Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России

Шаршов, Кирилл Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России"

На правах рукописи

□□3493В45

ШАРШОВ КИРИЛЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА Н5М -СУБТИПА, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДИКИХ И ДОМАШНИХ ПТИЦ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией й иммунология

Мг

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2010

- ^ МАе 2010

003493645

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Рос-потребнадзора

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты: ' доктор биологических наук

Аликин Юрий Серафимович,

кандидат биологических наук Афонюшкин Василий Николаевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Россельхозакадемии (ГНУВНИВИП)

Защита состоится «IТ» марта 2010 г. в «» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, а/я 8, тел.-факс (8-383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

СтеблеваГ.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Длительное существование вируса гриппа А (ВГА) в ареале обитания его естественных хозяев (в основном, птиц) привело к устойчивости системы вирус-хозяин в биосфере (Д.К. Львов с соавт., 2004; R. Webster et al., 1992). Между тем, в процессе эволюции периодически возникают новые высокопатогенные для человека и животных варианты. Это, в свою очередь, ставит мировое сообщество перед угрозой новой пандемии, наносит серьезный экономический урон в сельском хозяйстве, создает проблемы в области охраны биологических ресурсов. Подтверждением этому служат документированные случаи инфицирования человека и домашних животных высокопатогенными вирусами гриппа H9N2, H7N7, H5N1-субтипов (T. Horimoto, Y. Kawaoka, 2005).

Особенно актуальной на данный момент можно считать ситуацию с циркуляцией вируса H5N1-субтипа на планете. Действительно, на протяжении продолжительного периода изучения ВГА считалось, что отдельные штаммы и субтипы вируса существуют обособленно в популяциях диких животных и людей. При этом преодоление межвидового барьера является процессом маловероятным и требует длительного времени для эволюционного изменения вируса. Между тем, впервые зарегистрированный в Юго-Восточной Азии в 1996 г. у птиц азиатский вариант H5N1 к настоящему времени распространился на обширную территорию, вызвав беспрецедентную панзоотию среди домашних и диких птиц, а также гибель людей. Помимо многомиллионного ущерба, причиненного широким распространением вируса гриппа птиц H5NJ в мировом сельском хозяйстве, на 30 декабря 2009 г. было документировано 467 случаев инфицирования людей, из которых 282 окончились летальным исходом (\VHO, 2009).

В связи с этим, были пересмотрены некоторые из общепринятых положений, касающиеся инфекционного потенциала ВГА. Так, в настоящее время процесс преодоления межвидового барьера (например, от птиц к человеку) считается спорадическим и имевшим место в случае пандемий гриппа в прошлом (в частности, «испанского гриппа» 1918 г.) (D.M. Morens et al., 2009). Остроту данному вопросу придает идентификация в текущем году среди людей пандемичного вируса гриппа A H1N1, филогенетически происходящего от вариантов вируса гриппа свиней и птиц (N. Ding et al., 2009; A. Flahault et al., 2009). По данным WHO, к настоящему моменту (20 декабря 2009) этот вирус был диагностирован в 208 странах мира и вызвал гибель 11516 человек (WHO, 2009).

Помимо этого, эпизоотии гриппа H5N1-субтипа существенно вмешиваются в состояние экосистем и биоресурсов восприимчивых видов хозяев. Так, по оценкам специалистов, в ходе эпизоотии H5N1 в 2005 г. в Китае погибло до10% мировой популяции горного гуся (Anser indicus) (H. Chen et'al., 2005).

гибли и были уничтожены десятки миллионов голов домашней птицы (DJ. Alexander, I.H. Brown, 2009). Начиная с этого времени, на протяжении 4 лет на территории России регулярно отмечаются вспышки гриппа среди диких и домашних птиц. Между тем, до сих пор остается открытым вопрос о путях распространения вируса H5N1 и, главным образом, роль диких птиц в этом процессе. В связи с этим, актуальными остаются анализ эпизоотической ситуации в России и мире, создание коллекции вирусов этого субтипа, выделенных от диких и домашних птиц, а также получение данных об их биологических свойствах с целью дальнейшей разработки диагностических тест-систем, вакцин и лекарственных препаратов. Такого рода данные важны для прогнозирования эпизоотической ситуации, принятия адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий. При этом особое внимание следует уделять вирусам H5N1, выделенным от диких птиц в их природных биоценозах.

Данная работа посвящена изучению перечисленных аспектов биологии вируса гриппа А.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить анализ эпизоотической ситуации по гриппу птиц H5N1-субтипа в различных регионах России за 2005-2009 гг.

2. Провести вирусологические исследования биоматериала от диких и домашних птиц из различных территорий России; изучить репродуктивные свойства в системе РКЭ и патогенность выделенных штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа для кур и белых мышей.

3. Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ генов НА и NA штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных в России от диких и домашних птиц в 2005-2009 гг., в сравнении с ранее изученными вариантами.

4. Изучить возможность использования выделенных штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа в качестве основы для получения диагностического препарата.

Научная новизна. Получены современные данные, свидетельствующие о различном патогенном потенциале и генетической гетерогенности штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.

Не установлено существенной роли синантропных птиц в развитии эпизоотии гриппа H5Nl-cy6rana на юге Западной Сибири.

Впервые в мире показано носительство вируса гриппа H5N1-субтипа у сизой чайки (Larus с anus) и колпицы (Platalea leucorodia).

Получены данные об уникальных биологических свойствах ряда впервые выделенных штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, которые целесообразно использовать в создании диагностических и вакцинных препаратов (патент №2366709 «Штамм вируса гриппа птиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов»; заявка на патент «Штамм вируса

гриппа птиц A/common gull/Chany/P/2006 H5N1 субтипа для приготовления ан-тигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата» с приоритетом изобретения №2009100655 от 11.01.2009).

Теоретическая и практическая значимость. Получены современные данные о различных биологических свойствах вируса гриппа H5N1-субтипа вызвавшего эпизоотии в России в 2005-2009 гг., которые могут быть использованы как научная основа при эпизоотическом прогнозировании и принятии адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий.

Ряд штаммов из созданной коллекции обладает перспективой использования при разработке диагностических тест-систем, вакцин, проверки лекарственных препаратов.

Внедрение полученных результатов. Созданная коллекция из 16 штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг. принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

По результатам работы 44 нуклеотидные последовательности полных генов зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить базой для конструирования праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на международной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», (Москва, 2006), III международной орнитологической конференции «Современные проблемы орнитологии Сибири и Центральной Азии», (Улан-Удэ, 2006), VI международной конференции «Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases», (Бангкок, 2006), международном совещании «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», (Новосибирск, 2007), VI международной конференции «Options for the Control of Influenza», (Торонто, 2007), III международной конференции по мигрирующим птицам Севера тихоокеанского региона, (Якутск, 2007), III международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007), международной конференции «Avian Influenza 2008: Integration from Knowledge to Control», (Бангкок, 2008), X международном симпозиуме «Respiratory Viral Infections», (Сингапур, 2008), I международной конференции «Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human Health», (Оксфорд, 2008), III европейской конференции по гриппу, (Виламура, 2008), международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа», (Новосибирск, 2008), VIII азиатско-тихоокеанском конгрессе «Medical Virology», (Гонконг, 2009).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 25 работ (в том числе в трудах международных конференций),1^ из них в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и список литературы, приложение. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 178 источника, в том числе 153 работы зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические свойства 16 штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных на территории России в 2005-2009 гг.

2. Принадлежность вируса гриппа Н5Ш-субтипа, вызвавшего эпизоотии среди диких и домашних птиц в России (2005-2009 гг.), к различным генетическим линиям.

3. Данные об уникальных биологических свойствах ряда штаммов и возможность создания на их основе диагностических препаратов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2005-2009 гг. в отделе зоонозных инфекций и гриппа ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

При оценке эпизоотической ситуации использовали официальные данные Информационно-аналитического центра Россельхознадзора РФ, Роспотребнадзора РФ, Международного эпизоотического бюро (OIE), Всемирной организации здравоохранения (WHO. Также использовали результаты собственных наблюдений в местах работ по сбору биологического материала.

Выделение, идентификацию, субтипирование вируса гриппа А проводили согласно методикам рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения и Международного эпизоотического бюро (WHO, 2002; OIE,2009). Выделение вирусов проводили на 9-10 дневных РКЭ, с последующим субтипированием изоля-тов серологическим и молекулярно-биологическим методами.

Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, амплификацию, очистку продуктов амплификации и определение нуклеотидной последовательности проводили в соответствии с протоколами производителя наборов. Использовали праймеры, описанные ранее (Е. Hoffmann et al., 2001). Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI 9, MEGA 4 (К. Tamura et al., 2007). Филогенетические деревья выровненных нуклеотидных последовательностей строили с помощью программы MEGA 4 методом Neighbor-joining (N. Saitou, М. Nei, 1987).

Для определения патогенности штамма вируса гриппа А проводили расчет его IVPI (Intravenous Pathogenicity Index), который является численным показателем патогенности (или индексом патогенности) штамма для птиц при внутривенном заражении. Определение IVPI проводили на 6-недельных цыплятах согласно протоколу (WHO, 2002). Индекс IVPI может принимать значение от 0,00 до 3,00; при значении IVPI = 1,2 и выше штамм считается высокопатогенным.

Патогенность для мышей линии BALB/c определяли согласно методикам, описанным ранее (T.R. Maines et al., 2005).

Инфицирующие (ЕШ5о/мл) и летальные дозы (LD50/Wi) вычисляли по методу Кербера в модификации Ашмарина и Воробьева (И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962).

Выделенные штаммы стандартными методами подготовлены для патентного депонирования в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Рос-потребнадзора. Для длительного хранения созданной коллекции штаммы лиофи-лизировались в ампулах с САЖ (А.Ю. Селезнева, 1978).

В качестве антигенов использовали штаммы вируса гриппа типа А, инактивированные ß-пропиолактоном.

Для статистической обработки данных были использованы общепринятые методы описательной статистики с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel (Microsoft Office Professional Edition, 2007) и STATISTICA 6,0.

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Анализ эпизоотической ситуации по гриппу птиц Н51Ч1-субтипа

в России (2005-2009гг.). Результаты вирусологического исследования биоматериала от диких, домашних и синантропных птиц

Азиатский вариант вируса гриппа H5N1, являвшийся эндемичным в Юго-Восточной Азии, в России впервые был зарегистрирован нами в июле 2005 г. на территории южных регионов Западной Сибири. Обширное распространение этого патогена началось с внедрения его на территорию Барабо-Кулундинской низменности (юг Западной Сибири) (Ю.Г. Юшков с соавт., 2006; В.А. Евсеенко с соавт. 2007). В период миграций на территории Барабо-Кулундинской низменности сосредотачивается огромное количество перелетных птиц различных видов, чьи ареалы гнездования и зимовки находятся на достаточно удаленных друг от друга территориях. Это еще и регион массового содержания домашней водоплавающей птицы. Все это благоприятствует обмену вирусов гриппа между различными видами и популяциями диких и домашних птиц (Ю.Г. Юшков с соавт., 2006).

Далее нами был проведен анализ имевшихся данных о развитии эпизоотии гриппа птиц, распространившейся из Западной Сибири на обширную территорию РФ. Было установлено, что наиболее вероятным механизмом распространения вируса гриппа A/H5N1, было распространение с миграциями диких птиц. В период с июля 2005 г. по сентябрь 2009 нами был собран и исследован биологический материал от диких и домашних птиц из основных крупных очагов эпизоотии гриппа птиц H5Nl-cy6rana в России. Результаты исследования на наличие в нем вируса гриппа A/H5N1 представлены в таблице 1. Было выделено 111 изолятов вируса гриппа H5N1-субтипа из 8 регионов России.

В связи с обсуждением в ряде работ вопроса об участии синантропных птиц в циркуляции вируса гриппа А, в том числе высокопатогенных субтипов Н5 и Н7 (В. Panigrahy et al., 1996; Т.М. Ellis et al., 2004; Y.K. Kwon et al., 2005), нами было собрано 458 образцов от 10 видов синантропных птиц, в т.ч. 70 образцов собранных в районах Новосибирской области, охваченных эпизоотией среди домашней птицы и 388 - в постапизоотический периоды на территориях Новосибирской и

Омской областей. Собранный в ходе работы материал был изучен на возможность присутствия в нем вируса гриппа типа А по стандартной методике (WHO, 2002).

Таблица 1 - Выделение вируса гриппа H5Nl-cy6rana из материала от птиц

Время взятия материала Регион, откуда взят материал Виды, вовлеченные в эпизоотию Вид из которого выделены изо-ляты Количество изолятов Кол-во штаммов

Июль 2005 Новосибирская область различные виды диких и домашних птиц, гусь, курица, индюк, дикие утки 47 7

Август 2005 Омская область различные виды диких и домашних птиц утка курица 8 5

Октябрь 2005 Астраханская область различные виды диких и домашних ПТИЦ лебедь-шипун 4 1

Февраль 2006 Краснодарский край куры курица 3 1

Февраль 2006 Республика Дагестан куры курица 5 1

Май 2006 Новосибирская область куры курица 3 1

Май 2006 Омская область различные виды диких и домашних птиц дикие и домашние утки 10 2

Июнь 2006 Республика Тыва дикая птица большая поганка 6 1

Июль 2006 Новосибирская область дикая птица сизая чайка 10 1

Февраль 2007 Московская область домашняя птица курица 6 3

Декабрь 2007 Ростовская область различные виды диких и домашних птиц курица 5 1

Июнь 2009 Республика Тыва различные виды диких птиц большая и малая поганки, озерная чайка, колпица 4 4

ИТОГО 8 регионов РФ дикие и домашние птицы 111 28

В результате проведенных исследований из 458 проб, полученных в эпизоотический период 2005 г., низкопатогенный вирус гриппа H4N6-cy6rana был выделен только от одной особи сороки обыкновенной (Pica pica). Нами не было зафиксировано случаев выделения высокопатогенного вируса гриппа H5N1-субтипа. Таким образом, полученные данные указывают на отсутствие сущест-

венной роли птиц синантропных ввдов в циркуляции вируса гриппа А в эпизоотию гриппа птиц H5N1 на юге Западной Сибири в 2005-2006 гг.

2.2.2 Биологические свойства штаммов вируса гриппа HSNl-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в России (2005-2009)

2.2.2.1 Культивирование в системе развивающихся куриных эмбрионов

Изучение биологических свойств штаммов, определение оптимальных условий продукции, их инфицирующей дозы (ЭИД50/МЛ) проводили с использованием РКЭ.

Все изученные нами штаммы вируса гриппа H5N1 вызывали гибель развивающихся куриных эмбрионов по истечении 2 суток культивирования. В процессе визуального анализа инфицированных эмбрионов, в отличие от контрольных эмбрионов, регистрировались поверхностные гемморагии, а также образование желеобразной аллантоисной жидкости. При этом наблюдалось глубокое поражение зародышевых оболочек эмбриона. Эти факты свидетельствуют о высоком патогенном потенциале изученных штаммов для куриных эмбрионов.

По результатам сравнения величин максимальной продукции гемагглютинина нами был выбран штамм A/common gull/Chany/P/2006, характеризующийся максимальной продукцией гемагглютинина в системе РКЭ. Данные свойства штамма позволили рекомендовать его для разработки диагностического препарата.

2.2.2.2 Патогенность для кур

Важным было изучение экспериментальной инфекции гриппа H5N1 у кур, как наиболее чувствительной модели заболевания у птиц (OIE, 2009; WHO, 2002). Количественную оценку патогенности конкретного штамма определяли по величине индекса IVPI (intravenous pathogenicity index) при внутривенном заражении кур.

Первые клинические проявления инфекции и начало гибели птиц было отмечено на 1-2-е сутки после инфицирования. К третьим суткам для всех изученных штаммов, кроме A/common gull/Chany/P/2006, падеж составил 100%. Через сутки после заражения у птиц наблюдалось снижение двигательной активности, нахохленность, у отдельных особей регистрировались признаки поражения желудочно-кишечного тракта, были отмечены поражения нервной системы. Таким образом, все изученные штаммы вызывают острую системную инфекцию у кур при внутривенном заражении, которая приводит к 100% летальности.

В результате проведенного исследования (табл. 2) было показано, что все штаммы вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенные от диких и домашних птиц, оказались высокопатогенными для кур (индекс IVPI > 1,2).

Между тем, штамм A/common gull/Chany/P/2006, обладающий наибольшей продукцией гемагглютинина в РКЭ среди других штаммов, характеризовался наименьшим значением индекса, который составлял 1,7. Это значительно ниже показателей для всех остальных высокопатогенных штаммов, выделенных в России (индекс IVPI>2,7).

Таблица 2 - Результаты определения 1УР1 для штаммов вируса гриппа Н5Ы1-субтипа, выделенных в России (2005-2009)

№ п/п Штаммы IVPI индекс

1. A/goose/Suzdalka/10/05 2.7

2. A/turkey/Suzdalka/12/05 2.7

3. A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 2.9

4. A/Cygnus olor/Caspian sea/2005 2.7

5. A/common gull/Chany/P/2006 1.7

6. A/chicken/Krasnodar/02/06 3.0

7. A/chicken/Dagestan/06 3.0

8. A/chicken/Omsk/06 3.0

9. A/duck/Tuva/01/06 3.0

10. A/duck/Omsk/1822/2006 2.8

11. A/Chicken/Reshoty/02/06 2.7

12. A/chicken/Moscow/Domodedovo/07 2.9

13. A/Black-headed gulVTyva/l 15/09 2.8

14. A/Great crested Rrebe/Tyva/120/09 2.8

15. A/Little grebe/Tyva/118/09 2.8

16. A/Spoonbill/Tyva/117/09 2.8

Молекулярно-генетический анализ сайта протеолитического разрезания гемагглютинина показал, что все штаммы, включая A/common gull/Chany/P/2006, содержат характерную для высокопатогенных вариантов вируса гриппа птиц маркерную последовательность ERRRKKRG. Таким образом, результаты экспериментального заражения кур и молекулярно-генетический анализ сайта расщепления гемагглютинина полностью указывают на то, что все выделенные нами штаммы являются высокопатогенными для кур.

2.2.2.3 Патогенность для мышей

Актуально изучение патогенное™ различных вариантов вируса гриппа H5N1 для млекопитающих. При этом Всемирная Организация Здравоохранения рассматривает вирус H5N1 как потенциально пандемичный, угрожающий мировому сообществу (WHO, 2009). Общепризнанной моделью для изучения гриппозной инфекции является мышиная модель (D.L. Barnard, 2009). Согласно основной гипотезе, дикие птицы наиболее вероятные векторы распространения высокопатогенного вируса гриппа в различные, нередко отдаленные географические регионы. В связи с этим очень важным явилось выявить варианты потенциально опасные для млекопитающих именно тех штаммов, которые были выделены в природных популяциях от диких птиц, мигрирующих на значительные расстояния Евразии.

Для оценки восприимчивости и летальности белых мышей было проведено интраназальное заражение пятью штаммами, выделенными от диких птиц в разные годы в различных регионах России. Выбранные штаммы вызывали вспышки в популяциях диких птиц на территории России в 2005, 2006, 2007 и 2009 гг. Данные о миграциях птиц-источников выбранных штаммов,

предполагают их миграционную связь с отдаленными территориями, эндемичными по гриппу птиц, в том числе территориями Юго-Восточной Азии.

При интраназальном заражении белых мышей были определены значения летальной дозы для мышей у выбранных штаммов (табл. 3).

Таблица 3 - Значения летальной дозы (ЬО50) для белых мышей

№ п/п Штамм Вид хозяина Место выделения LD50 (lg EID»)

1 A/chicken/Rostov/22-1/2007 * Курица домашняя (Gallus gaüus) Ростовская обл., птицефабрика 1,75

2 A/Cygnus olor/Caspian sea/2005 Лебедь-шипун (Cygnus Cygnus) Дельта р. Волга, Астраханская обл. 1,80

3 A/duck/Omsk/1822/2006 Кряква (Anas platyrhynchos) Омская обл. 1,88

4 A/duck/Tuva/01/06 Большая поганка {Podiceps cristatus) Оз. Убсу-Нуур, Республика Тыва 2,13

5 A/common gull/Chany/P/2006 Сизая чайка (Larus canus) Оз. Чаны, Новосибирская обл. 2,45

6 A/Black-headed gull/Tyva/115/09 Большая поганка (Podiceps cristatus) Оз. Убсу-Нуур, Республика Тыва 2,60

7 A/cWcken/Vietnam/NCVD8/2003 - - 5,8**

Примечание: * - вариант вируса, выделенный от кур, вызвавший вспышку среди домашних и диких птиц диких (грачей, голубей); ** - значение для штамма A/chicken/Vietriam/NCVD8/2003 взято в работе T.R. Maines et al., 2005.

Согласно работе (T.R. Maines et al., 2005) низкопатогенными для мышей считаются штаммы, имеющие показатель LD50 более 5,5 lg EID50. Для сравнения был взят штамм H5N1 A/chicken/Vietnam/NCVD8/2003, классифицированный в данной работе как низкопатогенный для мышей (LD50=5,8 lg EID50) (T.R. Maines et al., 2005).

В результате экспериментов все исследованные штаммы вызывали острую летальную инфекцию у белых мышей при интраназальном заражении. Согласно ранее описанной классификации (T.R. Maines et al., 2005) все штаммы оказались высокопатогенными для мышей.

Таким образом, нами показано существование потенциально опасных для млекопитающих вариантов вируса H5N1-субтипа в природных популяциях некоторых видов диких птиц, мигрирующих на значительные расстояния в пределах Евразии.

2.2.2.4 Молекулярно-биологический и филогенетический анализ генов НА и NA штаммов вируса гриппа Н51У1-субтипа, выделенных в России от диких и домашних птиц (2005-2009 гг.)

Важнейшей характеристикой вируса является первичная структура его генома. Для вируса гриппа А актуально исследование и молекулярно-биологический анализ структуры его поверхностных белков - гемагглютинина

НА и нейраминидазы NA. Эти белки являются важнейшими антигенами вируса и непосредственно участвуют в инфекционном процессе.

Результаты проведенного анализа свидетельствуют о том, что гемапглютинин всех исследовавшихся вирусов содержит характерный маркёр высокой патогенности в сайге 338-347 аминокислотной последовательности НА.

При анализе аминокислотной последовательности рецептор-связывающего домена гемагглютинина, было показано, что для всех изученных штаммов вируса гриппа характерно наличие QSG-сайта в позиции 226-228 НА. В соответствии с (J. Stevens et al., 2006), присутствие этого сайта является характерным для вариантов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделяемых от птиц.

Филогенетический анализ показал, что все выделенные на территории России в 2005-2009 гг. штаммы имеют свое происхождение от вариантов, вызывавших эпизоотии в Юго-Восточной Азии с 1996 г., и относятся к двум генетическим группам, в соответствии с последовательностью гена НА (WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group, 2008). Так, штаммы A/goose/Suzdalka/10/05, А/turkey/SuzdaIka/12/05, A/chicken/Suzdalka/06/05, A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/Cygnus olor/Caspian sea/2005, A/common gull/Chany/P/2006, A/chicken/Krasnodar/02/06, A/chicken/Dagestan/06, A/chicken/Omsk/06, A/duck/Tuva/01/06, A/duck/Omsk/1822/2006,

A/Chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Moscow/Domodedovo/07 и

A/chicken/Rostov/22-1/2007 принадлежат кладе 2.2 (рис.1). Филогенетически они наиболее близки штаммам, выделенным на территории Европы и России в 2005-2006 гг. При этом штаммы, выделенные на юге Западной Сибири во время первых случаев гриппа птиц на территории России, образуют отдельный кластер. Наиболее близкими являются штаммы A/common gull/Chany/P/2006 и A/duck/Tuva/01/06. Отдельный кластер образуют штаммы, ставшие причиной вспышки гриппа птиц среди домашних птиц на птицефабриках и рынках в Ростовской и Московской областях в 2007 г. Вместе с тем, все перечисленные штаммы принадлежат к Цинхай-подобным штаммам (клада 2.2) (рис. 1).

A/Black-headed gull/Tyva/115/09, A/Great crested grebe/Tyva/120/09, A/Little grebe/Tyva/118/09 и A/Spoonbill/Tyva/117/09 принадлежат совершенно к другой кладе - 2.3.2. (рис. 1). Генетически они наиболее близки штаммам, выделенным в Японии в 2007-2008 гг., и штаммам, вызвавшим вспышку среди диких и домашних птиц в Приморском крае в апреле 2008 г. (Д.К. Львов с соавт., 2008).

Таким образом, на территории России в 2005-2009 г.г. циркулировали и вызывали вспышки гриппа птиц штаммы вируса H5N1-субтипа двух различных генетических линий: Цинхай-подобных (Quinhai-like) и Гуанкси/Фуджан-подобных (Guanxi/Fudjan-like), т.е. принадлежащие кладе 2.2 и 2.3.2, соответственно (WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group, 2008). При этом двенадцать изученных штаммов, выделенных в России в 2005-2007 г.г., принадлежат кладе 2.2, а четыре штамма, выделенных во время вспышки среди диких шиц в 2009 г., принадлежат кладе 2.3.2.

ЛАЛ*4 йосЫ&т алуЛ*1240/06

■-А/*Ьоор*г вупп/Мегф*«/244/200б

Ъ-АЩск«п/Кигдап/Э/2005

I-Л/млп/8кжвп1*/760/2006

- ЫсЬ\скеп!Кпгпо4шг!0г12<ХА

2Г/0 Д

А/Суопи> оки^С«»ь!ап «еа/2008 АК^цпм Ыог/А4пиш1/Ас(05-2И /2006 Л/Суртм Ыог/АлЫ9«п/Л|К&-2-7/2005 р-и А/соттои аиЁ/СЬ«пу/Р/200€ П-»0— А/вгЛ»/Туу«Л"ууО&-2Л)6 АМиск/ТитаЛИ/ДООв

А/сЫск«пЖо*1оу/22-1/2007

ЫсЫскт/РотоЛвдочоМ К/2007

АЛЛсквп/АЙуввлШЗЛ« — МЫсквгЛгмпоЛгЯМЛ» I 80

I— А/суд пи* оЫ/Н«1*/742/2006

-А/сЫс1с»пЮт«Ц0<

АД«Ы*4*40МмадпдМ/1Л/2Ойб •ч/А/сН кЬ»>уРао«>1апЛХ

А/Ввг-ЛвкМ Ооо«ЮгвЬв1/62®5

-АЫсямаЫс аоомЛчМагЯОООб

-А<сЬк*апЛ»тЬоу/570-2/06

'—АЛ^^исШпЫи1! 034105

-АЛиек/Рцкп/11094/2005

- А/«ЫскмЮиап9<]мф/191ЛМ

А/сЫск*п/Сиагщс1оп0/17М4

, АА^с*вп/Р*ПО«}»/1/200в ЛА^Ымп/Мтогак^ЗЗОООв

—-ЛЬФооругаап/НоИоиоЛ /2006

р МШмогМ/Ьопв Ког^вабЗ/2007

АЯЯас1с-Ьм4е<1 аи11/Туу»/И 8/2003

А/8роопЫШТУУ«/117/09

1 А/аг#«< сг»»^ ог»Ь«ЛУУ«/120/200»

■А/ШЬдгеЬ«ГГууа/И8/0»

А/чиы1/5Н*п»ои/3054/2002

-АМ*Ы»т/1194/2004

-АМискЛ/Мпат /1231/2005

-АУ*М«т/НКЭ040а/2005

— А/Ск/НК/УЦ777/02 ]««д«в

_|-А/АкЛ/РчвпЛЭТ/гООЗ ]

>%Соо»»/5Ь«л1оиЛ621А)5 ]

-АЛ4аскЫг4/НипапГ1/2004 ]«л

I—- А/4иск/Оиапд я/16&1/2004 1 ~Т--«Й^оомЛ»шп8М/1097/2004

»Юиск/РЦкпП 7/2001

-Л/СЫсквп/Нопд Кмч^Ц562/01 ]

_Р«аоом/оц|у«лвш7/гоов

' А/доо—ЛЗи1утпдЛ 175/2006 - ДДгм«рм««1/Нвп*п/2Ш)4

- АМк*ип/&Ыпя1У2!Х6

. А/6оом/Оиапд4оп0/1 /96 П-АЮооаеДЗи аг\д4оп0/Э/97

Рисунок 1 - Филогенетическое дерево гена НА штаммов Еируса гриппа Н5Ы1. Подчеркнуты штаммы, выделенные нами на территории России в 20052009 гг.

Следует отметить, что все изученные штаммы имеют делецшо двадцати аминокислот в поверхностном гликопротеине NA в положении 49-68, характерную для высокопатогенных вариантов H5N1 (Н. Zhou et al., 2009). Наличие этой делеции приводит к образованию высокопатогенного фенотипа вариантов вируса гриппа Н5Ш-субтипа.

На основании проведённого филогенетического анализа первичной структуры гена нейраминидазы было показано, что она является сходной со структурой нейраминидазы штаммов, близких по последовательности гемагглютинина и принадлежащих к одной кладе.

2.2.3 Изучение штамма A/common gull/Chany/P/2006 с позиции возможности создания на его основе диагностических препаратов

Среди выделенных нами вариантов вируса гриппа H5N1-субтипа, штамм A/common gull/Chany/P/2006 представляет наибольший интерес. Он обладает уникальными характеристиками, а именно: сниженная патогенность для кур, хорошие репродуктивные свойства на РКЭ и высокая продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости. Антиген на основе изучаемого штамма A/common gull/Chany/P/2006 позволяет выявлять сывороточные антитела к Н5-гемагглютинину в РТГА при гораздо более низких концентрациях антител, чем коммерческий референс-антиген Н5 CDC.

При изучении поликлональных сывороток, полученных в результате естественной иммунизации диких птиц, были зарегистрированы более высокие титры антител в тесте РТГА, когда в качестве антигена был использован антиген на основе штамма A/common gull/Chany/P/2006, что позволяет выявлять больший процент положительных сывороток, и с большей достоверностью детектировать наличие антител. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, положительными считают сыворотки с титром в РТГА > 1/40 (WHO, 2002), Таким образом, при использовании одинаковой дозы разных антигенов в РТГА сыворотки проявляют большее сродство к гемагглютинину штамма A/common gull/Chany/P/2006.

Эти свойства позволили предложить данный штамм для создания на его основе антигенсодержащего диагностического препарата, диагностических сывороток для серологического тестирования высокопатогенного вируса гриппа H5N1-субтипа. С его помощью можно определять уровень антител в сыворотках крови птиц и млекопитающих, как для оценки эпизоотической ситуации, так и в ретроспективных серологических исследованиях.

Благодаря молекулярно-биологическим характеристикам и эффективному культивированию в системе РКЭ штамм A/common gull/P/Chany/2006 может бьггь использован как контрольный при тестировании систем выделения РНК вируса гриппа H5N1-субтипа и систем ПЦР-диагностики. Кроме того, важно, что при длительном хранении (+4 ■*■ +7°С) в форме антигена, инактивированного р-пропиолактоном, субстанция вируса A/common gull/Chany/P/2006 может сохранять свои антигенные свойства без снижения гемагглютинирующего титра в пределах 1/256-1/1024 при использовании эритроцитов различных видов млекопитающих и птиц.

Уникальные биологические свойства штамма A/common gull/Chany/P/2006

обеспечивают технологическое преимущество по сравнению с другими штаммами, поскольку позволяют продуцировать антиген высокого качества в большом количестве. Учитывая относительно простые условия для его культивирования и хранения, антиген был рекомендован в качестве компонента для диагностики гриппа H5N1 у птиц (заявка на патент «Штамм вируса гриппа птиц A/common gull/Chany/P/2006 H5N1 субтипа для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата» №2009100655 с приоритетом от 11.01.2009).

3. ВЫВОДЫ

1. При исследовании 458 образцов биоматериала, взятых от 10 видов синан-тропных птиц Западной Сибири, как в период эпизоотии среди домашних птиц, так и в постэпизоотаческий период, только в одном образце, полученном в эпизоотический период от сороки обыкновенной (Pica pica), был выделен низкопатогенный вирус гриппа H4N6-cyÖTnna. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии существенной роли синантропных птиц в эпизоотии высокопатогенного гриппа H5Nl-cy6Tima среди диких и домашних птиц в Западной Сибири в 2005-2006 гг.

2. Молекулярно-биологическими методами показано, что все выделенные нами на территории России в 2005-2009 гг. штаммы вируса гриппа H5N1-субтипа имеют свое происхождение от вариантов, вызвавших эпизоотии среди диких и домашних птиц в Юго-Восточной Азии.

3. Установлена принадлежность вируса гриппа H5N1-субтипа, циркулировавшего в России в 2005-2009 гг., к двум различным генетическим линиям - клада 2.2 и 2.3.2 по гену гемагглютинина. При этом кладе 2.3.2 принадлежат исключительно штаммы, выделенные во время эпизоотии высокопатогенного гриппа H5N1-субтипа среди диких птиц на оз. Убсу-Нуур (Республика Тыва) в 2009 г.

4. Все выделенные от диких и домашних птиц штаммы вируса гриппа H5N1-субтипа оказались высокопатогенными для кур. При этом их патогенный потенциал был различен. В частности, A/common gull/Chany/P/2006, выделенный впервые в мире от сизой чайки (Laras canus) характеризовался наименьшим значением внутривенного индекса патогенности (IVPI), который составлял 1,7. Это значительно ниже показателей для всех остальных исследованных штаммов, (индекс IVPI>2,7).

5. При изучении антигенных свойств выделенных штаммов показано, что сыворотки проявляют большее сродство к антигену на основе штамма A/common gull/Chany/P/2006 и обнаруживают более высокие титры в РТГА в сравнении с другими. Высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах штамма A/common gull/Chany/2006 обеспечивают технологическое преимущество по сравнению с другими штаммами, поскольку позволяют продуцировать антиген высокого качества в большем количестве.

6. Показано, что все штаммы вируса гриппа H5Nl-cy6rana, выделенные от диких птиц в 2005-2009 гг. в природных экосистемах России являются высокопатогенными для белых мышей (LDso< 2,6 lg EID50). Полученные данные свидетельствуют о высоком патогенном потенциале исследованных штаммов для млекопитающих.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Уникальные биологические свойства некоторых штаммов необходимо использовать для изучения биологии вируса гриппа H5Nl-cy6mna, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов (патент на изобретение №2366709 от 13 мая 2008 г.), для создания антигенсодержащих диагностических препаратов, вакцин (заявка на патент №2009100655 от 11 января 2009 г.).

Полученные 44 нуклеотидные последовательности полных генов изученных штаммов вируса гриппа HSNl-субтипа, зарегистрированные в международной базе данных GenBank, предлагается применять при конструировании праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.

Полученные результаты целесообразно использовать в учебном процессе в специализированных ВУЗах, а также в дальнейших научных исследованиях и в практической противоэпизоотической работе.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковалевская, A.A. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синантроп-ной птицы на территории Омской области (данные 2006 г.) / A.A. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, A.M. Шестопалов // Ветеринарная патология. - 2007. - № 1. - С. 178-181.

2. Прокудин, A.B. Эпизоотологический мониторинг гриппа а у диких птиц на Таймыре в 2005-2007 гг. / A.B. Прокудин, К.А. Лайшев, К.А. Шаршов, А.Г. Дурыманов, A.M. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2008.-№ 6.-С. 92-94.

3. Шестопалов, A.M. Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных на территории Российской Федерации, на мышиной модели / A.M. Шестопалов, К.А. Шаршов, A.B. Зайковская, Ю.Н. Рассадкин, И.Г. Дроздов, В.А. Шкурупий, О.В. Потапова, Н.Г. Лузгана // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146. -№ 9. - С 317-319.

4. Евсеенко, В.А. Патогенез инфекционного заболевания мышей, вызванного вирусом гриппа птиц H5N1-подтипа / В.А. Евсеенко, К.А. Шаршов, Е.К. Букин,

A.B. Зайковская, В.А. Терновой, Г.М. Игнатьев, A.M. Шестопалов, C.B. Нетесов,

B.А. Шкурупий, И.Г. Дроздов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Приложение №1 «Труды научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН». - С. 52-55.

5.. Курская, О.Г. Реакция торможения гемагглютинации для ретроспективной диагностики гриппа птиц у млекопитающих / О.Г. Курская, А.Г. Дурыманов, К.А. Шаршов, A.B. Зайковская, A.M. Шестопалов, Т.Н. Ильичева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №5. - С. 75-79.

6. Донченко, A.C. Изучение высокопатогенного гриппа птиц Н5Ш-субтипа в России (2005-2009 гг.) / A.C. Донченко, Ю.Г. Юшков, К.А. Шаршов, Е.М. Шес-топалова, A.M. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2009. - № 10. - С. 84-89.

7. Прокудин, A.B. Результаты мониторинга гриппа среди диких птиц на территории полуострова Таймыр / A.B. Прокудин, К.А. Лайшев, A.M. Шестопалов, А.Ю. Алексеев, К.А. Шаршов, С.И. Золотых, А.Г. Дурыманов // Биологические

ресурсы Крайнего Севера: современное состояние и проблемы использования: сб. науч. тр.- Новосибирск, 2006. - С.170-173.

8. Проку дин, A.B. Результаты изучения вируса гриппа среди диких птиц на Таймыре / A.B. Прокудин, А.Ю. Алексеев, A.M. Шестопалов, К.А. Лайшев, К.А. Шаршов, С.И. Золотых, А.Г. Дурыманов // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы междунар. конф. - М., 2006. - С. 348-350.

9. Шаршов, К.А. Высокопатогенный вирус гриппа типа А. Роль диких птиц в распространении / К.А. Шаршов, А.Г. Дурыманов, С.И. Золотых, А.К. Юрлов, A.M. Шестопалов // Современные проблемы орнитологии Сибири и Центральной Азии: материалы III междунар. орнитолог, конф. - Улан-Удэ, 2006. - С. 91-92.

10. Шаршов, К.А. Результаты мониторинга вируса гриппа среди синантроп-ных птиц в эпизоотический и постэпизоотический периоды на юге Западной Сибири / К.А. Шаршов, С.И. Золотых, Е.Г. Федоров, И.В. Иванов, A.B. Друзяка, A.M. Шестопалов, C.B. Нетесов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 4. - С. 53-56.

11. Шаршов, К.А. Мониторинг высокопатогенного гриппа H5N1 на территории России (2006-2007 гг.) / К.А. Шаршов, A.B. Зайковская, В.А. Терновой, А.Г. Дурыманов, A.M. Шестопалов, C.B. Нетесов, И.Г. Дроздов // Материалы III междунар. конф. по мигрирующим птицам Севера тихоокеанского региона. -Якутск, 2007. - С. 87-88.

12. Шаршов, К.А. Случай выделения высокопатогенного вируса H5N1 от клинически здоровой Larus cams / К.А. Шаршов, A.B. Зайковская, А.Г. Дурыманов, А.К. Юрлов, A.M. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Фундаментальная - наука медицине: материалы III междунар. конф. - Новосибирск, 2007. - С. 84.

13. Суслопаров, И.М. Новые высокопатогенные вирусы H5N1, выделенные на территории стран СНГ зимой 2008 г. / И.М. Суслопаров, К.А. Шаршов,

A.Ю. Алексеев, В.А. Терновой, И.Д. Петрова, А.Б. Хайтович, A.M. Шестопалов // Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа: материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2008. - С.63.

14. Шаршов, К.А. Изучение биологических свойств высокопатогенного вируса гриппа H5N1, выделенного от клинически здоровой сизой чайки (Larus са-nus) / К.А. Шаршов, A.B. Зайковская, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов // Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа: материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2008. - С.70-71.

15. Шаршов, К.А. Некоторые биологические характеристики вновь выделенного высокопатогенного вируса гриппа H5N1 / К.А. Шаршов,

B.Ю. Марченко, И.М. Суслопаров, А.Г. Дурыманов, A.M. Шестопалов, О.Г. Курская // Российский иммунологический журнал. - 2008, - Т. 2 (11). - № 2-3.-С.265.

16. Alekseev, A.Y. Monitoring of influenza A viruses in synanthropic birds in South of Western Siberia in H5N1 epizootic and postepizootic period / A.Y. Alekseev, K.A. Sharshov, S.I. Zolotykh, I.G. Drozdov, A.M. Shestopalov // 8th International

Meeting on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases - Bangkok, Thailand, 2006. - P.75-76.

17.Evseenko, V.A. Experimental infection of H5N1 HPA1 in BALB/c mice / V.A. Evseenko, E.K. Bukin, A.V. Zaykovskaya, K.A. Sharshov, V.A. Ternovoy, G.M. Ignatyev, A.M. Shestopalov // Virology Journal. - 2007. - 4:77.

18. Sharshov, K.A. H5N1 HPAI Isolation From Common Gull (Lams Cams) without Clinical Symptoms of Disease / K.A. Sharshov, A.V. Zaykovskaya, V.A. Evseenko, V.A. Ternovoy, A.G. Duiymanov, I.G. Drozdov, A.M. Shestopalov // International Conference Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human Health. - Oxford, UK, 2008. - P. 29-30.

19. Sharshov, K.A. Monitoring avian influenza at wild birds in post epizootic period (autumn 2005 and autumn 2006) in the south of Western Siberia / K.A. Sharshov, A.M. Shestopalov, A.G. Durimanov, A.Y. Alekseev, S.I. Zolotykh, S.V. Netesov, I.G. Drozdov // The International Workshop «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza». - Novosibirsk, 2007. - P. 11.

20. Sharshov, K.A. New HPAI Viruses H5N1 in Russia (2006-2007) / K.A. Sharshov, N.Y. Silko, T.N. Ilyicheva, A.V. Zaykovskaya, S.I. Zolotykh, V.A. Ternovoy, A.G. Durimanov, I.G. Drozdov, A.M. Shestopalov // Options for the Control of Influenza VI Conference. - Toronto, Canada, 2007. P. 324-325.

21. Shestopalova, E.M. Monitoring of influenza viruses in wild birds in post-epizootic period 2005-2007 in Siberia, Russia / E.M. Shestopalova, K.A. Sharshov, S.I. Zolotykh, A.G. Durimanov, I.G. Drozdov, A.M. Shestopalov // International Conference on Avian Influenza 2008: Integration from Knowledge to Control. - Bangkok, Thailand, 2008. - P. 123.

22. Shestopalova, E.M. Results of 2007 influenza observations in wild birds in the South of Western Siberia / E.M. Shestopalova, K.A.Sharshov, A.G. Durymanov, A.K. Yurlov, I.G. Drozdov, A.M. Shestopalov // The Third European Influenza Conference. - Vilamoura, Portugal, 2008. - P. 26-26.

23. Susloparov, I.V. New outbreak HPAI H5N1 in poultry and wild bird in Russia / I.V. Susloparov, K.A. Sharshov, T.N. Ilycheva, V.A. Ternovoy, A.M. Shestopalov // X International Symposium on Respiratory Viral Infections. - Singapore, Singapore, 2008. - P. 34.

24. Susloparov, I.M. Isolation of low and middle pathogenic H5 influenza viruses in Western Siberia in 2007-2008 / I.M. Susloparov, A.M. Shestopalov, E.M. Shestopalova, K.A. Sharshov, I.G. Drozdov // 8th Asia Pacific Congress of Medical Virology. - Hong Kong SAR, China, 2009. - P. 105.

25. Патент 2366709 Российская Федерация, МПК С 12 N 7/00. Штамм вируса гриппа птиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов / Шестопалов A.M., Зайковская А.В., Дурыманов А.Г., Золотых С.И., Шаршов К.А., Рассадкин Ю.Н., Дроздов И.Г.; заявитель и патентообладатель ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.- №2008118903/13; заявл. 13.05.2008; опубл. 10.09.2009, Бюл. №25. -57 с.

ШАРШОВ КИРИЛЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА Н5М-СУБТИПА, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДИКИХ И ДОМАШНИХ ПТИЦ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 10.01.2010. Заказ № 7. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаршов, Кирилл Александрович

Список используемых сокращений „

ВВЕДЕНИЕ" ""/ ~I Г " "

ГЛАВА 1.ОБЗОР "ЛИТЕРАТУРЫ " " "

1. Вирус гриппа А

1Л Общее^строение вириона

1.2 Геном вируса гриппа А и вирусные белки •

2. Экология вируса гриппа А. Естественный резервуар в природе 16 2.1 Дикие птицы как природный резервуар LPAI-вирусов

2.1.1 Вирус гриппа у уток

2.1.2 Вирус гриппа у чаек

2.1. 3Вирус гриппа у других птиц

2.L4 Генетическое разнообразие вируса гриппа у диких птиц

3. Высокопатогенные варианты вируса гриппа A (HPAI)

3.1 Азиатский вариант вируса гриппа H5N1 -субтипа

3.2 Механизмы распространения HPAI

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России"

Грипп - заболевание, привлекающее огромный интерес большого числа специалистов не только в области современной медицины и вирусологии, но и достаточно широкого круга сфер деятельности человека (экономики, здравоохранения, сельского хозяйства, охраны окружающей среды и т.д.). Эта инфекция, известная уже около 400 лет, вызывается вирусом, обладающим достаточно высоким потенциалом антигенной изменчивости. В последние годы стало очевидным, что степень вариабельности вируса гриппа типа А так велика, что он с легкостью преодолевает иммунный барьер против ранее циркулировавших штаммов. За последние годы были получены важные результаты в области понимания структуры, репликации и иммунологии вируса гриппа А (ВГА) с помощью постоянно совершенствующихся методов, а также внедрения новых подходов. Результатом явился значительный прогресс в улучшении эпидемиологического и эпизоотического надзора, разработка новых средств профилактики и методов защиты от инфекции.

Длительное существование вируса гриппа А в ареале обитания его естественных хозяев (в основном, птиц) привело к устойчивости системы вирус-хозяин в биосфере (Д.К.Львов с соавт., 2004; R.G.Webster et al., 1992). Между тем, в процессе эволюции периодически возникают новые высокопатогенные для человека и животных варианты. Это, в свою очередь, ставит мировое сообщество перед угрозой новой пандемии, приносит серьезный экономический урон в сельском хозяйстве, создает проблемы в области охраны биологических ресурсов планеты. Подтверждением этому служат документированные случаи инфицирования человека и домашних животных высокопатогенными вирусами гриппа H9N2, H7N7, H5N1-субтипов (Т. Horimoto, Y. Kawaoka, 2005).

Среди данных субтипов H5N1 считается наиболее вероятным прародителем новой пандемии гриппа из-за высокой летальности, вирулентности и широкого круга чувствительных видов хозяев. Действительно, на протяжении продолжительного периода изучения ВГА считалось, что отдельные штаммы и субтипы вируса существуют обособленно в популяциях диких животных и людей. При этом преодоление межвидового барьера является процессом маловероятным и требует длительного времени для эволюционного изменения вируса. Между тем, впервые зарегистрированный у птиц в 1996 г. в Юго-Восточной Азии вариант H5N1 к настоящему времени распространился на обширную территорию, вызвав беспрецедентную панзоотию среди домашних и диких птиц, а также гибель людей. Помимо многомиллионного ущерба, причиненного широким распространением вируса гриппа птиц H5N1 в мировом сельском хозяйстве, на 30 декабря 2009 г. было документировано 467 случаев инфицирования людей, из которых 282 окончились летальным исходом (WHO, 2009). В связи с этим, были пересмотрены некоторые из общепринятых положений, касающихся инфекционного потенциала ВГА. Так, в настоящее время процесс преодоления межвидового барьера (например, от птиц к человеку) считается спорадическим и, вероятно, происходившим при пандемиях гриппа в прошлом (в частности, испанского гриппа 1918 г.) (D.M.Morens et al., 2009).

Кроме того, идентификация в текущем году среди людей пандемичного вируса гриппа А, филогенетически происходящего от вариантов вируса гриппа свиней и птиц, существенно повышает угрозу пандемии гриппа (N.Ding et al., 2009; A.Flahault et al., 2009). По данным WHO, к настоящему моменту (20 декабря 2009) этот вирус был диагностирован в 208 странах мира и вызвал гибель 11516 человек (WHO, 2009).

Помимо угрозы пандемии, эпизоотии гриппа H5N1-субтипа среди восприимчивых видов хозяев существенно нарушают равновесное состояние экосистем и биоресурсов. Так, по оценкам специалистов, в ходе эпизоотии

H5N1 в 2005 г. в Китае погибло до 10% мировой популяции горного гуся (Anser indicus) (H.Chen et al., 2005).

В 2005 г. в Китае началась масштабная волна эпизоотий H5N1 среди диких и домашних птиц. Летом 2005 года этот вирус был зарегистрирован впервые в России, на территории Новосибирской области, где он вызвал гибель домашних птиц. В кратчайшие сроки вирус гриппа А распространился по всей территории Западной Сибири, а впоследствии - на центральные и южные регионы России. В результате распространения вируса погибли и были забиты десятки миллионов голов домашней птицы (D.J.Alexander, I.H.Brown, 2009). Начиная с этого времени, на протяжении 4 лет на территории России регулярно отмечаются вспышки гриппа среди диких и домашних птиц. Между тем, до сих пор остается открытым вопрос о путях распространения вируса H5N1 и, главным образом, роль диких птиц в этом процессе. В связи с этим, актуальным остается анализ эпизоотологической ситуации в России и мире, создание коллекции вирусов этого субтипа, выделенных в России от диких и домашних птиц, а также получение данных об их биологических свойствах с целью изучения механизмов и путей распространения вируса гриппа H5N1. Полученные в ходе работы данные можно использовать для прогнозирования эпизоотической ситуации, принятия адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий. При этом особое внимание следует уделять вирусам H5N1, выделенным от диких птиц в их природных биоценозах. Результаты проведенного в данной работе изучения биологических свойств вновь выделенных штаммов субтипа H5N1 могут быть использованы при разработке диагностических тест-систем, вакцин и лекарственных препаратов. Данная работа посвящена изучению перечисленных аспектов биологии вируса гриппа А.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить анализ эпизоотической ситуации гриппа птиц H5N1-субтипа в различных регионах России за 2005-2009 гг.

4. Изучить возможность использования выделенных штаммов вируса гриппа Н5Ш-субтипа в качестве основы для получения диагностического препарата.

Научная новизна Получены современные данные, свидетельствующие о различном патогенном потенциале и генетической гетерогенности штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.

Не установлено существенной роли синантропных птиц в развитии эпизоотии гриппа H5N1 -субтипа на юге Западной Сибири.

Впервые в мире доказано носительство вируса гриппа H5N1-субтипа у - сизой чайки (Larus canus) и колпицы (Platalea leucorodia).

Теоретическая и практическая значимость Получены современные данные о различных биологических свойствах вируса гриппа Н5Ш-субтипа вызвавшего эпизоотии в России в 2005-2009 гг., которые могут быть использованы как научная основа при эпизоотическом прогнозировании и принятии адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические свойства 16 штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных на территории России в 2005-2009 гг.

Апробация работы Материалы исследований были представлены на следующих конференциях: Международной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», (Москва, 2006),

Третьей международной орнитологической конференции «Современные проблемы орнитологии Сибири и Центральной Азии», (Улан-Удэ, 2006), Шестой международной конференции «Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases», (Бангкок, 2006), Международном совещании «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», (Новосибирск, 2007), Шестой международной конференции «Options for the Control of Influenza», (Торонто, 2007), Третьей международной конференции по мигрирующим птицам Севера тихоокеанского региона, (Якутск, 2007), Третьей международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007), Международной конференции «Avian Influenza 2008: Integration from Knowledge to Control», (Бангкок, 2008), Десятом международном симпозиуме «Respiratory Viral Infections», (Сингапур, 2008), Первой международной конференции «Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human Health», (Оксфорд, 2008), Третьей европейской конференции по гриппу, (Виламура, 2008), Международной • научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа», (Новосибирск, 2008), Восьмом азиатско-тихоокеанском конгрессе «Medical Virology», (Гонконг, 2009).

По теме диссертации опубликовано 24 работы (в том числе в трудах международных конференций), 6 из них в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Работа была выполнена в*2005-2009 гг. в отделе зоонозных инфекций и гриппа Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

Внедрение результатов исследований.

Созданная коллекция из 16 штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг. принята на патентное депонирование в

Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 178 источника, в том числе 153 работы зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Шаршов, Кирилл Александрович

выводы

1. При исследовании 458 образцов биоматериала, взятых от 10 видов синантропных птиц Западной Сибири, как в период эпизоотии среди домашних птиц, так и в постэпизоотический период, только в одном образце, полученном в эпизоотический период от сороки обыкновенной (Pica pica), был выделен низкопатогенный вирус гриппа Н4Ы6-субтипа. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии существенной роли синантропных птиц в эпизоотии высокопатогенного гриппа H5N1-субтипа среди диких и домашних птиц в Западной Сибири в 2005-2006 гг.

4. Все выделенные от диких и домашних птиц штаммы вируса гриппа H5N1 -субтипа оказались высокопатогенными для кур. При этом их патогенный потенциал был различен. В частности, A/common gull/Chany/P/2006, выделенный впервые в мире от сизой чайки (Larus canus) характеризовался наименьшим значением внутривенного индекса патогенности (IVPI), который составлял 1,7. Это значительно ниже показателей для всех остальных исследованных штаммов, (индекс IVPI>2,7).

5. При изучении антигенных свойств выделенных штаммов показано, что сыворотки проявляют большее сродство к антигену на основе штамма

A/common gull/Chany/P/2006 и обнаруживают более высокие титры в РТГА в сравнении с другими. Высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах штамма A/common gull/Chany/2006 обеспечивают технологическое преимущество по сравнению с другими штаммами, поскольку позволяют продуцировать антиген высокого качества в большем количестве.

6. Показано, что все штаммы вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенные от диких птиц в 2005-2009 гг. в природных экосистемах России являются высокопатогенными для белых мышей (LD50< 2,6 lg ЕШ50). Полученные данные свидетельствуют о высоком патогенном потенциале исследованных штаммов для млекопитающих.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Уникальные биологические свойства некоторых штаммов необходимо использовать для изучения биологии вируса гриппа H5N1-субтипа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов (патент на изобретение №2366709 от 13. мая 2008 г.), для создания антигенсодержащих диагностических препаратов, вакцин (заявка на патент №2009100655 от 11 января2009 г.).

Полученные 44 нуклеотидные последовательности полных генов изученных штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, зарегистрированные в международной базе данных GenBank, предлагается применять при конструировании праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Шаршов, Кирилл Александрович, Новосибирск

1. Антигенная вариабельность вирусов гриппа птиц А/Н13, изолированных в СССР / С.С. Ямникова и др. // Вопросы вирусологии. 1989. - №5. - С. 568-575.

2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. М.:, Медгиз, 1962. -179 с.

3. Выделение вируса гриппа в Приаралье / Ю. В. Чернецов и др. // Вопросы вирусологии. 1980. - №3. - С. 277-279.

4. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулировавшим в Юго-Восточной Азии в 2003-05 гг. / Г. Г. Онищёнко и др. // Доклады РАН. 2006. - Т. 406. - № 2.- С. 278-280.

5. Изоляция вирусов гриппа А с новой антиненной формулой от диких птиц / В.И. Вотяков и др. // Вопросы вирусологии. 1981. - №2. -С. 141-145.

6. Изучение вирусов гриппа, выделенных от диких птиц / М.Х. Саятов и др. //Вопросы вирусологии. 1981. - №4. - С. 466-471.

7. Изучение разнообразия высокопатогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотию в Западной Сибири в 2005 г. / В.А. Евсеенко и др. // Доклады РАН. 2007. - Т. 414, № 4. - С. 561-566.

8. Изучение свойств вирусов гриппа, выделенных в 1976 г. от чайковых птиц в Астраханской области / Р.Я. Подчерняева и др. // Вопросы вирусологии. 1979. - №3. - С. 227-232.

9. Литвиненко, Н.М. Чернохвостая чайка / Н.М. Литвиненко. М.: Изд-во «Наука», 1980. - 144 с.

10. Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. -2005.-№4.-С. 4-11.

11. Львов, Д.К. Миграции птиц и перенос возбудителей инфекции / Д.К. Львов, В. М. Ильичев. М.: Наука, 1979. - 270 с.

12. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке / Д. К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - №5. - С. 4-8.

13. Расшифровка эпизоотической вспышки среди диких и домашних птиц на юге европейской части России в декабре 2007 г. / Д. К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - №4. - С. 18-22.

14. Рослая, И.Г. Инфицированность озерных чаек вирусами гриппа / И.Г. Рослая, Д.К. Львов, С.С. Ямникова // Вопросы вирусологии. 1984. -№2.-С. 155-157.

15. Селезнева, А.Ю. Выживаемость вируса гриппа при длительном хранении / А.Ю. Селезнева // Вопросы вирусологии. 1978. - №6. -С. 738-739.

16. Ходков, Г.И. Миграции и сезонные размещения чайковых птиц Барабинской низменности по данным кольцевания / Г.И. Ходков // Миграции птиц в Азии. Вып 8. Изд. «Наука» Казахской ССР. - 1983. -С. 143-156.

17. Циркуляция вирусов гриппа типа А среди домашней птицы в предэпизоотический период 2005 года в Новосибирской области / Ю.Г. Юшков и др. // Журн. Микробиол. 2006. - №5. - С. 59-65.

18. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979—2002 гг.) / Д.К. Львов и др. //Вопросы вирусологии. -2004. №3.- С. 17-24.

19. Эпизоотия среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижней дельте Волги (ноябрь 2005 г.), вызванная высокопатогенным вирусом гриппа

20. A/H5N1 / Д. К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2006. №3.1. C. 10-16.

21. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death / W. Chen et al. //Nat Med. 2001. - № 7(12). - P. 1306-1312.

22. A pandemic warning? / J.C. DeJong et al. // Nature. 1997. - №389. -P. 554.

23. Alerstam, T. Bird Migration: Physiology and Ecophysiology / T. Alerstam, A. Lindstrom // E. Gwinner, Ed. Springer-Verlag, Berlin. 1990. - 331-3511. P

24. Alexander, D.J. A review of avian influenza in different bird species /

25. D.J. Alexander // Vet Microbiol. 2000. - № 74(1-2). - P. 3-13.

26. Alexander, D.J. History of highly pathogenic avian influenza / D.J. Alexander,Т.Н. Brown // Rev Sci Tech. 2009. - № 28(1). - P. 19-38.

27. Alexander, D.J. Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006 / D.J. Alexander // Avian Dis. 2007. -№51(1).-P. 161-166.

28. Analysis of H5N1 avian influenza infections from wild bird surveillance in Hong Kong from January 2006 to October 2007 / T.M. Ellis et al. // Avian Pathol. -2009. № 38(2). - P. 107-119.

29. Antigenic and genetic characterization of a novel hemagglutinin subtype of influenza A viruses from gulls / V.S. Hinshaw et al. // J Virol. 1982. -№42. - P. 865-872.

30. Antigenic and molecular characterization of subtype H13 hemagglutinin of influenza virus / T.M. Chambers et al. // Virology. 1989. - №172 (1). -P. 180-188.

31. Are ducks contributing to the endemicity of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia? / K.M. Sturm-Ramirez et al. // J Virol. 2005. -№79.-P. 11269-11279.

32. Austin, F.J. Evidence of ortho- and paramyxoviruses in fauna from Antarctica / F.J. Austin, R.G. Webster // J Wildlife Dis. 1993. - № 29(4). P 568-571.

33. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl / H. Chen et al. // Nature. -2005. №436. P. 191-192.

34. Avian H5N1 influenza in cats / T. Kuiken et al. // Science. 2004. - №306. -P. 241.

35. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals / T.R. Maines et al. // J Virol. — 2005.-№79 (18).-P. 11788-11800.

36. Avian influenza A virus (H5N1) outbreaks, Kuwait, 2007 / A. Al-Azemi et al. //Emerg Infect Dis. -2008. №14 (6). - P. 958-961.

37. Avian influenza in Hong Kong 1997-2002 / L.D. Sims et al. // Avian Dis. -2003.-№47.-P. 832-838.

38. Avian influenza virus isolated in wild waterfowl in Argentina: evidence of a potentially unique phylogenetic lineage in South America / A.J. Pereda et al. // Virology. 2008. - №378 (2). - P 363-370.

39. Avian influenza viruses in Minnesota ducks during 1998-2000 / В .A. Hanson et al. // Avian Dis. 2003. - № 47(3). - P. 867-871.

40. Barnard, D.L. Animal models for the study of influenza pathogenesis and therapy / D.L. Barnard // Antiviral Res. 2009. - № 82(2). - P. 110-122.

41. Binding mechanism of H5N1 influenza vims neuraminidase with ligands and its implication for drug design / K. Gong et al. // Med Chem. 2009. -№5(3).-P. 242-249.

42. Brown, L. H. The Birds of Africa / L. H. Brown, E. K. Urban, K. Newman. Academic Press, London, 1982. vol. 1. - 135 p.

43. Capua, I. Ecology, epidemiology and human health implications of avian influenza viruses: why do we need to share genetic data? / I. Capua, D.J. Alexander// Zoonoses Public Health. 2008. - № 55(1). -P.2-15.

44. Capua, I. The use of vaccination to combat multiple introductions of Notifiable Avian Influenza viruses of the H5 and H7 subtypes between 2000 and 2006 in Italy / I. Capua, S. Marangon // Vaccine. 2007. - №25. -P. 4987-^995.

45. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI 6) obtained from black-headed gulls / R.A. Fouchier et al. // J Virol. 2005. -№79(5).-P. 2814-2822.

46. Characterization of avian influenza viruses A (H5N1) from wild birds, Hong Kong, 2004-2008 / G.J. Smith et al. // Emerg Infect Dis. -2009. №15 (3). - P. 402-407.

47. Characterization of H5N1 influenza A viruses isolated during the 20032004 influenza outbreaks in Japan / M. Mase et al. // Virology. 2005. -№332.-P. 167-176.

48. Characterization of low-pathogenicity H5N1 avian influenza viruses from North America / E. Spackman et al. // J Virol. 2007. - №81 (21). -P. 11612-11619.

49. Characterization of the complete genome of influenza A (H5N1) virus isolated during the 2006 outbreak in poultry in India / K. Ray et al. // Virus Genes. 2008. - №36 (2). - P. 345-353.

50. Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale / V.S. Hinshaw et al. // J Virol. 1986. - № 58 (2). - P. 655-666.

51. Chen, J. Influenza virus antigenic variation, host antibody production and new approach to control epidemics / J. Chen, Y.M. Deng // Virol J. 2009. -№ 6. - P. 30.

52. Coinfection of wild ducks by influenza A viruses: distribution patterns and biological significance / G.B. Sharp et al. // J Virol. 1997. - №71 (8). -P. 6128-6135.

53. Colman, P. M. Neuraminidase: Enzyme and antigen / P. M. Colman // The influenza viruses / Eds. R. M. Krug. New York: Plenum Press, 1989. -P. 175-218.

54. Conservation of North Pacific shorebirds / R. E. Gill et al. // Trans. North Am. Wildlife Nat. Resources. 1994. - № 59. - P. 63-78.

55. Del Hoyo, J. Handbook of the Birds of the World / J. Del Hoyo, A. Elliot, J. Sargatal // Lynx Edicions, Barcelona, 1996. vol 3.-821 p.

56. Detection of mammalian virulence determinants in highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses: multivariate analysis of published data / S.J. Lycett et al. // J Virol. 2009. - №83 (19). - P. 9901-9910.

57. Do hemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? / C. Rohm et al. // Virology. -1995. -№209.-P. 664-670.

58. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR / Y. Guan et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. № 99. -P. 8950-8955.

59. Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control / H. Chen et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. - № 103(8). - P. 2845-2850.

60. Evolution and ecology of influenza A viruses / R. G. Webster et al. // Microbiol Rev. 1992. - № 56. - P. 152-179.

61. Evolution of H5 subtype avian influenza A viruses in North America / M. Garcia et al. // Virus Res. 1997. - №51(2). P. 115-24.

62. Flahault, A. Potential for a global dynamic of Influenza A (H1N1) / A. Flahault, E. Vergu, P.Y. Boelle // BMC Infect Dis. 2009. - № 9(1). -P. 129.

63. Fouchier, R.A. Epidemiology of low pathogenic avian influenza viruses in wild birds / R.A. Fouchier, V.J. Munster // Rev Sci Tech. 2009. - №28 (1). -P. 49-58.

64. Free-grazing ducks and highly pathogenic avian influenza, Thailand / M. Gilbert et al. // Emerg Infect Dis. 2006. - № 12(2). - P. 227-234.

65. Functional genomics and serological analysis of the protective immune response resulting from vaccination of macaques with an NSl-truncated influenza virus / C.R. Baskin et al. // J Virol. 2007. - № 81(21). -P. 11817-11827.

66. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia/K.S. Li et al. //Nature. 2004. -№ 430 (6996). - P. 209-213.

67. Genetic conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China / J.H. Liu et al. // Virus Genes. -2004. №29 (3). - P. 329-334.

68. Genome analysis linking recent European and African influenza (H5N1) viruses / S.L. Salzberg et al. // Emerg Infect Dis. 2007. - №13 (5). -P. 713-718.

69. Global patterns of influenza a virus in wild birds / B. Olsen et al. // Science. 2006. - №312 (5772). - P. 384-388.

70. Gocnikova, H. Influenza a virus PB1-F2 protein / H. Gocnikova, G. Russ // Acta Virol. -2007. -№51(2). -P. 101-108.

71. Graves, I.L. Influenza viruses in birds of the Atlantic flyway / I.L. Graves // Avian Dis. 1992. -№36(1). P. 1-10.

72. H5N1 outbreaks and enzootic influenza / R.G. Webster, M. Peiris, H. Chen, Y. Guan // Emerg Infect Dis. 2006. - №12 (1). - P. 3-8.

73. Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migratory birds / J. Liu et al. // Science. 2005. - №309. - P. 1206.

74. History and evolution of HPAI viruses in southeast Asia / V. Martin et al. // Am N Y Acad Sci. 2006. - №1081. - p. 153-162.

75. Horimoto, T. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses / T. Horimoto, Y. Kawaoka // Clin Microbiol Rev. 2001. - № 14 (1). - P. 129149.

76. Human infection with influenza H9N2 / M. Peiris et al. // Lancet. 1999. -№354 (9182).-P. 916-917.

77. Independence of evolutionary and mutational rates after transmission of avian influenza viruses to swine / J. Stech, X. Xiong, C. Scholtissek, R.G. Webster//J Virol. 1999. - №73.-P. 1878-1884.

78. Influenza (H5N1) viruses in poultry, Russian Federation, 2005-2006 / A.S. Lipatov et al. // Emerg Infect Dis. 2007. - №13 (4). P. 539-546.

79. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems / A. Garcia-Sastre et al. // Virology. 1998. - № 252(2). - P. 324330.

80. Influenza A viruses in feral Canadian ducks: extensive reassortment in nature / T.F. Hatchette et al. // J Gen Virol. 2004. - № 85(8). - P. 23272337.

81. Influenza A viruses of migrating wild aquatic birds in North America / S. Krauss et al. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2004. - №4 (3). - P. 177189.

82. Influenza in magpies (Pica pica sericea) in South Korea / Y.K. Kwon et al. // J Wild Dis. 2005. - №41 (3). - P. 618-623.

83. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus / M. Mibayashi et al. // J Virol. 2007. - №81 (2). - P. 514-524.

84. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks / R. G. Webster et al. // Virology. 1978. - № 84. - P. 268-278.

85. Isolation and characterization of avian influenza viruses, including highly pathogenic H5N1, from poultry in live bird markets in Hanoi, Vietnam, in 2001 / D.C. Nguyen et al. // J Virol. 2005. - №79 (7). - P. 4201-4212.

86. Isolation and characterization of prevalent strains of avian influenza viruses in China / X. Tang, G. Tian, J. Zhao, K.Y. Zhou // Chin J Anim Poult Infect Dis. 1998. - №20. - P. 1-5.

87. Isolation of an influenza A virus strain from a bird embryo (Larus ridibundus) collected in Slovakia / M. Gresikova, M. Sekeyova, B. Tumova, A. Stumpa // Acta Virol. 1979. - № 23(1). - P. 89-92.

88. Isolation of influenza A viruses from migratory waterfowl in San-in District, western Japan in the winter of 1983-1984 / K. Otsuki et al. // Res Vet Sci. 1987. - №43 (2). - P. 177-179.

89. Isolation of influenza A viruses from migratory waterfowls in San-in District, Western Japan in winters of 1980-1982 / 1С. Otsuki et al. // Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg. 1987. - №265 (1-2). - P. 235-242.

90. Kida, H. Duck influenza lacking evidence of disease signs and immune response / H. Kida, R. Yanagawa, Y. Matsuoka // Infect Immun. -1980. №30 (2). - p. 547-553.

91. Krug, R. M. Cytoplasmic and nuclear virus-specific proteins in influenza virus-infected MDCK cells / R.M. Krug, P. R. Etkind // Virology.- 1973.-№56.-P. 334-348.

92. Lamb, R. A. Genes and proteins of the influenza viruses / R. A. Lamb // The influenza viruses // Eds.: R. M. Krug. New York: Plenum, 1989. -P. 1-87.

93. Lamb, R. A. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication / R.A. Lamb, R. M. Krug // Fields virology / Eds.: D. M., Fields, Knipe, P.M. Howley. 3rd ed. - Philadelphia: Lippincott-Raven. - 1996. - P. 13531395.

94. Lamb, R. A. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: Colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins / R. A. Lamb, С.J. Lai, P. W. Choppin // Proc Natl Acad Sci U S A. 1981. - № 78. - P. 4170-4174.

95. Lamb, R. A. Synthesis of influenza virus proteins in infected cells: Translation of viral polypeptides, including three P polypeptides, from RNA produced by primary transcription / R. A. Lamb, P. W. Choppin // Virology.- 1976.-№74.-P.504-519.

96. Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates / J.C. Obenauer et al. // Science. 2006. - №311 (5767). - P. 1576-1580.

97. Laver, V. G. Morphology of the isolated hemagglutinin and neuraminidase subunits of influenza vims / V. G. Laver, R. C. Valentine // Virology. 1969. - №38. - P. 105.

98. Laver, W.G. Amino acid composition of polypeptides from influenza virus particles / W.G. Laver, N. Baker // J Gen Virol. 1972. - №17 (1). -P. 61-67.

99. Lethality to ferrets of H5N1 influenza viruses isolated from humans and poultry in 2004 / E.A. Govorkova et al. // J Virol. 2005. - №79. -P. 2191-2198.

100. Matrix gene of influenza a viruses isolated from wild aquatic birds: ecology and emergence of influenza a viruses / L. Widjaja et al. // J Virol. -2004. -№78 (16).-P. 8771-8779.

101. Matrosovich, M. Influenza receptors, polymerase and host range / M. Matrosovich, J. Stech, H.D. Klenk // Rev Sci Tech. 2009. - №28 (1). -P. 203-217.

102. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 / K. Tamura, J. Dudley, M. Nei, S. Kumar // Mol Biol Evol. 2007. - №24. - P. 1596-1599.

103. Mixed infection and the genesis of influenza virus diversity / E. Ghedin et al. // J Virol. 2009. - № 83(17). - P. 8832-8841.

104. Molecular determinants within the surface proteins involved in the pathogenicity of H5N1 influenza viruses in chickens / D.J. Hulse,

105. R.G. Webster, R.J. Russell, D.R. Perez. // J Virol. 2004. - № 78(18). - P. 9954-9964.

106. Molecular evolution of novel swine-origin A/H1N1 influenza viruses among and before human / N. Ding et al. // Virus Genes. 2009. - №39 (3).-P. 293-300.

107. Morens, D.M. The persistent legacy of the 1918 influenza virus / D.M. Morens, J.K. Taubenberger, A.S. Fauci // N Engl J Med. 2009. -№361 (3).-P. 225-229.

108. Multiple gene segment reassortment between Eurasian and American lineages of influenza A virus (H6N2) in Guillemot (Uria aalge) / A. Wallensten et al. // Arch Virol. 2005. -№150 (8). - P. 1685-1692.

109. New genotype of avian influenza H5N1 viruses isolated from tree sparrows in China / Z. Kou et al. // J Virol. 2005. -№79 (24). - P. 54605466.

110. Noah, D.L. Influenza virus virulence and its molecular determinants / D.L. Noah, R.M. Krug // Adv Virus Res. 2005. - №65. - P. 121-145.

111. Normil, D. Avian influenza. Potentially more lethal variant hits migratory birds in China / D. Normil // Science. 2005. - № 309 (5732). -P. 231.

112. NS1 protein of influenza A virus inhibits the function of intracytoplasmic pathogen sensor, RIG-I / Z. Guo et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2007. - № 36(3). - P. 263-269.

113. Occurrence of influenza A viruses and their antibodies in migratory birds in Finland / T. Estola et al. // Nord Vet Med. 1980. - № 32(7-8). -P. 321-324.

114. OIE. World Organization for Animal Health. Avian influenza. (NB: Version adopted in May 2009) In: Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2009. Updated: 14.08.2009. Доступно на http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/Asummry.htm

115. Perkins, L.E. Pathogenicity of a Hong Kong-origin H5N1 highly pathogenic avian influenza virus for emus, geese, ducks, and pigeons / L.E. Perkins, D.E. Swayne // Avian Dis. 2002. - №46 (1). - P. 53-63.

116. Perkins, L.E. Susceptibility of laughing gulls (Larus atricilla) to H5N1 and H5N3 highly pathogenic avian influenza viruses / L.E. Perkins, D.E. Swayne // Avian Dis. 2002. №46 (4). - P. 877-885.

117. Perkins, L.E. Varied pathogenicity of a Hong Kong-origin H5N1 avian influenza virus in four passerine species and budgerigars / L.E. Perkins, D.E. Swayne // Vet Pathol. 2003. - №40 (1). - P. 14-24.

118. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water / J.D. Brown et al. // Avian Dis. 2007. - № 51(1). - P. 285-289.

119. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation / E. Spackman et al. // Virus Res. 2005. - №114 (1-2). - P. 89-100.

120. Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses / J. Banks, E. C. Speidel, J. W. McCauley, D. J. Alexander // Arch. Virol. 2000. - № 145. - P. 1047-1058.

121. Piersma, T. Do global patterns of habitat use and migration strategies co-evolve with relative investments in immunocompetence due to spatial variation in parasite pressure / T. Piersma // Oikos. 1997. - №80 (3). -P. 623-631.

122. Pinto, L. H. Influenza virus M2 protein has ion channel activity /.L. H. Pinto, L. J. Holsinger, R. A. Lamb // Cell. 1992. - № 69(3). - P. 517528.

123. Polypeptides specified by the influenza virus genome. Evidence for eight distinct gene products specified by fowl plague vims / S. C. Inglis, R. A. Lamb, A. R. Carroll, B. W. J. Mahy // Virology. 1976. - № 74. - P. 489-503.

124. Porter, A. G. Complete nucleotide sequence of an influenza virus haemagglutinin gene from cloned DNA / A, G. Porter, C. Barber, N.H. Carey // Nature. 1979. - № 282. - P. 471^7-7

125. Precursor genes of future pandemic influenza viruses are perpetuated in ducks nesting in Siberia / K. Okazaki et al. // Arch Virol. 2000. -№145 (5).-P. 885-893.

126. Preparedness for highly pathogenic avian influenza pandemic in Africa / R.F. Breiman et al. // Emerg Infect Dis. 2007. - № 13(10). -P. 1453-1458.

127. Recent influenza A (H1N1) infections of pigs and turkeys in northern Europe / S. Ludwig, A. Haustein, E.F. Kaleta, C. Scholtissek // Virology. -1994.-№202.-P. 281-286.

128. Recombination resulting in virulence shift in avian influenza outbreak, Chile / D. L. Suarez et al. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - №10. - P. 693699.

129. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease / M. Peiris et al. //Lancet. 2004. - №363. - P. 617-619.

130. Re-emerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are highly pathogenic to ducks / K.M. Sturm-Ramirez et al. // J Virol. 2004. -№78.-P. 4892-4901.

131. Refinement of the influenza virus hemagglutinin by simulated annealing / W. I. Weis, A. T. Brunger, J. J. Skehel, D. C. Wiley // J Mol Biol. 1990. -№212. P. 737-761.

132. Rohani, P. Opposite patterns of synchrony in sympatric disease metapopulations / P. Rohani, D.J. Earn, B.T. Grenfell // Science. 1999. -№286 (5441). P. 968-971.

133. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia / D.J. Hulse-Post et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. № 102. P. 10682-10687.

134. Saitou, N. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees / N. Saitou, M. Nei // Mol Biol Evol. -1987.-№ 4.-P. 406-425.

135. Schulze, I.T. The structure of influenza virus. A Model based on the morphology and composition of subviral particles / Schulze, I.T. // Virology. 1972. -№47.-P. 181.

136. Scott, D. A. Atlas of Anatidae Populations in Africa and Western Eurasia / D. A. Scott, P. M. Rose // Wetlands International, Wageningen, Netherlands. 1996. №41. - 336 pp.

137. Shorebirds: an illustrated behavioral ecology / J. Van de Kam, K.N. Bruno, T. Piersma, L. Zwarts // Publishers, Utrecht, Netherlands. -2004.- 368 p.

138. Spatial, temporal, and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds / V.J. Munster et al. // PLoS Pathog. -2007.-№3 (5).- P. 61.

139. Stevens, J. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus / J. Stevens, O. Blixt, T.M. Tumpey // Science. 2006. - №312. - P. 404-410.

140. Susceptibility of highly pathogenic H5N1 influenza viruses to the neuraminidase inhibitor oseltamivir differs in vitro and in a mouse model / E.A. Govorkova et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2009. - №53(7). -P. 3088-3096.

141. Susceptibility of pigeons to avian influenza / B. Panigrahy et al. // Avian Dis. 1996. - №40 (3). - P. 600-604.

142. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds / V.G. Dugan et al. // PLoS Pathog. 2008. - №4 (5):el000076.

143. The impact of a monthly rest day on avian influenza virus isolation rates in retail live poultry markets in Hong Kong / N.Y. Kung et al. // Avian Dis. 2003. - №47. - P. 1037-1041.

144. The NS1 protein of a human influenza virus inhibits type I interferon production and the induction of antiviral responses in primary human dendritic and respiratory epithelial cells / K. Haye et al. // J Virol. 2009. -№83(13).-P. 6849-6862.

145. The special neuraminidase stalk-motif responsible for increased virulence and pathogenesis of H5N1 influenza A virus / H. Zhou et al. // PLoS One. 2009. - №4 (7). - P. 6277.

146. Tiffany, J.M. Estimation of the number of surface projections on myxo- and paramyxoviruses / J.M. Tiffany, H.A. Blough // Virology. -1970.-№41.-P. 392.

147. Transmission of Eurasian avian H2 influenza virus to shorebirds in North America / N.V. Makarova et al. // J Gen Virol. 1999. - №80 (12). -P. 3167-3171.

148. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands / M. Koopmans et al. // Lancet. 2004. - № 363. - P. 587-593.

149. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses / E. Hoffmann et al. // Arch Virol. 2001. - № 146(12). -P. 2275-2289.

150. Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine / J.A. Richt et al. // J Virol. 2006. -№80 (22). P. 11009-11018.

151. Veen, J. An atlas of movements of Southwest Siberian waterbirds / J. Veen, A. K. Yurlov, S.N. Delany // Wetlands international, Wageningen, The Netherlands. 2005. - 60 p.

152. Webster, R.G. Reactions of antibodies with surface antigens ofmfluenza virus / R.G. Webster, V.G. Laver, E.D. Kilbourne // J. Gen. Virol. 1968. - №3. - P. 315.

153. WHO. H5N1 avian influenza: Timeline of major events / World Health

154. Organization. Situation Update, 20 April 2007.http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/timeline20070420.pdf

155. WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group. Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) /

156. WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group // Emerg Infect Dis. -2008. -№14(7). 1.

157. Wild ducks as long-distance vectors of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) / J. Keawcharoen et al. // Emerg Infect Dis. 2008. -№14 (4).-P. 600-607.

158. Wilson, I. A. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3E resolution / I. A. Wilson, J. J. Skehel, D. C. Wiley // Nature. 1981. - № 289. - P. 366-373.

159. Winter, G. Cloning of influenza cDNA into M13: The sequence of the RNA segment encoding the A/PR/8/34 matrix protein / G. Winter, S. Fields // Nucleic Acids Res. 1980. - № 8. - P. 1965-1974.

160. Wright, P. F. Orthomyxoviruses. P.F. Wright, R.G. Webster. In: D.M. Knipe, P.M. Howley, editors. Fields virology. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2001. - P. 1533-1579.

161. Yen, H.L. Mapping antibody epitopes of the avian H5N1 influenza virus / H.L. Yen, J.S. Peiris // PLoS Med. -2009. №6 (4). - P. el000064.

162. Zambon, M.C. Epidemiology and pathogenesis of influenza / M.C. Zambon // J Antimicrob Chemother. 1999. - №44. - P. 3-9.

163. Zebedee, S. L. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions / S. L. Zebedee, R. A. Lamb // J Virol. 1988. - № 62(8). - P. 2762-2772.

Информация о работе

Шаршов, Кирилл Александрович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы