Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукции

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукции"

На правах рукописи

СЕРГЕЕВА Мария Валерьевна

ПОВЫШЕНИЕ КАЧЕСТВА ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА А/Н5М ПУТЕМ УВЕЛИЧЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОГО ДОНОРА РЕПРОДУКЦИИ

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

З 'І СКЇ 2013

Санкт-Петербург — 2013

005536129

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Романова Юлия Романовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Киселева Ирина Васильевна

доктор биологических наук Щелканов Михаил Юрьевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 25 ноября 2013 года в _12_ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

Автореферат разослан «ЛЗ » октября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор медицинских наук

/ Е.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Появившиеся впервые в 1997 году в популяции людей высокопатогенные вирусы гриппа птиц A/H5N1 продолжают распространяться из Азии в Европу и Африку, представляя несомненную угрозу для человечества. (WHO, 29 August 2013). В настоящее время показано, что циркулирующему вирусу достаточно приобрести всего 24 мутации в основном поверхностном белке - гемагглютинине (НА), чтобы приобрести способность к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Rüssel et al., 2012). Следствием таких мутаций станет появление штамма, способного вызвать масштабные вспышки, эпидемию или даже пандемию. Вакцинопрофилактика является основным механизмом предотвращения широкого распространения гриппозной инфекции, а главным компонентом противогриппозных вакцин и основной мишенью нейтрализующих вирусспецифических антител является вирусный белок НА. Большинство существующих лицензированных вакцин против вируса гриппа A/H5N1 получают на основе реассортантных вирусов, содержащих поверхностные антигены НА и NA от птичьих вирусов, а остальные гены от донора репродуктивности, вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). В случае возникновения предпандемической ситуации потребуется быстрая наработка вакцины в количестве, необходимом для вакцинации населения всего земного шара. Однако данные реассортанты характеризуются сниженной репродуктивной активностью в куриных эмбрионах (КЭ), являющихся основным субстратом для производства вакцин, и низким содержанием НА в очищенных препаратах (Horimoto et al., 2006, Harvey et al., 2008). Причина этих феноменов до последнего времени оставалась неизвестной. Мы предположили, что одной из причин низкой репродуктивной активности реассортантов может быть несоответствие генов донора репродуктивности и птичьего вируса A/H5N1. Вторым фактором может являться НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц, который характеризуется высоким значением pH активации и отличается по этому параметру от всех вирусов гриппа человека (Scholtissek, 1985). Повышенное значение pH, при котором происходит изменение конформации НА, необходимой для обеспечения слияния вирусной и эндосомальной мембран, непосредственно связано с низкой стабильностью нативной структуры НА (Carr et al., 1997).

В данной работе исследуется возможность использования альтернативного донора для получения реассортантов A/H5N1 для производства гриппозных вакцин и изучается возможность повышения количества нативного НА в препаратах ИГВ путем понижения pH активации НА и повышения, таким образом, его стабильности.

Цель исследования: Конструирование и изучение репродуктивных свойств реассортантов A/H5N1, полученных на основе различных доноров, и оценка влияния стабильности гемагглютинина реассортантов A/H5N1 на его содержание в препаратах очищенных вирусов.

Задачи исследования:

1. Конструирование реассортантов, содержащих НА и NA высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1, на основе донора репродуктивности A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома.

2. Конструирование реассортантов A/H5N1, содержащих мутацию К5821 во второй субъединице НА, и оценка влияния данной мутации на стабильность вирусов и содержание нативного НА в инактивированных вакцинных препаратах.

3. Получение реассортантного штамма A/H5N1 на основе нового высокорепродуктивного и холодоадаптированного донора А/Гонконг/1/68/162/3 5(H3N2).

4. Изучение безопасности и специфической активности прототипов живой (ЖГВ) и инактивированной (ИГВ) вакцин, полученных из реассортантного штамма A/H5N1 на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) в модельных экспериментах на животных.

Научная новизна работы.

В результате проведенной работы впервые продемонстрировано влияние рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 и стабильности нативной конформации молекулы НА на количественное содержание НА в препаратах очищенных инактивированных вирусов.

Впервые в качестве донора внутренних генов для получения реассортанта A/H5N1 был использован холодоадаптированный и высокорепродуктивный штамм А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2). Показана высокая репродуктивная активность, безвредность, иммуногенность и защитная эффективность реассортанта Ast/HK, что подтверждает возможность использования вируса А/Гонконг/1/68/162/35 в качестве единого донора для производства штаммов для ИГВ и ЖГВ.

Практическая значимость работы.

В рамках проведенной работы определен параметр, а именно, стабильность НА, критически влияющий на качество ИГВ. Показана возможность повышения стабильности НА вирусов гриппа A/H5N1 путем введения модифицирующих мутаций во вторую субъединицу НА. Сконструированы реассортантные штаммы Ast58/PR8 и Kur58/PR8, обладающие высокой репродуктивной активностью в КЭ и стабильным НА, которые могут быть использованы для производства ИГВ против потенциально пандемических вирусов гриппа A/H5N1. Получен реассортант Ast/HK, обладающий помимо высокой репродуктивности, фенотипическими признаками аттенуации, который может быть рекомендован как единый вакцинный кандидат для производства ЖГВ и ИГВ против вирусов гриппа A/H5N1.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома при конструировании реассортантов с поверхностными антигенами высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории России и Казахстана, обеспечивало преимущество созданных реассортантов перед вакцинным вирусом NIBRG-14 по репродуктивной активности в КЭ.

2. Понижение рН активации НА путем введения точечной мутации К58—>1 в НА2 повысило устойчивость реассортантов A/H5N1 к воздействию кислой среды и повышенной температуры, и привело к увеличению содержания нативного и иммунокомпетентного гемагглютинина в очищенных инактивированных вирусных препаратах.

3. Реассортантный штамм с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса A/H5N1, созданный на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/35, унаследовал от донора свойства аттенуации и превосходил по репродуктивной активности скорости в КЭ реассортант на основе донора A/Puerto Rico/8/34.

4. Экспериментальные препараты ИГВ и ЖГВ, полученные из реассортантного штамма A/H5N1, созданного на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, обладали высокой иммуногенной и протективной активностью у лабораторных животных. Препарат ЖГВ при интраназальном введении стимулировал выработку мукозальных вирусспецифических антител, обеспечивая полноценную защиту от инфекции.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, анализе и статистической обработке полученных результатов. Автором лично получены высокорепродуктивные реассортантные штаммы A/H5N1, а также апробированы прототипы вакцинных препаратов на их основе. Вклад соавторов заключается в антигенной характеристике вирусов гриппа A/H5N1 с диагностическими постинфекционными сыворотками хорьков, а также в получении электронных микрофотографий очищенных вирусов гриппа.

Внедрение результатов работы. Сконструированные автором реассортантные штаммы Ast/HK, Ast58/PR8, Kur/PR8, Kur58/PR8 депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2626, 2734, 2735, 2736 соответственно. Штамм Ast/PR8 депонирован в коллекцию микроорганизмов НИИ проблем биологической безопасности Республики Казахстан под номером №М-12-09/D. Реассортантный штамм Ast/PR8 использован для производства моновалентной H5N1 инактивированной цельновирионной вакцины с алюминием «KAZFLUVAC», которая была зарегистрирована в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от

гриппа А подтипа H5N1 (регистрационное удостоверение РК-БП-3№019910 от 28.05.2013).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 2829 апреля 2011 года), Международной конференции «The Fourth ESWI Influenza Conference» (Мальта, 11-14 сентября 2011 года), II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12 - 14 ноября 2012 года), Конференции молодых специалистов «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012 года), Международной конференции «Options for the Control of Influenza VIII» (Кейптаун, ЮАР, 5-10 сентября 2013 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 научный обзор и 5 статей в реферируемых журналах и сборниках научных статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 заявка на изобретение РФ и б тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах текста, включая 14 таблиц, 32 рисунка и 4 приложения. Список цитируемой литературы содержит 192 источника. Из них 18 отечественных и 174 иностранных.

