Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вируса

Бабин, Юрий Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вируса
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вируса"

Бабин Юрий Юрьевич

005010558

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПОВ ИЗ, Н4, Н5 И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

03.02.02 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук д фГ1Э ?ГЛ?

Владимир-2012

005010558

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора

по НИР и развитию ФГБУ «ВНИИЗЖ» Дрыгин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Цыбанов Содном Жамьянович

доктор биологических наук,

заведующий лабораторией

ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии,

г. Щелково Матвеева Ирина Николаевна

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва.

Защита диссертации состоится <2/» февраля 2012 г. в «£.0 » часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан января 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, /

доктор биологических наук А.П. Пономарёв

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грипп птиц - вирусное заболевание диких и домашних птиц, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и пищеварения. На основании антигенных различий поверхностных белков вирус гриппа типа А подразделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (НА) и 9 подтипов по нейраминидазе. Особую опасность для птицеводства представляют высокопатогенные штаммы вируса гриппа птиц (ВГП) подтипов Н5 и Н7, способные вызывать высококонтагиозное заболевание со смертностью до 100%.

Вспышки заболевания, вызванного ВГП подтипа Н5, регистрировались повсеместно как среди диких, так и домашних птиц в течение последних 60 лет. Так, ВГП подтипа Н5 был выявлен в 1959 и 1991 гг. в Англии, в 1961 и 2004 г. в Южной Африке, в 1983г. в Ирландии [Alexander D.J., 2008], в 1967г. в России [Сюрин В.Н., 1972].

Начиная с 1996г., широкое распространение получил ВГП подтипа Н5 генетической линии A/goose/Guangdong/1/96 и вспышки высокопатогенного гриппа птиц были зарегистрированы на территории стран Европы, Африки и Ближнего Востока [Lupiani В. and Reddy S.M., 2008]. За последние 7 лет ВГП подтипа H5N1, относящийся к генетическим кладам 2.2 и 2.3.2 вызвал многочисленные вспышки заболевания как среди диких, так и домашних птиц в различных странах Европы и Азии [Львов Д. К., 2008; Reid S.M., 2011].

Считается, что птицы отрядов Anseriformes (гусеобразные) и Charadriiformes (ржанкообразные), являющиеся естественным резервуаром ВГП в природе, способны переносить вирус на значительные расстояния во время сезонных миграций [Sharov К., 2009; Prosser J.D., 2011]. В результате мониторинговых исследований, проведенных на территории Европы в период с 1998 г. по 2006 г. [Munster J.V., 2007], было установлено, что наиболее распространенными подтипами ВГП в популяциях диких птиц, являются подтипы НЗ и Н4.

При инфицировании домашних птиц некоторые изоляты ВГП подтипов НЗ и Н4 способны вызывать заболеваемость до 50% и смертность до 5%. Кроме того, смертность может достигать более высоких значений при инфицировании молодняка или ассоциированном течении заболевания [Swayne E.D. and Pantin-Jackwood М., 2008].

Через территорию РФ пролегают пять основных путей миграции птиц, перелетающих на значительные расстояния [Львов Д.К., 2004; Si Y., 2009], причем на территории европейской части РФ и Сибири расположены зоны гнездования не менее 16 видов птиц семейства Anseriformes [Gilbert М., 2008], являющихся естественными хозяевами ВГП. Большинство птиц, имеющих зоны гнездования на территории РФ, мигрируют на зимовку в Африку и ЮгоВосточную Азию [Lvov D.K., 2004], неблагополучные по высокопатогенному гриппу птиц.

Учитывая широкую распространенность ВГП подтипов НЗ и Н4, а также возможность заноса дикими мигрирующими птицами вируса подтипа Н5, особую значимость приобретают мониторинговые мероприятия и изучение биологических свойств изолятов вируса.

Степень разработанности проблемы. Предложены системы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени для выявления ВГП подтипа Н5 евразийской [Monne et al., 2008] и американской [Spackman et al., 2007] генетических линий, системы мультиплекс-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипа H5N1 [Payungpom et al., 2006; Wu et al., 2008]. Разработаны системы мультиплекс ПЦР для выявления ВГП подтипов Н5, Н7 и Н9 [Chaharaein et al., 2007], Н5 и Н9 [Saberfar et al., 2007]. Отечественными исследователями разработан методы ОТ-ПЦР для выявления ВГП типа А и подтипов ВГП Н5 и Н7 [Киреев и др., 2007].

Применение метода дуплекс ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП типа А и подтипа Н5, а также методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 позволяет сократить затраты времени, труда и

реактивов, необходимых для определения подтипа вируса и оценки его вирулентности.

Цель и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключалась в разработке методов выявления ВГП/А подтипов НЗ, Н4 и Н5 с помощью метода ПЦР, изучении биологических свойств и филогенетической взаимосвязи изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выявленных на территории РФ в период 2008-2010 гг.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в формате дуплекс в режиме реального времени (ОТ-дПЦР-РВ) для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработать методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучить биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.

4. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.

Научная новизна исследований.

1. Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработаны методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучены биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг., при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток МБСК.

4. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена НА 7 изолятов ВГП подтипа НЗ и 7 изолятов ВГП подтипа Н4, выявленных на территории РФ в течение 2008-2010 гг.

Практическая значимость исследования. Разработаны, одобрены Ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические рекомендации:

«Методические рекомендации по выявлению вируса гриппа А птиц и идентификации подтипа вируса гриппа птиц Н5 с помощью ОТ-дПЦР-РВ» (2011г.);

«Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц» (2010 г.);

«Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации» (2011 г.).

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 20082010 гг., опубликованы на Международной научно-практической конференции молодых ученых (Россия, 2010 г.) и международной конференции «Грипп птиц и здоровье человека» (Великобритания, 2009 г.).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования - генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку методов диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВГП, а также исследования биологических и филогенетических свойств изолятов ВГП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4,6, 8,10.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы - в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 260 источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 22 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Метод выявления ВГП типа А и подтипа ВГП Н5 на основе ОТ-дПЦР-РВ.

2. Методы выявления ВГП/А подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Результаты изучения биологических свойств ВГП подтипов НЗ и Н4.

4. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выявленных в РФ в 2008-2010 гг.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.в.н. Чвала И.А., к.б.н. Андриясову A.B., к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., биологу Елаткину Н.П. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

Вирусы. В работе использовали изоляты ВГП, выделенные от различных видов птиц на территории Российской Федерации в 2005-2010 гг., а также штаммы ВГП, полученные из NVSL (Ames, США). Также, в работе использовали штаммы вирусов инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц.

Куриные эмбрионы. Использовали 9-11-суточные эмбрионы СПФ-кур фирмы Lohman Tierzucht (Германия).

Лабораторные животные. В экспериментах использовали клинически здоровых 6-недельных цыплят, не имеющих антител к ВГП.

Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были синтезированы НПО «Синтол» (Россия).

Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм «Promega», (США), «Fermentas» (Литва), «Invitrogen» (США), «Вектор» (Россия), «Applied Biosystems» (США), ООО «Биоком» (Россия), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).

2.2. Методы

Выделение РНК. Вирусную РНК выделяли из образцов биологического материала с помощью набора «Рибо-Сорб» (ЦНИИЭМ, Россия), согласно инструкции изготовителя.

Обратная транскрипция. Для получения первой цепи кДНК реакционную смесь инкубировали в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США) при 42°С в течении 45 мин.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США). Реакционную смесь прогревали при 95°С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при температурном режиме: денатурация при 95°С в течение 30 сек, отжиг праймеров при 57°С в течение 30 сек, элонгация при 72°С в течение 1 мин.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Реакцию проводили в амплификаторе Rotor-Gene 6000 («Corbett Life Science», Австралия). Реакционную смесь прогревали при 95°С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при температурном режиме: денатурация при 95°С в течение 15 сек., отжиг праймеров при 55°С в течение 30 сек., элонгация при 72°С в течение 30 сек.

Получение плазмид, несущих последовательности генов Ml и НА. Для клонирования генов Ml и НА использовали плазмидные вектора pGEM-TEasy («Promega», США) и рТКР7,5 (НПО «Вектор», Россия).

Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК ВГП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.

Компьютерный анализ и сравнение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов гена НА. В работе были использованы последовательности гена НА штаммов ВГП из международной базы данных GenBank ('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Для

выравнивания последовательностей и построения дендрограмм использовали программы BioEdit 7.0 и MEGA З.1., соответственно.

Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в куриных эмбрионах. Из образцов биологического материала готовили 10%-ную суспензию на стерильном ФБР, и центрифугировали в течение 15 мин. при 1000g. Затем добавляли антибиотики, инкубировали при температуре 20°С в течение 60 мин и использовали для инокуляции эмбрионов СПФ-кур. Инокулированные эмбрионы инкубировали при температуре 37°С в течение 120ч. Выявление и идентификацию вируса проводили в РТГА.

Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в культуре клеток MDCK. В пробы биологического материала добавляли антибиотики и инкубировали в течение 1 часа при температуре 20-25°С. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирали и использовали для заражения монослоя клеток. Состояние монослоя контролировали под инвертированным микроскопом («Nicon», Япония). При появлении ЦПД культуральную жидкость исследовали в РГА, РТГА и ПЦР.

Определение титра инфекционной активности вируса гриппа птиц. В качестве тест-объектов для определения инфекционной активности вируссодержащего биоматериала использовали 11-суточные КЭ и монослой

культуры клеток MDCK. Титр вируса в исходном материале определяли по методу Кербера и выражали в единицах lg ЭИД50/см3 или ЦПД50/см3.

Определение индекса патогенности вируса гриппа. Проводили путем внутривенного заражения 6-недельных цыплят в соответствии с методическими рекомендациями МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, OIE, 2009).

Статистическая обработка результатов. Данные обрабатывались с использованием пакета прикладным программ StatSoft, версия 6.0.

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Разработка ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5. Для создания тест-системы ОТ-дПЦР-РВ были выбраны праймеры на гены матриксного белка (М) и НА подтипа Н5, при одновременном использовании которых не наблюдается их взаимного ингибирования. Схемы расположения праймеров представлены на рис. 1.

Рис.1. Схема расположения праймеров для амплификации фрагмента гена

М и НА в ОТ-дПЦР-РВ

Примечание: нумерация показана по последовательности генов М и НА изолята АЛЗоо5еЛЗиа^<1оп§/1/96(Н5М1). Для продукта амплификации указана длина. Буквами f и т обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно.

Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ. При тестировании десятикратных разведений аллантоисной жидкости, содержащей изоляты ВГП подтипов Н1-Н15, были определены минимальные титры вируса, выявляемые с использованием разработанного метода. Пределом чувствительности реакции

считали инфекционный титр вируса в наивысшем разведении, имевшем положительный результат в ОТ-дПЦР-РВ (табл. 1).

Таблица 1

Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ

Название штамма Чувствительность ОТ-дПЦР-РВ по гену М, lg ЭИД50/см3 Чувствительность ОТ-дПЦР-РВ по гену НА, 1е ЭИД50/ см

A/NJ/S/76-Equine-1 H1N7 2,6

A/pintail/Alberta/293/77 H2N9 2,6 -

А/dk/Ukraine/1/63 H3N8 2,6 -

A/mynah/Mass/71 H4N8 зд -

A/turkey/Tulа/551/05 H5N1 2,2 3,2

A/chicken/Volgograd/236/06 H5N1 2,0 3,0

A/grebe/Tyva/804/06 H5N1 2,4 3,4

A/chicken/Krasnodar/07/07 H5N1 2,0 3,0

A/Ty/Ontario/63 H6N8 2,4 -

A/turkey/ltaly/3675/99 H7N1 2,1 -

A/Ty/Ontario/6118/67 H8N4 2,1 -

A/gull/Maryland/4435/80 H9N5 2,6 -

A/ck/Germany/49 H10N7 3,1 -

A/dk/Memphis/546/74 Hl 1N9 1,4 -

A/dk/Alberta/60/76 H12N5 2,1 -

A/gull/Maryland/704/74 H13N6 2,1 -

A/mallard/Gurjev/263/82 H14N1 1,1 -

A/shearwater/W.Australia/2576/99 H15N9 1,6 -

- отрицательный результат

Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ составила 1,1-3,1 ЭИДзо/см3 для системы на ген М. Полученные данные указывают на возможность применения метода для выявления изолятов ВГП типа А, принадлежащих к различным подтипам. Для системы праймеров и зонда на ген НА подтипа Н5 чувствительность составила 3,0-3,4 1§ ЭИД50/см3.

Оценка эффективности амплификации фрагментов генов М и НА в ОТ-дПЦР-РВ. Для оценки эффективности амплификации были протестированы десятикратные разведения плазмид, несущих вставки генов НА и М ВГП АМиск/ЫоуоБ1Ыг5к/02/05 (H5Nl). Полученные графики эффективности амплификации представлены на рис.2 и 3. Для выявления ингибирования систем праймеров и зондов были протестированы разведения смеси плазмид, несущих вставки генов НА и М, и разведения плазмид в отдельности. Тестирование каждого разведения осуществлялось в трех

повторностях. Была получена линейная регрессия зависимости числа циклов ПЦР от разведений. Подставляя коэффициенты наклона в формулу расчета эффективности амплификации, получали значения эффективности амплификации (Е).

Рис.2. Линейность результатов при тестировании 10-кратных разведений плазмиды, несущей вставку гена М Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена М, на графике 2 - результаты, полученные при одновременной амплификации участков вставок генов М и НА.

г'« 0.9991: »« 0,2в5вО2144> .3.17928213 | 7 гг *0,8953; У *0.287621*48*» -3.40166481 | .

. • ' 5 1 -

1 * ' / ' ; ;

: ■ "Ч Г-

Рис.З. Линейность результатов при тестировании 10-кратных разведений плазмиды, несущей вставку гена НА Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена НА, на графике 2 - результаты, полученные при одновременной амплификации участков вставок генов М и НА.

При одновременной амплификации двух матриц, по сравнению с амплификацией одной матрицы, наблюдали некоторое снижение эффективности реакции. Для системы на ген М эффективность амплификации

снизилась с 95% до 90%, для системы на ген НА наблюдали меньшее снижение эффективности - с 93% до 92%. .

Специфичность ОТ-дПЦР-РВ. Для оценки специфичности разработанного метода ОТ-дПЦР-РВ были протестированы изоляты вируса гриппа, относящиеся к подтипам Н1-Н15 и, кроме того, штаммы вирусов: инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц. При тестировании данных вирусов, а также изолятов ВГП, неспецифических результатов получено не было.

Выявление ВГП/А подтипа Н5 в образцах биоматериала, отобранных от экспериментально зараженных птиц. Были протестированы клоакальные и ротоглоточные смывы, отобранные от птиц, экспериментально зараженных изолятом ВГП А/сЫскеп/Рптог5ку/85/08 Н5Ы1. Десять цыплят 6-недельного возраста были заражены интраназально в дозе 6,0 ^ ЭИД50/см3. Пробы отбирали ежесуточно и исследовали в ОТ-дПЦР-РВ, а также с помощью метода вирусовыделения в культуре клеток 1уГОСК.

При исследовании 24 клоакальных смывов вирус был выявлен в 19 пробах с помощью ОТ-дПЦР-РВ по гену М и в 17 пробах по гену НА. При исследовании ротоглоточных смывов было получено 23 положительных результата по обеим системам праймеров ОТ-дПЦР-РВ (табл. 2 и 3).

Таблица 2

Результаты исследования клоакальных смывов, отобранных от цыплят,

зараженных изолятом А/сІїіскеп/Ргітогеку/85/08 Н5ГУ1

Время отбора проб, сут. Результат выявления вируса в ОТ-дПЦР-РВ Результат выделения вируса в культуре клеток МОСК

по гену М по гену НА

1 5/10‘ 3/10 5/10

2 10/10 10/10 10/10

3 3/3 3/3 3/3

4 1/1 1/1 1/1

Всего 19/24 17/24 19/24

Примечание: 1 - в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

При исследовании клоакальных и ротоглоточных смывов с помощью метода вирусовыделения вирус был выделен из 19 и 20 проб, соответственно.

Таблица 3

Результаты исследования ротоглоточных смывов, отобранных от цыплят __________зараженных изолятом А/сЫскеп/Рптогеку/85/08 Н51Ч1____________

Время отбора проб, сут. Результат выявления вируса в ОТ-дПЦР-РВ Результат выделения вируса в культуре клеток МЭСК.

по М гену по Н5 гену

1 9/101 9/10 6/10

2 10/10 10/10 10/10

3 3/3 3/3 3/3

4 1/1 1/1 1/1

Всего 23/24 23/24 20/24

Примечание: - в числителе количество положительных результатов исследования, в знаменателе общее количество исследованных проб;

Тестирование образцов биоматериала от различных видов диких птиц. С помощью разработанного метода ОТ-дПЦР-РВ в 2010г. было исследовано 124 пробы биологического материала от различных видов диких птиц. Вирус гриппа типа А был выявлен в 13 пробах, ВГП подтипа Н5 был выявлен в 3 пробах. Положительные результаты ОТ-дПЦР-РВ подтверждены с помощью метода вирусовыделения в СПФ-эмбрионах кур.

2.3.2. Изучение изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4 Выделение вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4. С помощью метода вирусовыделения в КЭ в течение 2008-2010 гг. из проб биологического материала, отобранных от диких птиц, было выделено 16 изолятов ВГП, относящихся к подтипам НЗ и Н4 (табл. 4).

Таблица 4

Отряд Род Выделено изолятов Всего изолятов

2008 г. 2009 г. 2010 г.

Гусеобразные (Anseriformes) Утки (Anas) 2 1 10 13

Воробьинообразные (Passeriformes) Вороны (Corvus) 1 0 0 1

Воробьи (Passer) 2 0 0 2

От представителей отряда Апяеп/огтех выделяли вирусы, принадлежащие к подтипам НЗ и Н4. От птиц отряда /’оиеп/оготе.? (воробьинообразные) в 2008 г. были выделены вирусы, относящиеся к подтипу Н4. По нашим данным, случаев выделения ВГП подтипа А/Н4Ы6 от грачей и воробьев ранее не было описано.

Изучение биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4 при их культивировании в КЭ и монослое культуры клеток МОСК. С использованием 9-11 суточных КЭ и монослоя культуры клеток МЭСК были определены инфекционные титры изолятов ВГП/А подтипов НЗ и Н4. При культивировании вирусов в КЭ значения инфекционных титров составили 6,2-8,1 ^ ЭИД50/см3 для изолятов подтипа НЗ и 6,6-7,9 1" ЭИД50/см3 для изолятов подтипа Н4 (табл. 6).

