Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и сравнительные испытания экспериментальных вакцин против вирусов гриппа H5N1

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и сравнительные испытания экспериментальных вакцин против вирусов гриппа H5N1"

На правах рукописи

Боравлёва Елизавета Юрьевна

Конструирование и сравнительные испытания экспериментальных вакцин против вирусов гриппа Н5М

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 дек гт

Москва - 2013

005543854

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Гамбарян Александра Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

Ожерелков Сергей Викторович

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" РАМН, заведующий лабораторией

кандидат биологических наук, Тимофеева Татьяна Анатольевна

Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Научно-исследовательский

институт вирусологии им.

Д.И.Ивановского» Минздрава России,

ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН

Защита диссертации состоится 27 декабря 2013 г. в /Х^ часов_минут на

заседании Диссертационного совета Д 001.026.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" Российской академии медицинских наук по адресу: 142782, г. Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27км. Киевского шоссе

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «2 С » ноября 2013 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук

В.Н. Ляпустин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Вирусы гриппа Н5Ы1 привлекли внимание широкой общественности в 1997 году, после случаев смертельных заболеваний людей в Гонконге. С вирусом ведется перманентная борьба - уничтожается поголовье птиц в местах вспышек, проводится вакцинация домашней птицы — но все эти меры оказываются недостаточными. По не совсем понятным причинам даже трехкратная вакцинация кур инактивированными вакцинами не предотвращает последующее заболевание и распространение вируса.

Живые гриппозные вакцины требуют значительно меньших количеств антигена, чем инактивированные, вследствие чего они дешевле и, при острой необходимости, могут быть быстро наработаны в достаточных количествах. В последние годы методом обратной генетики создано много экспериментальных живых вакцин путем внесения в геном вируса одного или ряда изменений. Полученные штаммы глубоко аттенуированы, при сохранении хорошей иммуногенности. Однако генетическая стабильность таких конструкций может вызывать сомнения. В случае реассортации, рекомбинации или реверсии может возникнуть вирус с нежелательными характеристиками.

Живая вакцина, не вызывающая такого опасения, должна быть аттенуирована не по одному принципу или одному гену, а, желательно, по всем генам, тогда она не сможет служить причиной возникновения опасных реассортантов. Цели исследования:

1) Создание аттенуированных штаммов вирусов гриппа Н5, которые могут быть использованы в качестве вакцинных продуцентов против Н5Ы1 вирусов гриппа.

2) Сравнение безопасности, иммуногенности и протективности инактивированных цельновирионных и расщепленных вакцин,

вакцин с адъювантами, а также экспериментальных живых вакцины.

3) Создание экспериментальной ветеринарной вакцины против Н5И1 вирусов гриппа.

Задачи исследования:

1) Получить атгенуированный Н5Ш вариант высокопатогенного вируса А/сЫск еп/Ки^ап/3/2005.

2) Получить реассортанты с гемагглютининами Н5 и остальными генами двух доноров аттенуации: холодоадаптированного вируса и апатогенного вируса чайки.

3) Произвести сравнение вирусов с разными гемагглютининами, и полностью совпадающими по остальным генам в качестве экспериментальных вакцин.

4) Изучить на мышах и курах безопасность, иммуногенность и протективную способность инактивированных вакцин, полученных реассортантов и апатогенных вирусов диких уток.

Научная новизна работы

Разработан оригинальный метод «обратной селекции» для аттенуации высокопатогенных вирусов в условиях имитирующих жизненный цикл апатогенных вирусов.

Разработан оригинальный двухступенчатый метод получения реассортантов вирусов гриппа с промежуточной стадией термочувствительного варианта.

На модели мышей впервые показана безопасность и высокая иммуногенность реассортанта с гемагглютинином от высокопатогенного Н51Ч1 вируса А/сЫскеп/Ки^ап/3/2005, аттенуированного методом «обратной селекции» и внутренними генами от холодоадаптированного донора аттенуации.

Впервые изучены, в качестве экспериментальных вакцинных штаммов, конструкции с Н5 гемагглютинином и остальными генами от апатогенного вируса гриппа чайки и апатогенный H5N2 вирус дикой утки целиком.

Практическая значимость работы

Получены аттенуированные реассортанты H5N1 вирусов, перспективные в качестве продуцентов инактивированных и живых вакцин.

Показано, что вирус A/duck/Moscow/4182/2010 (H5N2), выделенный от дикой утки, можно рассматривать как кандидат ветеринарной живой вакцины против высоковирулентных H5N1 вирусов, так как он безопасен для мышей и однодневных цыплят, при этом обеспечивает высокий и равномерный прирост уровня антител и 100% защиту от последующего контрольного заражения высокопатогенным H5N1 вирусом.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Получены холодоадаптированные реассортанты вакцинного штамма А/Vietnam/1203/04-PR8/CDC-RG и аттенуированного штамма A/chicken/Kurgan/3654at/2005 с холодоадаптированным донором внутренних генов A/Leningrad/134/17/57. Оба реассортанта не патогенны для мышей, высокоурожайны на куриных эмбрионах, после однократного инфицирования формируют у мышей протективный иммунитет к вирусу Н5. Штаммы можно рекомендовать как продуценты для производства инактивированной и живой вакцины против вирусов гриппа H5N1.

2) Сравнение субъединичных, цельновирионных и живых вакцин вирусов на мышиной модели показало, что субъединичные вакцины, даже при добавлении адъювантов, недостаточно эффективны, цельновирионная вакцина эффективна только при гомологичной вакцинации, в то время как живые вакцины эффективны даже в

случае антигенного несоответствия вакцинного и инфекционного вируса гриппа.

3) Получены реассортанты VN-Gull и Ku-Gull (H5N2) с гемагглютининами Н5 и остальными генами от непатогенного вируса A/Gull/Moscow/3100/2006, которые после однократного инфицирования формируют у цыплят и мышей стерильный иммунитет.

4) Показано, что природные апатогенные вирусы гриппа птиц могут быть использованы в качестве доноров аттенуации при создании ветеринарных вакцинных штаммов.

5) Впервые показано, что природный апатогенный H5N2 вирус дикой утки можно рассматривать как кандидат ветеринарной живой вакцины против высоковирулентных H5N1 вирусов.

Личный вклад автора Выделение природных изолятов и их характеристика; получение реассортантов и изучение их безопасности, иммуногенности и протективной способности in vivo, а так же изучение иммуногенности и протективной активности вируса A/duck/Moscow/4182/2010 на курах проведено Боравлевой Е.Ю. самостоятельно.

Сравнение разных типов вакцин и получение аттенуированного варианта высокопатогенного вируса A/chicken/Kurgan/3/2005, а также определение нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов вирусов проводилось совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии вирусов гриппа. Определение индекса патогенности вирусов на курах проведено Ильёй Александровичем Чвала, в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Внедрение результатов работы В GenBank депонировано 17 нуклеотидных последовательностей генов вирусов, выделенных либо полученных Е.Ю. Боравлевой.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на:

1. VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007», Москва, 28-30 ноября 2007.

2. 19th Annual Meeting of the Society for Virology in Leipzig, Germany. 18 -21 March 2009.

3. Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», 21-22 декабря 2010 года, Санкт-Петербург.

4. Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» 23-27 мая 2011г. Ялта, Крым.

5. Конгрессе «Простуда и грипп 2012», Москва, 3-4 октября 2012.

6. Научной конференции «Грипп: эпидемиологии, вирусология. Профилактика и лечение», Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012.

7. 17-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 21-26 апреля 2013года

8. Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований,

обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 82 страницах текста, включает 10 таблиц и 10 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 160 источников. Из них 12 отечественных и 148 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы

Таблица 1. Характеристика вирусов гриппа, использованных в работе

Штамм Подтип Обозн. Примечание

A/Vietnam/1203/2004-PR8/CDC-RG H5N1 VN-PR Вакцинный штамм (CDC, Atlanta, USA)

A/Puerto Rico/8/34 H1N1 PR8 Вакцинный штамм

A/Leningrad/134/17/57 H2N2 Len Холодоадаптированный донор аттенуации

A/New Caledonia- Leningrad/134/17/57 H1N1 NC-Len Холодоадаптированный вакцинный штамм

A/duck/Moscow/4182/2010 H5N2 dk/4182 Апатогенный вирус утки

A/Gull/Moscow/3100/2006 H6N2 Gull/3100 Апатогенный вирус чайки

Реассортант с НА от VN-PR и остальными генами от донора аттенуации A/Leningrad/134/l 7/57 H5N2 VN-Len Холодоадаптированный реассортант

Реассортант с НА от VN-PR и остальными генами от штамма A/Gull/Moscow/3100/2006 H5N2 VN-Gull Апатогенный реассортант

A/chicken/Kurgan/3/2005 H5N1 Ku/05 Высоковирулентный вирус кур

A/chicken/Kurgan/3654at/2005, производный от A/chicken/Kurgan/3/2005 H5N1 Ku/at Атгенуирован методом «обратной селекции»

Реассортант с НА от Ku/at и остальными генами от донора аттенуации A/Leningrad/134/l 7/57 H5N2 Ku-Len Холодоадаптированный реассортант

Реассортант с НА от Ku/at и остальными генами от штамма A/Gull/Moscow/3100/2006 H5N2 Ku-Gull Апатогенный реассортант

■ . I

Образцы для иммунизации

В работе использовались инактивированные цельновирионные вакцины, H5Nl-spIit-BaKUHHa (полуфабрикат вакцины гриппозной инактивированной расщепленной с вирусом птичьего гриппа штамм Nibrg-14 A/Vietnam/1194/2004; производство «Микроген»), вводимая совместно с адъювантами или без них, субъединичные вакцины с адъювантом полиоксидонием, а также экспериментальные живые вакцины против H5N1 вирусов.

Изоляция вирусов диких птиц.

Выделение вирусов проводили из свежих фекалий, которые суспендировали в двойном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) с добавлением антибиотиков: 0,4 мг/мл гентамицина, 0,1мг/мл канамицина, 0,01 мг/мл нистатина и 2% раствора MycoKill AB (PAA Laboratories GmbH), центрифугировали при 4 тыс. об/мин 10 минут и заражали супернатантом (200 мкл) 10-дневные куриные эмбрионы. Через 48 часов инкубации при 37°С собирали аллантоисную жидкость и для дальнейшего пассирования отбирали положительные в реакции гемагглютинации (РГА) пробы. Типирование гемагглютинина проводили в реакции торможения гемагглютинации, либо секвенированием фрагмента НА.

Иммунизация мышей живыми штаммами вирусов гриппа

Вводили мышам интраназально по 50 микролитров вируссодержащих растворов под легким эфирным наркозом. Ежедневно взвешивали мышей, на 14-ый день или в другие сроки брали по 100 микролитров крови из хвоста.

Вакцинация цыплят путем выпаивания им живого вируса

Цыплят оставляли на ночь без воды. Утром помещали в клетки поилки, из расчета одна поилка на 3 цыплят, в которые было налито по 10 мл неразведенной ВАЖ с содержанием живого вируса 107 ЭИД/мл.

Аэрозольная вакцинация и контрольное заражение цыплят

Цыплят помещали в 20-литровый контейнер, к которому было подведена трубка от ультразвукового распылителя «Муссон», в который помещали 20 мл свежей вируссодержащей аллантоисной жидкости. Отводящая трубка была направлена на НЕРА-фильтр. Цыплят выдерживали в аэрозольной атмосфере 30 минут. Расчетная доза вируса на цыпленка - 10е ЭИД50. После обработки, цыплят 10 минут облучали ультрафиолетом и рассаживали по клеткам, после чего ежедневно взвешивали и контролировали падеж. Через 14 дней брали пробы крови из подключичной вены на определение антител, а через 30 дней проводили контрольное заражение Н5>11 вирусом гриппа А/сЫскеп/Ки^ап/3/2005 так же аэрозольным способом, но с дозой инфекционного вируса 103 ЭИД50.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование экспериментальных живых вакцин против гриппа Н51Ч1; сравнительные испытания на мышах

Аттенуация высокопатогенного вируса А/сМскеп/Ки^ап/3/2005 Для получения аттенуированного штамма из высокопатогенного Н5М1 вируса А/сЫскеп/Ки^ап/3/2005, мы воспользовались принципом «обратной селекции», проводя отбор вируса по тем параметрам, которые резко отличаются у непатогенных вирусов гриппа диких уток и высокопатогенных вирусов кур. Вирусы диких уток сохраняют инфекционность, проходя через кишечник птицы, а так же в течение зимних месяцев в природных водоемах. Это обусловлено высокой

устойчивостью этих вирусов. Они выдерживают обработку протеазами, инкубацию в кислой среде. Конформационный переход гемагглютинина, предшествующий слиянию вирусной и клеточной мембран, у утиных вирусов происходит при рН 4,5 - 5,1. Вирусы кур более лабильны. Они плохо выдерживают хранение, полностью инактивируются при обработке рН 5. Исходя из этих соображений, мы проводили селекцию аттенуированного варианта.

Принцип селекции заключался в получении вируса аттенуированного для куриных эмбрионов (КЭ), более устойчивого к протеазному расщеплению и кислым значениям рН, чем родительский вирус. В первых пяти пассажах посевной вирус (неразбавленная ВАЖ) предварительно инкубировали в течение 20 ч при 37°С с трипсином в концентрациях от 0,01 до 1 мг/мл, после чего заражали эмбрионы и брали в следующий пассаж образцы вируса, выдержавшие обработку самой высокой концентрацией трипсина. Инфекционность исходного вируса после первой обработки трипсином упала на 6

Последующие пять пассажей проводили с предварительной инкубацией посевного вируса в буферах с рН от 4,7 до 5,2 в течение 1 ч при 37°С. Из инфицированных КЭ для дальнейшей работы отбирали образцы вируса, выдержавшие обработку буфером с самым низким значением рН. Далее проводили селекцию по патогенности вируса для КЭ. Исходный вирус Ки/05 (Н5Ы1) вызывал гибель КЭ через 30 ч после заражения, достигая титра 32-64 (определяли в реакции гемагглютинации, РГА). Среди эмбрионов, инфицированных вирусом, прошедшим выше описанные пассажи, через 72 ч отбирали живые КЭ с титром вируса 128-512 в РГА. После того, как были пройдены все три этапа селекции, аттенуированный для КЭ вирус был клонирован путем трёх последовательных пассажей при предельных разведениях и получил название А/сЫскеп/Ки^ап//3654а1/2005 (Ки/аО.

Аминокислотные замены в Ku/at по сравнению с исходным вирусом A/chicken/Kurgan/3/2005 и с апатогенньши вирусами диких уток.

Сравнение нуклеотидной последовательности полного генома штамма Ku/at с исходным штаммом обнаружило мутации, повлекшие замену аминокислот, в генах РВ1, РВ2, НА, NP, NA, NS1. Неизмененными остались гены РА и М.

В табл. 2 приводятся аминокислоты в измененных позициях Ku/at по сравнению с родительским штаммом A/chicken/Kurgan/3/2005 и консенсусные аминокислоты в этих позициях у вирусов гриппа диких уток.

Табл.2. Аминокислотные замены в Ки/а1 по сравнению с родительским штаммом и вирусами гриппа диких уток. __^

Белок РВ1 PB2 HAÏ* HAÏ HA2 HA2 NP NA NA NSI

Позиция аминокислоты 218 25 54 222 48 131 386 46 189 37

Вирусы диких уток Leu Asp Asn Lys Ile Glu Trp Thr Asn Arg

Ки/05 Leu Asp Asp Lys Va! Lys Trp Ala Asn Arg

Ku/at Met Asn Asn Thr Ile Glu Cys Thr Ser His

♦Нумерация аминокислот гемагглютинина соответствует НЗ НА.

Все замены во внутренних генах касаются крайне консервативных участков кодируемых белков, участвующих в важных функциях репликативного цикла вируса. С другой стороны, 4 аминокислотные замены в НА и NA, являются реверсиями к последовательности, характерной для непатогенных вирусов гриппа диких уток [Ломакина и др., 2011]. Аминокислоты Asp54 в HAI, Val48 и Lysl31 в НА2 находятся в стеблевом участке гемагглютинина, где тесно контактируют НА1 и НА2 цепи. Мутации в этой области могут влиять на подвижность молекулы и

параметры конформационного перехода гемагглютинина. Для проверки этого предположения мы измерили рН конформационного перехода гемагглютинина штаммов Ки/05 и КиЛй в сравнении с Н5 вирусом дикой утки.

Изменение рН конформационного перехода гемагглютинина

Гемагглютинин вируса гриппа агглютинирует эритроциты при нейтральных значениях рН, а при кислых - приводит к их гемолизу. Степень гемолиза зависит от способности гемагглютинина к конформационному переходу при данном значении рН. На рис. 1 приведены кривые уровня гемолиза куриных эритроцитов в комплексе с вирусами АМиск/Рптопе/2621/2001 (Н5Ы2), Ки/05 и КиЫ при разных значениях рН. У непатогенного утиного вируса гемолиз проходит при рН5-5,2, а у высокопатогенного А/сЫскеп/Ки^ап/3/2005 при рН 5,6 и выше. Кривые гемолиза «утиного» и аттенуированного КиЫ вирусов совпали, то есть значение рН конформационного перехода НА аттенуированного вируса КшЫ снизилось на 0,5 единицы по сравнению с исходным высоковирулентным штаммом Ки/05 и приблизилось к таковому вирусов диких уток.

Рис.1. Зависимость гемолиза эритроцитов в комплексе с вирусами Н5 от значения pH среды. Обозначения: duck Н5 - A/duck/Primorie /2621/2001, Ku/05 - A/chicken/Kurgan/3/2005 и Ku/at - A/chicken/Kurgan/3654at/2005. A492 - поглощение при 492 нм, которое соответствует степени гемолиза эритроцитов.

Получение реассортанта с гемагглютинином от аттенуированного A/chicken/Kurgan/3654at/2005 и остальными генами от холодоадаптированного A/Letiingrad/134/l 7/57

Следующим этапом было получение термочувствительного реассортанта с гемагглютинином Н5 от Ku/at. В качестве источника остальных генов мы выбрали холодоадаптированный донор аттенуации A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (Len), любезно предоставленный нам Л.Г.Руденко (Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург). Этот донор аттенуации широко используется для производства живых гриппозных вакцин для взрослых и детей.

Для получения реассортанта 10-дневные куриные эмбрионы заражали одновременно вирусами A/Leningrad/134/17/57 и Ku/at и проводили селекцию в присутствии мышиной иммунной сывороткой против вируса A/Leningrad/134/17/57 при температуре 26°С. После клонирования выбрали образцы положительные в реакции торможения гемагглютинации с

сывороткой против А/сЫскеп/Ки^ап/3/2005 (Н5Ы1), и отрицательные с сывороткой против А/Ьешг^гас1/134/17/57. После этого трижды клонировали вирус предельными разведениями, культивируя 96 часов при 26°С.

У полученного реассортанта был определён генный состав и полная нуклеотидная последовательность гемагглютинина. В гемагглютинине не обнаружено ни одной аминокислотной замены по сравнению с Ки/а1, а все остальные гены соответствуют генам донора аттенуации А/ЬешгщгасШ 34/17/57. Реассортанту присвоено наименование Ки-Ьсп. Аналогичным образом из вакцинного штамма УЫН5Ш-РЯ8/СОС-ЯО (УЫ-РЯ) получен и охарактеризован реассортант УЫ-Ьеп [Боравлева и др., 2011].

Штаммы Ки-Ьеп и \Ы-Ьеп хорошо растут на 10-дневных куриных эмбрионах. При выращивании в течение 72 часов при 32°С их урожайность существенно выше, чем у родительских штаммов Ки/05 и КиМ и вакцинного штамма УЫ-РЯ. Ки-Ьеп и У1ч1-Ьеп сохранили присущие родительскому штамму А/Ьеп^гас1/134/17/57 холодоадаптированность и термочувствительность.

Штаммы Ки-Ьеп и У1Ч-Ьеп, так же как живая вакцина ЫС-Ьеп не вызывают никаких признаков заболевания мышей.

Исследование специфической и гетеросубтипической протективности экспериментальных штаммов в сравнении с инактивированными, цельновирионными и БрШ-вакцинами (с адъювантами и без них) показало что:

1) Холодоадаптированные реассортанты Ки-Ьеп и У1Ч-Ьеп после однократного инфицирования мышей формируют у них протективный иммунитет к вирусу Н5. Штаммы можно рассматривать как потенциальные продуценты для производства инактивированных и живых вакцин против вирусов гриппа Н5Ы1.

2) Гетеросубтипическая вакцинация живой вакциной не предотвращает заболевания при последующем заражении H5N1 вирусом, но способствует выздоровлению и практически полностью предотвращает гибель мышей.

3) Гетеросубтипическая вакцинация инактивированной цельно-вирионной вакциной не обеспечивает никакой защиты от последующего заражения H5N1 вирусом.

4) Вакцинация гетеросубтипической субъединичной вакциной с полиоксидонием делает мышей более уязвимыми к последующему заражению H5N1 и H1N1 вирусами.

Создание и испытание живых ветеринарных вакцин на курах Двухступенчатое получение реассортантов Ku-Gull и VN-Gull Поскольку дополнительной целью нашего исследования было создание ветеринарной анти-Н5Ш вакцины, а холодадаптированные штаммы плохо размножаются при температуре тела курицы, мы получили реассортантные штаммы с гемагглютининами от Ku/at и VN-PR и прочими генами от апатогенного вируса чайки A/Gull/Moscow/3100/2006.

Прямое получение реассортантов, содержащих модифицированный Н5 гемагглютинин и внутренние гены от вируса GuII/ЗЮО, осложнено тем, что родительские вирусы Ku/at и VN-PR содержат внутренние гены хорошо растущих в куриных эмбрионах вирусов, и заменить их в полном составе на гены Gull/3100 без селективного давления довольно сложно. Поэтому мы воспользовались двухступенчатой схемой, используя селективное воздействие температуры для отбора нужных внутренних генов на каждой стадии. На первой стадии внутренние гены от Ku/at и VN-PR заменили на гены холодоадаптированного Len путем отбора при температуре 26°С, и получили реассортанты Ku-Len и VN-Len. На второй стадии отбор при 39°С позволил нам заменить гены Len на гены Gull/ЗЮО. Отбор нужного

гемагглютинина проводился с помощью иммунных сывороток против донора внутренних генов: на первой стадии сыворотки против A/Leningrad/134/17/57, а на второй стадии сыворотки против A/Gull/Moscow/3100/2006.

Генный состав реассортантов определяли в ПЦР со специфическими праймерами, позволяющими дифференцировать гены PA, РВ1, РВ2 штаммов Len и PR8; а также секвенированием отдельных участков генома. В обоих реассортантах ген гемагглютинина соответствовал гемагглютинину Ku/at или VN-PR, а все остальные гены соответствовали генам A/Gull/Moscow/3100/2006. Примечательно, что, несмотря на неблагоприятное селективное действие сыворотки против H6N2 внутренним генам сопутствовала нейраминидаза. Штаммы Ku-Len и VN-Len содержали N2 от вируса A/Leningrad/134/17/57, а штаммы Ku-Gull и VN-Gull - N2 от вируса Gull/3100, так что все полученные варианты имели формулу H5N2. Возможно, этот результат объясняется тем, что штамм с формулой H5N2 дает более высокий урожай в КЭ, чем аналогичный в других отношениях штамм с формулой H5N1. По-видимому, низкоурожайные H5N1 клоны были нами потеряны в ходе селекции и клонирования.

Испытание экспериментальных штаммов в качестве живых ветеринарных вакцин на курах

Для выяснения вопроса, могут ли реассортанты с внутренними генами от апатогенного природного изолята, а так же нативный вирус дикой утки (H5N2) служить живыми ветеринарными вакцинами мы провели испытания штаммов Ku-Gull, VN-Gull и dk/4182 на курах. Для сравнения в опыты были включены родительские и холодоадаптированные штаммы.

Сравнение патогенности экспериментальных штаммов при разных схемах заражения кур

Таблица 3. Выживание цыплят при разных способах заражения.

Заражение: Аэрозольное Интра-назальное Выпаивание

Доза Штамм. 10ьЭИД5о 10ьЭИД5о 108ЭИД5о

Ки/05 0/5* 0/5 -

Ku/at - 8/11 -

Ku-Len 19/19 20/20 -

Ku-Gull 1/13 14/17 4/5

VN-Len 12/12 19/19 -

VN-Gull 6/10 9/10 5/5

dk/4182 26/26 8/8 60/60

gull/3100 8/8 8/8 -

♦Число выживших/ число зараженных.

Наиболее жестким способом заражения является аэрозольное инфицирование однодневных цыплят. В этом случае штамм Ku-Gull убивает подавляющее большинство цыплят, а штамм VN-Gull - около половины. При интраназальном заражении штаммы Ku/at, Ku-Gull и VN-Gull вызывают частичный падеж.

При выпаивании цыплятам свежей ВАЖ, содержащей 108 ЭИД50 инфекционного вируса, падеж отмечался в группе инфицированных вирусом Ku-Gull. Штаммы Ku-Len, VN-Len и природные изоляты dk/4182 и Gull/3100 не вызывали падежа ни при какой из испытанных схем вакцинации.

Иммуногенность экспериментальных штаммов для цыплят

Для оценки иммуногенности разных штаммов, через две недели после инфицирования у каждого цыпленка брали по 200 микролитров крови из подключичной вены и определяли титр специфических антител в сыворотках методом ИФА. Антигенами служили соответствующие очищенные вирусы (VN-PR для определения антител к Н5 НА и gull/3100 для определения антител к Н6 НА). На рис.2 представлены титры антител в сыворотках крови индивидуальных цыплят после инфицирования

реассортантными штаммами и вирусами гриппа диких птиц: A/duck/Moscow/4182/2010 и A/gull/Moscow/3100/2006.

Рис. 2. Титры анти-Н5 либо анти-Нб антител в сыворотках цыплят, инфицированных вирусами Ku-Len, Ku-Gull, VN-Len, VN-Gull, dk/4182 либо guIi/3100.

Под названием штамма приведено значение среднегеометрического титра для всей группы и специфичность антител.

У цыплят, вакцинированных вирусами Ku-Len и VN-Len, среднегеометрические титры лежат между значениями 100 и 200; причем разброс титров от сыворотки к сыворотке достигает 20. Примерно у половины цыплят титры анти-Н5 антител ниже 100, что ниже защитной величины. Вирусы Ku-Gull и VN-Gull вызывают, примерно, в 10 раз более высокий и более равномерный прирост антител.

В группах, вакцинированных dk/4182 либо gull/3100 даже в самых «слабых» сыворотках титр антител превышает защитный уровень. Соотношение иммуногенности реассортантов Ku-Len и VN-Len, с одной стороны, и Ku-Gull и VN-Gull, с другой стороны, коррелирует с их патогенностью. Однако природные изоляты dk/4182 и gull/3100 обеспечивают высокий и равномерный прирост антител, не вызывая у цыплят никаких клинических признаков заболевания.

Патогенность и протективная активность экспериментальных штаммов при аэрозольном заражении цыплят

Сравнение внутривенной, интраназальной и аэрозольной вакцинации привело к выводу, что наиболее жестким способом инфицирования является аэрозольная вакцинация 1-дневных цыплят. Кроме того, чем моложе цыплята, тем они чувствительнее к контрольному заражению, поэтому такая схема опыта лучше всего способна выявить слабые стороны экспериментальных вакцин. На Рис.3 приводятся результаты типичного опыта по аэрозольной вакцинации 1-дневных цыплят с последующим челленджем 100LD50 H5N1 вируса A/chicken/Kurgan/3/2005. Штаммы Ки-Gull и VN-Gull вызывают существенный падеж цыплят, то есть, не пригодны для использования в качестве живой вакцины. Штаммы Ku-Len и VN-Len не вызывают признаков заболевания и падежа, кривая веса совпадает с кривой веса интактных цыплят. Однако, эти штаммы недостаточно иммуногены, и защита от последующего заражения lOOLDso H5N1 вируса невелика. Наилучшие результаты получены с вирусом A/duck/Moscow/4182/2010, который не вызывал падежа и видимых признаков заболевания цыплят, но тем не менее обеспечивал высокий и равномерный прирост антител и 100% защиту от последующего контрольного заражения.

Дни после вакцинации

—♦—Контроль —а—dk4182 —е—Ku-Gull - х - Ku-Len —l—VN-Gull -л- VN-Len

Рис.3 Динамика веса цыплят после аэрозольного заражения штаммами VN-Len, VN-Gull, Ku-Len, Ku-Gull и dk/4182.

Протективная активность вируса A/duck/Moscow/4182/2010 при заражении цыплят путем выпаивания ВАЖ

Важнейшим параметром вакцины против H5N1 вируса для кур является простота использования, так как H5N1 HPAIV это, в первую очередь, проблема слаборазвитых стран и мелких семейных птицеводческих хозяйств. Наиболее простым способом инфицирования живой вакциной является добавление инфекционного вируса в поилку. Для изучения возможности такого использования вируса A/duck/Moscow/4182/2010, мы выпаивали цыплятам свежую ВАЖ, через две недели брали у них кровь на определение антител, а через 30 дней после инфицирования проводили челлендж вирусом A/chicken/Kurgan/3/2005 (100LD5O). На рис.4 представлены титры антител в сыворотках крови индивидуальных цыплят, инфицированных однократно в 7-дневном и 30-дневном возрасте, либо двукратно в 7- и 30-дневном возрасте. Выпаивание живого вируса 30-дневным цыплятам гораздо более эффективно, чем 7-дневным. У 30-дневных цыплят титр анти-Н5 антител варьировал от 500 до 5000 и у всех

превышал защитный уровень. Прирост антител у 7-дневных цыплят был слабым и неравномерным (титры от 50 до 500), однако такая иммунизация хорошо выполняла роль «праймирования», поскольку повторное выпаивание живого вируса обеспечило очень высокий уровень антител у всех цыплят.

Возраст цыплят при вакцинации и среднегеометрический титр антител

Рис. 4. Титры анти-Н5 антител в сыворотках индивидуальных цыплят и значение среднегеометрического титра для всей группы цыплят, инфицированных вирусом с!к/4182 путем выпаивания. Черные колонки отражают цыплят, погибших после челленджа, а белые колонки -переживших челлендж.

Заключение

С Н5Ы1 вирусами ведется перманентная борьба - уничтожается поголовье птиц в местах вспышек, проводится вакцинация домашней птицы - но все эти меры оказываются недостаточными. По не совсем понятным причинам даже трехкратная вакцинация кур инактивированными вакцинами не предотвращает последующее заболевание и распространение вируса. Не прекращающиеся усилия добиться полного антигенного соответствия вакцин циркулирующему вирусу приводят к ускорению эволюции вируса и изменению антигенных характеристик, что вызывает

потребность в очередной модернизации вакцинных штаммов. Одним из способов вырваться из этого порочного круга было бы использование живых вакцин, способных к гораздо более широкой перекрестной защите, чем инактивированные вакцины.

В последние годы методом обратной генетики создано много экспериментальных живых вакцин путем внесения в геном вируса одного или ряда изменений, радикально устраняющих отдельные факторы патогенности. Полученные штаммы глубоко аттенуированы, при сохранении хорошей иммуногенности, однако генетическая стабильность таких конструкций может вызывать сомнения. В случае реассортации, рекомбинации или реверсии искусственных штаммов может возникнуть вирус с нежелательными характеристиками. Но это связано с тем, что мощный аттенуирующий фактор в таких штаммах сочетается с факторами патогенности родительского вируса. Не случайно, в последнее время снова становится популярной старая идея МигрЬу — использовать гены авирулентных вирусов диких птиц как доноры аттенуации при создании вакцин [Боравлева и др., 2011; ОатЬагуап й а1, 2012]. Вирусы гриппа диких птиц тысячелетиями подвергались стабилизирующему естественному отбору по признаку авирулентности. Лишь в противоестественных условиях птицеводческих ферм с круглогодичной скученностью птицы повышение вирулентности перестает быть препятствием для распространения вируса. За годы циркуляции в домашних курах у Н5Ы1 вирусов практически во всех генах накопилось множество мутаций, повышающих их патогенность и отличающих их от вирусов гриппа диких птиц

Логическим завершением идеи МигрЬу является использование в качестве живой вакцины природного апатогенного вируса целиком. Наш опыт показывает, что Н5Ы2 вирус дикой утки хорошо работает в качестве живой ветеринарной вакцины против Н5Ы1 вирусов. Он практически

удовлетворяет всем требованиям «идеальной ветеринарной вакцины», сформулированными Peyre et al, в 2009г.

S Он безопасен для цыплят любого возраста при любом способе введения.

•S Он полностью безопасен для мышей, и, по всей вероятности, для других млекопитающих, включая человека.

■S Он вызывает хороший иммунный ответ при однократном введении.

■S Его можно использовать путем добавления живого вируса в поилку, что является самым простым способом вакцинации, не требующим индивидуальной обработки каждой птицы.

•S Он удовлетворяет критерию «DIVA» за счет нейраминидазы N2.

Теоретически, выделенный в природе вирус, в отличие от искусственных конструкций, должен быть генетически стабильным. Возможная утечка вакцинного вируса во внешнюю среду не должна представлять проблемы, так как этот вирус и так свободно циркулирует во внешней среде. Дополнительными преимуществами такой вакцины являются дешевизна, простота производства, и отсутствие необходимости покупки патентов на использование.

Выводы

1) Сравнение субъединичных, цельновирионных и живых вакцин вирусов на мышиной модели показало, что субъединичные вакцины, даже при добавлении адъювантов, недостаточно эффективны, цельновирионная вакцина эффективна только при гомологичной вакцинации, в то время как живые вакцины эффективны даже в случае антигенного несоответствия вакцинного и инфекционного вируса гриппа.

2) Разработан метод «обратной селекции» для аттенуации высокопатогенных вирусов в условиях имитирующих жизненный цикл

вирусов диких уток и получен аттенуированный H5N1 вариант вируса A/chicken/Kurgan/3/2005

3) Получены холодоадаптированные реассортанты вакцинного штамма A/Vietnam/l 203/04-PR8/CDC-RG и аттенуированного штамма Ku-at с холодоадаптированным донором внутренних генов A/Leningrad/134/17/57. Оба реассортанта не патогенны для мышей, высокоурожайны на куриных эмбрионах, после однократного инфицирования формирует у мышей протективный иммунитет к вирусу Н5. Штаммы можно рекомендовать как продуценты для производства инактивированной и живой вакцины против вирусов гриппа H5N1.

4) Разработан двухступенчатый метод получения реассортантов вирусов гриппа, основанный на привлечении холодоадаптированного вируса-посредника и селекции при определенных температурных режимах. Данный прием можно рекомендовать для всех случаев получения «трудных» реассортантов, когда нужно заменить гены высокопродуктивного вируса на гены низкопродуктивного.

5) Получены реассортанты VN-Gull и Ku-Gull (H5N2) с гемагглютининами Н5 и остальными генами от непатогенного вируса A/Gull/Moscow/3100/2006, которые после однократного инфицирования формируют у цыплят и мышей стерильный иммунитет.

6) Показано, что природные апатогенные вирусы гриппа птиц могут быть использованы в качестве доноров аттенуации при создании ветеринарных вакцинных штаммов.

7) Впервые показано, что природный апатогенный H5N2 вирус дикой утки можно рассматривать как кандидат ветеринарной живой вакцины против высоковирулентных H5N1 вирусов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Ganibaryan A.S., Boravleva E.Y., Matrosovich Т.Y., Matrosovich M.N., Klenk H.D., Moiseeva E.V., Tuzikov A.B., Chinarev A.A., Pazynina G.V., Bovin N.V. Polymer-bound 6' sialyl-N-acetyllactosamine protects mice infected by influenza virus // Antiviral Research. - 2005. - №3. -P. 116-123.

2) Ломакина Н.Ф., Гамбарян A.C., Боравлева Е.Ю., Кропоткина Е.А., Кириллов И.М., Лаврентьев М.В., Ямникова С.С. Характеристика апатогенного вируса гриппа А/Чайка/Москва/3100/2006 (H6N2), выделенного в г. Москве // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2009. — Т.29. — №1. — С. 32-40.

3) Ломакина Н.Ф., Боравлева Е.Ю., Кропоткина Е.А., Ямникова С.С., Дрыгин В.В., Гамбарян A.C. Аттенуация вируса гриппа А/курица/Курган/3/2005 (H5N1) селекцией в условиях, имитирующих жизненный цикл вирусов диких уток // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. -№3. - Р. 35-41.

4) Боравлева Е.Ю., Ломакина Н.Ф., Кропоткина Е.А., Руднева И.А., Ямникова С.С., Руденко Л.Г., Дрыгин В.В., Гамбарян A.C. Получение и характеристика реассортантного вируса гриппа А с гемагглютинином Н5 и остальными генами от апатогенного вируса H6N2. Испытание полученного штамма на мышах и курах // Вопросы вирусологии. - 2011. - №6. - С. 9-14.

5) Gambaryan A.S., Lomakina N.F., Boravleva K.Y.. Kropotkina E.A., Mashin V.V., Krasilnikov I.V., Klimov A.I., Rudenko L.G. Comparative safety, immunogenicity and efficacy of several anti-H5Nl influenza experimental vaccines in a mouse and chicken models // Influenza and Other Respiratory Viruses. - 2012. - №3. - P. 188-195;

6) Ломакина Н.Ф., Боравлева Е.Ю.. Кропоткина E.A., Дрыгин В.В., Гамбарян A.C. Испытание живых вакцин против вируса гриппа H5N1 на мышах и курах в сравнении с инактивированными вакцинами // Ветеринарна медицина, Харьков. - 2011. - №95 - С.209-211.

7) Боравлева Е.Ю.. Ломакина Н.Ф., Гамбарян A.C. Выделение вирусов гриппа А от птиц на водоёмах Москвы // Казарка. — 2012. — №2. — С.13-28.

Подписано в печать: 18.11.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 219 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.regiet.ru