Работа поддержана грантом правительства Санкт-Петербурга 2009 года для студентов и аспирантов № 2.6/30-04/083, субсидией правительства Санкт-Петербурга 2012 года для молодых ученых № 34/13-07/5 ОМУ, а также грантом ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» для молодых ученых № 12-04-31397.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. В работе использованы: холодоадаптированный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) [НК/са] и высокопатогенный вирус птичьего гриппа A/chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1), полученные из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, а также коммерческий реассортантный вакцинный штамм NIBRG-14, содержащий поверхностные антигены высокопатогенного вируса A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) и 6 остальных генов донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [PR8], полученный из NIBSC (Лондон, Великобритания).

В рамках работы были подготовлены следующие высокорепродуктивные 6:2 реассортанты A/H5N1:

- штаммы A/Astana/RG/6:2/2009 [Ast/PR8] и A/ck/Kurgan/05/2:6 RG/09 [Kur/PR8], содержащие 6 генов внутренних и неструктурных белков донора

PR8 и поверхностные антигены высокопатогенных вирусов А/chicken/Astana/6/2005 (H5N1) и A/chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1). Сайт расщепления гемагглютинина (НА) высокопатогенных вирусрв был заменен на трипсин зависимый сайт TETR/GLF (Horimoto et al., 2006);

- модифицированные штаммы A/Astana/K58I/2:6 RG/09 [Ast58/PR8] и A/ck/Kurgan/05/K581/2:6 RG/09 [Kur58/PR8], отличающиеся от исходных реассортантов аминокислотной заменой К58—* I в НА2 субъединице;

- штамм A/HK/Astana/6:2/2010 [Ast/HK] , содержащий 6 генов внутренних и неструктурных белков универсального донора А/НК/са, а также НА с модифицированным сайтом расщепления и нейраминидазу (NA) вируса А/chicken/Astana/6/2005 (H5N1).

Плазмиды. Последовательности генов РВ2, РВ1, PA, NP штамма PR8 генетической линии Mount Sinai, М и NS штамма PR8 генетической линии Cambridge (Horimoto et al., 2007), а также последовательности модифицированного НА и NA вирусов A/H5N1 (номера последовательностей в GenBank: FJ390028, FJ390029, DQ449632, DQ449634) были синтезированы в компании GeneArt (Регенсбург, Германия) и клонированы в вектор pHW2006, являющийся синтетическим аналогом pHW2000 (Hoffman et al., 2000). Для создания полноразмерных последовательностей НА и NA некодирующие области были взяты от вируса A/Hong Kong/213/03 (H5N1) (номера GenBank: АВ212054, АВ212056). Мутацию К5821 в НА2 вводили методом сайт-направленного мутагенеза, за счет изменения соответствующего кодона AAA—»ATT. Контроль осуществляли методом частичного секвенирования последовательности НА с использованием реагентов и автоматического секвенатора ABI GA 3130 производства Applied Biosystems (США).

Получение вирусов методом обратной генетики. Реассортанты получали методом обратной генетики на культуре клеток Vero полученной из Европейской Коллекции Клеточных Культур (Великобритания) и сертифицированной ВОЗ. Котрансфекцию клеток набором из 8 двунаправленных плазмид, кодирующих соответствующие генные сегменты, осуществляли методом электропорации с использованием оборудования Nucleofector II (Aniaxa, Германия). Трансфецированные клетки сеяли, инкубировали в течение 3-5 суток до развития цитопатического эффекта, после чего вируссодержащую культуральную жидкость собирали и использовали для заражения КЭ.

Получение вирусов генетической реассортацией. Реассортанты получали методом сочетанной инфекции КЭ с предварительной частичной инактивацией одного из вирусов ультрафиолетом (Schulman et al., 1976). Селекцию реассортантов с необходимым составом генома осуществляли с помощью антисыворотки к штамму-донору и пониженной температуры инкубации (25°С) с отбором проб с наибольшим титром в реакции гемагглютинации (РГА). Клонирование осуществляли методом предельных разведений в КЭ. Анализ состава генома клонов проводили методом

специфического расщепления амплифицированных ОТ-ПЦР фрагментов генов с помощью разработанного автором набора праймеров и рестриктаз.

Анализ генетических последовательностей осуществляли в программном пакете Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США), подбор праймеров осуществляли с помощью программы FastPCR 6.1 (Kalendar et al., 2009). Построение филогенетического дерева осуществляли в программе MEGA v5.03 (Tamura et al., 2011).

Культивирование штаммов и определение инфекционной активности. Штаммы культивировали в 10-12 дневных развивающихся КЭ, либо в культурах клеток Vero и MDCK при различных температурах инкубации. О наличие вируса судили по результатам РГА с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. Инфекционную активность вирусов в КЭ определяли титрованием, рассчитывали по методу Reed, Muench (1938) и выражали в логарифмах 50%-ой эмбриональной (ЭИД50) инфекционной дозы. Вирусы считали температурочувствительными, если разница в репродукции при оптимальной (34°С) и повышенной (39°С) температурах была > 5,0 ^ЭИДбО/мл. Вирусы считали холодоадаптированными, если разница в репродукции при оптимальной и пониженной (25°С) температурах инкубации не превышала 3,0-3,5 ^ЭИД50/мл (Александрова, Климов, 2004). Активность репродукции вирусов в тканевой культуре определяли путем титрования в среде с добавлением 5 мкг/мл трипсина при 34°С или 37°С, 5% С02 в течение 72 ч, и выражали в логарифмах 50%-ой тканевой инфекционной дозы (ТИД50).

Определение рН активации НА проводили по методу Maeda, Ohnishi (1980). Вирусы, адсорбированные на мембранах куриных эритроцитов, обрабатывали цитратными буферами со значением рН в интервале 5,0-6,2. Степень гемолиза в результате рН индуцированного слияния оценивали по количеству высвободившегося гемоглобина, измерением оптической плотности (ОП) при 415 нм. Уровень рН, при котором степень гемолиза составляла 50% от максимальной, считали значением рН активации.

Устойчивость вирусов к кислой среде оценивали методом иммунофлуоресценции (ИФ) в культуре клеток Vero (Krenn et al., 2011), a также в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием антител IIF4, специфичных к конформации НА при кислом рН (Vareckova et al., 2002). Устойчивость вирусов к воздействию высокой температуры оценивали по падению гемагглютинирующей активности после инкубации при 58°С в течение 10-60 мин.

Подготовка прототипов цельно вирионных ИГЕ. Вирусы накапливали в КЭ, либо в культуре клеток при температуре инкубации 34°С в течение 48 ч, после чего инактивировали 0,015% формалином при 32°С в течение 24,5 ч при постоянном перемешивании. Вируссодержащую жидкость осветляли, затем концентрировали в течение 1,5 ч при 47 OOOg. Вирионы очищали методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте

плотности сахарозы (20-60%) при llOOOOg в течение 2,5 ч, после чего снова концентрировали. Очищенные вирусы ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 0,01М MgS04.

Характеристика препаратов целыювириопных ИГВ. Содержание общего белка в препаратах определяли с помощью набора Qubit Protein Assay (Invitrogen, США). Содержание гемагглютинина в препаратах определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией аналогично методу Rudneva et al. (1996). Для сравнения количества иммунокомпетентного НА в составе препаратов проводили постановку теста одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) по методу Wood et al. (1977).

Устойчивость пативной структуры НА в очищенных вирусных препаратах исследовали методом электронной микроскопии (Hayat М.А., 2000) в режиме негативного контрастирования при увеличении 50К-200К с использованием электронного микроскопа JEM-1011 (Япония).

Наличие измененной конформации НА выявляли по чувствительности к трипсину (Skehel et al., 1982). Плотная нативная конформация НА устойчива к расщеплению трипсином, тогда как измененная конформация, характеризующаяся раскрытием тримера, становится чувствительной из-за доступности сайтов расщепления (Ruigrok et al., 1986). Препараты обрабатывали трипсином (100 мкг/мл) в течение 2 ч при 37°С, затем анализировали методом электрофореза. Полосы НА визуализировали окрашиванием геля раствором Кумасси G-250 или методом Вестерн-блот путем переноса на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивания постинфекционной сывороткой морской свинки.

Лабораторные животные. Белых мышей линии BALB/c в возрасте 16-18 недель получали из Филиала «Столбовая» ФГБУ «НЦ БМТ» РАМН. Морских свинок весом 500-600 г получали из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»» РАМН. Все работы с животными проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755). Перед началом работы животных выдерживали в карантине вивария ФГБУ «НИИ гриппа» в течение 21 дня.

Оценка безвредности и инфекциопности реассортанта Ast/HK па мышах. Вирус вводили мышам интраназально (и/н) в дозе 6,5 1§ЭИД50. На 3 сутки после инокуляции оценивали репродукцию вируса в легких и носовых ходах мышей титрованием 10% суспензии органов в КЭ. Инактивированный вирус вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг НА/мышь. Животных ежедневно взвешивали.

Изучение специфической активности прототипов ЖГВ и ИГВ па модели морских свинок. Иммунизацию морских свинок проводили без наркоза. Прототип ЖГВ вводили и/н в дозе 6,6 1йЭИД50. Инактивированные

препараты вводили внутримышечно (в/м) в дозе 10 мкг НА. Контрольным животным вводили ФСБ. Каждую группу составляли 4 животных.

Иммунный ответ морских свинок оценивали до и на 21 день после вакцинации. Защитную эффективность препаратов оценивали по интенсивности репродукции заражающего вируса при реинфекции животных. Для реинфекции через 4 недели после вакцинации животным в каждый носовой ход вводили по 10 мкл вируса Ast/PR8 в дозе 5,27 ^ЭИД50/животное. Интенсивность репродукции вируса в носовых смывах оценивали на 2, 4, 7 к 10 сутки после реинфекции.

Иммуногеиность прототипов вакцинных препаратов оценивали по титру сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции микронейтрализации (РН) и им муноферме i itном анализе (ИФА). Также определяли местные антитела в носовых смывах животных в ИФА. Постановку РТГА проводили с 1% лошадиными эритроцитами (Stephenson et al., 2004). Постановку РН осуществляли с использованием культуры клеток Vero аналогично методу Romanova et al. (2009), для выявления белка NP вирусов гриппа А использовали меченые пероксидазой хрена мышиные моноклональные антитела 4Н1-Пх, разработанные в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России. Постановку ИФА проводили аналогично методу Blokhina et al. (2013), используя в качестве антигена очищенный инактивированный вирус в концентрации 4 мкг/мл.

Статистический анализ данных проводили в программном пакете GraphPad Prism v5.01. Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднегеометрическое, среднеарифметическое, стандартное отклонение. Для сравнения малых биологических выборок, нормальность распределения которых не может быть определена, использовали непараметрические критерии (Манна-Уитни, знаковых рангов Уилкоксона). Различия считали достоверным при значении р < 0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Получение и характеристика реассортантов A/H5N1 на основе донора репродукции PR8 с комбинированным составом генома. Для конструирования реассортантов A/H5N1 в данном исследовании в качестве доноров поверхностных антигенов были использованы высокопатогенные вирусы гриппа птиц A/chicken/Astana/6/2005 (H5N1) и A/chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1) (Киселев и др., 2008, Султанкулова и др., 2010). Данные штаммы принадлежат клайду 2.2, о чем свидетельствуют результаты антигенного анализа в РТГА с диагностическими постинфекционными сыворотками хорьков, а также результаты филогенетического анализа аминокислотных последовательностей гемагглютинина (рис. 1).

-A/Hong Kong/213/2003 p-A/Viet Nam/1203/2004 ("Wet Nam/1194/2004

I-A/Cambodia/R040505(M007

-A/duck/Hunan/785/2002 -A/lndonesia/5/2005

A/BGH/Qinghai/1 A/2005 A/domestic 0ocrae/Pavlodar/1/2OO5

♦ A/chicken/As tana/6/2005 A/chicken/lndia/NIV33487/06 . ♦ A/chieken/Kurga n/05/2005 fA/whooper swan/Mongolia/244/200! I— А A/turkey Лигкеу/1/2005

A/EgypU2321-NAMRU3/200 -A/Egypt/N030?2/2010

Рис.1. Филогенетический анализ аминокислотных

последовательностей НА вирусов гриппа Л/Н5Ш различных клайдов (фрагмент). Референс-штаммы клайда 2.2 обозначены (♦), штаммы А/сЫскеп/Аз1апа/6/05 и А/сЫскеп/Кш^ап/5/05 отмечены (А).

_j"t/Vdi

A/Anhuí/1/2005 A/duck/taos/3295/2006

I-

Для получения реассортантов методом обратной генетики, нуклеотидные последовательности генов НА и NA диких вирусов были синтезированы и клонированы в вектор pHW2006, при этом сайт расщепления НА высокопатогенных штаммов был заменен на трипсин зависимый сайт TETR/GLF, встречающийся у низкопатогенных вирусов гриппа птиц (Horimoto et al., 2006). Нуклеотидные последовательности остальных генов были заимствованы от донора репродуктивности PR8. Из данных литературы известно, что наибольшей инфекционной активностью в КЭ обладают H5N1/PR8 реассортанты, содержащие гены РВ2, РВ1, PA, NP от штамма PR8 генетической линии Mount Sinai, а гены М и NS от штамма PR8 генетической линии Cambridge (Horimoto et al., 2008). При создании реассортантов мы также использовали данную комбинацию генов вируса PR8. В результате котрансфекции клеток Vero наборами из 8 двунаправленных плазмид были получены реассортанты Ast/PR8 и Kur/PR8.

Полученные штаммы Ast/PR8 и Kur/PR8 характеризовались высокой инфекционной (9,25-9,55 ^ЭИД50/мл) и гемагглютинирующей (512-1024 ГАЕ) активностью при культивировании в КЭ. При этом для референсного вакцинного штамма NIBRG-14, сконструированного на основе донора PR8 генетической линии Cambridge, инфекционный титр был ниже и составлял 7,4-8,5 ^ЭИД50/мл, гемагглютинирующая активность штамма NIBRG-14 составляла 256-512 ГАЕ. Относительное содержание НА в препаратах очищенных реассортантов Ast/PR8 и Kur/PR8 практически не отличалось при определении методом ЭФ в ПААГ, но, в то же время, превышало таковое коммерческого H5N1 вакцинного штамма NIBRG-14 (рис. 2).

А).

Б).

uí uu

*»IIPM :

•мл1

Attvms

KurPR3

.NP *HA1

Рис. 2 Сравнительный анализ содержания НА в препаратах очищенных вирусов. (А), (Б) Результаты ЭФ препаратов очищенных вирусов АбЪ№8, Киг/РЯ8 и №В1Ю-14.

;М1 |

,ЙИ НА2

Получение модифицированных реассортантов A/H5N1 с мутацией К582І в НЛ2. По данным литературы, НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 характеризуется высоким значением рН активации и наименьшей устойчивостью к воздействию кислой среды и высокой температуры по сравнению с НА низкопатогенных птичьих вирусов и вирусов гриппа человека (Scholtissek, 1985). В данном исследовании мы предложили повысить конформационную стабильность гемагглютинина созданных реассортантов A/H5N1 путем снижения рН активации НА. Для этого во вторую субъединицу НА реассортантов была введена точечная аминокислотная замена К5821 , которая, как известно, снижает рН активации НА (Steinhauer et al., 1991). Замену посредством сайт-направленного мутагенеза вводили в НА-кодирующие плазмиды, после чего мутантные штаммы Ast58/PR8 и Kur58/PR8 получали методом обратной генетики.

Штаммы Ast58/PR8 и Kur58/PR8 также как и исходные вирусы, характеризовались высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью при культивировании в КЭ. Интересно отметить, что инфекционная активность мутантных вирусов в КК Vero была ниже, чем в куриных эмбрионах (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика репродуктивных свойств исходных и

Штамм Число пассажей в КЭ Гемагглютинирующая активность (ГАЕ/50мкл) Инфекционная активность

В КЭ (^ЭИД50/мл) В КК Vero (1йТИД50/мл)

Ast/PR8 1 1024 9,55 9,43

Ast58/PR8 1 1024-2048 10,5 8,98

Kur/PR8 3 512-1024 9,25 8,6

Kur58/PR8 1 256-512 9,25 6,25

Влияние мутации К5821 на рН активации НА. Исходные вирусы вызывали гемолиз эритроцитов уже при рН 5,7 (штамм Аз1/РЯ8) и 5,8 (штамм Киг/РЯ8), в то время как для модифицированных вирусов Аз158/РЯ8 и Киг58/РЯ8 рН активации НА был ниже и составлял 5,4 и 5,5 соответственно (рис. 3). Таким образом, введение мутации К5821 привело к снижению рН активации НА реассортантов А/Н5М1 на 0,3 единицы рН.

Рис 3. Зависимость гемолитической активности НА исходных и мутантных вирусов от рН. ОП отражает степень гемолиза при заданном рН.

Влияние мутации К5821 на устойчивость вирусов к воздействию кислой среды и высокой температуры. Изменение конформации НА в случае отсутствия целевой мембраны приводит к необратимым изменениям в его структуре, в результате которых вирус теряет способность связываться с рецепторами и утрачивает инфекционность (Skehel et al., 2000). Для исходных штаммов Ast/PR8 и Kur/PR8 почти полная потеря инфекционности при заражении клеток Vero была зафиксирована при рН 5,6, тогда как модифицированные штаммы Ast58/PR8 и Kur58/PR8 при рН 5,6 еще сохраняли достаточную инфекционную активность, и теряли её лишь при рН 5,2-5,4, соответственно (рис. 4).

Поскольку конформационное изменение НА может быть вызвано не только снижением рН, но также повышением температуры (Сагг 1997), мы проверили устойчивость вирусов к прогреванию. Оказалось, что модифицированные вирусы дольше сохраняли гемагглютинирующую активность при инкубации при 58°С, по сравнению с исходными штаммами (рис. 5).

Влияние мутации К5821 на стабильность нашивной структуры

НА. Стабильность структуры НА реассортантов оценивали по степени связывания с моноклональными антителами IIF4, специфичными к конформации НА, характерной для кислого рН (Vareckova et al., 2003). Оказалось, что изменение конформации НА для исходных вирусов было отмечено уже при снижении рН до 5,8, в то время как для вирусов с мутацией это значение было ниже и составляло 5,5-5,6 (рис. 6).

Ast/PR8

Ast58/PR8

Kur/PR8

Рис. 4. Зависимость инфекционное™ вирусов от рН. Способность вирусов заражать клетки Vero оценивали по наличию в клетках вирусного белка NP методом ИФ.

Ast/PR8

0П 20 , 40 60 Время инкубации, мин

0 20 40 60 Время инкубации, мин

Рис. 5. Воздействие повышенной температуры на гемагглютинирующую активность исходных и модифицированных вирусов.

С

О

степень

Ast/PR8 Ast58/PR8

Рис. 6. Влияние рН на стабильность конформации НА. ОП отражает связывания с моноклональными антителами 11Р4 при заданном рН.

В процессе производства инактивированной вакцины вирус очищают от белков аллантоиса, которые могут обладать стабилизирующим действием. Поэтому далее мы проверили устойчивость нативной конформации НА исходных и модифицированных реассортантов в очищенных препаратах. Стабильность НА вирусов оценивали после одного цикла замораживания/оттаивания по чувствительности к трипсину. Мы показали, что количество нативного НА, устойчивого к расщеплению трипсином, в препаратах модифицированных вирусов было больше, чем в препаратах исходных штаммов (рис. 7).

Рис. 7. Устойчивость НА в очищенных вирусных препаратах при однократном замораживании/ оттаивании к протеолитическому расщеплению трипсином.

Кроме того, выявленные с помощью электронной микроскопии нарушения щетки НА после замораживания/оттаивания, а именно появление укороченных и толстых шипов, характерных для вирионов, обработанных кислым рН, присутствовали в большей степени в препарате вируса без мутации Kur/PR8, в сравнении с препаратом Kur58/PR8 (рис. 8). Таким образом, данные электронной микроскопии полностью подтвердили результаты трипсинового теста и продемонстрировали повышенную стабильность НА модифицированных штаммов в очищенных инактивированных вирусных препаратах.

Влияние мутации К5821 на содержание НА в прототипах инактивированных вакцин. Длительный и многостадийный процесс производства и последующего хранения вакцин может вызвать изменения структуры НА за счет воздействия различных физических и химических факторов, что, в конечном счете, может привести к снижению иммуногенности вакцины (Geeraedets et al., 2011). Наличие НА в измененной конформации в очищенных инактивированных препаратах вирусов Kur/PR8 и Kur58/PR8, осуществляли проверкой их чувствительности к трипсину с последующей оценкой количества НА, устойчивого к протеолитическому воздействию, методом Вестерн-блот. Для этого опыта были приготовлены препараты из вирусов, выращенных не только в КЭ, но также в клеточных культурах Vero и MDCK. Результат показал, что НА в измененной конформации, чувствительной к расщеплению трипсином, присутствовал практически во всех препаратах, однако в препаратах мутантного штамма его количество было гораздо меньше. Для препаратов, полученных на КЭ, после

A$t>PR9 A*tie.'PRÍ KtiííPRB KulfiS/FRB ♦T . - «-Т +Т

М< Ымм< UJ И"»

іш*» fe**« ішт *««*нр

обработки трипсином полоса мономера НАО для вируса Киг/РЯ8 практически исчезала, в то время как полоса мономера НАО для вируса Киг58/РЯ8 не изменялась (рис. 9). .При этом наиболее чувствительным к трипсину оказался препарат вируса, выращенного на клеточной линии МОСК. Для вируса Киг/Р118 при одинаковом количестве общего белка, полоса НАО практически пропадала после обработки трипсином, что свидетельствует о большой степени разрушения НА в данном препарате.

Рис. 8. Устойчивость структуры щетки НА в очищенных препаратах инактивированных вирусов. Увеличение 200К. Стрелками указаны фрагменты щетки, поврежденной после 1 цикла замораживания/оттаивания.

после

Киг/РІЧ8

ояигомеры НАО

Рис. 9. Анализ структуры НА в очищенных препаратах инактивированных вирусов по чувствительности к трипсину до (-) и после (+) обработки трипсином.

Данные чувствительности к трипсину оказались в прямой корреляции с результатами измерения содержания антигенно активного НА методом ОРИД. Так относительное содержание НА (на 100 мкг общего белка) в препарате Киг58/РЯ8 в 1,8 раза превышало содержание НА в препарате

к/э Уего ГШСК

Киг Кш58 Киг Киг58 Киг Киг58

+Т - +т +Т - +Т! +Т . +Т

тяя зга» єа

• мі

Кліг/РГ18 (рис. 10). Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижение рН активации НА реассортантов А/Н5М 1 ведет к повышению его конформационной устойчивости и к увеличению количества полноценного нативного НА в очищенных инактивированных вирусных препаратах в независимости от субстрата, используемого для накопления материала.

Получение и характеристика реассортанта A/H5N1 на основе нового универсального донора А/НК/са. По данным литературы, одной из причин сниженной репродуктивной активности реассортантов A/H5N1 также может быть функциональное несоответствие генов реассортанта (Harvey et al., 2008, Rudneva et al., 2007). Использование альтернативных доноров может быть одним из способов повышения репродуктивной активности реассортантов A/H5N1. Разработанный в НИИ гриппа донор А/НК/са сочетает в себе признаки аттенуации (ts- и са - фенотипы), необходимые для вакцинных кандидатов для ЖГВ и высокую репродуктивную активность в КЭ - качество, необходимое для производственных штаммов для ИГВ. Результаты, полученные в доклинических экспериментах, продемонстрировали перспективность штамма А/НК/са как единого донора генов, кодирующих внутренние белки, для вакцинных реассортантов живых и инактивированных вакцин (Цыбалова и др., 2012). В данной работе на основе донора А/НК/са был получен реассортант, содержащий НА с модифицированным сайтом расщепления и NA высокопатогенного вируса A/chicken/Astana/6/2005 (H5N1). Реассортант Ast/HK был получен методом классической генетической реассортации донора А/НК/са с вирусом Ast/PR8.

Сравнительное изучение репродуктивной активности реассортантов Ast/HK и Ast/PR8 в КЭ при оптимальной температуре показало, что штамм Ast/HK не уступал в росте штамму Ast/PR8. Инфекционная активность обоих вирусов достигала 9,5-9,7 1§ЭИД50/мл, а гемагглютинирующая составляла

Киг5

Kur

-Линейная (Kur)

Kur58

■ Линейная (Kur58)

13,439х + 26,101 R2 = 0,9928

= 24,725х +26,438 R2 = 0,9983

Разведение

Рис. 10. Сравнение относительного содержания НА в препаратах Киг/РК8 и Киг58/РК8 методом одиночной радиальной иммунодиффузии.

1024 ГАЕ. Однако штамм Аб^НК существенно превосходил вирус АэГ/РЯ8 по скорости роста в куриных эмбрионах при стандартной заражающей дозе 10 ЭИД50 (рис. 11).

18 24 48 72 Время после заражения, ч

□ А^НК

□ Аз1/РЯ8

Ж

18 24 48 72 Время после заражения, ч

Рис. 11. Динамика роста инфекционной и гемагглютинирующей активности штаммов Аб^НК и Аз1/РЯ8 при накоплении в КЭ.

Реассортант Аз{/НК унаследовал от донора са-фенотип и репродуцировался при пониженной температуре до 7,5 ^ЭИД50/мл. Разница в показателях репродукции штамма Аб^НК при повышенной и оптимальной температуре составляла 6,0. ^ ЭИД50, что свидетельствовало о наличии фенотипа, также унаследованного от донора (табл. 2).

Таблица 2. Репродуктивная активность реассортантного штамма

Вирус Инфекционная активность при температуре, [$ ЭИД50/мл 11СТ26 ЯСТ.,, Фенотип

26°С 32°С 39°С

А5№Я8 (Н5Ш) 3,50 9,50 8,50 6,0 1,0 поп-са, поп^в

А8ШК(Н5М) 7,50 9,50 3,50 2,0 6,0 са,

А/НК/са (НЗЫ2) 9,50 9.75 3,50 0.25 6,25 са,

Изучение безвредности реассортанта Аь^НК пи мышах. Штамм Авг/НК не вызывал развития клинических симптомов инфекции после и/н введения, отмеченных для родительского вируса Аз1/РЯ8, а именно учащенного поверхностного дыхания, взъерошенности шерсти, снижение двигательной активности, снижение потребления корма. Вирус Аб1/Р118 репродуцировался в легких мышей до титра 5,7 ^ ЭИД50/мл и вызывал 100% гибель мышей на 6-е сутки (табл. 3). Средний титр репродукции реассортанта АбШК в легких мышей составил 2,2 1« ЭИД50/мл и был незначительно

выше, чем уровень репродукции в верхних дыхательных путях (1,45 ^ ЭИД50/мл), уровень снижения веса мышей не превышал 1%. Внутрибрюшинное введение инактивированного препарата Ав^НК также не вызывало появления симптомов заболевания. Максимальное снижение веса не превышало 1,5%.

Таблица 3. Характеристика безвредности и инфекционности

зеассортанта Абі/НК.

Вирус / Препарат Репродукция в легких, 1§ЭИД50/мл Репродукция в носовых ходах, ^ЭИД50/мл Максимальная потеря веса, %

Аэ^РЯв (Н5Ы1) 5,7 3,2 30

А/НК/са (НЗИ2) 3,45 6,2 0

АвШК (ІІ5М) 2,2 1,45 1

Инактивированным препарат АзІ/НК (Н51М1) н/о н/о 1,5

Контроль (ФСБ) < 1,2 < 1,2 0

Сравнение иммуногенности и защитной эффективности прототипов ЖГВ и ИГВ из реассортантного штамма /Ш/НК проводили на модели морских свинок. Первой группе животных и/н вводили 6,6 ^ЭИД50 вируса Аэ^НК, второй группе вводили 10 мкг НА в/м очищенного инактивированного препарата вируса Аэ^НК. Для сравнения, третью группу животных иммунизировали инактивированным препаратом вируса Аз^РЯВ в аналогичной дозе. Во всех группах иммунизированных животных было отмечено достоверное повышение уровня антигемагглютинирующих, нейтрализующих и системных антител по сравнению с уровнем антител в контрольной группе (р<0,048, критерий Уилкоксона для выборки и медианы) (рис. 12). При этом среднегеометрические значения титров системных антител достоверно не отличались для трех групп животных, получивших живой или инактивированный препарат. Введение прототипа ЖГВ индуцировало образование локальных антител, титры которых (СГТ = 26,9) достоверно превышали значения, обнаруженные у животных, получивших црототипы ИГВ (СГТ= 5,7) (рис. 12Г).