Титр вирусов при их культивировании в монослое клеток МОСК не превышал значения 4,6 ^ ЦПД50/см3 для изолятов подтипа НЗ и 5,0 ^

ЦПД50/см3 для изолятов, относящихся к подтипу Н4. При этом титр ГА при культивировании вирусов подтипов НЗ и Н4 в монослое клеток МБСК не превышал значения 1:64. Максимальное накопление гемагглютинина в культуральной жидкости наблюдали через 4-5 сут после заражения монослоя клеток. Первые признаки ЦПД вируса в культуре клеток КЮСК наблюдали через 3 сут после заражения монослоя.

Определение индексов патогенности изолятов ВГП подтипа Н4Ш. Индексы патогенности были определены для изолятов, выделенных от грача и воробья: в каждом из экспериментов после инфицирования цыплят наблюдали слабо выраженные признаки заболевания. Инкубационный период болезни длился не менее 4 сут. Определенные индексы патогенности изолятов А/гоок/КхШоу/30/08 Н4Ы6 и А/5рагго\\'/11о51;оу/33/08 Н4Ы6 имели значения 0,19 и 0,22, соответственно, что характеризует данные вирусы как низковирулентные.

2.3.3. Разработка методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ

и Н4. В результате анализа нуклеотидных последовательностей ВГП подтипов НЗ и Н4 из банка данных (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/ Database) были выбраны специфические праймеры для выявления соответствующих подтипов (рис. 4).

Рис.4. Схема расположения праймеров для амплификации фрагмента гена НА ВГП подтипа НЗ и Н4 Примечание: нумерация показана по последовательности гена НА изолятов АВ292668 А/аиск/икгате/1/1963 (НЗШ) (а) и ОШ52381 АА1иск/С2есЬо51оуаШ1956 (Н4Ы6) (б) для систем праймеров, амплифицирующих фрагмент гена НА подтипов НЗ и Н4, соответственно. Для продуктов амплификации указана длина. Буквами Гиг обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно.

Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4. Определение аналитической чувствительности разработанных методов ОТ-ПЦР проводили с использованием десятикратных разведений вируссодержащей аллантоисной жидкости изолятов ВГП подтипов НЗ (АЛеа1/Кгазпоуагзк/1581/08 (НЗЫ6), А/1еа1/Кгазпоуагзк/501/10 (НЗШ), А/ша11аг(1 /Кгазпоуагек/453/10 (НЗШ)) и Н4 (А/зИоуеПег/КгазпоуагзкЛ 586/08 (Н4Ы6), А/та11агс1/У1асНгшг/446/09 (Н4Ы2), А/рт1а11/КгазпоуагБк/508/10 (Н4Ы6)). Аналитическая чувствительность предложенных методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 находилась на уровне 3,4-3,9 ^ ЭИД50/см3.

Специфичность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и

Н4. Для оценки специфичности разработанных методов ОТ-ПЦР были протестированы изоляты ВГП, относящиеся к подтипам Н1-Н15 и, кроме того, штаммы других вирусов: инфекционного бронхита, инфекционного

ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и метапневмовируса птиц. При тестировании данных вирусов, а также изолятов ВГП, неспецифических результатов получено не было.

Выявление ВГП/А подтипа НЗ и Н4 в образцах биоматериала, отобранных у экспериментально зараженных птиц Были протестированы клоакальные и ротоглоточные смывы, отобранные от птиц, экспериментально зараженных изолятами ВГП типа А. Для проведения эксперимента сформировали 2 группы цыплят и провели заражение: 1) 10 птиц интраназально заразили в дозе 6,0 ^ ЭИД50/см3 АЛеа1/Кгазпо1аг5к/515/10 (НЗШ); 2) 10 птиц интраназально заразили в дозе 6,0 ^ ЭИД50/см3 А/гоок/ИхЫоу/ЗЗ/ОЗ (Н4Ы6). В качестве контроля содержали еще 5 цыплят. Пробы отбирали ежесуточно и исследовали в ОТ-дПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и с помощью метода вирусовыделения в культуре клеток МЭСК.

При исследовании ротоглоточных смывов от цыплят, зараженных изолятом подтипа НЗШ, положительный результат был получен для 4 проб в ОТ-дПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и вирусовыделении (табл. 5). Вирус в смывах выявляли на 3 и 4 сут после заражения с использованием всех использованных методов.

Таблица 5

Результаты исследования ротоглоточных и клоакальных смывов, отобранных от цыплят, зараженных вирусом гриппа АЛеа^Кгавпоигз к/515/10 НЗШ

Вид проб Результат выявления вируса в ОТ-дПЦР-РВ Результат выявления вируса в ОТ-ПЦР Выделение вируса в культуре клеток MDCK

по М гену по Н5 гену

Ротоглоточные смывы 4/70 0/70 4/70 4/70

Клоакальные смывы 6/70 0/70 4/70 5/70

При исследовании клоакальных смывов положительный результат был получен для 6 проб в ОТ-дПЦР-РВ, 4 проб - в ОТ-ПЦР и 5 проб в вирусовыделении. При этом вирус выявляли с 3 по 6 сут в ОТ-дПЦР-РВ, на 3 и 4 сут в ОТ-ПЦР, и на 3,4 и 6 сут с помощью метода вирусовыделения (табл. 5).

При исследовании ротоглоточных смывов от цыплят, зараженных изолятом подтипа Н4Ы6, вирус выявляли со 2 по 5 сут в ОТ-дПЦР-РВ и ОТ-ПЦР. С помощью метода выделения, вирус выявляли на 3 и 4 сут, при этом положительный результат был получен для 8 проб в методах ПЦР и для 6 в вирусовыделении. При исследовании клоакальных смывов вирус выявляли со 2 по 4 сут с использованием всех методов, при этом положительный результат был получен для 8 проб в ОТ-дПЦР-РВ и 7 проб в ОТ-ПЦР и вирусовыделении (табл. 6).

Таблица 6

Результаты исследования ротоглоточных и клоакальных смывов, отобранных от цыплят, зараженных вирусом гриппа А/гоок/Ш^оу/08 Н4М

Вид проб Результат выявления вируса в ОТ-дПЦР-РВ Результат выявления вируса в ОТ-ПЦР Выделение вируса в культуре клеток МЭСК

по М гену по Н5 гену

Ротоглоточные смывы 8/70 0/70 8/70 6/70

Клоакальные смывы 8/70 0/70 7/70 7/70

2.3.4. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов ВГП/А подтипов НЗ и Н4 Анализ вариабельности последовательности гена НА вируса гриппа птиц подтипа НЗ. На основе участка последовательности гена НА ВГП подтипа НЗ была построена дендрограмма (рис. 5), включающая вирусы, выделенные на территории РФ в период с 2008 по 2010 гг.

Вирусы АЛеа1/Кгазпо1аг5к 1581/08(НЗЫ6), А/таНагё/КгаБШмагск /45Э/10(НЗШ), АЛеаЖгазшйагекМб 1/10(НЗШ), АЛеа1/Кга5П01аг5к/464 /10(НЗШ), АЛеа1/Кга5потгзк/515/10(НЗШ) и А/§геус1иск/Кга8по1аг5к /528/10(НЗШ) вошли в группу изолятов, выделенных на территории Юге-

Восточной и Средней Азии. В группу вирусов, выделенных на территории Европы и Африки, вошел изолят АЛеа1/Кгазпо1аг5к/501 /10 (НЗШ).

Вирусы, отнесенные к азиатской группе, имели максимальную степень гомологии (97-99%) по изучаемому фрагменту гена с изолятами, выделенными ранее на территории Сибири и Монголии. Изолят АЛеа^КгаБгкмагек/бОШО (НЗШ) имел наибольшую степень сходства (98%) с изолятами А/соттоп1еа1/5\уес1еп/1/2003(НЗ№) и А/та11агс1/5\ук2ег1ап(1 /\VV4060167/2006 (Н3№).

—АЛеаІ/КгавпоІагек/бІб/ІО НЗЫ8

----АЛеаІ/КгавпоІагек 1581/08 НЗИб

-------------------А/дгеу йиск/Кгавпоіагек/бгв/Ю Н3№8

■ АЛеаІ/КгавпоіагекМбІЛО Н3№

1-А

•А/1еаІ/Кга8ПОІагек/4$4/10 Н3№

•А/гесІ сгевіеіі росЬіагсШопдоІіа/1915/2006 НЗМ6 —A/duck^Siberia/100/2001 НЗЫ8 ■А/ациаіїс Ьігсі/Нопд Копд/399/99/ Н3№

-А/сЬіскеп/І_аоз/А0573/2007 НЗМ8 -А/дасЬмаІІ/АКа1/1328/2007 НЗМ8

СЕ

- А/таІІагс1/Кга8поІагзк/453/10 НЗЫ8 -АЛигг«Іопе/№Ьегіап<І8/1/2007/НЗМ8

----А/Апаэ ріа№угііупсНоз/враіп/0454/2006/ НЗМ8

------------------------------А/реІісап/2атЬіа/01/2006 НЗИб

АЛеаІ/Кгавпоіагак/бОІ/Ю HЗN8 ----А/таІІагі/РіпІапсі/12072/06 НЗЫ8

УтаІІаг<^іІ2ЄГІапсУ\ЛЛ/4060167/2006/НЗМ5 Усоттоп ІеаІ/8ууес1еп/1/2003 НЗМЗ -А/аиск/икгаіпе/1/1963 НЗМ8

--------------------------------А/сІискЛ/ісЛогіа/1992 НЗЫв

-А/таІІагсІ/МагуІапсі/1127/2005 НЗМ8

-А/ вЬоуеІег/СаІГЇотіа/НКАЛ/РІ 021/2007/ НЗМ7

Рис.5. Филогенетическое положение изолятов ВГП подтипа НЗ по фрагменту гена НА (721-1084 н.)

Вирусы подтипа НЗ, выделенные от птиц, имели консервативную аминокислотную последовательность сайта расщепления НА: РЕКрТІШЬР, характерную для низковирулентных изолятов.

Анализ вариабельности последовательности гена НА вируса гриппа птиц подтипа Н4. На основе участка последовательности гена НА ВГП подтипа Н4 была построена дендрограмма (рис. 6), включающая вирусы, выделенные на территории РФ в период с 2008 по 2010 гг.

Изоляты АЛеа1/Кгазпо1аг5к/506/10(Н4№), А/рЫаП/КгаБ^агек /508/10 (Н4Ы6), А/таНаг(1/ Кгазпо1аг5к/517/10(Н4Мб), А/\\'_с1иск/У1асНггпг/534/10 (Н4Ы6) и А/5Ьоуе11ег/Кга5по1аг5к/1586/08/ (Н4Ш) вошли в группу изолятов,

выделенных на территории Азии. Изоляты А/гоок/11о51:оу/30/08 (Н4Ы6) и А/та11агс1/У1асН1Шг/446/09 (Н4Ы2) вошли в группу вирусов, выделенных на территории Европы и Африки.

Рис.6. Филогенетическое положение изолятов подтипа Н4 по фрагменту

Изоляты ВГП А/Н4, вошедшие в азиатскую группу, имели 97% сходства нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА с вирусами, выделенными в Казахстане. Для изолята А/гоокЛ1о51оу/30/08 (Н4Ы6)

наибольший процент сходства (97%) наблюдали с вирусами, выделенными на территории Швеции, Чехии, Нидерландов и Южной Африки. Вирус

АЛеаМКгавпоюгек/бОб/Ю №N6

99 А/вЬоуеИег/Кгаэпснагзк/1586/08 Н4И6

А/та11агс1/Кга5по1аг5к/517/10 Н4№

А/р1п1аП/Кга$по!агзк/508/10 Н4№

----------АММ duck/Vlad¡m¡r/534/10 Н4М6

-A/tufted duck/Aktau/1456/2006 Н4Ы6

ч_

-АМиск/Нипап/8-19/2009 Н4Ы2

100

-АМискМетат/01Е-2454/2009 Н4Ы6

А/та11агйЛ/^1гтг/446/09 НЛЫ2

-АМиск/Боит АМса/1233А/2004 Н4М8

--------------А/доо5е/гатЫа/07/2008 Н4Ы6

А/гоок/РовЬу/ЗО/Ов Н4Ы6

-A/dunlin/Sweden/1/2005 И4Ы6

|—A/mallard/Czech ЯериЫ1с/12652/2007 Н4Ы6 71 ^—А/та1!агс1/Ме1Ьег1апй5/7/2007 Н4№ -A/duck/Czechoslovakia/1956 Н4Ыб

—A/red-necked вАпУА^гаИаЛ/гСКМ Н4М8 -А/рекю duck/Cal^fom¡a/P30/2006/H4N2 ----------А/рinta.il/А1а&ка/310/2005 Н4М6

0.02

гена НА (745-1143 н.)

А/та11агс1/У1асИпйг/446/09 (Н4№) имел наибольший процент сходства (97%) с вирусами А/таИагё/СгесЬ ЯериЬПс/12652/2007 (H4N6) и

A/Inallard/Netherlands/7/2007 (Н4Ы2).

В таблице 7 представлена аминокислотная последовательность сайта расщепления НА изолятов ВГП подтипа Н4, выделенных в период 2008-2010 гг.

Таблица 7

Структура сайта расщепления НА изолятов ВГП подтипа Н4

Изолят Последовательность аминокислот сайта расщепления НА

А/гоок/Яо51оу/30/08 (Н4ІЇ6) НАвИДи

АйоуеІІег/Кгазпоіагек/1586/08 (Н4Ы6) КЕ.8ЯОЬР

А/ша11агс1/У1аі1ітіг/446/09 (Н4Ы2) KA.SR.GLF

АЛеаІ/Кгазпоіагек^Об/Ю (Н4Ы6) КРЫСЬЕ

А/ріпІаі1/Кга5поіаг5к/508/10 (Н4Ы6) КЬЖСЬР

А/та11аг(]/Кгазпоіаг5к/517/10 (Н4Ы6) КЕ8ЯСЬР

АМіШ с!иск/УШітіг/534/10 (Н4Ы6) кдваоьр

Примечание: жирным шрифтом выделена аминокислота-маркер принадлежности к группе.

Большинство известных сайтов изолятов ВГП А/Н4 имеют вид КАХ1ЮЬР, где X - одна из аминокислот: Т-для изолятов из Северной Америки, Р - для вирусов, выявляемых в Сибири, и 8 - для вирусов, циркулирующих на территории Евразии.

3. ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ, позволяющий одновременно выявлять вирус гриппа птиц типа А и подтипа Н5. Аналитическая чувствительность разработанного метода составила 1,1-3,1 ^ ЭИД50/см3 для системы праймеров на ген М и 3,0-3,4 ^ ЭИД50/см3 для системы праймеров на ген НА.

2. В течение 2008-2010 гг. из образцов биологического материала с помощью метода вирусовыделения в куриных эмбрионах получено 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа НЗ и 9 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4.

3. Изучены биологические свойства изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4 при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток МОСК. Полученные значения инфекционных титров вирусов подтипа НЗ составили 6,2-8,1 ^ ЭИД50/см3, вирусов подтипа Н4 - 6,6-7,9 1§ ЭИД50/см3.

Титр вирусов при их культивировании в монослое клеток MDCK не превышал значения 4,6 lg ЦПД50/см3 для изолятов подтипа НЗ и 5,0 lg ЦПД50/см3 для изолятов, относящихся к подтипу Н4.

4. Разработаны методы ОТ-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4. Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 составила 3,4-3,9 lg ЭИД50/см3.

5. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена НА 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа НЗ и 7 изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4. В результате проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что данные изоляты входят в группы европейских и азиатских вирусов. Анализ аминокислотной последовательности сайта расщепления гена НА изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4 выявил наличие аминокислоты Ser в позиции 342 белка НА1, являющейся маркером вирусов евразийской генетической линии.

6. Изученные изоляты ВГП подтипа Н4 имели аминокислотную структуру сайта расщепления НА: RASRGLF, KESRGLF и KASRGLF, изоляты подтипа НЗ - KQTRGLF. Данная структура сайта расщепления изолятов ВГП характерна для низковирулентных вирусов. Значения индексов патогенности изолятов ВГП подтипа H4N6, выделенных в 2008г. от синантропных птиц, составили 0,19 и 0,22, что также подтверждает низкую вирулентность данных вирусов.

4. Практические предложения

Для практического использования предлагаются одобренные Ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

1. Методические рекомендации по выявлению вируса гриппа А птиц и идентификации подтипа вируса гриппа птиц Н5 с помощью ОТ-дПЦР-РВ.

2. Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц.

3. Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации.

5. Список использованной литературы

1. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции / Д.Е. Киреев, Д.С. Аканина, Т.В. Гребенникова [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т.52, №4. - С. 17-22.

2. Об эпизоотологическом потенциале вируса гриппа птиц / В.Н. Сюрин,

Н.Г. Осидзе, З.Я. Чистова, Ю.В. Родин // Ветеринария. - 1972. - № 8. - С. 41-43.

3. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке / Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, Н.А. Власов [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т.53, № 5.- С. 4-9.

4. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002гг.) / Д.К. Львов, С.С. Ямникова, И.Т. Федякина [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2004. -Т. 49, №3,-С. 17-24.

5. Alexander D.J. An overview of the epidemiology of avian influenza // Vaccine. - 2008. - Vol. 25, N 30. - P. 5637-5644.

6. A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and В and subtypes H5 and N1 / C. Wu, X. Cheng, J. He [et al.] // J. Virol. Methods.-2008.-Vol. 148, № 1-2. - P. 81-88.

7. Avian influenza (H5N1) outbreak among wild birds, Russia, 2009 / K. Sharov, N. Silko, I. Sousloparov [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16. - P. 349-51.

8. Detection of H5, H7 and H9 subtypes of avian influenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction / B. Chaharaein, A.R. Omar, I. Aini [et al.] // Microbiol. Res. - 2007. - Vol. 164. - P. 174-179.

9. Development and validation of a one-step real time PCR assay for simultaneous detection of subtype H5, H7, and H9 avian influenza viruses /1. Monne,

S. Ormelli, A. Salviato [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 1769— 1773.

10. Development of a realtime reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 haemagglutinin subtypes / E. Spackman, D.A. Senne, T.J. Myers [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 32563260.

11. Evolution of H4, H5 influenza A viruses in natural ecosystems in Northern Eurasia (2000-2002) / D.K. Lvov, S.Y. Yamnikova, I.T. Fedyakina [et al.] // International Congress Series. - 2004. - Vol. 1263.-P. 169-173.

12. First reported incursion of highly pathogenic notifiable avian influenza A H5N1 viruses from clade 2.3.2 into European poultry / S.M. Reid, W.M. Shell, G. Barboi [et al.] // Transbound Emerg. Dis. - 2011. - Vol. 58, N 1. - P. 76-78.

13. Gilbert M., Slingenbergh J., Xiao X. Climate change and avian influenza // Rev. Sci Tech. - 2008. - Vol. 27, N 2. - P. 459-466.

14. Lupiani B., Reddy S. M. The history of avian influenza // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 32, N 4. - P. 311-323.

15. Saberfar E., Forghani-Fard M.M., Mosavi M. Multiplex reverse transcriptase-PCR assay for typing and subtyping of influenza A (H5 & H9) virus in Iran // Iran Biomed. J. - 2007. - Vol. 11, № 2. - P. 69-74.

16. Single step multiplex real-time RT-PCR for H5N1 influenza A virus detection / S. Payungpom, S. Chutinimitkul, A. Chaisingh [et al.] // J. Virol. Methods. - 2006. - Vol. 131, N 2. - P. 143-147.

17. Spatial, temporal, and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds / V.J. Munster, C. Baas, P. Lexmond [et al.] // PLoS Pathog. - 2007. - Vol.3, № 5. - P. 630-638.

18. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns / Y. Si, A. K. Skidmore, T. Wang [et al.] // Geospatial Health. - 2009. - Vol.

4, N 1.-P. 65-78.

19. Swayne D.E., Pantin-Jackwood M. Pathobiology of avian influenza virus infections in birds and mammals // Avian Influenza / ed. D.E. Swayne. - Ames, Iowa, USA etc., 2008. - Chap. 5. - P. 87-122.

20. Wild bird migration across the Qinghai-Tibetan Plateau: a transmission route for highly pathogenic H5N1 / D.J. Prosser, P. Cui, J.Y. Takekawa [et al.] // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6, N 3. - P. 1-14.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Биологические свойства вируса гриппа A/H4N6, выделенного от синантропных птиц в Ростовской области / Л.Ю. Абрамова, И.А. Чвала, A.B. Андриясов, И.П. Пчёлкина, С.Н. Колосов, Ю.Ю. Бабин // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 6-7.

2. Анализ вариабельности фрагмента гена гемагглютинина изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4, выделенных на территории РФ в 20082010 гг. / Ю.Ю. Бабин, И.А. Чвала, A.B. Андриясов, С.Н. Колосов // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. - С. 8-10.

3. ОТ-дуплекс-ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса гриппа птиц типа А и идентификации подтипа А/Н5 / Ю.Ю. Бабин, И.А. Чвала, A.B. Андриясов // Труды федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, - 2011. - Т. 9. - С. 55-62.

4. Особенности течения гриппа А у уток-крякв, вызванного

A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 / И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, М.И. Шульпин, Ю.Ю. Бабин, A.B. Варкентин, М.Ю. Щелканов, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов, В.В. Дрыгин, Л.Ю. Абрамова, H.A. Власов // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С. 25-26.

5. Characteristics of influenza A infection caused by

A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 virus in mallards / I.A. Chvala, L.O. Scherbakova,

L.Y. Abramova, M.I. Shulpin, A.V. Varkentin, Y.Y. Babin, N.S. Mudrak, V.V. Drygin // BirdFlu 2009: Avian Influenza and Human Health. - Oxford, UK, - 2009. -P. 23-25.

Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 80 экземпляров, январь 2012 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабин, Юрий Юрьевич, Владимир

61 12-3/503

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ

ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи № от г. экз. №

БАБИН Юрий Юрьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПОВ НЗ, Н4, Н5 И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

03.02.02 «Вирусология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор ДРЫГИН Владимир Викторович

Владимир - 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГ - вирус гриппа

ВГП - вирус гриппа птиц

ВГП/А - вирус гриппа птиц типа А

ВНБ - вирус ньюкаслской болезни

ВПГП - высокопатогенный грипп птиц

ГП - грипп птиц

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - ДНК-копия с РНК матрицы

КЭ - куриный эмбрион

МЭБ - всемирная организация охраны здоровья животных н. п. - нуклеотидные пары ОТ - обратная транскрипция ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ОТ-дПЦР-РВ - обратная транскрипция полимеразная цепная реакция в

режиме реального времени в формате дуплекс

РГА - реакция гемагглютинации

РДП - реакция диффузионной преципитации

РНП - рибонуклеопротеин

РТНА - реакция торможения нейраминидазной активности

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

НПГП - низкопатогенный грипп птиц

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ЦПД - цитопатическое действие

ЭЭЖ - экстраэмбриональная жидкость

НА - гемагглютинин

МЭСК - культура клеток почки собаки 1УР1 - внутривенный индекс патогенности NA - нейраминидаза

ГЧУ8Ь - Национальная ветеринарная лаборатория, г. Эймс, США

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................11

1.1. Историческая справка........................................................................................11

1.2. Классификация и номенклатура вируса гриппа.............................................12

1.3. Строение вируса гриппа....................................................................................14

1.4. Цикл репликации вируса гриппа......................................................................15

1.5. Молекулярные детерминанты патогенности, вирулентности и ограничения круга хозяев.........................................................................................18

1.5.1. Гемагглютинин................................................................................................19

1.5.2. Белок РВ2.........................................................................................................20

1.5.3. Белок NS1.........................................................................................................22

1.5.4. Белок PB1-F2...................................................................................................24

1.6. Распространение вируса гриппа в популяциях диких птиц..........................24

1.7. Инфицирование млекопитающих вирусом гриппа птиц...............................28

1.8. Инфицирование рептилий и земноводных вирусом гриппа птиц................31

1.9. Молекулярно-генетические методы в диагностике вируса гриппа птиц.....32

1.9.1. Применение ОТ-ПЦР в диагностике вируса гриппа птиц..........................32

1.9.2. Применение ОТ-ПЦР-РВ в диагностике вируса гриппа птиц....................33

1.9.3. Применение мультиплекс-ПЦР в диагностике вируса гриппа птиц.........37

1.9.4. Применение ДНК-биочипов в диагностике вируса гриппа птиц..............39

1.10. Заключение по обзору литературы................................................................41

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................42

2.1. Материалы..........................................................................................................42

2.1.1. Вирусы..............................................................................................................42

2.1.2. Куриные эмбрионы.........................................................................................43

2.1.3. Лабораторные животные................................................................................43

2.1.4. Праймеры.........................................................................................................44

2.1.5. Растворы и буферные смеси..........................................................................44

2.1.6. Ферменты.........................................................................................................45

2.1.7. Плазмидные векторы......................................................................................44

2.1.8. Коммерческие наборы....................................................................................45

2.1.9. Оборудование..................................................................................................45

2.2. Методы................................................................................................................46

2.2.1. Выделение РНК...............................................................................................46

2.2.2. Обратная транскрипция..................................................................................47

2.2.3. Полимеразная цепная реакция.......................................................................47

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени....................47

2.2.5. Получение плазмид, несущих последовательности генов М1 и НА.........48

2.2.6. Определение первичной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК................................................................48

2.2.7. Компьютерный анализ и сравнение первичной нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА................................................................49

2.2.8. Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в куриных эмбрионах...................................................................................................................49

2.2.9. Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в культуре клеток МВСК.........................................................................................................................50

2.2.10. Определение титра инфекционной активности вируса гриппа птиц......51

2.2.11. Определение индекса патогенности вируса гриппа птиц.........................52

2.2.12. Статистическая обработка результатов......................................................53

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................................54

3.1 Разработка метода ОТ-дПЦР-РВ для выявления вируса гриппа птиц типа А и идентификации подтипа Н5..............................................................................54

3.1.1. Выбор праймеров для ОТ-дПЦР-РВ.............................................................55

3.1.2. Аналитическая чувствительность ОТ-дПЦР-РВ.........................................56

3.1.3. Оценка эффективности амплификации фрагментов генов М и НА в ОТ-дПЦР-РВ.....................................................................................................................58

3.1.4. Специфичность ОТ-дПЦР-РВ........................................................................60

3.1.5. Выявление вируса гриппа птиц подтипа Н5 в образцах биоматериала, отобранных от экспериментально зараженных птиц............................................61

3.1.6. Тестирование образцов биоматериала от различных видов диких птиц.. 62

3.2. Выделение и изучение изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4.... 64

3.2.1. Выделение изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4.....................64

3.2.2. Изучение биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4 при их культивировании в КЭ и монослое культуры клеток МБСК..........................................................................................................................66

3.2.3. Определение индексов патогенности изолятов ВГП подтипа Н4Ы6........70

3.3. Разработка методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4.........71

3.3.1. Выбор праймеров для выявление вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4................................................................................................................................71

3.3.2. Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4...................................................................74

3.3.3. Специфичность методов ОТ-ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4......................................................................................................75

3.3.4. Выявление вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4 у экспериментально зараженных птиц.......................................................................................................75

3.4. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц подтипов НЗ и Н4.............................................................................................79

3.4.1. Анализ вариабельности последовательности гена НА вируса гриппа птиц подтипа НЗ........................................................................................................79

3.4.2. Анализ вариабельности фрагмента гена НА изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н4........................................................................................................85

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................93

5. ВЫВОДЫ.............................................................................................................100

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................................102

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................103

8. ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................135

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Грипп птиц - вирусное заболевание диких и домашних птиц, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и пищеварения. На основании антигенных различий поверхностных белков вирус гриппа типа А подразделяют на 16 подтипов по гемагглютинину и 9 подтипов по нейраминидазе. Особую опасность для птицеводства представляют высокопатогенные штаммы ВГП подтипов Н5 и Н7, способные вызывать высококонтагиозное заболевание со смертностью до 100%.

Через территорию РФ пролегают пять основных путей миграции птиц, перелетающих на значительные расстояния [Львов Д.К., 2004; Si Y., 2009], причем на территории европейской части РФ и Сибири расположены зоны гнездования не менее 16 видов птиц семейства Anseriformes [Gilbert М., 2008], являющихся естественными хозяевами ВГП. Большинство птиц, имеющих зоны гнездования на территории РФ, мигрируют на зимовку в Африку и Юго-Восточную Азию [Lvov D.K., 2004], неблагополучные по высокопатогенному гриппу птиц.

Степень разработанности проблемы. Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП подтипа Н5 евразийской [Моппе et al., 2008] и американской [Spackman et al., 2007] генетических линий, системы мультиплекс-ПЦР для выявления ВГП подтипа H5N1 [Payungporn et al., 2006; Wu et al., 2008]. Разработаны системы мультиплекс ПЦР для выявления ВГП подтипов Н5, Н7 и Н9 [Chaharaein et al., 2007], Н5 и Н9 [Saberfar et al., 2007]. Отечественными исследователями разработан методы ОТ-ПЦР для выявления ВГП типа А и подтипов ВГП Н5 и Н7 [Киреев и др., 2007].

реактивов, необходимых для определения подтипа вируса и оценки его вирулентности.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработать методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучить биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.

Научная новизна исследований.

1. Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.

2. Разработаны методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Изучены биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг., при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток МОСК.

«Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц» (2010 г.);

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 6, 8, 10.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 260 источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 22 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Метод выявления ВГП типа А и подтипа ВГП Н5 на основе ОТ-дПЦР-РВ.

2. Методы выявления ВГП/А подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.

3. Результаты изучения биологических свойств ВГП подтипов НЗ и Н4.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.в.н. Чвала H.A., к.б.н. Андриясову A.B., к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., биологу Елаткину Н.П. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Историческая справка

Первое упоминание о гриппе птиц относится к 1878 году, когда итальянский исследователь Э. Перончито (1847-1936) описал заболевание кур, характеризующееся высокой смертностью и быстрым распространением. Первоначально заболевание связывали с острой септицемической формой холеры птиц. Однако, в 1880 году, вскоре после первого описания, Риволта и Дельпрато показали отличие данной инфекции от холеры птиц на основе клинических и патологоанатомических признаков и назвали болезнь Typhus exudatious gallinarum. С начала 20 века грипп птиц стал эндемичным заболеванием в Италии и Центральной Европе. Нужно отметить, что отсутствие диагностических методов и циркуляция ВНБ совместно с ВГП делали невозможным точное определение возбудителя вспышек заболеваний домашней птицы, произошедших в начале 20 века. Первые вспышки гриппа птиц в Северной Америке зарегистрированы в 1924-1925 годах. Возможно, что вирус вызвавший эпиз�

Информация о работе

Бабин, Юрий Юрьевич
кандидата биологических наук
Владимир, 2012
ВАК 03.02.02

Диссертация

Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вируса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы