

9. Romanovskaja-Romanko Е., Egorov A., Romanova J. Protective efficacy of replication deficient H5N1 influenza vaccine candidate in mouse model. Abstract book of International Conference «Emerging diseases: tick-transmitted and influenza». Россия, Новосибирск. 27 February-3 March, 2007, C. 14.

10. Egorov A., Romanova J., Ferko В., Wolschek M., Krenn В., Maurer E., Morokutti A., Ruthsatz Т., Romanovskaya-Romanko E., Shurigina A., Kiselev

O., Muster T. Replication deficient intranasal delNSl H5N1 influenza vaccine. Abstract book of International Conference: Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook. Russia, St.-Petersburg. March 15-17, 2007. P. 109-110. . ,

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВАК - Высшая аттестационная комиссия

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ИНФ - интерферон ;

ИТ - индекс тяжести заболевания

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - комплементарная ДНК

МЛД50 - 50% мышиная летальная доза

o.e. - ошибка среднего

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РМН - реакция микронейтрализации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

егт - среднее геометрическое

ТИДзо - 50% тканевая инфекционная доза

УЕ - условная единица

ЭИД5о - 50% эмбриональная инфекционная доза

ЭЛД50 - 50% эмбриональная летальная доза

НА - гемагглютинин

MOI - множественность заражения

NA - нейраминидаза

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю - доктору биологических наук Егорову Андрею Юрьевичу за предложенную интересную тему и внимательное отношение на всех этапах работы. Автор благодарит заведующего лабораторией к.б.н. Грудинина М.П., к.м.н. Стукову М.А. и сотрудников лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии и других подразделений ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоиразвития России за различную помощь при выполнении работы. Автор благодарит д.б.н. Гамбарян А.С, к.м.н. Вышемирского О.И., сотрудников НИИ медицинской приматологии РАМН и сотрудников филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ» за сотрудничество в проведении исследований. Автор также благодарит коллег и соавторов публикаций, принимавших участие в получении и оформлении результатов работы: к.б.н. Романову Ю.Р., д.м.н. Цыбалову Л.М. и к.б.н. Кривицкую В.З. Автор выражает искреннюю признательность директору ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоиразвития России, академику, д.б.н., профессору Киселеву О.И. за всестороннюю поддержку работы.

Подписано в печать 15.11.2011 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 553

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199048, Санкт-Петербург, В.О., 6-я линия, д. 59 корпус 1, оф. 40

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романовская-Романько, Екатерина Андреевна, Санкт-Петербург

РОМАНОВСКАЯ-РОМАНЬКО Екатерина Андреевна

04201253150

БЕЗОПАСНОСТЬ, ИММУНОГЕННОСТЬ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА A/H5N1 С УДАЛЕННЫМИ ФАКТОРАМИ ПАТОГЕННОСТИ: БЕЛКАМИ NS1 И PBT-F2

Специальность 03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Егоров А.Ю.

Санкт-Петербург -2011

СОДЕРЖАНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

2.1 Вирусы гриппа A H5N1 - потенциальные возбудители пандемии. 11

2.1.1. Структура вируса гриппа A H5N1. 12

2.1.2. Особенности репродукции гриппа птиц A H5N1 15 2. 1.3. Эпидемиология вируса гриппа A H5N1. Угроза пандемии, вызванной вирусом гриппа A H5N1. 18

2.1.4. Иммунный ответ при гриппозной инфекции. 21

2.1.5. NS1 белок вируса гриппа: ингибитор врожденного и адаптивного иммунитета. 28

2.1.6. Белок PB1-F2. Новый фактор патогенности вируса гриппа 34 А.

2.1.7. Метод «обратной генетики» вируса гриппа. 37 2.2. Вакцинопрофилактика гриппа 40

2.2.1. Подготовка H5N1 кандидатов в вакцинные штаммы 41

2.2.2. Современные подходы к разработке H5N1 вакцин. 44

2.2.3. Разработка гриппозных вакцин с использованием методов обратной генетики. 51

2.2.4. Новый подход к созданию пандемической гриппозной вакцины. Живая гриппозная вакцина с удаленной генетической 52 последовательностью, кодирующей белок NS1 .

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 5 7

3.1 Клеточные культуры. 57

3.2 Вирусы. 57

3.3 Вирусологические методы. 58

3.4 Лабораторные животные. 59

3.5 Иммунологические методы. 60

3.6 Молекулярно-генетические методы. 63

3.7 Методы статистической обработки данных. 65

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 65

4.1 Получение и характеристика реассортантных H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы. 65

4.1.1 Получение реассортантных H5N1 delNSl штаммов. 65

4.1.2 Рост H5N1 delNSl штаммов на культуре клеток Vero. 69

4.2 Безопасность и профилактическая эффективность H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы при применении у мышей. 70

4.2.1 Выделение H5N1 delNSl штаммов из респираторного

тракта и трансмиссия в другие органы. 70

4.2.2 Динамика изменения массы тела мышей, иммунизированных H5N1 delNSl штаммами. 71

4.2.3 Формирование кросс-реактивной защиты у мышей,

иммунизированных кандидатом в вакцинные штаммы VN1203delNSl. 1Ъ

4.2.4 Иммуногенностъ кандидата в вакцинные штаммы VN1203delNSl на мышиной модели. 75

4.2.5 Профилактический эффект иммунизации кандидатом в вакцинные штаммы VN1203delNSl при гриппозной инфекции у мышей. 76

4.3 Безопасность и профилактическая эффективность кандидата в вакцинные штаммы VN1203delNSl на модели яванских макак. 78

4.3.1 Развитие клинических симптомов у макак,

иммунизированных штаммом VN1203delNSl. 80

4.3.2 Выделение штамма VN1203delNSl из респираторного тракта вакцинированных животных. Трансмиссия в другие органы. 81

4.3.3 Иммуногенностъ штамма VN1203delNSl на модели яванских макак. 83

4.3.4 Протективная эффективность штамма VN1203delNSl на модели яванских макак. 87

4.4 Влияние отсутствия эксперессии белка PB1-F2 на характеристики H5N1 delNSl вакцинного штамма. 93

4.4.1 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на вирулентность H5N1 реассортантного вирусного штамма. 93

4.4.2 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на способность H5N1 реассортантного вирусного

штамма, вызывать летальную инфекцию у мышей. 95

4.4.3 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на ростовые характеристики H5N1 delNSl штаммов на культуре клеток Vero 96

4.4.4 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на иммуногенностъ H5N1 delNSl штаммов. 97 4.5.4.Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на профилактическую эффективность H5N1 delNSl штаммов. 99

5. ОБСУЖДЕНИЕ 101

6. ВЫВОДЫ 109

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Э Оптическая плотность

НА Гемагглютинин

М01 Множественность инфекции

ЫА Нейраминидаза

Ж)У Вирус болезни Ньюкасла

а.к. Аминокислота

АПК Антигенпрезентирующие клетки

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

вРНК Вирусная РНК

ДК Дендритная клетка

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

днРНК Двунитевая РНК

жвг Живая гриппозная вакцина

ивг Инактивированная гриппозная вакцина

ил Интерлейкин

ИНФ Интерферон

ИФА Иммуноферментный анализ

кРНК Комплементарная РНК

мРНК Матричная РНК

мяРНК Малая ядерная РНК

НК Натуральный киллер

онРНК Однонитевая РНК

ОРС Открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

п.О. Пара оснований

Пре-мРНК Предшественник мРНК

РКЭ Развивающиеся куриные эмбрионы

РМН Реакция микронейтрализации

РНК Рибонуклеиновая кислота

РНП Рибонуклеопротеин

РТГА Реакция торможения гемагглютинации

ТИД50 Тканевая инфекционная доза 50%

ТМБ Тетраметилбензидин

Тх Т-хелпер

ФБР Фосфатно-буферный раствор

ФИО Фактор некроза опухоли

ЭИД50 Эмбриональная инфекционная доза 50%

ЭЛД50 Эмбриональная летальная доза 50%

ЭФ Электрофорез

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Циркуляция высоко патогенных вирусов гриппа А/Н5М1 среди птиц, с периодическими инфекциями людей, продолжается с 1997 года. Высокий уровень смертности (>60%) обусловил необходимость создания эффективной вакцины, для предотвращения потенциальной пандемии, вызванной вирусами «птичьего гриппа».

Одной из основных проблем при создании вакцин против «птичьего гриппа» является недостаток информации об антигенных свойствах возможного пандемического штамма. Это требует либо создания резерва штаммо-специфических вакцин из вирусов - потенциальных возбудителей пандемии, которые смогут защитить население от антигенно различающихся вирусов, либо создания подходящего варианта вакцины из актаульных штаммов в чрезвычайно короткий промежуток времени от начала пандемии.

В настоящее время существует большое количество стратегий для создания пандемических противогриппозных вакцин, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. Так, применяемые в настоящее время традиционные инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ) характеризуются тем, что вызывают выработку системных антител, однако не стимулируют локальный ^А и цитотоксический иммунный ответ. В результате, данные вакцины не способны обеспечивать широкую защиту от антигенно различающихся дрейф-вариантов вируса. Кроме этого, ИГВ, полученные на основе Н5Ш вирусов, демонстрируют низкую иммуногенность, вследствие чего, для формирования протективного иммунного ответа требуется введение в состав вакцины высоких доз антигена, двойной иммунизации и применения различных адъювантов. При подготовке к пандемии живые аттенуированные вакцины имеют ряд преимуществ. В отличие от ИГВ живые интраназальные гриппозные вакцины (ЖГВ) индуцируют местный и системный иммунный ответ, обеспечивая более широкий спектр защиты против дрейф-вариантов вирусов гриппа (Кис1епко е/ а1, 1996; Векке et а1, 2007). Интраназальный

способ введения вакцины является более предпочтительным, по сравнению с инъекционной формой, с физиологической и медицинской точек зрения, особенно у детей (Levine, 2003).

В последнее время во многих исследованиях показана возможность и перспективность использования рекомбинантных вирусов, с усеченным или содержащим замены в белке NS1, в качестве живых-аттенуированных противовирусных вакцин (Egorov et al, 1998; Talon et al, 2000; Fer ko et al, 2004; Falcon et al, 2005; Quinlivan et al, 2005; Solorzano et al, 2005; Baskin et al, 2007; Vincent et al, 2007; Richt et al, 2009). Подобные вакцинные штаммы получают с помощью методов «обратной генетики» и предназначены для интраназального применения. Вирусные штаммы за счет нарушения основной функции полноразмерного NS1 белка, как антагониста системы интерферонов 1-го типа, теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, но могут реплицироваться до высоких титров на соответствующих ИФН-дефицитных системах, таких как клетки Vero, что обеспечивает эффективное производство вакцины (Talon et al, 2000; Romanova et al, 2009). Отсутствие целой генетической последовательности, кодирующей белок NS1, обеспечивае т таким штаммам генетическую стабильность, а отсутствие распространения вируса после вакцинации обеспечивает высокий уровень безопасности вакцины. В то же время, несмотря на отсутствие репликации, delNSl вакцинные вирусы являются достаточно иммуногенными, вследствие повышенной продукции цитокинов в месте апликации вакцины. Местное высвобождение цитокинов, таких как интерфероны первого типа, стимулирует местный иммунитет на слизистых, опосредованный секреторными антителами класса IgA, цитотоксический иммунитет, а также системный В - и Т- клеточный иммунный ответ, обеспечивая перекрестную защиту без использования адъювантов (Talon et al, 2000; Ferko et al, 2004; Stasakova et al, 2005).

Результаты доклинических исследований delNSl кандидатов в вакцинные штаммы против эпидемических вирусов гриппа A (H1N1, H3N2) и В

продемонстрировали их безопасность и профилактическую эффективность на экспериментальных моделях мышей, хорьков и приматов (Wressnigg et al., 2009; Nakowitsch et al., 2011). Перспективность использования delNSl гриппозных вакцин у людей была показана в ходе I фазы клинического исследования моновакцины на основе штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (Wacheck et al., 2010). Использование вирусных штаммов с усеченным NS1 сегментом генома является перспективным подходом к разработке пандемических гриппозных вакцин против вируса гриппа A/H5N1.

Цель исследования. Разработка вакцинных кандидатов против высоко патогенного вируса гриппа A/H5N1 на основе вирусных штаммов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1. Задачи исследования

1. С помощью методов «обратной генетики» получить рекомбинантпые вакцинные штаммы вируса гриппа A/H5N1 различных клайдов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl).

2. Охарактеризовать рекомбинантные H5N1 delNSl вакцинные штаммы in vitro по следующим параметрам: репродуктивность в клеточных культурах, генетическая стабильность и антигенные свойства.

3. Оценить безопасность и иммуногенные свойства H5N1 delNSl вакцинных штаммов на моделях мышей и приматов при интраназальном введении.

4. Оценить протективные свойства H5N1 delNSl вакцинных штаммов вируса гриппа при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей и приматов.

5. Изучить влияние удаления фактора патогенности - белка PB1-F2 на безопасность, иммуногенную активность и протективные свойства delNS 1 вакцинных штаммов.