Для оценки защитного действия препаратов, через 4 недели после вакцинации морских свинок инфицировали штаммом Аз1:/Р118 (рис. 13). При реинфекции у контрольных животных вирус выделялся из носовых смывов в течение 7 суток после заражения. В группах животных, иммунизированных прототипами ИГВ, было зафиксировано сокращение срока выделения вируса, использованного для реинфекции, до 4 суток, а также достоверное снижение его титра на 1,25 - 2,5 ^ЭИД50, по сравнению с контрольными морскими

свинками. Вакцинация прототипом ЖГВ полностью предотвращала выделение вируса, использованного для реинфекции.

(А)

-а

О) 6-

у

¿г

# /

(Б)

/Ь /Ъ л*

Ф ¿Г

¿Г ^

# /• ^

V

з 4-І

2 2 о

(В)

<р

.,-ї5'

/ /

8-

га о

я>

3 * 5

5 *

(П

У / # ^

Рис. 12. Иммунный ответ морских свинок на введение прототипов ЖГВ и ИГВ. На диаграммах приведены индивидуальные значения титров антител по данным РТГА (А), РН (Б) и ИФА (В и Г), чертой отмечен среднегеометрический титр для каждой группы животных. *, ** р=0,029.

0 2 4

сутки после инфицирования

Рис. 13. Динамика выделения вируса из носовых смывов у контрольных и иммунизированных морских свинок после заражения вирусом Аз1УРК8. Нижний предел определения инфекционной активности составлял 0,8 ^ЭИД50/мл. *, **, р<0,029.

ВЫВОДЫ

1. Полученные методом обратной генетики реассортантные штаммы, содержащие поверхностные антигены высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и оптимальную комбинацию генов вируса PR8 разных генетических линий, превосходили по репродукционной активности в куриных эмбрионах эталонный вакцинный штамм NIBRG-14.

2. Введение мутации К582—>1 в НА2 приводило к понижению pH активации НА и повышению стабильности нативной структуры НА реассортантов A/H5N1.

3. Реассортанты Ast58/PR8 и Kur58/PR8, содержащие модифицированный НА, не уступали исходным реассортантам по репродукции в куриных эмбрионах, однако очищенные препараты модифицированных вирусов содержали больше нативного НА, чем препараты исходных штаммов.

4. Реассортантный штамм Ast/HK, полученный на основе нового донора А/НК/са и содержащий НА и NA высокопатогенного вируса гриппа A/H5N1, обладал ts- и са - фенотипом и был безвреден для лабораторных животных.

5. Реассортант Ast/HK так же активно репродуцировался в куриных эмбрионах, как и штамм Ast/PR8, но при этом превосходил последний по скорости роста.

6. Экспериментальные препараты живой и инактивированной вакцин, полученные из штамма Ast/HK, проявили высокую иммуногенность при введении лабораторным животным.

7. Экспериментальный препарат живой вакцины из штамма Ast/HK, в отличие от инактивированного препарата, индуцировал местные антитела и полностью предотвращал репродукцию вируса при реинфекции морских свинок при одинаковых титрах системных антител.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

/. Статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертационных исследований:

1. Цыбалова JI.M., Горев Н.Е., Потапчук М.В., Репко И.А., Коротков A.B., Сергеева М.В.. Комиссаров А.Б., Писарева М.М., Задонская A.B., Кузнецов В.В., Грудинин М.П., Киселев О.И. Характеристика холодоадаптированного штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) как потенциального донора аттенуации и высокой репродуктивное™ // Вопр. вирусол. - 2012. - Т. 57. - № 6. - С. 13-17.

2. Потапчук М.В., Репко И.А., Сергеева М.В., Коротков A.B., Комиссаров А.Б., Сандыбаев Н.Т., Червякова О.В., Хайрулин Б.М., Цыбалова JI.M. Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/35(НЗМ2) // Вопр. вирусол. - 2012. - Т. 57. -№ 6.-С. 42-46.

3. Sansyzbay A.R., Erofeeva M.K., Khairullin B.M., Sandybayev N.T., Kydyrbayev Z.K., Mamadaliyev S.M., Kassenov M.M., Sergeeva M.V.. Romanova J.R., Krivitskaya V.Z., Kiselev O.I., Stukova M.A. Inactivated and adjuvanted whole virion clade 2.2 H5N1 (A/chicken/Astana/6/05) influenza vaccine is safe and immunogenic in a single dose in humans // Clin. Vaccine Immunol. -2013. — Vol. 20. —N 8. — P. 1314-1319.

4. Сергеева M.В.. Романова Ю.Р. Вакцины против высокопатогенных вирусов гриппа птичьего происхождения (научный обзор) // Вопр. вирусол. — 2013. —Т. 58. - № 4. - С. 4-9.

II. Публикации в других изданиях:

5. Сергеева М.В. Пути повышения эффективности штаммов-кандидатов для производства вакцин для людей против вирусов гриппа А подтипа H5N1 // Четырнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Сборник тезисов. Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга. - СПб: Изд-во СПбГПУ, 2009 - С. 68.

6. Сергеева М.В. Повышение иммуногенности инактивированной гриппозной вакцины за счёт стабилизации основного антигена // Молодежь — медицине будущего: тез. докл. междунар. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященной 135-летию со дня рождения Н.Д. Стражеско, г. Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 г. / Под. ред. В.М. Запорожан - Одесса: Изд-во ОНМедУ, 2011.-С. 47.

7. Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Репко И.А., Потапчук М.В., Сергеева М.В., Киселев О.И. Вирус гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) -донор внутренних генов для реассортантов, используемых в производстве живых и инактивированных противогриппозных вакцин и полученные на его основе реассортанты А/СПБ/ГК/09 (H1N1) и A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) для производства живой, и инактивированной вакцин против гриппа // Заявка на изобретение № 2011131124/10 от 25.07.2011.

8. Tsybalova L.M., Gorev N.E., Repko I.A., Potapchuk M.V., Sergeeva M.V. Korotkov A.V., Komissarov A.B., Pisareva M.M., Grudinin M.P., Kiselev 0,1. Influenza strain A/HK/1/68/162/35 as potential unified vaccine donor // The Fourth ESWI Influenza Conference, Malta, 11-14 September 2011. -P. 129.

9. Sultankulova K.T., Sandybayev N.T. , Chervyakova O.V., Strochkov V.M., Tailakova E.T., Sansyzbay A.R., Orynbayev M.B., Gorev N.E., Sergeyeva M.V.. Potapchuk M.V., Repko I.A., Tsybalova L.M., Kiselev O.I. New recombinant strain A/HK/Astana/6:2/2010 for prophylaxis of A/H5N1 influenza // BTRB.-2012.-Vol. l.-N 1. - P: 005-014.

10. Сергеева M.В.. Романова Ю.Р. Влияние точеной мутации в гемагглютинине на стабильность противогриппозной инактивированной вакцины подтипа H5N1 // Конференция молодых специалистов "Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение», Санкт-Петербург, 2425 октября 2012. Сборник статей, под ред. Л.М. Цыбаловой, В.В. Егорова. -СПб: НП-ПРИНТ, 2012. - С. 16-21.

11. Сергеева М.В. Сравнительное исследование специфической активности живой и инактивированной вакцин против потенциально пандемического гриппа на морских свинках // Мед. Акад. Журнал. - 2012. — Т. 12.-№ 4.-С 52-54.

12. Сергеева М.В. Экспериментальное исследование специфической активности прототипов вакцин против потенциально пандемического гриппа, подготовленных на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/35 // Семнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. Сборник тезисов. - СПб: Изд-во РГГМУ, 2012 — С. 68.

13. Sergeeva M.V.. Krokhin А.А., Tsybalova L.M., Romanova J.R. Main factor of the low antigen content of inactivated H5N1 influenza vaccines -decreased stability of the H5 Hemagglutinin protein // «Options for the Control of Influenza VIII», Cape Town, South Africa, 5-10 September 2013. - P389-390.

Подписано в печать «21» октября 2013 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Закат № 235 Типография «Сан Принт» 197022, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр. 54

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергеева, Мария Валерьевна, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

СЕРГЕЕВА Мария Валерьевна

ПОВЫШЕНИЕ КАЧЕСТВА ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА А/Н5М ПУТЕМ УВЕЛИЧЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОГО ДОНОРА РЕПРОДУКЦИИ

03.02.02 - Вирусология

Диссертация

^ на соискание ученой степени

ю

кандидата биологических наук

О

о ^ ю

о ~ см

Научный руководитель: доктор биологических наук

СМ 05

_4> ° Романова Ю.Р

Санкт-Петербург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................12

1.1 Появление высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и разработка противопандемических вакцин............................................................................12

1.2 Создание вакцинных штаммов для производства вакцин против вирусов гриппа A/H5N1......................................................................................................17

1.3 Гемагглютинин высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 в составе вакцинных препаратов..........................................................................................30

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................41

2.1 Материалы.......................................................................................................41

2.2 Молекулярно-биологические методы...........................................................45

2.3 Вирусологические методы.............................................................................55

2.4 Подготовка и характеристика прототипов инактивированных гриппозных вакцин.....................................................................................................................60

2.5 Иммунологические и серологические методы.............................................63

2.6 Работа с животными.......................................................................................67

2.7 Методы статистической обработки данных.................................................69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................70

3.1 Получение и характеристика реассортантов A/H5N1 на основе донора репродукции A/Puerto Rico/8/34 с комбинированным составом генома.........70

3.2 Повышение стабильности гемагглютинина реассортантов H5N1/PR8 путем точечного мутагенеза................................................................................75

3.3 Получение и характеристика реассортанта A/H5N1 на основе нового

универсального донора А/Гонконг/1/68/162/3 5.................................................90

2

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................106

ВЫВОДЫ.................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................115

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................................138

Приложение 1. Вирусы, использованные в филогенетическом анализе......138

Приложение 2. Нуклеотидные последовательности праймеров....................139

Приложение 3. Аминокислотные последовательности НА высокопатогенных вирусов и реассортантов Н5Ш/Р118..................................................................140

Приложение 4. Нуклеотидные последовательности НА реассортантов Н51Ч1/РР8 по данным частичного секвенирования.........................................142

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

в/м - внутримышечно

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

и/н - интраназально

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

КК - культура клеток

КЭ - куриные эмбрионы

ОП - оптическая плотность

ОТ - обратная транскрипция

н/о - не определяли

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТИД50 - 50% тканевая инфекционная доза

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

ЭФ - электрофорез

DPBS - Dulbecco modified phosphate buffered saline (ФСБ в модификации Дульбекко, без ионов Са2+ и Mg2+)

НА - hemagglutinin (гемагглютинин) NA - neuraminidase (нейраминидаза)

RCT - reproductive capacity at different temperatures (изменение показателя репродукции при различных температурах)

4

SDS - sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия) ts- (фенотип) - temperature sensitive (температурочувствительный) фенотип

ca- (фенотип) - cold-adapted (холодоадаптированный) фенотип

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

Появившиеся впервые в 1997 году в популяции людей высокопатогенные вирусы гриппа птиц A/H5N1 продолжают распространяться из Азии в Европу и Африку, представляя несомненную угрозу для человечества (WHO, 29 August 2013). В настоящее время уже показано, что циркулирующему вирусу достаточно приобрести всего 2-4 мутации в основном поверхностном белке -гемагглютинине (НА), чтобы приобрести способность к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Rüssel et al., 2012). Следствием таких мутаций станет появление штамма, способного вызвать масштабные вспышки, эпидемию или даже пандемию. Вакцинопрофилактика является основным механизмом предотвращения широкого распространения гриппозной инфекции. Главным компонентом противогриппозных вакцин и основной мишенью нейтрализующих вирусспецифических антител является вирусный белок НА. Большинство существующих лицензированных вакцин против вируса гриппа A/H5N1 получают на основе реассортантных вирусов, содержащих поверхностные антигены НА и нейраминидазу (NA) от птичьих вирусов, а остальные гены от донора репродуктивности, вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8). В случае возникновения предпандемической ситуации потребуется быстрая наработка вакцины в количестве, необходимом для вакцинации населения всего земного шара. Однако данные реассортанты характеризуются сниженной репродуктивной активностью в куриных эмбрионах (КЭ), являющихся основным субстратом для производства вакцин, и низким содержанием НА в очищенных препаратах (Horimoto et al., 2006, Harvey et al., 2008). Причина этих феноменов до последнего времени оставалась неизвестной. Мы предположили, что одной из причин низкой репродуктивной активности реассортантов может быть несоответствие генов донора репродуктивности и птичьего вируса A/H5N1. Вторым фактором может

являться НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц, который характеризуется высоким значением рН активации и отличается по этому параметру от всех вирусов гриппа человека (Scholtissek, 1985). Повышенное значение рН, при котором происходит изменение конформации НА, необходимой для обеспечения слияния вирусной и эндосомальной мембран, непосредственно связано с низкой стабильностью нативной структуры НА (Carr et al., 1997).

В данной работе исследуется возможность использования альтернативного донора для получения реассортантов A/H5N1 для производства гриппозных вакцин и изучается возможность повышения количества нативного НА в препаратах инактивированной вакцины путем понижения рН активации НА и повышения, таким образом, его стабильности.

Цель исследования: Конструирование и изучение репродуктивных свойств реассортантов A/H5N1, полученных на основе различных доноров, и оценка влияния стабильности НА реассортантов A/H5N1 на его содержание в препаратах очищенных вирусов.

Задачи исследования:

1. Конструирование реассортантов, содержащих НА и NA высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1, на основе донора репродуктивное™ A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома.

2. Конструирование реассортантов A/H5N1, содержащих мутацию K582I во второй субъединице НА, и оценка влияния данной мутации на стабильность вирусов и содержание нативного НА в инактивированных вакцинных препаратах.

3. Получение реассортантного штамма A/H5N1 на основе нового высокорепродуктивного и холодоадаптированного донора A/T0HK0Hr/l/68/162/35(H3N2).

4. Изучение безопасности и специфической активности прототипов живой (ЖГВ) и инактивированной (ИГВ) вакцин, полученных из

7

реассортантного штамма А/Н5>П на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 (Н3№) в модельных экспериментах на животных.

Научная новизна работы.

В рамках проведенной работы впервые продемонстрировано значение рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц А/Н5№ и стабильности нативной конформации молекулы НА для качества высокорепродуктивных вакцинных кандидатов. Показано значение вышеуказанных параметров на количество полноценного НА в препаратах очищенных инактивированных вирусов.

