Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации"

На правах рукоОЛси

ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна

Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины»

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент

Киселева Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Ленева Ирина Анатольевна

ФГБНУ «Научно исследовательский

институт вакцин и сывороток им.

И.И. Мечникова», заведующая

лабораторией

кандидат биологических наук, Тимофеева Татьяна Анатольевна

ФГБУ "Федеральный научно-

исследовательский центр

эпидемиологии и микробиологии

имени почетного академика

Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России,

ведущий научный сотрудник

Ведущая организация ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Защита состоится 24 апреля 2015 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» по адресу: 142782, г. Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» и на сайте http://poliomyelit.ru.

Автореферат разослан: « ^ » _2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Романова Лидия Юрьевна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Вакцинопрофилактика гриппа, как и многих других вирусных инфекций, остается эффективным средством предупреждения развития этого заболевания. Существует два основных направления специфической профилактики гриппа - вакцинопрофилактика с помощью инактивированной (ИГВ) и живой гриппозной реассортантной (ЖГВ) вакцин. Преимущество ЖГВ заключается, во-первых, в возможности наращивания больших объемов препарата в короткие сроки, что особенно важно в случае возникновения угрозы новой пандемии и в странах с высокой плотностью населения, во-вторых - в стимуляции более широкого спектра факторов адаптивного иммунитета, в том числе во «входных воротах» инфекции (Найхин и др., 1991, 1997, 2010, 2012; Ташига е1 а1„ 2005). Эксперты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют применение ЖГВ наряду с ИГВ, поскольку в результате вакцинации этим препаратом у привитых возникает перекрестный иммунитет к разным вариантам вируса гриппа (\¥НС)/1УВ/09.05).

На количественные и качественные характеристики поствакцинального адаптивного иммунного ответа к ЖГВ могут в комплексе влиять гено- и фенотипические признаки как вакцинируемых людей, так и вакцинного штамма. Если первая сторона этого вопроса изучена довольно основательно, то вторая - значительно слабее. Настоящая работа посвящена исследованию связи между некоторыми биологическими признаками вируса гриппа (чувствительность к повышенной температуре и к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови, наличие отдельных или множественных аминокислотных замен в белках) и интенсивностью гуморального иммунного ответа на этот возбудитель.

Степень разработанности темы. Развитие иммунного ответа на ЖГВ и вирусы гриппа изучается как в экспериментальных работах (Рекстин и др., 2002; Петухова и др., 2006), так и с эпидемиологической точки зрения (Яи(1епко, 2011; Найхин, 2012). Накоплены данные о закономерностях его

формирования при гриппозной инфекции и вакцинации (Найхин и др., 2002; Найхин, 2010; 2012). Разработан комплексный метод оценки гуморального противогриппозного иммунитета (Найхин и др., 1997; Найхин, 2010).

В отдельных работах описана связь иммунного ответа организма с такими фенотипическими признаками вирусов гриппа А, как чувствительность к высокой температуре инкубации, чувствительность к неспецифическим сывороточным ингибиторам (Веаге 1969, 1971; Tyrrell et al., 1969; Медведева и др., 1972, 1977; Жилова 1973). Однако в данных работах изучен только один показатель иммунного ответа: антигемагглютинирующие антитела. Периодически появляются новые сведения об одиночных мутациях, влияющих на иммунный ответ (Hoffmann et al., 2005; Chen et al., 2010, 2012; Kuznetcova et. al., 2013; и др.), и экспериментальные исследования в этом направлении позволят дополнить знания о роли определенных аминокислотных позиций в белках вируса гриппа.

На настоящий момент активно развивается направление оптимизации кодонного состава генетических конструкций, используемых в противовирусных вакцинных препаратах. Данный прием позволяет повысить иммуногенность различных ДНК-вакцин (Ingolotti et al., 2010; Zhu et al., 2010), в том числе гриппозных (Wang et al., 2006; Chen et al., 2008; Tenbusch et al., 2010). В литературе описано получение аттенуированного штамма полиовируса с деоптимизированным кодонным составом (Bums et al., 2006). Сведения о применении этой методики по отношению к живому вирусу гриппа в литературе отсутствуют.

Таким образом, литературные данные о влиянии биологических свойств вируса гриппа на формирование поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа, разрозненны и не позволяют сделать окончательный вывод о том, какие свойства «дикого» вируса гриппа дают возможность повысить иммуногенность вакцинных штаммов в отношении индукции гуморального иммунитета.

Целью работы явилось изучение отдельных биологических свойств вирусов гриппа, влияющих на показатели гуморального иммунного ответа при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Обосновать возможность использования морских свинок как модели для

изучения гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию и вакцинацию живой гриппозной вакциной.

2. На базе этой модели изучить связь количественных показателей гуморального иммунного ответа с чувствительностью вирусов гриппа к неспецифическим сывороточным ингибиторам и наличием одиночных аминокислотных замен в гемагглютинине.

3. Охарактеризовать штаммы вируса гриппа с искусственно измененным составом кодонов в гене, кодирующем гемагглютинин, и оценить влияние изменения кодонного состава на показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo.

4. На основе анализа результатов клинических испытаний оценить влияние

свойств температуро- и ингибиторочувствительности «дикого» родительского вируса на интенсивность гуморального ответа у людей, привитых живой гриппозной вакциной.

Научная новизна. Впервые обоснована возможность использования морских свинок как модели для изучения гуморального иммунного ответа на ЖГВ.

Впервые исследованы свойства живых вирусов гриппа А с измененным составом кодонов сегмента генома, кодирующего гемагглютинин, в экспериментах in vitro и in vivo и показана перспективность кодонной оптимизации гемагглютинина живого вируса гриппа А применительно к повышению его иммуногенности.

Впервые в опытах in vivo и по материалам клинических испытаний проведен сравнительный анализ иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на основе «диких» вирусов гриппа А и В, с

разным уровнем ингибиторо- и температуроустойчивости. Установлена связь этих свойств с выраженностью гуморального иммунного ответа.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа включает как теоретические, так и практические аспекты. Полученные данные о влиянии на иммуногенность изученных фенотипических свойств вирусов фиппа А и В, аминокислотных замен в гемагглютинине, изменения кодонного состава гемагглютинина дополняют знания о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа к этому возбудителю. Решен ряд практических задач:

Обоснована возможность использования морских свинок в качестве модельного объекта для изучения показателей гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа А и В.

Разработана схема оценки показателей гуморального иммунного ответа к ингибиторочувствительным вирусам гриппа А и В у морских свинок.

Сформулированы принципы отбора «диких» вирусов гриппа А и В для использования в качестве источников антигенных детерминант при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, позволяющие повышать показатели гуморального иммунного ответа.

Показана перспективность применения методики направленного изменения кодонного состава НА живых вирусов гриппа А для повышения их иммуногенности при интраназальном введении.

Отработаны приемы, позволяющие повысить эффективность реассортации вирусов, содержащих внутренние гены от высокоурожайного вируса А/РЯ/8/34 с холодоадаптированным донором аттенуации.

Методология и методы исследования. Основной методологической базой явились экспериментальные исследования на морских свинках. Были использованы вирусологические, серологические, иммунологические и молекулярно-биологические методы (см. «Материалы и методы»).

Личный вклад автора. Автором лично спланирована, подготовлена и проведена экспериментальная часть данного исследования: работа с

вирусами и с животными, исследование биоматериалов, молекулярно-биологический анализ. Осуществлена статистическая обработка полученных данных. Автором систематизированы и проанализированы архивные данные клинических испытаний вакцинных штаммов, проведенных в разные годы силами коллектива отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ»),

Положения, выносимые на защиту.

Морские свинки могут быть использованы как модель для изучения поствакцинального и постинфекционного гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа.

Вакцинные штаммы, подготовленные на основе устойчивых к температуре и неспецифическим сывороточным ингибиторам «диких» вирусов гриппа, обладали повышенной иммуногенностью в отношении индукции гуморального иммунного ответа.

Одиночные аминокислотные замены T131I в НА1 и D112N в НА2 гемагглютинина вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1), приводили к снижению показателей гуморального иммунного ответа у экспериментальных животных.

Полученные данные о применении метода кодонной оптимизации гемагглютинина вируса гриппа А открывают перспективы конструирования высоко иммуногенных живых гриппозных вакцин.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность и объективность выносимых на защиту положений и выводов диссертации подтверждается значительным объемом исследований и большим массивом статистически обработанных данных. Результаты были представлены на 16 международных и российских конференциях, в том числе на 4 и 5 конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 2014; Рига, Латвия, 2014); на научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение» (СПб, 2012); на

международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (СПб, 2013); на VIII Международном конгрессе по контролю за гриппом (ЮАР, Кейптаун, 2013); на 8 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, 2014); на Межлабораторной конференции ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» (Москва, 2015), а также регулярно заслушивались на заседаниях отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» (2010-2014).

Публикации. Основные результаты и положения диссертации, выводы и заключение полностью отражены в 14 научных статьях, 6 из которых опубликованы в российских журналах, входящих в Перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК, 3 - в зарубежных журналах, индексируемых в международных системах цитирования (библиографических базах - Web of Science, Scopus, PubMed).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 191 странице текста, включая 39 таблиц, 25 рисунков, 7 приложений. Список цитируемой литературы содержит 364 источника, из них 64 отечественных и 300 иностранных.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ (1), МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В работе были использованы вирусы гриппа типа А и В. «Дикие» вирусы: A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/California/07/2009 (HlNl)pdm, A/Singapore/1/57 (H2N2), A/Califomia/7/2004 (H3N2), B/Wisconsin/1/2010. Реассортанты для инактивированных гриппозных вакцин: VN/1203/PR8-IBCDC-RG (VN1203) (H5N1), A/Califomia/07/2009 х PR8 (6:2) (НIN 1); N1BRG-23 (H5N1), подготовленные на основе вируса PR8,

полученные из ВОЗ и Центра по контролю за заболеваемостью (CDC, США). Вирусы с кодон-оптимизированным НА: NYMCX181A (H1N1) (A/Califomia/07/2009pdm (кодон-опт) х NYMCX-157) и АЛигкеу/Тигкеу/1/2005(кодон-опт) х PR8 (6:2) (H5N1), полученные в рамках совместного проекта из Махидолского университета (Тайланд). Холодоадапгированные (ХА) доноры аттенуации отечественной живой гриппозной вакцины, А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) и В/СССР/60/69 (В60) и реассортантные вакцинные штаммы, полученные на их основе, являющиеся собственностью ФГБНУ «ИЭМ».

Животные. Морские свинки (самки-альбиносы) весом 300-350 г. были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Работа проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (2010) и была одобрена Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ». Всего в работе было использовано 150 морских свинок.

Методы. Накопление вирусов и определение инфекционного титра производилось в 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) или культуре клеток MDCK. Реассортантные штаммы ЖГВ получали по стандартной методике (Александрова и др., 1977) с использованием ряда модификаций. Геном вирусов исследовали методом ПЦР, а также секвенированием отдельных участков. Уровень экспрессии НА с модифицированным и нативным составом кодонов при трансфекции клеток плазмидами или заражении их вирусами, содержащими соответствующие гены, сравнивали методами иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР в реальном времени.

Исследование гуморального иммунного ответа осуществляли на морских свинках. Животных интраназально заражали вирусами в дозе 5,0 lg ЭИД50. Накануне заражения, а также через 2, 4 и 8 недель после заражения, производился забор биоматериалов (назальные смывы, сыворотка крови). Оценивали следующие показатели гуморального иммунного ответа: титры сывороточных антигемагглютинирующих антител в реакции торможения

гемагглютинации (РТГА), титры сывороточных вируснейтрализующих антител в реакции микронейтрализации (РМН), титры локальных иммуноглобулинов класса А и сывороточных класса G методом иммуноферментного анализа (ИФА). Работы выполнялись в соответствии с МУ 3.3.2.1758-03.

Для оценки влияния фенотипических свойств вирусов-родителей на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ проводился ретроспективный анализ данных клинических испытаний 33 вакцинных штаммов ЖГВ, полученных в отделе вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ».

Статистическая обработка данных производилась стандартными методами (Гланц, 1998; Наследов, 2011). Отличия считались достоверными при уровне статистической значимости р <0,05.

(2). СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морская свинка - модель для изучения вирусов гриппа.

Самыми распространенными животными для изучения гриппа являются мыши и хорьки (Belser et al., 2011; Thangavel et al., 2014). В последние годы показана перспективность использования морских свинок в качестве модели для экспериментального изучения этой инфекции (Bushnell et al., 2010; Thangavel et al., 2014).

Для изучения возможности применения этой модели с целью оценки показателей гуморального иммунного ответа на ЖГВ морских свинок заражали штаммами ЖГВ и «дикими» вирусами гриппа, на основе которых они были подготовлены. Были использованы следующие пары штаммов: (1) A/Califomia/07/09pdm (H1N1) и А/17/Калифорния/09/38; (2) NIBRG-23 (H5N1) (A/turkey/Turkey/01/2005 х PR8) и А/17/индюк/Турция/05/133.

Полученные результаты сопоставили с литературными данными о аналогичных экспериментах, выполненных на традиционных модельных животных (мыши, хорьки) (табл. 1).

Показатели выделения вирусов из назальных смывов животных, а также ректальная температура по динамике повторяли картину,

наблюдаемую у хорьков. Иммунный ответ на «дикий» вирус формировался интенсивнее, чем на ХА штамм, что соответствует результатам аналогичных экспериментов на хорьках и на мышах (табл. I).

Таблица 1. Характеристики гриппозной инфекции, воспроизведенной на традиционных моделях (данные литературы) и морских свинках (собственные данные).

Параметр

Мыши

Хорьки

Морские свинки

Репликация «диких» и ХА вирусов гриппа в верхних отделах респираторного тракта1

Й 3

о. S со

f 2

хаЩ

3 сутки

Штаммы H5N1 (Suguitan et al„ 2006)

1 3 5 Сутки после заражения

Штаммы HIN1 (Stitlelaar el al., 2011)

2 3 4 Сутки после заражения

Штаммы H1NI Собственные данные

Гуморальный иммунный ответ на эпидемический вирус и ХА

реассортант на его основе

9

Ее

о. 5

_

и КУП

14 день

Штаммы H1N1 (Kuznetcova et а!.. 2013)

14 день

Штаммы H1N1 (Stillelaar et al , 2011)

14 день

Штаммы H5N1 Собственные данные

Гуморальный иммунный ответ на ХА вирусы с разной степенью аттенуирован-ности2

5|-

|2jj

S,

™4 г

Iii

14 день

Штаммы H1N1 (Kuznctcova et al.. 2013)

14 день

Штаммы H2N2 (Киселева, 2001)

14 день

Штаммы H1N1 Собственные данные

WT - «дикий» вирус; ХА - холодоадаптированный вакцинный штамм, подготовленный на основе данного вируса;

2 I - шгамм, содержащий дополнительные аттенуирующие мутации во внутренних генах; 2 - штамм, содержащий стандартное количество аттенуирующих мутаций во внутренних генах

Для того, чтобы понять, можно ли на морских свинках выявить тонкие различия в иммуногенности ХА штаммов, было поставлено два эксперимента с вакцинными штаммами, подготовленными на основе вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (HINl). В первом эксперименте животных заражали

стандартным вакцинным штаммом ЖГВ A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), содержащим 8 аттенуирующих мутаций в генах, кодирующих внутренние белки, и штаммом, содержащим две дополнительные мутации (PBI975, NP1066) (Киселева и др., 2005). Штамм, не содержащий дополнительных аттенуирующих мутаций, был более иммуногенен (табл. 1), что согласуется с результатами, полученными на мышах (Kuznetcova et al., 2013).

Во втором эксперименте на морских свинках проводили исследование иммуногенности реассортантов, для которых были известны показатели их иммуногенности для хорьков (Palker et al., 2004). Полученные нами данные существенно не отличались.

Таким образом, результаты, полученные на морских свинках, по всем исследованным параметрам были сопоставимы с данными, полученными на других модельных животных. Это позволяет сделать вывод о пригодности морских свинок в качестве модели для изучения вирусов гриппа, в том числе постановки экспериментов по тонким отличиям в иммуногенности ХА штаммов.

Влияние степени ингибиторочувствительности штамма на его иммуногенность в эксперименте. Сыворотки крови разных видов млекопитающих содержат неспецифические ингибиторы вирусов гриппа (Лузянина 1966; Krizanova et al., 1969; Gimsa et al., 1996; Reading et al., 2007). Степень чувствительности штамма вируса гриппа к ингибиторам является фенотипическим отражением рецепторной специфичности и характера гликозилирования НА, а также субстратной специфичности нейраминидазы (NA) (Gimsa et al., 1996; Schulze 1997; Matrosovich et al., 1998).

Животных иммунизировали интраназально ингибиторочувствительным (ИЧ) или ингибитороустойчивым (ИУ) вариантами вируса гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2). При детекции показателей гуморального иммунного ответа в качестве антигена использовали оба варианта. Влияние выбора антигена для постановки реакции на результаты РТГА и РМН было

статистически значимым (рис. 1). В контрольной группе (плацебо) в реакции с ИЧ-антигеном отмечено неспецифическое ингибирование вируса, чего никогда не наблюдалось в реакции с ИУ-антигеном. Тигры оцененные методом ИФА, были наиболее высокими (до 1:40960), неспецифические реакции в контрольной группе животных отсутствовали. Титры сыворочных антител при использовании гомологичного антигена были выше при учете любым способом, что свидетельствует о возможных антигенных отличиях ИУ и ИЧ вариантов вируса.

РТГА РМН ИФА IgG

h- „ . v/ш г\\ I r/ш NM I г/т I , r/m rw i r/m .\i i '/ал i ( r/m im i и/т \\ \ r/m

препарат 1234 1234 12 34 12 3 4 1234 12 3 4 1234 1234 1234

24 8 248 248

Срок после иммунизации, нед.

Рисунок 1. Гуморальный иммунный ответ морских свинок к ИЧ и ИУ вариантам вируса A/Singapore/1/57 (H2N2).

1 и 3 животные иммунизированы ИЧ-вариантом; 2 и 4 - животные иммунизированы ИУ-вариантом. 1 и 2 - постановка реакций с ИЧ-антигеном; 3 и 4 - постановка реакций с ИУ-антигеном. Представлены значения среднегеометрических титров в logs +ошибка среднего значения. Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо -менее 1:10.

Был также изучен вопрос, влияет ли NA, унаследованная от ИЧ или ИУ вируса гриппа, на показатели гуморального иммунного ответа. Для этого использовали пару реассортан тов, полученную на основе вируса A/California/7/2004 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а также вторую пару, созданную на основе вируса B/Wisconsin/1/2010 и донора аттенуации В/СССР/60/69. Каждая пара представляла собой: (1) реассортант с формулой генома 6:2 (NA унаследована от ИЧ «дикого» вируса) и (2) реассортант с формулой генома 7:1 (NA от ИУ донора аттенуации).

Включение в геном вакцинного штамма NA от ИУ вируса снижало чувствительность вакцинного штамма к ингибиторам в 8-16 раз. На

показатели гуморального иммунного ответа, определяемые в РТГА, РМН и ИФА, происхождение NA не влияло. При учете результатов РТГА использование 6:2 или 7:1 реассортантов в качестве антигена влияло на результаты учета статистически достоверно.

Таким образом, показатели гуморального иммунного ответа не зависели от уровня ингибиторочувствительности штамма, использованного для иммунизации животных, однако этот признак влиял на учет серологических тестов. При оценке в РТГА и РМН иммунного ответа на ИЧ вирусы использование ИУ антигена приводило к получению заниженных показателей, а ИЧ антиген неспецифически подавлялся компонентами сыворотки. ИФА позволял получать адекватные данные об уровне вирусспецифических антител вне зависимости от

ингибиторочувствительности антигена.

Влияние отдельных аминокислотных замен в гемагглютинине вируса гриппа А на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами ЖГВ.

В работе использовали полученные из ВОЗ два варианта «дикого» вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1): выделенный в: (1) РКЭ и (2) культуре клеток MDCK, а также 4 их реассортанта с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) отечественной ЖГВ (табл. 2). Реассортанты были подготовлены в отделе вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ».

Для изучения состава гетерогенной популяции «дикого» вируса проведено клонирование РКЭ-варианта с последующим секвенированием сегментов генома, кодирующих НА клонов, а также НА и NA реассортантов. Последовательности сегмента генома, кодирующего NA изученных штаммов, не отличались.

В НА1 вариабельность была обнаружена в четырех аминокислотных позициях - 78, 131, 190 и 225. Еще две вариабельные позиции (аминокислотные остатки 106 и 112) располагались в НА2 (табл. 2).

Два варианта вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) - выделенный в РКЭ (№ последовательности в GenBank AJ344014.1) и выделенный в клеточной культуре MDCK (ISDNAU0001) отличались по аминокислотной позиции 190 (НЗ-нумерация) (табл. 2).

Таблица 2. Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина в гетерогенной популяции «дикого» вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинных штаммов, подготовленных на его основе

Локализация Гетероген- Штаммы

Позиция аминокислоты в ность в 25M/12

аминокислоты1 молекуле НА исходной популяции 39E/2 NC 145 NC 84

78 Glu/Lys Glu Glu Glu Lys

131 НА1 Thr Thr lie Thr Thr

190 Asp/Asn Asn Asp Asp Asn

225 Asp/Gly Gly Asn Gly Asp

436 (НА2 106) НА2 Arg/Lys Arg Arg Lys Arg

442 (НА2 112) Asp Asn Asp Asp Asp

Позиции аминокислот указаны в НЗ-нумерации (Raymond et al., 1983). " 25М/1 -вакцинный штамм, подготовленный в культуре клеток MDCK на основе выделенного в MDCK варианта вируса (MDCK/MDCK): 39Е/2 - MDCK/PK3; NC145 - РКЭ/РКЭ; NC84 - РКЭ/РКЭ.

Замена Asn190—>Asp190 описана в литературе как адаптационная к куриным эмбрионам: вследствие ее появления изменяется распределение заряда и способность к взаимодействию с рецептором с а-2,3 связью (Gambaryan et al., 1999; Nobusawa et al., 2000). Вакцинные штаммы, подготовленные на основе вирусов, выделенных в разных субстратах, сохраняли аминокислотный остаток в позиции 190: штамм 25М/1 содержал

100 ]90

Asn , штаммы 39Е/2 и NC145 - Asp . При клонировании «дикого» вируса в РКЭ нам удалось выделить компонент популяции, содержавший Asn190. Данный чистый клон был использован для подготовки вакцинного штамма NC84, в котором Asn190 сохранился после 6 пассажей в куриных эмбрионах. Это свидетельствует о том, что влияние субстрата не однозначно определяет появление аминокислотной замены, но значительно повышает вероятность отбора субстрат-адаптированных вариантов. При подготовке штаммов ЖГВ

предварительное клонирование и выбор клона может обеспечить более предсказуемый результат.

Далее были проанализированы показатели гуморального иммунного ответа после заражения реассортантными штаммами морских свинок. Наиболее значимые различия по интенсивности иммунного ответа обнаружены между штаммами, подготовленными в культуре клеток МОСК. (25М/1 и 39Е/2), и подготовленными в РКЭ (N0145, N084) (рис. 2).

РТГА РМН И ФА IgG

г— r/m и i/т кч VY1 , г/т м г/т м v/m м ¡ v/m f/m \i г/т

препарат 1234 1234 12 34 1234 1234 1234 12 34 1234 1234

248 248 248

Срок после иммунизации, нед.

Рисунок 2. Гуморальный иммунный ответ морских свинок к вирусу гриппа A/New Caledonia/20/99 (HINI).

Свинки иммунизированы штаммами: (1) 25М/1; (2) 39Е/2; (3) NC84; (4) - NC145. Данные представлены в виде: среднегеометрический титр в logi+ошибка среднего значения. Значения титров антител до иммунизации и в группе плацебо - менее 1:10.

Две вариабельные позиции в НА1 не оказали значительного влияния на иммуногенность: гетерогенные позиции 78 и 225 (табл. 2).

Штамм 39Е/2 за счет замены Thr —>11е в НА 1 потерял потенциальный сайт гликозилирования. Подобная замена описана в исследовании (Gambaryan et al., 1998) как влияющая на способность НА вируса к связыванию с рецептором. Возможно, именно это стало причиной сниженной иммуногенности данного реассортанта, поскольку по остальным позициям 39Е/2 не отличается от более иммуногенных штаммов на основе A/New Caledonia/20/99 (рис. 2).

Два реассортанта содержали уникальные замены в НА2 - NC 145 и 25М/1 (табл. 2). Штамм NC145, обладавший наиболее высокой иммуногенностью rio показателям гуморального иммунного ответа (рис. 2), содержал Lys""' в НА2, у остальных исследованных штаммов в данной

позиции располагается остаток Arg106. Гетерогенность Arg/Lys в данной позиции характерна для HI-вирусов (Thoennes et al., 2008). Позиция 106 располагается в области оси симметрии тримера НА, в непосредственной близости от пептида слияния (Bullough et al., 1994). Возможно, Lys106 стабилизировал структуру НА штамма NC145, что и привело к его наибольшей иммуногенности среди исследованных штаммов.

Замена Asp"2—»Asn112 в НА2 была обнаружена у штамма 25М/1, обладавшего самой низкой среди исследованных штаммов иммуногенностью и сниженными показателями репродукции в РКЭ. По данным литературы, Asp"2 формирует 4 водородных связи, стабилизирующих пептид слияния, и мутации в этой позиции приводят к изменению конформации при менее кислых рН (Isin et al., 2002).

Таким образом, иммуногенность штаммов была связана с наличием одиночных аминокислотных замен в гемагглютинине. Наименьшей иммуногенностью из исследованных штаммов обладали два штамма «клеточной» подготовки, которые приобрели уникальные замены в молекуле НА. Оба штамма, подготовленные в РКЭ, отличались высокой иммуногенностью.

Использование методики изменения кодонного состава гемагглютинина для повышения иммуногенности штаммов вируса гриппа.

Изменение кодонного состава - методика, позволяющая без внесения замен в аминокислотную последовательность белка, влиять на эффективность его экспрессии (Holm 1986; Tokuoka et al., 2008). Этот способ применяется для получения аттенуированных полиовирусов (Burns et al., 2006; Mueller et al., 2006), a также для повышения иммуногенности ДНК-вакцин (Graf et al., 2004; Jiang et al., 2007).

Опубликован ряд исследований, посвященных влиянию кодонной оптимизации на иммуногенность ДНК-вакцин на основе НА подтипов HI (Tenbusch et al., 2010), H3 (Wang et al., 2006), H5 (Jiang et al., 2007; Chen et al.,

2008; Li et al., 2008). В настоящем разделе работы мы попытались понять, возможно ли с использованием данной методики получать штаммы ЖГВ с повышенной иммуногенностью. В рамках совместного проекта с Махидолским университетом (Таиланд) было подготовлено два штамма, содержащих НА с оптимизированным кодонным составом (далее: КО).

Разработка и синтез КО генов были выполнены компанией GenScript (США). В качестве основы использовали последовательности генов НА вирусов A/Califomia/07/09 (№ последовательности в Genbank: GQ906804.1) и A/turkey/Turkey/1/2005 (№ DQ407519.1). Полиосновный сайт расщепления в НА Н5 был заменен на моноосновный. В НА вируса H1N1 было внесено 410 замен, H5N1 - 408 замен. Далее гены клонировали в плазмиды pHW2000, после чего по методике (Hoffmann et al., 2002) были сконструированы два реассортантных штамма, каждый из которых содержал NA соответствующего «дикого» вируса, КО НА, а остальные 6 генов принадлежали штамму PR8.

После изменения кодонного состава структура РНК полностью изменилась. Теоретически внесенные изменения должны были привести к увеличению стабильности РНК и большей эффективности процессов транскрипции и трансляции в клетках млекопитающих. Структура белка осталась неизменной.

В экспериментах мы сравнивали КО вирусы с не модицицированными реассортантами для инактивированной вакцины. Способность к репликации в РКЭ и культуре клеток MDCK у КО реассортантов оказалась снижена. По способности к репродукции за пределами температурного оптимума КО и не модифицированные вирусы не отличались между собой.

Уровень экспрессии как HI, так и Н5 КО генов в составе плазмид в клетках линии Vero был выше по сравнению с нативными генами. Внутриклеточный уровень НА в клетках MDCK, зараженных вирусами с КО НА через 12 часов после заражения, был выше, чем в клетках, зараженных вирусами с нативным НА, через 24 часа - незначительно ниже. ОТ-ПЦР

анализ в реальном времени не выявил достоверных отличий между уровнями как смысловой, так и антисмысловой цепей РНК вирусов с нативным и оптимизированным составом кодонов в НА, что свидетельствует об отсутствии дефектов на уровне репликации и транскрипции КО гена.

КО штаммы, как и не модифицированные варианты, не были токсичными для морских свинок при интраназальном введении.

Для исследования показателей репродукции вирусов в верхних дыхательных путях морских свинок заражали интраназально в дозе 4,5 lg ЭИД50. КО вирусы выделялись в течение меньшего срока и в меньших титрах, чем не модифицированные (рис. 3).

Иммуногенность КО вирусов исследовалась в серии экспериментов на морских свинках. КО вирусы обладали более высокой иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа, чем не модифицированные варианты (рис. 4). Это подтверждает, что метод изменения кодонного состава является многообещающим способом повышения иммуногенности. Превышение титров после иммунизации КО вариантами было сравнимо с данными, полученными после иммунизации ДНК-вакцинами (Wang et al., 2006; Jiang et al., 2007; Tenbusch et al., 2010).

» 3

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 ?

День после заражения День после заражения

Рисунок 3. Динамика выделения штаммов с измененным кодонным составом и их не модифицированных аналогов из назальных смывов морских свинок. Данные представлены в виде: титр ^ЭИД5о±ошибка среднего значения. Слева: динамика выделения вирусов подтипа Н1. Справа: динамика выделения вирусов подтипа Н5.

РТГА

РМН

и

I- о

2 4 8

Срок после иммущшцки, нед.

И ФА ДО

2 4 8

Срок после иммунизации, нед.

И ФА 1вА

(сыворотки)

(смывы]

2 4 8

Срок после иммунизации, нед

2 4 8

Срок после иммунизации, нед.

Рисунок 4. Гуморальный иммунный ответ морских свинок к вирусу гриппа А/СаШогша/07/09 (Н1М).

Заштрихованные столбцы: морские свинки иммунизированы штаммом А/СаНГогшаУ07/09хРК8 с нативной последовательностью НА. Черные столбцы: морские свинки иммунизированы штаммом Н1-КО. Данные представлены в виде: среднегеометрический титр в ^2+ошибка среднего значения. Значения титров антител до иммунизации и в группе плацебо - менее 1:10.

С использованием классической методики реассортации (Александрова и др., 1977), а также с применением модификаций (инактивация «дикого» вируса, сокращение времени инкубации, последовательное внесение вирусов в куриный эмбрион) нам не удалось получить реассортанты КО вирусов с донором аттенуации ЖГВ (Федорова, 2012). По-видимому, это связано со сниженной способностью к репликации вирусов с КО НА.

Таким образом, в экспериментах на животных была показана перспективность метода изменения кодонного состава применительно к повышению иммуногенности живого вируса гриппа.

Влияние температуре- и ингибиторочувствительности «диких» вирусов на иммуногенность для людей штаммов ЖГВ, подготовленных на их основе.

В этом разделе работы был проведен ретроспективный анализ количества конверсии сывороточных антигемагглютинирующих антител у

людей, привитых ЖГВ, в зависимости от температуро- и ингибиторочувствителъности «диких» родительских вирусов. Был проведен анализ данных клинических испытаний вакцинных штаммов ЖГВ отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» в период с 1972 по 2008 год. В исследование вошло 33 вакцинных штамма ЖГВ, подготовленных на основе 28 «диких» вирусов гриппа А и В.

При оценке влияния ингибиторочувствительности на иммуногенность вакцин использовались критерии оценки из фармакопейной статьи (ФСП Р N003224/01-270313): иммуногенными считали штаммы, вызвавшие более 50% сероконверсий у серонегативных пациентов после однократной иммунизации и более 70% - после двукратной. Остальные штаммы считались низкоиммуногенными. Для более детального анализа при оценке влияния температурочувствительности иммуногенные вакцинные штаммы были разделены на высокоиммуногенные (частота конверсий антител после однократной иммунизации превышала 60%, а после двукратной - 80%) и среднеиммуногенные (соответственно 50-60 и 70-80% конверсий).

Вакцинные штаммы, полученные на основе более устойчивых к температуре вариантов вируса гриппа, были более иммуногенны (коэфф. корреляции Спирмена ггапк=-0,508, р<0,05) (рис. 5). На основе ИУ вирусов более иммуногенные штаммы также получались достоверно чаще (х2=8,29, р<0,05).

Проведен также анализ иммуногенности штаммов ЖГВ с точки зрения влияния комбинаций двух изученных фенотипических признаков «диких» вирусов-родителей. Показано, что влияние сочетания данных признаков статистически достоверно (критерий Краскела-Уоллеса Н=14,1, р<0,05). Наиболее высокий процент сероконверсий (78,3%) наблюдался в группе штаммов, в которой «дикий» родительский вирус одновременно являлся ингибиторо- и температуроустойчивым. При этом температуро- и ингибиторочувствительность коррелировали между собой:

температуроустойчивые вирусы чаще оказывались устойчивы и к

ингибиторам нормальной сыворотки (коэфф. корреляции Сгшрмена Гпшк=0,4Ю, р<0,05).

Температуро- Ингибиторо-

чувствительность чувствительность

100 1....................-...........................................: 100 Т-'------1

* —

-80 ----- ° 80 - -

■ * ГЦ

5 во - М I со--^- -

'ЕЕГШ!

низкая средняя высокая низко- тшуцогсниые

иммуиогснныс

Иммуногенность Штаммы

Рисунок 5. Влияние температуро- и ингибиторочувствительности «диких» родителей на иммуногенность штаммов ЖГВ. Слева: белые столбцы — вакцинные штаммы, подготовленные на основе «диких» температурочувствительных родительских вирусов; черные столбцы — штаммы, подготовленные на основе «диких» температуроустойчнвых родительских вирусов. Справа: белые столбцы — вакцинные штаммы, подготовленные на основе «диких» ИУ родительских вирусов; черные столбцы - штаммы, подготовленные на основе «диких» ИЧ родительских вирусов. Иммуногенность оценивалась по частоте сероконверсий

На количество поствакцинальных клинических реакций исследованные свойства вирусов не влияли: все вакцинные штаммы были арсакгогенны.

Таким образом, показано, что наиболее иммуногенные штаммы ЖГВ чаще получаются на основе «диких» вирусов, устойчивых к повышенной температуре и неспецифичсским сывороточным ингибиторам. При этом данные свойства родительского вируса не влияли на количество ноствакцинальных клинических реакций у волонтеров.

(3). ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных результатов позволяет сделать ряд практических выводов, которые могут быть использованы при подготовке штаммов ЖГВ и оценке их иммуногенности.

Предварительное клонирование популяции «дикого» вируса гриппа и выбор клона на основе анализа последовательности НА и ЫА может

обеспечить получение реассортантов с заданными свойствами. При этом внимание необходимо обращать на мутации, локализованные не только в антигенных областях НА и ЫА, но также и в других функционально важных участках, таких как сайт, обеспечивающий взаимодействие с остатком сиаловой кислоты, участки, ответственные за взаимодействия внутри олигомерного комплекса, пептид слияния НА.

При выборе «дикого» вируса гриппа, на основе которого будет получен вакцинный реассортант, следует руководствоваться его фенотипическими свойствами. На основе более температуроустойчивого вируса может быть получен более иммуногенный вариант вакцины. Чувствительность вируса-родителя к неспецифическим сывороточным ингибиторам оказывает неоднозначное влияние на иммуногенность вакцинного штамма: с одной стороны, по нашим и литературным данным в условиях эксперимента ингибиторочувствительность не влияет на иммуногенность, либо, в отдельных случаях, ИЧ-штаммы, имеющие сродство к а-2,6 рецепторам, преобладающим в верхних дыхательных путях человека, вызывают более интенсивный гуморальный иммунный ответ, чем аналогичные ИУ-варианты, предпочтительно прикрепляющиеся к а-2,3 - рецепторам. С другой стороны, анализ данных клинических испытаний показал, что на основе ИУ-вирусов в среднем получались более иммуногенные вакцинные штаммы, что, возможно, связано с эволюционной историей данных вирусов.

Для детекции показателей гуморального иммунного ответа на ИЧ штамм стоит использовать ИЧ антиген, поскольку использование ИУ антигена занижает показатели иммунного ответа. При этом особое внимание необходимо обращать на способы обработки сыворотки и при необходимости проводить дополнительные серологические исследования (в частности, методом ИФА).

Кодонная оптимизация НА в составе живого вируса позволяет повысить интенсивность гуморального иммунного ответа, что делает эту методику перспективным способом повышения иммуногенности ЖГВ.

ВЫВОДЫ:

1. Морская свинка является адекватной моделью для оценки постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунного ответа, индуцированного вирусами гриппа и штаммами живой гриппозной вакцины.

2. Неспецифические ингибиторы, содержащиеся в сыворотке крови, приводят к искажению оценки значений показателей гуморального иммунного ответа при использовании ингбиторочувствительных штаммов вируса гриппа в реакциях торможения гемагглютинации и микронейтрализации. Метод иммуноферментного анализа позволяет получать воспроизводимые результаты вне зависимости от уровня ингибиторочувствительности антигенов. При использовании адекватного метода определения антител показано, что чувствительность к неспецифическим ингибиторам не оказывает влияния на иммуногенность штаммов вируса гриппа.

3. Выявлены одиночные аминокислотные замены (Т1311 в НА1 и D112N в НА2 гемагглютинина), приводящие к снижению гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок штаммами живой гриппозной вакцины, подготовленными на основе вируса гриппа A/NewCaledonia/20/99 (H1N1).

4. Впервые сконструированы штаммы вирусов гриппа с измененным кодонным составом гемагглютинина и изучены их биологические свойства. Показано, что штаммы с измененным кодонным составом реплицировались в системе in vitro и in vivo хуже, чем их не модифицированные аналоги, однако вызывали более интенсивный гуморальный иммунный ответ.

