Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Экспериментальная модель гриппа A/H5N1 на представителях вида кошка домашняя

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная модель гриппа A/H5N1 на представителях вида кошка домашняя"

00461-:

На правах рукописи

КОВАЛЕВСКАЯ АНАСТАСИЯ АНДРЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ГРИППА А/Н5Ш НА ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ ВИДА КОШКА ДОМАШНЯЯ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология 06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 8 НОЯ 2010

НОВОСИБИРСК-2010

004613092

Работа выполнена в Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет».

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Околелое Владимир Иванович,

кандидат биологических наук Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Плешакоеа Валентина Ивановна,

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Юшков Юрий Георгиевич

Ведущая организация: Федеральное государственное образова-

тельное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» (ФГУВНИИЗЖ)

Защита состоится « 16 » ноября 2010 г. в « 15 00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ИЭВСиДВ, а/я 8, тел./факс (8-383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан« » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Г.М. Стеблева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В отношении гриппа все чаще используется термин «эмерджентные болезни» (S.S. Morse, 1995; D.M. Morens, G.K. Folkers, A.S. Fauci, 2004) (от англ. emerging disease) - новые болезни, возникающие в результате изменения известных патогенов или известные инфекции, распространившиеся на новые территории/популяции в процессе эволюции.

Выделение от диких птиц высоко патогенных вирусов гриппа субтипа H5N1 стало приобретать массовый характер с середины 90-х годов в странах Юго-Восточной Азии.

Предок циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа A/H5N1 был впервые выделен от гуся в 1996 году и от погибшего человека в 1997 года' в Китае (K.S. Li, 2004 и др.). Эволюционируя и распространяясь, он стал реальной угрозой сначала для птицеводства, а в последствие и для человека. К началу XXI века стало очевидно, что именно вирусы гриппа A/H5N1 являются потенциально папдемичными (D.L. Suarez, 2000; R.G.Webster, 2001; Т. Horimoto, Y. Kawaoka, A.S. Lipatov, 2005; Г.Г. Онищенко, Д.К. Львов, 2006,2007 и др.).

В 2005 году в Китайской провинции Цинхай была зафиксирована крупнейшая вспышка заболевания диких птиц.

Уже в середине 2005 года вирусы, подобные выделенным от погибших птиц в провинции Цинхай, вызвали вспышки на территории Сибири, а в последствие на большей части России. Это было первым появлением вирусов высоко патогенного гриппа птиц A/H5N1 в России. Возникла необходимость определить биологические свойства этих вирусов для понимания возможных последствий их распространения.

При проведении исследований были описаны особенности патогенеза на различных животных моделях: на хорьках (L.A. Zitzow, 2002; Е.А. Govorkova, 2005; A.S. Lipatov, 2006; H.L. Yen, B.A. Евсеенко, 2007 и др.), мышах (B.A. Евсеенко, 2007; CKJ Paniker, 1972; A. S. Lipatov, 2003, 2005 и др.), красных лисах (L. A. Reperant, 2008), собаках (М. Giese, 2008) и кошках (CKJ Paniker, 1970; Т. Kuiken, 2004; К. Кагаса, 2005; G.F. Rimmelzwaan, 2006; М. Leschnik, 2007). На протяжении последних лет высоко патогенные вирусы A/H5N1 были выделены от тигров и леопардов (J. Keawcharoen, 2004; R. Thanawongnuwech, 2005 и др.), домашних кошек (Т. Songserm, S.L. Yingst, 2006; R. Klopfleisch, 2007; T.W. Vahlenkamp, 2008), пальмовых циветт Оусто-на (S.I. Roberton, 2006), домашних собак (Т. Songserm, 2006), каменных куниц (R. Klopfleisch, 2007), американских норок (В. Klingeborn, 1985; L. Englund, 1986; Т. Mörner, 2006 и др.), диких енотов (Jeffrey S. Hall, 2008), диких грызунов (J. Zhou, 2009) и других млекопитающих. Заболевание у представителей этих видов протекает чаще по типу респираторной инфекции, а также с вовлечением в патологический процесс нескольких систем организма. Участие вышеперечисленных видов животных в распространении и развитии гриппозной инфекции остается малоизученным и требует проведения детальных исследований.

Цель исследований - воспроизвести в экспериментальных условиях у представителей вида кошка домашняя инфекцию, обусловленную вирусом гриппа птиц А/Н5Ш, и изучить в динамике проявление основных характеризующих ее показателей.

Задачи исследований:

• изучить динамику проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа Н5Ы1;

• изучить возможность горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А субтипа ГОШ у представителей вида кошка домашняя;

• изучить динамику развития патоморфологических изменений в органах и тканях у кошек домашних, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А субтипа Н5Ш.

Научная новизна. Подтверждена возможность заражения представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа Н5Ш, выделенного от домашней птицы в период эпизоотии гриппа, и возможность горизонтальной передачи вируса внутри вида.

Получены данные о клиническом проявлении болезни, описаны гематологические, серологические показатели, патоморфологические изменения в динамике развития инфекционного процесса у домашних кошек.

Подтверждено выделение вируса инфицированными кошками во внешнюю среду, что определяет их возможное участие в эпизоотическом процессе гриппозной инфекции.

Дана сравнительная оценка классическому вирусологическому и моле-кулярно-биологическому методу количественного исследования вируса в клиническом и патологическом материале.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований вносят вклад в изыскание новых возможных хозяев и изучение межвидовой передачи вирусов гриппа.

Материалы диссертационной работы могут быть использованы при написании соответствующих разделов учебных пособий и руководств при подготовке специалистов в высших, средних специальных и научно-исследовательских учреждениях.

На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом Л/П5КГ1 в период эпизоотии гриппа птиц».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 6-й межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ (Омск, 2007), на 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007), на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО ОмГАУ (Омск, 2007, 2008, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней», посвященной 70-летию учения о природной очаговости болезней E.H. Павловского (Омск, 2009), на международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц», посвященной 80-летию УРНИВИ (Екатеринбург, 2010).

Публикации результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 10 научных работах, 2 из них - в ведущих научных журналах («Ветеринария» и «Ветеринарная патология»), рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 59 рисунками. Список литературы включает 140 источников, в том числе 42 отечественных и 98 работ иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа H5N1.

2. Возможность горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А субтипа H5N1 у представителей вида кошка домашняя.

3. Пагоморфологические изменения в органах и тканях у кошек домашних, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А субтипа H5N1.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии, паразитологии, инфекционных и инвазионных болезней животных Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет». Проведение лабораторных исследований осуществлялось в отделе зоонозных инфекций и гриппа, отделе микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Рос-потребнадзора и вирусологическом отделе Государственного учреждения Омской области «Омская областная ветеринарная лаборатория».

При проведении экспериментальной часта работы объектом исследований послужили клинически здоровые беспородные котята, серонегативные в отношении вируса гриппа А/Н5, возраст которых на момент проведения опыта составил 3,5-4 месяца. Перед проведением эксперимента котята были выдержаны на карантине в течение 30 дней.

Общее количество подопытных животных - 14 разнополых особей, 10 из которых участвовали в основном опыте, 2 были введены на 2-й день эксперимента и 2 служили отрицательным контролем.

Все работы, связанные с инфекционным материалом, производили в боксах биологической безопасности II класса защиты, а также в соответствии с нормативными документами.

Заражение подопытных животных производили штаммом вируса гриппа Л/Н5КЧ - А^оозе/Кгазпогегзкоуе/627/05 с физическим титром Ю10,2/мл, предоставленного из репозитория отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Вирус был выделен в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) из легкого погибшего гуся в период эпизоотии гриппа птиц в селе Краснозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года.

Инфицирование производили путем интраназального введения вирус-содержащей суспензии в объеме 500 мкл, по 250мкл в носовую полость с каждой стороны с титром 106ЭИД5О/мл. Определение ЭИД50 (50%-ной эмбриональной инфекционной дозы) проводили титрованием вируса в РКЭ с обработкой полученных данных по методу Рида-Менча. Процедуру заражения опытных животных осуществляли под ингаляционным эфировым наркозом.

Наблюдение проводили в течение 21 дня. Клинические признаки болезни регистрировали визуально, ежедневно проводилась термометрия, ау-скультация грудной клетки и отбор проб носоглоточных смывов. С интервалом в 3 дня производили отбор проб крови для серологического исследования на наличие специфических антител и определения гематологических показателей.

Все погибшие и убитые в ходе эксперимента животные подвергались патологоанатомическому исследованию. Убой подопытных животных производили тотальным обескровливанием при помощи кардиальной пункции, под эфировым наркозом. При вскрытии производили отбор фрагментов внутренних органов для проведения гистологических и вирусологических исследований. Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Титрование вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, тканях органов и моче, осуществляли в РКЭ параллельно с использованием метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). В качестве калибровочных стандартов, использовали ряд последовательных разведений аллантоисной жидкости с известным титром.

Заражение: интраназально, 10бЭИД50/мл, в дозе 500мкл/жив.

StS

Сутки после заражения

X -Пали

О «Диагностический убой

2! 3 5 7 12 21 i

Ча

Отрицательный контроль

Введены в опыт для изучения возможности горизонтальной передачи вируса

Ч»

Павшие и убитые животные:

"Патологоанатомическое исследование "Отбор проб внутренних органов для: ^титрования вируса в РКЭ и ОТ-ПЦР ^гистологического исследования ^иммуногистохимического исследования

Ежедневно:

•Осмотр, аускультация и термометрия

'Отбор носоглоточных смывов для титрования вируса в РКЭ и ОТ-ПЦР С интервалом в 3 дня:

* Отбор крови для серологических исследований •Определение

гематологических показателей

Рисунок 1 - Схема проведения эксперимента.

Определение содержания гемоглобина проводили классическим калориметрическим методом по Сали. Подсчет количества форменных элементов крови проводили пробирочным методом с использованием камеры Горяева. расчет производили по соответствующим формулам. Мазки крови для подсчета лейкоцитарной формулы окрашивали по Романовскому-Гимза и мик-роскопировали при помощи светового микроскопа.

Образцы для натолого-гистологического исследования фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида, приготовленного на растворе Хенкса (рН 7,2-7,4). Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по методу Вейгерта - ван Гизона. Для получения полутонких срезов исследуемые образцы тканей органов постфиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия. Полученные препараты обезвоживали по стандартной методике, заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы окрашивали 1%-ным раствором азураП.

Материалом для проведения иммуногистохимического исследования служили парафиновые срезы. Иммунопероксидазная реакция выполнялась с использованием набора реагентов «Novocastra peroxidase dataction system RE7120-K500» «Novocastra Ltd», США. В качестве специфических антител использовались антитела к нуклеопротеину (NP) вируса гриппа A/H5N1 в разведении 1:100, предоставленные лабораторией R.G.Webster.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Динамика проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у кошек вирусом гриппа А субтипа Н5М

При воспроизведении в экспериментальных условиях у кошек инфекции, вызываемой вирусом гриппа А субтипа Н5Ш, были изучены в динамике проявления основных характеризующих ее показателей.

2.2.1.1. Клиническая картина

Инкубационный период у кошек при интраназальном заражении составил 8-12 часов.

Первые проявления болезни характеризовались повышением температуры тела, общим угнетением, снижением аппетита, взъерошенностью волосяного покрова и нарастающим обезвоживанием.

В дальнейшем болезнь преимущественно протекала по типу респираторной инфекции, сопровождаясь конъюнктивитами, воспалением третьего века, отеком межчелюстного пространства и лицевой часта головы, одно- и двусторонними серозными ринитами, нарастающее угнетение, животные не реагировали на адекватные раздражители. Наблюдалось нарушение функций со стороны аппарата дыхания: чихание, кашель, затрудненное учащенное дыхание; со стороны аппарата пищеварения - незначительные отклонения, проявляющиеся диареей. Регистрировалась прогрессирующая патология со стороны центральной нервной системы, характеризующаяся нарушением координации движений, неспособностью сохранять равновесие. Наряду с общим угнетением, временно наблюдалась повышенная возбудимость животных. У отдельных особей отмечалась симптоматическая эпилепсия, характеризующаяся приступами тонико-клонических судорог, что свидетельствует о вовлечении в патологический процесс центральной нервной системы.

При проведении ежедневной термометрии и регистрации температурных показателей было определено, что первая волна гипертермии наблюдалась со 2-го по 5-й день эксперимента, затем вторая - с 9-го по 11-й день, вероятнее всего обусловленная осложнением гриппозной инфекции вторичной микрофлорой. В промежутке между 5-м и 9-м днем температура удерживалась на верхней границе физиологических показателей, а после 11-го дня температурные показатели стабилизировались в пределах нормы (рис. 2).

40,0

38,7

37,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 сутки

Рисунок 2 - Среднесуточные показатели температуры тела подопытных животных на протяжении эксперимента.

2.2.1.2. Гематологические показатели

Содержание гемоглобина в крови подопытных кошек на протяжении эксперимента находилось на границе максимальных физиологических показателей, либо характеризовалось незначительной плейохромией, вероятно обусловленной сгущением крови вследствие интоксикации организма и усиленного потоотделения при лихорадочном состоянии. К 9-му дню показатели содержания гемоглобина в крови стабилизировались в пределах физиологической нормы.

Через 24 часа после инфицирования у животных регистрировали лейкоцитоз. Количественные показатели достигли 19,3 тыс/мкл, средний показатель по группе составил 18,5 тыс/мкл. С 3-го по 9-й день эксперимента наблюдалась ярко выраженная лейкоцитопения. Отмечено снижение процентного соотношения лимфоцитов, увеличение процента нейтрофилов, непосредственно за счет преобладания сегментоядерных форм клеток (сдвиг ядра вправо). Результаты наших исследований согласуются с данными A.A. Смородинцева с соавторами (1977).

2.2.1.3. Серологические показатели

Развитие инфекционной патологии, обусловленной вирусом гриппа А и непосредственно субтипом H5N1, сопровождается синтезом и накоплением в сыворотке крови специфических антител. В ходе проведения эксперимента подопытные кошки положительно реагировали в реакции торможения ге-магглютинации (РТГА) с высокими титрами специфических антител, начиная с 12-го дня, была отмечена позитивная сероконверсия. Наивысшие значения титров (> 1/5120) установлены с гомологичным антигеном вируса, используемого для инфицирования подопытных животных (табл. 1).

Таблица 1 - Динамика синтеза и уровень антител у инфицированных кошек.

Эритроциты Антиген Л/йоо5е/Кга5Поогегекоуе/627/05

сутки после инфицирования, титр

9 12 15 18 21

гуся - 160/-/- 1280/80 2560/160 >5120/160

лошади - 1280/-/- >5120/1280 >5120/1280 >5120/1280

человека - 640/-/- 2560/320 >5120/320 >5120/320

Эритроциты Антиген A/common gull/Chany/P/2006

сутки после инфицирования, титр

9 12 15 18 21

гуся - 40/-/- 320/40 640/40 2560/40

лошади - 640/-/- >5120/320 >5120/640 >5120/640

человека - 80/-/- 320/40 320/40 1280/40

Примечание: через дробь указаны титры антител в РТГА

2.2.1.4. Длительность и динамика выделения вируса

Спустя сутки после заражения подопытные животные выделяли вирус во внешнюю среду. Ежедневно концентрация вируса увеличивалась. Максимальные значения составили 104'7-105'° ЭИД 50/мл на 5-8-й день после инфицирования, пик выделения вируса в носоглоточных смывах - Ю5,0 ЭИД 50/мл зарегистрирован на 6-й день методом ОТ-ПЦР и 8-й - культивированием в РКЭ. К 9-му дню концентрация вируса постепенно снижалась, и к 16-му дню, при исследовании клинического материала, выделение вируса прекратилось (рис. 3).

Рисунок 3 - Средние титры вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, М(±т)

2.2.1.5. Количественные показатели содержания вируса в тканях органов и моче

Анализируя полученные в ходе проведения исследований данные но изучению аффинитета органов и систем организма кошек к вирусу гриппа А/Н51М1, а также определения вирусной нагрузки методами ОТ-ПЦР и культивированием в РКЭ, можно отметить, что средние показатели содержания вируса в легких, трахее, селезенке, головном мозге, почках, сердце и кишечнике достаточно схожие и не превышают 0,3 к^Ю ЭИД50/мл 10%-иой сус-пензии/лаважа тканей органов. Оба способа количественного исследования подтверждают пантропность используемого для заражения вируса, высокую концентрацию его в носоглоточных смывах, тканях органов и моче и демонстрируют аналогичность полученных результатов (рис. 4).

кишечник кишечник почка моча

Рисунок 4 - Средние титры вируса, содержащегося в тканях органов и моче, М(±т).

Значительные различия установлены при исследовании печени и мочи, причем значения титра вируса в печени на 50% больше при исследовании методом культивирования в РКЭ, чем методом ОТ-ПЦР. а в моче концентрация вируса на 84,6% выше при исследовании методом ОТ-ПЦР. нежели культивированием в РКЭ. Вероятно, данные различия связаны с присутствием веществ, снижающих чувствительность данных методов исследований. Присутствующий в печени гепарин является ингибитором ПЦР, а содержание в моче солей, различных органических кислот и продуктов метаболизма, образующихся в процессе жизнедеятельности организма животного, оказывает токсическое воздействие на развитие эмбрионов.

Результаты наших исследований по определению титров вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, тканях органов и моче согласуются с

данными полученными CKJ Paniker (1970, 1972), Т. Kuiken, G.F. Rimmelzwaan, S. L. Yingst (2006), M. Leschnik (2007) и др.

2.2.1.6. Результаты иммуногистологического исследования

Иммуногистохимическим методом исследования определено наличие и локализация вирусного антигена в некоторых тканях органов. В головном мозге установлено диффузное и мелкоочаговое накопление вирусного антигена в области коры полушарий, в легких - в мононуклеарах, альвеолярном и бронхиальном эпителии, в печени - в цитоплазме гепатоцитов, в почках - в эндотелии почечных клубочков, в лимфатических узлах - в эндотелиальных клетках и лимфоцитах, в тонком и толстом кишечнике - в цитоплазме энте-роцитов и мононуклеарах. Наиболее выражена экспрессия вирусного антигена на границе нормальной и вовлеченной в патологический процесс ткани органов. Полученные нами данные согласуются с таковыми G.F. Rimmelzwaan с соавторами (2006).

2.2.2. Результаты изучения возможности горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа A/H5N1 у кошек

При изучении возможности внутривидовой передачи вируса гриппа A/H5N1 у кошек отмечено, что спустя 12 часов регистрировались первые клинические признаки болезни. Спустя сутки подопытные животные, после введения их в основную группу, выделяли вирус во внешнюю среду. Ежедневно концентрация вируса увеличивалась. Максимальные значения концентрации вируса в носоглоточных смывах отмечали перед гибелью животных - 105'2 и 105'8 ЭИД 50/мл при исследовании методом ОТ-ПЦР и 105'3 и 105,6 ЭИД 50/мл - методом культивирования в РКЭ, на 4 и 6 сутки соответственно (рис. 5).

д: S

4,1 5,8

2,4 3,7 4,2 3,7

| 0

Mi_ 5.3

5,6

3,9 .......И"*^ 3,8

0 ^ ---1.3

4,0

сутки

5,0

Нй™1

6,0

Рисунок 5 - Титры вируса, содержащегося в носоглоточных смывах от кошек, при изучении возможности внутривидовой передачи вируса.

Характер клинической и патологоанатомической картины был сходен с таковой у животных основного эксперимента, с преобладанием патологии со стороны аппарата дыхания.

В результате проведенных исследований по определению титров вируса в тканях органов и моче павших животных при изучении возможности горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А/Н5№, установлено присутствие вируса во всех органах, выбранных для исследования, а также в моче (рис. 6).

4,0

Рисунок 6 - Титры вируса, содержащегося в тканях органов и моче кошек, при изучении возможности внутривидовой передачи вируса.

Результаты проведенных нами исследований по изучению возможности внутривидовой передачи вируса гриппа А/Н5М1 у представителей семейства кошачьих согласуются с данными Я. ТЬатшдуогщтдаесЬ (2005) и О. Р. Штте1г\¥аап (2006). Полученные данные оставляют ряд вопросов, на которые предстоит ответить при проведении дальнейших исследований.

2.2.3. Динамика развития патоморфологических изменений в органах и тканях у кошек, экспериментально инфицированных вирусом гриппа A/H5N1

2.2.3.1. Результаты патологоанатомического исследования

В проведенном нами эксперименте гибель подопытных животных наблюдали с 6-ого по 8-ой день после инфицирования.

Динамику развития патологических изменений оценивали при диагностическом убое кошек на 1, 3, 5, 7 и 12-й дни опыта.

При патологоанатомическом вскрытии животного, убитого через 24 часа после инфицирования, изменений на макроуровне не наблюдалось. У павших и убитых животных преобладала патология со стороны органов аппарата дыхания. При убое животных на 3, 5, 7 и 12-й дни опыта наблюдалась стадийность развития крупозной пневмонии до тотального поражения легочной ткани. Поражения внутренних органов характеризовались явлениями геморрагического диатеза, а также воспалением и некрозами, что также отмечено в работе Keith G. Mansfield (2007) по изучению тропности вируса и патогенеза гриппозной инфекции у млекопитающих и В.А. Евсеенко с соавторами (2007) по изучению гриппа птиц A/H5N1 на мышиной и хорьковой модели.

При вскрытии животных, убитых на 21-й день после инфицирования, мы наблюдали остаточные явления патологоанатомических изменений, регистрировавшихся у павших и ранее убитых животных в ходе проведения эксперимента.

2.2.3.2. Результаты патолого-гистологического исследования

При проведении патолого-гистологического исследования нами была поставлена основная задача - изучение динамики развития патологических изменений, происходящих в тканях органов кошек при экспериментальном инфицировании вирусом гриппа А субтипа H5N1.

Течение инфекционного процесса в тканях головного мозга сопровождалось выраженными воспалительными изменениями (диффузная и очаговая лимфоцитарная инфильтрация), нарушением гемодинамики (отек, парез сосудов, диапедезные кровоизлияния), морфологическими проявлениями ДВС-синдрома (тромбообразование). В мозжечке на 5-й день обнаружены дистрофические изменения клеток Пуркинье. К 7-му дню регистрировались крупные кровоизлияния в мягкие мозговые оболочки. Поражение головного мозга - развитие энцефалита у каменной куницы при заражении вирусом гриппа А/Н5Ы1описьгаает R. Klopfleisch с соавт. (2007).

В слизистой оболочке, выстилающей носовую полость, отмечено появление гигантских многоядерных клеток, дистрофические изменения обонятельного эпителия, очаги его пролиферации и неравномерной секреции бокаловидных клеток, отек подслизистой оболочки, ее лимфоцитарная инфильтрация и парез сосудов. Все эти признаки характеризовали течение воспалительного процесса.

Отмечалось неравномерное течение патологического процесса с очаговым поражением эпителиальной выстилки трахеи. Дистрофические изменения эпителиоцитов и их десквамация в первые дни заболевания сопровождались нарушениями гемодинамики в виде выраженного отека и диапедезных кровоизлияний. В дальнейшем развивался процесс регенерации эпителия, на фоне которого сохранялись дистрофически-некротические изменения.

Прослеживалось неравномерное поражение респираторной ткани легких. На фоне гнойного бронхита и эмфизематозно расширенных альвеол характерно присутствие очагов воспалительно-клеточной инфильтрации. Одновременно отмечались очаги воспаления с некрозом межальвеолярных перегородок и формированием фокусов некроза.

Наблюдали признаки дистрофии и некроза гепатоцитов, крупные кровоизлияния в паренхиму. Регистрируемые патологические изменения характерны для инфекционно-токсического поражения печени.

Делимфатизация красной пульпы селезенки, в белой - крупные фолликулы с расширенным и некротизированным герминативным центром. Выявленные изменения, отражают выраженную антигенную стимуляцию органа и развитие общесептической реакции.

При исследовании ткани почек установлена дистрофия нефротелия, набухание почечных клубочков, регистрировались кровоизлияния в строме и формирование субкапсулярных кист с геморрагическим содержимым.

При изучении гистологических препаратов тонкого кишечника обнаружено слияние апикальной поверхности ворсинок, формирование крипт-абсцессов на фоне отека и интенсивной воспалительно-клеточной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки, дистрофия и десквамация энтероцитов, интенсивный трансэпителиальный диапедез.

Регистрировали дистрофические изменения и десквамацию каемчатых колоноцитов, интенсивную мононуклеарную инфильтрацию, опустошение лимфоидных образований, формирование крипт-абсцессов, очаги некроза.

В ткани сердца обнаружена дистрофия кардиомиоцитов, мононуклеар-ная очаговая инфильтрация, диапедезные кровоизлияния. На 5-й день обнаружен крупный очаг некроза миокарда, на 7-й - разволокнение волокон, отек стромы.

В лимфатических узлах зарегистрировано уменьшение количества лимфоидных клеток в корковом и мозговом слоях, делимфатизация лимфоидных фолликулов.

Результаты патолого-гистологического исследования согласуются с данными полученными при проведении аналогичного эксперимента С. Б. Штте1г\уаап (2006), а также Ь. А. Керегап! (2008), использовавшего модель на красных лисах.

3. выводы

1. Воспроизведена экспериментальная инфекция гриппа А/Н5Ш на представителях вида кошка домашняя путем интраназального заражения вирусом, выделенным из легкого домашнего гуся, погибшего в период эпизоотии гриппа 2005 года, в дозе 500 мкл с титром 106ЭИД5о/мл. Инкубационный период составил 8-12 часов, болезнь преимущественно протекала по типу респираторной инфекции. Динамику воспроизводимой инфекции оценивали при убое кошек на 1, 3, 5, 7, 12 и 21-й дни опыта, гибель животных регистрировали на 6, 7, и 8-й день.

2. Исследованиями носоглоточных смывов подтверждено выделение вируса инфицированными животными во внешнюю среду с 1 по 15-й день эксперимента. Максимальные значения концентрации вируса 104'7 - Ю5,0 ЭИД 50/мл зарегистрированы с 5 по 8-й день.

3. Появление специфических антител в сыворотке крови к вирусу гриппа А/Н5 зарегистрировано на 12-й день (1/40 - 1/1280) и достигли максимальных значений к 21-му дню (>5120) эксперимента, установлена позитивная сероконверсия.

4. При количественном исследовании вируса в тканях органов и моче вирусологическим и молекулярно-биологическим методом показатели концентрации вируса в легких, трахее, селезенке, головном мозге, почках, сердце и кишечнике достаточно схожи и не превышают 0,3 1о§10 ЭИД50/мл. Значительные различия установлены при исследовании печени и мочи, титр вируса в печени на 50% больше при исследовании методом культивирования в РКЭ, чем методом ОТ-ПЦР, а в моче на 84,6% больше при исследовании методом ОТ-ПЦР, чем методом культивирования в РКЭ.

5. Иммуногистохимическим исследованием установлена локализация антигена вируса гриппа А/Н5М1 в тканях головного мозга, легких, печени, почек, кишечника и лимфатических узлов, что подтверждает пантроп-ность используемого в эксперименте вируса для кошки домашней.

6. Первые клинические признаки у кошек, введенных на второй день эксперимента в группу интранозально-инфицированных животных, зарегистрированы через 12 часов, болезнь протекала по типу респираторной инфекции, что свидетельствует о горизонтальной передаче вируса. Гибель данных особей была зафиксирована на 6 и 8-й день эксперимента.

7. Основные патоморфологические изменения обнаружены в головном мозге, трахее, легких, селезенке, печени, почках, сердце, кишечнике и характеризуются воспалительными процессами, нарушением гемодинамики и морфологическом проявлении ДВС-синдрома.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Основные практические предложения нашли отражение в методических рекомендациях «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом ЛЛ15М в период эпизоотии гриппа птиц» одобренных, ре-

комендованных к изданию и практическому применению секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 6 от 24 сентября 2009г.) и утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 4 от 10 ноября 2009г.). В рекомендациях изложены краткие сведения о морфологии и биологических свойствах вируса гриппа A/H5N1, его роли в эпизоотическом/эпидемическом процессе. Определены возможные пути заражения представителей семейства кошачьих вирусом H5N1-субтипа в период эпизоотии гриппа птиц, описана клиническая и патологоанатомическая картина у представителей данного вида, а также современные методы диагностики.

Полученные данные необходимо учитывать при планировании и проведении противоэпизоотических мероприятий по профилактике и мерам борьбы в случае возникновения гриппа.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковалевская, A.A. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и си-иантроппой птицы на территории Омской области / A.A. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, A.M. Шестопалов // Ветеринарная патология. - 2007. - № 1 (20). - С. 178-181.

2. Ковалевская, A.A. Экспериментальная инфекция вируса гриппа A/H5N1 у представителей вида Felis catus / A.A. Ковалевская, В.И. Околелов, A.M. Шестопалов, A.B. Зайковская, И.Г. Дроздов // Ветеринария. - 2010. - № 3. - С. 28-30.

3. Ковалевская, A.A. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синан-тропной пиши на территории Омской области в 2006 г. / A.A. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, A.M. Шестопалов // Ветеринарный консультант. - 2007.-№5(144).-С.7-10.

4. Ковалевская, A.A. Изучение патогенности вирусов гриппа A/H5N1 для домашних кошек / A.A. Ковалевская. В.И. Околелов, A.B. Зайковская, A.M. Шестопалов // Национальные приоритеты России. Актуальные проблемы природной очаговости болезней. — 2009. - № 2. - С. 230-231.

5. Ковалевская, A.A. Эпизоотия гриппа птиц на территории Омской области в 2006 году / A.A. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов // Естественная и специфическая резистентность населения и животных в условиях Сибири: материалы 6-й межрегион, науч.-практ. конф., посвящ. 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ. - Омск, 2007. - С. 26-29.

6. Ковалевская, A.A. Грипп птиц в Омской области / A.A. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов // Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения: сб. науч. тр. - Омск, 2007. - С. 108-114.

7. Хатько, Н.Ф. Диагностика и мониторинг гриппа птиц на территории Омской области / Н.Ф. Хатько, A.A. Ковалевская, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, A.M. Шестопалов // Молекулярная диагностика - 2007: сб. тр. 6-ой Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. Участием. - Москва, 2007. -Т. 1.-С. 217-219.

8. Ковалевская, A.A. Клиническое проявление гриппа A/H5N1 у домашних кошек в эксперименте / A.A. Ковалевская, В.И. Околелов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: сб. науч. тр. ведущих ученых России и Зарубежья. - Вып. 3. - Екатеринбург, 2010.-С. 141-144.

9. Ковалевская, A.A. Результаты титрования вируса гриппа A/H5N1 методом ПЦР в носоглоточных смывах домашних кошек в условиях эксперимента / A.A. Ковалевская, В.И. Околелов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: сб. науч. тр. ведущих ученых России и Зарубежья. - Вып. 3. - Екатеринбург, 2010. -С. 144-148.

10. Малкова, Е.М. Патологические изменения респираторной системы домашних кошек Felis catus при экспериментальном гриппе птиц A (H5N1) / Е.М. Малкова, О.Б. Грицык, A.A. Ковалевская, В.В. Омигов, A.M. Шестопалов, A.B. Зайковская, Е.А. Ставский, И.Г. Дроздов // Морфологические ведомости. - 2010. - № 3. - С. 30-35.

Отпечатано в ООО «Образование Информ» ул. Серова, 13, тел. (3812)45-13-25 Тираж 100 шт.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Ковалевская, Анастасия Андреевна

Список используемых сокращений.

ВЕЛЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Истопический обзоп.:.

1.2. Структура вируса гриппа.

1.3. ТТанттемии XX века.

1.4. Грипп птиц обусловленный вирусом А/Н5Ы1-субтипа.

1.4.1. Эпизоотологические данные.

1.4.2. Клинические и патоморфологические признаки.

1.5. Грипп А/ШИ! у человека.

1.5.1. Эпидемиологические данные.

1.5.2. Клинические и патоморфологические признаки.

1.6. Грипп А/Н5Ы1 у животных в экспериментальных и естественных условиях.

1.6.1. Грипп А/Н5Т<[1 у хорей.

1.6.2. Грипп А/Н5Ш у лабораторных мышей.

1.6.3. Грипп А/Н5Ш у красных лис.

1.6.4. Грипп А/Н5Ы1 у собак.

1.6.5. Грипп А/Н5Ш у кошек.

1.7. Межвидовая миграция вирусов гриппа А/Н5Ш.

1.8. Лабораторная диагностика гриппа А/Н5Ш.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Экспериментальная модель гриппа A/H5N1 на представителях вида кошка домашняя"

Актуальность темы. Проблем в современном мире существует большое количество. Одна из них проблема гриппа, - болезнь поражает человека, различные виды животных и птиц. Грипп представляет собой уникальную инфекцию, не имеющую аналогов среди других инфекционных болезней. В настоящее время грипп является подлинно глобальной инфекцией не только потому, что он распространен во всех странах, но главным образом потому, что это инфекция человечества [7]. Эпидемии гриппа происходят ежегодно и не воспринимаются как нечто экстраординарное, но при изменении антигенных и биологических свойств возбудителя, вирус молниеносно распространяется в мире, способен поражать до четверти населения планеты с высоким уровнем заболеваемости и смертности, что приводит к социальной нестабильности и колоссальным экономическим потерям.

В отношении гриппа все чаще используется термин «эмерджентные болезни» [110, 111] (от англ. emerging disease) - новые болезни, возникающие в результате изменения известных патогенов или известные инфекции, распространившиеся на новые территории/популяции в процессе эволюции.

Современная наука не располагает средствами предупреждения ежегодно возникающих гриппозных эпидемий, а имеющаяся в настоящее время система профилактических и лечебных мероприятий несовершенна в виду антигенной нестабильности поверхностных белков возбудителя и его способности к изменчивости.

Изучение вирусов гриппа А является наиболее приоритетной задачей для исследователей всего мира, т.к. представители данной группы циркулируют в человеческой и животной популяции, ставя задачи перед специалистами гуманитарной и ветеринарной медицины.

Благодаря постоянному мониторингу циркулирующих среди людей, домашних и диких животных вирусов, а также знаниям, полученным в ходе развития современной науки, появилась возможность для прогнозирования появления новых вариантов вируса склонных к пандемическому распространению и способных преодолевать межвидовой барьер [89, 129]. В последние годы претендует на эту роль изначально непатогенный вирус гриппа птиц Н5№ [28]. В конце 2003 г. он вызвал эпизоотию гриппа среди домашних птиц, перешедшую в 2005 г. в панзоотию [6, 14, 15, 17, 24, 27, 74]. Этот вирус начал поражать различные виды животных и людей, но пока не может передаваться от человека к человеку. Чтобы он приобрел эту способность, достаточно замены всего одной аминокислоты в одном из вирусных белков [75, 89, 129]. Ранее существующая концепция об ограниченности круга хозяев для вирусов гриппа птиц, которая в свете последних событий рушится на глазах. Свидетельством этому послужили подтвержденные случаи инфицирования людей вирусом А/Н9Ы2 в Гонконге [94], вспышка А/Н7Ш-инфекции в Нидерландах в 2003 г. [106] и регистрирующиеся с 1997 г. вспышки гриппа А/Н5Ы1 -субтипа [87, 139].

Поступавшие в МЭБ официальные сообщения правительственных органов ряда стран свидетельствовали о том, что географическое распространение вируса А/Н5Ш расширялось [90]. Российская Федерация была вовлечена в эпизоотию гриппа птиц с лета 2005 года. Наряду с Россией, о вспышках заболевания домашних птиц сообщил и Казахстан, неблагополучные пункты зафиксированы на территориях, граничащих с очагом вспышки в Сибири. Вирус последовательно распространился и охватил 6 краев и областей Сибирского и Уральского федеральных округов. Вспышки имели место в Новосибирской, Омской, Курганской, Тюменской, Челябинской областях и Алтайском крае. В начале августа Монголия сделала экстренное сообщение о том, что зафиксирована массовая гибель перелетных птиц на озерах северной части страны. Причиной данному факту послужил вирус гриппа птиц типа А субтипа Н5. Вспышка вируса гриппа А/Н5М1 среди домашних птиц в августе того же года была выявлена в Тибете (Китай). Вспышки в России и Казахстане свидетельствуют о том, что вирусы Н5Ш распространились далеко за пределы своего первоначального места обитания в странах Юго-Восточной Азии, где, как известно, вспышки гриппа птиц начались в середине 2003 года [б].

По данным ВОЗ и МЭБ, в ряде стран были зарегистрированы случаи гибели представителей семейства кошачьих и выделения от них высоко патогенных вирусов гриппа Н5Ш субтипа (www.who.int, www.oie.int). Так в 2006 году в Германии на острове Рюген из внутренних органов кошки выделен вирус гриппа А субтипа Н51Ч1. Непосредственно перед этим на берегу Балтийского моря была зафиксирована гибель диких птиц, вызванная вирусом того же субтипа. В 2005-2006 годах в Ираке и Индонезии во время эпизоотии гриппа обусловленной высоко патогенным вирусом Н5Ш была зарегистрирована необычно высокая смертность кошек. В декабре 2003 года в зоопарке Таиланда произошла гибель леопардов и тигров, по два представителя каждого вида. На протяжении 2004 года в Бангкоке отмечалась гибель крупных кошек: в феврале - снежного барса, в марте - белого тигра, а в октябре из 441 тигра погибло 147. Во всех случаях, по сообщению ВОЗ, было подтверждено наличие вируса Н5№ во внутренних органах погибших животных. Наиболее вероятным источником инфицирования кошек данным субтипом вируса является факт скармливания животным тушек, термически не обработанных, зараженных птиц.

Учитывая способность вирусов гриппа А к преодолению межвидового барьера, отмеченную многими исследователями [18, 37, 40, 42, 48, 49, 59, 63, 84, 93, 100, 102], становится актуальным вопрос по изучению новых потенциальных источников инфекции и, в первую очередь, для человека. Кошка является постоянным обитателем человеческого жилища, достаточно часто имеет неограниченный контакт с дикой и синантропной птицей и поэтому представляет особый интерес для научных исследований, что и предопределило цель нашей работы.

Цель исследований — воспроизвести в экспериментальных условиях у представителей вида кошка домашняя инфекцию, обусловленную вирусом гриппа птиц А/Н5Ш, и изучить в динамике проявление основных характеризующих ее показателей.

Задачи исследований:

• изучить динамику проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа Н5Ш;

• изучить возможность горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А субтипа Н51М1 у представителей вида кошка домашняя;

• изучить динамику развития патоморфологических изменений в органах и тканях у кошек домашних, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А субтипа Н5Ш.

Научная новизна. Подтверждена возможность заражения представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа Н51М1, выделенного от домашней птицы в период эпизоотии гриппа, и возможность горизонтальной передачи вируса внутри вида.

Получены данные о клиническом проявлении болезни, описаны гематологические, серологические показатели, патоморфологические изменения в динамике развития инфекционного процесса у домашних кошек.

Подтверждено выделение вируса инфицированными кошками во внешнюю среду, что определяет их возможное участие в эпизоотическом процессе гриппозной инфекции.

Дана сравнительная оценка классическому вирусологическому и молекулярно-биологическому методу количественного исследования вируса в клиническом и патологическом материале.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований вносят вклад в изыскание новых возможных хозяев и изучение межвидовой передачи вирусов гриппа.

Материалы диссертационной работы могут быть использованы при написании соответствующих разделов учебных пособий и руководств при подготовке специалистов в высших, средних специальных и научно-исследовательских учреждениях.

На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом А/Н51чГ1 в период эпизоотии гриппа птиц».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 6-й межрегиональной научно-практической конференции посвященной 85-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ (Омск, 2007);

• 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007);

• научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО ОмГАУ (Омск, 2007, 2008, 2009);

• Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» посвященной 70-летию учения о природной очаговости болезней Е. Н. Павловского (Омск, 2009);

• международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц» посвященной 80-летию УРНИВИ (Екатеринбург, 2010).

Публикации результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 10 научных работах, 2 из них - в ведущих научных журналах («Ветеринария» и «Ветеринарная патология»), рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Внедрение результатов исследований. На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом

A/H5N1 в период эпизоотии гриппа птиц» одобренные, рекомендованные к изданию и практическому применению секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 6 от 24 сентября 2009 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции «Инфекционная патология ветеринарной медицины» Сибирского отделения Россельхозакадемии (протокол № 4 от 10 ноября 2009 года). В рекомендациях изложены краткие сведения о морфологии и биологических свойствах вируса гриппа A/H5N1, его роли в эпизоотическом/эпидемическом процессе. Определены возможные пути заражения представителей семейства кошачьих вирусом H5N1-субтипа в период эпизоотии гриппа птиц, описана клиническая и патологоанатомическая картина у представителей данного вида, а также современные методы диагностики.

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии, паразитологии, инфекционных и инвазионных болезней и анатомии, гистологии и патологической анатомии, Института ветеринарной медицины Омского Государственного аграрного университета, на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов в ФГУ «Институт повышения квалификации» и семинарах для практикующих ветеринарных врачей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 59 рисунками. Список литературы включает 140 источник, в том числе 42 отечественных и 98 работ иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Ковалевская, Анастасия Андреевна

4. ВЫВОДЫ

1. Воспроизведена экспериментальная инфекция гриппа A/H5N1 на представителях вида кошка домашняя путем интраназального заражения вирусом, выделенным из легкого домашнего гуся погибшего в период эпизоотии гриппа 2005 года, в дозе 500 мкл с титром 106 ЭИД50/мл. Инкубационный период составил 8-12 часов, болезнь преимущественно протекала по типу респираторной инфекции. Динамику воспроизводимой инфекции оценивали при убое кошек на 1, 3, 5, 7, 12 и 21-й дни опыта, гибель животных регистрировали на 6, 7, и 8-й день.

2. Подтверждено выделение вируса инфицированными животными во внешнюю среду с 1 по 15-й день эксперимента, исследованиями носоглоточных смывов. Максимальные значения концентрации вируса 104'7 - Ю5'0 ЭИД 50/мл зарегистрированы с 5 по 8-й день.

3*. Появление специфических антител в сыворотке крови к вирусу гриппа А/Н5 зарегистрировано на 12-й день (1/40 - 1/1280) и достигли максимальных значений к 21-му дню (>5120) эксперимента, установлена-позитивная сероконверсия.

4. При количественном исследовании вируса в тканях органов и моче вирусологическим и молекулярно-биологическим методом показатели концентрации вируса в легких, трахее, селезенке, головном мозге, почках, сердце и кишечнике достаточно схожи и не превышают 0,3 logl0 ЭИД50/мл. Значительные различия установлены при исследовании печени и мочи, титр вируса в печени на 50% больше при исследовании методом культивирования в РКЭ, чем методом ОТ-ПЦР, а в моче на 84,6% больше при исследовании методом ОТ-ПЦР, чем методом культивирования в РКЭ.

5. Иммуногистохимическим исследованием установлена локализация антигена вируса гриппа А/Н51М1 в тканях головного мозга, легких, печени, почек, кишечника и лимфатических узлов, что подтверждает пантропность используемого в эксперименте вируса для кошки домашней.

6. Первые клинические признаки у кошек, введенных на второй день эксперимента в группу интранозально-инфицированных животных, зарегистрированы через 12 часов, болезнь протекала по типу респираторной инфекции, что свидетельствует о горизонтальной передаче вируса. Гибель данных особей была зафиксирована на 6 и 8 день эксперимента.

7. Основные патоморфологические изменения обнаружены в головном мозге, трахее, легких, селезенке, печени, почках, сердце, кишечнике и характеризуются воспалительными процессами, нарушением гемодинамики и морфологическом проявлении ДВС-синдрома.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Основные практические предложения нашли отражение в методических рекомендациях «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом А/Н5Ы1 в период эпизоотии гриппа птиц» одобренные, рекомендованные к изданию и практическому применению секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 6 от 24 сентября 2009г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции «Инфекционная патология ветеринарной медицины» Сибирского отделения Россельхозакадемии (протокол № 4 от 10 ноября 2009г.).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Ковалевская, Анастасия Андреевна, Омск

1. Алмазов, И.В. Атлас по гистологии и эмбриологии / И.В. Алмазов, Л.С.

2. Сутулов. М.: Медицина, 1978. - 545 с.

3. Боль, К.Г., Основы патологической анатомии сельскохозяйственных животных / К.Г. Боль, Б.К. Боль. М.: Сельхозгиз, 1954. - 606 с.

4. Вирусы гриппа и грипп. Под редакцией чл. корр. АМН СССР Д.К. Львова. М.: Медицина, 1978. - 585 с

5. Выявление в Западной Сибири высоко патогенных Н51Ч1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-Восточной Азии в 2003-2005 гг. / Г.Г. Онищенко и др. // Доклады Академии наук. 2006. - № 2. - С. 63-65.

6. Грипп. Обзор литературы / Н.С. Дудникова и др. Владимир: Изд-во ФГУ ФЦОЖ, 2005. - 59 с.

7. Диагностика и мониторинг гриппа птиц на территории Омской области: сб. науч. трудов 6-ой всерос. науч.-практ. конф. с междун. участ. 28-30 нояб. 2007г. / Н.Ф. Хатько и др. // Молекулярная диагностика 2007. - М.: Пайс, 2007. -Т. 1. - С. 217-219.

8. Донченко, A.C. Разработка> вакцины против высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1 / A.C. Донченко и др. // Ветеринария. — 2009. № 2. - С. 23-26.

9. Европейская конвенция по защите позвоночных животных используемых для экспериментов и других научных целей. // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2003. - №4. - С. 34-36.

10. Евсеенко, В.А. Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах: дис. . канд. биол. наук: 03.00.06 / Василий Александрович Евсеенко; ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Кольцово, 2007. - 125 с.

11. Ибрагимов A.A. Патологоанатомические изменения при гриппе птиц // Ветеринария. 2006. - № 4. - С. 26-27.

12. Изоляция вирусов гриппа А от диких птиц и ондатры в западной части Восточно-Азиатского миграционного русла / Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2001. -№. 4. - С. 35-39.

13. Изучение высоко патогенного H5N1 вируса гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири. / Г.Г. Онищенко и др. // Микробиология. 2006. - №5. - С. 47-54.

14. Изучение разнообразия высоко патогенных вирусов гриппа Н5Ш, вызвавших эпизоотии среди птиц на территории Западной Сибири в 2005 году / В.А. Евсеенко и др. // Доклады Академии наук. 2007. -№414.-С. 226-230.

15. Каверин, Н.В. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий / Н.В. Каверин, Ю.А. Смирнов // Вопр. вирусологии. 2003. - № 3. - С. 4-12.

16. Львов, Д.К. Вирусы гриппа: события и прогнозы / Д.К. Львов, А.Д. Забережный, Е.И. Алипер // Природа. 2006. - № 6. - С. 3-13.

17. Львов, Д.К. Миграция птиц и перенос возбудителей инфекции / Д.К. Львов, В.Д. Ильичев. М.: Наука, 1979. - 270 с.

18. Мельник, Н.Г. Диагностика вирусных болезней животных / Н.Г. Мельник. Омск: Изд. ИВМ ОмГАУ, 2001.-157 с.

19. Методические указания МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного мкроорганизмами 1-П групп патогенности"

20. Микроэволюция генома вируса гриппа типа А Н51Ч1 подтипа: сб. науч. трудов 6-ой всерос. науч.-практ. конф. с междун. участ. 28-30 нояб. 2007г. / В.А. Терновой и др. // Молекулярная диагностика 2007. -М.: Пайс, 2007. -Т. 1. - С. 189.

21. Молекулярно-биологический анализ изолятов вируса гриппа, вызвавших эпизоотии на Юге Западной Сибири и Автономной Республике Крым / Г.Г. Онищенко и др. // Ветеринарная медицина: М1жвщ. Темат. Наук. 36. Харыав, 2006. - № 87. - С. 143-150.

22. Первый прорыв нового для.России генотипа-2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа А/Н5№ на Дальнем Востоке/ Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2008. — № 5. - С. 418.

23. Птичий грипп / Т.П. Лобанова. В экспресс-бюллетене «Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф». Под ред. В.И. Покровского, Санкт-Петербург: Росток, 2006. 270"с.

24. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)"

25. Селезнева, А.Ю. Выживаемость вируса гриппа при длительном хранении / А.Ю. Селезнева // Вопросы вирусологии. 1978. - № 6. - С. 738-739.

26. Симонян, F.A., Ветеринарная гематология, / Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов. М. Колос, 1995. - 255 с.

27. Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека. / Гамбарян A.C. и др. // Молекулярная биология. 2002. - № 1. - С. 1-9.

28. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. М.: Колос, 1984. - 376 с.

29. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004 г. в Южной и Юго-Восточной Азии/ А.С. Липатов, Ю.А. Смирнов, Н.В. Каверин, Р.Г. Вебстер // Вопросы вирусологии. 2005. - Т. 50. - № 4. - С. 11-17.

30. Эволюция рецепторной специфичности гемагглютинина вирусов гриппа при пнредаче от уток к свиньям и людям. / Маринина В.П. и др. // Вопросы вирусологии. 2004. - № 4. - С. 17-21.

31. Юрлов, А.К. Новые сведения о путях пролета и районах зимовки некоторых видов птиц из южной части Западной Сибири / А.К. Юрлов,

32. B.М. Чернышов, А.П. Яновский // Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. -С. 189-192.

33. Ямникова С.С. Вирусы гриппа расширяют круг своих хозяев /

34. C.С. Ямникова, И.Т. Федякина, Б.Т. Стегний // Ветеринарная Медицина. Харьков, 2004. - №. 84. - С. 879-881.

35. Agarwal, S.B. Bird flu: a diagnostic dilemma in the present scenario. / S.B. Agarwal, N. Karavadara, V. Khakhkhar // JIACM. 2004. - № 5.- P. 345-347.

36. Alexander, D.J. A review of avian influenza in different bird species /

37. D.J. Alexander // Vet. Microbiol. 2000. - № 74 (1-2). - P. 3-13.

38. An avian influenza A virus killing a mammalian species- the mink/ B. Klingeborn et al. // Arch Virol. 1985. - Vol. 86. - P. 347-351.

39. Are ducks contributing to the endemicity of highly patogenic H5N1 influenza virus in Asia / K.M. Sturm-Ramirez et al. // J. Virol. 2005.- V. 79. № 17. -P. 1269-1279.