Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах

Евсеенко, Василий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах"

На правах рукописи

Евсеенко Василий Александрович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЯДА ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ Н5Ш -СУБТИПА, ВЫДЕЛЕННЫХ В РОССИИ В 2005-2006 ГОДАХ

03 00 06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово 2007

003162331

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

кандидат биологических наук Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Таранин Александр Владимирович кандидат биологических наук Гашникова Наталья Матвеевна

Ведущая организация

ФГУН Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л А Тарасевича Роспотребнадзора (Москва)

Защита состоится « 13 » ноября 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ГНЦ ВБ «Вектор», р п Кольцово, Новосибирская область, 630559, тел (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Авотреферат разослан «_» октября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

Малыгин Э Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. За последние десятилетия стало ясно, что битва с инфекционными болезнями никогда не будет выиграна В этот период были выявлены новые инфекции, появились вирулентные штаммы давно идентифицированных возбудителей, и значительно расширилась географическая представленность ранее известных инфекционных агентов Совокупность этих инфекций была объединена новым термином — «возникающие» заболевания (от англ слова emerging — возникающий) (Morens DM et al 2004) Появление возникающих и вновь возникающих инфекций обусловлено социально-экономическими факторами, изменяющими мировое устройство рост темпов урбанизации, проникновение человека в новые экосистемы, расширение международных торгово-экономических связей, а вместе с этим увеличение объема путешествий Вирусы гриппа А относят к одним из самых значимых для человечества возбудителей возникающих инфекционных болезней Появление высокопатогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей птичьего гриппа человеку ставят проблему новой пандемии перед мировым здравоохранением Основные эпидемии гриппа 20-го века были вызваны вирусами, произошедшими непосредственно от птичьих вирусов путем генетической реассортации между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг ) или адаптации птичьего штамма к человеку («испанка» 19181919 гг ) (Wright PF, Webster RG, 2001) В последнее время все большее значение приобретает прямая передача вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц Долгое время существовавшая концепция об ограниченности круга хозяев для возбудителей гриппа птиц рушится на глазах Доказательством тому служат два подтвержденных случая инфицирования вирусом A/H9N2 в Гонконге (Peins M, et al, 1999), вспышка А/Н7Ы7-инфекции в Нидерландах в 2003 году и регистрирующиеся с 1997 года вспышки птичьего гриппа A H5N1-субтипа среди людей (Koopmans M, et al, 2004) Особый интерес представляет возбудитель гриппа A H5N1-субтипа в связи с тем, что можно провести некоторые параллели между данным вирусом и вирусом «испанки» (подтип H1N1), явившемся причиной гибели до 40 миллионов людей во время пандемии 1918-1919 гг Подобно вирусу «испанки», вирус гриппа А Н5Ш-субтипа может передаваться непосредственно от инфицированных птиц людям, обладает необычайно высокой патогенностью и способностью вызывать генерализованную инфекцию в отсутствии ранее сформировавшегося специфического иммунитета в человеческой популяции, по крайней мере, в определенных возрастных группах Исследования циркулирующих возбудителей демонстрируют продолжающуюся эволюцию вируса и увеличение видового спектра организмов хозяев Нужно отметить угрожающую динамику каждый год происходит удвоение числа заболевших и погибших людей Все эти обстоятельства заставляют рассматривать вирус А Н5Ш-субтипа в качестве наиболее вероятной причины будущих пандемий гриппа В 2005 году в с Суздалка был зафиксирован падеж домашней птицы, который был вызван вирусом Н5Ш-субтипа В кратчайшее время вирусы распространились по территории Западной Сибири, а в

последствии в Центральных регионах и Юго-запада России В результате распространения погибло и было забито более 1 млн голов домашней птицы (Г Г Онищенко, 2006) Происходил контакт населения и больной птицы, который мог привести к заболеванию и гибели людей Поскольку это были первые случаи выявления вирусов высокопатогенного гриппа птиц Н5Ш-субтипа на территории России, актуальным являлось получение данных о фенотипических особенностях — патогенности для птиц и млекопитающих, филогенетическом положении, серологических свойствах Также было необходимо разработать животные модели гриппа птиц Н5№-субтипа для использования их при разработке вакцин и лекарственных препаратов Решению этих проблем была посвящена данная работа

Цель и задачи исследования.

Целью работы является изучение разнообразия фенотипических, молекулярно-генетических, филогенетических и серологических свойств 7 штаммов вируса гриппа птиц Н5Ш-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах

В соответствии с поставленной темой необходимо было решить следующие задачи

1 Определить нуклеотидную последовательность геномов следующих штаммов вирусов гриппа А АЛигкеу/8иг<Ыка/12/05, А/сЬ1скеп/8иг<За1ка/06/05, А/£Оозе/8игс1а1ка/10/05, А/сЫскеп/Кгазпос1аг/123/06, А/сЫ скеп/Иеэ Ыу/02/0 6 А/с1иск/Тиуа/01/06, А^оо5е/Кга5поогегзкоуе/627/05

2 Провести анализ функционально значимых районов генома

3 Определить филогенетические отношения изучаемых штаммов и их положение среди вирусов гриппа А Н5>11 -субтипа

4 Определить патогенность изучаемых штаммов для модельных животных (кур, мышей линии ВАЬВ/с, беспородных хорьков)

5 Определить серологическую кросс-реактивность антигенов изучаемых штаммов с поликлональными референс сыворотками, полученными на вирусы гриппа птиц Н5>П-субтипа, выделенных в период с 1997 по 2004 годы

6 Определить динамику изменения системной продукции 1РТ\1^атта, ЮТ-а1рЬа, ГИЬйа, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-18 при экспериментальной инфекции ВАЬВ/с мышей

Научная новизна и практическая значимость.

В данной работе проведено комплексное изучение молекулярно-генетических, филогенетических, серологических и фенотипических свойств семи штаммов вируса гриппа А Н5Ш-субтипа, выделенных на территории России в 2005 и 2006 годах

Впервые в мире было показано теоретически и подтверждено экспериментами на животных моделях, что вирусы, принадлежащие кладе 2 субкладе 2, обладают различной патогенностью для млекопитающих

Впервые в мире описано развитие геморрагического синдрома при экспериментальном заражении штаммом гриппа A H5N1-субтипа A/duck/Tuva/01/06 мышей BALB/c

Впервые в России описаны характеристики экспериментальной инфекции у мышей линии BALB/c и беспородных хорьков

Фактически были разработаны модели гриппа птиц H5N1-субтипа, которые могут быть использованы для определения алгоритмов лечения, проверки эффективности существующих и новых противогриппозных препаратов Также эти модели могут быть использованы для проверки иммуногенных и протективных свойств вакцин гриппа птиц H5N1-субтипа

Положения, выносимые на защиту.

• Молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей семи штаммов вируса гриппа, выделенных в России в 2005-2006 годах

• Результаты исследования патогенных свойств исследованных штаммов на животных моделях (мыши линии BALB/c, беспородные хорьки, куры)

• Системная гиперпродукция IFN-gamma, IL-6, IL-1 beta отягчает течение заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц H5N1- субтипа

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «2006 Keystone Symposia Conference Е7 Respiratory Viruses of Animals Causing Disease in Humans» (Сингапур, 2007), на Международной конференции «4th Vaccines All Things Considered» (Вашингтон, 2007), на Международном конгрессе общества по изучению инфекционных заболеваний (ISID) «12 International Congress on Infectious Diseases» (Лиссабон, 2006) и др (11 конференций) Опубликовано 7 статей в ведущих российских и международных журналах За изучение вирусов высокопатогенного гриппа птиц Н5М-субтипа автор удостоен премии "Novartis Vaccine Award for Epidemiology of Infectious Diseases" общества по изучению инфекционных заболеваний (International Society for Infectious Diseases, 2006) Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, раздела «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка использованной литературы (6 источников на русском языке и 103 на английском) Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 24 рисунка и одно приложение

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы вируса, использованные в исследовании, были получены из репозитория Отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Штаммы, исследованные в работе, представлены в таблице 1 Наработку стоковых растворов вирусов проводили на РКЭ Заражение проводили в аллантоисную полость 9-и дневных РКЭ Инкубировали при 37°С в течение 48-72 часов Дважды в день контролировали жизнедеятельность эмбриона овоскопированием Собирали аллантоисную жидкость, разделяли на

аликвоты, хранили при температуре -70°С до использования Серологические исследования выполняли методом РГА, РТГА, РТНА РГА РТГА проводили в I]-образных микропланшетах

Таблица 1 Штаммы, исследованные в работе

Штаммы Источник вируса Система выделения Место Год

A/duck/Tuva/01/06 Чомга (дик) РКЭ Оз Увс-Нуур, Тыва 2006

A/chicken/Krasnodar/123/06 Курица РКЭ Краснодарский край, подворье- 2006

A/chicken/Reshoty/06/06 Курица РКЭ с Решоты, НСО, подворье 2006

A/goose/Krasnoozerskoye/627 /05 Домашний гусь РКЭ п Красноозерское, НСО, гусеферма 2005

A/chicken/Suzdalka/06/05 Курица РКЭ с Суздалка, НСО, подворье 2005

А/turkey/Suzdalka/12/05 Индюк РКЭ с Суздалка, НСО, подворье- 2005

A/goose/Suzdalka/10/05 Гусь РКЭ с Суздалка, НСО, подворье 2005

Использовали 0,5% суспензию эритроцитов петуха В РТГА использовали сыворотки предоставленные Робертом Вебстером (StJude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA) Сыворотки перед использованием прогревали при 56°С, обрабатывали RDE и эритроцитами петуха В РТНА серотипировали нейраминидазу с использованием референс сывороток РНК вируса гриппа выделяли наборами "ВектоРНК - экстракция (Вектор-Бест, Россия)", SV Total RNA Isolation System (Promega, США) кДНК получали с использованием праймера UNI12, комплементарного 3' концу всех сегментов вирусного генома Также использовали набор QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, США) ПЦР проводили с праймерами, предоставленными Эриком Хоффманом (StJude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA) Продукты ПЦР разделяли в 13% агарозном геле Продукты ожидаемой длины выделяли из геля набором SNAP Gel Purification kit for agarose gels (Invitrogen Life technologies, США) Нуклеотидную последовательность геномов изученных вирусов получали с использованием набора Beckman sequencing kit и прибора BECKMAN COULTER CEQ 2000XL Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью программы VECTOR NTI V 10 (INFORMAX) Использовали алгоритм Клустал (ClustalW v 1 8) Трансляцию нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ выполняли с помощью программы MEGA V 3 1 (Kumar S , et al, 2004) Топологию филогенетических деревьев выполняли по методу ближайшего соседа (Neighbor-Joining) Матрицу дистанций вычисляли на основании данных о количестве замен Достоверность ветвления проверяли по методу Бутстреп (Bootstrap) с 500 повторами (Obenauer J С et al, 2006)

Исследовали патогенность для кур, мышей, хорьков После получения животных рассаживали по клеткам в соответствии с планом заражения В течение недели проводили осмотр на наличие признаков острых респираторных заболеваний (лихорадочные состояния, выделения из носовой полости, конъюнктивиты) Мышей и хорьков заражали интраназально Для кур определяли IVPI (intra venous pathogenity index) - индекс патогенности при внутривенном заражении Определяли базовую продукцию цитокинов при заражении штаммами A/duck/Tuva/01/06, A/turkey/Suzdalka/12/05 Для определения сывороточных уровней IFN-gamma, TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL 1-beta, IL-12 мы использовали ELISA R&D Systems kits (Minneapolis, MN, USA) Сывороточный уровень IL-18 был определен, используя коммерческий набор для определения мышиного IL-18 ELISA test kit (MBL, Nagoya, Japan) Сыворотка забиралась на 0, 3, 5, 7, 8 сутки, была разделена на аликвоты и хранилась при температуре -80°С до использования Последней точкой в эксперименте были выбраны 8 сутки, так как в ходе установочных титровок было определено среднее время до смерти, которое составило 8 ± 0,18 суток Статистический анализ проводили общепринятыми методами с использование программы STATISTICA 6 0 Различия считали достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что гемагглютинин всех исследовавшихся штаммов содержит характерный маркер высокой патогенности (PQGRRKKKRJ.GL) в сайте протеолитического расщепления Рецептор-связывающий домен гемагглютинина изучавшихся вирусов в соответствии с (Stevens J et al, 2006) является характерным для штаммов гриппа А, выделенным от птиц

У всех изучавшихся вирусов в эпитопобразующих районах не было зафиксировано замен В гене полимеразного белка 2 (РВ2) в позиции 627 для штаммов A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/SuzdaIka/12/05,

A/goose/Suzdalka/10/05 определен гистидин Для штаммов

A/chicken/Krasnodar/123/06, A/duck/Tuva/01/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/chicken/Reshoty/02/06 в данной позиции определен лизин Анализ генов неструктурного белка (NS) всех изученных штаммов выявил делецию размером в 5 аминокислот, схожую с таковой для штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, классифицированных как имеющих генотип Z На основании филогенетического анализа гемагглютинина изученных штаммов, все они были отнесены нами к группе «Цинхай»-подобных вирусов (клада 2, субклада 2) Филогенетический анализ всех генов установил наличие реассортации генов у штаммов A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 Гены NP и NS вероятнее всего происходят от вирусов, подобных штаммам A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 (Кластер 5 по гену гемагглютинина) Гены НА, NA, М, PA, РВ1, РВ2 происходят от штаммов, филогенетически принадлежащих к кластеру 4 по гемагглютинину

- Aítfii^rfMOítШ 2/2007 -А/.Й zftrhgj. эпГОО?" 11 5í30Qíi

■ ЛгАге^^шш tjt$2fáQÓ6

A/chickei

-Aícflc ktei? lyOiy Coaotft ÍS?/ 2Ш6

- Á/tft t ten/Col* (i S Г-?*; 20 D&

- Aidtck/Cole,dlvsire/1787-í й'20C6 -AíÑigeiííV6e/3007"

- AÍcÍTf с ketfKif icartf 3í20ÜS

- Aíc ti с к ег/tíl^rta/Б 41 (2006

- Ai с ft cksnrKurgatf.о и 2005

- At bar* h efrted/gooseíw aigolra/1 /70 0 5

- A/gí»s0fl-]uriC!aiy;34í 3/2 007

- А/ с W с kerW о kjagra

- AíwhooDcr- аччгапГ M on go¡ ía/& 2005

- АУ С W&tf S gyptí 1300-NAM SU 3? 2007

- А/ E gy $/902732/0 6

- Aíswa ni В! overraí ГБОГ 2006.

- A/Cy g поз ol o ¡rCz ec h fígóu blic t<¿\ 7.0/2.000

- A/cygnu* d le n'Italy/ aOB?20C6

-Am.fKíry/1í/í005

-п'-ттт

— Aíoumca fowfjN lgcrft/557'3

с/егт*й!р5 ■ fí A/tySnm o tet e ro atraíí5005

míí?

А/с hit kc nf Tu ЮГ í/2005 A/C nic ко rtfO jtiswi4/200 5 А/с hie Ke nrCxirnaa/Ü4/¿ÜO 5 A/<Jyc ki NoTOSi1}irs.lcf 56/3 0 05 A/s üo;s fefs üz da ¡ka' 10*2305. Щ A/Ch¡ckenfSu?tía>ka/a6/20Ü5 ■ AAuDtey/s^daiks/l'2/2005 ■ A/Bar-headed Gooae/Q;ngriai/5/2QOS A/fi ret e/Moyos b: rsk/29/50 05

Рисунок 1, Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей гемагглютинина изученных штаммов и современных штаммов гриппа птиц 115N1-субтипа. Топология дерева выстроена по методу ближайшего соседа па основании матрицы расстояний, рассчитанной по количеству замен. Достоверность ветвления проверялась м его дом Бутстреп (Bootstrap) с 500 повторами, с использованием программы MEGA 3 Л ♦

Анализ выведенной аминокислотной последовательности белка М2 не выявил каких-либо мутаций, характерных для ремантадин-устойчивых штаммов Таким образом, изученные штаммы являются потенциально чувствительными к ремантадину Сравнение аминокислотной последовательности нейраминидазы эталонного, устойчивого к озельтамивиру штамма А/\УиЬап/359/95 (НЗЫ2) с аналогичными последовательностями этого гена для изученных нами штаммов показало, что у штаммов нет замен, определяющих устойчивость к озельтамивиру штаммам, т е изученные штаммы являются потенциально чувствительными к озельтамивиру

Таблица 2 Уникальные аминокислотные замены, выявленные в белках исследованных штаммов

Штаммы НА КА ЫР М1 М2 N31 N32 РА РВ1 РВ2

А/ Оя/Ктпоогегвко ус/627/05 Ь8Р N2895 У80Ь 02865 - - Ь49Р 3388Н 1465У А704У 36520 М6531 Т6661 Н627К

АЛигкеу/Зиг<1а1ка/12/05 - - - - - -

А«11ск/гиуа/01/0б VIII, К13511, А512Э Р485 Р340Ь - - - 02060 М50У КОТ У4491. 347Ш Н627К

А/скскеп/КгавпойагЛ 23/06 Т52А 1223У эзгш - - • Р163Н Р2060 К220Н М50У 1226Т У521М Т552А Ь640М У44И К126К У3561 У3381 К702Б, 11731С Н627К

А/сЬ1сксп/КсзЬо1у/02/0б Б365Е - - - -

А/сЬскеп^игсЫка/ОбД» - - 1451 - -

А/йоо8е/Зик1а1ка/10/05 35091. - - - -

Патогенность для мышей линии ВАЬВ/с

Для штаммов, имеющих замену Н627К, течение заболевания было стереотипно Заболевание начиналось с лихорадки на 1-2 сутки при дозах заражения > 4 Ь§ЭИД50, на 3-5 сутки при дозах <4 1^ЭИД50 К 5-8 суткам после заражения, в зависимости от дозы заражения, развивалась выраженная дыхательная недостаточность, цианоз К 8-12 суткам после заражения развивались поражения, несовместимые с жизнью (атональная стадия), в которой мыши умертвлялись У 12% животных, зараженных нейротропными штаммами, развивались парезы нижних конечностей При вскрытии характерным признаком заболевания являются тотальные поражения легкого При исследовании вируса А/с1иск/Тиуа/01 /06 впервые были зафиксированы видимые проявления геморрагического синдрома в виде обширных внутрикожных геморрагий и геморрагий тонкого кишечника

Первоначально были определены ростовые свойства на РКЭ А/£оо8е/Кга5поогег8коуе/627/05, А/Шгкеу/ЗигсЫ ка/12/05, АМиск/Тиуа/ОШб культивировались в титрах 9,2, 9,3, 9,2 1^ЭИД50, различия являлись статистически недостоверными Изоляты А/сЬ1скеп/Кгазпос1аг/123/06, А/сЬ1скеп/Ке5Ьо1у/02/06, культивировались в титрах 8,4, 8,6 Различия по ростовым свойствам на РКЭ являлись незначительными Репликация оценивалась в тканях мозга, селезенки, почек, печени, легкого Только штамм А^оо5е/Кга8поогег5коуе/627/05 продуктивно реплицировался в селезенке, печени и почках При этом можно говорить о том, что в почках он находился в

значительных количествах Это является нехарактерным для вирусов гриппа птиц Н5Ш -субтипа на мышиной модели Репликация в мозге, напротив, характерна для исследовавшихся штаммов Даже классифицированный как низкопатогенный штамм АЛигкеу/8и2<За1ка/12/05 находился в мозге в значительном титре Все исследованные штаммы эффективно реплицировались и выделялись в значительных титрах в легких Здесь можно выделить штаммы А/с1искеп/11е81ю1у/02/06 и А/§оо5е/Кга5поогегзкоуе/б27/05, при заражении которыми титры вируса в легких достоверно выше, чем у других исследованных высокопатогенных и низкопатогенных штаммов

Таблица 3 Основные вирусологические показатели экспериментальной инфекции, вызванной исследованными штаммами гриппа А Н5Ш -субтипа

|Штаммы ЭЦДм*« МИДа, млм Органы

Лёгкие Селезёнка Мозг Печень Почка

А/коо$е/Бгахпо охег$коуе/627/05 9,2 2,2 ± 0,2 23 ± 0,3 6,1 ±03 1,6 ±0,5 5,2 ± ОД 1,6 ± 03 2,6 ±0,2

А/И1гкеу/8ииЫка/12/05 93 5,3 ± 0,4 63 ± ОД 4,1 ± 0,5 <1 23 ± 0,5 <1 <1

АМиек/ТпуаЛШб 9,2 1,4 ± 0,3 1,4 ± ОД 53 ± 0,4 <1 3,4 ± 03 <1 <1

А/с1цскепЛСга$п0|1а1У123/0б 8,4 2,1 ± 0,4 23 ± 0,4 4,7 ±0,6 <1 3,1 ±0,7 <1 <1

А/скскеп/Не11м1уЛ)2у0б 8,6 1,2 ± 0,3 13 ± од 6,7 ±0,4 <1 4Д±03 <1 <1

Примечание Данные выражены в ЭИД50 Данные о стандартном отклонении при титровании органов получены на основании результатов 3 мышей Данные представлены как среднее ± Б Б

Для штаммов А/с1пскеп/Кга5пос1аг/123/06, АЛ1иск/Тиуа/01/06, АЛигкеу/Би2с1а1ка/12/05 полученные значения высоки и статистически неразличимы Для мышей, зарашенных штаммом А/ёиск/Тиуа/01 /06 было определено среднее время жизни При заражении стандартной дозой вируса в 5 МЛД50 оно составило 8 ± 0,18 суток после заражения

Патогенность для беспородных хорьков

Патогенность для хорьков определялась в ходе экспериментов по интраназальному заражению Степень патогенности оценивалась комплексно определялись титры в носоглоточных смывах, тканях органов Оценивали состояние животных Отмечали появление симптомов поражения ЦНС Для каждого исследованного штамма проводили эксперимент следующего дизайна На один штамм вируса в эксперимент брали 6 животных Заражали стандартной дозой в 105 ЭИД50 интраназально Начиная с первых суток после заражения, брали смывы из носоглотки На 5 сутки после заражения 3 хорьков из группы хорьков умертвляли, забирали головной мозг и внутренние органы

Таблица 4 Сводные данные характеризующие исследованные вирусы на хорьковой модели

Штаммы Титры вируса в органах и моче

мозг легкое селезенка кишечник печень почка моча

АЛпгк«>у/5о1с1а1каЛ2Л>5 2 3±0 5 4 1±0 6 0 0 0 0 0

М31/Кгазпоохег$коуе/627Л)5 5 2±0 2 6 1±0 3 1 6±0 5 0 1 6±0 3 2 6±0 2 0

А/сЬ1скеп/КгатойагЛ23/0б 4 8±04 4 3±0 4 0 1 3±0 4 4 7±0 5 1 2±0 4 1 5±0 5

А/с Ы скепЖе {ЬогуЛЦЛб 5 1 ± 0 3 6 3 ± 0 4 0 2 4+0 3 3 45 ±0 3 3 3±0 3 0

А/.1искЛи»аЛ1ЛМ 3 Ш6 4 0±0 7 0 0 0 1 25±0 5 0

Примечание Титры вирусов в тканях органов и моче выражены в Ьс^ЭИД50 Титры вируса определены для 100 мкг ткани и 100 мкл мочи, взятые от животных умерщвлены на 5 сутки после заражения Данные представлены как среднее ± Б Б

Таблица 5 Титры исследованных вирусов в мазках из зева хорьков

Штаммы Титр вируса в мазках из зева хорьков

1 г 3 4 5 6 7 г 9 10 11 12

АЛигклу/Яи 1а1ка/12/05 2 4±0 5 1 9±0 7 1 7±0 7 1±0 5 1 0 0 0 0 0 0 0

А/С5/Кгым«хегака)«/627Л4 4 0±0 9 4 9±1 4 9±0 8 4 9±0 8 6±0 7 6±0 6 1 9±0 б 1 4±0 5 1 1±0 3 1±0 3 1 0

Л/сНккгж/Кгим4агЛ23Я£ 4 3±0 б 4 4±0 7 4±0 7 4±0 8 3 1±0 8 2 3±1 2 0 0 0 0 0 0

Л/еЫскепЛгес1ш*уЛ]2Л)б 3 8±0 7 3 1±1 5 3 6±0б 3 6±0 4 3 3±0 5 1±0 9 X X X X X X

Л/*кк/Т«уаЛ)1/1)6 4 8±0 4 5 3±0 5 5 5±0 7 4 8±0 9 3 7±0 5 3 6±0 4 2 4±0 5 0 0 0 0 0

Примечание Титры вирусов в мазках выражены в Ьс^ЭИД50 Мазки брались с 1 по 12 сутки после заражения Х- все животные умерли Данные представлены как среднее ± Б Э

Штаммы А/с1пскеп/Кгазпос1аг/123/06, А/с1иск/Тиуа/01/06,

А/с1искеп/Н.е51ю1у/02/06, А^оо5е/Кгазпоогегзкоуе/627/05 нами были

охарактеризованы как высокопатогенные для хорьков А/Тигкеу/5игёа1ка/12/05 как низкопатогенный

Результаты 1УР1-теста

Таблица 6 Результаты 1УР1 теста, стандартного теста, определяющего степень патогенности штаммов вируса гриппа А Н5Ш-субтипа

Штаммы IVPI индекс

A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 2,9

A/turkey/Suzdalka/l 2/05 2,7

А/duck/Tuva/01/06 3

A/chicken/Krasnodar/123/06 3

A/chicken/Reshoty/02/06 2,7

Примечание Высокопатогенными для кур считают штаммы, с индексом > 2,5

Результаты РТГА с референс сыворотками

Для определения антигенных свойств мы использовали реакцию торможения гемагглютинации с сыворотками, полученными на штаммы гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенные на территории Юго-Восточной Азии Были выбраны сыворотки, полученные к штаммам, выделявшимся последовательно с 1997 года Значимые титры кросс-реактивности с изучавшимися штаммами проявляют сыворотки A/Gs/HK/99, А/НК/213/03, A/VN/1203/04 Так как достоверность метода ограничена двумя разведениями, о достоверных различиях между ними говорить трудно, однако можно выделить сыворотку против Gs/HK/99 Данный эксперимент являлся моделированием нейтрализующих процессов в системе in vivo, то есть моделирование иммунизации различными вариантами препаратов Полученные данные позволяют говорить, что антигенно вирусы «Цинхайской» группы дивергировали от остальных групп, но степень дивергенции низка

Таблица 7 Результаты реакции торможения гемагглютинации Использовали антигены штаммов вирусов гриппа птиц Н5Ш-субтипа, исследованных в работе

Штаммы Политональные сыворотки

НКЛ56/97 Gs/HK№ HK/213/03 VN/1203/D4 A/Píachinbn/6231/04

A/turkev/Suzdalka/12/05 10 160 160 160 20

A/chicken/Suzdalka/06/05 10 320 80 so 10

A/goose/Suzdalka/10/05 10 320 80 80 20

A/goose/ECrasnoozerskoe/627/05 10 160 80 80 10

A/duck/Tuva/01/2006 JO 640 160 160 40

A/chicken/Krasnodar/123/06 20 640 320 320 40

A/chicken/Reshoty/02/06 20 640 320 320 40

Характеристика цитокинового ответа при экспериментальной инфекции группам птиц

Поскольку в заболевании человека ключевую роль играют INF-gamma, IL1-beta. IL-б — провоепалительные цнтокины острой фазы заболевания, то и в мышиной модели мы оценивали уровни продукции этих цитокинов. Мы исследовали системную продукцию IL-12 — индуктора пролиферации НК и дифференциаций Т-лимфопитов в Thl- лимфоциты. Макрофагальпый IL-18 — синергист 1L-12 активатор продукции IFN-gamma. Также мы определяли системную продукцию TNT-alpha и противовоспалительного цитокина IL-10. Уровень цитокинов определяли методом ELISA.

Рисунок 2. Динамика изменения концентрации IFN-gamma, IL-lbeta, TNlH'-alpha. IL-6 в Сыворотке крови мышей линии BALB/c, заражённых интраназально ЮгЭЩЬ0 A/diick/Tuva/01/06 и A/turkey/Suzdalka/12/05.

IFN-gamma

Примечание. На графиках указаны средние значения. Стандартное отклонение получено при измерении концентрации в сыворотке 3 мышей, п.й - не детектировался.

Экспериментальное заболевание было вызвано двумя штаммами — АЛ)иск'Тиу а/01/06 и ЛЛш'ксу/ЗигсЫка/12/05. Штамм Л^иек/Тиуа/О1/06 является высокопатогеииым для мышей линии БАЬВ/с, АЛшкеу/8 игс!а1 кш' 12/05 низкопатогенным и ири инфицирующей дозе в 1 (ГЭПД;0 только штамм

А/с1иск/Тиуа/01/06 вызывал продуктивную инфекцию Штамм АЛигкеу/8иг<1а1ка/12/05 фактически являлся отрицательным контролем Минимальная концентрация Ш^-датта в сыворотке мышей, зараженных штаммом А/с1иск/Тиуа/01/06, была зафиксирована на 5 сутки (14,3±10,8 пг/мл), уровень вырос почти 8-кратно до 256±27 пг/мл при прогрессивном течении инфекции в сравнении с уровнями в сыворотке интактных животных У мышей, зараженных штаммом АЛигкеу/ЗигсЫкаЛ 2/05, повышение наблюдали на 3 сутки с последующим снижением до уровней базовой продукции (рисунок 2) На 3 и 5 сутки системная продукция ЮТ-а1рЬа в сыворотке мышей зараженных штаммом А/ёиск/Тиуа/01/06 была ниже предела определения использованного набора Максимальное значение было зафиксировано на 7 сутки и составило 24 ± 3,2 пг/мл, и уровень оставался повышенным до 8 суток

У мышей, зараженных штаммом АЛигкеу/8игс1а1ка/12/05, наблюдали экспрессию на базовом уровне в течение всего периода наблюдения Интересно, что концентрация 1Ь-1 Ье1а у мышей, зараженных штаммом А/с1иск/Тиуа/01/06, была значимо меньше в сравнении к конститутивно экспрессирующимися количеством этого цитокина Неожиданно, что снижение 1Ь-1Ье1а было отмечено на 3 сутки, но в дальнейшем наблюдалось шаговое повышение уровня к 5 суткам и далее У мышей, зараженных штаммом АЛигкеу/8игс1а1ка/12/05, не наблюдалось каких-либо аномалий уровней и в течение всего срока наблюдения фиксировались базовые уровни После 2,5 кратного поднятия к 3 суткам уровни 1Ь-6 значительно снизились к 5 суткам, но высшие значения наблюдались к 8 суткам и составили 133±12 пг/мл У мышей, зараженных штаммом АЛигкеу/81К(1а1ка/12/05, незначительное увеличение уровня было отмечено на третьи сутки после заражения с последующей стабилизацией Конститутивная продукция 1Ь-10 была за пределами детектирования Динамика 1Ь-10 показала рост с максимальным уровнем в 92,1±6,0 пг/мл, достигнутом в атональном состоянии У мышей, зараженных штаммом АЛигкеу/8игс1а1ка/12/05, уровни поднимались к 5 суткам после заражения, с последующим снижением (рисунок 3) Мы зафиксировали статистически значимое повышение 1Ь-12 после заражения штаммом А/с1иск/Тиуа/01/06 Концентрации этого цитокина остались стабильными, исключая неожиданное снижение к 7 суткам Экспрессия 1Ь-18 не детектировалась в течение всего периода наблюдения как у мышей зараженных штаммом А/с1иск/Тиуа/01/06 так и АЛигкеу/5игс1а1 ка/12/05

Рисунок 3, Динамика изменения концентрации 1Ь-10,1Ь-12 в сыворотке кропи мышей линии В А1.В/с, заражённых интраназально 102ЭИД5О А/йиеЬ/Тиуа/О1 /06 и АЧигксу/8и2Йа1ка/12/05.

ез avducbtuva/ulj'df. IIB Mujkeyi'Suzd,! ka/12/03

ш A/duL^Tu vu'Oii'Oe jnin ^u'lmkgyi'S ugJ.il aoñ

Примечание. На графиках указаны средние значения. Стандартное отклонение получено при измерении концентрации в сыворотке 3 мышей, л.с! - не детектировался.

Благодарности. Автор благодарит коллег по лаборатории и сотрудников ГНЦ Btí «Вектор» Роспотребнадаора, в тесном с(утру, днйчестр.с: г, которыми пыпа выполнена диссертационная работа. Так -же автор благодарит А.С Липатова за поддержку и рекомендации по дизайну экспериментов. Е. Hoffman за предоставление панели праймеров для амплификации и сиквенса геномов исследованных пиру сон, R.G. Webster за организацию и поддержку сиквенса в SíJude Chiklrens Research hospital, Memphis, TN.

Выводы

1, Впервые определены полноразмерные нуклеотидные последовательности геноййв следующих штаммов вирусов гриппа A/chLcken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/go о se/Krasn о oze г s koy e/627/05, A/chícken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/duck/Tuva/ÓI/06. На основании филогенетического анализа последовательностей всех генов вышеуказанных штаммов было показано, что все исследованные штаммы принадлежат кладе 2 субклады 2, или так называемым «Цинхай» - подобным штаммам вируса гриппа А подтипа H5N1-субтипа.

2. Анализ районов «петля 130», «петля 220», «спираль 190» показал, что все изученные штаммы имеют структуру рсцептор-связывающсго домена, характерную для вирусов, циркулирующих в популяциях птиц. Аминокислотных замен в антигенно значимых районах геммагглютинина у данных штаммов вируса не обнаружено, В РТГА с референс сыворотками к вирусу гриппа А H5N1-субтипа также была подтверждена серологическая однородность изученных штаммов. Было показано отсутствие замен, характерных для

лекарственно устойчивых (ремантадин и озельтамивир) штаммов вируса гриппа А

3 Установлено наличие реассортации генов у штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 Гены NP и NS вероятнее всего происходят от вирусов, подобных штаммам A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/SuzdaIka/10/05 (Кластер 5 по гену гемагглютинина) Гены НА, NA, М, PA, РВ1, РВ2 происходят от вирусов, филогенетически принадлежащих к кластеру 4 по гемагглютинину

4 Определена патогенность изученных штаммов для модельных животных -кур, мышей линии BALB/c, и беспородных хорьков Было показано, что все изученные штаммы высоко патогенны для кур (индекс патогенности от 2,6 до 3), но делятся на две группы по патогенности для млекопитающих — мышей и хорьков штаммы A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey /Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 низкопатогенны, а штаммы A/goose/krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 A/chicken/Krasnodar/123/06 и A/chicken/Reshoty/02/06 - высокопатогенны для данных животных

5 У низкопатогенных для мышей линии BALB/c и беспородных хорьков штаммов A/chicken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05 в 627 позиции белка РВ2 находится гистидин (Н), в то время как у высокопатогенных A/chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 находится лизин (К) Что может говорить о связанности данных генетического и фенотипического признаков

6 Нами впервые было показано, что цитокины IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 играют очень важную, если не ключевую, роль в патогенезе гриппа птиц H5N1-субтипа у мышей Показано увеличение уровней IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 в сыворотке крови в 8, 3 и 4 раза, соответственно, к моменту гибели мышей

Список публикаций по теме работы:

1 Евсеенко В.А, Зайковская А В, Терновой В А, Дурыманов А Г, Золотых С И, Рассадкин Ю Н, Липатов А С, Webster R G, Шестопалов А М, член корр РАН Нетесов С В Изучение разнообразия высоко патогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотии среди птиц на территории Западной Сибири в 2005 году // Доклады АН, 2007, №4, стр 226-230

2. Evseenko VA, Bukin ЕК, Zaykovskaya AV, Sharshov KA, Ternovoi VA, Ignatyev GM, Shestopalov AM Experimental infection of H5N1 HPAI in BALB/c mice // Virol J 2007 Jul 27, 4(1) 77

3 Aleksandr S Lipatov*, Vasily A. Evseenko*, Hui-Ling Yen, Anna V Zaykovskaya, Alexander G Durimanov, Sergey I Zolotykh, Sergey V Netesov, Ilya G Drozdov, Gennadiy G Onishchenko, Robert G Webster and Alexander M Shestopalov Influenza (H5N1) Viruses in Poultry, Russian Federation, 2005-2006 // Emerg Infect Dis 2007, Vol 13, No 4 April p 539-546 * Эквивалентный вклад в выполненную работу

4 Г Г Онищенко, А М Шестопалов, В А Терновой, В.А. Евсеенко, А Г Дурыманов, Ю Н Рассадкин, А В Зайковская, С И Золотых, А К Юрлов, В Н Михеев, С В Нетесов, И Г Дроздов Изучение высокопатогенного H5N1 вируса

гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири // Журн Микробиол , 2006 №5, с 47-54

5 Shestopalov AM, Durimanov AG, Evseenko VA, Ternovoi VA, Rassadkin YN, Razumova YV, et al H5N1 Influenza virus from domestic birds, Western Siberia, Russia // Emerging infection diseases (EID), 2006, 2006 Jul, 12(7) 1167-9

6 Evseenko V.A, Zaikovskaya A V, Lipatov A S, Shestopalov A M Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005 // International Journal of Infectious Diseases (IJID) supplemental edition, 2006, June

7 Г Г Онищенко, A M Шестопалов, В А Терновой, В.А. Евсеенко, А Г Дурыманов, Ю Н Рассадкин, Ю В Разумова, А В Зайковская, С И Золотых, С В Нетесов, JIС Сандахчиев Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-Восточной Азии в 2003-2005 гг // Доклады АН, 2006, №2, стр 63-65

Тезисы докладов

8. Evseenko V.A., Zaykovskaya А V , Ignatyev G М , Shestopalov А М , Drozdov

I G Lethal mouse model based on strain A/Grebe/Tuva/01/06 2006 Keystone Symposia Conference E7 Respiratory Viruses of Animals Causing Disease in Humans Poster presentation

9 Evseenko V.A., Zaykovskaya A V , Ignatyev G M , Shestopalov A M Lethal mouse model of H5N1 HPAI based on a novel strain of 2006 4th Vaccines All Things Considered November 16-17, 2006, Washington D С Poster presentation 10. Evseenko V.A, Zaikovskaya A V, Lipatov A S, Shestopalov A M Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005 12 International Congress on Infectious Diseases, Lisbon June 15-19, Portugal 2006 Oral presentation

II Shestopalov A M , Evseenko V.A., Ternovoy V A , Durimanov A G , Zolotykh ZI, Urlov А К, Netesov S V The study of genetic variety of influenza A viruses of highly pathogenic H5N1 subtype that were isolated during the epizooty in period from 2005 to 2006 in Russian Federation First international Conference on Avian Influenza in Humans, Institut Pasteur, Paris-France, June 29-30, 2006 Poster presentation

12 Шестопалов A M , Евсеенко В.А., Терновой В A , Дурыманов А Г , Золотых С И, Юрлов А К, Нетесов С В Дроздов И Г Изучение генетического разнообразия вирусов высоко патогенного гриппа А подтипа H5N1, выделенный в ходе эпизоотии 2005-2006 гг в России III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006 Доклад Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием Новосибирск 2729 сентября 2006 Новосибирск Цэрис 2006, с 244- 245

13 Шестопалова JIВ , Шаркова Т В , Евсеенко В. А., Зайковская А В , Юшков Ю Г , Шестопалов А М Изучение морфологических изменений тканей птиц при экспериментальном заражении высокопатогенными вирусом гриппа H5N1 III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006 Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным

участием Новосибирск 27- 29 сентября 2006 Новосибирск Цэрис 2006, с 244245

14. Евсеенко В.А., Зайковская АВ, Терновой В А, Дурыманов АГ, Золотых С И , Рассадкин Ю Н, Шестопалов А М , Нетесов С В , Дроздов И Г Изучение разнообразия Высокопатогенных вирусов гриппа Н5Ш, вызвавших эпизоотию в Западной Сибири III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006 Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием Новосибирск 27- 29 сентября 2006 Новосибирск Цэрис 2006, с 232-233

15. Евсеенко В. А., Терновой В А, Зайковкая АВ, Золотых СИ, Дурыманов А Г , Рассадкин Ю Н, Кононова Ю В , Юшков Ю Г, Нетесов С В , Шестопалов А М Генотипичекое разнообразие вирусов гриппа А типа Н5Ш, выделенных от домашних птиц во время летней и осенней эпизоотии 2005 года в нескольких районах новосибирской области Инфекционные болезни проблемы здравоохранения военной медицины Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006 г Доклад Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им С М Кирова Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с 102- 103

16 Зайковская А В, Евсеенко В.А., Шестопалов АМ Изучение патогенных свойств вирусов гриппа Н5Ы1, выделенных в новосибирской области в 2005 году Инфекционные болезни проблемы здравоохранения военной медицины Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006 г Доклад. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им С М Кирова Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с 122- 123

17 Яцышина С Б , Подколзин А Т , Терновой В А , Евсеенко В.А., Шестопалов А М , Краснова Т В , Обухов И Л , Нетесов С В , Шипулин Г А , Малеев В В Апробация ПЦР-Тест-Систем для выявления вируса гриппа птиц Генодиагностика инфекционных болезней НСО 25-27 октября 2005 Доклад Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им С М Кирова Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с 174- 177

18 Щелканов М Ю , Шестопалов А М , Цэреноров Д , Золотых С И , Раумова Ю В , Кононова Ю В , Славский А А, Петренко М С , Галкина И В , Евсеенко В.А., Епанчинцева А В , Абмед Д, Аристова В А , Морозова Т Н, Альховский С В , Юрлов А К , Терновой В А , Локтев В Б , Громашевский В Л , Нетесов С В , Львов Д К Комплексное вирусологическое обследование птиц западносибирского пролетного пути результаты исследований по Гранту РФФИ-03-04-49158 Генодиагностика инфекционных болезней НСО 25-27 октября 2005 Доклад Материалы Российской научно- практической конференции Новосибирск Цэрис 2005, с 170- 173

Награды

За изучение вирусов высокопатогенного гриппа птиц H5N1-субтипа автор удостоен премии "Novartis Vaccine Award for Epidemiology of Infectious Diseases" общества по изучению инфекционных заболеваний (International Society for Infectious Diseases, 2006)

Подписано к печати 2 октября 2007 г Тираж 100 экз Заказ № 614 Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евсеенко, Василий Александрович

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор Литературы.

1.1 История открытия вирусов гриппа.

1.2 Пандемии.

1.3 Структура вириона.

1.4 Химический состав вирусной частицы.

1.5 История возникновения вирусов гриппа птиц H5N1 -субтипа.

1.6 Филогенетический анализ.

1.7 Патогенность.

1.8 Молекулярные маркёры фенотипических свойств вирусов.

1.8.1 Молекулярные маркёры устойчивости к лекарственным препаратам (ремантадину, озельтамивиру).

1.9 Животные модели.

1.10 Заболевание человека.

1.10.1 Клиническая картина заболевания.

1.10.2 Диагностический алгоритм.

1.10.3 Этиотропная терапия птичьего гриппа.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1 Результаты молекулярно-генетического анализа.

3.2 Результаты филогенетического анализа.

3.3 Патогенность для мышей.

Список использовавшихся сокращений

ВГП - вирус гриппа птиц

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛД50 - 50% летальная доза

МЛД50 - 50% мышиная летальная доза

НК - натуральный киллер

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДС (ARDS) - респираторный дистресс синдром

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТОРС - тяжёлый острый респираторный синдром

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

ЮАР - Южно Африканская Республика

IVPI - intra venous pathogenity index (индекс патогенности при внутривенном введении)

РА - полимеразный белок

РВ1 - полимеразный белок

РВ2 - полимеразный белок

НА - гемагглютинин

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеин

NS - неструктурный белок

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах"

Актуальность работы

За последние десятилетия стало ясно, что битва с инфекционными болезнями никогда не будет выиграна. В этот период были выявлены новые инфекции, появились вирулентные штаммы давно идентифицированных возбудителей, и значительно расширилась географическая представленность ранее известных инфекционных агентов. Совокупность этих инфекций была объединена новым термином -«возникающие» заболевания (от англ. слова emerging - возникающий) (Morens D.M. et al. 2004). Появление возникающих и вновь возникающих инфекций обусловлено социально-экономическими факторами, изменяющими мировое устройство: рост темпов урбанизации, проникновение человека в новые экосистемы, расширение международных торгово-экономических связей, а вместе с этим увеличение объёма путешествий.

Вирусы гриппа А относят к одним из самых значимых для человечества возбудителей возникающих инфекционных болезней. Появление высокопатогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей птичьего гриппа человеку ставят проблему новой пандемии перед мировым здравоохранением. Основные эпидемии гриппа 20-го века были вызваны вирусами, произошедшими непосредственно от птичьих вирусов путем генетической реассортации между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг.) или адаптации птичьего штамма к человеку («испанка» 1918-1919 гг.) (Wright P.F.,Webster R.G., 2001). В последнее время всё большее значение приобретает прямая передача вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц. Долгое время существовавшая концепция об ограниченности круга хозяев для возбудителей гриппа птиц рушится на глазах.

Доказательством тому служат два подтвержденных случая инфицирования вирусом A/H9N2 в Гонконге (Peiris М. et al., 1999), вспышка А/Н7Ш-инфекции в Нидерландах в 2003 году (Koopmans М. et al, 2004) и регистрирующиеся с 1997 года вспышки птичьего гриппа A H5N1-субтипа среди людей (WHO, 2007).

Особый интерес представляет возбудитель гриппа A H5N1-субтипа в связи с тем, что можно провести некоторые параллели между данным вирусом и вирусом «испанки» (подтип H1N1), явившемся причиной гибели до 40 миллионов людей во время пандемии 1918-1919 гг. Подобно вирусу «испанки», вирус гриппа A H5N1-субтипа может передаваться непосредственно от инфицированных птиц людям, обладает необычайно высокой патогенностью и способностью вызывать генерализованную инфекцию в отсутствии ранее сформировавшегося специфического иммунитета в человеческой популяции, по крайней мере, в определённых возрастных группах. Исследования циркулирующих изолятов возбудителя демонстрируют продолжающуюся эволюцию вируса и увеличение видового спектра организмов хозяев. Нужно отметить угрожающую динамику: каждый год происходит удвоение числа заболевших и погибших людей. Все эти обстоятельства заставляют рассматривать вирус A H5N1-субтипа в качестве наиболее вероятной причины будущих пандемий гриппа.

В 2005 году в с. Суздалка был зафиксирован падёж домашней птицы, который был вызван вирусом H5N1-субтипа. В кратчайшее время вирусы распространились по территории Западной Сибири, а в последствии в Центральных регионах и Юго-запада России. В результате распространения погибло и было забито более 1 млн. голов домашней птицы (Онищенко Г.Г., 2006). Происходил контакт населения и больной птицы, который мог привести к заболеванию и гибели людей. Поскольку это были первые случаи выявления вирусов высокопатогенного гриппа птиц H5N1 -субтипа на территории России, актуальным являлось получение данных о фенотипических особенностях - иатогенности для птиц и млекопитающих, филогенетическом положении, серологических свойствах. Также было необходимо разработать животные модели гриппа птиц H5N1 -субтипа для использования их при разработке вакцин и лекарственных препаратов. Решению этих проблем была посвящена данная работа.

Цель

Целью работы является изучение разнообразия фенотипических, молекулярно-генетических, филогенетических и серологических свойств 7 штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах. Задачи

1. Определить нуклеотидную последовательность геномов следующих штаммов вирусов гриппа A: A/turkey/Suzdalka/12/05, A/chicken/Suzdalka/06/05, А/goose/Suzdalka/10/05, A/chicken/Krasnodar/123/06 A/chicken/Reshoty/02/06. A/duck/Tuva/01 /06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

2. Провести анализ функционально значимых районов генома.

3. Определить филогенетические отношения изучаемых штаммов и их положение среди вирусов гриппа A H5N1-субтипа.

4. Определить патогенность изучаемых вирусов для модельных животных (кур, мышей линии BALB/c, беспородных хорьков).

5. Определить серологическую кросс-реактивность антигенов изучаемых штаммов с поликлональными референс сыворотками, полученными на вирусы гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в период с 1997 по 2004 годы.

6. Определить динамику изменения системной продукции IFN-gamma, TNF-alpha, IL-lbeta, IL-6, IL-10, IL-18 при экспериментальной инфекции BALB/c мышей.

Научная новизна и практическая значимость

В данной работе проведено комплексное изучение молекулярно-генетических, филогенетических, серологических и фенотипических свойств семи штаммов вирусов гриппа A H5N1 -субтипа, выделенных на территории России в 2005 и 2006 годах.

Впервые в мире описано развитие геморрагического синдрома при экспериментальном заражении штаммом гриппа A H5Nl-cy6rana A/duck/Tuva/01/06 BALB/c мышей.

Впервые в России описаны характеристики экспериментальной инфекции у мышей линии BALB/c и беспородных хорьков.

Были получены данные о серологической кросс-реактивности антигенов вирусов, принадлежащих кладе 2 субкладе 2 с сыворотками, полученными против вирусов, принадлежащих кладе 1.

Фактически были разработаны модели гриппа птиц H5N1-субтипа, которые могут быть использованы для определения алгоритмов лечения, проверки эффективности существующих и новых противогриппозных препаратов. Также эти модели могут быть использованы для проверки иммуногенных и протективных свойств вакцин гриппа птиц H5N1-субтипа.

Апробация работы

Список публикаций по теме работы:

1. Бвсеенко В.А, Зайковская А.В, Терновой В.А, Дурыманов А.Г, Золотых С.И, Рассадкин Ю.Н, Липатов А.С, Webster R.G, Шестопалов А.М, член. корр. РАН Нетесов С.В. Изучение разнообразия высоко патогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотии среди птиц на территории Западной Сибири в 2005 году // Доклады АН 2007,414:226-30.

2. Evseenko VA, Bukin ЕК, Zaykovskaya AV, Sharshov KA, Ternovoi VA, Ignatyev GM, Shestopalov AM. Experimental infection of H5N1 HPAI in BALB/c mice.// Virol J. 2007 Jul 27;4(1):77

3. Aleksandr S. Lipatov*, Vasily A. Evseenko*, Hui-Ling Yen, Anna V. Zaykovskaya, Alexander G. Durimanov, Sergey I. Zolotykh, Sergey V. Netesov, Ilya G. Drozdov, Gennadiy G. Onishchenko, Robert G. Webster and Alexander M. Shestopalov. Influenza (H5N1) Viruses in Poultry, Russian Federation, 2005-2006. // Emerg Infect Dis 2007, Vol 13, No 4. April p. 539-546. Эквивалентный вклад в выполненную работу

4. Г.Г. Онищенко, A.M. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, А.В. Зайковская, СМ. Золотых, А.К. Юрлов, В.Н. Михеев, С.В.Нетесов, И.Г. Дроздов. Изучение высокопатогенного H5N1 вируса гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири. // Журн. Микробиол., 2006 №5, с. 47-54

5. Shestopalov AM, Durimanov AG, Evseenko VA, Ternovoi VA, Rassadkin YN, Razumova YV, et al. H5N1 Influenza virus from domestic birds, Western Siberia, Russia. // Emerging infection diseases (EID), 2006, 2006 Jul; 12(7):1167-9.

6. Evseenko V.A, Zaikovskaya A.V, Lipatov A.S, Shestopalov A.M. Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005 // International Journal of Infectious Diseases (IJID) supplemental edition, 2006, June.

7. Г.Г. Онищенко, A.M. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, Ю.В. Разумова, А.В. Зайковская, С.И. Золотых, С.В. Нетесов, JI.C. Сандахчиев. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-Восточной Азии в 20032005 гг. // Доклады АН, 2006, №2, стр. 63-65. Тезисы докладов

8. Evseenko V.A., Zaykovskaya A.V., Ignatyev G.M., Shestopalov A.M., Drozdov I.G. Lethal mouse model based on strain A/Grebe/Tuva/01/06. 2006 Keystone Symposia Conference E7: Respiratory Viruses of Animals Causing Disease in Humans. Poster presentation.

9. Evseenko V.A., Zaykovskaya A.Y., Ignatyev G.M., Shestopalov A.M. Lethal mouse model of H5N1 HPAI based on a novel strain of 2006. 4th Vaccines: All Things Considered November 16-17, 2006, Washington D.C. Poster presentation.

10. Evseenko V.A, Zaikovskaya A.V, Lipatov A.S, Shestopalov A.M. Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005. 12 International Congress on Infectious Diseases, Lisbon June 15-19, Portugal 2006. Oral presentation.

11. Shestopalov A.M., Evseenko V.A., Ternovoy V.A., Durimanov A.G., Zolotykh Z.I., Urlov A.K., Netesov S.V. The study of genetic variety of influenza A viruses of highly pathogenic H5N1 subtype that were isolated during the epizooty in period from 2005 to 2006 in Russian Federation. First international Conference on Avian Influenza in Humans, Institut Pasteur, Paris-France, June 29-30, 2006. Постер.

12. Шестопалов A.M., Евсеенко B.A., Терновой B.A., Дурыманов А.Г., Золотых С.И., Юрлов А.К., Нетесов С.В. Дроздов И.Г. Изучение генетического разнообразия вирусов высоко патогенного гриппа А подтипа H5N1, выделенный в ходе эпизоотии 2005-2006 гг. в России. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Доклад. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 244- 245.

13. Шестопалова J1.B., Шаркова Т.В., Евсеенко В.А., Зайковская А.В., Юшков Ю.Г., Шестопалов A.M. Изучение морфологических изменений тканей птиц при экспериментальном заражении высокопатогенными вирусом гриппа H5N1. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 244- 245.

14. Евсеенко В.А., Зайковская А.В., Терновой В.А., Дурыманов А.Г., Золотых С.И., Рассадкин Ю.Н., Шестопалов A.M., Нетесов С.В., Дроздов И.Г. Изучение разнообразия Высокопатогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотию в Западной Сибири. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 232- 233.

15. Евсеенко В.А., Терновой В.А., Зайковкая А.В., Золотых С.И., Дурыманов А.Г., Рассадкин Ю.Н., Кононова Ю.В., Юшков Ю.Г., Нетесов С.В., Шестопалов A.M. Генотипичекое разнообразие вирусов гриппа А типа H5N1, выделенных от домашних птиц во время летней и осенней эпизоотии 2005 года в нескольких районах новосибирской области. Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения военной медицины. Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006 г. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 102- 103.

16. Зайковская А.В, Евсеенко В.А., Шестопалов A.M. Изучение патогенных свойств вирусов гриппа H5N1, выделенных в новосибирской области в 2005 году. Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения военной медицины. Санкт

Петербург, 22-24 марта 2006 г. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 122-123.

17. Яцышина С.Б., Подколзин А.Т., Терновой В.А., Евсеенко В.А., Шестопалов A.M., Краснова Т.В., Обухов И.Л., Нетесов С.В., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Апробация ПЦР-Тест-Систем для выявления вируса гриппа птиц. Генодиагностика инфекционных болезней. НСО 25-27 октября 2005. Доклад. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 174- 177.

18. Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M., Цэреноров Д., Золотых С.И., Раумова Ю.В., Кононова Ю.В., Славский А.А., Петренко М.С., Галкина И.В., Евсеенко В.А., Епанчинцева А.В., Абмед Д., Аристова В.А., Морозова Т.Н., Альховский С.В., Юрлов А.К., Терновой В.А., Локтев В.Б., Громашевский В.Л., Нетесов С.В., Львов Д.К. Комплексное вирусологическое обследование птиц западносибирского пролётного пути: результаты исследований по Гранту РФФИ-03-04-49158. Генодиагностика инфекционных болезней. НСО 25-27 октября 2005. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции. Новосибирск: Цэрис. 2005, с. 170- 173. Награды

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Евсеенко, Василий Александрович

Выводы

1. Впервые определены полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов следующих штаммов вирусов гриппа A/chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/chicken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/duck/Tuva/01/06. На основании филогенетического анализа последовательностей всех генов вышеуказанных штаммов было показано, что все исследованные штаммы принадлежат кладе 2 субклады 2, или так называемым «Цинхай» - подобным штаммам вируса гриппа А подтипа H5N1-субтипа.

2. Анализ районов «петля 130», «петля 220», «спираль 190» показал, что все изученные штаммы имеют структуру рецептор-связывающего домена, характерную для вирусов, циркулирующих в популяциях птиц. Аминокислотных замен в антигенно значимых районах геммагглютинина у данных штаммов вируса не обнаружено. В РТГА с референс сыворотками к вирусу гриппа A H5N1 -субтипа также была подтверждена серологическая однородность изученных штаммов. Было показано отсутствие замен, характерных для лекарственно устойчивых (ремантадин и озелтамивир) штаммов вируса гриппа А.

3. Установлено наличие реассортации генов у штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Гены NP и NS вероятнее всего происходят от вирусов, подобных штаммам A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 (Кластер 5 по гену гемагглютинина). Гены НА, NA, М, PA, РВ1, РВ2 происходят от вирусов, филогенетически принадлежащих к кластеру 4 по гемагглютинину.

4. Определена патогенность изученных штаммов для модельных животных - кур, мышей линии BALB/c, и беспородных хорьков. Было показано, что все изученные штаммы высоко патогенны для кур (индекс патогенности от 2,6 до 3), но делятся на две группы по патогенности для млекопитающих - мышей и хорьков: штаммы A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 низкопатогенны, а штаммы A/goose/krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 A/chicken/Krasnodar/123/06 и A/chicken/Reshoty/02/06 - высокопатогенны для данных животных.

5. У низкопатогенных для мышей линии BALB/c и беспородных хорьков штаммов A/chicken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05 в 627 позиции белка РВ2 находится гистидин (Н), в то время как у высокопатогенных A/chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 находится лизин (К). Что может говорить о связанности данных генетического и фенотипического признаков.

6. Нами впервые было показано, что цитокины IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 играют очень важную, если не ключевую, роль в патогенезе гриппа птиц H5N1-субтипа у мышей. Показано увеличение уровней IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 в сыворотке крови в 8, 3 и 4 раза, соответственно, к моменту гибели мышей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евсеенко, Василий Александрович, Кольцово

1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Изд. 2. - Л., 1962.

2. Львов Д.К. Вирусы гриппа и грипп. Москва, Медицина 1978.

3. Онищенко Г.Г. Грипп птиц в Сибири. Новосибирск, «ЦЭРИС» 2006.

4. Юрлов А.К., Чернышов В.М., Яновский А.П. // Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. С. 189-192.

5. Юрлов А.К., Чернышов В.М., Яновский А.П. Новые сведения о путях пролета и районах зимовки некоторых видов птиц из южной части Западной Сибири. // Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. С. 189-192.

6. Apisarnthanarak A. et al. Atypical avian influenza (H5N1) // Emerg. Infect. Dis. 10, 1321-4 (2004).

7. Garcia M., Suarez D.L., Crawford J.M., Latimer J.W., Slemons R.D., Evolution of H5 subtype avian influenza A viruses in North America // Journal Virus Res. 51 (2), 115-124 (1997)

8. Apisarnthanarak A. et al. Atypical avian influenza (H5N1) // Emerg. Infect. Dis. 10, 1321-4 (2004).

9. Chotpitayasunondh Т. et al. Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004 // Emerg. Infect. Dis. 11, 201-9 (2005).

10. Beigel J. H. et al. Avian influenza A (H5N1) infection in humans // N. Engl. J. Med. 353, 1374-85 (2005).

11. Beare A. S., Webster R. G. Replication of avian influenza viruses in humans // Arch. Virol. 119, 37-42(1991).

12. Bone R.C. 1992. Toward an epidemiology and natural history of SIRS (systemic inflammatory response syndrome) // Jama 268:3452-5.

13. Brown E.G. Influenza virus genetics // Biomed. Pharmacother. 2000 May; 54(4): 196-209. Review.

14. Li M.L., Ramirez B.C., Krug R.M. RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites //EMBO J. 1998 Oct 1; 17(19):5844-52.

15. Capua I., Mutinelli F. A color atlas and text on avian influenza. Papi Editore, Bologna, Italy, 2001.

16. Chan P.K. Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997 // Clin. Infect. Dis. 34 Suppl. 2, S58-64 (2002).

17. Chan P.K. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997 // Clin Infect Dis. 34 Suppl. 2, S58-64 (2002).

18. Cheung C.Y. et al. Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? // Lancet 360, 1831-7 (2002).

19. Cheng V.C., Tang, B.S., Wu, A. K„ Chu, C.M., Yuen, K.Y. Medical treatment of viral pneumonia including SARS in immunocompetent adult // J Infect 49, 262-73 (2004).

20. Esmon, C.T. 2005. The interactions between inflammation and coagulation // Br. J. Haematol. 131:417-30.

21. Fields Virology (eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M.) (Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, 2001).

22. Fitch W.M. Rate of change of concomitantly variable codons // J. Mol. Evol. 1971; l(l):84-96.

23. Gately, M.K., A.G. Wolitzky, P.M. Quinn, R. Chizzonite. 1992. Regulation of human cytolytic lymphocyte responses by interleukin-12 // Cell. Immunol. 143:127-42.

24. Moore, K.W., R. de Waal Malefyt, R.L. Coffraan, A. O'Garra. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor// Annu. Rev. Immunol. 19:683-765.

25. Govorkova, E.A., Leneva, I.A., Goloubeva, O.G., Bush, K, Webster, R.G. Comparison of efficacies of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N2, and other avian influenza viruses // Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2723-32 (2001).

26. Guan Y, Poon L.L., Cheung C.Y., Ellis T.M., Lim W., Lipatov A.S., et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:8156-61.

27. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 May 25;101(21):8156-61.

28. Gubareva L.V., McCullers J.A., Bethell R.C., Webster, R.G. Characterization of influenza A/HongKong/156/97 (H5N1) virus in a mouse model and protective effect of zanamivir on H5N1 infection in mice // J. Infect. Dis. 178, 1592-6 (1998).

29. Hirst G.K. Antigenic variation among influenza viruses // Bull NY Acad. Med. 1952 Nov; 28(11):769.

30. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2000 May 23;97(11):6108-13.

31. Hoffmann E., Lipatov A.S., Webby R.J., Govorkova E.A., Webster R.G. Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Sep 6; 102(36): 12915-20

32. Hulse-Post D.J., Sturm-Ramirez K.M., Humberd J. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Jul 26; 102(30): 10682-7.

33. Ilyushina N.A., Govorkova E.A., Webster R.G. Detection of amantadine-resistant variants among avian influenza viruses isolated in North America and Asia // Virology. 2005; 341:102-6

34. Katz J.M., Lu X., Frace A.M., Morken Т., Zaki S.R., Tumpey T.M. Pathogenesis of and immunity to avian influenza A H5 viruses // Biomed. Pharmacother. 2000 May; 54(4): 178-87.

35. Kiso, M. et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study // Lancet 364, 759-65 (2004).

36. Kida, H. et al. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs // J. Gen. Virol. 75 (Pt 9), 2183-8 (1994).

37. Koopmans M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands // Lancet 363, 587-93 (2004).

38. Kuiken Т., Rimmelzwaan G., van Riel D., van Amerongen G., Baars M., Fouchier R., Osterhaus A // Science. 2004 Oct 8; 306(5694):241.

39. Kuiken Т., Rimmelzwaan G.F., Van Amerongen G., Osterhaus A.D. Pathology of human influenza A (H5N1) virus infection in cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) // Vet. Pathol. 2003 May; 40(3):304-10.

40. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinform. 2004 Jun; 5(2):150-63.

41. Le Q.M., Kiso M., Someya K., Sakai Y.T., Nguyen Т.Н., Nguyen K.H., et al. Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus // Nature. 2005; 437:1108.

42. Li K.S. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature 430, 209-13 (2004)

43. Lipatov A.S., Krauss S., Guan Y., Peiris M„ Rehg J.E., Perez D.R., Webster R.G. Neurovirulence in mice of H5N1 influenza virus genotypes isolated from Hong Kong poultry in2001 //J. Virol. 2003 Mar; 77(6):3816-23.

44. Lipatov A.S., Webby R.J., Govorkova E.A., Krauss S., Webster R.G. Efficacy of H5 influenza vaccines produced by reverse genetics in a lethal mouse model // J. Infect. Dis. 2005 Apr 15;191(8):1216-20.

45. Lipatov A.C., Smirnov Iu.A, Kaverin N.V, Webster R.G. Evolution of avian influenza viruses H5N1 (1997-2004) in southern and south-eastern Asia // Vopr. Virusol. 2005 Jul-Aug; 51(4): 11-7.

46. Lu X.H., Cho D„ Hall H„ Rowe Т., Mo I.P., Sung H.W., Kim W.J., Kang C., Cox N„ Klimov A., Katz J.M. Pathogenesis of and immunity to a new influenza A (H5N1) virus isolated from duck meat // Avian Dis. 2003; 47(3 Suppl): 1135-40.

47. Macken C., Lu H., Goodman J., Boykin L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of Influenza IVII Elsevier Science, 2001, 103106.

48. Maines T.R., Lu X.H., Erb S.M., Edwards L., Guarner J., Greer P.W., et al. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals//J. Virol. 2005; 79:17888-800.

49. Morens D. M., Folkers G.K., Fauci A.S. The challenge of emerging and re-emerging infectious diseases //Nature 430, 242-9 (2004).

50. Obenauer J.C., Denson J., Mehta P.K., Su X., Mukatira S., Finkelstein D.B., et al. Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates // Science. 2006; 311:1576-80

51. Peiris J.S. et al. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease // Lancet 363, 617-9 (2004).

52. Peiris M. et al. Human infection with influenza H9N2 // Lancet 354, 916-7 (1999).

53. Peiris J.S., de Jong M.D., Guan Y. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health // Clin. Microbiol. Rev. 2007 Apr; 20(2):243-67.

54. Peiris M. Pathogenesis of avian flu H5N1 and SARS. Novartis Found Symp 279, 56-60; discussion 60-5, 216-9 (2006).

55. Rimmelzwaan G.F., Kuiken Т., van Amerongen G., Bestebroer T.M., Fouchier R.A., Osterhaus A.D. A primate model to study the pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection.

56. Rimmelzwaan G.F., Kuiken Т., van Amerongen G., Bestebroer T.M., Fouchier R.A., Osterhaus A.D. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model // J. Virol. 2001 Jul; 75(14):6687-91.

57. Ron A.M. Foucher, Thijs Kuiken, Guus F. Rimmelzwaan, Albert D.M.E. Osterhaus. Materials of Respiratory of Animals causing disease in Humans, p.27

58. Rowe T. et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays // J Clin Microbiol 37, 937-43 (1999).

59. Seo S. H., R.G. Webster. 2002. Tumor necrosis factor alpha exerts powerful anti-influenza virus effects in lung epithelial cells // J. Virol. 76:1071-6.

60. Seo S. H., E. Hoffmann, R. G. Webster. 2002. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses // Nat. Med. 8:950-4.

61. Shestopalov A.M., Durimanov A.G., Evseenko V.A., Ternovoi V.A., Rassadkin Y.N., Razumova Y.V., Zaykovskaya A.V., Zolotykh S.I., Netesov S.V. H5N1 Influenza Virus, Domestic Birds, Western Siberia, Russia// Emerg. Infect. Dis. 2006 Jul; 12(7): 1167-9.

62. Shortridge K.F., Peiris J.S., Guan Y. The next influenza pandemic: lessons from Hong Kong. // J. Appl. Microbiol. 2003; 94 Suppl:70S-79S.

63. Slemons R.D., Condobery P.K., Swayne D.E. Assessing pathogenicity potential of waterfowl-origin type A influenza viruses in chickens // Avian Dis. 1991 Jan-Mar; 35(1):210-5.

64. Stevens J., Blixt O., Tumpey T.M. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus // Science, 2006, v. 312, 404-410

65. Swayne D.E., Perdue M,L., Garcia M., Rivera-Cruz, E., Brugh M., Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chickens // Avian Dis. -1997, -41(2), -p. 35-46.

66. Swayne D.E., Beck J.R. Mickle T.R., Efficacy of recombinant fowl poxvirus vaccine in protecting chickens against a highly pathogenic Mexican-origin H5N2 avian influenza virus // Avian Dis. -1997, -41(4), -p. 10-22.

67. Swayne D.E., Pantin-Jackwood M. Pathogenicity of avian influenza viruses in poultry // DevBiol (Basel). 2006; 124:61-7.

68. Subbarao K., Klimov A., Katz J., Regnery H., Lim W., Hall H., et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness // Science. 1998;279:393-6

69. Tanaka H., Park C.H., Ninomiya A., Ozaki H., Takada A., Umemura Т., Kida H. Neurotropism of the 1997 Hong Kong H5N1 influenza virus in mice // Vet. Microbiol. 2003 Aug 29; 95(1-2):1-13.

70. Tam J.S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine 20 Suppl 2, S77-81 (2002).

71. Tran Т.Н. et al. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam // N. Engl. J. Med. 350, 1179-88 (2004).

72. Tamura K, Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 Jul 27; 101 (30): 11030-5.

73. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus // Proc. Am. Philos. Soc. 2006 Mar; 150(1):86-112.

74. To K.F. et al. Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus // J. Med. Virol. 63, 242-6 (2001).

75. Webby R.J., Webster R.G. Are we ready for pandemic influenza? // Science. 2003 Nov 28; 302(5650): 1519-22.

76. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance.

77. Wong S.S., Yuen K.Y. Avian influenza virus infections in humans // Chest 129, 156-68 (2006).

78. World Health Organization. H5N1 avian influenza: Timeline of major events. Situation Update, 20 April 2007. http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/timeline20070420.pdf.

79. Wright P.F., Webster R.G. in Fields Virology (eds. Knipe, D. M. & Howley, P. M.) (Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, 2001).

80. Xu Т., J. Qiao, L. Zhao, G. Wang, G. He, K. Li, Y. Tian, M. Gao, J. Wang, H. Wang, and C. Dong. 2006. Acute Respiratory Distress Syndrome Induced by Avian Influenza A (H5N1) Vims in Mice // Am. J. Respir. Crit. Care Med.

81. Yen H.L., Hoffmann E., Taylor G., Scholtissek C., Monto A.S., Webster R.G., Govorkova E.A. Importance of neuraminidase active-site residues to the neuraminidase inhibitor resistance of influenza viruses // J. Virol. 2006 Sep; 80(17):8787-95.

82. Yen H.L., Monto A.S., Webster R.G., Govorkova E.A. Virulence may determine the necessary duration and dosage of oseltamivir treatment for highly pathogenic A/Vietnam/1203/04 influenza virus in mice // J. Infec. Dis. 192, 665-72 (2005).

83. Yuen K.Y. et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus // Lancet 351, 467-71 (1998).

84. EF205209 EF205208 EF205207 EF205206

85. EF205201 EF205200 EF205199 EF205198

86. EF205193 EF205192 EF205191 EF205190

87. EF205185 EF205184 EF205183 EF205182

88. EF205177 EF205176 EF205175 EF205174

89. EF205169 EF205168 EF205167 EF205166

90. EF205161 EF205160 EF205159 EF205158

91. DQ676836 DQ861295 DQ861294 DQ861293

92. DQ231241 DQ231240 DQ676839 DQ676842

93. DQ676835 DQ676834 DQ676833 DQ676832

94. АВ076705 АВ076704 АВ076703 АВ076702

95. АВ076697 АВ076696 АВ076695 АВ076694