Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологическое разнообразие вариантов вируса гриппа A у диких птиц Центральной Азии

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологическое разнообразие вариантов вируса гриппа A у диких птиц Центральной Азии"

МАРЧЕНКО ВАСИЛИЙ ЮРЬЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА А У ДИКИХ ПТИЦ ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

1 С ОЕо Ш

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2012

005010057

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Глотова Татьяна Ивановна,

кандидат ветеринарных наук, доцент Грязин Валерий Николаевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт птицеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИВИП)

Защита состоится «29» февраля 2012 г. в « 11-00 » часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01. при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл.. Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной

сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «_______» января 2012 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета ( / ^ Стеблева Г.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирус гриппа типа А (ВГА) способен инфицировать различные виды животных, включая свиней, лошадей, морских млекопитающих и птиц, вызывая эпизоотии среди популяций

сельскохозяйственных животных. Это, в свою очередь, наносит серьезный экономический ущерб и является угрозой здоровью человека

(D.J. Alexander, 2000; Т. Horimoto, 2001).

Определенную роль в распространении ВГА играют дикие перелетные птицы, у которых заболевание протекает, в основном, без проявления клинических признаков. Благодаря этому, сезонные миграции диких птиц способствуют переносу возбудителя на значительные расстояния

(Д.К. Львов, 1979).

Считается, что основным природным резервуаром вируса гриппа являются дикие птицы водно-болотного экологического комплекса. В основном это птицы отрядов Гусеобразные (утки, гуси, лебеди и пр.) и Ржанкообразнйе (чайки, кулики). В настоящее время только от птиц были выделены варианты вируса гриппа, содержащие все известные на сегодняшний день 16 субтипов гемагглютинина и все 9 субтипов нейраминидазы в наибольшем числе комбинаций (V.S. Hinshaw et al., 1982; Y. Kawaoka et al., 1990; R.G. Webster et al., 1992; C. Rohm et al., 1996(a); R.A. Fouchier, 2005). В связи с этим, мониторинг вируса гриппа среди диких птиц данных групп позволяет изучить современное разнообразие вариантов вируса, оценить вероятную эволюционную тенденцию, а также изучить биологические свойства вновь возникающих вариантов. Это дает возможность принимать своевременные меры по контролю над распространением возбудителя.

Актуальность мониторинга вируса гриппа, в первую очередь у диких птиц, вызвана тем, что, начиная с 1997 года, в странах Юго-Восточной Азии и Китае начал формироваться эндемичный очаг вируса гриппа H5N1-субтипа. Впоследствии вирус распространился по всему миру, вызывая вспышки заболевания в Азии, Европе, Африке. Вирус гриппа H5N1-субтипа способствовал возникновению массовых эпизоотий домашних и диких птиц и являлся причиной заболевания и гибели нескольких сотен людей. Так, по данным ВОЗ на 03.06.2011 зарегистрировано 555 случаев инфицирования людей вирусом гриппа H5N1-субтипа, из которых 324 закончились летальным исходом (WHO, 2011).

В связи с этим очевидна необходимость проведения мониторинга вируса гриппа А в природных местообитаниях диких птиц, среди видов, наиболее важных в эпизоотологическом отношении, с точки зрения их участия в распространении вируса.

Особое значение в исследованиях ВГА имеет территория Центральной Азии, поскольку через данный регион проходят основные миграционные маршруты диких птиц между странами Юго-восточной Азии и Россией, объединяя огромные популяции диких птиц различных видов в данном регионе (Е. Spackman, 2009). Этот факт не исключает вероятность заноса вируса гриппа

на территорию России из очагов инфекции, находящихся в регионах, которые охватывают данные пролетные пути.

Помимо этого, физико-географическое положение Центральной Азии и экологические особенности орнитофауны данного региона могут создавать весьма благоприятные условия для реассортации геномов различных штаммов вируса гриппа. Это, в свою очередь, может способствовать увеличению гетерогенности вирусной популяции, появлению и распространению на различных территориях новых, ранее не описанных вариантов вируса гриппа (Д.К. Львов, 2004).

Следует также отметить, что подобные исследования на данной территории немногочисленны (Д.К. Львов, 2004; Е. Зраскшап, 2009, У.БакосЬ,

2010). Имеющихся данных недостаточно, чтобы однозначно делать заключения о закономерностях эволюции и экологических особенностях ВГА на территории Центральной Азии.

Вышеперечисленные факты делают актуальными изучение экологии вируса гриппа А на территории Центральной Азии, разнообразия его вариантов, циркулирующих в популяциях диких птиц, а также исследование некоторых биологических свойств выделенных изолятов. Полученные результаты исследования вируса гриппа могут быть использованы при разработке диагностических тест-систем, вакцин и лекарственных препаратов. Также, данные исследования позволят оценить механизмы и пути распространения вируса, определить причины возникновения его новых вариантов, что обеспечит возможность прогнозировать эпизоотическую ситуацию.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучение биологического разнообразия вариантов вируса гриппа А, циркулирующих у диких нтиц на территории Центральной Азии,

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии с использованием комплекса диагностических исследований для определения разнообразия его циркулирующих вариантов.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных изолятов вируса гриппа А.

Научная новизна. В ходе работы получены современные данные о циркуляции вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии с 2003 по 2010 гг. Впервые в России выявлены наиболее важные в эпизоотолопическом отношении территории в пределах Центрально-азиатского пролетного пути диких птиц. Представлены результаты эпизоотологического мониторинга на территории России, Монголии и Казахстана.

От диких птиц на территории Центральной Азии выделены 25 оригинальных штаммов вируса гриппа А семи различных субтипов и изучены их основные биологические свойства.

Три штамма вируса гриппа, выделенные во время эпизоотии среди диких птиц на оз. Убсу-Нур, были отнесены к Н5Ы1-субтииам и являлись высокопатогенными для кур и мышей.

Впервые на территории Азии выделен вирус гриппа Н13Ы8-субтипа (штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08), ранее не описанный для исследованного региона. Показана возможность его использования в диагностике (заявка на патент «Штамм вируса гриппа A/Herring gull/Mongolia/454/08/ Н13Ш-субтипа, используемый при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей» с приоритетом изобретения № 2010138219 от 15.09.2010).

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в данной работе штаммы вируса гриппа А можно использовать в диагностических целях в качестве антигенов и создания на их основе диагностических сывороток. Полученные в ходе исследования данные о биологических свойствах выделенных штаммов вируса гриппа А, а также информация об их хозяевах позволяют предполагать вероятные пути распространения вируса гриппа и, возможно, прогнозировать эпизоотическую ситуацию в различных регионах Азии.

Внедрение полученных результатов. Создана коллекция из 25 штаммов вируса гриппа А различных субтипов, выделенных на территории Центральной Азии в 2003-2010 гг. Данные штаммы приняты на патентное депонирование в коллекцию культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР».

По результатам работы 36 нуклеотидных последовательностей генов вируса гриппа зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить базой для конструирования праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции “Zoonotic infectious diseases and tourism” (Улан-Батор 2009); международной телеконференции «Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии» (Томск, 2010); тринадцатом международном симпозиуме «XIII International Symposium on Respiratory Viral Infections» (Италия, Рим, 2011); международной конференции «Russian-German Conference «Molecular Basis of Infections»» (Новосибирск,

2011); третьем международном семинаре «The 3rd international Young Researcher Seminar for Zoonosis Control» (Япония, Саппоро, 2011); четвертой международной конференции «4th oxford international influenza conference «Influenza 2011» (Англия, Лондон, 2011); Второй международной конференции «Астана Биотех 2011» (Казахстан, Астана, 2011.)

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Российский иммунологический журнал», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы и приложения. Диссертация

иллюстрирована 13 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 178 источников, в том числе 150 работ зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты эпизоотологического мониторинга вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии.

2. Результаты изучения основных биологических свойств выделенных изолятов вируса гриппа А.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в отделе зоонозных инфекций и гриппа Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора в период с 2007 по 2011 гг. при поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» - Госконтракт № 11.519.11.2014.

Лабораторные исследования проведены по методикам, рекомендованным Всемирной Организацией Здравоохранения и Международным Эпизоотическим Бюро (WHO 2002; OIE 2009). Все работы с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Мониторинг ВГА систематически проводился на территории северозападной части республики Монголия, республики Казахстан и юга Центральной Сибири (Красноярский край, республика Хакасия). Места проведения мониторинговых работ определялись в соответствии с данными о миграциях птиц таким образом, что точки сбора материала лежали в пределах миграционных маршрутов диких птиц, летящих Центрально-Азиатским пролетным путем. Сбор биологического материала проводили на территориях крупных озер в местах наибольшего скопления дикой птицы. Птицы добывались отстрелом, а также при помощи орнитологических паутинных сетей (мелкие воробьинообразные и кулики).

Биологический материал от птиц был представлен клоакальными смывами и фрагментами кишечника. Выделение изолятов вируса гриппа проводили на 9дневных РКЭ (WHO, 2002). После выделения изоляты были субтипированы серологическими (РТГА) и молекулярно-биологическими (ПЦР) методами.

При постановке реакции торможения гемагглютинации использовали панель референс антисывороток, предоставленную доктором Вэбстером (Мэмфис, США) согласно протоколу ВОЗ и OIE (WHO, 2002; OIE,2009).

Субтипирование ВГА методом ПЦР осуществляли с помощью пар подтипспецифичных праймеров (К. Tsukamoto et al., 2008; Bao-Feng Qiu et al.,

2008) для определения первичных последовательностей генов НА и NA. Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, амплификацию, очистку продуктов амплификации и определение нуклеотидной последовательности проводили в соответствии с протоколами производителя соответствующих наборов. Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью компьютерных программ Vector NTI 9, MEGA 4 (К. Tamura et al., 2007). Для построения филогенетических деревьев на основе выровненных нуклеотидных последовательностей использовали компьютерную программу MEGA 4 с использованием метода Neighbor-joining (N. Saitou, М. Nei, 1987).

Патогенность штаммов вируса гриппа изучали на 6-недельных курах и белых мышах линии BALB/c.

На курах определяли 1VPI (Intravenous pathogenicity index), согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 2002). При значении IVPI >1,2 штамм считали высокопатогенным.

На белых мышах применяли метод, описанный в работе T.R. Maines et. al. (2005). Инфицирующие (ЭИД50) и летальные (ЛД50) рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962). Согласно работе T.R. Maines et al. (2005) низкопатогенными для мышей считали штаммы, показатели ЛД50 которых составляли более 5,5 lg ЭИД50.

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Результаты эпизоотологического мониторинга вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии

С 2003 по 2009 гг. на территории Центральной Азии был собран и обследован биологический материал от 2604 особей диких птиц. Основное количество особей составили птицы трех отрядов - гусеобразные (Anseriformes), ржанкообразные (Charadriiformes) и воробьинообразные (Passeriformes). Процентное соотношение количества особей птиц данных отрядов было примерно одинаковым и составило, от общего числа, 23,2%, 26,3%, 25,9% соответственно. Отряду аистообразные (Ciconiiformes)

принадлежало 11,5% птиц. На долю остальных 10 отрядов птиц пришлось около 13% образцов (табл. 1).

Собранный биологический материал был исследован по стандартной методике (WHO, 2002). Клоакальные мазки были культивированы в течение трех пассажей на 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). При этом все инфицированные эмбрионы сохраняли жизнеспособность в течение всего трехдневного срока наблюдения. Таким образом, все выделенные вирусные изоляты не являлись патогенными по отношению к РКЭ. В результате было получено 17 изолятов вирус гриппа А, которые подвергли исследованию в реакции торможения гемагглютинации с панелью сывороток к вирусу гриппа Н1-Н16-субтипов. Все титры в РТГА были значимыми, т.е. равнялись или были выше 1:40 (WHO, 2002). Методом ПЦР был определен субтип нейраминидазы этих изолятов.

Таблица 1 — Таксономическая и количественная характеристики диких птиц Центральной Азии

Отряд Семейство Количество видов Количество особей Количество положительных проб

Гусеобразные утиные 17 604 9

бекасовые 14

Ржанкообразные чайковые 4 684

ржанковые 3 1

крачковые 1

шилоклювковые 1

врановые 6

мухоловковые 6

трясогузковые 5

овсянковые 4

жаворонковые 3

Воробьинообразные воробьиные 2 674

славковые 2 2

вьюрковые 2

дроздовые 2

сорокопутовые 1

скворцовые 1

ласточковые 1

суторовые 1

Аистообразные цаплевые 2 300

ибисовые 1

Журавлеобразные пастушковые 2 118

настоящие 1

Поганкообразные поганковые 2 45 1

Пеликанообразные баклановые 1 95 3

Хищные птицы ястребиные 6 42 1

соколиные 1

Курообразные фазановые 3 16

Голубеобразные голубиные 3 18

Ракшеобразные удодовые 1 3

Кукушкообразные кукушковые 1 2

Дятлообразные дятловые 1 2

Совообразные совиные 1 1

Всего: 14 33 102 2604 17

Таким образом, их отнесли к Н4Ш (5 штаммов), НЗЫ6 (6), НЗЫ8 (2), НШ1(2), Н13Ш и НЮШ-субтипам ВГА (табл. 2).

Все 17 выделенных изолятов оказались непатогенными для кур (1\Ф1=0).

ВГА различных субтипов были выделены от птиц 6 отрядов: гусеобразные (хохлатая чернеть, черный турпан, большой крохаль, кряква, огарь, красноголовый нырок, чирок-свистунок и широконоска); ржанкообразные (серебристая чайка); воробьинообразные (каменка плясунья, сорока), поганкообразные (чомга); пеликанообразные (большой баклан) и

хищные птицы (лунь болотный). В качестве вирусоносителей доминировали представители видов, экологически связанных с водно-болотными местообитаниями или, так называемые, водно-болотные птицы.

От птиц данной группы было выделено 14 изолятов ВГА из 17(82,4%).

Таблица 2 - Субтипы вируса гриппа, выделенных от птиц Центральной Азии

Наименование штамма Субтип ВГА Время и место выделения Объект выделения

A/magpie/Mongolia/17/03 H4N6 Август 2003, Монголия сорока

A/isabelline wheater/Mongolia/19/03 каменка плясунья

A/grebe/Mongolia/24/03 чомга

A/comiorant/Mongo)ia/5/03 баклан большой

A/cormorant/Mongolia/2/03 баклан большой

A/cormorant/Mongolia/22/04 H3N6 Август 2004, Монголия баклан большой

A/tufted duck/Mongolia/16/04 хохлатая чернеть

A/velvet sco ter/Mongolia/19/04 черный турпан

A/common merganser/Mongolia/29/04 большой крохаль

A/marsh harrier/Mongolia/30/04 лунь болотный

A/Mallard/Mongolia/2307/2006 H1N1 Сентябрь 2006, Монголия кряква

A/roody shelduck/Mongolia/632/2007 Сентябрь 2007, Монголия огарь

A/herring gull/Mongolia/454/08 H13N8 Сентябрь 2008, Монголия серебристая чайка

A/pochard/S iberi a/249/08 H10N7 Август 2008, Республика Хакасия красноголовый нырок

A/european teal/Siberia/237/08 H3N8 Август 2008, Красноярский край чирок- свистунок

A/shoveler/Siberia/236/08 H3N6 Август 2008, Красноярский край широконоска

A/mallard/Sibcri a/294/08 H3N8 Август 2008, Красноярский край кряква

2.2.2 Изучение биологических свойств штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8)

Штамм вируса гриппа A/herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8), выделенный нами на территории западной части Монголии в 2008 г. от серебристой чайки (larus argentatus), является единственным известным штаммом вируса гриппа H13N8-субтипа, выделенным за последние 12 лет на азиатской территории России.

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) инфекционный титр штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08 (HI3N8) достигал 7,5 lg ЕГО50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 5120 ГАЕ/мл.

В эксперименте штамм имел одинаковые титры в реакции гемагтлютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь, хорек, а также с эритроцитами человека.

Штамм не обладал патогенными свойствами для мышей при интраназальном и внутрибрюшинном заражении. В эксперименте не было отмечено летальной инфекции. Не наблюдалось также клинических признаков инфекции и выработки антител по истечении 21 суток после инфицирования.

Полученная нами поликлональная сыворотка путем внутривенного заражения указанным штаммом 6-недельных кур обладала титром РТГА с гомологичным антигеном 1/320-1/640 (табл. 3) при диагностическом значении >1/40 (WHO, 2009).

Таблица 3 — Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08

№ животного Титр сыворотки до инфицирования Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования

1 <1/10 ' 1/320

2 <1/10 1/640 •

3 <1/10 1/640

Таким образом, она оказалась приемлемой для использования при определении принадлежности к Н13-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8).

В дальнейшем с ее помощью было осуществлено пробное типирование 4 неидентифицированных изолятов ВГА, выделенных в результате мониторинга из 89 проб от диких перелетных птиц Западной Сибири (М.В. Сивай с соавт., 2008). Результаты представлены в таблице 4.

Из 4 типируемых антигенов антиген №1 проявил высокое родство к сыворотке, полученной на предлагаемый штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08 НІЗЩ-субтипа. У трех других антигенов проявилось родство к сывороткам, полученным на штаммы вируса гриппа НЗ и Н1 субтипов.

Важно отметить, что типирующая сыворотка, полученная на штамм A/gull/Mary land/707/77 (H13N6) (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), не дала положительного результата в РТГА с антигеном предлагаемого штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8). Таким образом, штамм A/gull/Mary land/707/77 (H13N6), используемый при производстве типирующей сыворотки к Н13-субтипу гемагглютинина, в антигенном отношении отличается от некоторых современных вариантов, циркулярующих в Азии, и не пригоден для определения их принадлежности к Н13-субтипу.

Таблица - 4 Титры цитирующих сывороток в РТГЛ с исследуемыми гемагглюпшпирующими антигенами

Поликлональная сыворотка Титр сыворотки с антигеном

№ 1 №2 № 3 №4

A/PR/8/34 (H1N1) <1/10 <1/10 <1/10 1/20

A/swine/IА/30 (Н1N1) <1/10 <1/10 <1/10 1/20

A/Wild duck/Shenton/992/00 (HI) <1/10 <1/10 <1/10 1/1280

A/Japan/305/57 (H2N2) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/duck/1283/00 (НЗ) <1/10 1/1280 1/640 <1/10

A/equine/Miami/63 (H3N8) <1/10 1/20 1/20 <1/10

A/duck/Ukraine/63 (H3N8) <1/10 1/40 1/40 <1/10

A/duck/Czech/56 (H4N6) <1/10 <1/10 1/20 <1/10

A/duck/HK/264/92 (H4) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/tern/So. Af./61 (H5N3) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/goose/HK/167/99 (H5N1) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/turkey/MA/65 (H6N2) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/teal/HK/1312/97 (H6) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/equine/Prague/56 (H7N7) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/FPV/Rostock/34 (H7N1) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/turkey/Ont./6118/68 (H8N4) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/turkeyAVl/66 (H9N2) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/duck/HK/4880/97 (H9N2) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/chicken/N/Germany/49 (H10N8) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/duck/Memphis/546/74 (HI 1N9) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/duck/England/56 (H11 N6) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/duck/Alberta/60/76 (H12N5) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/gull/MD/707/77 (H13N6) 1/20 <1/10 <1/10 <1/10

A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8) * 1/640 <1/10 <1/10 <1/10

A/mallard/Ast./263/82 (H14N5) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

A/shearwater/W.Aus./79 (H15N8) <1/10 <1/10 <1/10 <1/10

Примечание- * - сыворотка, полученная на предлагаемый штамм.

2.2.3 Характеристики вируса гриппа Н51Ч1-субтипа, выделенного во время эпизоотии среди диких птиц в России (Республика Тыва) в 2010 г.

В июне 2010 г. на оз. Убсу-Нур (республика Тыва) была зафиксирована эпизоотия среди диких птиц. Из проб биологического материала, отобранных от погибших птиц видов большая поганка (Podiceps cristatus), озерная чайка (Larus ridibundus) и колпица (Platalea leucorodia), были получены три изолята вируса гриппа: A/great crested grebe/Tyva/22/2010, A/black-headed

gull/Tyva/8/2010, A/spoonbill/Tyva/1/2010. Выделенные гемагглютинирующие агенты имели положительную реакцию на вирус гриппа A/H5N1 -субтипа по результатам проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

С антигенами штаммов была проведена РТГА с референс сыворотками и сыворотками против вирусов, ранее выделенных на территории России. В результате у исследованных штаммов установлено наибольшее антигенное сродство к штаммам A/black-headed gull/Tyva/115/09 и A/chicken/Primorsky/85/2008 (клада 2.3.2), выделенным ранее на территории озера Убсу-Нур и Дальнем Востоке России. Их титры в РТГА составили 1/1280 (табл. 5).

Таблица S - РТГА штаммов A/great crested grebe/Tyva/22/2010 и A/duck/Tuva/0J/2006 (оз. Убсу-Нур) поликлональными референс-сыворотками к штаммам различных клад вируса гриппа HSNl-субтипа

Обратные титры в РТГ А с поликлональными референс-сыворотками к штаммам различных клад вируса гриппа Н5Н 1-субтипа

Наименование штамма 04 £ Г' ГО 'й с о 00 е о а: ъ о §3 5 A/goose/Hong Kong/213/2003 (R) A/duck/Hun an/795/2002 A/duck/Tuva/01/06 1 | А/duck/Hunan/101/2004 (R) A/В lack-headed gull/Tyva/l15/09 A/chicken/Primorsky/85/2008 A/Japanese white-eye/Hong | Kong/103 8/2006 40 О о C't ro ГО "oil с « ‘5 О <u о о A/chicken/Hong Kong/YU22/2002 r- o © С! то $ § >> С (4 Wj s о А/Anas platyrhynchos/Chanv Lake/9/03 ’

0 i 2.1 2.2 2.3.1 2.3.2 2.3.2 2.3.4 4 8 H5 N2 H5 N3

A/great crested КгеЬеЛ'у va/22/2010 640 10 640 80 160 1280 1280 40 20 640 10 80

A/d Lick/Гuva'01/7006 640 20 640 2560 160 40 80 40 40 320 20 80 1

Изучение патогенности штаммов вируса гриппа Н5М-субтипа для кур

При внутривенном заражении кур изучаемыми штаммами, проявление первых клинических признаков заболевания было отмечено на 1-е сутки. Были зафиксированы снижение двигательной активности, признаки поражения желудочно-кишечного тракта и нервной системы. Ко вторым суткам для всех изученных штаммов падеж зараженных кур составил 100%.

Таким образом, изученные штаммы оказались высокопатогенными для кур (IVPI=2,9).

Изучение патогенности для мышей

Общепризнанной моделью изучения гриппозной инфекции и способов защиты от нее является мышиная модель (D.L. Barnard, 2009).

При интраназальном заражении белых мышей были определены значения летальной дозы для них у изученных штаммов. В результате экспериментов все исследованные штаммы вызывали острую летальную инфекцию у белых мышей при интраназальном заражении. Согласно ранее описанной классификации (T.R. Maines et al., 2005) все штаммы оказались высокопатогенными для мышей (ЛД50 = 2,8 lg ЭИД50).

Согласно работе T.R. Maines et al. (2005) низкопатогенными для мышей считаются штаммы, показатели ЛД50У которых составляют более 5,5 lg ЭИД50.

Таким образом, нами показано существование потенциально опасных для млекопитающих вариантов вируса гриппа H5N1 -субтипа в природных популяциях ряда видов птиц, мигрирующих на значительные расстояния в пределах Евразии.

Молекулярно-генетический и филогенетический анализ

Филогенетический анализ гена гемагглютинина (НА) штаммов A/great crested grebe/Ty va/22/2010, A/black-headed gull/Tyva/8/20I0 и

A/spoonbill/Tyva/1/2010 (рис. 1) выявил высокую степень гомологии с НА штаммов, выделенных во время вспышки в Монголии и России (оз. Убсу-Нур) в 2009 г., на озере Цинхай в 2009 г. и в Монголии - 2010 г. По принятой классификации исследованные штаммы принадлежат кладе 2.3.2 (D.J. Alexander 2009, К.А. Sharshov et al. 2010). Примечательно, что они отличались от штамма A/duck/Tuva/01/06, выделенного на территории озера Убсу-Нур в 2006 г., который отнесен к кладе 2.2.

Была определена нуклеотидная последовательность всех восьми сегментов генома штамма A/great crested grebe/Tyva/22/2010 (Genbank: HQ 131674 - HQ131681).

В аминокислотной последовательности NA обнаружена делеция 20 аминокислот I(48)CNQSIITYENNTWVNQTYV(67), что является характеристикой высокопатогенных штаммов гриппа H5N1 -субтипа (Е. Spackman et al., 2002). Не было обнаружено ни одной аминокислотной замены по консервативным позициям (нумерация по N1 без делеции) нейраминидазы (NA) (Е-119, Н-274, R-292, N-294) у исследуемого штамма, которые предположительно обуславливают устойчивость к ингибиторам нейраминидазы (M.D. De Jong, 2005; D.J. Alexander, 2009). Также обнаружена общая для представителей клады 2.3.2 делеция одной аминокислоты лизина в положении 345 (D.J. Alexander, 2009; К. Sharshov, 2010(a)).

i A/black-headed gull/Tyva/8/2010 A/spoonbill/Tyva/1/2010 L A/great crested grebe/Tyva/22/2

- А/дгеЬеЯ yva/3/2009 A/whooper swan/Mongolia/2/2009 A/whooper swan/Mongolia/6/2009 A/whooper swan/Mongolia/8/2009

- A/whooper swan/Mongolia/21/2010 A/whooper swan/Mongolia/11/2010

A/ruddy shelduck/Mongolia/X42/2009 A/bar-headed goose/Mongolia/X53/2009 A/bar-headed goose/Mongolia/X54/2009 A/bean goose/Tyva/10/2009 A/ruddy shelduck/Mongolia/X63/2009

- A/common goldeneye/Mongolia/X60/2009 , A/whooper swan/Mongolia/7/2010

Клада 2.3.2

: Клада 2.2

— A/whooperswan/Hokkaido/1/2008 ... 100 '100 \ A/chicken/Primorje/1/2008

87 A/chicken/Primorsky/85/2008 r- - A/pika/Qinghai/QW/2007 A/pika/Qinghai/HMH/2007

I9 Ю0 r,

ijA/pikaQinghai/SHK/2007

! *- A/pika/Qtnghai/GRL/200?

.- —.....A/great black-headed gull/Qinghai/2/2007

! ,------A/chicken/Nigeria/OD9/2006

100; .i j- A/chicken/Krasnodar/01/2006

j | • *.. -.....—- A/chicken/Rostov/22-1/2007

; A/duck/Tuva/01/2006

i. 95 1-- A/grebe/Tyva/Tyv06-2/06

- A/goose/Krasnoozerskoe/627/05 ,. A/Bar-headed Goose/Qinghai/62/05 if- A/barheadedgoose/Qinghai/1 A/2005 24jr- — A/goose/S uzdalka/10/05 t ■ А/swan/Austria/216/2QQ6

89 - AAvhooper swan/Mongolia/244/2005

• ■- A/duck/Vietnam/1231/2005

100 - • A/VietNam/HN30408/2005

83 - A/Viet Nam/1194/2004

- — A/duck/Fujian/897/2005 100 - ■ A/Goose/Shantou/1621/05 A/CWHK/YU777/02

- A/goose/Guangxi/1097/2004

• A/blackbird/Hunan/1/2004

A/treesparrow/Henan/2/2004 A/Beijing/01 /2003

................................. A/chicken/Shanxi/2/2006

- • A/Pheasant/HongKong/FY155/01

■— A/goose/Guiyang/337/2006 100 ... - A/goose/Guiyang/1175/2006

- A/Goose/Guangdong/1/96

wo L A/whooper swan/Mongolia/1/2010 ] A/great crested-grebe/Qinghai/1/2009 : - A/great crested grebe/Tyva/120/2009 A/black-headed gull/Tyva/115/2009

Рисунок 1 - Филогенетическое дерево гена НА штаммов вируса гриппа HSN1. Полужирным шрифтом выделены

штаммы, полученные нами на территории России в 2006-2010 гг. Примечание:

топология дерева восстановлена при

помощи метода Minimum Evolution, Матрица генетических расстояний

рассчитана с применением метода Кимуры с двупараметрической метрикой Указаны индексы поддержки узлов, превышающие 70.

В сентябре 2010 г. на оз. Тагарское (Красноярский край) была зафиксирована эпизоотия среди диких птиц. Первоначально предполагалось, что она была вызвана высокопатогенным вирусом гриппа H5N1 -субтипа.

Для выявления вируса гриппа был собран биоматериал от 23 погибших птиц пяти видов: кряквы обыкновенной (Anas platyrhynchos) (n = 7), чирка-свистунка (Anas crecca) (n = 8), шилохвости (Anas acuta) (n = 2), широконоски (Anas clypeata) (n = 2) и лысухи (Fulica atra) (n = 4). От каждой птицы были взяты фрагменты легкого, почки, селезенки, кишечника, головного мозга.

Из материала от погибших птиц было выделено 5 изолятов вируса гриппа А (табл. б).

Таблица 6 - Штаммы вируса гриппа А, выделенные от диких птиц на оз. Тагарское

Вид птицы Наименование штамма Субтип ВГA

кряква A/mallard/Tagarskoe lake/5/2010 H4N6

шилохвость A/pintail/Tagarskoe lake/11/2010 H3N8

чирок-свистунок A/teal/Tagarskoe lake/13/2010 H3N8

чирок-свистунок A/teal/Tagarskoe lake/14/2010 H3N8

чирок-свистунок A/teal/Tagarskoe lake/22/2010 H3N8

Методом ПЦР в реальном времени было определено, что данные изоляты относятся к Н4Ш и НШ8-субтипам вируса гриппа. Высокопатогенного вируса гриппа А ШМ-субтипа в исследованных пробах выявлено не было.

Выделенные изоляты были культивированы в системе РКЭ. Все они вызывали гибель развивающихся куриных эмбрионов, но по истечении 2 суток культивирования. В процессе визуального анализа инфицированных эмбрионов, в отличие от контрольных, регистрировались поверхностные геморрагии, а также образование желеобразной аллантоисной жидкости. При этом наблюдалось поражение зародышевых оболочек эмбриона.

Патологические изменения сосудов и зародышевых оболочек свидетельствовали о высоком патогенном потенциале изученных штаммов для куриных эмбрионов.

Следующим логическим продолжением исследования было изучение патогенности (1УР1) данных штаммов для птиц. Однако, при заражении кур данными штаммами не наблюдалось гибели птиц по истечении 10 суток после инфицирования. Внутривенный индекс патогенности составил 0 для всех изученных штаммов.

Полученные нами данные с большой долей вероятности указывают на то, что вирус гриппа А не являлся основной причиной гибели диких птиц в Красноярском крае в 2010 году.

3. выводы

1. Показана циркуляция вируса гриппа А в популяциях диких птиц Центральной Азии в период с 2003 по 2009 гг. Из 2604 исследованных проб было выделено 17 штаммов вируса гриппа А (0,7%).

2. Основное количество (82,4%) вирусов гриппа А было выделено от диких птиц водно-болотной экологической группы, что подтверждает их основную роль в циркуляции вируса гриппа А.

3. Выделенные в период с 2003 по 2009 гг. 17 штаммов вируса гриппа А отнесены к 6 субтипам (H4N6(5), H3N6(6), H3N8(2), H1N1(2), H13N8, H10N7). Все они не являются патогенными для кур и мышей. Вирус гриппа А Н13Ш-субтипа (штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08) был выделен на территории Центральной Азии впервые.

4. При культивировании в РКЭ гемагглютинируюший титр антигена штамма A/Herring gull/Mongolia/454/08 достигал 5120 ГАЕ/мл. При внутривенном заражении кур титр антигемагглютиниругощих антител' в сыворотке кур достигал 1/320-1/640. Данные характеристики позволяют эффективно использовать штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08 для приготовления антигенсодержащего диагностического препарата и получения диагностической поликлональной сыворотки.

5. В 2010 г. на оз. Убсу-Нур (республика Тыва) в России был выделен вирус гриппа A H5N1-субтипа, который явился причиной эпизоотии среди диких птиц. Штаммы A/black-headed gull/Tyva/8/2010, A/great crested grebe/Tyva/22/2010 и A/spoonbill/Tyva/1/2010 оказались высокопатогенными для кур (IVPI=2,9) и мышей (ЛД50 = 2,8 lg ЕИД5о). Установлена принадлежность данных штаммов к генетической кладе 2.3.2.

6. Вирусы гриппа А, выделенные во время массовой гибели птиц на

оз. Татарское (Красноярский край) в 2010 г. отнесены к H3N8 и H4N6-субтипам и оказались непатогенными для кур. В связи с этим маловероятно, что данные штаммы послужили причиной эпизоотии.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты могут быть использованы широким кругом ветеринарных специалистов и студентами ВУЗов, а также специалистами другого профиля, принимающих участие в организации и проведении противоэггазоотических мероприятий.

Целесообразно использовать штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08 для приготовления антигенсодержащего диагностического препарата и получения диагностической поликлональной сыворотки.

Практические предложения отражены в методических рекомендациях «Комплексный эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А на территории Сибири и Дальнего Востока», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока»

отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шаршов, К.А. Некоторые биологические характеристики вновь выделенного высокопатогенного вируса гриппа HSN1 / К.А. Шаршов,

B.Ю. Марченко, И.М. Суслопаров А.Г. Дурыманов, А.М. Шестопалов, О.Г. Курская II Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (II). -№2-3.-С. 265.

2. Марченко, В.Ю. Выделение вируса гриппа А от диких птиц на территории западной части Монголии / В.Ю. Марченко, А.Ю. Алексеев, И.М. Суслопаров, К.А. Шаршов, Ф.А. Ильиных, С.И. Золотых, А.М. Шестопалов, Д. Церенноров, Д. Абмед, И.Г. Дроздов, Д. Отгонбаатар // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - № 6. - С. 18-21.

3. Донченко, А.С. Результаты мониторинга вируса гриппа среди диких птиц на территории Красноярского края (2008 г.) / А.С. Донченко, Ю.Г. Юшков, В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, А.Ю. Алексеев, Ф.А. Ильиных, И.А. Савченко, Н.В. Карпова, А.П. Савченко, А.М. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2010. - № 7. - С. 61-67.

4. Зайковская, А.В. Исключение этиологического значения вируса гриппа при массовой гибели диких птиц в Красноярском Крае / А.В. Зайковская, С.Г. Сайфутдинова, В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, А.Г. Дурыманов, С.И. Золотых, JI.B. Шматова, П.М. Демчин, Ю.Г. Юшков, А.С. Донченко, В.А. Недужко, А.М. Шестопалов II Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2011. - № 1. — С. 88-93.

5. Марченко В.Ю. Характеризация вируса гриппа H5N1 субтипа, выделенного во время вспышки среди диких птиц в России (Республика Тыва) в 2010 г. / В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, Н.Ю. Силко, И.М. Суслопаров, А.Г. Дурыманов, А.В. Зайковская, А.Ю. Алексеев,

О.В. Смоловская, А.П. Стефаненко, Е.М. Малкова, А.М. Шестопалов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология..- 2011. — № 4. -

C. 36-40.

6. Марченко, В.Ю. Экология вируса гриппа в популяции диких птиц центральной Сибири (2008г.) / А.Ю. Алексеев, Ф.А. Ильиных, К.А. Шаршов, А.П. Савченко, Н.В. Карпова, И.А. Савченко, А.М. Шестопалов // Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии: международная телеконф. — Томск, 2010. - С. 79-80.

7. Марченко, В.Ю. Использование штамма A/herring gull/Mongolia/454 (H13N8), выделенного в 2008 г. в Центральной Азии для диагностики вируса гриппа А / В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, А.Ю. Алексеев, А.М. Шестопалов // Астана биотех 2011: И-я междунар. конф. - Астана, Казахстан, 2011.- С. 156.

8. Marchenko, V.Yu. Influenza virus monitoring of wild birds living in western part territory of Mongolia (2003-2008) / V.Yu. Marchenko, A.Yu. Alekseev,

I.M. Susloparov, K.A. Sharshov, F.A. Ilinykh, S.I. Zolotykh, A.M. Shestopalov, D.D. Tserennorov, Ya. Batjav, U. Dagvadorj, B. Onorsaykhan, D. Baygalmaa D. Abmed, D. Otgonbaatar // Zoonotic infectious diseases and tourism: international conference. — Ulaanbaatar, Mongolia, 2009. - P. 115-121.

9. Marchenko, V.Yu. Results of the influenza virus surveillance in wild birds in Western part of Mongolia / V.Yu. Marchenko, A.Yu. Alekseev, D.D. Tserennorov, A.K. Yurlov, I.M. Susloparov, K.A. Sharshov, F.A. Ilyinykh, S.I. Zolotykh,

D. Abmed, D. Otgonbaatar, A.M. Shestopalov // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. -2010. -V. 3(2). - P. 90-93.

10. Sharshov, K.A. Results of Avian Influenza Virus Surveillance in Western Siberia (Russia) in 2010 / K.A. Sharshov, M.V. Sivay, V.Yu. Marchenko, N.Yu. Silko, A.G. Durymanov, I.M. Susloparov, A.V. Zaikovskaya, A.Yu. Alekseev,

5.1. Zolotykh, A.M. Shestopalov II XIII International Symposium on Respiratory

Viral Infections. - Rome, Italy, 2011. - P. 26. '

11. Sharshov, K.A. Highly Pathogenic H5N1 Influenza Viruses in Russia (20052010) / K.A. Sharshov, V.Yu. Marchenko, A.G. Durymanov, I.M. Susloparov, A.V. Zaikovskaya, A.Yu. Alekseev, S.I. Zolotykh, A.M. Shestopalov // Molecular Basis of Infections: Russian-German Conference. - Novosibirsk, Russia, 2011. - P. 44.

12. Sharshov, K.A. H5N1 virus in Russia (2005-2011): molecular epidemiology, ecology and evolution / K.A. Sharshov, V.Yu. Marchenko, O.G. Kurskaya, N.Yu. Silko, A.G. Durymanov, I.M. Susloparov, A.V. Zaikovskaya, A.Yu. Alekseev,

5.1. Zolotykh, A.M. Shestopalov // Influenza 2011, zoonotic influenza and human health: 4th oxford international influenza conference. — Oxford, UK, 2011. - P. 14-15.

13. Sharshov, K.A. H5N1 virus in Russia (2005-2011): molecular epidemiology, ecology and evolution / K.A. Sharshov, V.Yu. Marchenko, I.M. Susloparov, A.Yu. Alexeev, A.G. Durymanov, A.M. Shestopalov // The 3rd international Young Researcher Seminar for Zoonosis Control. - Sapporo, Japan, 2011. - P. 31.

Научное издание

МАРЧЕНКО Василий Юрьевич

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА А У ДИКИХ ПТИЦ ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ

Специальность 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 23.01.2012 г. Формат 60x84 /16. Уч.-изд. л. 1,1. Уел. печ. л. 1. Тираж 100 экз.

Заказ № 5 і Редакционно-издательский центр НГУ. 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Марченко, Василий Юрьевич, Новосибирск

61 12-3/629

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека

Федеральное бюджетное учреждение науки

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

На правах рукописи

Марченко Василий Юрьевич

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА А У ДИКИХ ПТИЦ ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук Шестопалов А.М.

Новосибирск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ......................................................................4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................12

1.1. Вирус гриппа А..........................................................................................................................................................12

1.1.1. Строение вириона и структура генома вируса гриппа А.. 12

1.1.2. Цикл репродукции вируса гриппа А......................................................................15

1.1.3. Генетическая изменчивость вируса гриппа А........................................17

1.2. Экология вируса гриппа А........................................................................................................................18

1.2.1. Круг восприимчивых к вирусу гриппа хозяев......................................18

1.2.2. Роль птиц в распространении вируса гриппа................................20

1.2.2.1. Вирус гриппа у сельскохозяйственных птиц............................20

1.2.2.2. Вирус гриппа у синантропных видов................................................23

1.2.2.3. Дикие птицы как природный резервуар вируса гриппа 25

1.3. Роль Центральной Азии в экологии вируса гриппа А..........................30

1.3.1. Физико-географические характеристики

Центральной Азии..............................................................................................................31

1.3.2. Характеристика современной орнитофауны..................................33

1.3.3. Центрально-Азиатский пролетный путь............................................37

1.4. Заключение по обзору литературы........................................................................39

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................58

3.1. Эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А

среди диких птиц Центральной Азии................................................................58

3.1.1. Характеристика исследованной выборки диких птиц.... 58

3.1.2. Вирусологическое исследование

материала от диких птиц..........................................................................................66

3.2. Некоторые биологические свойства выделенных в работе

изолятов вируса гриппа..................................................................................................69

3.2.1. Культивирование в системе

развивающихся куриных эмбрионов....................................................................................69

Стр.

3.2.2. Изучение патогенности

изолятов вируса гриппа для кур..........................................72

3.3. Изучение биологических свойств штамма

A/Herring gull/Mongolia/454/08 (H13N8)............................. 72

3.3.1. Получение поликлональной сыворотки на штамм Вируса гриппа A/Herring gull/Mongolia/454/08 (HI 3N8)......... 73

3.3.2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма

вируса гриппаА/Herring gull/Mongolia/454/08/ (HI3N8)......... 74

3.4. Характеризация вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенного

во время эпизоотии среди диких птиц в России в 20 Юг........ 77

3.4.1. Изучение патогенности штаммов

вируса гриппа H5N1 -субтипа для кур.............................. 78

3.4.2. Изучение патогенности штаммов

вируса гриппа H5N1 -субтипа для мышей.................. 79

3.4.3. Молекулярно-генетический и филогенетический

анализ штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа................... 80

3.5. Выявление причины массовой гибели птиц на оз. Тагарское 83

3.6. Создание коллекции штаммов вируса гриппа А, выделенных от диких птиц Центральной Азии................... 85

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................... 88

ВЫВОДЫ................................................................................ 102

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.............................................. 103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 104

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................ 126

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВМЕ - (3-меркаптоэтанол BPL - [3-пропиолактон НА - гемагглютинин

IVPI (Intra venous pathogenity index) - индекс патогенности при внутривенном введении

M - матричный белок NA - нейраминидаза NP - нуклеопротеин NS - неструктурный белок РА - полимеразный белок PB 1 - полимеразный белок 1 РВ2 - полимеразный белок 2

RDA (RNA Dilution Buffer) - буфер для растворения РНК

RLA (RNA Lysis Buffer) - лизирующий буфер

RWA (RNA Wash Solution) - промывочный буфер

TSR - template suppression reagent

А.ж. - аллантоисная жидкость

ВВГП - высокопатогенный вирус гриппа птиц

ВГА - вирус гриппа А

ВГП - вирус гриппа птиц

ГАЕ - гемагглютинируюгцая единица

гРНК - геномная РНК

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

кРНК - РНК, комплементарная геномной РНК

ЛД5о - доза, вызывающая 50% гибель

НВГП - низкопатогенный вирус гриппа птиц

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РКЭ - развивающийся куриный эмбрион

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

САЖ - стабилизирующий раствор, содержащий 10% сахарозы и 15% желатина

УФ - ультрафиолетовое излучение ФСБ - фосфатно-солевой буфер ЦА - Центральная Азия

ЭИД50 - доза, инфицирующая 50% эмбрионов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Вирус гриппа типа А (ВГА) способен инфицировать различные виды животных, включая свиней, лошадей, морских млекопитающих и птиц, вызывая эпизоотии среди популяций сельскохозяйственных животных, что, в свою очередь, наносит серьезный экономический ущерб и является угрозой здоровью человека (D.J. Alexander, 2000; Т. Horimoto and Y. Kawaoka, 2001).

Определенную роль в распространении ВГА играют дикие перелетные птицы, у которых заболевание протекает, в основном, без проявления клинических признаков. Благ одаря этому, сезон ные миграции диких птиц способствуют переносу возбудителя на значительные расстояния (Д.К. Львов, 1979).

Считается, что основным природным резервуаром вируса гриппа являются дикие птицы водно-болотного экологического комплекса. В основном это птицы отрядов Гусеобразные (утки, гуси, лебеди и пр.) и Ржанкообразные (чайки, кулики). В настоящее время только от птиц были выделены варианты вируса гриппа, содержащие все известные на сегодняшний день 16 субтипов гемагглютинина и все 9 субтипов нейраминидазы в наибольшем числе комбинаций (V.S. Hinshaw et al., 1982; Y. Kawaoka et al., 1990; R.G. Webster et al., 1992; C. Rohm et al., 1996(a); R.A. Fouchier, 2005). В связи с этим, мониторинг вируса гриппа среди диких птиц данных групп позволяет изучить современное разнообразие вариантов вируса, оценить вероятную эволюционную тенденцию, а также изучить биологические свойства вновь возникающих вариантов. Это позволит принимать своевременные меры по контролю над распространением возбудителя.

Актуальность мониторинга вируса гриппа, в первую очередь у диких

птиц, вызвана тем, что, начиная с 1997 года, в странах Юго-Восточной Азии

и Китае начал формироваться эндемичный очаг вируса гриппа H5N1-

5

субтипа. Впоследствии вирус распространился по всему миру, вызывая вспышки заболевания в Азии, Европе, Африке. Вирус гриппа H5N1 -субтипа способствовал возникновению массовых эпизоотий домашних и диких птиц и являлся причиной заболевания и гибели нескольких сотен людей. Так, по данным ВОЗ на 3.06.11 зарегистрировано 555 случаев инфицирования людей вирусом гриппа H5N1-субтипа, из которых 324 закончились летальным исходом (WHO, 2011).

В связи с этим, мониторинг вируса гриппа А необходимо проводить в природных местообитаниях диких птиц, среди видов, имеющих наиболее важное эпизоотологическое значение, с точки зрения участия в распространении вируса гриппа.

Особое значение в исследованиях ВГА имеет территория Центральной Азии, поскольку через данный регион проходят основные миграционные маршруты диких птиц между странами Юго-восточной Азии и Россией, объединяя огромные популяции диких птиц различных видов в данном регионе (Е. Spackman, 2009). Этот факт не исключает вероятность заноса вируса гриппа на территорию России из очагов инфекции, находящихся в регионах, которые охватывают данные пролетные пути.

Помимо этого, физико-географическое положение Центральной Азии и экологические особенности орнитофауны данного региона могут создавать весьма благоприятные условия для реассортации геномов различных штаммов вируса гриппа. Это, в свою очередь, может способствовать увеличению гетерогенности вирусной популяции и обеспечивает формирование большего разнообразия вирусов, а также появления и распространения на различных территориях новых, ранее не описанных вариантов вируса гриппа (Д.К. Львов, 2004).

Следует, также, отметить, что подобные исследования на данной

территории немногочисленны (Д.К. Львов, 2004; Е. Spackman,

2009; Y. Sakoda, 2010). Имеющихся данных недостаточно, чтобы однозначно

б

делать заключения о закономерностях эволюции и экологических особенностях ВГА на территории Центральной Азии.

Вышеперечисленные факты делают актуальным изучение экологии вируса гриппа А на территории Центральной Азии, изучение разнообразия его вариантов, циркулирующих в популяциях диких птиц, а также исследование некоторых биологических свойств выделенных изолятов. Полученные результаты исследования вируса гриппа могут быть использованы при разработке диагностических тест-систем, вакцин и лекарственных препаратов. Также, данные исследования позволят оценить механизмы и пути распространения вируса, определить причины возникновения его новых вариантов, что дает возможность прогнозировать эпизоотическую ситуацию.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы - изучение разнообразия вариантов вируса гриппа А, циркулирующих у диких птиц на территории Центральной Азии, а также изучение некоторых биологических свойств выделенных изолятов.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии с использованием комплекса диагностических исследований для определения разнообразия его циркулирующих вариантов.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных изолятов вируса гриппа А.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В ходе работы получены современные данные о циркуляции вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии в 2003 по 2010 г. Впервые в

7

России выявлены наиболее важные в эпизоотологическом отношении территории в пределах Центрально-азиатского пролетного пути диких птиц и представлены результаты эпизоотологического мониторинга на территории России, республики Монголии и республики Казахстан.

От диких птиц на территории Центральной Азии выделено 25 оригинальных штаммов вируса гриппа А и изучены их основные биологические свойства.

Во время эпизоотии среди диких птиц на оз. Убсу-Нур, республика Тыва в 2010 г. было выделено три штамма вируса гриппа H5N1-субтипа, которые являлись высокопатогенными для кур и мышей.

Впервые на территории Азии выделен вирус гриппа Н13Ш-субтипа (штамм A/Herring gull/Mongolia/454/08), ранее не описанный для исследованного региона. Изучение биологических свойств данного штамма показало, что его целесообразно использовать для создания диагностического препарата (заявка на патент «Штамм вируса гриппа A/Herring gull/Mongolia/454/08/ Н13Ы8-субтипа, используемый при получении антигенсодержагцего субстрата и сыворотки для диагностических целей» с приоритетом изобретения № 2010138219 от 15.09.2010).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные в данной работе штаммы вируса гриппа А можно использовать в диагностических целях в качестве антигенов и создания на их основе диагностических сывороток. Полученные в ходе исследования данные о биологических свойствах выделенных штаммов вируса гриппа А, а также информация об их хозяевах позволят предполагать вероятные пути распространения вируса гриппа и, возможно, прогнозировать эпизоотологическую ситуацию в различных регионах Азии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Результаты эпизоотологического мониторинга вируса гриппа А среди диких птиц Центральной Азии.

2. Результаты изучения основных биологических свойств выделенных изолятов вируса гриппа А.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

1. Международная конференция "Zoonotic infectious diseases and tourism" (Улан-Батор, 2009);

2. Международная телеконференция «Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии» (Томск, 2010);

3. XIII Международный симпозиум по респираторным вирусным инфекциям «XIII International Symposium on Respiratory Viral Infections» (Италия, Рим, 2011);

4. Международная конференция «Russian-German Conference «Molecular Basis of Infections»» (Новосибирск, 2011);

5. Третий международный семинар «The 3rd international Young Researcher Seminar for Zoonosis Control» (Япония, Саппоро, 2011);

6. Четвертая международная конференция «4th oxford international influenza conference «Influenza 2011» (Англия, Лондон, 2011);

7. Вторая международная конференция «Астана Биотех 2011» (Казахстан, Астана, 2011.)

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации:

1. Шаршов, К.А. Некоторые биологические характеристики вновь выделенного высокопатогенного вируса гриппа H5N1 / К.А. Шаршов,

B.Ю. Марченко, И.М. Суслопаров А.Г. Дурыманов, A.M. Шестопалов, О.Г. Курская // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11). -№2-3.-С. 265.

2. Марченко, В.Ю. Выделение вируса гриппа А от диких птиц на территории западной части Монголии / В.Ю. Марченко, А.Ю. Алексеев, И.М. Суслопаров, К.А. Шаршов, Ф.А. Ильиных, С.И. Золотых, A.M. Шестопалов, Д. Церенноров, Д. Абмед, И.Г. Дроздов, Д. Отгонбаатар // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. -№6. -С. 18-21.

3. Донченко, A.C. Результаты мониторинга вируса гриппа среди диких птиц на территории Красноярского края (2008 г.) / A.C. Донченко, Ю.Г. Юшков, В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, А.Ю. Алексеев, Ф.А. Иль-иных, И.А. Савченко, Н.В. Карпова, А.П. Савченко, A.M. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2010. - № 7.-

C. 61-67.

4. Зайковская, A.B. Исключение этиологического значения вируса гриппа при массовой гибели диких птиц в Красноярском Крае / A.B. Зайковская, С.Г. Сайфутдинова, В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, А.Г. Дурыманов, С.И. Золотых, Л.В. Шматова, П.М. Демчин, Ю.Г. Юшков, A.C. Донченко, В.А. Недужко, A.M. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2011. -№ 1.-С. 88-93.

5. Марченко В.Ю. Характеризация вируса гриппа H5N1 субтипа,

выделенного во время вспышки среди диких птиц в России (Республика

10

Тыва) в 2010 г. / В.Ю. Марченко, К.А. Шаршов, Н.Ю. Силко, И.М. Суслопаров, А.Г. Дурыманов, A.B. Зайковская, А.Ю. Алексеев, О.В. Смоловская, А.П. Стефаненко, Е.М. Малкова, A.M. Шестопалов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - № 4. -С. 36-40.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Создана коллекция из 25 штаммов вируса гриппа А различных субтипов, выделенных на территории Центральной Азии в 2003-2010 гг. Данные штаммы приняты на патентное депонирование в коллекцию культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР».

По результатам работы 36 нуклеотидных последовательностей генов вируса гриппа зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить основой для конструирования праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 178 источников, в том числе 150 работ зарубежных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гриппа А

Грипп - опасное инфекционное заболевание, которое поражает достаточно широкий круг восприимчивых животных, а также человека. С момента первых упоминаний и до наших дней, грипп наносил колоссальный ущерб человечеству. Эпидемии характеризовались тяжелым течением заболевания, а также смертностью среди людей. Крупнейшей пандемией вируса гриппа в популяции людей за последние сто лет до сих пор считается пандемия, так называемого, «испанского» гриппа, который появился в начале прошлого столетия и унес жизни, по меньшей мере, 20 млн. человек по всему миру (А.Н. Reid et al., 1999). Она была вызвана вирусом гриппа H1N1-субтипа. Позже было показано, что штамм, вызвавший пандемию, произошел от вариантов, циркулирующих в популяциях птиц и свиней.

Благодаря высокой изменчивости ВГА на протяжении всей истории периодически возникали его новые высокопатогенные варианты, которые являлись причиной массовых эпизоотий диких и домашних птиц, сельскохозяйственных животных, а также случаев заболевания и гибели людей (A.W. Crosby, 1976; R.G. Webster et al., 1992;