Молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России

Ильичёва, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России"

На правах рукописи

Ильичёва Татьяна Николаевна

молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России (2005-2012 гг.)

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 В Ш 2й13

Кольцово - 2013

005531581

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные Нетёсов Сергей Викторович, член-корреспондент РАН, доктор

консультанты биологических наук, профессор, Новосибирский государственный университет

Шестопалов Александр Михайлович, доктор биологических наук, профессор, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Официальные Локтев Валерий Борисович, доктор биологических наук, профессор, оппоненты ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов.

Игнатьев Георгий Михайлович, доктор биологических наук, профессор, ФГУП «НПО «Микроген», начальник управления науки, инновационного развития и внедрения новых препаратов.

Беклемишев Анатолий Борисович, доктор биологических наук, профессор, Институт биохимии СО РАМН, заведующий лабораторией генетической инженерии.

Ведущая ФГБУН Институт цитологии и генетики Сибирского отделения

организация: Российской академии наук

Защита диссертации состоится «11» октября 2013 г. в 9°° на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирской области, тел.: +7(383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан июля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета доктор биологических наук, ' ¿у ■ ^

профессор Трошкова Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грипп в его зоонозной, сезонной эпидемической и пандемической формах остается серьезной угрозой здоровью населения. Непрерывная циркуляция вирусов гриппа в природе, главным образом среди водоплавающих птиц, и способность к реассортации способствуют появлению новых вариантов вируса с пандемическим потенциалом. Если вирус приобретает способность эффективно передаваться от человека к человеку, он может вызвать вспышку заболевания. Слабый популяционный иммунитет не в состоянии защитить население от нового вируса, и он быстро распространяется по странам и континентам. В отличие от сезонного пандемический грипп поражает преимущественно молодых людей и лиц среднего возраста. Опыт пандемий XX века показал, что они существенно отразились на здоровье людей и повлекли значительные экономические потери.

В 1947 г. Всемирной организацией здравоохранения была создана «Глобальная система надзора за гриппом» (с мая 2011 г. она называется Global Influenza Surveillance and Response System - GISRS), главной задачей которой является получение текущей репрезентативной картины изменений вируса гриппа на глобальном уровне. Программа была организована как сеть лабораторий, нацеленных на изучение циркуляции и особенностей генетического строения штаммов вируса гриппа, выделенных из клинических образцов и секционного материала Национальными центрами по гриппу (WHO/CDS/2005.29).

Сегодня Глобальная программа ВОЗ по надзору за гриппом включает 138 Национальных центров по гриппу из 108 стран, шесть сотрудничающих с ВОЗ референс-центров, расположенных в Лондоне (Англия), Атланте (США), Мельбурне (Австралия), Токио (Япония), Пекине (Китай), Мемфисе (США), 4 Головные контрольные лаборатории (в Австралии, Японии, Великобритании, США), 12 референс-лабораторий по диагностике А/Н5.

Современная концепция надзора за гриппом в России сложилась благодаря совместным усилиям Руководителя Роспотребнадзора, акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко, академика РАМН, проф. Д.К. Львова и академика РАМН, проф. О.И. Киселева. Система базируется на деятельности двух Национальных центров по гриппу, существующих на базе НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и НИИ гриппа, и 59 базовых

вирусологических лабораторий Роспотребнадзора. Система охватывает практически всю территорию РФ.

После 2005 г., когда высокопатогенный вирус гриппа птиц А(Н5Ш) вызвал несколько эпизоотии на территории России, на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» был организован референс-центр по надзору за высокопатогенным вирусом гриппа и референс-лаборатория ВОЗ по диагностике А/Н5. Помимо работ, связанных с эпизоотиями, вызванными высокопатогенным гриппом, в перечень задач этой лаборатории всходит выявление случаев инфицирования людей вирусами гриппа птиц и появления в человеческой популяции вирусов гриппа с пандемическим потенциалом.

В появлении новых вариантов вируса гриппа велико значение Азиатских регионов РФ. Так, юг Западной Сибири (долины рек Оби и Иртыша, Обь-Иртышское междуречье) богат реками и озерами, находится на путях миграции многих видов птиц и является гнездовым ареалом большого числа видов, экологически связанных с водоемами. Территориальные связи западно-сибирских птиц, которые устанавливаются в процессе сезонных миграций, весьма обширны, поскольку здесь сходятся миграционные потоки птиц, зимующих в различных регионах мира - Европе, Африке, на Ближнем Востоке и в Средней Азии, Индостане и Юго-Восточной Азии. Поскольку Юго-Западная Сибирь - это регион с развитой инфраструктурой, относительно высокой для Сибири плотностью населения, то здесь высока вероятность появления реассортантных штаммов между вирусами гриппа человека и животных и возникновения локальных вспышек заболевания людей, вызванных необычными вариантами вируса гриппа.

Физико-географическое положение Восточной Сибири и экологические особенности орнитофауны этого региона также создают благоприятные условия для реассортации геномов различных штаммов вируса гриппа А. Это, в свою очередь, способствует увеличению гетерогенности вирусной популяции и обеспечивает формирование большого разнообразия штаммов, появления и распространения новых, ранее не описанных вариантов вируса гриппа (Львов, 2004).

Дальневосточный регион имеет особое значение в экологии и эпидемиологии гриппа. По его территории пролегает восточноазиатско-австралийский пролетный путь, который включает территории Австралии, Индонезии, Китая, Японии, США, России и некоторых других стран. Таким образом, птицы, мигрирующие этим путем, могут осуществлять перенос патогенных штаммов, эндемичных для Индонезии и Китая, где

постоянно регистрируются вспышки, вызванные вирусом подтипа А(Н5Ы1). Дальневосточный регион имеет самую протяженную в РФ границу с Китаем, страной, где наиболее часто появляются эпидемические штаммы вируса гриппа.

В связи с вышесказанным представляется очевидным, что для своевременного выявления новых вариантов вируса гриппа человека, ретроспективного эпидемиологического анализа и оценки степени защищенности населения от эпидемически значимых типов / субтипов вируса, в дополнение к ординарному эпидемиологическому надзору необходимо проводить комплексное исследование, включающее выявление циркулирующих штаммов вирусов, анализ их молекулярно-биологических и антигенных свойств, филогенетических связей, поиск маркеров высокопатогенных вирусов в сыворотках крови людей из групп риска, анализ динамики популяционного иммунитета.

Цель исследования. Цель настоящей работы - охарактеризовать пандемию гриппа 2009-2010 гг., предпандемический и постпандемический периоды в Азиатской части России, используя комплексную методологию молекулярно-эпидемиологического мониторинга.

Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи.

1. Организовать сбор сывороток крови людей, проживающих на территориях, неблагополучных по гриппу птиц А(Н5Ш).

2. Разработать методику и провести тестирование сывороток людей на наличие антител к вирусу гриппа А(Н5Ы1).

3. Организовать всесезонный сбор образцов сывороток крови в условиях случайной независимой выборки по категориям: мужчины, женщины, возраст 0-18 лет, 19-45, 46 - 60 лет и старше 60 лет. На каждого человека собрать основную анамнестическую информацию с обязательными данными о вакцинации.

4. Провести анализ сывороток на наличие специфических антител к серотипам вируса гриппа А (НШ1, НШ1 рс1т09; НЗК2, Н5Ш) и вирусу гриппа В двух генетических линий - Виктория и Ямагата. Сыворотки крови, положительные в РТГА к вирусам гриппа птиц А(Н5Ы1), исследовать методом микронейтрализации.

5. Организовать сбор клинических образцов от пациентов с диагнозом «ОРВИ» и патологического материала от людей, скончавшихся от пневмонии, и исследовать их на возможное присутствие различных типов и серотипов вируса гриппа с применением ПЦР-анализа и серологических методов типирования и субтипирования вирусов.

6. Провести секвенирование всех генов у изолированных нетипичных и пандемических штаммов вируса гриппа, у типичных штаммов определить нуклеотидные последовательности генов поверхностных белков - гемагглютинина и нейраминидазы, построить филогенетические деревья генов НА и ЫА.

7. Провести анализ аминокислотных замен в белках выделенных штаммов по отношению к соответствующим белкам вакцинных штаммов.

8. Определить лекарственную чувствительность штаммов вируса гриппа к используемым в России противогриппозным препаратам.

9. Проанализировать особенности эпидемических сезонов по гриппу в Сибири в сравнении с другими регионами мира.

Научная новизна. Обоснована комплексная методология молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа, позволяющая выявлять варианты вируса с пандемическим и эпидемическим потенциалом, проводить ретроспективный анализ эпидемических вспышек заболевания, оценивать популяционный иммунитет населения в отношении значимых типов / субтипов вируса гриппа.

Впервые получены данные о наличии специфических антител к поверхностному антигену вируса гриппа птиц серотипа А(Н5"Ы1) в сыворотках крови людей на территории России.

Предложен подход к выявлению специфических антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках людей, в котором, наряду с референс-антигеном, используются штаммы вируса гриппа, выделенные от птиц данного региона; при постановке РТГА используются нативные эритроциты лошади, макаки-резус или формалинизированные эритроциты лошади, макаки-резус и гуся.

Показано, что эпидемия гриппа в 2009 г. в Азиатской части России была вызвана пандемическим вирусом гриппа А(НШ1)рс1т09. В предпандемический период эпидемию вызывали вирусы гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и вирусы гриппа В (линия Виктория), в первый постпандемический сезон преобладал вирус гриппа А(Н1Ш)рс1т09, коциркулировали вирусы А(НЗ№) и гриппа В (линия Виктория). Во второй постпандемический сезон преобладали вирусы гриппа А(НЗЫ2) и В (линия Ямагата). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал генетическое разнообразие штаммов вируса гриппа, циркулировавших в Сибири в 2009-2012 гг.

С помощью молекулярно-генетического анализа была определена лекарственная чувствительность выделенных в 2009 г. штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1)р<Зт09 к используемым в России противогриппозным препаратам (все штаммы были чувствительны к антинейраминидазным препаратам озельтамивир, занамивир, препарату арбидол и устойчивы к ремантадину).

Практическая значимость работы. Полученные в ходе работы данные были использованы при подготовке лекционных и практических занятий по курсу Микробиология в Новосибирском государственном университете и на курсах повышения квалификации врачей-вирусологов Центров гигиены и эпидемиологии субъектов РФ, проводимых на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Результаты, полученные при выполнении настоящей работы, были использованы для подготовки пяти учебных и учебно-методических пособий.

Данные о лабораторно подтвержденных случаях гриппа еженедельно предавались во всемирную сеть надзора за гриппом Р1и№1.

61 нуклеотидная последовательность генов разных типов/субтипов вируса гриппа депонированы в международную базу ОепВапк (табл. 1).

Создана и принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» коллекция из 43 штаммов вируса гриппа различных типов / субтипов, выделенных в Азиатской части России в 2008-2012 гг. (табл. 2).

Получены два патента РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Дана характеристика пандемии гриппа 2009-2010 гг., предпандемического и постпандемического периодов в Азиатской части России.

2. Обоснована комплексная методология молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа, позволившая выявить маркеры вируса с пандемическим потенциалом в сыворотках крови у жителей Западной Сибири, провести ретроспективный анализ эпидемических сезонов гриппа, оценить популяционный иммунитет населения в отношении значимых типов / субтипов вируса.

3. В последний предпандемический по гриппу сезон 2008-2009 гг. в Западной Сибири заболевание вызывали штаммы вируса гриппа А(НШ1), А(НЗК2) и вируса гриппа В, по молекулярно-биологическим характеристикам подобные вакцинным штаммам.

4. В 2009 г. грипп вызывали штаммы пандемического вируса А(НШ1)рс1т09, по молекулярно-биологическим и антигенным характеристикам подобные референс-штамму А/СаП[огша/04/2009. От пандемического гриппа наиболее пострадало население Дальнего Востока, в меньшей степени - население Восточной и Западной Сибири, болели в основном люди в возрасте до 30 лет.

5. В эпидемические сезоны по гриппу в 2010-2011 и 2011-2012 гг. заболевание вызывали штаммы вируса гриппа А(Н1Ы 1^(111109, А(НЗШ), и вирусы гриппа В двух генетических линий - Виктория и Ямагата.

6. С марта 2009 по май 2012 г. состояние популяционного иммунитета к гриппу в Западной Сибири существенно изменилось, что было связано с появлением пандемического вируса А(НШ1)рёт09.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международных конференциях по молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетике инфекционных болезней (Бангкок, Таиланд, 2006, Амстердам, Нидерланды, 2010), 3-ей Международной конференции «Фундаментальная наука медицине» (Новосибирск, 2007), Международной конференции «Грипп птиц 2008: интеграция для познания и контроля» (Бангкок, Таиланд, 2008), 10-ом Международном симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (Сингапур, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), 7-м Международном симпозиуме по гриппу птиц «Грипп у домашних и диких птиц» (Афины, Джорджия, США, 2009), Международной конференции «Патогенез гриппа: взаимодействие вируса и хозяина» (Гонконг, Китай, 2011) и др. международных и всероссийских научных конференциях.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе 21 статья (из них 16 в научных журналах, рекомендованных ВАК и 4 статьи в высокорейтинговых международных журналах), 2 патента РФ, 5 учебных и учебно-методических пособия и 15 тезисов научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 271 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы,

результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы, содержащий 453 работы отечественных и зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 23 рисунками.

Личный вклад автора в исследования, вошедшие в диссертацию, был определяющим. Постановка задач, планирование экспериментов, анализ результатов, представленных в диссертационной работе, написание основополагающих научных трудов осуществлялись автором лично. Автором лично или под ее руководством проведено выделение, типирование и субтипирование изолятов вируса гриппа, исследованы их антигенные свойства (при участии А.Г. Дурыманова, О.Г. Курской), проведены молекулярно-биологические исследования (при участии к.б.н. И.М. Суслопарова, И.А. Соболева, М.В. Сивай), исследована чувствительность вирусов к химиопрепаратам, получены иммунные сыворотки животных (совместно с к.б.н. A.B. Зайковской и к.б.н.

A.A. Романовской). Сыворотки крови людей, собранные в 2005-2007 гг., были исследованы автором лично в СЦ ВОЗ по гриппу, CDC, Атланта, США, в лаборатории д-ра [А. Климова| и лаборатории д-ра J. Katz. В организации сбора образцов от людей и животных принимали участие к.б.н. К.А. Шаршов, к.б.н. А.Ю. Алексеев, С.И. Золотых,

B.C. Беспалов, JI.M. Горбатовская. Синтез новых противовирусных препаратов проводился сотрудниками ИОХ СО РАН, ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН., ИОС УрО РАН. Анализ противовирусной активности препаратов автор проводила лично или совместно с к.б.н. O.A. Плясуновой, Т.Р. Проняевой, к.б.н. [Е.Ф. Белановым[ под руководством д.м.н., проф. А.Г. Покровского. В обсуждении концепции работы участвовали научные консультанты: чл.-корр. РАН, д.б.н., проф. C.B. Нетесов и д.б.н., проф. A.M. Шестопалов. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены автором лично. Вклад в работу соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор выражает глубокую искреннюю благодарность за совместную работу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методы

Работа выполнена в отделе зоонозных инфекций и гриппа ФБУН «Государственный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в 1998-2012 гг. в рамках Распоряжения Правительства Российской Федерации № 820-Р от 5 июня 2006 г. и при поддержке ФЦП

«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (Госконтракт № 14.740.11.0247 от 17.09.2010 г. и Соглашение № 14.В37.21.1927 от 04.10.2012).

Все работы с клиническими образцами (мазки из носа и зева, сыворотки крови) и секционным материалом одобрены решением этического комитета IRB 00001360 (протокол № 2 от 20.05.08) и Комитетом по биомедицинской этике при ФГБУ Научный центр Клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (решение № 25 от 19 ноября 2012 г.).

Сбор и хранение образцов, выделение вируса гриппа в культуре клеток MDCK линии Лондон, проведение реакции торможения гемагглютинации (РТГА), микронейтрализации (МН), типирование и субтипирование штаммов вируса гриппа А и В проводили по протоколам, рекомендованным ВОЗ (WHO, 2011). В работе использованы референс-сыворотки и моноклональные антитела, любезно предоставленные СЦ ВОЗ по гриппу (Атланта, США; Мемфис, США).

Данные по серотипированию подтверждали методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Для этого использовали набор реагентов для выявления РНК вирусов гриппа A (Influenzavirus А) и вируса гриппа В (Influenzavirus В) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс InfluenzavirusA/B-FL» и набор для типирования (идентификации субтипов H1N1 и H3N2) вирусов гриппа A (Influenzavirus А) «АмплиСенс InflucnzavirusA-iHii-FL» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва, Россия).

Обратная транскрипция для получения кДНК по матрице РНК вируса гриппа осуществлялась с помощью набора Fermentas RevertAid (Fermentas International Inc., Vilnius, Lithuania). Для амплификации отдельных фрагментов генов, кодирующих поверхностные гликопротеины вируса гриппа, использовали ПЦР с ген-специфическими праймерами (Ghedin, et al., 2005). Для экстракции наработанных методом ПЦР фрагментов генов, кодирующих нейраминидазу и гемагглютинин исследованных штаммов вируса гриппа, использовался набор реагентов QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden). Реакцию секвенирования проводили с использованием набора «BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit» (Applied BioSystems, USA). Амплификация проходила в соответствии с рекомендацией производителя. Очистку продукта проводили набором «BigDye XTerminator Purification Kit» (Applied BioSystems, USA). Анализировали

Штамм Номер в GenBank HA Номер в GenBank NA

1 A/Novosibirsk/2/2009(H 1N1) CY053656 CY053657

2 A/Novosibirsk/3/2009(H 1N1) CY053658 CY053659

3 A/Novosibirsk/4/2009(H IN 1) CY053664 CY053665

4 A/Novosibirsk/7/2009(H IN 1) CY053670 CY053671

5 A/Novosibirsk/8/2009(H 1N1) CY053676 CY053677

6 A/Novosibirsk/I51/2009(H1N1) CY053654 CY053655

7 A/Novosibirsk/653/2009(H 1N1) CY053668 CY053669

8 A/Novosibirsk/716/2009(H 1N1) CY053674 CY053675

9 A/Novosibirsk/1062/2009(H 1N1) CY053650 CY053651

10 A/Novosibirsk/31/2009(H3N2) CY053660 CY053661

11 A/Novosibirsk/319/2009(H3N2) CY053662 CY053663

12 A/Novosibirsk/628/2009(H3N2) CY053666 CY053667

13 A/Novosibirsk/707/2009(H3N2) CY053672 CY053673

14 A/Novosibirsk/1211/2009(H3N2) CY053652 CY053653

15 A/Novosibirsk/24k/2011 (H1N1 )pdm09 CY103845 CY103846

16 A/Novosibirsk/53k/2011 (HlNl)pdm09 CY103847 CY 103848

17 A/Novosibirsk/89d/2011 (HlNl)pdm09 CY103841 CY 103842

18 A/Novosibirsk/104k/2011 (HlNl)pdm09 CY 103849 CY 103850

19 A/Novosibirsk/105d/2011 (HlNl)pdm09 CY 103843 CY 103844

20 A/Novosibirsk/107k/2011 (HlNl)pdm09 CY103851 CY103852

21 A/Novosibirsk/KSh/2011 (HlNl)pdm09 JQ041354 JQ041356

22 A/Tomsk/18/2011 (HlNl)pdm09 CY 103853 CY 103854

23 A/Tomsk/29/2011 (H1N1 )pdm09 CY 103855 CY103856

24 A/Novosibirsk/76k/2011 (H3N2) JN940427 JN940428

25 A/Novosibirsk/1927/2011 (H3N2) JN940431 JN940432

26 A/Novosibirsk/1832/2011 (H3N2) J N940429 JN940430

27 B/Novosibirsk/36/2009 KF23446

28 B/Novosibirsk/715/2009 KF234472

29 B/Novosibirsk/04/2010 KF234470

30 B/Tomsk/12/2011 KF301651 KF234464

31 B/Vladi vostok/693/2012 KF234474

32 B/Irkutsk/489/2012 KF234473

33 | B/Novosibirsk/74/2012 KF301656 KF301657

продукты на автоматическом секвенаторе 310 Genetic analyzer (Applied BioSystems, USA). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием специализированного программного обеспечения: Vector NTI Advance 10 (Invitrogen), SeqMan (Lasergene) и специализированных ресурсов Influenza Virus Resource (Bao, et al„ 2008.) и BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine). Анализ аминокислотных последовательностей осуществляли с помощью программы BioEdit.

Таблица 2. Штаммы вируса гриппа человека, принятые на патентное депонирование в Государственную коллекцию Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

№ Наименование штамма Дата выделения Объект выделения Регист. номер

1 АЛПа<Нуоз1ок/01/2009 (НШ1)рс1т09 Июль 2009 носоглоточный смыв У-440

2 А/Моуозл1гзк/02/2009 (Н1Ш)р<1т09 Август 2009 носоглоточный смыв У-447

3 А/Отзк/02/2009 (НШ1)рс1т09 Август 2009 носоглоточный смыв У-464

4 А/Готзк/02/2009 (НШ1)рс1т09 Август 2009 носоглоточный смыв У-444

5 А/Готзк/03/2009 (НШ1)рёт09 Август 2009 носоглоточный смыв У-441

6 А/Тотзк/05/2009 (НШ1Ыт09 Ноябрь 2009 секционный материал У-457

7 АЛГотзк/06/2009 (НШ1)рёт09 Ноябрь 2009 секционный материал У-458

8 А/КЬаЬагоузк/01/2009 (НШ1)Рат09 Ноябрь 2009 секционный материал У-459

9 А/ВЬроуеБЬепБк/01/2009 (Н11М1)рс1т09 Ноябрь 2009 секционный материал \М54

10 А/Ноуо51Ь1г5кУ24к/2011 (НШ1)рёт09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-565

11 А/МоуозШкзкШк/гОП (НШ1Ыт09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-566

1?, А/Моуоз№зк/76к/2011 (НЗЫ2) Февраль 2011 носоглоточный смыв У-567

П А/Моуоз1Ь1гзк/89с!/2011 (HlNl)pdm09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-568

14 А/Ыоуоз1ЬкзкЛ04к/2011 (НШ1^т09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-569

15 А/М^Л^кЛ 05(1/2011 (HlNl)pdm09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-570

16 А/Моуоз1Ь1гзк/107к/2011 (HlNl)pdm09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-571

17 А/Моуозйжзк/653/2009 (НШ1) Март 2009 носоглоточный смыв У-572

18 А/КоуозШ^к/КЗЬ/гО! 1 (HlNl)pdm09 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-573

19 А/Ватаи1/23 8/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-601

70 АЛгкШБк/01/2012 (НЗЫ2) Апрель 2012 носоглоточный смыв У-602

71 А/Кгазпоуагзк/10/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-588

7? А/№уозйжзк/02/2013 (НЗЫ2) Январь 2013 носоглоточный смыв У-627

73 А/Моуоз1Ь1Гзк/13/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-603

74 А/ЫоуозЛ^Шг/гОП (НЗЫ2) Март 2012 носоглоточный смыв У-590

75 А/М0У051Ыгзк/23 к/2012 (НЗШ) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-581

76 А/Моуоз1Ькзк/26к/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-586

27 А/МоуОзПшзк/59/2012 (НЗЫ2) Апрель 2012 носоглоточный смыв У-591

78 А/Моуоз«жзк/77/2012 (ИЗЫ2) Декабрь 2012 носоглоточный смыв У-626

79 А/Отзк/1/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-586

30 А/Туитеп/03/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-587

31 А/У1аШуозШк/59/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смьв У-578

37 A/Vladivostok/81/2012 (НЗЫ2) Февраль 2012 носоглоточный смыв У-579

33 А/УЫ1уозйк/99/2012 (ИЗN2) Январь 2012 носоглоточный смыв У-580

34 А/УЫ!уозЮк/342/2012 (HlNl)pdra09 Февраль 2012 носоглоточный смыв У-605

^5 A/Vladivostok/344/2012 (Н1Ы1Ыт09 Февраль 2012 носоглоточный смыв У-606

36 В/Отзк/7/2012 Март 2012 носоглоточный смыв У-597

37 В/1гки15к/01/2012 Март 2012 носоглоточный смыв У-598

38 ВЛгки1зк/02/2012 Апрель 2012 носоглоточный смыв У-599

39 В/Ма^ап/478/2012 Май 2012 носоглоточный смыв У-600

40 В/Коуозйжзк/29к/2011 Февраль 2011 носоглоточный смыв У-574

41 B/Vladivostok/98/2012 Февраль 2012 носоглоточный смыв У-595

47 В/УЫ1уоз1ок/102/2012 Февраль 2012 носоглоточный смыв У-596

43 В/МоусшЫгйкт/МП Июнь 2012 носоглоточный смыв У-629

Филогенетические деревья на основе выровненных нуклеотидных последовательностей строили с помощью программы MEGA5 методом «максимального правдоподобия (модель Tamura-Nei)». Для оценки достоверности использовали бутстреп-тест (1000 репликаций).

Для статистической обработки данных были использованы общепринятые методы описательной статистики с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel (Microsoft Office Professional Edition, 2007) и STATISTICA 6,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Предпапдемический период (2005 - апрель 2009 г.)

С начала 21 века и до апреля 2009 г. вирус гриппа птиц A(H5N1) эксперты ВОЗ считали наиболее вероятным кандидатом в качестве прототипа будущего пандемического штамма.

Летом 2005 г. высокопатогенный вирус гриппа A(H5N1) был впервые выделен и охарактеризован в России (Onishchenko, 2006). Первая вспышка заболевания домашней птицы была зафиксирована на юге Западной Сибири, после чего вирус распространился до Каспийского и Черноморского бассейнов и далее на юг Западной Европы. В течение 20052007 гг. среди домашней птицы в Западной Сибири неоднократно наблюдались вспышки высокопатогенного гриппа, вызванного вирусом серотипа A(H5N1). Чаще всего от гриппа погибала птица в частных хозяйствах.

Начиная с августа 2005 г. мы исследовали клинические образцы и секционный материал, полученные от людей с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом гриппа птиц A(H5N1). Всего в ГНЦ ВБ «Вектор» было передано 289 образцов, которые были исследованы в ПЦР-анализе, наличие вируса тестировали посевом (не менее трех пассажей) в развивающиеся куриные эмбрионы и культуру клеток MDCK. Ни в одном образце вирус A(H5N1) обнаружен не был.

Модификация методики РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц A(H5N1) в сыворотках млекопитающих

Для сероэпидемиологических исследований сывороток крови людей с целью определения уровня специфических антител к различным серотипам вируса гриппа чаще всего используют реакцию торможения гемагглютинации («золотой стандарт серодиагностики»). Основываясь на наблюдениях многих исследователей, считается, что

титр сыворотки в РТГА, равный 1:40, коррелирует с 50 %-ым снижением риска развития заболевания в восприимчивой популяции (Наппоип, е1 а1., 2004) и может быть назван 50 %-ым защитным титром.

К сожалению, в случае инфицирования людей высокопатогенным вирусом гриппа птиц (Н51<1, Н7Ш) этот метод в стандартном исполнении оказался слабо чувствительным. Были предприняты попытки модифицировать методику, и показано, что высокая специфичность и чувствительность наблюдались при использовании эритроцитов лошади. Тем не менее, актуальной оставалась разработка простого, надежного и доступного метода исследования сывороток крови людей на наличие антител к антигену А(Н5) вируса гриппа птиц.

Нами был проведен сравнительный анализ использования нативных и формалинизированных эритроцитов разных видов животных при постановке реакции торможения гемагглютинации. Мы показали, что титры антител в РТГА с формалинизированными эритроцитами макаки-резус, морской свинки, барана, петуха и гуся были, как правило, более высокими, чем с нативными (результаты не показаны). Титры в РТГА с нативными эритроцитами лошади были или равны титрам, полученным с формалинизированными эритроцитами, или в 2-4 раза выше. Титры в РТГА с нативными эритроцитами макаки-резус чаще в 2-4 раза ниже титров с формалинизированными эритроцитами. Формалинизированные эритроциты барана, петуха, гуся давали титры, как правило, выше, иногда значительно (до 32 раз), чем нативные эритроциты. Данные РТГА с формалинизированными эритроцитами представлены в табл. 3.

Из представленных в табл. 3 данных следует, что при серомониторинге высокопатогенного гриппа птиц в человеческой популяции необходимо использовать, наряду с референс-антигеном, аборигенные штаммы вируса гриппа А(Н5Ы1). Для скрининговых работ в реакции торможения гемагглютинации кроме эритроцитов лошади можно использовать эритроциты макаки-резус. Полученные нами данные позволяют рекомендовать к использованию в РТГА формалинизированные эритроциты, поскольку срок их пригодности гораздо более длительный, чем для нативных эритроцитов. Для целей серомониторинга можно использовать формалинизированные эритроциты лошади, макаки-резус, петуха и гуся.

Таблица 3. РТГА с формалинизированными эритроцитами

Сыворотка Антиген Обратный титр сыворотки в РТГА с эритроцитами

Макака-резус Морская свинка Лошадь Баран Петух Гусь

Референс-сыворотка №1 (СЦ ВОЗ, Атланта) референс-антиген (Атланта) 10240 10240 5120 5120 10240 10240

чайка 10240 10240 10240 10240 10240 5120

Тыва3 10240 10240 10240 5120 10240 5120

Н5Ю" 10240 2560 5120 2560 10240 5120

Референс-сыворотка №2 ■ (СЦ ВОЗ, Мемфис) референс-антиген (Атланта) 10240 5120 5120 5120 10240 10240

чайка4 5120 1280 10240 5120 1280 2560

Тыва5 5120 2560 10240 2560 1280 5120

Н5Ш" 10240 2560 5120 1280 10240 2560

Н5Ш1 референс-антиген (Атланта) 320 <40 160 80 80 160

- 4 чайка 160 40 160 160 80 160

Тыва5 160 80 320 80 80 160

Н5Ю" 1280 640 1280 320 640 320

Краснодар2 референс-антиген (Атланта) <40 <40 80 <40 <40 <40

чайка4 640 80 640 320 160 640

Тыва5 5120 1280 2560 2560 1280 1280

Н5Ю6 1280 640 1280 160 1280 1280

TывaJ референс-антиген (Атланта) <40 <40 <40 <40 <40 <40

чайка4 640 <40 640 160 80 640

Тыва 5120 2560 2560 2560 1280 2560

шга" 640 160 320 <40 80 160

Моноклон (СЦ ВОЗ Атланта) референс-антиген (Атланта) 16384 512 16384 2048 512 1024

чайка4 2048 н.д. 2048 512 512 1024

Тыва5 4096 н.д. 8192 1024 1024 4096

Н5Ю6 2048 н.д. 8192 2048 2048 1024

1 - Антисыворотка к вирусу гриппа А/Апазр1а1угЬупсЬо5/СЬапуЬак;е/9/03 (Н5ЫЗ).

2 - Антисыворотка к вирусу гриппа А/СЫскеп/Кгазпо<1аг/06 (Н5Ы1).

3 - Антисыворотка к вирусу гриппа А/с1иск/Тиуа/01/06 (Н5Ы1).

4 — Высокопатогенный штамм вируса гриппа А/Соттог^иП/СИапу/2006 (Н5М1).

5 -Высокопатогенный штамм вируса гриппа A/duck/Tuva/01/06 (Н5Ш).

6 - Апатогенный штамм вируса гриппа А/Апа5р!а1угЬупсЬоз/СЬапуЬаке/9/03 (Н5№).

Выявление маркеров вируса гриппа птиц в сыворотках крови жителей Западной Сибири

С августа 2005 по апрель 2009 г. было собрано 2282 образца сыворотки крови от жителей разных регионов России, различающихся по уровню риска заражения гриппом птиц A(H5N1). Из них 33 образца собраны в августе 2005 г. у жителей с. Суздалка (Доволенский район, Новосибирская область), где впервые в России от домашней птицы был выделен высокопатогенный вирус гриппа A(H5N1). Все образцы были получены от хозяев подворий, где погибла домашняя птица. 1880 образцов получены от жителей I районов Новосибирской области, в которых были зафиксированы вспышки заболевания птиц, вызванные вирусом A(H5N1). 262 образца получено от жителей Ханты-Мансийского автономного округа (ХМАО), где не было случаев выделения вируса гриппа птиц A(H5N1), но жители которого традиционно занимаются охотой и поэтому могут быть отнесены к группе риска. 51 образец был получен от работников птицефабрики в г. Ростов-на-Дону, где была вспышка гриппа у птиц в ноябре 2007 г. В отношении к вирусу A(H5N1) все исследованные сыворотки, собранные в 2005-2007 гг., оказались отрицательными.

При анализе сывороток, собранных на территории ХМАО в 2008 г., у пяти жителей г. Когалым и четырех жителей п. Новоаганск были обнаружены антитела к вирусу гриппа A(H5N1).

Таблица 4. Серологическое исследование сывороток жителей Доволенского района Новосибирской области и Ханты-Мансийского автономного округа

РТГА

Шифр Дата забора крови1 Антиген Антиген мн

сыворотки Н5Шчайка2, Н5Шчайка\ с

ф.э.3 макаки- ф.э.3 лошади ШШчайка1

резус

Е 24.02.2009 80 160 <20

Я 19.03.2009 80 160 <20

в 16.03.2009 160 160 40

Н 16.03.2009 160 320 <20

I 17.03.2009 160 320 320

] 18.03.2009 80 160 <20

К 19.03.2009 160 160 40

ь 20.03.2009 160 160 40

м 23.03.2009 320 320 <20

N 23.03.2009 160 160 20

О 23.03.2009 320 320 320

р 25.03.2009 80 160 < 20

25.03.2009 160 160 <20

я 19.03.2009 160 160 80

8 24.02.2009 80 160 <20

Т 24.02.2009 160 160 40

и 27.01.09 80 160 <20

V 02.03.2009 80 160 <20

19.03.2009 160 160 80

X 22.02.2009 80 160 <20

У 24.02.2009 160 160 40

Референс-сыворотка 10240 10240 1280

1 - Все сыворотки парные, с интервалом 7 дней. Указана дата первого забора крови. Титры сывороток в паре различались не более чем в 2 раза. Указан меньший титр. ^ - Высокопатогенный штамм вируса гриппаЛ/Соттог^иП/СИапу/Об (Н5Ш) (клада 2.2). " - Формалннизированные эритроциты.

Для подтверждения результатов были получены повторные образцы крови от жителей г. Когалым (в г. Новоаганск сыворотки собрать не удалось), а также от лиц из их ближайшего окружения, и собран эпидемиологический анамнез. Из 9 человек семь оказались серопозитивными в отношении вируса гриппа А(Н5М1) (результаты не показаны).

В сезоне 2008-2009 гг. сбор и анализ сывороток был продолжен. В результате анализа были обнаружены положительные сыворотки в отношении вируса гриппа А(Н5Ш) у двух жителей Доволенского района Новосибирской области и у 19 жителей ХМАО. Результаты представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, не все сыворотки, взаимодействовавшие в РТГА с антигеном Н5, тестировались методом микронейтрализации как положительные. Не исключена возможность, что в РТГА мы иногда получали ложноположительные результаты. Но даже если принять последнее предположение, часть сывороток оказались положительными как в РТГА, так и в МН (выделены бежевым и голубым цветом), что по рекомендациям ВОЗ достаточно для доказательства наличия антител к вирусу гриппа A(H5N1) в сыворотках крови людей (Katz, et al., 1999).

Таким образом, нами впервые получены данные о наличии специфических антител к вирусу гриппа птиц серотипа A(H5N1) в сыворотках крови людей на территории России. Все положительные сыворотки получены от пациентов, в анамнезе которых не было заболевания высокопатогенным вирусом гриппа птиц A(H5N1) или контакта с погибшей домашней птицей.

Обследование свиней в эпизоотических по вирусу A(H5N1) районах Новосибирской области

Известно, что свиньи чувствительны как к вирусам гриппа птиц, так и к вирусам гриппа человека, и могут сыграть решающую роль в появлении реассортантных штаммов с пандемическим и эпидемическим потенциалом (Webster et al., 1992). Поэтому необходимо обследовать свиней в местах эпизоотий, вызванных вирусами гриппа птиц, чтобы вовремя выявить новые варианты вируса.

С этой целью было проведено обследование свиней в эпизоотических по вирусу A(H5N1) районах Новосибирской области. Образцы собирали от свиней с подворий в селах Доволенского и Купинского районов, где в 2005-2006 гг. был зафиксирован падеж домашней птицы от вируса гриппа A(H5N1). Кроме того, носовые смывы были собраны от животных свиноводческого комплекса поселка Красный Яр Ордынского района, находящегося вблизи от эпицентра вспышки гриппа A(H5N1) в 2005 г. (табл. 5). Смывы были получены, транспортированы и исследованы согласно рекомендациям ВОЗ. Материал от каждого животного вводили в аллантоисную полость 9-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), инкубировали 3 суток при 35°С, затем собирали аллантоисную жидкость. В реакции гемагглютинации определяли наличие вируса гриппа в аллантоисной жидкости и снова инокулировали в РКЭ. Материал от каждого животного пассировали в РКЭ трижды.

Во всех экспериментах куриные эмбрионы оставались живыми в течение трех суток инкубации, реакция гемагглютинации с аллантоисной жидкостью была отрицательная на протяжении трех пассажей. Ни в одном случае вирус гриппа обнаружен не был. Таким образом, наши данные показывают, что в местах эпизоотий, вызванных в 2005-2006 гг. вирусом гриппа птиц А(Н5М1), не было заболевания свиней.

Таблица 5. Обследование свиней на наличие в носовых смывах вируса гриппа А(Н5Ш)

Место сбора Доволеиский район КупинскиП район Ордынский район

Подворья с. Ильинка Подворья с. Баклуши Подворья с. Васильевка Подворья с. Копкуль Свиноводческий комплекс пос. Красный Яр

Количество образцов 10 12 10 6 300

молекулярно-эпидемиологическая характеристика вирусов гриппа, циркулировавших iia юге западной сибири в 2008-2009 гг.

В сезоне 2008-2009 гг. было исследовано 149 образцов (мазки из зева), собранных в феврале-марте 2009 г. в двух районах Новосибирской области, неблагополучных по гриппу птиц - Доволенском и Здвинском, а также Новосибирском сельском и г. Новосибирске. В культуре клеток MDCK было выделено 17 штаммов вируса гриппа, в том числе девять - вируса гриппа A(H1N1), пять - вируса гриппа A(H3N2) и три - вируса гриппа В.

Получены нуклеотидные последовательности генов гемагглютинина и нейраминидазы всех выделенных штаммов. Мы нашли, что гомология с вакцинными штаммами по генам НА и NA составила 98,2-99,9 %. Почти все нуклеотидные замены привели к заменам аминокислот: гомология белков 96,5-99,6 %. I.A.Wilson и N.J.Сох полагают (Wilson, Сох, 1990), что эпидемически важные дрейфовые варианты обычно имеют четыре или более аминокислотные замены, расположенные в двух или более антигенных сайтах на субъединице НА1. Среди вирусов A(H1N1), циркулировавших на юге Западной Сибири, нами выявлено три штамма (A/Novosibirsk/2/2009, A/Novosibirsk/4/2009, A/Novosibirsk/7/2009), которые имели четыре аминокислотные замены в антигенных сайтах Ca, Cb и Sb. У штаммов A(H3N2) мы обнаружили 2 замены в антигенных сайтах гемагглютинина: P194L в сайте В и K174Q в сайте Е.

По нуклеотидным последовательностям НА были построены деревья, представленные на рис. 2, 3. Филогенетический анализ продемонстрировал, что все

выделенные штаммы вируса А(НШ1), кроме А/Моуо81Ыгзк/653/2009, как по гемагглютинину, так и по нейраминидазе относились к кладе 2В, объединяющей А/Вп5Ьапе/59У2007-подобные штаммы. Штамм А/ЫоУО51Ыг5к/653/2009 вошел в кладу 2С.

A/Netherlands/345/2007 A/Thailand/56/2008 AWashingtOftTOa/2008

— ♦ A/Novos ibîrs k/7/2009

♦ A/Novoelbira k/8/2009 & I I-+ A/No\oslbirak/4/2009

-♦ AfNovosibirsk/2/2009

A/Nebraska/07/2008 A/North Dako(<rt>1/2008 — + A/Novoslbir5k/1062/2Q0Ö 57 r- A/Sydf>eyi7/2008 51 fl— A/PertW4e/2008

I-A/New CaledoniaW2008

I A/Johannesburg/279/2008

-♦ A/Novo$ibirek/151/2009

-♦ A/Nows ibirs k/3/2009

Clade 2B

661-♦ A/Novosiblrslc/716/2009

• AJScotiafxVS/2007

__A/Harail/20/2007

781-A/Ta»wan/0258/2008

*2L VA/Brisbane/58/2007

- ♦ A/Novosibirak/653/2009

- A/Cambodi а/502/2007

- A/Oregon/06/2007 - A/Massachusetts/01/2008

- A/Missouri/0&2008

- A/Califomi a/07/2008

Clade 2C

A/New Jereey/09/2007 I A/Solomon ls!ands/2/200e

Clade 2A

-A/South Dakota/03

A/New Caledonia/20/99

Рис. 3. (справа) Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 н.о.) вирусов гриппа А(НЗ№) (2007-2009 гг.).

Рис. 2. (слева) Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 н.о.) вирусов гриппа А(НШ1) (2007-2009 гг.)

I-и

Hj-A/Pr Щурам

-Г"

S-А/

A/KoreafWRAIR1038Р/200Э ■AMVIMOS BtoeiWIMOM нсмщи^тш A/Hang К01ЧП952Л009 —A/Hong Kongf1985/2009 А№й»ю/5/Ш

I-А/КепуаШПО

ЧМШюИПЮга

—^A/SingapOT/GPMmS I-А/ЕИРМВДШ)

-Ьтяоштж

[— ♦A/Nwsibirs

If—*

и-A/Mta

Фаммймшоп

♦ А№гаЬпкЛ21Ш9

тхмет ■НСЯтМПШОВ A/Wasl»rgtoni15ß009

:A/№rtiCaroünalOra« I—«AtoBmRAIR1562Pffl09 ^.♦А/ШоЛЫЯШВ

I-me» iMiim

-A/Halaysia/19S78292008 -A/Bnsbane/24/2008

-A/Malaysa/19GMY2008

S7i-ша/я/пипип

-7А/ВЫпП0в007

I-A/WsconsW67/2005

100L

Perth/16 Me

Brisbane/10 clade

Все штаммы А(НЗШ) по обоим поверхностным гликопротеинам были вариантами эталона А/Вп5Ьапе/10/2007(НЗ№) и вошли в кладу ВпБЬапе/Ю (филогенетические деревья ЫА не показаны).

Таким образом, эпидемия гриппа на юге Западной Сибири в феврале-апреле 2009 г. была обусловлена циркуляцией двух серотипов вируса гриппа A - A(H1N1) и A(H3N2) и вируса гриппа В (линия Виктория). Все штаммы A/H3N2 были вариантами эталона А/Brisbane/ 10/2007(H3N2), штаммы вируса A/H1N1 были близки эталону A/Brisbane/59/2007(HlNl). Представленные данные согласуются с результатами, полученными в других регионах, и иллюстрируют обычный антигенный дрейф гемагглютинина вируса гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в сезоне 2008-2009 гг. на юге Западной Сибири.

Чувствительность штаммов вируса гриппа, циркулировавших в Западной Сибири в 2008-2009 гг., к противовирусным препаратам

Сезонные штаммы вируса гриппа, выделенные на территории Западной Сибири в эпидемическом сезоне 2008-2009 гг., были исследованы в культуре клеток на чувствительность к противогриппозным препаратам. В работе были использованы препараты арбидол (серии 2188 и 2189, «Фармстандарт», Россия), солянокислый ремантадин («Адамантан», Россия), как референс-препарат использован рибавирин (ЗАО «Вертекс», Россия), характеризующийся высокой этиотропной активностью.

По итогам МТТ-теста ЦД50 (50 %-ная цитопатическая доза) для арбидола составила 40мкг/мл, для ремантадина- 60 мкг/мл и для виразола (рибавирина)- 100 мкг/мл. Репродукция референс-штамма вируса гриппа A/NewCaledonia/20/1999 в культуре клеток MDCK эффективно ингибировалась всеми препаратами, следовательно, соединения находились в рабочем состоянии и проявляли противовирусную активность. Эффективным подавлением вирусопродукции считали ингибирование на 50 % и выше. Принимая супрессию вирусопродукции на 50 % за нижнюю границу нормы, а подавление на 100 %-за верхнюю, можно отметить дискретный характер распределения штаммов по чувствительности к этиотропным препаратам (табл. 6).

При использовании препарата арбидол было показано, что из пяти исследованных штаммов вируса A(H3N2) два проявили минимальную чувствительность, а штамм A/Koltsovo/31/2009 A(H3N2) оказался резистентным к действию арбидола, даже высокие концентрации препарата (15 мкг/мл) не подавляли репродукцию вируса на 50 %. Ранее о выявлении природных изолятов, резистентных к арбидолу, известно не было, сообщалось только о полученных в лаборатории устойчивых штаммах (Leneva, et al., 2009). Арбидол как противогриппозный препарат наиболее эффективен в отношении всех изученных нами

штаммов вируса гриппа В- В/ЫоуозПигек/1270/2009, В/гсМп5к/50/2009 и ъ/гдтютыгт. Степень ингибирования их вирусопродукции максимальна и приближается к 100 %.

Таблица б. Чувствительность штаммов вируса гриппа к химиопрепаратам в культуре клеток МОСК

Штамм вируса гриппа Тин /субтип вируса гриппа Виразол (10 мкг/мл) Ремантадин (5 мкг/мл) Арбидол (10 мкг/мл)

A/New Caledonia/20/1999 референс-штамм А(НШ1) ++ ++ ++

A/Novosibirsk/15/2009 А(Н1Ш) + - ++

A/Novosibirsk/1062/2009 А(НШ1) + + +

A/Novosibirsk/151/2009 А(НШ1) ++ +++ +

A/Novosibirsk/653/2009 А(НШ1) ++ - +

A/Zdvinsk/3/2009 А(НШ1) ++ ++ ++

A/Zdvinsk/7/2009 А(Н1Ы1) +++ +++ +++

A/Zdvinsk/2/2009 А(НШ1) ++ +-Н- +++

A/Zdvinsk/4/2009 А(Н1Ш) +++ ++ +++

A/Novosibirsk/1211/2009 А(НЗК2) +++ - +

A/Novosibirsk/319/2009 А(НЗ№) +++ +++ -Н-+

A/Novosibirsk/628/2009 А(НЗЫ2) ++ - ++

A/Novosibirsk/707/2009 А(НЗЫ2) ++ - +

A/Koltsovo/31/2009 А(НЗ№) +-Н- - -

B/Novosibirsk/1270/2009 В -Н-+ н/и +++

B/Zdvinsk/50/2009 В +++ н/и +++

B/Zdvinsk/36/2009 В +++ н/и +++

(н/и) - не исследовали;.

(+++)- высокая чувствительность к препарату. Максимальное подавление (90-100%) вирусопродукции при множественности заражения 0,0001-0,001 ТЦИД50 (50 %-ная инфекционная доза для культуры клеток);

(++) - средняя степень чувствительности к действию препарата. Подавление вирусопродукции на 60-90 % при множественности заражения 0,0001-0,001 ТЦИД5о на клетку;

(+)- пониженная чувствительность к действию препарата. Подавление вирусопродукции - 5060 % при множественности заражения 0,0001-0,001 ТЦИД5о на клетку; (-) - резистентный к действию препарата штамм вируса гриппа.

Среди вирусов гриппа А(Н1Ы1) не выявлено штаммов, резистентных к арбидолу, но по степени чувствительности можно выделить две группы: для штаммов А/Ыоуо81Ыг5к/1062/2009, А/Ыоуоз1Ыг5к/151/2009, А/Ыоуоз1Ыг5к/653/2009 показана степень ингибирования вирусопродукции, незначительно превышающая 50%, а подавление штаммов АЛАтп&ЛИт, А/2сЫп5к/2/2009 и А/2сЫп8к/4/2009 близко к 100 %.

Противовирусное действие ремантадина исследовали только в отношении вирусов гриппа А, т. к. вирусы гриппа В к нему устойчивы, что связано со структурой белка М2. Для исследованных штаммов вируса гриппа А показана Крайне низкая чувствительность к действию ремантадина. Для штаммов вируса гриппа А(НЗШ): А/ЫоуозМгзкЛ 211/2009, А/КоИзоуо/З 1/2009, АЖоУоз1Ь1г5к/628/2009, А/Моуоз1Ыг5к/707/2009 и штаммов вируса гриппа А(НШ1): А/Ыоуоз1Ыгзк/653/2009, А/ЫоуозМгекЛ 5/2009 ингибирование вирусопродукции не достигало 50 %. Вирусопродукция штамма АЖоуоз1Ыгзк/15/2009(НШ1) эффективно ингибировалась только повышенной концентрацией препарата (15 мкг/мл).

Таким образом, выделенные в эпидемическом сезоне 2008-2009 гг. штаммы вируса гриппа были чувствительны к действию арбидола (за единственным исключением - штамм А/КоКэоуо/З 1/2009(НЗЫ2) и в подавляющем большинстве резистентны к ремантадину.

Пандемический период по гриппу А(Н1Ш)ром09 (июнь 2009 - август 2010 гг.)

В России первый случай заболевания, вызванного пандемическим вирусом гриппа А(НШ1)рс1т09, был зарегистрирован 18 мая 2009 г. у туриста, вернувшегося из США. Вирус быстро распространился по территории Российской Федерации, и уже в июле появились лабораторно подтвержденные случаи заболевания людей в Екатеринбурге, Томске, Барнауле и во Владивостоке. В начале пандемии вирус определяли у людей, вернувшихся из-за границы, а также у лиц, находившихся с ними в тесном контакте. Позднее вирус пандемического гриппа начал поражать лиц, которые непосредственно не контактировали с вернувшимися из-за границы людьми. Начиная с этого времени появились больные с тяжелым течением гриппозной инфекции. Первые летальные случаи были зарегистрированы в Читинской и граничащей с ней Амурской областях, в октябре-ноябре 2009 г. наибольший подъем заболеваемости, вызванной пандемическим гриппом, был зафиксирован в Амурской области (Грипп: эпидемиология ..., 2012).

Исследование популяционного иммунитета к гриппу в Азиатской части России в 2010 гг.

Было исследовано 3566 сывороток крови, собранных случайной выборкой на

Дальнем Востоке, в Восточной и Западной Сибири в марте 2010 г. Это позволило

приблизительно оценить число людей, контактировавших с пандемическим вирусом

гриппа в период между июнем 2009 и мартом 2010 гг. Сыворотки были получены от людей

разных возрастных групп: до 30 лет, 31-55 лет, 56 лет и старше. Всего было собрано 1520 сывороток на Дальнем Востоке, 1022 сыворотки - в Восточной Сибири и 1018 сывороток -в Западной Сибири.

Для оценки предсуществующих перекрестно-реагирующих антител к вирусу гриппа А(Н1Ы1)рёт09 были проанализированы 792 сыворотки крови людей, собранные до начала пандемии: с октября 2008 по март 2009 г. Нами было показано, что с пандемическим вирусом гриппа в РТГА взаимодействовали (6,2 ±4,1) % сывороток, собранных в этот

Рис. 4. Количество (%) положительных сывороток крови к пандемическому и сезонным вирусам гриппа в марте 2009 г. и марте 2010 г. в Восточной и Западной Сибири и на Дальнем Востоке.

Как видно из рис. 4, в марте 2010 г. процент специфичных в отношении пандемического вируса сывороток оказался уже выше: (11,2 ± 1,6) %, (12,8 ± 2,0) % и (29,5 ± 3,4) % в Западной. Восточной Сибири и на Дальнем Востоке соответственно. Так как сбор образцов крови в каждом регионе проводился в условиях репрезентативной выборки, рекомендованной ВОЗ (не менее 600 образцов из каждого региона, равное представительство половых и возрастных групп) (ВОЗ, 1972, № 454), то полученные данные возможно применить к региону в целом. Таким образом, прирост положительных к пандемическому вирусу гриппа образцов по сравнению с фоновым значением предпандемического периода составил (5,0 ± 4,3) %, (6,6 ± 4,5) % и (23,3 ± 5,2) % в Западной, Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, соответственно. Возрастание количества положительных сывороток можно объяснить только недавней инфекцией вирусом (в острой или скрытой форме), потому что осенью 2009 г. пандемический вирус гриппа еще не был включен в состав трехвалентной вакцины.

Первая вспышка пандемического гриппа с летальным исходом в Азиатской части России была зарегистрирована в Амурской области в ноябре 2009 г.

период (рис. 4).

■ А(е-1М1)рст05

■ Сезонный Н1М1

■ НЗМ2

Западная Затаднан Зэсточнан Дальний Сибирь март Сибиэыларт Сибирь V.: р т Восюкмарт 2009 2310 2010 2010

Этиология заболевания выявлена на основании данных ПЦР-анализа. Во время вспышки мы выделили несколько штаммов вируса гриппа А(НШ1)рс1т09 и определили нуклеотидную последовательность всего генома штамма А/В1а§оуес11еп5к/01/2009 (табл. 8).

За январь-февраль 2010 г. мы собрали и проанализировали 574 сыворотки крови от жителей Амурской области (табл. 7), болевших острыми респираторными заболеваниями в предыдущие два-три месяца.

Таблица 7. Количество (процент) положительных сывороток крови среди образцов, собранных в Амурской области в январе-феврале 2010 г.

Возраст пациентов Количество проанализированных сывороток Количество положительных сывороток к вирусу А(Н1М)Рат09 Количество положительных сывороток к вирусу сезонного гриппа А(НШ1) Количество положительных сывороток вирусу сезонного гриппа А(НЗШ)

до 1В 75 47 (62,7 %) 49 (65 %) 26 (34,7 %)+

18-30 221 98 (44,3 %)* 72 (32,6 %)* 59 (26,7 %)

3(М15 166 37 (22,3 %)* 72 (43,4 %)* 50(30,19%)

45-60 112 19(17%)* 34 (30,3 %)* 36(32,1 %)

Всего 574 201 (35 %) 227 (39,5 %) 172 (29,8 %)

* - достоверность различий в сравнении с группой лиц в возрасте до 18 лет, имеющих антитела против пандемического или сезонного вируса гриппа, р < 0,001; | - достоверность различий в сравнении с возрастной группой людей до 18 лет, имеющих антитела к сезонному вирусу гриппа А (НШ1), р < 0,001.

Мы обнаружили антитела к А(НШ1)рс1т09 в 201 из 574 образцов сыворотки крови (35 %). Половина серопозитивных [(48,9 ± 3,8) %] были люди в возрасте до 30 лет (выделено желтым и зеленым цветом), некоторые из которых имели очень высокие титры антител (160 или выше). Только у (20,1 ± 2,6) % людей старше 30 лет были обнаружены антитела к пандемическому штамму вируса гриппа. Антитела к сезонным штаммам вируса гриппа А(НШ1) и А(НЗШ) были обнаружены в (39,5 ± 2,9) % и (29,8 ± 3,1) % пациентов соответственно. Кроме того мы нашли значительный процент сывороток с высокими титрами антител к сезонному гриппу А(НШ1) в возрастной группе до 18 лет (р <0,001) (табл. 7).

Данные рис. 4 и табл. 7 отличаются принципиально, т. к. сбор сывороток был проведен различными методами. Образцы крови для исследования антител к серотипам вируса гриппа А в Западной и Восточной Сибири и на Дальнем Востоке (рис. 4) были

получены путем случайной выборки. Сыворотки из Амурской области (табл. 7) были собраны сразу после вспышки от людей, имевших в анамнезе острое респираторное заболевание в течение предыдущих двух-трех месяцев.

Выделение пандемического вируса гриппа из клинического и секционного материала

Из 238 клинических образцов и секционного материала, собранных в Восточной и Западной Сибири и на Дальнем Востоке в 2009-2010 гг., было выделено 56 штаммов вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, у всех исследованы антигенные свойства, для 11 штаммов получены нуклеотидные последовательности полного генома и для двух штаммов, выделенных в п. Кольцово, последовательности генов НА и ЫА. В РТГА с использованием набора специфических хорьковых постинфекционных сывороток (СЦ ВОЗ, Атланта, США) все выделенные штаммы по антигенным свойствам не отличались от вакцинного штамма А/СаПГогша/07/2009 (данные не приведены). Аминокислотные замены в белках пандемических штаммов представлены в табл. 8-12.

Таблица 8. Аминокислотные замены в НА штаммов пандемического вируса гриппа

Штамм вируса гриппа СспЬапк (НА) НА

А/СаМГогша/04/2009 Р (83) в (128) Т (197) в (203) Са1 К (209) Г О 1 (222) N (293) I (304) I (493)

А/Вагпаи1/04/2009 ОШ92889 Б А Т Б V

А/В1айОУесЬепзк/01/2009 НМ173599 Б А т V т

А/Кагазик/01/2010 ОШ62458 Б Р А т О V

А/Маг>ас1ап/02/2009 04592905 Б А т

А/Моуоз1Ыг5к/02/2009 011433033 в А т V

А/Ошзк/02/2009 ОШ11235 в А т V

А/Топи1с/03/2009 ви433025 Э А т О V

А/Тотзк/02/2009 сиг 11243 Б А т V

А/Тот$к/05/2009 011560008 Э Р А Т V

А/Тогшк/06/2009 011560016 Б Р А т V

А/У1асНуо8Юк/01/2009 011211219 Б А Е V

А/КоНэоуо/ОЗ/гООЭ н/д* Б А т

А/Кй1ькж>/05/2009 н/д Б А Н V

Как видно из табл. 8-12, наибольшее количество аминокислотных замен отмечалось в гемагглютинине (НА) и полимеразном белке РВ1. Три аминокислотные замены в НА (Р838, 8203Т, 1304V), обнаруженные у исследованных штаммов, часто встречались у поздних вариантов пандемического вируса гриппа, выделенных в различных странах мира, начиная С осени 2009 г. Замена 1493Т была уникальной для штамма А/В 1а£ОУесЬеп5к/01 /2009.

Таблица 9. Аминокислотные замены в ЫА и N8 штаммов пандемического вируса гриппа

Штамм вируса гриппа вепЬапк (НА) ИА ОепЬапк (ЫЭ) N81

А/СаПГогша/04/2009 V (80) V (106) V (116) N (248) Т (452) 1* (78) I (123) Е (159)

А/Ватаи1/04/2009 011592891 1 О N ви592893 К V

А/ШавоуесИепзк/ОШО 09 НМ173601 I 0 НМ173603 V

А/Каггцшк/ОШОЮ ви562460 I Э 011562462

А/Майас1ап/02/2009 011592907 I Б ви592909 К V

А/КоуовМгек/ОгЯООЭ ви433035 I О 011433037 V

А/От5к/02/2009 ви211237 I О 011211239 V

А/Тош8к/03/2009 011433027 I 0 ОШ33029

А/Тотзк/02/2009 виг 11245 виг 11247 V

А/Тотзк/05/2009 ОШбООЮ I О 611560012 V в

А/ТотБк/06/2009 ОШбОО18 0 Си560020 V в

АЛ/1а<1геО5(:ок/01/2009 сиг 11221 М I виг! 1223

А/КоИвйУо/ОЗДООЭ н/д ,1 О

А/Ко1йоуо/05/2009 н/д л Э

Таблн ца 10. Аминокислотные замены в РА и М штаммов пандемического вируса гриппа

Штамм вируса гриппа СепЬапк (РА) РА СепЬапк (М) М1 М2

А/СаШгша/04/2009 Р (224) И (269) Е (298) с (59) И (88)

А/Вагпаи1/04/2009 011592894 Э 0и592890

А/В^оуесЬепзк/01/2009 НМ 173 604 Э НМ 173600

А/Кагагик/О1/2010 04562463 э Ои562459

А/Мавас1ап/02/2009 011592910 в К К 0и592906

А/ЫоуО51Ыг5к/02/2009 04433038 Б 011433034

А/ОтБк/02/2009 ОШ11240 в виг 11236

А/Тотзк/03/2009 04433030 Б 0и433026

А/Тогшк/02/2009 вт 11248 Э виг 11244 А

АУТотзк/05/2009 ОШбООВ Б 0и560009

А/Тот5к/06/2009 011560021 в 04560017

АЛ/ЬсНуозЮк/01/2009 ОШ 11224 04211220 N

Таблица 11. Аминокислотные замены в РВ2А и № штаммов пандемического вируса гриппа

Штамм вируса гриппа СепЬапк (РВ2) РВ2 СепЬапк (N10

А/СаИГогша/04/2009 N V К Т Т V

(102) (109) (340) (471) (588) (100)

А/Вагпаи1/04/2009 04592896 Б I 011592892 I

А/ШайСИгесЬегек/01/2009 НМ173606 О НМ 173602 I

А/КагаБик/01 /2010 04562465 N М 011562461 I

А/Ма§ас1ап/02/2009 011592912 N 01)592908 I

А/Ыоуо51Ыгзк/02/2009 й4433040 N ОШЗЗОЗб I

АЮш8к/02/2009 04211242 011211238 I

АЯот5к/03/2009 0и433032 М 04433028 I

А/Тош5к/02/2009 виг 11250 м ОШ 11246 I

АЯошБк/05/2009 0и560015 Р I 011560011 I

А/Тот5к/06/2009 ОШ60023 И 1 0и560019 I

А/УЫ^ОБЮк/ОШООЭ ОШ 11226 М ОШ 11222 V

Таблица 12. Аминокислотные замены в РВ1 штаммов пандемического вируса гриппа

Штамм вируса гриппа Genbank (PB1) PB1

A/California/04/2009 К E К S T S H К

(237) (256) (353) (384) (566) (633) (649) (698)

A/Barnaul/04/2009 GU592895 R

A/Blagovechensk/01/2009 HM173605 D

A/Karasuk/01/2010 GU562464

A/Magadan/02/2009 GU592911 R

A/Novosibirsk/02/2009 GU433039

A/Omsk/02/2009 GU211241

A/Tomsk/03/2009 GU433031

A/Tomsk/02/2009 GU211249

A/Tomsk/05/2009 GU560014

A/Tomsk/06/2009 GU560022 P

A/Vladivostok/O 1/2009 GU211225 R A T O

* н/д - нуклеотидная последовательность гена не была депонирована в GenBank. Бежевым цветом выделены замены в антигеном сайте НА, сиреневым - замена D222G.

В гемагглютинине штамма (A/Karasuk/01/2010) обнаружена замена аспарагиновой

кислоты в 222 положении на глицин (D222G). Штамм был выделен из секционного материала (фрагмент легкого). Данный образец был получен в конце декабря 2009 г. от женщины 1952 года рождения, умершей от гриппа. Эта мутация часто ассоциируется с тяжелым течением болезни (Miller, et al., 2010; Antón, et al., 2010). Однако такая же мутация обнаружена нами в НА штамма A/Vladivostok/O l/2009pdm09, выделенного в июле 2009 г. В том случае заболевание закончилось полным выздоровлением.

Подобно референс-штамму A/California/04/09 (HlNl)pdm09 NA выделенных штаммов не содержала характерных мутаций (Е-119, Н-275, R-293, N-295), обусловливающих резистентность вируса к ингибиторам нейраминидазы (озельтамивир -«Тамифлю», занамивир - «Реленза»). У всех штаммов в М2-белке из мутаций, характерных для ремантадин-устойчивых вариантов вируса (L26, V27, А30, S31, G34), присутствовала одна - S31N (поскольку эта мутация содержится в белке референс-штамма, она не отмечена в табл. 10), т. е. серин замещен аргинином, что свидетельствовало о резистентности всех штаммов к препаратам адамантанового ряда.

В отношении другого противогриппозного средства - арбидола - анализ аминокислотной последовательности белка НА, точнее его субъединицы НА2, показал, что данные штаммы не имели характерных мутаций: Q27, Q42, К51, К116, обусловливающих резистентность вируса гриппа к арбидолу (Leneva, et al., 2009).

Таким образом, результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что штаммы пандемического вируса гриппа, выделенные в июле-декабре 2009 г. на

территории Азиатской части России, по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям на 99 % и выше идентичны референс-штамму A/California/04/2009. Единичные замены в антигенных сайтах не изменили антигенные характеристики штаммов. По данным серомониторинга в сезоне 2009-2010 гг. в азиатской части России наиболее пострадал от пандемии гриппа Дальневосточный регион, прирост в популяции положительных к пандемическому вирусу гриппа образцов сывороток крови относительно фоновых показателей (6,2 ± 4,1 %) составил (5,0 ± 4,3) %, (6,6 ± 4,5) % и (23,3 ± 5,2) % в Западной, Восточной Сибири и на Дальнем Востоке соответственно. По результатам анализа вспышки пандемического гриппа в Амурской области можно сделать вывод, что болели в основном люди моложе 30 лет.

постпандемический период (2010-2012 ГГ.)

Молекулярно-эпидемиологическое исследование гриппа в п. Кольцове Новосибирской области в 2010-2011 гг.

В сезоне 2010-2011 гг. молекулярно-эпидемиологическое исследование гриппа было нами проведено в п. Кольцово Новосибирской области. Рабочий поселок Кольцово расположен в ближайшем пригороде Новосибирска (менее 5 км от юго-восточной границы города и около 25 км от центра), занимает территорию около 18 км2. В поселке проживает 15,1 тыс. человек с небольшим преобладанием женского населения, в основном за счет старшей возрастной группы. Градообразующим предприятием является Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор». Поселок тесно связан с разными районами областного центра автомобильными дорогами. Около половины жителей поселка учатся или работают в Новосибирске. Таким образом, относительно обособленное расположение Кольцово позволяет проводить самостоятельные мониторинговые работы по молекулярной эпидемиологии гриппа, а близость и тесные связи с мегаполисом делают возможным с высокой вероятностью экстраполировать полученные данные и на г. Новосибирск.

В эпидемическом сезоне 2010-2011 гг. подъем заболеваемости гриппом в п. Кольцово начался с первых дней 2011 г. С 10.01.11 по 31.03.11 было зарегистрировано 1930 случаев гриппа и ОРВИ, на долю детей и подростков до 14 лет пришлось 63,7% заболеваемости (1229 случаев). От пациентов с предварительным диагнозом «грипп» было собрано 118 мазков из зева, из них в культуре клеток MDCK выделено 37 штаммов вируса

гриппа А(НШ1)рс1т09, три штамма вируса гриппа А(НЗ№) и четыре штамма вируса гриппа В. Выделенные штаммы были типированы и субтипированы в реакции торможения гемагглютинации. Данные РТГА были подтверждены методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

Для молекулярно-генетических исследований из 37 выделенных штаммов А(НШ1)рс1т09 было отобрано пять. Анализ антигенных свойств отобранных штаммов представлен в табл. 13.

Таблица 13. Антигенные свойства штаммов вируса А(НШ1)р<іт09

Антиген Референс-сы во ротка

A/California/ 07/09 (HlNl)pdm09 A/Texas/ 77/2009 (HlNl)pdm09 A/South Carolina/2/2010 (HlNl)pdm09 A/England/ 195/2009 (HlNl)pdm09

A/Califoraia/07/09 (HlNl)pdm09 5120 160 1280 160

A/Texas/77/2009 (HlNl)pdm09 320 160 80 160

A/South Carolina/2/2010 (HlNl)pdm09 2560 320 1280 160

A/England/195/2009 (HlNl)pdm09 5120 320 1280 160

A/Koltsovo/01/09 (HlNl)pdm09 5120 640 1280 1280

A/Koltsovo/02/09 (HlNl)pdm09 5120 640 1280 1280

A/Koltsovo/03/09 (HlNl)pdm09 5120 640 1280 2560

A/Koltsovo/04/09 (HlNI)pdm09 5120 640 1280 1280

A/Koltsovo/05/09 (HlNl)pdm09 5120 640 1280 640

A/Novosibirsk/24k/2011 (HlNl)pdm09 2560 160 640 80

A/Novosibirsk/53k/2011 (HlNl)pdm09 2560 160 640 80

A/Novosibirsk/104k/2011 (HlNl)pdm09 2560 160 640 80

A/Novosibirsk/107k/2011 (HlNl)pdm09 2560 160 640 80

A/Novosibirsk/KSh/2011 (HlNl)pdm09 10240 640 640 5120

Как видно из данных табл. 13, штаммы А(НШ1)рс1т09, выделенные в п. Кольцово в январе-марте 2011 г., антигенно родственны вакцинному штамму А/Са1ійігпіа/7/2009 (НШ1) рс!т09, так же как и штаммы, выделенные в предыдущем сезоне, но несколько отличаются по антигенным свойствам от штаммов 2009-2010 гг., что обусловлено антигенным дрейфом вируса.

Молекулярно-генетические исследования штаммов, выделенных в 2011 г. (в п. Кольцово, п. Довольное и г. Томске, см. ниже), подтвердили, что исследованные штаммы близки вакцинному штамму А/СаШогпіа/7/2009 (НШ1)рс1ш09, несмотря на ряд

Таблица 14. Аминокислотные замены в гемагглютинине штаммов вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, выделенных в Западной Сибири в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг.

Штамм вируса гриппа № GenBank 16 70 Cb 8 3 9 7 1 4 3 185 Sb 1 9 7 203 Ca 1 21 1 21 5 23 5 С al 31 6 32 1 37 4 451 4 5 8

A/California/ 07/2009 V L P D S S A S К A E т I Е S К

A/Novosibirsk/2 4k/2011 CY103845 S G T T T V К N R

A/Novosibirsk/5 3k/2011 CY103847 s G T T T К V К N

A/Novosibirsk/8 9d/2011 CY103841 I s G T T T К V К N

A/Novosibirsk/1 04k/2011 CY103849 s G T T T V к N

A/Novosibirsk/1 05d/2011 CY103843 s G T T T V к N

A/Novosibirsk/1 07k/2011 CY103851 s G T T T V к N

A/Novosibirsk/ KSh/2011 JQ041354 F s G T T T N E V к N

A/Torask/18/ 2011 CY103853 s G T T T V к N R

A/Tomsk/29/ 2011 CY103855 s N G T T T К А V к N

Таблица 15. Аминокислотные замены в нейраминидазе штаммов вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, выделенных в Западной Сибири в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг.

Штамм вируса гриппа № GenBank 29 36 44 51 71 75 106 241 248 343 369 451 458

A/California/ 07/2009 I H N Q N A V V N A N S К

A/Novosibirsk/ 24k/2011 CY103846 S V I I D К N R

А/Novosibirsk/ 53k/2011 CY103848 s I I D К N

А/Novosibirsk/ 89d/2011 CY103842 Y s I I D к N

A/Novosibirsk/ 104k/2011 CY103850 s I I D к N

A/Novosibirsk/ 105d/2011 CY103844 s К I I D к N

A/Novosibirsk/ 107k/2011 CY103852 s I I D к N

A/Novosibirsk/ KSh/2011 JQ041356 s T I I D к N

A/Tomsk/18/ 2011 CY 103854 T s I I D к N R

A/Tomsk/29/ 2011 CY103856 s I I D V К N

аминокислотных замен в поверхностных белках гемагглютинине и нейраминидазе (табл. 14, 15).

При сравнении аминокислотных последовательностей гемагглютинина было обнаружено 8 замен, характерных для всех исследованных нами штаммов (P83S, S143G, S185T, А197Т, S203T, I321V, Е374К, S451N), замена Е235К встречается у трех штаммов, замена K458R отмечена у двух штаммов, у 6 штаммов присутствует по одной уникальной замене. Некоторые из обнаруженных замен расположены в антигенных сайтах гемагглютинина (Xu et al., 2010) (в табл. 14 выделены бежевым цветом): замены S185T (антигенный сайт Sb) и S203T (Cal) характерны для всех штаммов, замена Е235К (Cal) присутствует в штаммах A/Novosibirsk/53k/2011, A/Novosibirsk/89d/2011 и A/Tomsk/29/2011, замена L70F (Cb) обнаружена в штамме A/Novosibirsk/KSh/2011. У всех проанализированных штаммов обнаружены замены (S143G, S185T, А197Т, S451N), позволяющие отнести их к генетической группе 7 (WHO, 2011). Штаммы, принадлежащие к данной генетической группе, имеют аминокислотные замены в нейраминидазе: V241I, N369K и N44S, что мы также наблюдали во всех проанализированных штаммах, выделенных во время сезона 2010-2011 гг. (табл. 15). Ни у одного штамма не было обнаружено замен, обусловливающих устойчивость к ингибиторам нейраминидазы (озельтамивир, занамивир). По нуклеотидным последовательностям гена НА штаммов, выделенных в 2009 г. и 2011 г., было построено филогенетическое дерево (рис. 5). Оно демонстрирует отсутствие антигенного дрейфа вируса A(H1N1) pdm09 в 2009 г., что связано с очень низким популяционным иммунитетом к новому вирусу.

На деревьях, как построенных нами, так и представленных в научной литературе, все штаммы 2009 г. расположены близко к стволу (Fereidouni et al., 2009), на деревьях не выделяются генетические группы, что объясняется с высокой степенью подобия циркулировавших в 2009 г. вирусов вакцинному штамму A/California/07/2009 (H1N1) pdm09.

В сезоне 2010-2011 гг. начался антигенный дрейф вируса A(H1N1) pdm09, что отразилось на филогенетическом дереве НА появлением генетических групп, достоверно удаленных от ствола. Все выделенные нами штаммы были сходны по строению поверхностных белков, поэтому на деревьях располагаются в одной генетической группе.

4 А/Ыою*Шпк/89с1/2011 о»1Ыг»к/вЭк/2011

|«к/га/2011 ♦ А/Иочо»1Ыг»к/24к/2011 901 ♦ Д/Топ>» к/1 В/2011 А/Мело» 1Ыг»к/106ДО011 Л/М0*0»1Ы|»к/Ю4к/2011 Л/Но*о»1Ьм*к/107к/2011

к/К ЭК/г011 А/в 1оскИс4т/14/2011 А/Вг1»Ь«>»Г7СУ2011

А/Нопд Колд/3671/2011

Рис. 5. Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 н.о.) штаммов вируса гриппа .А(Н1М1)р(1т09, 20092011 гг.

- А/Е*1от1а'ЗЭв4в/г011 I А/БвтЫ »»СО 2/201 1

- А/МаНа/МУ000235/2011

- А/ыот'яу/в4а/го11

— А/Вг1»Ьота/1(Уг010

- А/ТЬм »«1ол1к 1/10ВШ2О11

— А/У«|1^111/2011 - А/МадасЮТ^ог/гоое

— А/Ноод Коов/Н09&«в7-У10/2009 ¡1 А/Моплу/ЗВЗ 5/2000

А/Сиапдаопд/55'2000 9 А/81пдарога/0№е&г2009 А/1«щ*Пв/Нолд Копд/2в85/2000 » А/От*к/02/200в

- ф А/Тот»к/06/2009 - А/0иап9«1ог>9/302/г01й А/СИНв/01/2000 ► АУКвГМик/01/2010

— А/АлЛшЛ 22^2010

- А/ниаашюсугооо ~~641 ♦ А/Тал» к/0&>2000

А/Вву«^еа'2009 * А/мо«»кж»к/ог/гоое А/НЙ» I пк!/Р13/2000 А/в I оск ГкЯт/ЭЗ/2009

. А/$| пд МХ¥*'СР3205/2ООО _| А/1^пв/ТаКувп/РТ-120*/2009 , ♦ А/Тал « к/02/2000

— + А/Ватаы1/04/2000 I А/РиЧапаюцггООО

- А/Иопд К<жчв/НО0О-77в-У 10/2009

- А/ТГШ1!ап<1/ТНв0419/2009 - + А/Ко« »ОЧО/ОМООв

— А/УакШ»к/СЯ1е-ЕАУ/20Ов

- А/Ушо*1*д/СПЕ-СНМУ/2000

А/МагНа/1/2000 — А/ыоп«ау/1 зза/гоов

-А/В ау «т/в9/2000

" -А/ЭЮНиап/1/2000

-АЛЛаШмо»«с*/01/2000

— А/саикута/од/гооо |(0Л« №07/2000

Результаты анализа антигенных свойств штаммов вируса гриппа А(НЗ№), выделенных в п. Кольцово в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг., и сравнение со штаммами, выделенными в п. Кольцово в 2008-2009 гг., представлены в табл. 16.

Антиген Референс-сыворотка

U rusuav/716/2007 Brisbane/10/2007 A/Perth/16/2009

Uruguay/716/2007 1280 640 <40

Brisbane/10/2007 1280 1280 640

A/Perth/16/2009 <40 <40 640

New York/55/2004 640 320 <20

A/Novosibirsk/31/2009 640 1280 160

A/Novosibirsk/319/2009 1280 1280 320

A/Novosibirsk/76k/2011 <20 <20 640

A/Novosibirsk/1927/2011 <40 <40 640

A/Novosibirsk/1832/2011 <40 <40 1280

Как видно из табл. 16, по антигенным свойствам штаммы A/Novosibirsk/76k/2011, A/Novosibirsk/1832/2011 и A/Novosibirsk/1927/2011 схожи с вакцинным штаммом A/Perth/16/2009 (H3N2). Результаты серологического исследования коррелируют с анализом аминокислотных последовательностей. В первичной структуре белка гемагглютинина исследованных штаммов обнаружены замены, свойственные вакцинному штамму 2009-2011 гг. A/Perth/16/2009 (H3N2) и отличающие его от вакцинного штамма прошлых эпидемических сезонов A/Brisbane/10/2007 (H3N2): Е78К, N160K, K174N, K189Q, N205K, I377R. Кроме того, в структуре гемагглютинина выделенных штаммов обнаружено несколько общих аминокислотных замен, отличающих их от вакцинного штамма A/Perth/16/2009 (Е66К, P178S, S230I, I276M и R277Q у всех штаммов), и несколько уникальных замен: T183I, S416L в штамме A/Novosibirsk/76k/2011 и S140N, I538M в штамме A/Novosibirsk/1927/2011.

По нуклеотидным последовательностям гена НА штаммов вируса гриппа A(H3N2) было построено филогенетическое дерево (рис. 6). При филогенетическом анализе гена гемагглютинина вируса A(H3N2) 2010-2011 гг. выделяют клады A/Perth/16/2009-подобных штаммов (клада Perthl6) и A/Victoria/208/2009-подобных штаммов (Vic 208).

Клада Perth 16 на дереве НЗ характеризуется по пяти заменам аминокислотных остатков в позициях 62, 144, 162, 260 и 261 при сравнении с вакцинным штаммом A/Brisbane/10/2007, четыре из этих мутаций находятся в антигенных сайтах: в сайте А (N144K), сайте В (P162S) и сайте Е (I260M и R261Q). Клада Vic 208 была выделена на основании замены Т212А, локализованной в антигеном сайте С (Dapat, et al., 2012). Выделенные нами в 2011 г. штаммы вируса гриппа A(H3N2) относились к кладе Perthl6.

-л

АЛех as/NHRCOOO1/2011 A/Iowa/19/2010 А/Во» lon/OO А77/2011 — A/Denmerti/21/2011 — A/Califomia/NHRC0003/2011 L A/Mexico Cily/WRAIR3577T/2010 —■ A/On(afio/011 /2011 A/Singapore/GP185/2011

-A/Slockholm/17/2011

-A/BogotaWRAlR3457T/2010

-A/Denma(V105/2010

'91-A/Gu angdon g/94/2011

A/Sir>gapor^GP427{V2010 [— A/MontanaTC5/2011 L A/Sao Paulo/02-2344/2011 A/Ontario/O1 5/2011 A/PiaU/14211/2011

- A/Boston/DOA32/2011

A/England/215/2011 -A/Guangdong/441/2010

-/VAlab am a/05/2010

A/Vicl«1 a/208/2009

A/Nethert and s/034/2010

A/Hong Kong/3969/2011 A/Sing apor а/ККЗвв/2011 A/Stockholm/1 a/2011 VDefun ark/22/2011 -A/Sao PauI(V11 -1800/2011 «agua/5B-11/2011 - A/Slngapore/G P4180/2010 — A/Sydney/DD2-01/2010

- A/B oiton/DO A24/2011 A/Soulh Carolina/NHRC0001 /2011 A/M aseachus ett s/08/2011

-А/ Piaui/8448/2011

A/Keny a/091/2010

-A/Districl of CdumbiaWRAIR030Q/2010

A/Onlarlo/007/2010

A/aslricI of Columbia/WRAIR0301 /2010 Nbi ¡gal a/403/2009

А/В о» ton/DO A71 /2011 A/Vicl orta/210/2009

— A/Nanjing/1654/2010 A/B el grada/W RAIR2379N/2010 AMadi«»lok/11/2010 ♦ A/Nosoei birt k/76K/2011 Novo* ibirsk/1832/2011 A/Naitfng/1655/2010

A/Nanjing/1663/2010 notiblrek/l927/2011 A/Net heriands/063/2011 A/Norway/1186/2011

-A/Shantou/546/2010

A/Niigata/1148/2010 A/Niigata/1147/2010 A/NHgata/1149/2010

Рис. 6.

Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 и.о.) штаммов вируса гриппа А(НЗК2), сезон 2010-2011 гг.

Victoria/208 dade

Perth/16 clade

— А/Вг1зЬапе/10/2007 НА

— A/Uruflimy/716/2007 НА -A/WtiCon«ln/67/2005 НА

Анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа В, выделенных в п. Кольцово в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг., в сравнении со штаммами, выделенными в п. Кольцово в 2008-2009 гг., представлен в табл. 17.

Таблица 17. Антигенные свойства штаммов вируса гриппа В в РТГА с референс-сыворотками и эритроцитами петуха

Антиген Рефе ренс-сыворотка

В/Malaysia /2506/2004 (Vict.lin.) B/Ohio/1/2 005 (Vict.lin.) B/Brisban e/60/2008 (Vict.lin.) B/FIorida/0 4/2006 (Yam.lin.) B/Bangla desh/3333 /2007 (Yam.lin.)

B/Malaysia/2506/2004 (Vict.lin.) 320 640 40 <20 <20

B/Ohio/1/2005 (Vict.lin.) 320 640 40 <20 <20

B/Brisbane/60/2008 (Vict.lin.) 320 1280 640 <20 <20

B/Florida/04/2006 (Yam.lin.) <20 <20 <20 320 40

B/Bangladesh/3333/2007 (Yam.lin.) <20 <20 <20 640 640

B/Novosibirsk/36/2009 160 320 320 <20 <20

B/Novosibirsk/50/2009 640 1280 640 <20 <20

B/Novosibirsk/715/2009 320 640 320 <20 <20

B/Novosibirsk/S 1/2011 20 320 160 <20 <20

B/Novosibirsk/29k/2011 40 160 160 <20 <20

B/Novosibirsk/91 k/2011 20 80 40 <20 <20

B/Novosibirsk/153k/2011 20 80 80 <20 <20

Как видно из табл. 17, все штаммы вируса гриппа В, выделенные в п. Кольцово в эпидемические сезоны 2010-2011 и 2008-2009 гг., относятся к линии Victoria и близки к вакцинному штамму B/Brisbane/60/2008. Тем не менее, штаммы 2011 г. по антигенным свойствам заметно отличаются от штаммов 2009 г. Антигенный дрейф проявился в уменьшении сродства штаммов 2011 г. с антисывороткой к штамму B/Malaysia/2506/2004.

Таким образом, с 10 января по 31 марта 2011 г. в п. Кольцово 12,7% населения обратились за медицинской помощью по поводу ОРВИ или гриппа. Больше 60 % больных были дети и подростки. Примерно у каждого 15-го заболевшего были взяты мазки из зева. В результате посева в культуру клеток MDCK было выделено 44 штамма вируса гриппа, из них 37 штаммов вируса гриппа A(HlNl)pdm09, три штамма вируса гриппа A(H3N2) и четыре штамма вируса гриппа В. Исследование антигенных и молекулярно-генетических характеристик штаммов показало, что все штаммы вируса A(HlNl)pdm09 были близки вакцинному штамму A/California/7/2009 (HlNl)pdm09, штаммы A(H3N2) были вариантами

штамма A/Perth/16/2009 (H3N2), вирусы гриппа В подобны B/Brisbane/60/2008.

Мы сравнили штаммы вирусов гриппа А и В, выделенные в п. Кольцово, со штаммами, • выделенными в других населенных пунктах юга Западной Сибири (сбор образцов проводился в гг. Новосибирске, Томске, Омске, Барнауле, п. Довольное). По антигенным свойствам и нуклеотидным последовательностям поверхностных белков штаммы А(НШ1)р<Зт09, выделенные в п. Кольцово. были близки штаммам вируса гриппа, выделенным нами в Томске, расположенном в 270 км к северо-востоку от Новосибирска, и в Доволенском районе Новосибирской области, около 270 км к юго-западу от Новосибирска (табл. 10, 11). Вирусы гриппа В. выделенные в Новосибирске, так же как штаммы из п. Кольцово, принадлежали генетической линии Виктория.

Кроме того, мы провели сероэпидемиологическое исследование до начала эпидемического сезона и после его окончания в Новосибирске и удаленных от мегаполиса районах Новосибирской области (рис. 7). Всего было собрано и проанализировано 1280 сывороток крови в октябре-ноябре 2010 г. и 840 образцов в марте-апреле 2011 г., в исследовании репрезентативно представлены возрастные группы населения с 18 лет.

Рис. 7. Сероэпидемиологическое исследование в Новосибирской области в 2010-2011 гг.

Как видно из рис. 7, в конце эпидемического сезона отмечалось статистически значимое увеличение числа положительных сывороток к вирусу гриппа A(HlNl)pdm09 по сравнению с осенью 2010 г. в возрастных группах 18-35 лет и 36-59 лет. Также весной 2011 г. во всех возрастных группах наблюдалось значительное увеличение числа серопозитивных лиц в отношении вируса гриппа В (Victoria lineage) по сравнению с осенью 2010 г. К вирусу гриппа A(H3N2) не было достоверного изменения количества положительных сывороток в конце эпидемического сезона по сравнению с началом сезона.

Вместе с тем отмечался значимый прирост процента положительных сывороток к старому сезонному вирусу гриппа А(НШ1) в возрастной группе 18-35 лет, несмотря на то, что данный субтип не выделялся с 2009 г.

Таким образом, на основании молекулярно-эпидемиологического исследования гриппа, проведенного в п. Кольцово, сравнении штаммов вируса гриппа, выделенных в п. Кольцово, со штаммами, выделенными в других населенных пунктах Западной Сибири, и данных серомониторинга, проведенного в условиях репрезентативной выборки, можно сделать заключение, что в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг. на юге Западной Сибири заболевание вызывали преимущественно штаммы вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, менее значимым был грипп В, вклад в эпидемический процесс вируса гриппа А(НЗЫ2) был несущественным.

Эпидемический сезон 2011-2012 гг.

В 2011-2012 гг. клинический материал (мазки из носа и зева) собирали в период с декабря 2011 г. по июнь 2012 г. Всего в течение сезона было проанализировано 619 образцов от жителей Новосибирска и Новосибирской области и 254 образца из других регионов Сибири (гг. Омск, Томск, Красноярск, Барнаул, Ханты-Мансийск, Владивосток, Иркутск, Магадан).

Из полученных образцов при заражении культуры клеток МБСК было выделено 97 штаммов вируса гриппа, из них 7 штаммов вируса гриппа В, 90 штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2).

Из 7 штаммов вируса гриппа В, выделенных в 2011-2012 гг., 6 штаммов принадлежали к линии Ямагата и по антигенным свойствам были подобны В/\У1зсоп5т/01/2010, и только 1 штамм относился к линии Виктория и в антигенном отношении был близок к В/ВгЬЬап с/60/2008. Следует отметить, что в течение нескольких предыдущих эпидемических сезонов на территории Сибири выделялись штаммы вируса гриппа В только Викторианской линии. Известно, что линии вируса гриппа В (ВЛЛаопа/2/87-подобные и В/Уап^а1а/16/88-подобные штаммы), различаются генетически и по антигенным свойствам, и антитела к вирусам одной линии не являются протективными в отношении вирусов другой линии.

За весь эпидемический сезон 2011-2012 гг. на территории Западной Сибири нами не было выделено ни одного штамма вируса гриппа А(НШ1)рёт09. Среди собранных

образцов в Томской области были два положительных в ПЦР по А(НШ1)рёш09, но вирус из этих проб выделить не удалось.

Как сказано выше, доминирующим во время сезона 2011-2012 гг. был вирус гриппа А(НЗШ). Анализ антигенных свойств этих штаммов в сравнении со свойствами штаммов сезона 2010-2011 гг. представлен в табл. 18.

Таблица 18. Антигенные свойства штаммов вируса гриппа A (H3N2), (2010-2012 гг.)

Обратный титр в РТГА с референс-сывороткой

Штамм вируса гриппа A/Brisbane/ A/Perth/ А/Victoria/

10/2007 16/2009 361/2011

A/Brisbane/10/2007 640 80 -

A/Perth/16/2009 20 640 640

A/Victoria/361/2011 80 80 2560

A/Novosibirsk/76k/2011 20 640 1280

A/Novosibirsk/1832/2011 20 640 5120

A/Novosibirsk/1927/2011 20 640 1280

A/Novosibirsk/47/2012 20 40 160

A/Novosibirsk/38/2012 20 80 640

A/Novosibirsk/44/2012 20 80 2560

A/Novosibirsk/37/2012 20 160 320

A/Novosibirsk/32/2012 20 160 640

A/Novosibirsk/59d/2012 20 160 1280

A/Novosibirsk/41k/2012 20 160 1280

A/Novosibirsk/155/2012 20 160 2560

A/Novosibirsk/59/2012 20 160 2560

A/Novosibirsk/56/2012 20 160 5120

A/Novosibirsk/15/2012 20 320 1280

A/Novosibirsk/16/2012 20 320 2560

A/Novosibirsk/26k/2012 40 40 160

A/Novosibirsk/60/2012 40 80 160

A/Novosibirsk/61/2012 40 80 640

A/Novosibirsk/57/2012 40 80 1280

A/Novosibirsk/52/2012 80 80 5120

A/Kovosibirsk/13/2012 80 320 1280

A/Novosibirsk/23k/2012 160 160 320

A/Novosibirsk/35k/2012 160 160 5120

A/Tyumen/03/2012 20 160 640

A/Krasnoyarsk/10/2012 40 80 320

A/Omsk/08/2012 160 160 2560

A/Omsk/01/2012 160 320 2560

Пояснения о выделении цветом - в тексте.

Как видно из табл.18, у 11 штаммов, выделенных в сезоне 2011—2012 гг.,

наблюдалось 4-кратное, у 7 штаммов- 8-кратное (выделено цветом), а у штаммов А/Моуоз1Ыгек/47/2012 и А/Моуо81ЫгБк/26к/2012 - 16-кратное снижение титра (выделено цветом) в РТГА с референс-сывороткой к вакцинному штамму А/РспЬ/1б/2009.

Для сыворотки А/ВпБЬапеЛ 0/2007 мы наблюдали отсутствие кроссреактивности со штаммами сезона 2010-2011 гг. и повышение уровня антигенного сродства к некоторым штаммам сезона 2011-2012 гг. Наибольшее сродство большинство штаммов вируса гриппа А(НЗШ) сезона 2011-2012 гг. проявляли с сывороткой, полученной на штамм А/Ую1опа/361/2011, включенный в состав гриппозной вакцины следующего сезона (2012— 2013 гг.).

Для 7 штаммов вируса гриппа А(НЗШ), выделенных во время эпидемического сезона 2011-2012 гг. в Новосибирской области, а также для штаммов А/Кгазпоуагзк/10/2012 и А/Туишеп/03/2012, получены полные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих поверхностные гликопротеины вируса гриппа (номера в ОепВапк КС135496-КС1354513), и проведен анализ аминокислотных последовательностей белков в сравнении с НА и ЫА штамма А/У1с1опа/361/2011 и штаммов, выделенных в 2010-2011 гг.

Анализ аминокислотных замен в структуре гемагглютинина показал, что исследованные штаммы вируса гриппа А(НЗЫ2) схожи между собой и со штаммом А/У1с1опа/361/2011. При этом первичная структура гемагглютинина штаммов А/Моуоз1Ыгек/59с1/2012 и А/Моуоз1Ыгек/155/2012 полностью идентична, при наличии синонимичных замен в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих данный белок. Большинство (85 %) замен, обнаруженных в аминокислотных последовательностях НА всей рассмотренной выборки штаммов, локализовано в антигенных детерминантах. Филогенетический анализ гена гемагглютинина показал сходство штаммов А(НЗ№), выделенных в 2011-2012 гг., с вакцинным штаммом следующего сезона А/У1с1опа/361/2011. Выделенные штаммы относились к генетической кладе У1йопа/208 (рис. 8).

По аминокислотному составу белка нейраминидазы исследуемые штаммы эпидемического сезона 2011-2012 гг. отличались как от вакцинного штамма предыдущих сезонов А/ВпзЬапе/10/2007, вакцинного штамма текущего сезона А/РеП11/16/2009, так и от штамма А/Ыоуо51Ыг5к/76к/2011, выделенного на территории п. Кольцово в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг., и сходны со штаммом А/У1си>па/361/2011, включенного в состав вакцины на сезон 2012-2013 гг.

Одной из задач молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа является оценка целесообразности использования этиотропных химиопрепаратов, применяемых в

-А/СгвсП ЙариЫ1с/121/2012

- А/&пдарс«Л"т7Г2011 —А/ммест/ог^лг

■ А/В**п'93/г011

- ♦ А/Ыоюы Ь«гак/2№/2012 -4 АЛ"уитвп/03/2012

- А/СМидмГ4О76б4/г012 А/51пварога«ЗР1669/2011

, А/<ЗиатЯ057/2012

♦ А/Мода*1ЫгвкД 3/2012

_^А/№яоз1Ыпк/59Ф2012

-+А/Кга*поуапкЛ0/2012

АЖй1г^г>ага£УРЮ2/2012 ♦ А/Иоч>»1Ь«1(/155/2012 — ф А/М№о1Ыгак/1 №2012

А/Моим ¡Ыгск/22/2012

А/Отз к/М02/2012

А/81поарогаПТ4&У2011 АЛЛс1опа^в1/2011

АМарап/ЭОО*/2012 А/Э ¡пдароге/ОР1561/2011 А/ЭйШ РМогаЬигв/ПЮ1/2012

- А/5уйпеу/204/2012 А/5<пдароге€ N312/2011

- А/Со1огМ(УЭ005/г012 -АЛУ»»Мпд1оп/2в9в/2012

- А/Аа1гакГшптмв5/2011 АЛ1а(1«и(ок/59/2012

А/№но*1Ыпк/02(1/2012 • АЛ>«гы*вй»к/ШЮ1/2012

-А/С2«сЬ НериЫ1с/11*2012

— Ат>аи1/смсосо4вь'2012 -А/Вов1оп/СЮАМ/2012

99|_Г еи

- А/Эап! Рйеп Ьигд/И 123/2012 А/$(оск Мт/1 &/2011 А/БвгЬ а/71/2011

-А/М а1адмсаг/06*в'2011

— А/У1С(опа/208/2000

— А/А1аЬ«паШ2010

-А/гао РаикУ49663/2012

. 11 Д/ГосапИмММ1/2011

_А/гшШ Рв(вга1л*о/га 163/2012

-А/Св1ИИг*а/3000/2012

_АЛМиМпдЮп/г997/2012

-АЮКкЛ987/2012

-А/Сгес!) ЯериЬНсЛ 26/2012

Рис. 8.

Филогенетическое дерево гена гемагглютинина (1701 н.о.) штаммов вируса гриппа А(НЗМ2), сезон 20112012 гг.

Мйог1а/208 clэde

68'А/1л«*1№2010

— АЛЛаЛляЮкЛ 0/2011

-Л^ол»ау/1106/2О11

— АЛ/1сИх1а1210/2009 -А/РЫЬ/16/2008

-А/№мау/13ЭШ2010

-А/М»саи1п/15/200в

-А/Гч1т-Топд»|/196/г0йй

-А/Вп»Ь«пвМ1У200Т

Репь/16 с1ас*е

терапии этого заболевания. На данный момент известен ряд мутаций в белке ЫА вируса

гриппа А(НЗИ2), характерных для штаммов, резистентных к озельтамивиру (наиболее

широко используемого ингибитора нейраминидазы вируса гриппа): 11292К, Е119У,

Е119У+1222У, N2948, с!с!244-247, С)136К. Согласно проведенному исследованию, в

аминокислотной последовательности белка нейраминидазы штаммов эпидемического

сезона 2011-2012 гг. нами не обнаружено мутаций, обусловливающих устойчивость к озельтамивиру.

Из 7 штаммов вируса гриппа В, выделенных в 2011-2012 гг. в Сибири, 6 штаммов принадлежали к линии Ямагата и только 1 штамм относится к линии Виктория (выделено голубым в табл. 19). Анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа В, выделенных в сезоне 2011-2012 гг. представлен в табл. 19.

Таблица 19. Анализ антигенных свойств штаммов вируса гриппа В (2011-2012 гг.)

Штамм вируса гриппа Обратный титр в РТГА с рефереис-сывороткой

В/Ма1ау$1а / 2506/2004 В/ОЫо / 1/2005 В/ВпвЬапе / 60/2008 В/Пог1<1а / 04/2006 В/Вавд1а -йевЬ/ 3333/200 7 ВЛУвсоп-514/01/201 0

В/Ма1ау81а/2506/2004 (УкИт.) 320 640 40 <20 <20 <20

ВЮ1но/1/2005 (УюМт.) 320 640 40 <20 <20 <20

1Шпч1>апе/60/2008 (УкЫт.) 320 1280 640 <20 <20 <20

В/11оп<1а/04/2006 (Уат.Нп.) <20 <20 <20 320 40 -

В/Ва^аДевЬШЗЗ/гОО 7 (УатЛт.) <20 <20 <20 640 640 -

В/У^сопяп/ОШОМ (Уат.Пп.) <20 <20 <20 - - 320

В/Моуо81Ыгек/34/2012 <20 <20 <20 160 80 640

В/ОтвкЛИ/2012 <20 <20 <20 160 640 320

В/Моуо$1Ыгек/74/2012 40 80 80 <20 <20 <20

В/УЫ1уо8Юк/693/2012 <20 <20 <20 160 320 640

ВЛгкШ5к/489/2012 <20 <20 <20 320 640 320

В/Маяас1ап/478/2012 <20 <20 <20 160 320 640

В/1гкШ5к/01/2012 <20 <20 <20 320 320 160

Следует заметить, что в течение трех предыдущих эпидемических сезонов в Сибири выделялись только штаммы Викторианской линии. Однако, как видно из табл. 19, в антигенном отношении штамм Викторианской линии, выделенный нами в 2012 г., В/Моуо81Ыг5к/74/2()12, проявлял сниженную кроссреактивность с референс-сыворотками, полученными к штаммам Викторианской линии 2004-2008 гг.: титры в РТГА в 8 раз ниже по сравнению с гомологичными. В то же время выделенные штаммы линии Ямагата хорошо взаимодействовали с сыворотками к референс-штаммам 2006-2010 гг.

Для сероэпидемиологического исследования нами был проведен сбор образцов сыворотки крови у жителей Западной Сибири (Новосибирск, Ханты-Мансийск, Барнаул, п. Довольное) в начале и в конце эпидемического сезона. Всего за этот период было собрано

758 образцов в октябре-ноябре 201 1 г. и 808 образцов в апреле-мае 2012 г. Результаты исследования представлены на рис. 9.

Октибрь-нанбрь 2011

Апрель-май 2012

AIH1NJ)

■ A(HlNl|pdm09

■ AIH3N2)

и В(Викторин)

■ В (Ямагата}

Рис. 9. Сероэпидемиологическое исследование в сезоне 2011-2012 гг.

Как видно из рис. 9, за сезон 2011-2012 гг. достоверно количество положительных сывороток к вирусу гриппа A(HlNl)pdm09 не увеличилось в ни в одной возрастной группе. К вирусу гриппа A(H3N2) процент положительных сывороток достоверно вырос только в группе 36-59 лет, с 10,7 ± 2,3 до 20,4 ± 3,6. Основной прирост положительных сывороток (в 2-3 раза) наблюдался к вирусу гриппа В линии Ямагата во всех возрастных группах.

Данные серомониторинга несколько расходятся с количественными показателями выделенных штаммов вируса гриппа из клинического материала. Так, по данным о выделенных штаммах в циркуляции преобладал вирус гриппа A(H3N2), а по результатам серомониторинга - вирус гриппа В. На наш взгляд, данные серомониторинга дают более объективную картину прошедшего эпидемического сезона, и в 2011-2012 гг., по-видимому, преобладал вирус гриппа В, но заболевание, вызванное этим вирусом, протекало в более легкой форме, поэтому мало людей обращалось за медицинской j помощью в лечебные учреждения, где собирался клинический материал.

Таким образом, в эпидемическом сезоне 2011-2012 гг. в Западной Сибири в основном циркулировали штаммы вируса гриппа A(H3N2) и гриппа В двух генетических линий (Виктория и Ямагата) с преобладанием линии Ямагата. Вклад в эпидемический процесс вируса гриппа А(Н INI )pdm09 был несущественным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как будет дальше эволюционировать вирус гриппа А, в настоящее время предсказать невозможно, но можно и нужно сделать все возможное, чтобы вовремя обнаружить новый вариант вируса, и если не предотвратить, то хотя бы уменьшить последствия вспышки заболевания, эпидемии или пандемии. Один из сценариев появления вируса гриппа с пандемическим потенциалом может быть следующим. После последней пандемии А(НШ1)рс1т/09-подобные вирусы распространились почти по всему миру. Благодаря высокой восприимчивости свиней к вирусу гриппа человека потомки пандемических штаммов циркулируют сейчас в свиньях. Поскольку свинья восприимчива и к вирусам гриппа птиц, то в результате реассортации возможно появление патогена, к которому иммунитет в человеческой популяции или отсутствует, или находится на крайне низком уровне. При таком сценарии появление пандемического штамма может произойти в любой точке земного шара, однако наиболее вероятно это событие в местах скопления водоплавающей птицы и тесных контактов ее с домашней птицей, которые в свою очередь могут стать источником заражения свиней. Этим критериям, несомненно, соответствуют условия юга Западной Сибири.

Следует отметить, что после появления в человеческой популяции нового варианта вируса и до начала пандемии, по-видимому, должно пройти какое-то время, необходимое для адаптации нового патогена к человеку (Смородинцев, 1982). В связи с этим молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа на территории Сибири необходим не только в эпидемический сезон, но и в весенне-осенний период. Для выявления вируса гриппа с пандемическим потенциалом нужно также отслеживать процессы эволюции вируса в популяции диких птиц, а также свиней, особенно в домашних хозяйствах, расположенных рядом с водоемами, где гнездятся дикие водоплавающие птицы.

Однако, «занимаясь борьбой с пандемией, необходимо помнить, что и обычные ежегодные эпидемии гриппа приносят огромный вред здоровью людей и экономике страны» (Гендон, 2008). В связи с этим нам представляется, что постоянный молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа на территории Сибири позволит не только выявить в человеческой популяции штаммы вируса, обладающие пандемическим потенциалом, но будет способствовать решению ряда проблем практического здравоохранения, связанных с ежегодными эпидемиями гриппа.

выводы

1. Дана характеристика пандемии гриппа 2009-2010 гг., предпандемического и постпандемического периодов в Азиатской части России при использовании комплексной методологии молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа.

2. Впервые получены данные о наличии специфических антител к вирусу гриппа птиц серотипа А(Н5Ш) в сыворотках крови людей на территории России. Все положительные сыворотки получены от пациентов, в анамнезе которых не было заболевания высокопатогенным вирусом гриппа или контакта с погибшей домашней птицей.

3. Предложен подход для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках людей, использующий, наряду с референс-антигеном, штаммы вируса гриппа, выделенные от птиц данного региона, при постановке РТГА использующий нативные эритроциты лошади, макаки-резус или формалинизированные эритроциты лошади, макаки-резус или гуся.

4. В предпандемический сезон (2008-2009 гг.) на юге Западной Сибири грипп был обусловлен циркуляцией штаммов вируса гриппа А(НЗШ), подобных А/ВшЬапе/10/2007(Н3^2), штаммов вируса А(НШ1), подобных А/Вп5Ьапе/59/2007(Н 1N1) (генетические клады 2В и 2С), и вирусом гриппа В (генетическая линия Виктория). Все штаммы вируса гриппа были чувствительны к действию арбидола (за единственным исключением - штамм А/Кокэоуо/31/2009(НЗЫ2) и в подавляющем большинстве резистентны к ремантадину.

5. В Азиатской части России эпидемия гриппа 2009-2010 гг. началась на Дальнем Востоке, затем распространилась на всю территорию Сибири. Заболевание вызывал пандемический вирус гриппа А(Н1Ш)рс1т09. Исследование популяционного иммунитета в условиях репрезентативной выборки показало, что к марту 2010 г., относительно фонового показателя (6,2 ±4,1) %, прирост в популяции серопозитивных к вирусу гриппа А(НШ1)рс1т09 людей составил (5,0 ± 4,3)%, (6,6 ± 4,5)% и (23,3 ± 5,2) % в Западной, Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, соответственно.

6. Исследование сывороток крови людей, переболевших острой респираторной вирусной инфекцией в ноябре-декабре 2009 г. в Амурской области, показало, что к февралю-марту 2010 г. эпидемически значимые титры антител к вирусу гриппа А(НШ1)рс1т09 имели 48,9 % лиц в возрасте до 30 лет и 20,1 % лиц старше 30 лет.

7. Штаммы пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, выделенные в 2009 г. на территории Азиатской части России, по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям на 99 % и выше идентичны референс-штамму А/СаШгша/04/2009. Единичные замены в антигенных сайтах не изменили антигенные характеристики штаммов. Молекулярно-генетический анализ выявил, что все штаммы были чувствительны к антинейраминидазным препаратам (озельтамивир, занамивир), препарату арбидол и устойчивы к ремантадину.

8. В 2010-2011 гг. в Западной Сибири заболевание вызывали штаммы вируса гриппа А(НШ1)рс1т09, по молекулярно-биологическим и антигенным характеристикам близкие вакцинному штамму А/СаИй)гша/7/2009 (НШ1)рс1т09, штаммы вируса гриппа А(НЗК2) - варианты вакцинного штамма А/РелЬ/16/2009 (клада РеПЬ/16), и вирусы гриппа В, генетическая линия Виктория, подобные В/ВшЬапе/60/2008.

9. В эпидемическом сезоне по гриппу 2011-2012 гг. из клинического материала выделялись преимущественно штаммы вируса А(НЗЫ2) (генетическая клада У1сЮпа/208) и штаммы вируса гриппа В двух генетических линий (Виктория и Ямагата).

10. Исследование популяционного иммунитета в условиях репрезентативной выборки показало, что среди населения Западной Сибири процент серопозитивных лиц к вирусу гриппа А(НШ1)рс1т09 увеличился с 6,2 ± 4,1 в марте 2009 г. до 13,6 ± 2,4 в марте 2011 г. и 21,5 ± 2,9 в мае 2012 г.; к вирусу сезонного гриппа А(НШ1) снизился с 38,6 ± 3,5 в 2009 г. до 9,4 ± 2,2 в 2012 г.; к вирусу гриппа А(НЗЫ2) снизился с 43,1 ± 3,5 в марте 2009 г. до 11,7 ± 2,2 в 2011 г. и затем вырос до 19,4 ± 2,8 в мае 2012 г.; к вирусу гриппа В (линия Виктория) снизился с 26,0 ± 4,0 в марте 2009 г. до 13,0 ± 2,3 в 2011г. и вырос до 18,6 ± 2,7 в мае 2012.; к вирусу гриппа В (линия Ямагата) вырос с 8,9 ± 2,1 в марте 2011 г. до 19,6 ± 2,8 в мае 2012 г.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Шестопалов A.M., Кихтенко Н.В., Сергеев А.Н., Михеев В.Н., Ильичева Т.Н., Рыжиков А.Б. Высокопатогенный грипп птиц A(H5N1): ситуация в 2009-2012 гг. и прогноз пандемического потенциала. // Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 1. С. 44-50.

2. Курская О. Г., Соболев И. А., Дурыманов А. Г., Дронова С. А., Шестопалов А. М., Ильичева Т. Н. Анализ эпидемической ситуации по гриппу в 2011- 2012 годах в Западной Сибири // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2013. — Т. 11(1).-С. 118-123.

3. Ильичева Т.Н., Бажан С.И., Шестопалов A.M., Нетесов C.B. Репродукция вируса гриппа человека и иммунопатогенез вызываемого им заболевания// Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10(4). - С. 59-65.

4. Соболев И.А., Курская О.Г., Иванова Е.В., Дурыманов А.Г., Ильичева Т.Н., Михеев В.Н., Шестопалов A.M. Эпидемиологическая ситуация по гриппу на юге Западной Сибири в 2011 - 2012 гг. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - Т. 5(87). - С. 122 - 126 (Бюллетень ВСНЦ СО РАМН).

5. Романовская A.A., Ильичева Т.Н., Дурыманов А.Г., Игнашкина М.Б., ШаршовК.А., Суслопаров И.М., МалковаЕ.М., Ставский Е.А., Шестопалов A.M., Смирнов В.Т., Жукова H.H., Павлова И.И., Нехрюк Т.Ю., Панамарева Т.П., Дроздов И.Г. Пандемический вирус гриппа A (HINI) в Амурской области осенью 2009 г. // ЖМЭИ. -2011.-Т. 1.-С. 35-39.

6. Курская О.Г., Суслопаров И.М., Дурыманов А.Г., Игнашкина М.Б., Глущенко A.B., Шестопалов A.M., Ильичева Т.Н. Изучение пандемического гриппа A/H1N1 в Сибирском и Дальневосточном регионах (сезон 2009- 2010)// Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. -2011. - Т. 9(2). - С. 156-161.

7. Соболев И., Романовская А., Курская О., Дурыманов А., Шестопалов А., Ильичева Т. Чувствительность вирусов гриппа 2008 - 2009 гг. к противовирусным химиопрепаратам // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9(3).-С. 13-20.

8. Онищенко Г.Г., Ильичева Т.Н., Курская О.Г., Колодий K.M., Ясинская Л.М., Дурыманов А.Г., Игнашкина М.Б., Зайковская A.B., Шестопалов A.M., Дроздов И.Г. Случаи выявления антител к вирусу гриппа A/H5N1 у жителей Российской Федерации // ЖМЭИ. - 2010. - Т. 2. - С. 13-16.

9. Ильичева Т.Н., Романовская A.A., Ильиных Ф.А., Курская О.Г., Дурыманов А.Г., Игнашкина М.Б., Кулак М.В., Иванова Е.В., Беспалов B.C., Горбатовская Л.М., Сивай М.В., Шестопалов A.M., Малкова Е.М., Дроздов И.Г. Мониторинг гриппа у населения Западной Сибири в 2007 - 2009 гг. // ЖМЭИ. - 2010. - Т. 6. - С. 26 - 30.

Ю.Курская О.Г., Ильичева Т.Н., Зайковская A.B., Горбатовская Л.М., Шестопалов A.M., Дроздов И.Г.. Мониторинг антител к вирусу гриппа А у населения различных регионов Западной Сибири // ЖМЭИ. - 2009. - Т. 3. - С. 92 - 95. П.Курская О.Г., Дурыманов А.Г., Шаршов К.А., Зайковская A.B., Шестопалов А.М., Ильичева Т.Н. Реакция торможения гемагглютинации для ретроспективной диагностики гриппа птиц у млекопитающих // ЖМЭИ. - 2009. - Т. 5. - С. 75 - 79.

12. Ильичева Т.Н., Зайковская A.B., Шестопалов A.M., Юшков Ю.Г., Пашков

A.А.Мониторинг свиней в неблагополучных пунктах по гриппу птиц // Ветеринария. -2007. -Т. 5. - С. 23-25.

13. Ильичева Т.Н., Кулишова Л.А., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Ясько М.

B., Серова O.A., Волков Г.Н., Беланов Е.Ф., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Противовирусная активность тритерпенов растительного происхождения, их производных и фосфонатов рибавирина // Вестник РАМН. - 2005. - Т. 2. - С. 26 - 30.

Н.Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Иммуностимулирующая активность тритерпенов растительного происхождения и их производных // ЖМЭИ. - 2001. - Т. 2. - С. 53 - 56.

15. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Ильичева Т.Н., Борисова O.A., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности// Химия в интересах устойчивого развития. -2001. - Т. 9. - С. 485-491.

16. Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Чернов C.B., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Иммуностимулирующая активность производных урсуловой кислоты// ДАН.-1999.-Т. 369(3).-С. 414-415.

Патенты

1. Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Беланов Е.Ф., Волков Г.Н., ¡Суханова М.К., Александрова JI.A. 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды - ингибиторы репродукции вирусов кори и Марбург. Патент РФ № 2264409, опубликовано в БИ №32 от 20.11.05

2. Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Котовская С.К., Романова С.А., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н. Фторированные производные 2-акроил-3-метил-6,7-дифторбенз [4,5]-имидазо[1,2-Ь][1,3]-тиазолов - ингибиторы репродукции вируса кори. Патент РФ № 2238093, опубликовано в БИ № 29 от 20.11.05

Статьи в международных журналах и других изданиях

1. Sobolev I., Kurskaya О., Susloparov I., Ilyicheva Т., Shestopalov A. Molecular genetic analysis of influenza A/H3N2 virus strains isolated in Western Siberia in the 2010- 2011 epidemic season // Infect Genet Evol. - 2012 - V. 12. - P. 1694 - 1698.

2. Ilyicheva Т., Susloparov I., Durymanov A., Romanovskaya A., Sharshov K., Kurskaya O., Ignashkina M., Shestopalov A. Influenza A/HlNlpdm virus in Russian Asia in 2009 - 2010 // Infect Genet Evol. - 2011. - V. 11. - P. 2107 - 2112.

3. Ilyicheva T.N., Evseenko V.A., Ternovoy V.A., Dyrimanov A.G., Zolotikh S.I., Shestopalov A.M., Netesov S.V., Drozdov I.G. Avian influenza H5N1 in Russia// Infect Genet Evol. -2008.-V. 8(4). - S27.

4. Prokopeva E.A., Sayfutdinova S.G., Glushchenko A.V., Kurskaya O.G., Zaykovskaya A.V., Durymanov A.G., Ilyicheva T.N., Shestopalova L.V., Shestopalov A.M. Comparative analysis of biological properties of influenza A(HlNl)pdm09 vims strains isolated in the pandemic of 2009 and the post-pandemic period in Russian Asia // Journal of Virology and Microbiology, 2013. Volume 2013, Article ID 890660, DOI: 10.5171/2013. 890660

5. Ilyicheva T.N., Zaikovskaya A.V., Katz J.M., Shestopalov A.M., I.G. Drozdov. Monitoring of serologic antibody response to the avian H5N1 virus before flu pandemia// Natural cataclysms and global problems of the modern civilization. Baku - Insbruck. - 2007. - P. 478-483.

Монографии, учебные и учебно-методические пособия

1. Ильичева Т.Н., Нетесов С.В., Гуреев В.Н. Вирусы гриппа. Микробиология. -Новосибирск: изд-во НГУ, 2012. - 164 с.

2. Азаев М.Ш., Кисленко В.Н., Дадаева А.А., Ильичева Т.Н., Сергеев А.Н. Теоретическая и практическая иммунология. Учебное пособие. - Новосибирск: ООО «Оптовый дом», 2013.-277 с.

3. Азаев М. Ш., Нетесов С. В., Бакулина JI. Ф., Генина Е. С., Сороченко С. А., Дадаева А. А., Ильичева Т. Н., Сергеев А. Н. Практическое пособие по работе с клеточными культурами. Арзамас: «Арзамасская типография», 2011. - 108 с.

4. Покровский А.Г., Федюк Н.В., Ильичева Т.Н. Микробиология и вирусология. Культивирование культур клеток. Методические указания. - Новосибирск, изд-во НГУ, 1999.-35 с.

5. Покровский А.Г., Федюк Н.В., Ильичева Т.Н. Микробиология и вирусология. Культивирование риккетсий и вируса гриппа. Методические указания. - Новосибирск: изд-во НГУ, 2001.-28 с.

Материалы конференций

1. Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Покровский А.Г., Шульц Э.Э., Чернов С.В., Толстиков Г.А. Иммуностимулирующее действие растительных тритерпенов. // Конференция Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск. - Тезисы докладов. - 10-11 апреля 1998. - С 209.

2. Ильичева Т.Н., Олькин С.Е., Федюк Н.В., Абдуллаев С.М., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Фармакокинетика глицциризиновой кислоты и ее производных. // Материалы 8-ой международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 19-24 мая 2000 г. - С.86.

3. Ilyicheva T.N., Evseenko V.A., Ternovoy V.A., Dyrimanov A.G., Zolotikh S.I., Shestopalov A.M„ Netesov S.V., Drozdov I.G. Avian influenza H5N1 in Russia. // MEEGID - VIII, Bangkok, Thailand, Nov 30 - Des 2,2006: 66

4. Sharshov K.A., Silko N.. Ilyicheva T.N., Zaykovskaya A.V., Zolotikh S.I., Ternovoy V.A., Durimanov A.G., Drozdov I.G., Shestopalov A.M. New HPAI viruses H5N1 in Russia (20062007 years). // Options for the Control of influenza VI, Toronto, Canada, June 17-23. 2007: 324-5.

5. Ilyicheva T.N., Zaikovskaya A.V., Achenbach J., Veguilla V., Shestopalov A.M., Katz J.M. Risk of infecting humans with highly pathogenic avian influenza H5N1 virus. // 3rd International Conference Basic Science for Medicine, Novosibirsk, Russia, Sep 2-8,2007:30.

6. Ilyicheva Т., Zaikovskaya A., Achnbach J., Veguilla V., Shestopalov A., Drozdov I., Klimov A., Katz J. Risk of human infection with highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in Russia. // Avian Influenza 2008: Integration from Knowledge to Control. Bangkok, Thailand. January 23-25, 2008:174

7. Ильичева Т.Н., Шестопалова E.M., Шаршов K.A., Золотых С.И., Дурыманов А.Г., Дроздов И.Г., Шестопалов A.M. Надзор за гриппом у диких птиц в постэпизоотический период 2005-2007 гг. на территории Сибири. // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития. Алматы, Казахстан. 19-21 мая 2008:629.

8. Susloparov I.M., Sharshov К.А., Ilycheva T.N., Ternovoy V.A., Shestopalov A.M.«New outbreak HPAI H5N1 in poultry and bird in Russia» //X International Symposium on Respiratory Viral Infections, February 28, 2008 - March 2, 2008, Singapore.

9. Kurskaya O. G., Zaykovskaya A. V., Durymanov A. G., Shestopalov A. M., Drozdov I. G., Ilyicheva T. N. Influenza A markers in sera of Russian population with different risk of exposure to H5N1 avian influenza virus.// "Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human Health". St Hilda's College, Oxford, England, UK, 10-11 September 2008.

Ю.Ильичева Т.Н., Курская О.Г., Дурыманов А.Г., Шестопалов A.M. Маркеры гриппа у населения Западной Сибири. // Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа. Материалы международной научно-практической конференции. 9-10 октября 2008 г., Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС», 2008, стр. 33-34.

И.Ilyicheva T.N., Prokudin A.V., Durymanov A.G., Kurskaya O.G., Sharshev K.A., Layshev K.A., Shestopalov A.M. Serological monitoring of influenza in wild birds from Taymir Peninsula // 7th International Symposium on Avian Influenza: Avian Influenza in Poultry and Wild Birds, April 5-8, 2009. Athens, Georgia, USA. P. 74.

12. Игнашкина М.Б., Курская О.Г., Романовская А.А., Дурыманов А.Г., Кулак M.B., Шестопалов A.M., Ильичева Т.Н. Особенности вирусов гриппа, вызвавших сезонный подъем заболеваемости в Новосибирской области в 2008-2009 г. // Материалы научной конференции «Медицинская геномика и протеомика», 9-13 сентября 2009 года, г. Новосибирск, Россия, стр. 126.

И.Ильичева Т.Н., Курская О.Г., Дурыманов А.Г., Игнашкина М.Б., Глушенко А.В., Соболев И.А., Шестопалов A.M. Маркеры пандемического вируса гриппа A (H1N1) у населения Сибири и Дальнего Востока в 2009-2011 гг. // Всероссийская научно-

)

практическая конференция с международным участием "Дни иммунологии в Сибири", 27 - 28 апреля 2011, г. Абакан, С. 133.

14. Sobolev I.A., Romanovskaya А.А., Kurskaya O.G., Durymanov A.G., Ilyicheva T.N., Shestopalov A.M. Influenza virus sensitivity to antiviral drugs: rimantadine, oseltamivir and arbidol // 4th Oxford International Influenza Conference «Influenza2011: Zoonotic Influenza and Human Health», 7-9 September 2011, St Hilda's College, Oxford, UK. P. 12-13.

15. T. Ilycheva, O. Kurskaya, A. Durymanov, I.Susloparov, I.Sobolev, A.Shestopalov. Influenza A/H1N1 pdm virus in Western Siberia in 2009-2011 //Pathogenesis of Influenza: Virus-Host Interaction, 23-28 May 2011, Kowloon, Hong-Kong SAR, China, P.78.

Подписано к печати 5 июля 2013г. Тираж 100 экз. Заказ № 036. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ильичёва, Татьяна Николаевна, Кольцово, Новосибирская область

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей

и благополучия человека Федеральное бюджетное учреждение науки ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

05201351568 На правах рукописи

Ильичёва Татьяна Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ГРИППА В АЗИАТСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ В 2005-2012 ГГ.

03.01.03 — молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

чл.-корр. РАН, д.б.н., проф.

C.B. Нетёсов

д.б.н., проф. A.M. Шестопалов

Кольцово, Новосибирская область - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................................................7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..............................................................................................10

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ...............................................................................................................10

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................................................................13

НАУЧНАЯ НОВИЗНА........................................................................................................................14

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ................................................................................17

I. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................21

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................................................21

1.1. СТРОЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА..............................................................................................22

1.1.1. Строение вириона................................................................................................................22

1.1.2. Геном и белки вируса гриппа...........................................................................................23

1.1.3. Репликативный цикл вируса гриппа..............................................................................25

1.2. ЭВОЛЮЦИЯ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ВИРУСА ГРИППА...........................................27

1.2.1. Структура гемагглютинина и нейраминидазы...........................................................27

1.2.2. Антигенный дрейф...............................................................................................................32

1.2.3. Антигенный шифт (сдвиг).................................................................................................34

1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ГРИППА................................................................................................35

1.3.1. Первые исторически зафиксированные эпидемии и пандемии гриппа................35

1.3.2. Пандемии гриппа в XX веке..............................................................................................37

1.3.2.1. Пандемия гриппа А(НINI) в 1918- 1920-х гг. («испанка»)..........................................37

1.3.2.2. Пандемия «азиатского гриппа» A(H2N2) в 1957 - 1959 гг.............................................38

1.3.2.3. Пандемия «гонконгского гриппа» A(H3N2) (1968 - 1970 гг.).......................................39

1.3.2.4. Пандемия Русского гриппа A(H1N1) (1977- 1978 гг.)...................................................40

1.3.2.5. Эпидемия гриппа A(HINI) в 1946- 1947 гг....................................................................40

1.3.3. Пандемия гриппа А(НINI) в XXI веке............................................................................41

1.3.4. Заболевания человека, вызванные вирусами гриппа свиней.................................44

1.3.5. Заболевания человека, вызванные вирусами гриппа птиц......................................44

1.3.6. Эпидемиология гриппа В..................................................................................................47

1.3.7. Эпидемиология сезонного гриппа.................................................................................48

1.4. ПАТОГЕНЕЗ..............................................................................................................................53

1.4.1. Патогенез при инфицировании вирусом гриппа человека.......................................53

1.4.2. Особенности патогенеза при заражении человека вирусами гриппа птиц подтипа A(H5N1)................................................................................................................................57

1.4.3. Патогенез при заражении человека вирусами гриппа птиц H7N7, H7N3, H7N2, H9N2 59

1.4.4. роль вирусных белков в адаптации к хозяину и патогенезе....................................60

1.4.4.1. Белки полимеразного комплекса.......................................................................................60

1.4.4.2. Гемагглютинин...................................................................................................................63

1.4.4.3. Неструктурный белок NS1.................................................................................................67

1.4.4.4. Роль других белков вируса гриппа в патогенезе.............................................................67

1.5. ИММУНИТЕТ ПРИ ГРИППЕ..................................................................................................68

1.5.1. неспецифический иммунитет..........................................................................................69

1.5.1.1. Рецепторы распознавания патоген-ассоциированных молекулярных структур в респираторном тракте..........................................................................................................................70

1.5.1.1.1. Толл-подобные рецепторы (toll-like receptors - TLR).................................................70

1.5.1.1.2. НОД-подобные рецепторы (nucleotide oligomerization domain-like receptors - NLR)73

1.5.1.1.3. RIG-I-подобные рецепторы (retinoic acic induced gene I-like receptors - RLR).........74

1.5.1.1.4. Цитокины.........................................................................................................................75

1.5.1.2. Связь между врожденным и адаптивным иммунными ответами..................................76

1.5.2. Адаптивный иммунный ответ на вирус гриппа А.......................................................77

1.5.2.1. Гуморальный ответ.............................................................................................................77

1.5.2.2. Цитотоксический Т-клеточный ответ...............................................................................79

1.5.3. Влияние популяционного иммунитета на смену серотипов вируса гриппа......80

1.6. ПОЯВЛЕНИЕ ПАНДЕМИЧЕСКИХ ВИРУСОВ ГРИППА А...............................................83

1.6.1. Дискуссия о появлении шифтовых вариантов вируса гриппа...............................83

1.6.2. Современные представления о возникновении пандемических вирусов гриппа 84

1.6.2.1. Появление «испанки» 1918 г.............................................................................................85

1.6.2.2. Появление азиатского (1957 г.) и гонконгского (1968 г.) гриппа..................................86

1.6.2.3. Появление пандемического вируса A(HlNl)pdm2009...................................................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................91

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................................93

2.1. МАТЕРИАЛЫ............................................................................................................................93

2.1.1. Материалы и реактивы.......................................................................................................93

2.1.2. Коммерческие тест-системы и диагностические наборы........................................94

2.1.3. Животные..............................................................................................................................95

2.1.4. Музейные вирусы................................................................................................................95

2.1.5. Культуры клеток..................................................................................................................95

2.2. МЕТОДЫ....................................................................................................................................96

2.2.1. Сбор и хранение материала..............................................................................................96

2.2.1.1. Сбор и хранение мазков из носа и зева............................................................................96

2.2.1.2. Сбор и хранение образцов сыворотки крови...................................................................97

2.2.2. Работы с культурой клеток MDCK..................................................................................97

2.2.2.1. Культивирование клеточной культуры MDCK...............................................................97

2.2.3. Вирусологические методы...............................................................................................99

2.2.3.1. Определение наличия вируса гриппа в клиническом образце.......................................99

2.2.3.2. Выделение вируса гриппа из клинического образца....................................................101

2.2.3.3. Титрование вируса гриппа в культуре клеток MDCK..................................................102

2.2.3.4. Культвирование и титрование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах 103

2.2.4. Серологические и иммунологические методы.........................................................106

2.2.4.1. Реакция торможения гемагглютинации.........................................................................106

2.2.4.1.1. Подготовка сывороток..................................................................................................106

2.2.4.1.2. Подготовка эритроцитов..............................................................................................107

2.2.4.1.3. Адсорбция сывороток с эритроцитами для удаления неспецифических агглютининов......................................................................................................................................108

2.2.4.1.4. Подготовка вируса........................................................................................................109

2.2.4.1.5. Реакция торможения гемагглютинации......................................................................109

2.2.4.2. Реакция микронейтрализации.........................................................................................110

2.2.4.2.1. Подготовка культуры клеток MDCK..........................................................................110

2.2.4.2.2. Подготовка рабочего раствора вируса........................................................................111

2.2.4.2.3. Микронейтрализация....................................................................................................112

2.2.5. молекулярно-биологические методы диагностики и исследования вирусных геномов.............................................................................................................................................. 117

2.2.6. тестирование чувствительности штаммов вируса гриппа к противовирусным препаратам........................................................................................................................................ 124

2.2.6.1. Определение токсичности препаратов при помощи МТТ-теста..................................124

2.2.6.2. Использование РГА для скрининга противогриппозной активности препаратов.....126

2.2.6.3. Иммуноферментный анализ для тестирования противовирусной активности препаратов...........................................................................................................................................128

2.2.7. ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬИХ АНТИСЫВОРОТОК......................................................................... 132

2.2.8. Статистическая обработка результатов.....................................................................133

III. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................................................134

3.1. ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД (2005 - АПРЕЛЬ 2009 ГГ.).....................................134

3.1.1. Вирус гриппа птиц A/H5N1 как вирус, обладающий пандемическим потенциалом.................................................................................................................................... 134

3.1.2. Модификация методики РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц A(H5N1) в сыворотках млекопитающих...................................................................................135

3.1.3. Поиск маркеров вируса гриппа A(H5N1).....................................................................141

в сыворотках крови людей............................................................................................................141

3.1.4. Обследование свиней в эпизоотических по вирусу A(H5N 1) районах Новосибирской области................................................................................................................149

3.1.5. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика вирусов гриппа, циркулировавших на юге Западной Сибири в 2008 - 2009 гг................................................150

3.1.6. Чувствительность штаммов вируса гриппа, циркулировавших в Западной Сибири в 2008 - 2009 гг., к противовирусным препаратам.....................................................156

3.2. ПАНДЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД ПО ГРИППУ A(H1N1)PDM09 (ИЮНЬ 2009 - АВГУСТ 2010 ГГ.)..............................................................................................................................................160

3.2.1. Исследование популяционного иммунитета к гриппу в Азиатской части России 160

3.2.2. Выделение пандемического вируса гриппа из клинического и секционного материала.......................................................................................................................................... 164

3.3. ПОСТПАНДЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД (2010-2012 ГГ.).....................................................173

3.3.1. молекулярно-эпидемиологическое исследование гриппа в поселке кольцово

Новосибирской области в 2010 -2011 гг....................................................................................173

3.3.2. Сравнение иммуногенных свойств штаммов вируса гриппа A/Novosibirsk/13/2009 (HlNl)pdm09 и A/Novosibirsk/KSH/2011 (HlNl)pdm09................................................................184

3.3.3. Эпидемический сезон 2011 - 2012 гг.............................................................................192

ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................................................202

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................217

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................220

ПРИЛОЖЕНИЕ 1...................................................................................................................................252

Заключение этического комитета о возможности проведения научно-исследовательской работы ..................................................................................................................................................................252

ПРИЛОЖЕНИЕ 2...................................................................................................................................253

Штаммы вируса гриппа, принятые на патентное депонирование.....................................................253

ПРИЛОЖЕНИЕ 3...................................................................................................................................256

Паспорта штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09................................................256

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CDC Центр по контролю заболеваний (США, г. Атланта) dNTP дезоксирибонуклеозидтрифосфат EDTA этилендиамин тетраацетат

FluNet ГриппСеть, «глобальный инструмент для вирусологического наблюдения за гриппом» - раздел на сайте Всемирной организации здравоохранения

http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/flunet/en/

GISRS Глобальная система надзора за гриппом (Global Influenza Surveillance and Response System)

НА гемагглютинин вируса гриппа

HA1 тяжелая цепь гемагглютинина

НА2 легкая цепь гемагглютинина

HPAI highly pathogenic avian influenza - высокопатогенный вирус гриппа птиц

LPAI low pathogenic avian influenza- низкопатогенный вирус гриппа птиц

Ml матриксный белок вируса гриппа

MDCK культура клеток почки взрослой самки кокер-спаниеля

NA нейраминидаза

NP нуклеопротеин

NS неструктурный белок

РА белок РА полимеразного комплекса (polymerase acidic protein)

РВ1 белок PB1 полимеразного комплекса (polymerase basic protein 1)

PB2 белок PB2 полимеразного комплекса (polymerase basic protein 2)

SDS додецилсульфат натрия

a.o. аминокислотный остаток

БОЕ бляшкообразующая единица

БСА бычий сывороточный альбумин

вг вирус гриппа

ВГА вирус гриппа А

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ГАЕ гемагглютинирующая единица

гРНК геномная РНК

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

дц ДНК двуцепочечная ДНК

ид50 50 %-ная инфицирующая доза

ИФА иммуноферментный анализ

кДНК ДНК, комплементарная вирусной РНК

кРНК РНК, комплементарная геномной РНК

ЛД50 50 %-ная летальная доза

М.в. молекулярный вес

М2 белок ионного канала вируса гриппа

МКА моноклональное антитело

МН микронейтрализация

н.о. нуклеотидное основание

НСО Новосибирская область

о.е. оптическая единица

ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция

ОТ обратная транскрипция

п.н. пара нуклеотидов

п.о. пара нуклеотидных оснований

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР полимеразная цепная реакция

РГА реакция гемагглютинации

РКЭ развивающиеся куриные эмбрионы

РНК рибонуклеиновая кислота

РНП рибонуклеопротеин

РТГА реакция торможения гемагглютинации

ТЦД50 50 %-ная тканевая цитопатическая доза

УФ ультрафиолетовое излучение

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЦНС центральная нервная система

ЦПД цитопатическое действие

ЦРБ центральная районная больница

эид50 50 %-ная эмбриональная инфицирующая доза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Грипп в его зоонозной, сезонной эпидемической и пандемической формах остается серьезной угрозой здоровью населения. Сезонный грипп является высокоинфекционным острым вирусным заболеванием, которое преимущественно поражает дыхательные пути. Он может вызывать заболевание разной степени тяжести, от легкой и даже бессимптомной формы до тяжелой с летальным исходом. Младенцы, лица престарелого возраста, а также люди с хроническими заболеваниями - наиболее уязвимые группы населения, так называемые группы риска. Сезонные эпидемии гриппа могут поражать до 15 % населения и ежегодно уносить 250 ООО - 500 ООО человеческих жизней (Программа исследований ВОЗ..., 2009).

Непрерывная циркуляция вирусов гриппа в природе, главным образом среди водоплавающих птиц, и способность к реассортации способствуют появлению новых вариантов вируса с пандемическим потенциалом. Если вирус приобретает способность эффективно передаваться от человека к человеку, он может вызвать вспышку заболевания. Слабый популяционный иммунитет не в состоянии защитить население от нового вируса, и он быстро распространяется по странам и континентам. В отличие от сезонного пандемический грипп поражает преимущественно молодых людей и лиц среднего возраста. Опыт пандемий XX века показал, что они существенно отразились на здоровье людей и повлекли значительные экономические потери.

В 1947 году Всемирной организацией здравоохранения была создана «Глобальная система надзора за гриппом» (с мая 2011 года она называется Global Influenza Surveillance and Response System - GISRS), главной задачей которой является получение текущей, репрезентативной картины изменений вируса гриппа на глобальном уровне. Программа была организована, как сеть лабораторий, нацеленных на изучение циркуляции и особенностей генетического строения штаммов вируса гриппа, выделенных из клинических образ-

цов и секционного материала Национальными центрами по гриппу (\УНС)/С08/2005.29).

Сегодня Глобальная программа ВОЗ по надзору за гриппом включает 138 Национальных центров по гриппу из 108 стран, шесть сотрудничающих с ВОЗ референс-центров, расположенных в Лондоне (Англия), Атланте (США), Мельбурне (Австралия), Токио (Япония), Пекине (Китай), Мемфисе (США), 4 Головные контрольные лаборатории (в Австралии, Японии, Великобритании, США), 12 референс лабораторий по диагностике А/Н5.

Современная концепция надзора за гриппом в России сложилась благодаря совместным усилиям Руководителя Роспотребнадзора, акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко, академика РАМН, проф. Д.К. Львова и академика РАМН, проф. О.И. Киселева. Система базируется на деятельности двух Национальных центров по гриппу, существующих на базе НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского и НИИ гриппа, и 59 базовых вирусологических лабораторий Роспотребнадзора. Система охватывает практически всю территорию РФ.

После 2005 г., когда высокопа

Информация о работе

Ильичёва, Татьяна Николаевна
доктора биологических наук
Кольцово, Новосибирская область, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы