Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства вируса гриппа свиней типа A и усовершенствование методов серологической диагностики

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вируса гриппа свиней типа A и усовершенствование методов серологической диагностики"

На правах рукописи

РЕМЫГА Степан Геннадьевич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ ТИПА А И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

03.02.02 «Вирусология»

2 8 НОЯ 2013

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир-2013 005539730

005539730

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Груздев Константин Николаевич

Официальные оппоненты:

Ирза Виктор Николаевич

доктор ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга.

Белоусов Василий Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «ЦНМВЛ», заместитель директора.

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии).

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в «14 » часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских ->_ -Г)

диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», ¿ЛУ-^ГГТ^*?> кандидат биологических наук Жбанова Татьяна Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Грипп свиней (инфлюэнца свиней, энзоотическая бронхопневмония) - высоко контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся резко выраженной лихорадкой, общей слабостью и поражением органов дыхания, сопровождающимся кашлем, чиханием, и выделением назальной слизи. Вирус гриппа свиней (ВГС) может вызывать заболевание у людей и, наоборот, установлена возможность заражения свиней вирусом гриппа человека [4].

ВГС является широко распространенным и значимым возбудителем респираторного заболевания у свиней [5]. Основные подтипы данного вируса - H1N1, H3N2 и H1N2. Клинические проявления заболевания могут присутствовать в стаде несколько недель, по мере распространения вируса от свиньи к свинье внутри популяции. На течение и тяжесть заболевания свиней гриппом могут влиять ко-инфекционные агенты, возраст животных, общее состояние здоровья и иммунного статуса и, потенциально, штамм ВГС [4, 5. 9].

Эпизоотическая ситуация по гриппу свиней имеет большое социальное значение в связи со способностью вируса к реассортации и возникновению штаммов, высоко патогенных для людей [13].

Пандемии гриппа, возникшие в различные временные интервалы XX века, разнились по своей тяжести, от легких до катастрофических. К ним можно отнести пандемию Испанского гриппа H1N1 («испанки») 1918 года, унесшего по разным данным от 20 до 50 миллионов жизней людей по всему миру. Пандемия 1957 года (Азиатский грипп) и 1968 года (Гонконгский грипп) унесли 1 и 0,5 миллиона жизней людей по всему миру, соответственно [1,9, 8].

Эпизоотическая ситуация по гриппу обострилась после заболевания и гибели людей от "нового" вируса гриппа свиней типа А, начавшегося в апреле 2009 г. в Мексике [4, 11]. Генетический анализ этого вируса показал, что он произошел от комбинированных Североамериканского и Евроазиатского вирусов гриппа свиней [6,

Для выявления вируса гриппа в свиноводческих хозяйствах существует ряд методик, которые условно можно разделить на прямые и косвенные.

7, 8].

К прямым методам выявления ВГС можно отнести выделение вируса в куриных эмбрионах (КЭ), культуре клеток (КК), выявление генома вируса в полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведения реакции иммунофлюоресценции, постановка иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антигена, реакции иммуногистохимии (ИГХ).

С развитием заболевания (в организме животных) вирус быстро накапливается в легких и носовой слизи, что позволяет выделить его для культивирования и идентификации [14]. При использовании данных методов часто необходимо учитывать такие аспекты, как пробоподготовка, оптимизация параметров культивирования, выявление генома или антигена ВГС. Вирус можно «потерять» при несоблюдении правил отбора, упаковки или транспортировки патологического материала.

При проведении диагностических исследований на грипп свиней широко используют серологические реакции. Все их можно отнести к косвенным методам определения присутствия ВГС. В научных работах зарубежных исследователей описываются различные методы серологической диагностики гриппа свиней. К ним можно отнести: реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), реакцию нейтрализации (РН), иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления антител.

Степень разработанности проблемы. С появлением новых подтипов ВГС, а также из-за существования значительной антигенной неоднородности внутри подтипов вируса гриппа и вариационных линий в разных географических районах мира [12], диагностировать данное заболевание становится значительно труднее. Поэтому классические методы диагностики, такие как РТГА или РН необходимо совершенствовать, разрабатывая наборы к новым актуальным штаммам ВГС. Учитывая тот факт, что на территории РФ вакцинация против гриппа свиней не входит в перечень обязательной специфической профилактики заболевания, данные методы диагностики являются первостепенными при проведении скрининговых или мониторинговых исследований на ГС. Выявление в сыворотках крови свиней антител к ГС указывает на возможное присутствие заболевания. Отсутствие в доступной литературе сведений о наличии отечественных тест-систем для выявления антител к ВГС, свидетельствует о необходимости и своевременности их разработки.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение биологических свойств ВГС типа Л и усовершенствование методов серологической диагностики гриппа свиней типа А подтипа H1N1 и H3N2 в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА) и микронейтрализации (РМН).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

определить условия культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 и 1I3N2 в куриных эмбрионах (КЭ), в первичной и перевиваемых культурах клеток с целью выделения, адаптации ВГС и получения вируссодержащего материала; изучить гемагглютинирующие свойства ВГС, подобрав необходимые эритроциты от разных видов животных и параметры постановки РГА и РТГА;

изучить чувствительность лабораторных животных к ВГС типа А подтипа H3N2;

подобрать инактивант и режим инактивации ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2, с целью получения антигенов, обладающих выраженной антигенной и гемагглютинирующей активностью;

получить вирусоспецифические сыворотки крови свиней к ВГС типа А подтипов II1N1 и H3N2; оптимизировать условия очистки нативных сывороток крови свиней от термостабильных и термолабильных ингибиторов;

установить условия лиофильного высушивания иммуноспецифических компонентов набора РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 (антиген, положительные и нормальные сыворотки крови свиней);

разработать нормативную документацию на набор РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1, а также методические рекомендации для выявления антител к ВГС типа А подтип H3N2 в РТГА и H1N1 в РМН. Научная новизна результатов исследований.

Впервые в России разработана технология изготовления компонентов РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1. Подобраны оптимальные параметры культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 в КЭ и перевиваемой культуре клеток. Изучены биологические свойства изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/ H3N2, при культивировании его в КЭ, перевиваемой и первичной культурах клеток. Определена его гемагглютинирующая, инфекционная и антигенная активности.

Установлены основные параметры инактивации ВГС типа А подтипов Н1Ш и НЗЫ2 при сохранении их основных антигенных и гемагглютинирующих свойств.

Теоретическая н практическая значимость работы. На основании проведенных исследований изучены биологические свойства полученного изолята и штаммов ВГС типа А подтипов НШ1 и Н3№. Определены основные параметры их культивирования па культурах клеток и куриных эмбрионов. Установлены параметры инактивации ВГС, а также приготовления и хранения иммуноспецифических компонентов ВГС типа А. Определена корреляционная зависимость полученных результатов исследований в разработанных тест-системах с коммерческими наборами ИФА. По результатам проведенных исследований разработан и утвержден пакет научно-технической документации:

- Набор и инструкция для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа Н1Ы1 в реакции торможения гемагглютинации (СТО 00495527-0189 -2012), утвержденные Россельхознадзором в 2012 году;

- Промышленный регламент на изготовление и контроль «Набора для серодиагностики гриппа свиней типа А подтипа НШ1 в реакции торможения гемагглютинации», утвержденный директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011 году;

Предложены, комиссионно проверены, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические указания:

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А в реакции торможения гемагглютинации» в 2010 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа НЗЫ2 в реакции торможения гемагглютинации» в 2013 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипаНШ1 вреакции микронейтрализации» в 2011 году;

Методология и методы исследования. Для достижения поставленной цели диссертационной работы были использованы экспериментальные методы исследования, которые включали в себя прямые и косвенные методы лабораторной диагностики. Прямые методы были задействованы при вирусологических исследованиях, а именно выделение и наработка ВГС типа А в куриных эмбрионах и культуре клеток. Косвенные методы лабораторной диагностики применяли при

серологических исследованиях (РТГА, РМН, ИФА) для выявления антител к вирусу гриппа свиней.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. биологические свойства ВГС типа А;

2. подбор оптимальных условий культивирования ВГС типа А в КЭ и КК;

3. гемагглютинирующая, инфекционная и антигенная активность ВГС типа А;

4. технология получения иммуноспецифических компонентов РТГА для выявления ВГС типа А.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2010-2013гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении «ФГБУ ВНИИЗЖ».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований - взаимодействие между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов культивирования вируса гриппа свиней типа А подтипа НШ1 и НЗШ в КЭ и перевиваемой, и первичной культурах клеток, инактивации и хранения полученного вирусного материала, получение иммуноспецифических компонентов, подбору эритроцитов, очистки нативных сывороток от термостабильных и термолабильных ингибиторов.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 2, 3, 6, 7, 10.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, что подтверждает их достоверность. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета «ФГБУ ВНИИЗЖ» в 2010-2012 годах, на международной научной конференции «Достижение молодых ученых в ветеринарную практику»

(Владимир, 2010 г.), на всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы биологии», (г. Чебоксары 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, две из которых опубликованы в изданиях по перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 32 таблицами и 10 рисунками. Список использованной литературы включает 166 источников, из них 135 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. Долгановой Е.К., к.б.н. Баборенко Е.П., к.в.н. Пузанковой О.С., к.в.н. Шевцову A.A., к.в.н. Чвале И.А., а также Горюшеву О.Ю. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

2.1.1 Вирусы. В работе были использованы вирусы гриппа свиней музейных штаммов А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1 (ГНУ «ВНИИВВиМ Россельхозакадемии»); штамм ВГС «А/свинья/Айова/15/30» (ФГБУ «ВГНКИ»), а также изолят ВГС «А/свинья/Владимирское/2010/ H3N2». Изолят был выявлен в назальной слизи свиньи, принадлежащей ЗАО по свиноводству «Владимирское» в 2010 г.

В настоящее время материалы по данному изоляту направлены для депонирования в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

2.1.2 Куриные эмбрионы. Использовали эмбрионы кур 9-12 суточного срока инкубации, категории SPF фирмы Loman Tiehrzucht (Германия) (СПФ).

2.1.3 Культуры клеток. В опыт использовали перевиваемую культуру клеток почки собаки MDCK.; перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК;

перевиваемую культуру клеток феталыюй почки макаки резус Marc-145 и первичную культуру клеток почки свиньи СП. Культуры клеток в виде готового монослоя получали из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

2.1.4 Ннактиванты. В качестве инактивантов использовали димер этиленимина (АЭЭИ) производства НПП «Биохимресурс» (г.Владимир), ß-пропилактон (ß-ПЛ) (Польша), формальдегид (Россия).

2.1.5 Животные. В лабораторных опытах использовали естественно восприимчивых к гриппу животных - серонегативных свиней пород ландрас, крупная белая, дюрок: поросята 2-4 месячного возраста живой массой 20 - 25 кг - 10 голов; также в исследованиях использовали: кроликов породы шиншилла, живой массой 2 -2.5 кг - 25 голов; морских свинок, живой массой 250-300 г - 30 голов; мышей линии Balb/c 5-6-неделыюго возраста - 20 голов, петухов живой массой 1.5-2 кг-4 головы; лошадь (для получения взвеси эритроцитов).

2.1.6 Сыворотки. Для исследований использовали сыворотки крови свиней, присланные из свиноводческих хозяйств РФ; специфические сыворотки к ВГС типа А подтипа H1N1; специфические сыворотки к ВГС типа А подтипа H3N2; специфические сыворотки к парвовирусной инфекции свиней; нормальные (отрицательные) сыворотки к ВГС типа А.

2.1.7 Эритроциты. В работе использовали взвесь эритроцитов петуха, морской свинки и лошади.

2.2 Методы

2.2.1 Культивирование ВГС типа А в СПФ КЭ. Для наработки ВГС типа А подтипа H1N1 (штамм «А/свинья/Калифорния/07/2009» и «А/свинья/Айова/15/30») и H3N2 использовали 9-12 суточные СПФ КЭ (Lohmar! Tiehrzucht, Германия). Зараженные эмбрионы инкубировали при температуре (37±2)°С и относительной влажности 60-70% в течение 70-72 ч. Биологический контроль проводили путем овоскопирования эмбрионов каждые 24 ч. Эмбрионы, погибшие в более поздний срок, а также живые инфицированные эмбрионы снимали через 70-72 ч, охлаждали и использовали для сбора вируссодержащей экстраэмбрионалыюй жидкости (ЭЭЖ).

2.2.2 Культивирование ВГС типа А на культуре клеток. При культивировании ВГС типа А подтипов H1N1 (штамм «А/свинья/Калифорния/07/2009» H1N1, штамм «А/свинья/Айова/15/30» H1N1) и H3N2 (изолят А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ)

использовали 2-3 дневные перевиваемые и первичную культуры клеток. Матрасы с зараженным монослоем инкубировали в С02-инкубаторе при температуре 37±2°С. Ежедневно, в течение 3-7 суток, проводили микроскопию при проявления цитопатического действия (ЦПД) ВГС. Процент ЦПД выражали в крестах: + 25%; ++ 50%; +++ 75%; ++++100%.

2.2.3 Определение инфекционной активности ВГС типа А. Инфекционную активность ВГС, полученного в КЭ, определяли в 9-12-суточных эмбрионах СПФ-кур. Инфекционную активность выражали в эмбрион-инфицирующих дозах - ЭИД50.

Инфекционную активность ВГС, полученного на культурах клеток, определяли путем титрования на используемых перевиваемых культурах клеток. Титром вируса считали наивысшее его разведение, вызывающее четкое цитопатическое действие (ЦПД) в 50% монослоя культуры клеток. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина.

2.2.4 Определение гемагглютинирующей активности ВГС типа А. Гемагглютинирующую активность ВГС типа А определяли в реакции гемагглютинации (РГА) постановкой общепринятым методом в планшетах с использованием суспензии эритроцитов.

2.2.5 Определение стерильности. Стерильность матровой расплодки определяли по ГОСТ 28085.

2.2.6. Очистка и концентрирование вируса гриппа свиней типа А. Проводили методом центрифугирования через 20% слой сахарозы. В качестве вируссодержащего материала использовали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ).

2.2.7 Инактивация вирусного материала. Инактивацию ВГС типа А подтипов И INI и H3N2 в вируссодержащих суспензиях проводили ß-ПЛ, АЭЭИ и формальдегидом, при этом использовали различные концентрации и pH инактивантов, температуру и длительность инактивации.

2.2.8 Серологические методы исследований. Уровень специфических антител к ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 определяли в РТГА, РМН и ИФА с использованием коммерческого набора (IDEXX, США).

2.2.9 Интерпретация результатов РТГА. За отрицательный порог реакции принимали уровень антител к ВГС типа А подтипа И INI со значением < 5,0 log2. Положительное значение было > 6,0 log2. При диагностике ВГС типа А подтипа H3N2

отрицательное значение составляло <5,0 log2. Положительное значение было > 6,0 log2. Пороговое значение отрицательного контроля реакции (доверительный интервал 'а') определяли с помощью статистических расчетов: при уровне достоверности р <0.05.

2.2.10 Статистическая обработка результатов исследований. Использовали общепринятые способы статистической обработки экспериментально полученных выборок варьирующих переменных. Определяли дисперсию, стандартное отклонение и доверительный интервал средних значений [3].

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Разработка набора для определения уровня антител к ВГС типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинацин

На начальном этапе разработки набора по выявлению антитела к ВГС типа А подтипа H1N1 в РТГА необходимо было провести исследования по определению эритроцитов животного, чувствительных к применяемому вирусу. Использовали эритроциты от трех видов животных: морской свинки, лошади и петуха в различных концентрациях. Для определения качества агглютинации ставили РГА в трех повторностях с штаммами ВГС А/свинья/Айова/15/ЗО и А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Подбор взвеси эритроцитов разных видов животных (п=3)

Концентрация эритроцитов (%) Вид животного Штамм ВГС

морская свинка лошадь петух

Титр в РГА log2, M±m

0,4 <2 <2 7,0±0,48 А/свинья/Калифорния/07/09

0,6 <2 <2 7,4±0,36

0,8 <2 <2 8,0±0,22

1,0 <2 <2 6,2±0,46

1,2 <2 <2 5,8±0,47

0,4 7,2±0,34 <2 6,9±0,29 А/свинья/Айова/15/30

0,6 7,9±0,28 <2 7,6±0,48

0.8 7,3±0,82 <2 7,0±0,72

1,0 6,4±0,39 <2 6,5±0,64

1.2 5,9±0,31 <2 5,7±0,57

где, п - число повторностей; М - среднее значение титра; т - стандартная ошибка

Из данных таблицы 1 видно, что ни один из представленных штаммов ВГС эритроциты лошади не агглютинировал. Штамм ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1 эритроциты морской свинки также не агглютинировал.

Для наиболее четкой визуализации результатов реакции целесообразно использовать 0,8% взвесь эритроцитов петуха для штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1 или 0,6% взвесь эритроцитов морской свинки для штамма ВГС А/свинья/Айова/15/30.

Так как в дальнейшем при постановке РТГА использовали эмбриональный антиген

штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1, применяли 0,8% взвесь

эритроцитов петуха.

2.3.2 Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа

H1N1 для использования в серологических реакциях 2.3.2.1 Культивирование ВГС типа А подтипа H1N1 в куриных эмбрионах

Для получения эмбрионального антигена ВГС типа А подтипа H1N1, необходимо

было определить ряд его показателей.

При определении параметров снижения чувствительности КЭ к заражению ВГС, необходимо было определить оптимальный возраст КЭ при сроках инкубирования 70-72 ч. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Количество и качество экстраэмбриональной жидкости от эмбрионов разного срока инкубирования при заражении штаммами А/свинья/Калифорния/07/2009 и А/свинья/Айова/15/30 НШ1

Штамм ВГС Возраст КЭ (сут.) Средний объем ЭЭЖ от одного КЭ (см3) Качество ЭЭЖ

А/свипья/Калифорния/07/2009 9 5,3 4,4 4,0 -

10 7,3 7,0 7,6 +

И 7,7 8,0 8,0 +

12 5,5 6,0 6,3 -

А/свинья/Айова/15/30 9 5.0 4,5 4,3 -

10 7,0 7,3 7,0 +

11 7,6 8,5 8,0 +

12 5,3 6,2 6,8 -

«-» - неудовлетворительное качество ЭЭЖ; «+» - удовлетворительное качество ЭЭЖ

Из представленных данных Таблицы 2 видно, что оптимальный возраст КЭ для заражения вирусом гриппа свиней типа А подтипа H1N1 составляет 10-11 дней.

Для установления оптимальной заражающей дозы штаммов ВГС использовали разведения с таким расчетом, чтобы в заражающем объеме 0,1 см3 содержалось 1,2,3,4 lg ЭИД5О/0,1см3 каждого штамма. Активность вируса в ЭЭЖ 10-дневных КЭ определяли в РГА. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 — Гемагглютинирующая активность вируссодержащего материала штаммов А/свннья/Калнфорния/07/2009 и А/свинья/Айова/15/30 НШ1 в зависимости от инфицирующей дозы (п=3)

Штамм ВГС Заражающая доза (1ёЭИД5(|/0,1 см3) Титр в РГА (1о§2)

№1 №2 №3 М±т

А/свннья/Калифорния/07/2009 1 7,0 7,0 6,0 6,7±0,3

2 8,0 9,0 7,0 8,0±0,6

3 7,0 6,0 7,0 6,7±0,3

4 6,0 5,0 7,0 6,0±0,6

А/свинья/Аиова/15/30 1 7.0 7,0 6.0 6,7±0.3

2 7,8 8,0 7,8 7,9±0,12

3 7,0 6,0 7,0 6,7±0,3

4 6,0 5,0 7.0 6.0±0,6

Где, п - число повторностей; М - среднее значение титра; ш - стандартная ошибка

Из представленных данных таблицы 3 видно, что при использовании инфицирующей дозы 2,0 ^ ЭИД50/0,1см3 вирусов А/свинья/Калифорния/07/2009 НШ1 и А/свинья/Айова/15/ЗО НШ1, получали максимальные гемагглютинирующие титры в ЭЭЖ. равные 8.0±0,6 log2 и 7,9±0,12 log2, соответственно.

После определения оптимального возраста КЭ, пригодных для инкубации ВГС, необходимо было определить титр инфекционной активности вируссодержащего материала, полученного после заражения различными дозами ВГС, используемых штаммов. Данные результатов представлены в таблице 4.

Таблица 4 —Инфекционная активность вируссодержащего материала в зависимости от заражающей дозы штаммов А/свинья/Калифорния/07/2009 и А/свинья/Айова/15/30 Н11Ч1 (п=3)

Штамм ВГС Заражающая доза, ^ ЭИД50/О, I см3 Титр инфекционной активности (1р ЭИД5„/см3)

№1 №2 №3 М±ш

А/свинья/Калифорния/07/2009 1 7,6 7,3 6,9 7,3±0,2

2 8,0 8,0 7,0 7,7±0,3

3 8,2 7,8 8,2 8,1±0,2

4 5,0 4,4 4,5 4,6±0,3

А/свинья/Аиова/15/30 1 7,0 7,2 7,2 7,3±0,1

2 7,6 7,8 7.8 7,7±0,1

3 8,2 7,9 7,4 7,8±0,2

4 6,5 6,3 6,0 6,3±0,2

Где, п- число повторностей; М - среднее значение титра; ш — стандартная ошибка

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что при заражении КЭ в дозе 2,0 и 3,0 ^ ЭИД50/0,1см3 удается получить вирусное сырье с наибольшей инфекционной активностью: 7,7±0,30 ^ ЭИД50/см3 и 8,1±0,2 1а ЭИД50/см3 для штамма

А/свинья/Калифорния/07/2009. Для штамма А/свинья/Айова/15/30 наибольшая инфекционная активность составляла 7,7±0,1 ЭИД50/см3 и 7,8 ±0,2 ЭИД50/см3.

Таким образом, для получения вируссодержащего материала с высоким титром инфекционной активности, необходимо строго придерживаться возраста, инфицирующей дозы и сроков инкубирования зараженных КЭ.

2.3.3 Получение культурального ВГС типа А подтипа НШ1 для использования в серологических реакциях

Для культивирования ВГС типа А подтипа НШ1 использовали перевиваемые

культуры клеток: ППК (перевиваемая культура почки поросенка), Магс-145 (перевиваемая культура почки зеленой мартышки), МОСК. (перевиваемая культура почки собаки).

При культивировании штаммов ВГС типа А использовали КК МОСК, поскольку именно в монослое данной культуры наблюдали наибольшие гемагглютинирующие титры и продолжительность инкубирования составила 6 пассажей. При этом штамм А/свинья/Калифорния/07/2009 НШ1 показал наибольший средний гемагглютинирующий титр в данной культуре (8,5 ±0,1 по сравнению со

штаммом А/свинья/Айова/15/30 (5,4 ±0,2 В дальнейшем осуществляли

культивирование штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 на перевиваемой культуре клеток МОСК. П1-1У пассажей.

Для определения периода инкубации перевиваемую КК МОСК заражали эмбриональным вирусом штамма А/свинья/Калифорния/07/09 с гемагглютинирующей активностью 8,0 1о£3. Учет результатов вели визуально, при помощи инвертированного микроскопа. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Цнтопатическое действие ВГС штамма А/свннья/Калифорння/07/2009 на монослой перевиваемой КК МОСК в разные периоды инкубации

Штамм Пассаж Инкубационный период (ч)

ВГС 24 48 72

А/свинья/Калифорния /07/2009 I - +++ 1 1 1 1

11 + 1 1 1 1 1 1 1 1

III ++ ++++ 1 1 1 1

ЦПД (%): + 25; ++ 50; +++ 75; ++++100.

Как видно из таблицы 5, для достижения максимального разрушения монослоя достаточно 48 ч периода инкубации. Именно в этот период наблюдали ЦПД в 75 % в первом пассаже и 100% - во II и III пассажах.

Для определения инфекционного титра был отобран культуральпый ВГС штамма А/свинья/Калифорния/07/09 IV пассажа. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Инфекционная активность вируссодержащего материала в (КК МОСК) в зависимости от заражающей дозы штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 (п=3)

Штамм ВГС Заражающая доза (1ёТЦЦ5„/см3) Уровень инфекционной активности (18ТЦЦ5„/см3)

№1 №2 №3 М±ш

3 4,3 4,6 5,0 4,6±0,2

А/свинья/Калифорния 6 6,4 5,9 6,3 6,20±0,15

/07/2009 9 6,5 6,0 6,1 6,20±0,15

12 6,0 6,6 6,1 6,30±0,19

Где, п- число повторностей; М - среднее значение титра; т — стандартная ошибка Из таблицы 6 видно, что для наибольшего накопления вируссодержащего

материала в культуре клеток необходимо использовать заражающую дозу 6,0 ^ ТЦДзо/см3. При этом уровень инфекционной активности составил 6,2 ТЦД50/см3.

2.3.4 Инактивация ВГС А подтипа НШ1 Инактивацию вируссодержащего материала, полученного в КЭ, проводили (3-пропиолактоном при температуре (27±0,5)°С, АЭЭИ и формальдегидом при температуре (37±2,0)°С в различных концентрациях в течение 24 ч. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Инактивация вируса гриппа свиней типа А подтипа НШ1, полученного в КЭ (п=3)

Вид инактиванта Концентрация РГА, 1о&2 М±гп Инфекционность

МОСК КЭ

р-пропиолактон 0,01% 7,0±0,17 - -

0,02% 7,0±0,15 - -

0,05% 6,5±0,24 - -

0,1% - - -

0,2% - - -

Димер этиленимина 0,02% 7,0 ± 0,0 + +

0,1% 7,0 ± 0, 0 - -

0,15% 7,0 ± 0,0 - -

0,2% 6,5 ± 0,0 - -

0,3% 2,0 ± 0,0 - -

Формальдегид 0,02% 6,0 ± 0,0 - -

0,04% 6,0 ± 0,0 - -

0,1% 5,5 ± 0,0 - -

0,2% 5,0 ± 0,0 - -

0,4% 4,8 ± 0,0 - -

Контроль (37 ±2°С) * 7,0 ± 0,0 + +

Контроль (6 ±2°С) ** 7,0 ± 0,0 + +

Где, п- число повторностей; М - среднее значение титра; ш - стандартная ошибка

* - Вируссодержащую ЭЭЖ хранили в течение 24 ч при 37±2°С;

** - Вируссодержащую ЭЭЖ хранили в течение 24 ч при 6±2°С.

Из таблицы 7 видно, что оптимальная доза для инактивации эмбрионального вируса составила для формальдегида - 0.02%, для димера этиленимина - 0,4%, для р-пропиолактона - 0,05%. Полноту инактивации полученного антигена испытывали на КЭ 10-11 суточного возраста либо на культуре клеток.

После инактивации вируссодержащего сырья необходимо было провести его лиофилизацию с сохранением гемагглютинирующего титра. Лиофильная сушка осуществлялась на аппарате ЦШПЮШ (Франция).

Массовая доля влаги в препарате не превышала 4%. Активность готового лиофильно высушенного инактивированного препарата антигена штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 НШ1 составляла в РГА 6 1о£2.

Полученные инактивированные препараты антигена ВГС в реакции с гетерологичной сывороткой к парвовирусной инфекции свиней были неактивны.

Также были определены условия хранения полученного препарата. Активность антигена ВГС в лиофилизированном виде сохранялась в течение 18 мес. при -10°С; 12 мес. при 4°С и 6 мес. при 25°С. Активность антигена ВГС в разведенном виде сохранялась в течение 1 нед. при 4°С , 12 мес. при минус 10 °С и менее 1 нед. при 25°С.

2.3.5 Оптимизация параметров обработки нативных сывороток перед использованием их в РТГА

В серии опытов проводили сравнительные исследования сывороток крови свиней

после обработки следующими методами:

- разведенные 1:16 сыворотки крови прогревали на водяной бане при (56±2)°С в течение 40 минут;

- к 0,2 см3 инактивированной сыворотки добавляли 0,6 см3 25%-ной суспензии каолина;

- к 0,2 см3 инактивированной сыворотки добавляли 0,1 см3 осадка эритроцитов морской свинки. Результаты исследований отражены в таблице 8.

Таблица 8 - Исследования сывороток крови свиней в РТГА после различных способов обработки (п=3)

Метод обработки сывороток Среднегеометрический титр антител в РТГА, log2, М±ш

Прогревание при (56+2)°С 7,4±0.2 7,80±0,35 8,0±0,6 9,00+0,56 9,2+0,6

Прогревание + обработка эритроцитами морской свинки 6,0±1,4 8,0±0,5 7,6±0,7 9,4+0,3 9,8+0,6

Прогревание + обработка каолином 3,8+1,4 5,6±1,3 7,0+1,2 7,7+1,1 9,2+0,8

где, М - среднее значенне титра; m - стандартная ошибка

Из данных таблицы 8 видно, что при постановке в РТГА испытуемых проб сыворотки крови свиней можно ограничиваться только их прогреванием в течение 40 мин на водяной бане при (56±2)°С.

2.3.6 Получение лиофильно высушенной положительной вирусспецифической и нормальной сывороток крови свиней

Вирусспецифическая сыворотка была получена путем двукратной вакцинации (с

интервалом в 21 сутки) серонегативиых к ВГС типа А подтипа H1N1 поросят антигеном ВГС штамм А/свииья/Калифорния/07/2009, смешанным с адъювантом Montanide ISA-70 фирмы SEPPIC (Франция) в соотношении 1:2. Титр в РТГА составил 9 log2. Нормальную сыворотку получили от серонегативиых поросят к ВГС типа А подтипа H1N1. Далее сыворотки крови свиней подвергли лиофильной сушке на аппарате USIFROID (Франция).

Активность полученной лиофильно высушенной вирусспецифической сыворотки крови свиней в РТГА составляла не менее 8 log2.

После проведения исследований по подбору оптимальных условий и максимального времени хранения компонентов набора РТГА был определен срок годности набора - 12 мес. с даты изготовления при хранении и транспортировании в сухом защищенном от света месте и температуре от 2°С до 8°С.

2.4 Разработка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H3N2

2.4.1. Подбор эритроцитов крови при постановки РГА и РТГА

Используя схему разработки набора для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 в РТГА, подобрали эритроциты от трех видов животных: морской свинки, лошади и петуха в различных концентрациях. Данные представлены в таблице 9.

Таблица 9 - Подбор эритроцитов разных видов животных (п=3) при определении гемагглютинирующей активности изолята ВГС

А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ

Концентрация Эритроцитов (%) Вид животного

Морская Свинка Лошадь Петух

Титр в РГА, 1о^2

0,4 6,8±0,6 <2,0±0,1 4,0±0,1

0.6 7,0±0,2 <2,0±0,1 4,0±0,1

0,8 6,2±0,18 <2,0±0,1 3,20±0,14

1,0 5,2±0,12 <2,0±0,1 <2,0±0,1

1.2 3,8±0,2 <2,0±0,1 <2,0±0,1

где, М - среднее значение титра; ш - стандартная ошибка

Из данных таблицы 9 видно, что изолят ВГС А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ эритроциты лошади не агглютинировал. При испытании эритроцитов петуха и морской свинки, взятых в аналогичных концентрациях, агглютинация присутствовала, однако титр в РГА был выше в случае использования эритроцитов морской свинки, при этом их оптимальная концентрация составила 0,6%.

2.4.2 Изучение биологических свойств изолята вируса гриппа свиней

«А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№» 2.4.2.1 Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа Н3№ для использования в серологических реакциях 2.4.2.2. Культивирование ВГС типа А подтипа Н3№ в куриных эмбрионах При получении эмбрионального препарата антигена ВГС (изолят

А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№) были использованы основные параметры

культивирования ВГС (штаммы А/свинья/Калифорния/07/2009 и

А/свинья/Айова/15/30 НШ1).

На начальном этапе исследований необходимо было провести серию опытов по

культивированию изолята ВГС А/свинья/Владимирс кое/2010/113 N2 в зависимости от

возраста КЭ. Срок инкубирования при этом составил 72 часа. Данные исследования

представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Количество и качество ЭЭЖ от эмбрионов разного срока инкубнрованмя при заражении изолятом А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№ (п=3)

Изолят ВГС Возраст КЭ (сут.) Средний объем (смЗ) ЭЭЖ от одного КЭ Качество ЭЭЖ

А/свинья/Владимирское/2010/НЗЫ2 9 5,3 4,4 4,0 -

10 7,3 7,0 7,6 +

11 7,7 8,0 8,0 +

12 5,5 6,0 6,3 +

«-»-неудовлетворительное качество ЭЭЖ; «+»-удовлетворительное качество ЭЭЖ

Из таблицы 10 видно, что оптимальный возраст КЭ для заражения вирусом гриппа свиней типа А подтипа НЗШ составил 10-12 дней.

Следующим этапом работы было определить такой важный показатель, биологических свойств ВГС, как гемагглютинирующая активность. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11 — Гемагглютинирующая активность вируссодержащего материала изолята А/свинья/Владимирское/2010/НЗ^ в зависимости от заражающей дозы изолята (п=3)

Изолят ВГС Заражающая доза (^ЭИД50/0,1 смЗ) Титр в РГА (1о§2)

№1 №2 №3 М±т

А/свинья/Владимирское/2010/НЗЫ2 1 6,4 6,8 6,8 6,7±0,20

2 7,6 7,6 7,4 7,5±0,12

3 7,0 7,0 6,8 6,9±0,12

4 5,6 6,0 6,0 5,9±0,20

где, М - среднее значение титра; ш — стандартная ошибка

Из таблицы 11 видно, что при использовании инфицирующей дозы 2,0 ^ ЭИД50/0,1см3 изолята А/свинья/Владимирское/2010/НЗЫ2 получали максимальный гемагглютинирующий титр ЭЭЖ, равный 7,5±0,12 1о§2.

Оптимизация следующего параметра культивирования ВГС в КЭ включала определение титра инфекционной активности вируссодержащего материала, полученного после заражения различными дозами испытываемого изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Инфекционная активность вируссодержащего материала в зависимости от заражающей дозы изолята А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№2 (п=3)

Изолят ВГС Заражающая доза, lg ЭИД5„/0,1 см3 Титр инфекционной активности (lg ЭИДл/см3)

№1 №2 №3 М±ш

А/свинья/Владимирское/2010/H3N2 1,0 6,8 7,0 6,8 6,90 ± 0,20

2,0 7,25 7,25 7,33 7,30 ±0,11

3.0 7,33 7,50 7,47 7,40 ± 0,20

4,0 7,0 7,13 7.13 7,08 ±0,17

где, М - среднее значение титра; m — стандартная ошибка

Из таблицы 12 видно, что при заражении КЭ в дозе 2,0 и 3,0 lg ЭИД50Д),1см3,

удается получить вирусное сырье с наибольшей средней инфекционной

активностью: 7,40±0,11 lg ЭИД50/см3.

2.4.2.3. Получение культурального вируса гриппа свиней типа А подтипа H3N2 для использования в серологических реакциях 2.4.2.4. Культивирование вируса гриппа свиней в перевиваемой культуре клеток

В опыт брали культуру клеток почки поросенка (ППК), перевиваемую культуру клеток почки зеленой мартышки (Marc-145) и перевиваемую культуру клеток почки собаки (MDCK), а также первичную культуру клеток почки поросенка (СП). Исследования проводили на 2-3 суточном монослое культуры клеток в матрасах (объем 25 см3). Опыт завершали по результатам ЦПД (60-80% монослоя) - ППК и MDCK через 48 и 72 часов; СП и Marc-145 - через 96 и 120 часов. Результаты ГА-активности опытных образцов шести последовательных пассажей представлены в таблице 13.

Таблица 13 - Результаты адаптации изолята ВГС А/свннья/Владимирское/2010/НЗ^, полученного в СПФ КЭ, к системе культур клеток(п=3)

Пассаж Перевиваемая КК (РГА, log2) Первичная КК (РГА, log2)

MDCK (M±m) Marc-145 ППК СП (М±ш)

I 3,12 ± 0,12 - - 2,1 ±0,8

II 3,5 ±0,16 - - 2,9 ±0,1

III 6,12 ±0,2 - - 4,5 ±0,12

IV 7,5 ± 0,22 - - 5,8 ±0,18

V 7,0 ±0,18 - - 6,4 ±0,21

VI 4,12 ±0,13 - - 4,8 ±0,12

где, М - среднее значение титра; m - стандартная ошибка

Из таблицы 13 видно, что изолят ВГС Л/свинья/Владимирскос/2010/НЗЫ2 не был чувствителен к КК Магс-145 и ПИК. Наивысший средний ГА-титр наблюдали в КК МОСК (7,5±0,12 1о£2). При адаптации изолята ВГС А/скинья/М.тадимпрское/2010/113N2 (ЭЭЖ КЭ), к первичной культуре клеток почки поросенка (СП), наивысший средний титр ГА-активности составил 6,42±0,21 1о«2.

Для достижения максимального разрушения монослоя КК МОСК, достаточно было инкубировать вирус в течение 48 ч.

Оптимальную заражающую дозу определяли путем внесения вируса в перевиваемую КК МОСК. Опыт проводили в трех повторностях. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14 - Инфекционная активность вируссодержащего материала в зависимости от заражающей дозы изолята ВГС

А/свинья/Владнмирское/2010/НЗШ (п=3)

Изолят ВГС Заражающая доза 0еТЦД5(/см3) Уровень инфекционной активности (1еТЦД„/см3) М±т

№1 №2 №3

А/свинья/Владимирское/2010/НЗЫ2 3 4,3 4,6 5,0 4,60±0,2

6 6,4 6,6 6,6 6,50±0,12

9 6,0 6,0 5,9 5,9±0,10

12 4,3 4,6 5,0 4,60±0,2

где, М - среднее значение титра; ш — стандартная ошибка.

Из представленных данных таблицы 14 видно, что для накопления вируссодержащего материала при наименьших затратах матрового вируса, можно использовать заражающую дозу в 6,0 1ц ТЦД5о/см3 для изолята А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ.

2.4.2.5 Экспериментальное заражение лабораторных животных ВГС типа А подтипа НЗ^

В экспериментальном заражении животных использовали белых мышей, морских свинок и кроликов. Животных заражали дозой вируса 3 ^ ЭИД50/0,1 см3 внутримышечно. На протяжении всего периода наблюдения у животных во всех группах отклонений от общего состояния здоровья и клинических признаков заболевания не наблюдали. Патологоанатомические изменения в легких и других внутренних органах у животных, убитых на 4 и 6 дни после заражения, отсутствовали. Вирус гриппа во внутренних органах этих животных методом ПЦР-РВ не обнаруживался.

2.4.2.5.1 Инактивация изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№

Инактивацию данного изолята проводили согласно отработанной схеме при разработке набора РТГА ВГС типа А подтипа Н Ш1.

По результатам исследований инактивация эмбрионального вируса изолята А/свинья/Владимирское/2010/НЗ№, составила для формальдегида - 0.02%, для димера этиленимина - 0,1%, для Р-пропиолактона - 0,05%.

2.4.2.5.2 Оптимизация параметров обработки нативных сывороток перед использованием их в РТГА Сыворотки для набора РТГА по выявлению антител к ВГС типа А подтипа НЗИ2 осуществляли согласно пункту 2.3.5.

2.4.2.5.3 Получение специфической к изоляту ВГС «А/свинья/Владимирское/2010/НЗШ» и нормальной сывороток крови свиней с дальнейшей лиофилизацией Схема получения вирусспецифической и нормальной сывороток крови свиней, а также их лиофилизация описана выше в п.2.3.6. Активность полученной лиофильно высушенной вирусспецифической сыворотки крови свиней в РТГА составила 10

2. 5 Разработка реакции микронейтрализации для выявления антител к ВГС типа подтипа Н1Ш Целью исследований явилась разработка РМН с использованием отечественных компонентов (культура клеток, питательная среда и др.) Согласно руководству МЭБ [14] для РМН рекомендуется использовать клетки почки собаки МОСК.

На первом этапе определяли оптимальную посевную концентрацию клеток. Опыты проводили в 3-х повторностях. Результаты этих исследований представлены в таблице 15.

Таблица 15 — Подбор оптимальной концентрации клеток МОСК для реакции микронейтрализации

Возраст культуры (ч) Сформировавшийся монослой (%) при различной концентрации клеток (кл/см3)

0,05-0,Г105 0,1-0,15*105 0,2-0,3" 105 0,4-0,5 Х105

24 40±5% 80±10% 100±10% 100±10%

48 70% 100% 100% 100%

Из данных таблицы 15 видно, что ровный монослой образовался через 48 часов в лунках, где концентрация клеток составила 0,1 -0,15х 105 кл/см3.

В реакции использовали штамм ВГС «А/свинья/Калифориия/07/2009 НШ1 с исходным титром 8,1 ±0,2 ЭИД5(/см3. В качестве референтных позитивных сывороток использовали сыворотки крови свиней (20 проб), переболевших гриппом (20 проб), с титрами в РТГА не ниже 5 Микроскопию планшетов вели ежедневно в течение 5-7 дней, просматривая их под инвертируемым микроскопом, регистрируя лунки с выраженным ЦПД и/или лунки с монослоем. Данные представлены в таблицы 16.

Таблица 16 - Исследование в РМН референтных сывороток с различными дозами вируса (п=3)

Сыворотки крови свиней Титры антител (^2,) при различных дозах ви руса, М±ш

100 200 300 500 1000

Позитивные 6,25±0,12 6,50±0,18 6,60±0,20 5,75±0,10 5,0±0,10

Негативные <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

где, М - среднее значение титра; ш - стандартная ошибка

Из данных таблицы 16 видно, наиболее оптимальной являлась рабочая доза ВГС в пределах 200-500 единиц.

С целью оценки специфичности разработанной модификации реакции микронейтрализации исследовали сыворотки крови свиней и кроликов, вакцинированных против различных заболеваний (болезнь Ауески, парвовирусная инфекция свиней, трансмиссивный гастроэнтерит свиней ит.д.). В пробах сывороток крови, отобранных от животных, вакцинированных против выше обозначенных инфекций, в РМН антител к вирусу ВГС не выявили.

С целью оценки сопоставимости двух методов результаты исследований, полученные в РМН, сравнивали с результатами, полученными в РТГА. Коэффициент корреляции оказался равен 0,8, что свидетельствовало о том, что результаты, полученные в разработанной РМН и РТГА, сопоставимы между собой. 2.6 Применение разработанного набора РТГА для серологических исследований сывороток крови свиней на обнаружения антител к ВГС типа А подтипа НШ1 Разработанным набора РТГА в период с 2010 по 2012 гг., было исследовано более 3000 проб сывороток крови свиней, присланных из свиноводческих хозяйств РФ Центрального и Приволжского федеральных округов. Данные представлены на рисунке 1.

----- ------------ --23,12 ->0,4

---------------------------- -

^иШ Г Л МЛ I

Рисунок 1 - Проведение серологических исследований сывороток крови свиней в период 2010-2012 гг. в РТГА

Из данных, представленных на рис. 1, видно, что при исследовании проб во многих свиноводческих хозяйствах РФ за период с 2010 по 2012 гг., обнаружены сероположительные пробы к ВГС типа А подтипа НШ1. Данные результаты свидетельствуют о возможной циркуляции ВГС типа А подтипа НШ1 в свиноводческих хозяйствах РФ. Поэтому необходимо проведение дальнейших серологических исследований на грипп свиней, изучение его роли в развитии патологий с респираторным и репродуктивным синдромами у данного вида животных.

3. ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы биологические свойства изолята ВГС «А/свинья/Владимирское/2010/113Ы2» отечественного происхождения:

при культивировании полученного изолята ВГС в СПФ КЭ 10-12 суточного возраста в течение 48 часов средний инфекционный титр составил 7,40±0,11 ^ ЭИД50/см3; максимальный титр в РГА - 7

после адаптации изолята к перевиваемой культуре клеток МОСК. и первичной культуре клеток СП средние инфекционные титры составили 7,5 ^ ТЦД5о/см3 и 6,4 ^ ТЦД50/см3, соответственно;

- установлено, что при экспериментальном заражении белые мыши, морские свинки и кролики оказались не восприимчивы к данному изоляту.

2. После адаптации штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 НШ1 к перевиваемой культуре клеток МОС уровень инфекционной активности вируса на 4 пассаже составил 6.2 ^ ТЦД5о/см3.

3. Максимальное накопление штамма ВГС А/свинья/Калифорния/07/2009 НШ1 в

ЭЭЖ (8 lg ЭИД50/см3) с выраженной гемагглютинирующей активностью (8,0±0,6 log2) отмечается при заражении 10-11 дн. КЭ в дозе 3 lg ЭИД50/0,1см3 и культивировании в течение 2 сут.

4. Установлены параметры инактивации ВГС типа А подтипа H1N1 и H3N2: при применении ß-пропиолактона в конечной концентрации 0,05% и инкубации смеси в течение 24 ч. при температуре 27°С вирус теряет инфекционные свойства без снижения гемагглютинирующей активности.

5. Отработана схема иммунизации свиней эмульсионной вакциной с антигеном ВГС H1N1 (2-кратно с интервалом 21 сут в дозе 2 см3) с целью получения и последующей очистки вирусспецифических сывороток крови с активностью не менее 9 log,

6. Определены условия лиофильного высушивания иммуноспецифических компонентов набора для РТГА. Оптимизирована схема комплектования набора с включением солей буферного раствора, иммунологических микропанелей. Срок годности коммерческого набора для РТГА при этом составил не менее 12 мес.

7. Разработан и утвержден Россельхознадзором пакет нормативной документации на «Набор для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации» (СТО 00495527-0189 -2012).

8. С использованием разработанного набора для РТГА в 2010-2012 гг. исследовано более 3000 проб сывороток крови свиней из хозяйств Центрального и Приволжского федеральных округов и показано, что от 20,4 до 27,85% проб были положительными к ВГС типа А подтипа H1N1, что свидетельствует о циркуляции ВГС типа А подтипа H1N1 в свиноводческих хозяйствах РФ.

9. Оптимизированы условия постановки реакции микронейтрализации для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H1N1. Относительная чувствительность и специфичность к разработанному набору РТГА составили 80% и 100%, соответственно.

4. Практические предложения

Для практического использования предлагается нормативно-техническая документация:

- Набор и инструкция для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации (СТО 00495527-0189 -2012), утвержденные Россельхознадзором в 2012 году;

- Промышленный регламент на изготовление и контроль «Набора для серодиагностики гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации», утвержденный директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011 году;

Предложены, комиссионно проверены, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические указания:

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А в реакции торможения гемагглютинации» в 2010 году» в 2010 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H3N2 в реакции торможения гемагглютинации» в 2013 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H INI в реакции микронейтрализации» в 2011 году.

5. Список литературы

1. Болезни сельскохозяйственных птиц / А.А Лимаренко, И С Дубров, A.A. Таймасуков. С H Забашта - СПб: Лань, 2005 - 448 е.;

2. Воронин Е.С. Иммунология//- М.: Академкнига, 2007 - 322с.

3. Гайдышев И. Анализ и обработка данных: специальный справочник. - СПб: Питер, 2001;

4. Грипп свиней (эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики) / С. А. Кукушкин, Т. 3. Байбиков, А. В. Каньшина, М.В. Челышева // Ветеринария. -2009. - № 9. - С. 3-7.

5. Каверин Н.В., Смирнов Ю.Л. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий // Вопр. вирусологии. — 2003. - №3. -С. 4-12.

6. Соловьев Б.В. Грипп: современные представления- Вет. жизнь. - 2006. - № 7-8 (апрель). - С. 14-15.

7. Antigenic categorization of contemporary H3N2 swine influenza virus isolates using a high-throughput serum neutralization assay / B. M. Hause, T. A. Oleson, R. F. Bey, [et al.] // J. Vet. Invest. - 2010. - Vol. 22. - P. 352-359.

8. Brown I.H. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs // Vet. Microbiol.-2000.-Vol.74.-P.29-46.

9. Global patterns of influenza a virus in wild birds / B. Olsen, J.V. Munster, A. Vallensten [et al] // Science. - 2006. Vol. 312, № 5772. P. 384-388.

] 0.Comparison of three serological assays to determine the cross-reactivity of antibodies from eight genetically diverse U.S. Swine influenza viruses/ B. Leuvverke, P. Kitikoon, R. Evans, [et al.] Hi. Vet. Diagn. Invest. - 2008,- Vol. 20,- P. 426-432. 11.Swine Influenza A (H1N1) infection in two children-Southern California // MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. -2009,- Vol. 58,- №15,- P. 400-402.

12.Jung Т., Choi C., Chae C. Localization of swine influenza virus in naturally infected pigs // Vet. Pathol. - 2002. - Vol.39, №1. - P. 10-16.

13.Pathogenicity of a swine influenza H1N1 virus antigenically distinguishable from classical and European strains / Brown I.H., Done S.H., Spencer Y.I. [et al] // Vet. Rec. - 1993. - vol. 132. P. 598-602.

14.OIE. Terrestrial Manual, CR 2.8.8. Swine influenza. Paris, 2010. P. 1-9. 15.01sen C.W. a. Emergence of novel strains of swine influenza virus in North America // Trends in Emerging Viral Infections of Swine /ed. [et al.]. - Ames, IA, 2002. - P. 37-43.

6 Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Выявление антител к гриппу свиней методом РТГА на территории РФ в период с 2009 по 2011 год / С. Г. Ремыга, О. Ю. Горюшев, Е. К. Долганова, А.А. Шевцов// Ветеринарный врач. - 2012. - № 3. - С. 9-11;

2. Оптимизация параметров культивирования вируса гриппа свиней типа А/ О. Ю. Горюшев, С. Г. Ремыга, И. А. Чвала, А.А. Шевцов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - 2011. - Т. 9. - С. 117-123. - 619.6 Т 78.

3. Оптимизация постановки реакции торможения гемагглютинации для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа свиией типа A (H1N1) / С.Г. Ремыга. О.Ю. Горюшев, Е. К. Долганова, А. А. Шевцов // Ветеринария и кормление. -2010,-№6.-С. 14-15.

4. Серологические исследования на грипп свиней / С. Г. Ремыга, А. А. Шевцов, О. Ю. Горюшев [и др.] // Актуальные проблемы биологии: материалы Всерос. науч.-практ. конф. - 2011. - С. 75-77.

Подписано в печать 12 ноября 2013 г. Формат 60*90 1/16. Усл. печ. л.1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ремыга, Степан Геннадьевич, Владимир

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи

04201450537

РЕМЫГА Степан Геннадьевич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ ТИПА А И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКИ

03.02.02 «Вирусология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

Доктор биологических наук, профессор ГРУЗДЕВ Константин Николаевич

Владимир-2013

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................13

2.1 Классификация вируса гриппа............................................................................13

2.2 Морфологический и химический состав вируса гриппа свиней и устойчивость к физико-химическим факторам.......................................................14

2.3 Репликация вируса................................................................................................16

2.4 Патогенез...............................................................................................................17

2.5 Клинические признаки.........................................................................................18

2.6 Патологоанатомические и гистологические изменения...................................20

2.7 Клинико-эпизоотологическая характеристика гриппа свиней........................21

2.8 Иммунитет и профилактика заболевания...........................................................24

2.9 Диагностика...........................................................................................................28

2.9.1. Серологическая диагностика................................................................30

2.9.2 Реакция нейтрализации..........................................................................32

2.9.3 Иммуноферментный анализ..................................................................34

2.9.4 Полимеразная цепная реакция...............................................................35

2.9.5 Заключение по обзору литературы..................................................................36

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................38

3.1. Материалы............................................................................................................38

3.1.2. Вирусы...............................................................................................................38

3.1.3. Эмбрионы кур...................................................................................................38

3.1.4 Культуры клеток................................................................................................38

371757 Животные. 77.7....7777......7.................................................................................39

3.1.10. Получение нормальной сыворотки крови животных.................................39

3.1.11. Получение специфической к типу А подтипа H1N1 сыворотки крови животных.....................................................................................................................39

животных.....................................................

3.1.13 Получение эритроцитов животных

40

3.1.14. Подготовка сывороток крови свиней и кроликов к исследованиям.........41

3.1.15. Химреактивы и растворы...............................................................................42

3.1.15.1 Приготовление поддерживающей питательные среды..................42

3.1.15.2 Приготовление физиологического раствора...................................43

3.1.15.3 Приготовление консерванта Мигулиной........................................43

3.1.15.4 Приготовление раствора цитрата натрия........................................43

3.1.16. Оборудование..................................................................................................43

3.2. Методы исследования.........................................................................................44

3.2.1. Культивирование ВГС типа А подтипа H1N1 на куриных СПФ эмбрионах.........................................................................................................44

3.2.2. Получение ВГС А подтипа H3N2 на куриных СПФ эмбрионах......45

3.2.3 Получение вируса гриппа свиней типа А подтипа H1N1 на перевиваемой культуре клеток MDCK...................................................................................46

3.2.4. Получение ВГС типа А подтипа H3N2 на перевиваемой культуре клеток MDCK................................................................................................................46

3.2.5. Определение стерильности матровой расплодки ВГС......................47

3.2.6. Молекулярно-генетические методы исследований............................48

3.2.7. Определение инфекционной активности ВГС....................................48

3.2.8. Экспериментальное заражение лабораторных животных ВГС типа А подтипа H3N2...................................................................................................50

3.2.9. Определение гемагглютинирующей активности ВГС типа А..........50

3.2.10. Инактивация ВГС типа А....................................................................51

3.2.11. Очистка и концентрирование вируса гриппа свиней типа А.........52

"3.2.12. Лйофйлизация 1штйгена~и сывороток...............................................52

3.2.13. Определение титра антител к ВГС типа А в реакции торможения гемагглютинации.............................................................................................53

3.2.14. Интерпретация результатов РТГА.....................................................54

3.2.15. Постановка реакции микронейтрализации (РМН) для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 в сыворотках крови свиней............55

3.2.16. Постановка ИФА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 и

H3N2..................................................................................................................56

3.2.17. Статистическая обработка результатов исследований....................56

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................57

4.1. Оценка серологических исследований по гриппу свиней типа А подтипа H1N1, проведенного в 2009-2010..............................................................................57

4.2. Разработка набора для определения уровня антител к ВГС типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации......................................................58

4.3. Подбор эритроцитов крови при определении гемагглютинирующей активности ВГС типа А подтипа H1N1.........................................................58

4.4. Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа H1N1 для использования в серологических реакциях.......................................................62

4.4.1. Культивирование ВГС типа А подтипа H1N1 в куриных эмбрионах62

4.5. Получение культурального ВГС типа А подтипа H1N1 для использования в серологических реакциях...........................................................................................65

4.5.1. Культивирование ВГС в перевиваемой культуре клеток..................65

4.6. Инактивация ВГС А подтипа H1N1...................................................................68

4.6.1. Получение лиофильно высушенного инактивированного антигена ВГС типа А подтипа H1N1.................................................................................................69

4.7. Оптимизация параметров обработки нативных сывороток перед использованием их в РТГА........................................................................................71

4.8. Получение лиофильно высушенной положительной вирусспецифической и нормальной сывороток крови свиней.......................................................................73

4.9. Разработка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к

Büpycy гриппа свиней типа А подтипа H3N2..........................................................75

4.9.1. Подбор эритроцитов крови при постановки РГА и РТГА...........................76

4.9.2 Изучение биологических свойств изолята вируса гриппа свиней

«А/свинья/Владимирское/2010/H3N2».....................................................................79

4.9.2.1 Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа

H3N2 для использования в серологических реакциях............................................79

4.9.2.2. Культивирование ВГС типа А подтипа H3N2 в куриных эмбрионах......79

4.9.2.3. Экспериментальное заражение лабораторных животных ВГС типа А

подтипа НЗШ...................................................................................................82

4.9.3. Получение культурального вируса гриппа свиней типа А подтипа НЗШ

для использования в серологических реакциях............................................83

4.9.3.1. Культивирование вируса гриппа свиней в культуре клеток..........83

4.10. Инактивация изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/НЗЫ2.......88

4.11. Оптимизация параметров обработки нативных сывороток перед

использованием их в РТГА.............................................................................90

4.11.1. Получение специфической к изоляту ВГС

«А/свинья/Владимирское/2010/НЗN2» и нормальной сывороток крови свиней с дальнейшей лиофилизацией...........................................................................90

4.12. Разработка реакции микронейтрализации для выявления антител против ВГС типа подтипа Н1Ш........................................................................<....................90

4.13. Сравнительные исследования сывороток крови свиней на наличие антител к ВГС в РТГА, РМН и ИФА......................................................................................96

4.14. Воспроизводимость результатов РТГА в зависимости от времени и условий постановки реакции.....................................................................................99

4.15. Проведение серологических исследований на грипп свиней типа А в свиноводческих хозяйствах России........................................................................102

5. ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................................105

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................114

7. ВЫВОДЫ..........................................................................................................116

8. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................................................118

Список-сокращений и условных обозначений .?::....:.тг:.... .:.тг........ г.тг...... .777.. 1 19"

Список терминов.......................................................................................................120

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................121

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................137

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Грипп свиней (инфлюэнца свиней, энзоотическая бронхопневмония) - высоко контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся резко выраженной лихорадкой, общей слабостью и поражением органов дыхания, сопровождающимся кашлем, чиханием, и выделением назальной слизи. Вирус гриппа свиней (ВГС) может вызывать заболевание у людей и, наоборот, установлена возможность заражения свиней вирусом гриппа человека [14].

ВГС является широко распространенным и значимым возбудителем респираторного заболевания у свиней [20]. Основные подтипы данного вируса -H1N1, H3N2 и H1N2. Клинические проявления заболевания можно наблюдать в стаде несколько недель, по мере распространения вируса внутри популяции. Основными факторами, влияющими на течение и тяжесть заболевания свиней гриппом являются ко-инфекционные агенты, возраст животных, общее состояние здоровья и иммунного статуса и, потенциально, штамм ВГС [14, 20, 81].

Сложившаяся эпизоотическая ситуация по гриппу свиней имеет большое социальное значение в связи с возможностью вируса к реассортации и возникновению штаммов высоко патогенных для людей.

На протяжении XX в. неоднократно фиксировались пандемии гриппа разной степени тяжести, от легких до катастрофических. Одной из первых можно считать пандемию Испанского гриппа H1N1 («испанки») 1918 года, унесшего по разным данным от 20 до 50 миллионов человеческих жизней по всему миру. В 1957 году (Азиатский грипп) и 1968 году (Гонконгский_грипп) пандемия, повлекла гибель 1 _ и 0,5 миллиона людей по всему миру соответственно [40, 79].

Большую угрозу вызвал высокопатогенный вирус гриппа птиц подтипа H5N1 в Юго-Восточной Азии с дальнейшим распространением в Европу и Африку, в первую очередь из-за высокого уровня смертности людей [153, 42].

Факт инфицирования данным подтипом вируса был выявлен в 1997 году в Китае, во время вспышки на одном из птицеводческих хозяйств [76].

Впоследствии высоко патогенный H5N1 при повторном появлении в 2003 и 2004 гг. получид широкое распространение. В результате проникновения вируса на территорию Европы и Африки миллионы голов домашней птицы были инфицированы. Установлены случаи заражения и смерти людей. Вспышки гриппа среди домашней птицы нанесли серьезный удар по экономике, обеспечению продовольствием и торговле в пострадавших странах[121].

Циркуляция вируса H5N1 среди домашней птицы по-прежнему представляет угрозу общественному здоровью, так как сохраняется возможность инфицирования людей, особенно в период реоссортации вируса, с приобретением способностей передаваться от человека к человеку [45, 146]

Наряд с перечисленными подтипами ВГС среди домашней птицы и животныхциркулируют и другие подтипы, представляя потенциальную угрозу для здоровья населения.

Эпизоотическая ситуация по гриппу обострилась после заболевания и гибели людей от "нового" вируса гриппа свиней типа А, выявленного в апреле 2009 г. в Мексике [14, 79, 114]. Генетический анализ данного вируса показал, что он произошел от комбинированных Североамериканского и Евроазиатского вирусов .гриппа свиней [121, 129, 150].

На данный момент существует ряд методик, которые условно можно разделить на прямые и косвенные, призванных выявлять вирус гриппа в свиноводческих хозяйствах.

К прямым методам выявления ВГС можно отнести выделение вируса в куриных эмбрионах (КЭ), культуре клеток (КК), выявление генома вируса в полимеразной цепной ~ ~ реакции (ПЦР), проведение реакции иммунофлюоресценции, постановка иммуноферментного анализа (ИФА) на антиген и реакции иммуногистохимии (ИГХ).

С развитием заболевания вирус быстро накапливается в легких и носовой слизи, что позволяет выделить его для культивирования и идентификации [23, 33, 56].

При использовании данных методов часто необходимо учитывать такие

аспекты, как пробоподготовка, оптимизация параметров культивирования, выявление генома или антигена ВГС. К тому же вирус можно «потерять» при несоблюдении правил отбора, упаковки или транспортировки патологического материала.

Также при проведении диагностических исследований на грипп свиней используют серологические реакции. Все их можно отнести к косвенным методам определения присутствия вируса гриппа у свиней. В научных работах зарубежных исследователей описываются различные методы диагностики на выявления антител к гриппу свиней. К ним можно отнести: РТГА, РН, ИФА на выявления уровня антител, РТНА и др. В 1995 г. И.Х. Браун с соавторами исследовали сыворотки крови свиней в Великобритании, с использованием реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации [141].

Степень разработанности проблемы. С появлением новых подтипов ВГС, а также из-за существования значительной антигенной неоднородности внутри подтипов вируса гриппа и вариационных линий в разных географических районах мира [40], диагностировать данное заболевание становится значительно труднее. Поэтому классические методы диагностики, такие как РТГА или РН требуют усовершенствования, разработки наборов к новым, актуальным штаммам ВГС. Учитывая тот факт, что на территории РФ вакцинация против гриппа свиней не входит в перечень обязательной специфической профилактики заболевания, данные методы диагностики являются первостепенными при проведении скрининговых или мониторинговых исследований на ГС. Выявление в сыворотках крови свиней антител к ГС указывает на возможное присутствие "заболевания. Отсутствие в доступной литературе сведений о наличии отечественных тест-систем для выявления антител к ВГС, свидетельствует о необходимости и своевременности их разработки.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение биологических свойств ВГС типа А и усовершенствование методов серологической диагностики гриппа свиней типа А подтипа НШ1 и Н3№ в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА) и микронейтрализации (РМН).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

определить условия культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 в куриных эмбрионах (КЭ), в первичной и перевиваемых культурах клеток с целью выделения, адаптации ВГС и получения вируссодержащего материала; изучить гемагглютинирующие свойства ВГС, подобрав необходимые эритроциты от разных видов животных и параметры постановки РГА и РТГА;

изучить чувствительность лабораторных животных к ВГС типа А подтипа H3N2;

подобрать инактивант и режим инактивации ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2, с целью получения антигенов, обладающих выраженной антигенной и гемагглютинирующей активностью;

получить вирусоспецифические сыворотки крови свиней к ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2; оптимизировать условия очистки нативных сывороток крови свиней от термостабильных и термолабильных ингибиторов;

установить условия лиофильного высушивания иммуноспецифических компонентов набора РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 (антиген, положительные и нормальные сыворотки крови свиней);

разработать нормативную документацию на набор РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1, а также методические рекомендации для выявления антител к ВГС типа А подтип H3N2 в РТГА и H1N1 в РМН. Научная новизна результатов исследований.

Впервые в России разработана технология изготовления компонентов РТГА ^цля вШвленйяантителк ВГС типа А подтипа H1N1. Подобраны оптимальные параметры культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 в КЭ и перевиваемой культуре клеток. Изучены биологические свойства изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/ H3N2, при культивировании его в КЭ, перевиваемой и первичной культурах клеток. Определена его гемагглютинирующая, инфекционная и антигенная активности. Установлены основные параметры инактивации ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 при

сохранении их основных антигенных и гемагглютинирующих свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований изучены биологические свойства полученного изолята и штаммов ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2. Выявлены основные параметры их культивирования на культурах клеток и куриных эмбрионах. Установлены параметры инактивации ВГС, а также приготовления и хранения иммуноспецифических компонентов ВГС типа А. Определена корр