Впервые в качестве донора внутренних генов для получения А/Н5№ реассортанта был использован холодоадаптированный и высокорепродуктивный штамм А/Гонконг/1/68/162/35 (НЗШ). Показана высокая репродуктивная активность, безвредность, иммуногенность и защитная эффективность полученного реассортанта, что подтверждает возможность использования вируса А/Гонконг/1/68/162/35 в качестве единого донора для производства штаммов для ИГВ и ЖГВ.

Практическая значимость работы.

В рамках проведенной работы определен параметр, а именно, стабильность НА, критически влияющий на качество ИГВ. Показана возможность повышения стабильности НА вирусов гриппа А/Н51Ч1 путем введения модифицирующих мутаций во вторую субъединицу НА.

Сконструированы реассортантные штаммы Аз158/РЯ8 и Киг58/РЯ8, обладающие высокой репродуктивной активностью в КЭ и стабильным НА, которые могут быть использованы для производства ИГВ против потенциально пандемических вирусов гриппа А/Н51Ч1.

Получен реассортант Аб^НК, обладающий помимо высокой репродуктивности, фенотипическими признаками аттенуации, который может быть рекомендован как единый вакцинный кандидат для производства ЖГВ и ИГВ против вирусов гриппа А/Н5Ш.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома при конструировании реассортантов с поверхностными антигенами высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории России и Казахстана, обеспечивало преимущество созданных реассортантов перед вакцинным вирусом NIBRG-14 по репродуктивной активности в КЭ.

2. Понижение рН активации НА путем введения точечной мутации К58—>1 в НА2 повысило устойчивость реассортантов A/H5N1 к воздействию кислой среды и повышенной температуры и привело к увеличению содержания нативного и иммунокомпетентного НА в очищенных инактивированных вирусных препаратах.

3. Реассортантный штамм с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса A/H5N1, созданный на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/3 5, унаследовал от донора свойства аттенуации и превосходил по репродуктивной активности в КЭ реассортант на основе донора A/Puerto Rico/8/34.

4. Экспериментальные препараты ИГВ и ЖГВ, полученные из реассортантного штамма A/H5N1, созданного на основе донора А/Гонконг/1/68/162/3 5, обладали высокой иммуногенной и протективной активностью у лабораторных животных. Препарат ЖГВ при интраназальном (и/н) введении стимулировал выработку мукозальных вирусспецифических антител, обеспечивая полноценную защиту от инфекции.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, анализе и статистической обработке полученных результатов. Автором лично получены высокорепродуктивные реассортантные штаммы A/H5N1, а также апробированы прототипы вакцинных препаратов на их основе. Вклад соавторов заключается в антигенной характеристике вирусов гриппа A/H5N1 с

9

диагностическими постинфекционными сыворотками хорьков, а также в получении электронных микрофотографий очищенных вирусов гриппа.

Внедрение результатов работы.

Сконструированные автором реассортантные штаммы Ast/HK, Ast58/PR8, Kur/PR8, Kur58/PR8 депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2626, 2734, 2735, 2736 соответственно, штамм Ast/PR8 депонирован в коллекцию микроорганизмов НИИ проблем биологической безопасности Республики Казахстан под номером №M-12-09/D. Реассортантный штамм Ast/PR8 использован для производства моновалентной H5N1 инактивированной цельновирионной вакцины с алюминием «КАЗФЛЮВАК», которая была зарегистрирована в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа H5N1 (регистрационное удостоверение РК-БП-3№019910 от 28.05.2013).

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы представлены на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 года), Международной конференции «The Fourth ESWI Influenza Conference» (Мальта, 11-14 сентября 2011 года), П всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12 - 14 ноября 2012 года), Конференции молодых специалистов «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2425 октября 2012 года), Международной конференции «Options for the Control of Influenza VIII» (Кейптаун, ЮАР, 5-10 сентября 2013 года).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 научный обзор и 5 статей в реферируемых журналах и сборниках научных

10

статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 заявка на изобретение РФ и 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах текста, включая 14 таблиц, 32 рисунка и 4 приложения. Список цитируемой литературы содержит 192 источника. Из них 18 отечественных и 174 иностранных.

Работа поддержана грантом правительства Санкт-Петербурга 2009 года для студентов и аспирантов № 2.6/30-04/083, субсидией правительства Санкт-Петербурга 2012 года для молодых ученых № 34/13-07/5ОМУ, а также грантом ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» для молодых ученых № 12-04-31397.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Появление высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и разработка противопандемических вакцин

Вирусы гриппа А различных подтипов постоянно циркулируют среди диких водоплавающих птиц, не вызывая у своих естественных хозяев признаков серьезного заболевания. Однако вирусы гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 могут приобретать свойство высокой патогенности и широко распространяться, преодолевать межвидовой барьер и поражать не только диких, но и домашних птиц, а также млекопитающих, в том числе человека, вызывая заболевания различной степени тяжести (de Jong M.D, Hien, 2006). Во время первой вспышки высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 на птичьих фермах Гонконга в 1997 году вирус преодолел межвидовой барьер и без предварительной адаптации инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом (Subbarao et al., 1998). Быстрое уничтожение всех домашних птиц в этом районе позволило остановить распространение инфекции. Однако в 2002 году в Гонконге было отмечено возникновение нового антигенного варианта вируса A/H5N1, который в апреле 2005 г. в Китае в районе озера Цинхай вызвал массовую гибель диких птиц, с последующим распространением вируса по всему земному шару (Chen et al., 2006). До настоящего времени вирус продолжает циркулировать среди диких водоплавающих птиц и периодически инфицировать людей (WHO, 2013). По данным Всемирной Организации Здравоохранения при заражении людей вирусами гриппа A/H5N1 отмечается высокий уровень смертности, который на данный момент составляет 59% (WHO, 29 August 2013). Большинство случаев заражения связаны с тесным контактом с больной птицей. Прямая передача вируса от человека к человеку является довольно редким явлением (Katz et al., 1999). Однако потенциальную способность вирусов данного подтипа приобрести крайне опасное свойство -передаваться от человека к человеку, подтверждают исследования полученных

12

в лабораторных условиях мутантных штаммов A/H5N1, способных к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Chen et al., 2012, Imai et al., 2012, Herfst et al., 2012). Периодическая циркуляция высокопатогенных вирусов A/H5N1, происходящая на птичьих фермах в непосредственной близости и постоянном контакте с человеком, создает угрозу внедрения в популяцию людей вируса гриппа нового субтипа, к которому отсутствует иммунитет практически у всего населения. Следствием появления нового трансмиссивного варианта вируса A/H5N1 могут стать масштабные вспышки и эпидемии.

Создание защитного иммунного ответа против циркулирующих вирусов гриппа является основным механизмом контроля над распространением гриппозной инфекции. Эффективность предотвращения широкого распространения инфекции и возникновения масштабной эпидемии находится в прямой зависимости от качества применяемых вакцинных препаратов (Киселев и др., 2006, Киселев, 2010). Для профилактики гриппа наиболее широко в настоящее время применяются ИГВ, которые представляют собой суспензию очищенных инактивированных вирионов (цельновирионная вакцина), разрушенного детергентом вируса (сплит вакцины) или очищенных вирусных поверхностных гликопротеинов (субъединичные вакцины). В отдельных странах (Россия, США) используют ЖГВ, которые представляют собой ослабленный вирус, вводимый и/н. ЖГВ индуцирует выработку как противовирусных антител (секреторные и сывор