Научная новизна работы

С помощью методов «обратной генетики» впервые были получены вакцинные штаммы с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl), относящиеся к различным клайдам вируса гриппа A/H5N1. Впервые получены данные о способности H5N1 вакцинных штаммов к эффективному росту на культуре клеток Vero и их генетической стабильности при длительном пассировании. Получена новая информация о безопасности и иммуногенной активности delNSl кандидатов в вакцинные штаммы при применении у животных. Впервые показаны кросс-протективные свойства delNSl штаммов в отношении различных антигенных вариантов вируса гриппа A/H5N1. Показана возможность повышения иммуногенной активности delNSl вирусных штаммов путем дополнительной модификации генома, приводящей к отсутствию экспрессии вирусного белка PB1-F2 - фактора ингибирования системы интерферонов.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований показано, что использование штаммов вируса гриппа A/H5N1, имеющих делецию последовательности, кодирующей белок NS1 (delNSl), в качестве интраназальной вакцины может служить перспективным подходом в решении задач разработки нового поколения пандемических противогриппозных вакцин. Результаты, полученные в ходе проведенных доклинических исследований, использованы для проведения клинического исследования I фазы вакцинного кандидата VN1203 delNSl на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1). Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа A/H5N1, имеющие делецию геномной последовательности, кодирующей белок NS1, являются генетически стабильными при длительном пассировании на культуре клеток Vero и обладают высоким уровнем репродуктивной активности.

2. H5N1 delNSl вакцинные штаммы обладают аттенуированным фенотипом и являются безопасными при интраназальном применении у мышей и приматов.

3. Интраназальная иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами приводит к формированию кросс-реактивного иммунного ответа и обеспечивает защиту от инфекции, вызванной вирусами гриппа A/H5N1 различных клайдов.

4. Отсутствие экспрессии белка PB1-F2 - антагониста системы интерферонов -не снижает ростовых характеристик и приводит к увеличению безопасности и иммуногенной активности H5N1 delNSl вакцинного штамма.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Реассортантные вирусные штаммы получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях лично автором. Экспериментальное заражение приматов высоко патогенным вирусом гриппа A/H5N1 выполнено сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ» - «ВЦ». Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме «Emerging diseases: tick-transmitted and influenza» (Новосибирск,

2007), на Международной конференции «Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook» (Санкт-Петербург, 2007), на Ежегодной отчетной конференции по международному европейскому проекту «Fluvacc» (Вена,

2008), на Международной вирусологической конференции Retroscreen «Medical, Scientific and Historical Lessons from the Great Avian (H1N1) "Spanish" Influenza Pandemic of 1918: The 90th Anniversary» (Лондон, 2008), также представлены на Международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009), международной конференции «Options for the Control of Influenza VII» (Гонконг, 2010), второй

международной конференции «Fundamental and applied problems of medical

primatology» (Сочи, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 11 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 29 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 195 источников на русском и английском языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирусы гриппа A/H5N1 - потенциальные возбудители пандемии.

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, к его единственному роду Influenza. В настоящее время внутри данного рода выделяются три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа различных типов отличаются друг от друга рядом признаков: количеством сегментов генома, гексагональной структурой выступов поверхности, кругом возможных хозяев, а также антигенными различиями внутренних белков (NP и М), не дающими перекрестных межтиповых серологических реакций (Сох, 1999). Несмотря на то, что вирусы гриппа В и С достаточно широко циркулируют в человеческой популяции, только вирусы гриппа А способны вызывать пандемии, представляя, таким образом, серьезную опасность для человечества. Вирусы гриппа А были изолированы не только от человека, но и от птиц и различных видов животных: свиней, лошадей и морских млекопитающих. Однако источником и природным резервуаром всех вирусов гриппа типа А считаются водоплавающие птицы, у которых большинство вирусных штаммов не вызывают смертельных заболеваний, что свидетельствует об их оптимальном уровне адаптации к данному хозяину (Webster et ai, 1992, Львов, 2006).

Разделение вирусов типа А на подтипы основано на антигенных свойствах двух поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время известно 16 подтипов НА и 9 подтипов NA вирусов гриппа А, циркулирующих среди позвоночных. Различия аминокислотных последовательностей участков НА, отвечающих за антигенность, между различными подтипами составляет 30% и более (Rohm et al, 1996).

Одной из особенностей вирусов гриппа является их быстрая изменчивость, вследствие чего появляются штаммы, способные обходить существующий в человеческой популяции иммунитет. Высокий уровень

изменчивости связан либо с возможностью генетической реассортациия между различными субтипами вируса во время смешанной инфекции, либо с высокой скоростью накопления точечных мутаций в геноме вируса. Эти явления являются основными причинами антигенного «шифта» и «дрейфа».

Вирусы всех существующих подтипов НА и НА типа А были выделены от птиц в то время, как среди млекопитающих циркулирует лишь ограниченное число подтипов вируса гриппа А (Каверин, 2003; Са1с1е1 а1., 2007). В человеческой популяции циркулируют вирусы с тремя подтипами НА (Н1, Н2, НЗ) и два ИА (N1 и N2). Эти варианты формируют три основных подтипа вируса гриппа А характерных для человека: НШ1, Н21Ы2 и НЗШ. В истории 20 века известны три пандемии, вызванные вирусами этих субтипов: в 1918 год