5. На основе ретроспективного анализа клинических испытаний вакцинных штаммов за 30-летний период выявлена прямая зависимость между температуро- и ингибитороустойчивостью «диких» родительских вирусов гриппа А и В и уровнем гуморального иммунного ответа привитых лиц на живые гриппозные вакцины, подготовленные на основе данных вирусов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также в зарубежных журналах, входящих в международные системы цитирования

1. Kiseleva I. Possible outcomes of reassortment in vivo between wild type and live attenuated influenza vaccine strains / I. Kiseleva, I. Dubrovina, E. Bazhenova, E. Fedorova. N. Larionova, L. Rudenko // Vaccine. - 2012. - V. 30.-№51.-P.7395-7399.

2. Киселева И.В. Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины / И.В. Киселева, Е.А. Баженова, Н.В. Ларионова, Е.А. Федорова. И.А. Дубровина, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко // Вопросы вирусологии. -2013. -№5. - С.26-31.

3. Larionova N. Live attenuated influenza vaccines against highly pathogenic H5N1 avian influenza: development and preclinical characterization / N. Larionova, I. Kiseleva, I. Isakova-Sivak, A. Rekstin, I. Dubrovina, E. Bazhenova, T.M. Ross, D. Swayne, L. Gubareva, V. Tsvetnitsky, E. Fedorova. E. Doroshenko, L. Rudenko // Journal of Vaccines and Vaccination. - 2013. -V. 4. _ №8. - doi: 10.4172/2157-7560.1000208.

4. Киселева И.В. Роль нейраминидазы в формировании чувствительности вирусов фиппа к сывороточным ингибиторам и эффективности реассортации / И.В. Киселева, Н.В. Ларионова, Е.А. Баженова, Е.А. Федорова. И.А. Дубровина, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. - 2014. - №3. -С.34—40.

5. Kiseleva I. Contribution of neuraminidase of influenza viruses to the sensitivity to normal sera inhibitors and reassortment efficiency /1. Kiseleva, N. Larionova, E. Fedorova. E. Bazhenova, I. Dubrovina, I. Isakova-Sivak, L. Rudenko // The Open Microbiology Journal. - 2014. - № 8. - P.59-70.

6. Федорова Е.А. Факторы, влияющие на иммуногенность вируса гриппа и гриппозных вакцин / Е.А. Федорова, И.В. Киселева, Н.В.Ларионова, Е.П. Григорьева, С.А. Донина, Е.А. Баженова, И.А. Дубровина, М.К. Ерофеева,

B.П. Дриневский, Л.Г. Руденко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2014. -№3. - С. 70-83.

7. Федорова Е.А. Оптимизация кодонного состава гемагглютинина как перспективный способ повышения иммуногенности гриппозных вакцин / Е.А._Федорова, И.В. Киселева, P. Auewarakul, О. Suptawiwat, Л.Г. Руденко // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2014. - № 4. -

C. 3-9.

8. Федорова Е.А.. Одиночные аминокислотные замены в молекуле гемагпиотинина штаммов живой гриппозной вакцины, подготовленных в разных субстратах, и их влияние на иммуногенность (экспериментальные данные) / Е.А._Федорова, И.В. Киселева, И.Н. Исакова-Сивак, И.А. Дубровина, Л.Г. Руденко // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 11.-С. 1311-1315.

9. Киселева И.В. Оценка генетической и фенотипической стабильности живой гриппозной вакцины против потенциально пандемического вируса гриппа птиц / И.В. Киселева, И.А. Дубровина, Н.В. Ларионова, И.Н. Исакова-Сивак, Е.А. Федорова. Е.А. Баженова, М.А. Стукова, М.К. Ерофеева, Л.Г. Руденко // Фундаментальные исследования. - 2014. -№ 11. -С. 1301-1305.

Статьи в прочих научных изданиях:

1. Баженова Е.А. Проблемы подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины на основе потенциально пандемических вирусов гриппа / Е.А. Баженова, Н.В. Ларионова, Е.А. Федорова. И.А. Дубровина, И.В. Киселева, Л.Г. Руденко // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012. - №6. - С. 16-20.

2. Федорова Е.А. Реассортация эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в эксперименте / Е.А. Федорова. И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, Е.В. Иванова, Н.В. Ларионова, И.В. Киселева, Л.Г. Руденко // Материалы научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию НИИ гриппа 24—25 октября 2012 года, Санкт-Петербург. Ред. Цыбалова Л.М., Егоров В.В. -СПб, 2012.-С. 28-38.

3. Федорова Е.А. Иммуногенность реассортантных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины, подготовленных на основе вируса А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), при интраназальном заражении морских свинок / Е.А. Федорова, И.Н. Исакова-Сивак, С.А. Кузнецова, В.А. Кузнецова, И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, И.В. Киселева // Медицинский академический журнал. - 2012. - № 4. - С.57-59.

4. Дубровина И.А. Изучение возможности реассортации эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в экспериментах ш vivo / И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, Е.А. Федорова. Е.В. Иванова, Н.В. Ларионова, И.В. Киселева // Медицинский академический журнал. - 2012. - № 4. -С.45-47.

5. Kiseleva I. Live cold-adapted attenuated vaccine against H5N1 influenza viruses / I. Kiseleva, N. Larionova, E. Fedorova. I. Dubrovina, E. Bazhenova, T.M. Ross, L. Rudenko //Journal of Medical Safety. - 2013. - P. 36^11.

Подписано в печать 20.02.2015 Формат 60x84'/|6 Цифровая Печ. л. 1.1 Тираж 100 Заказ № 34/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)

15--279Ö

2014270610

2014270610