Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности современных эпидемических штаммов вирусов гриппа A и B

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности современных эпидемических штаммов вирусов гриппа A и B"

На правах рукописи

Матюшина Русава Олеговна

ОСОБЕННОСТИ СОВРЕМЕННЫХ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ВИРУСОВ ГРИППА А и В

03.00.06 - вирусология 14.00.30 - эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003062338

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна

Доктор медицинских наук, Заслуженный деятель науки РФ, профессор Слепушкин Анатолий Николаевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Академик РАМН, профессор Каверин Николай Вениаминович Доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, г. Москва

Защита состоится «21» мая 2007 года в 1200 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан «20» апреля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

Косякова Н.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Грипп является массовой инфекцией, ежегодно регистрируемой в различных частях земного шара и наносящей огромный экономический ущерб. Основная причина этого связана с полиэтиологичностью возбудителей, естественной изменчивостью их генома, приводящих к изменению структуры и свойств вирионных белков (Lin Y.P. et al., 2004). В случаях появления нового антигенного варианта вируса гриппа типа А человечество вовлекалось в пандемии гриппа, отличием которых являлось быстрое распространение, высокие показатели заболеваемости и летальности. Во время эпидемии заболевает не менее 20-30% детей и 5-10 % взрослого населения, при пандемии - до 40-60%. При этом заболеваемость варьирует и зависит от возбудителя пандемии (Гендон Ю.З., 2007; Slepushkin

A.N.et al., 2004; Potter C.W., 1998) По числу сезонной смертности в развитых странах грипп занимает первое место: ежегодно умирают от гриппа и его осложнений от 250 000 до 500 000 человек (Reichert Т.А., Sharma А., 2001; WER, 2005). Особенностью настоящего периода является распространение новых антигенных вариантов циркулирующих вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, их «циркуляция, возникновение новых эволюционных линий и реассортантов (Литвинова О.М., Лузянина Т.Я., 2001; Литвинова О.М. и др., 2003; Иванова

B.Т. и др., 2004; Соминина A.A. и др., 2005; Webster R. et al, 1994; Ellis J.S.et al., 2002; Goddard N.L. et al., 2002; Xu X. et al., 2002). Интродукция вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию может свидетельствовать о возникновении потенциальных кандидатов в новые пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; MMWR, 2004; Ilyushina N.A. et al., 2004, Webster R. et al., 2006; WER, 2006).

В рамках подготовки мероприятий по борьбе с возможной пандемией, большое значение отводится надзору за распространением инфекции, своевременной этиологической диагностике заболевания, характеристике биологических особенностей возбудителя. Изучение циркуляции вирусов гриппа в таком огромном регионе земного шара, каким является Россия, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Для характеристики возбудителя проводятся вирусологические исследования - выделение и титрование штаммов вирусов гриппа, изучение свойств вирионных белков, влияние различных факторов на них, установление степени взаимодействия между вирусами гриппа человека и клетками животных (Бурцева Е.И. и др., 2001; Marishita et al., 1996), Результаты серологических исследований различными современными методами, позволяют обеспечить определение не только этиологических агентов, вызвавших эпидемию, но и структуру постинфекционного и поствакцинального иммунитета как к поверхностным, так и к консервативным внутренним белкам, общим для вирусов гриппа человека и животных (WER, 2002). Это актуально при исследовании сывороток переболевших гриппозной инфекцией людей, находившихся в контакте с больными птицами или проживающих в эндемичном по птичьему гриппу районе, поскольку антитела, образующиеся при этом, являются вируснейтрализующими и не могут быть выявлены в РТГА (Wong S.S.Y., Yuen К.,

2006). Углубленное изучение молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов позволяет определять основные тенденции в изменчивости вирусов гриппа А и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими ранее и возникающими вновь в различных регионах земного шара (Webster R. et al., 1992; Hay A.J, 2001). Изучение динамики популяционного иммунитета в зависимости от периода эпидемического цикла позволяет определить степень защиты людей от актуальных эпидемических штаммов.

Огромную роль в проблеме борьбы с гриппом играет разработка новых методов диагностики, что побуждает обращаться к поиску методических решений для вирусологических исследований с привлечением современных достижений различных областей науки, в том числе материалов и методов для создания тест-систем. Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы как для расшифровки причин текущих и прогнозирования грядущих эпидемий, так и для проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, в том числе - разработки новых вакцинных и диагностических препаратов.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования является характеристика биологических и иммуногенных свойств эпидемических штаммов, циркулировавших в России с 2002 по 2006 гг. и усовершенствование лабораторной диагностики гриппа.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Оценить современную эпидемическую ситуацию в отношении гриппа в России в период с 2003 г. по 2006 г.

2. Определить антигенные свойства возбудителей эпидемий гриппа в период 2003-2006 гг., их эволюционные связи с эталонными и эпидемическими штаммами, циркулировавшими в России и в мире в разные годы.

3. Изучить чувствительность различных клеток человека, животных и птиц, используемых для изоляции (клеток культуры тканей MDCK и куриных эмбрионов - КЭ) и идентификации вирусов гриппа (эритроциты), к эпидемическим штаммам, изолированным в период 2002-2006 гг.;

4. Определить влияние различных факторов (температурного воздействия, протеолитической обработки различными ферментами) на активность вирионных белков (НА, NA и М) эпидемических штаммов, изолированных в период с 2002 по 2006 гг., и обладающих разными антигенными свойствами;

5. Исследовать методом иммуноблота иммунные сыворотки животных и людей, для характеристики постинфекционного и поствакцинального противогриппозного иммунитета;

6. Изучить состояние популяционного иммунитета населения к эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического цикла;

7. Разработать новый методический подход для идентификации вирусов гриппа с применением современных материалов и методов.

Научная новизна работы

На основании результатов вирусологических и серологических исследований определена этиологическая структура гриппа в России в период с 2003 г. по 2006 г., установлено преобладание в популяции А(НЗ№) антигенных вариантов новых эталонных штаммов А/Фуцзянь/411/02 и А/Калифорния/7/04 в 2003-2005 гг. и 2005-2006 гг. соответственно.

Выявлено чередование циркуляции представителей двух эволюционных линий вирусов гриппа В в период с 2004 г. по 2006 г., при этом впервые в России в эпидемическом сезоне 2005-2006 гг. выявлены новые антигенные варианты подобные В/Малайзия/2506/04 линии В/Виктория/2/87.

Установлено, что эпидемические штаммы вирусов гриппа А(НЗ№), родственные новым эталонам А/Фуцзянь/411/02 и А/Калифорния/7/04, в отличие от вирусов гриппа А(НШ1) наименее чувствительны к системе изоляции КЭ, что говорит о том, что клетки культуры тканей КШСК продолжают оставаться приоритетной системой для изоляции вирусов гриппа А(НЗ№) из носоглоточных смывов.

Установлены различия в чувствительности эритроцитов человека разных групп крови, морской свинки и кур к современным штаммам вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и В, изолированным в период с 2002 по 2006 гг.: наименьшей чувствительностью обладали эритроциты кур при взаимодействии с вирусами гриппа типа А.

Впервые установлены отличия хроматографических профилей триптических гидролизатов консервативных белков М1 вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и В, свидетельствующие о различиях в структуре этих белков.

Впервые метод иммуноблота был применен доя определения спектра вирусспецифических антител в сыворотках переболевших гриппозной инфекцией и установлено наличие в них антител к внутренним белкам М1 и ИР.

Впервые иммуноблот был использован для определения спектра вирусспецифических антител в сыворотках лиц, вакцинированных гриппозными вакцинами - полимер-субъединичной вакциной Гриппол™ и расщепленной вакциной Ваксигрип™, и выявлено наличие антител к гемагглюшнину вакцинных штаммов.

Впервые установлена возможность использования в вирусологии метода поляризационной микроскопии для анализа комплексов антигенов вирусов гриппа и антител к ним, с применением современных материалов полианилина и жидких кристаллов.

Практическая значимость работы

Полученные данные по идентификации и изучению особенностей вирусов гриппа, циркулировавших на территории России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции вирионных белков этих вирусов учитывались при прогнозировании эпидемий и отборе кандидатов в вакцинные штаммы. Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств циркулировавших штаммов вирусов гриппа включались в информационные материалы, посылавшиеся в ВОЗ, в департамент Госсанэпиднадзора Минздравсоцразвития РФ, в базовые областные и городские центры Госсанэпиднадзора.

В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве (Швейцария) и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылались ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входили в состав коллекций вирусов этих центров. В Государственную коллекцию вирусов депонировано 2 оригинальных штамма: А/Москва/34/03 (ГКВ № 2369) и В/Москва/3/03 (ГКВ № 2370), которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа А и В. Коллекция вирусов Научно-практического центра экологии и эпидемиологии гриппа пополнена изученными штаммами (98), наиболее характерными для вирусных популяций ежегодных эпидемий гриппа (в течение 3 лет). Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.

Обосновано применение клеток культуры ткани MDCK для изоляции современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В и использование эритроцитов 0(1) группы крови человека при их индикации и идентификации.

Выявление методом иммуноблота (ИБ) в сыворотках переболевших гриппом и ОРВИ антител как к наружным, так и к внутренним белкам позволяет использовать этот метод для дифференциальной диагностики гриппоподобных заболеваний. В рамках подготовки к пандемии гриппа, ИБ возможно применять для анализа вирусспецифических антител в сыворотках больных, зараженных гриппом птиц или новыми пандемическими штаммами, которые невозможно выявить в РТГА.

Исследование методом иммуноблота спектра антител у вакцинированных позволяет рекомендовать этот метод для оценки иммуногенности разных вакцин в отношении разных белков современных вакцинных штаммов и определения специфичности и длительности поствакцинального иммунитета.

Имеется Патент РФ № 2290444 2006 г. на предложенный метод определения комплексов антиген-антитело для диагностики гриппа и других вирусных инфекциях.

Апробация работы

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: VI Международном симпозиуме по вирусным респираторным инфекциям (Форт-Майерс, США, 2004); I Международной конференции по гриппозным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004); Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» (г.Санкт-Петербург, 2004); V Конференции по инфекционным заболеваниям поев. Луису Пастеру (Париж, Франция, 2004); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (г. Санкт-Петербург, 2004); П1 Конференции по исследованию Ортомиксовирусов (Кембридж, Великобритания, 2005); Европейский конгресс по полимерам 2005 (г. Москва, 2005); VI конгресс детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (г. Москва, 2005); Международной конференции по зооантропонозам (Ульяновск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология-2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики,

диагностики и лечения инфекционных болезней» (г. Москва, 2006); V Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (г. Москва, 2006); Европейской конференции «Инфекционные болезни и болезни пищеварительного тракта» (Париж, Франция, 2006).

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела экологии вирусов с Центром по экологии и эпидемиологии гриппа и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 1 марта 2007 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых российских научных журналах, 1 патент и тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает отечественных и зарубежных источников. Диссертация

изложена на /76 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы и 30 рисунков.

Ключевые слова: эпидемические штаммы, вирусы гриппа А и В, иммунные сыворотки, популяционный иммунитет, куриные эмбрионы, клетки культуры ткани МБСК, хроматографический анализ, иммуноблот, жидкие кристаллы, поляризационная микроскопия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусы и антитела. Использовано 11 эталонных штаммов вирусов гриппа типов А и В: А(НШ1) - 1, А(НЗ№) - 5, В - 5, которые были получены из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа, НИИ вирусологии РАМН, а также из справочных центров ВОЗ. Исследовано 238 эпидемических штаммов вирусов гриппа человека типов А и В, циркулировавших в России в период с 2002 г. по 2006 г., из них А(НШ1) - 43 штамма, А(НЗ№) - 131 штамм, В - 64 штамма. Кроме того, в работе использовали 86 носоглоточных смывов для изоляции эпидемических штаммов на куриных эмбрионах. Носоглоточные смывы и вирусные изоляты были получены от больных с диагнозом грипп и ОРВИ, в возрасте <1-79 лет в период с 2002 г. по 2006 г. из 13 городов России. Серологические исследования включали изучение 1116 сывороток от лиц с разным анамнезом, в числе которых; 200 парных сывороток, полученных от переболевших гриппом и ОРВИ, из 2 городов России за 2 эпидсезона (2004-2005 и 2005-2006); 481 сыворотка, полученная от доноров города Москвы в период 2003-2006 гг.; 235 сывороток от 86 детей в

возрасте от 2 до 18 лет, привитых гриппозными вакцинами. Кроме того, в работе использованы иммунные сыворотки животных, содержащие поли- и моноклональные антитела к вирусным белкам: кроличья, приготовленная в лаборатории, к внутреннему М1-белку вируса гриппа А/СССР/090/77 (H1N1), и мышиная, содержащая моноклональные антитела (МКАТ) к белкам НА и NP вируса гриппа с подтипом гемагглютинина НЗ, входящая в диагностический набор ВОЗ (KIT, кат. № VS2246).

Характер многолетней динамики, сезонности, распространенности, этиологической, возрастной структуры заболеваемости гриппом был изучен на основании государственных статистических форм и оперативной отчетности центра Госсанэпиднадзора г. Москвы, Роспотребнадзора, ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» 13 городов России.

Выделение и культивирование вирусов на системе изоляции - куриные эмбрионы (КЭ) и клетках культуры ткани MDCK. Выделение вирусов гриппа из носоглоточных смывов, полученных от больных с диагнозом грипп и ОРВИ, а также из вируссодержащей культуральной жидкости (MDCK), проводили на 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ). Заражение осуществлялось в амниотическую полость КЭ. Вирусы культивировали на клетках культуры ткани MDCK по методу Davies H.W. et al., 1978г. Гемагглютинирующую активность вирусов определяли в РГА по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% эритроцитов 0(1) группы крови человека.

Определение антигенной активности гемагглютинина вирусов гриппа А и В, методом РТГА. Изучение антигенной структуры гемагглютинирующих изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием референс-пггаммов, а также приготовленных к ним сывороток и стандартных сывороток из диагностических наборов ВОЗ. Реакцию ставили по общепринятому методу, рекомендованному ВОЗ, и «Методам определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» (28.09.2003 г.).

Термочувствительность поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминндазы (NA) определяли по изменению гемагглютинирующего титра в РГА и нейраминидазной активности в РЛА по отношению к исходной активности после прогревания вируссодержащей жидкости при Т- 56°С в течение 60 мин.

Получение очищенных препаратов вирусов гриппа дифференциальным центрифугированием в ультрацентрифуге L5-50, ротор Ti-35, у=25000об./мин., t=l4ac; очищали в градиенте концентрации сахарозы 10-50%, у=22000об./мин, ротор SW 27.1,1=1час. Вирус ресуспевдировали в буфере SIE (0,01М Tris-HCl, 0,1М NaCl, 0,001М ЭДГА; рН=7,4).

Получение субвирусных частиц протеолизом осуществляли путем обработки вирусов гриппа В двумя препаратами фермента бромелаина фирм Merk и Sigma. За основу был взят метод, разработанный Brand С.М., Skehel J.J. (1972).

Выделение М1-белка, ферментативный гидролиз М1-белка, хроматографический анализ гидролизатов. Выделение М1-белка производилось методом кислотной

солюбилизации из субвирусных частиц (core) по методу Zhirnov O.P. (1992). Препараты белка подвергались ферментативному гидролизу с помощью трипсина фирмы «Promega» при Т-37°С в течение 18 часов в буфере с рН-7,8 (5% глицерин, 0,1% NP-40, ЮОтМ NaCl, 0,2М Tris) Тригггические гидролизаты анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией в обращенной фазе (ОФ ВЭЖХ) на хроматографе МИЛИХРОМ А-02 с использованием колонки с сорбентом Nucleosil 100 Cig (Fedorova N.V. et al, 1998)

Изучение иммуногенности гриппозных вакцин. В целях изучения динамики выработки вирусспецифических антител в ответ на иммунизацию полимер-субъединичной вакциной Гриппол™, у 63 привитых детей с соматической патологией были взяты пробы крови: 1-я проба - перед вакцинацией, 2-я - через 1,5 месяца, 3-я - через 1 год после вакцинации У привитых расщепленной вакциной Ваксигрип™ 23 детей, инфицированных микобактериями туберкулеза, были взяты пробы крови: 1-я проба - перед вакцинацией, 2-я -через 1 месяц Определение вирусспецифических антител к вакцинным и эпидемическим вирусам гриппа проводили в РТГА с использованием современных эталонных штаммов вирусов гриппа А и В.

Исследование иммунных сывороток в иммуноблоте. Разделение вирионных белков и аналш препаратов осуществляли в электрофорезе в 12% полиакриламвдном геле (ПААГ) в не восстанавливающих условиях по методу Laemmli UK. (1970) ИБ проводили по методике, описанной Towbin H et al. (1979) Перенос белков на мембрану (TOTALBLOT™ PVDF) осуществляли при J=80 шА В качестве конъюгатов использовали антитела, меченные пероксвдазой ангимышиные поливалешные Ig, в разведении 1:100 (SIGMA, №А-0412), свиные антитела против Ig кролика, в разведении 1:200 (ORION DIAGNOSTICA, №GE38), диагностические антитела против IgG человека, в разведении 1200 (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф Гамалеи); в качестве субстрата-диаминобензвдин(ДАБ)

Электронную микроскопию выполняли совместно с д.б.н Маныкиным А.А. (ГУ НИИ вирусологии РАМН) Негативное контрастирование проводили с помощью 2% водорастворимой фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН=6,0 (ФВК) и 2% водного раствора уранилацетата (У А)

Поляризационная микроскопия комплексов антиген-антитело проводилась совместно с к х.н M Ю. Яблоковым (НИ Физико-химический институт им Л.Я. Карпова, Москва) на приборе ПОЛАМ Л 213. Диаметр поля зрения 800 нм. В качестве подложки использовали проводящий полимер полианилин, синтезированный в Институте электрохимии им АН Фрумкина РАН (Москва). В качестве детектирующей системы использовались жидкие кристаллы (ЖК), состоящие из п-метоксибензилиден-п-н-бутиланилина (МББА) и п-этоксибезилиден-п-н-бутиланилина (ЭББА), имеющий интервал мезофазы 14-46°С.

Статистическую обработку результатов проводили стандартным методом Стьюдента, который включал вычисление показателей иммуногенности средних геометрических титров антител, средних квадратичных отклонений согласно Белякову ИД идр,1981

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эпидемиологические особенности гриппа в России в период с 2003 по 2006 гг.

Ежегодно вирусы гриппа вызывают подъем заболеваемости в России в осенне-зимне-весенний период Анализ заболеваемости гриппом и ОРВИ в России за последние 10 лет (в период с 1997 по 2006 гг.), проведенный на основании данных Минздравооцразвития РФ, выявил тенденцию к снижению заболеваемости гриппом в последние 3 года Максимальная заболеваемость гриппом была отмечена в 1997 г. - 5173,8 на 100 тыс населения и минимальная в 2004-2006 гг - 645,7-350,2 на 100 тыс. населения соответственно. В тоже время заболеваемость ОРВИ практически не изменялась на протяжении рассматриваемого периода и колебалась в пределах от 17256,7 до20354,3 на 100 тыс населения

Начало эпидемического подъема обычно сопровождалось поступлением носоглоточных смывов, вирусных изолятов, штаммов и сывороток от больных в Центры эпидемиологии и гигиены ФГУ здравоохранения разных регионов России (таб.1).

Анализ сезонности гриппа в 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006 гг. показал, что подъемы заболеваемости начинались с распространения вирусов гриппа А(НЗ№), однако старты их и состав возбудителей были различными. Циркуляция вирусов и появление больных с диагностическим приростом антител в сыворотках больных к эталонам этих сезонов приходилась на зимний период, однако эти данные несколько варьировали в зависимости от эпидемического сезона. Так, по вирусологическим данным, эпидемический сезон 2003-2004 гг. длился с ноября по январь, пик подъема заболеваемости приходился на декабрь-январь Эпидемический сезон 2004-2005 гг. начинался в декабре 2004 г. и закончился в апреле 2005 г. Особенностью эпидсезона 2005-2006 гг. было более позднее начало изоляции вирусов - с последней декады января по май 2006 г., причем пик подъема заболеваемости в России, обусловленный вирусами гриппа, пришелся на март 2006 г. При этом заболевания регистрировали и позже, по серологическим данным диапазон времени расширялся.

В каждом эпидсезоне, по вирусологическим данным, мы наблюдали циркуляцию вирусов гриппа А(НЗИ2) и социркуляцию их с вирусами гриппа А(НШ1) и В в различных сочетаниях в сезонах 2004-2005 и 2005-2006 гг. Например, доля эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НЗШ) в изученной нами вирусной популяции варьировала 100% в 20032004 гг.; 46,4% в 2004-2005 гг. и 63,5% в 2005-2006 гг По числу изолятов второе место занимали вирусы гриппа В, они были изолированы в 2 сезонах, в 2004-2005 гг. - 51,8%, в 2005-2006 гг. - 29,8% За рассматриваемый период вирусы гриппа А(НШ1) составляли наименьшую долю в вирусной популяции в эпидсезоне 2003-2004 гг. не было выделено ни одного штамма А(НШ1), 2004-2005 гг. они были выделены в спорадических случаях и составили 1,8% вирусной популяции, в 2005-2006 гг. доля вирусов гриппа А(НШ1) была 6,6%. Таким образом, наблюдалась тенденция к увеличению количества изолятов, что может свидетельствовать об усилении активности вирусов гриппа А(НШ1) в России

Таблица 1.

Циркуляция вирусов гриппа Л и В в регионах России в период с 2003 по 2006 гг. по _вирусологическим данным

Эпид сезон Тип вируса Эталонные штаммы Период изоляции 1Ч(%) % детей* Города**

20032004 А(НШ1) вирусы не были изолированы В.Новгород Владимир Екатеринбург Калининград Липецк Москва Н.Новгород Омск Ровно Ростов-на-Дону Рязань Ставрополь Тверь Томск Хабаровск Ярославль

А(НЗ№) А/Фуцзянь/411/02 17.11 0330.03.04 101 (100) 52,5

В вирусы не были изолированы

20042005 А(НЩ1) А/Н.Каледония/20/99 19.02.051.03.05 3(1,8) 51,2

А(НЗМ2) А/Фуцзянь/411 /02 10.01.0112.04.06 78(46,4)

В В/Шанхай/361/02 (Я)*** 6.12.0428.03.05 87(51,8)

20052006 А*НШ1) А/Н.Каледония/20/99 6.03.06 -20.04.06 13(6,6) 37,9

А(НЗЫ2) А/Калифорния/7/04 23.01.06 -20.04 06 113(633)

В В/Малайзия/2506/04 (В)**** 20.03.0622.05.06 56(29,8)

Примечание: N (%)- число изолированных штаммов и доля среди всех изолированных вирусов; * - % детей до 14 лет, от которых был получен вирусологический материал;** - города, из ЦЭЭГ которых были получен материал для исследования, смывы и вирусные изоляты; *** - эталонный штамм Ямагатской линии; **** - эталонный штамм Викторианской линии

При рассмотрении этиологической структуры возбудителей, вызывавших подъем заболеваемости в каждом эпидсезоне, по данным серологических исследований, диагностический прирост титров антител к эталонам соответствующих вирусов А и В наблюдался во всех эпидсезонах. Однако, доля их значительно варьировала в зависимости от сезона. Наибольшее показатели регистрировались у вирусов гриппа А(НЗ№) (54%) в эпидсезон 2003-2004гг. (Иванова В.Т. и др., 2006) В эпидемическом сезоне 2004-2005 гг. сероконверсии к вирусам гриппа А(НЗ№) составляли 14,9%, к вирусам гриппа В - 38,0%, к А(НШ1) - 2,5%. В эпидемическом сезоне 2005-2006 гг. в среднем процент сероконверсий к эталонам А(НЗШ) составлял 27,8%, к В - 21,5%, к А(НШ1) - 13,9%. Таким образом, в периоды, когда наблюдалось большее число сероконверсий в парных сыворотках от больных к данному возбудителю, регистрировали наибольшее число изолированных штаммов вируса гриппа. Кроме того, за период 2004-2006гг. по серологическим данным нами было выявлено 46,5% заболеваний с клинической картиной, сходной с гриппом, однако этиология их была не ясна. На долю микст-инфекции, вызванной разным сочетанием вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В, приходилось 7,5% от общего числа переболевших (рис.1).

A(H3N2)

21%

A(H!N1)+ A(H3N2) -0,5%

- В 21%

A^B 7%

A(H1N1) 4%

Рис,!. Этиологическая структура подъемов заболеваемости гриппом поданным серодиагностики в период с 2004 но 2006 гг.

Особый интерес представлял возрастной состав больных. По нашим данным процент детей до 14 лет, из носоглоточных смывов которых был изолирован вирус гриппа, варьировал'. 52,5% в сезоне 2003-2004 гг., 51,2% в екюне 2004-2005 гг. я 37,9% в сезоне 2005-2006 гг. По данным Ра с потреби адзора. процент заболевших гриппом детей до 14 лет в 2004 г. составлял 37,5%, в 2005 г. - 41,1%., в 2006 г. - 46,1% (Минздравсоцраэвнтия РФ, Детские инф., 2006, 2007).

В результате проведенных исследований была установлена этиология эпидемий, в период с 2003 по 2006 гг. В целом за этот период в вирусной популяции, как по вирусологическим, так и по серологическим данным, доминировали вирусы гриппа A(H3N2). Они составляли по вирусологическим данным 64,7%, по серологическим 32,4%, для вируса гриппа А(НШ1) -3,5% и 6%; а для вируса гриппа В - 31,7% и 20,6%, соответственно. Таким образом, количественное соотношение возбудителей было сходным по вирусологическим и серологическим данным.

Состояние популяционяого иммунитета к современным штаммам вирусов гриппа А и В с 2003 г. по 2006 г. у доноров г. Москвы и Московской области

Особое внимание заслуживала эпидемическая ситуация по Московскому региону. Общее число изолятов по Москве составляло 70 в 2004-2005 гг, а в 2005-2006 гг, - 124, что в процентном соотношении к общему числу изодятов было 41,7 и 68,1% соответственно. Сравнение спектра вирусов, циркулировавших в Москве и Московской области и в целом по России, показало, что в Москве циркулировали и доминировали A(H3N2) и В. По серологическим данным были выявлены приросты ко всем вирусам гриппа, при этом приросты к вирусам гриппа AíHffll) были наименьшими. Исследование динамики популяционного иммунитета на модели сывороток доноров Москвы и Московской области, показало, что на протяжении периода с 2003 по 2006 г., который включал 3 эпидсезона (2003-2004, 2004-2005, 2005-2006 гг.), уровень антител к циркулировавшим в данный период штаммам колебался в зависимости от фазы эпидсезона (до, во время и после активной изоляции вирусов) (рис.2).

XI 20С? :-l 2(КМ [ll1.v.20O4 VN zOO-l |Х.ХГ.20Ш III-V2005

ПСриоЛЫ КСС.'1еД0ВЯНИЙ

VII 2И5 PX-XN 2ÖQ5 ili-lv 20K V-V1.20O6

Рис,2, Динамика иопуляционного иммунитета в Москве и Московской области в период с 2003 по 2006 гг.

Наибольшие приросты антител были выявлены в постэпидемический период (июль 2005 г.) к вирусам гритша В. т.к. на протяжении этих периодов произошла смеяа представителей вирусов двух эволюционных линий. Что касается вирусов гриппа A(H3N2), то рост тигров антител К Ним наблюдался во всех трех сезонах. Вирусы гриппа A(H1"N1): Е 2003-2004 гг. практически не было выявлено существенных приростов СГГ (максимум 3,6-4,4 log2), в других сезонах, когда по нашим данным в стране начали циркулировать вирусы гриппа A(HINI) выявлено увеличение СГГ с 3,2 до 5,3 logs и 3,9 до 5,5 log;. Таким образом, результаты вирусологических, серологических исследований, а также анализ полулядионного иммунитета в Москве и Московской области отражали общую картину циркуляции вирусов в стране.

Антигеяньк свойства вирусов гриппа А и В, циркулировавших в России с 2003 по 2006 гг.

Сравнение антигенных свойств вирусов Гриппа А(Н IN 1), цирк)1 лироваилих в России в период 2004-2006 гг., показало, что большинство вирусов гриппа А(Н INI) были идентичными или являлись антигенными вариантами А/Новая Каледония/20/ВД. И только наличие 1 штаммов, слабо взаимодействовавших с гомологичной сывороткой, свидетельствовало о происходящих изменениях в а]ггигенной структуре гемагглютинина вирусов A(HTNi). Появление в мире штаммов вирусов гриппа с отличными от эталона А/Ноиая Каледсигия'20/99 антигенными свойствами, придало к замене этого эталона на новый штамм А/Соломоновы 0строва/3/2006 (H1N1) в составе вакцин, рекомендованном совещанием экспертов ВОЗ тЯ сезона 2007-2008гг, (WER, 2007).

Анализ вирусов гриппа A(H3N2), изолированных во всех сезонах, показал, что в молекуле белка гемагглютинина идет активный антигенный лрейф. В эпидемическом сезоне 2003-2004 гг.

все изолированные штаммы A(H3N2) были подобны эталону А/Фуцзянь/411/02. Однако, при ретроспективном анализе штаммов A(H3N2), изолированных в 2002-2003 гг., когда почти вся популяция была представлена антигенными вариантами А/Москва/10/99, была выявлена часть штаммов с антигенной структурой, подобной А/Фуцзянь/411/02. В сезоне 2004-2005 гг. большинство изолятов были близко родственны эталону А/Фуцзянь/411/02. Вместе с тем было выявлено несколько штаммов, взаимодействующих до !/< и менее гомологичного тигра, которые были подобны новому эталону АЛСалифорния/7/04(НЗК2). Аншгенные варианты этого эталона доминировали в следующем эпидсезоне 2005-2006 гг., составляя 89 % вирусной популяции. В то же время в вирусной популяции выявлены 13 вирусов, которые взаимодействовали с гомологичной сывороткой к этому эталону <% титра Они были подобны штамму А/Висконсин/67/05, варианты которого выделялись в разных странах в 2005-2006rr.(WER, 2006). Таким образом, антигенный дрейф в молекуле НА у эпидемических штаммов шел в направлении НА А/Москва/10/99 - А/Фуцзянь/411/02 - (А/Калифорния/7/04. При этом появляющиеся в процессе эволюции новые штаммы сначала составляли небольшую часть популяции, а в последующих сезонах уже доминировали в вирусной популяции.

Вирусы гриппа В в России в 2003-2004 гг. не были изолированы. В сезоне 2004-2005гт. циркулировали варианта В/Шанхай/361/02 линии В/Ямагата/16/88 (Ямагатской линии), и только 3 штамма были подобны эталону В/Гонконг/330/01 линии В/Викгория/2/87 (Викторианской линии). В эпидсезоне 2005-2006 гг. доминировали представители Викторианской линии, подобные новому эталону В/Малайзия/2506/04. Этот факт свидетельствует о произошедшем значительном антигеном дрейфе в молекуле гемагглютинина у представителей этой линии. Широкая циркуляция вирусов гриппа, подобных штамму В/Малайзия/2506/04 в мире в сезоне 2005-2006 г. позволила экспертам ВОЗ рекомендовать этот штамм в состав вакцин на сезон 2006-2007 гг. (WER, 2006). Сравнительный анализ антигенных свойств вирусов гриппа В показал, что в период с 2004 г. по 2006 г. циркулировали вирусы гриппа обеих эволюционных линий, при этом произошла смена доминирующей линии.

Таким образом, широкий спектр вирусов гриппа и изменения антигенных свойств вирусов гриппа A(H3N2) и В привели к подъему заболеваемости гриппом в эпидсезонах 2003-2004, 20042005,2005-2006 гг.

Изучение взаимосвязи антигенной структуры и биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа, изолированных в период с 2002 по 2006 гг.

Следующим направлением наших исследований было изучение чувствительности разных

биологических систем к современным эпидемическим штаммам. Необходимость этого была вызвана уменьшением числа штаммов, изолированных на КЭ в конце XX века, и активным использованием для изоляции вирусов клетки культуры тканей MDCK (Бурцева Е.И. и др., 2001). Исследования, проведенные с 1999 по 2004 г., показали, что тропизм к традиционной системе культивирования вирусов гриппа - куриным эмбрионам (КЭ) - был разным для вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В.

Исследование эпидемических штаммов вирусов гриппа, изолированных в 2004-2006 гг., показало, что это свойство сохранялось у вирусов гриппа A(H1N1). Нам удалось как изолировать

из носоглоточных смывов от больных на КЭ (2 штамма из 15 смывов за 2 периода), так и адаптировать к КЭ 6 из 12 штаммов за 2 периода, изолированных на MDCK. Что касается штаммов вируса гриппа A(H3N2), то из 48 исследованных за 2 периода смывов не удалось изолировать на КЭ ни одного вируса, и только 1 штамм А/Ростов-на-Дону/1 /06(H3N2), изолированный на MDCK, удалось адаптировать к КЭ. Ситуация с вирусом гриппа В носит промежуточный характер: из 24 смывов нам удалось изолировать на КЭ только 1 штамм В/Москва'35/05, в то время, как из 14 исследованных штаммов, изолированных на MDCK в сезоне 2005-2006 гг. 7 штаммов удалось адаптировать к КЭ.

Интересно отметить, что у вирусов гриппа В Ямагатской линии способность к адаптации к КЭ была обнаружена у штаммов, подобных В/Сичуань/379/99 (20 из 30 исследованных), в то врем, как у вирусов гриппа В/Гонконг/330/01-подобных (Викторианской линии),способность не была обнаружена В наших исследованиях в 2005-2006 гг., когда циркулировали эпидемические штаммы В/Малайзия/2506/04-подобные, сильно отличавшиеся по антигенной структуре от В/Гонконга/330/01, удалось адаптировать 7 штаммов из 14. Эти данные свидетельствуют о том, что эволюционный процесс затронул не только антигенную область, но и рецепторную зону гемагглюткнина вирусов гриппа В Викторианской линии, что привело к увеличению тропизма к КЭ. Изменение тропизма вирусов к системам изоляции при изменении антигенных свойств гемагглютивина наблюдалось и ранее, например с вирусами гриппа A(H1N1), когда на смену вирусов, подобных А/Иоганесбург/82/96, хорошо изолировавшихся на КЭ, появились вирусы новой линии А/Пекин/262/95(НШ1), при этом наблюдалась уменьшение тропизма к КЭ и возрастание к MDCK (Бурцева Е.И. и др., 2001).

В связи с полученными данными возникает вопрос о существовании возможной связи тропизма эпидемических штаммов к КЭ и MDCK с их способностью активно взаимодействовать с эритроцитами животных, птиц и человека. Поэтому мы провели исследования чувствительности эритроцитов человека 0(1) и А(П) групп крови, морской свинки и кур к эпидемическим штаммам, циркулировавшим в период с 2002 по 2006 тт. Анализ результатов показал, что человеческие эритроциты имели большую, чем куриные эритроциты, чувствительность к эпидемическим пггаммам A(H3N2) и A(H1N1), изолированным на MDCK (таб.2). Не было выявлено существенных различий в чувствительности всех взятых для исследования эритроцитов к эпидемическим штаммам вируса гриппа В. Разница СГТ вирусов гриппа В с человеческими и куриными эритроцитами была меньше, чем у вирусов гриппа А, и составляла в разные эпвдсезоны от 3,1 до 0,1 Iog¡. Наименее чувствительными к куриным эритроцитам оказались эпидемические штаммы В/Гонконг/330/01-подобные, что коррелирует с данными по изоляции и адаптации вирусов на КЭ в эпидсезоне 2002-2003 гг., когда не было получено положительных результатов для этих вирусов по изоляции и адаптации к КЭ (Иванова В.Т. и др., 2004). В то же время эпидемические штаммы, подобные эталонам В/Шанхай/361/02 и В/Сичуань/379/99 Ямагатской линии удалось как изолировать, так и адаптировать к КЭ, при этом в РГА с куриными эритроцитами были выявлены такие же титры, как и при взаимодействии с эритроцитами человека (таб.2).

Таблица 2.

Биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа Л и В, изолированных на МОСК

в период с 2002 по 2006 г.

Тип вируса Эпид-сезон Эталонные штаммы N СГТ гемагглютинирующей активности вирусов с эритроцитами ( М±ш в log2) ДСГТ (эритроциты 0(1) гр.крови человека и кур) Термочувствительность вирусных белков

групп крови человека морской свинки курицы НА МА

0(1) А(П) Ис/М Ис/И

А(НШ1) 2002-2003 А/Н.Каледония/20/99 30 7,0±0,2 6,8±0,2 2,8±0,2 <1,0±0,1 6,0 19/30 6/16

2003-2004 Вирусы не были изолированы

2004-2005 А/Н.Каледония/20/99 3 7,7±0,3 6,7±0,3 4,8±0,2 <1,0±0,1 6,7 3/3 н/и

2005-2006 5 6,6±0,2 7,2±0,3 4,0±0,0 <1,0±0,2 5,6 5/5 н/и

А(НЗШ) 2002-2003 А/Москва/) 0/99 44 5,9±0,2 6,6±0,2 3,2±0,4 <1,0±0,5 4,9 24/26 1/26

2003-2004 А/Фуцзянь/411/02 А/Калифорния/7/04 18 5,6±0,4 5,9±0,5 3,3±0,5 <1,0±0,4 4,6 44/56 37/56

2004-2005 34 3,6±0,4 н/и н/и 1,1±0,4 2,5 7/8 н/и

2005-2006 33 5,1±0,3 4,8±0,3 3,4±0,2 1,1 ±0,4 4,0 24/33 н/и

В 2002-2003 В/Гонконг/330/01 (В)* 11 6,4±0,5 7,0±0,7 4,7±0,4 3,3±0,6 3,1 5/11 3/6

2003-2004 Вирусы не были изолированы

2004-2005 ВДИанхай/361/02 (Я)** 51 6,3±0,1 н/и н/и 5,2±0,3 1,1 21/26 н/и

2005-2006 В/Малайзия/2506/04 (В) 8 6,5±0,1 6,9±0,2 5,0±0,3 6,6±0,2 0,1 8/8 н/и

Примечание: Ыс/ N - соотношение числа штаммов со стабильным при нагревании поверхностным белком к общему числу исследованных штаммов; Д СГТ - разница средних геометрических титров гемагглютинирующей активности вирусов при взаимодействии с эритроцитами 0(1) группы крови человека и кур; * - эталонный штамм Викторианской линии; ** - эталонный штамм Ямагатской линии; н/и — исследования не проводились.

Таким образом, выявленный ранее феномен большего сродства к эритроцитам млекопитающих, чем птичьим, штаммов вируса гриппа А(НЗК2) продолжает регистрироваться у эпидемических штаммов, изолированных с 2002 по 2006 гг. Объяснение этому кроется в совокупности факторов, в том числе в наличии клеточных рецепторов с определенными связями 1Ч-ацетилнейраминовой кислоты с галактозой, в аминокислотном составе в рецепторной оболочке гемагглютинина.

Для определения степени гетерогенности вирусной популяции были проведены исследования чувствительности к нагреванию поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) вирусов гриппа А и В, циркулировавших в период с 2002 г. по 2006 г. (таб.2). Что касается термочувствительности гемагглютинина, то в популяции в основном преобладают вирусы с термостабильным гемагглютинином. При сравнении с данными, полученными по термочувствительности нейраминидазы, выявлено, что большинство вирусов обладали лабильной к нагреванию ЫА.

Исследование чувствительности гемагглютинина к протеолитической обработке ферментом бромелаином не выявило различий в чувствительности НА у вирусов гриппа В разных эволюционных линий несмотря на существенное различие структуры (Оеп Вапк, www.flu.lanl.gov) и антигенных свойств. НА обоих вирусов были одинаково чувствительны к воздействию используемых нами препаратов бромелаина, и более чувствительны, чем НА вирусов гриппа А(НШ1) и А(НЗ№). Обработка вирусов бромелаином приводит к получению субвирусных частиц, в состав которых входят М1 и ОТ, белки полимеразного комплекса, в небольшом количестве мембранный белок М2, а также заякоренные в мембране фрагменты НА и КА, которыми они фиксируются в вирионе. Столь сложный состав делает субвирусные частицы предметом отдельных исследований, например анализа вирионных белков и их взаимодействия рядом новых методов структурной биологии (ЭЫзЬкоу А.У. е1 а1.,1999; Ког(1уикоуа й а1„ 2004).

Целесообразность исследования чувствительности внутреннего М1-белка вирусов гриппа к обработке трипсином обусловлена тем, что в настоящее время получили широкое распространение и интродукция вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию. Возникшая ситуация приводит к необходимости усиленного изучения наиболее консервативных в процессе эволюции внутренних белков вируса гриппа - матриксного (М1) и нуклеопротеинового (ЫР), как наиболее перспективных при разработках тест систем для диагностики гриппа. В работе были использованы эталонные штаммы А(НШ1), А(НЗК'2) и В 1999-2002 гг. изоляции, а также реассортант А(НЗЫ2) А/Х-31 (Килбурн Э., 1969). Из очищенных вирусных частиц по методу Жирнова (2Ыгпоу О.Р., 1992) нами были получены М-белки вирусов гриппа А и В, которые были подвергнуты обработке ферментом трипсином, расщепляющим связи между аминокислотами аргинином и лизином. Последующий анализ полученных гидролизатов показал отличия хроматографических профилей у штаммов вирусов гриппа А с разным подтипом НА и вирусов гриппа В, что было подтверждено данными секвенирования генов М1-белка и свидетельствует о существовании эволюционных процессов в генах консервативного внутреннего белка М1 (www.flu.lanl.gov)

(рис.3). Этот метод может быть использован при выявления различий в структуре М1 белка, как альтернативный методу секвенирования.

Рис.3. Сравнение хроматографических профилей триптичсских гндролизатов М1-белков вирусов гриппа А и В.

Выявление комплексов вирусов гриппа и антител к ним с помощью различных методов

Для изучения спектра специфических антител, вырабатываемых в организме животных, иммунизированных отдельными препаратами вирусных белков, а также людей в ответ на гриппозную инфекцию и вакцинацию, нами был налажен и применен метод иммуноблота (ИБ). При исследовании в иммуноблоте моноклональных антител к ПА и внутреннему белку

вируса гриппа с подтипом гемагглютининаНЗ, входящих в диагностический набор ВОЗ, результат взаимодействия моноклональных антител с вирусными белками подтвердил наличие в тест-системе только анти-НА и анти-ИР антител. При изучении в ИБ кроличьей сыворотки, содержащей поликлональные антитела к внутреннему белку М1 вируса гриппа А/СССР/090/77(Н 1N1), мы впервые получили наглядное подтверждение наличия в сыворотке иммунизированного животного антител только к М-белку вируса гриппа (рис.4). Специфичность сыворотки ранее была определена в результате использования непрямых методов (ТФ РИА, ИФА) (Иванова В.Т. и др., 1983). Таким образом, полученные данные показывают возможность применения метода ИБ для определения специфичности иммунного ответа при иммунизации отдельными препаратами вирусных белков.

Для определения возможности изучения с помощью метода ИБ динамики прироста и спектрального состава антител, продуцируемых в организме человека, перенесшего гриппозную инфекцию, были отобраны парные сыворотки с выявленными в РТГА диагностическими приростами анти-НА, взятые в разные дни от начала заболевания и с разными вариантами прироста антител к НА во вторых сыворотках. При сопоставлении результатов, полученных в РТГА и в ИБ, установлено, что интенсивность окрашивания полос на мембране, соответствующих белку НА, коррелировала с величиной титров анти-НА в сыворотках переболевших гриппом (рис.5). При исследовании методом ИБ вторых сывороток видно, что в большинстве из них в процессе заболевания образовались антитела

ко всем трем мажорным пептидам вируса гриппа (НА, № и М). Таким образом, полученные данные указывают, что первыми в крови переболевших гриппом лиц появляются анти-НА, затем апти-ЫР. Антитела к внутреннему белку М1 у многих активно выявляются начиная с 7-го дня от ияиа заболевания.

М-

НА-NP-

М1 -

ЕЗ

; * Р £ v К

-М1

Рис.4. Исследование в иммуноблоте сыворотокживотных, Содержащих моно- и поли клепальные ант н тела к белкам НА, и М1

а - ИБ с мышиной монеклопал ьной сывороткой из диагностического набора ВОЗ, содержащей антитела к белкам НА и

6 - ИЕ5 с кроличьей сывороткой, приготовленной к внутреннему белку М1;

дорожки 1,4-5 - мембрана после переноса белков, окрашенная Соотаз51е В1ие, 2-3,6-7 - мембрана

после обработки сывсроткой, конъюгагом, окрашенная ДЛБ.

НА -NP -

1 UtWm (ib*

t s ¡4,,'

День болезни: Титр анти-НА в Р'ГГА:

12 3 4 2-й 10-й < I; 10 1:320

Kt

НА NP

М1

5 6 7 3 9 10 II 12 3-й 12-й 2-й 7-й

1:20 1:2560 1:160 1:1280

Рис.5. Исследование в иммуноблоте спектра специфических антител к вирусу гриппа A(H3N2) в парных сыворотках, полученных от больных е диагнозом Грипп в разные дин от начала заболевании.

a-fi - разные больные дорожки 1-2, 5-6, 9-10 - первая сыворотка; 3-4, 7-8, ) 1-12 - вторая сыворотка

Представлялось интересным определить методом ИБ спектр антител, выработку которых индуцируют современные инактивированные гриппозные вакцины Гриппол™ и Ваксигрип™. На первом этапе, методом РТГА были исследованы наборы сывороток, полученные от детей с разным анамнезом, иммунизированных вакцинами Гриппол™ (с соматической патологией) и Ваксигрип™ (дети, инфицированные микобактериями туберкулеза). Анализ этих сывороток в РТГА показал наличие иммунного ответа в виде прироста антител к НА вакцинных и эталонных штаммов вирусов гриппа А и В, антигенные варианты которых циркулировали в период 2003-2005 гг. Инактивированная полимер-субьединичная вакцина Гриппол™ обладала выраженной иммуногенной активностью к исследованным вирусам, входящим в состав вакцины штаммам А/Новая Каледония/20/99 (НШ1) и В/Гонконг/330/01 Викторианской линии, а также к другим актуальным штаммам, не входившим в нее' А/Кумамото/102/02 (аналог эталона А/Фуцзянь/411/02) и В/Сичуань/379/99 (Ямагатской линии). Защитные уровни антител сохранялись через 1 год после вакцинации. Инактивированная расщепленная вакцина Ваксигрип™ активно стимулировала выработку специфических антител на защитном уровне ко всем трем вакцинным и аналогичным штаммам (А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), А/Кумамото/102/02(НЗК2) и В/Сичуань/379/99) и не обладала выраженной иммуногенной активностью в отношении вируса В/Гонконг/330/01 Викторианской линии.

При исследовании методом ИБ сывороток вакцинированных Грипполом детей, на мембране выявлялась лишь одна полоса, соответствующая вирусному белку гемагглютинину, интенсивность которой увеличивалась через 1,5 месяца и уменьшалась через 1 год после вакцинации, что коррелировало с изменением титров антител к НА в РТГА (рис.6)

Титр анги-НА Н1 НЗ В/ГК В/Ш «РТГА <1:10 1:80 1:40 1:20

НА-

ДО

Н1 НЗ В/ГК В/Ш 1:320 1:320 1:640 1:320

через 1,5 мес ВАКЦИНАЦИЯ

Н1 НЗ В/ГК В/Ш 1:40 1:160_1-320 1:80

— те

-НА

через 1 год после вакцинации

Рис 6 Исследование динамики уровня антител к НА вирусов гриппа А и В в крови привитых субъединичной вакциной Гриппол™ в 2003 г.

Дорожки Н1 - анти-HAl (А/Н Каледония/20/99), Ю - анти-НАЗ (А/Кумамото/102/02), В/ГК - анти-НАВ (В/Гонконг/330/01), В/Ш - анги-НАВ (В/Шанхай/361/02)

Известно, что полимер-субъединичная вакцина Гриппол™ содержит только поверхностные белки В отличие от Гриппола, сплит-вакцина Ваксигрип™ имеет в своем

составе и поверхностные, и внутренние белки (НР и М). При исследовании в ИБ сывороток вакцинированных Наксигрнпом детей также были выявлены антитела к поверхностному белку гемаплгатннину, как в случае с Грипполом. Антител к внутренним белкам, входящим в состав вакцины Ваксигрип™, во взятых для исследования сыворотках, в том числе через 1 месяц после вакцинации, выявлено не было, 5то может быть объяснено как отсутствием иммуногенности этих белков в составе вакцин, так и недостаточным временем для выработки этих антител. Таким образом, исследование сывороток, полученных от вакцинированных детей в разные сроки до и после прививки, методами Р'ГГА и ИБ показало, что обе вакцины индуцируют вырабогку антител только к гема гипотонику вирусов гриппа А и В Кроме того, наблюдается динамика изменения концентрации антител к НА в крови вакцинированных, которая регистрируется в ИБ в виде изменения интенсивности полосы НА на мембране.

Определение комплексов антиген-антитело методом поляризационной микроскопии с помощью жидких кристаллов

Диагностика вирусных заболеваний является актуальной проблемой. К недостаткам существующих иммуноферментных и иммунофлуоресцентных методов относится их многостадийность, большие временные 'затраты, недостаточная специфичность и в некоторых случаях достаточно сложное аппаратурное оформление Нами был разработан методический подход, суть которого - получение многослойной структуры и ее анализа с помощью поляризационного микроскопа В качестве подложки использовалась пленка полианилина, на которую последовательно наносились иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела к определенному вирусу гриппа, затем вирусы. В качестве детектирующей системы использовали слой жидких кристаллов (ЖК). Анализ с помощью поляризационного микроскопа оптических свойств пленки ЖК, находящейся в контакте с тонким слоем вирусных частиц, позволил выявить специфические различия в свойствах поверхности слоя вирусов после их взаимодействия их с антителами Изучение специфических различии в свойствах поверхности вирусов при образовании комплексов антиген-антитело стало ВОЗМОЖНЫМ благодаря оптическим свойствам пленки ЖК, определяющимися локальным поверхностным натяжением на границе раздела ЖК / иммунные комплексы. В случае гомологичной системы в поляризационный микроскоп наблюдается прсципитационные полосы на границе образования иммунных комплексов (рис 7), похожие на прещшитационкьк полосы в агарозном геле СЗсЫЗсЗ С.С., Регена И.О., 1969).

Рис,7, Изображение структуры полиаинлни + антитела к вирусу гриппа В + вирус гриппа В + слой ЖК (гомологичная система), наблю/сас.мое и поляризационном микроскопе при скрещенных под углом 90° поляризаторе и анализаторе. Диаметр нося наблюдения 800 нм

В гетерогенной системе преципитационные полосы не были обнаружены. Применение ЖК сделало возможным впервые использовать в вирусологических исследованиях поляризационный микроскоп.

Независимо от нас Shiyanovskii S.V. et al. (2005) предложили использовать ЖК для детектирования вирусов и микробов. Однако в качестве визуализирующей среды авторы использовали не широко доступные ЖК, а специальный тип дефицитных лиотропных жидких кристаллов. Кроме того, результаты, полученные этими авторами, существенно отличаются от полученных нами - результат взаимодействия проявляется в виде бесформенного светового пятаа на темном фоне при достижении определенной плотности комплексов антиген-антитело на поверхности полупроводниковой подложки. Таким образом, впервые с помощью поляризационного микроскопа выявлены комплексы вирусов гриппа и антител к ним, не обнаруживаемые с помощью ранее применявшихся оптических методов. Обнаруженное явление может быть использовано в вирусологических исследованиях для определения вирусов гриппа и изучении изменений в их белках (Патент РФ, №2290444).

Подводя итог результатам изучения особенностей современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, следует отметить следующее. Анализ полученных данных и сопоставление их с литературными показывает, что эпидемический процесс гриппа в России в период с 2003 по 2006 гг. характеризовался минимальным за последние 10 лет уровнем заболеваемости гриппом в России, и был обусловлен циркуляцией и социркуляцией вирусов гриппа A(H3N2), В и А(НШ1), родственных референс-штаммам, аналоги которых циркулировали в мире в рассматриваемый период. Наши исследования показали, что эволюционные изменения происходили в структуре вирионных белков и приводили к изменению не только антигенных, но и других биологических свойств. Комплексное изучение иммуногенных свойств современных штаммов вирусов гриппа различными методами (РТГА и иммуноблот), выявило способность этих штаммов индуцировать ответ не только к наружным белкам (НА), но и к внутренним (NP и М) у переболевших гриппозной инфекцией и к наружным белкам (НА) у привитых против гриппа. Для обнаружения комплексов антиген-антитело впервые предложен новый метод на основе поляризационной микроскопии, который позволяет визуализировать комплексы антиген-антитела и может быть применен в диагностике не только гриппа, но и других инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Анализ результатов вирусологических и серологических исследований показал, что этиологическая структура подъемов заболеваемости гриппом в России в период с 2003 по 2006 год была представлена циркуляцией вирусов гриппа A(H3N2) в 2003-2004 гг. и социркуляцией вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В в 2004-2006 гг.; диагностический прирост титров антител к этим штаммам в парных сыворотках переболевших в периоде варьировал в диапазонах: 4-24%, 10-33% и 20-36% соответственно. Уровень популяционного

иммунитета изменялся в течение периода 2003-2006 гг., при этом увеличение уровня антител в конце эпидсезона было наиболее выражено к вирусам гриппа В.

2. В эпидемический период 2003-2006гт. антигенный дрейф поверхностных белков эпидемических штаммов имел свои особенности для вирусов гриппа А и В. Среди популяции вирусов А(НШ1) циркулировали антигенные варианты А/Новая Каледония/20/99; для вирусов гриппа А(НЗК2) был характерен последовательный дрейф в направлении НА эталонных штаммов А/Фувдянь/411/02 - А/Калифорния/7/04, причем представители нового эталона начинали циркулировать в предыдущем сезоне; для вирусов гриппа В - циркуляция штаммов с поверхностными белками разных эволюционных линий и появление в эпидемическом сезоне 2005-2006 гг. штаммов, подобных новому эталону В/Малайзия/250б/04 эволюционной линии В/Виктория/2/87-подобных.

3. Установлено, что наиболее чувствительной системой для изоляции вирусов гриппа остается культура ткани МОСК.: вирусы гриппа А(НЗК2) продолжают утрачивать тропизм к КЭ, а современные штаммы вирусов гриппа А(НШ1) и В в значительной мере сохраняют тропизм к системе изоляции КЭ, что дает возможность выделять часть вирусов на КЭ и адаптировать их к КЭ после выделения на клетках культуры тканей МБСК. Анализ взаимодействия эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, изолированных в период 2002-2006 гт. с эритроцитами человека, морской свинки и кур выявил наибольшие отличия у вирусов гриппа А, и незначительные отличия или их отсутствие у вирусов гриппа В.

4. При изучении чувствительности к различным факторам современных эпидемических штаммов, изолированных в период с 2002 г. по 2006 г., установлена гетерогенность популяций вирусов гриппа А и В по термочувствительности поверхностных белков НА и КА. В основном преобладали штаммы со стабильным гемагглютинином и лабильной нейраминидазой.

5. Исследование воздействия протеолитических ферментов на вирусные белки НА и М1 впервые показали отличия хроматографических профилей триптических гидролизатов М1-белков разных вирусов гриппа А(Н1Ы1), А(НЗК2) и В; установлена одинаково высокая чувствительность НА вирусов гриппа В разных эволюционных линий к обработке бромелиином по сравнению с НА вирусов гриппа А.

6. Впервые с помощью метода иммуноблота в сыворотках лиц, перенесших гриппозную инфекцию, выявлено наличие антител не только к поверхностным белкам вируса гриппа (НА), но и к внутренним (М и №>), которые определялись в зависимости от времени, прошедшего от начала заболевания. Этот метод также позволяет получать наглядное подтверждение специфичности иммунного ответа, в том числе в сыворотках животных, иммунизированных отдельными вирусными белками.

7. Впервые метод иммуноблота был использован для анализа спектра вирусспецифических антител в сыворотках лиц, привитых полимер-субъединичной инактивированной вакциной Гриппол™ и расщепленной инактивированной вакциной Ваксигрип™, при этом выявлено наличие антител к НА вакцинных штаммов в виде полос на

мембране, интенсивность окраски которых варьировала в зависимости от периода наблюдения и коррелировала с титром антител к НА в РТГА.

8. Разработан новый методический подход для идентификации вирусов гриппа и вирусспецифических антител к ним с помощью поляризационного микроскопа с использойанием современных материалов - полианилина и жидких кристаллов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.Т. Иванова, Е.И. Бурцева, А.Н. Слепушкин, М.Ю. Щелканов, Ю.В. Загорская, Е.С. Шевченко, P.O. Ракутина (Матюшина), Е.Г. Черкасов, Е.И. Исаева, Т.А. Оскерко, Е.Л. Феодоритова, Д.В. Маслов, Р.З. Гатич. Характеристика эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших в эпидемическом сезоне 2003-2004 гг. в России.// Вопросы вирусологии, 2006, №1, с.19-32.

2. В.Т. Иванова, P.O. Ракутина (Матюшина), JI.B. Кордюкова, A.A. Маныкин, Н.В. Федорова, А.Л.Ксенофонтов, А. Н. Слепушкин. Получение и исследование внутренних белков эпидемических штаммов вируса гриппа.// Вопр. вирусологии, 2006, №2, с.22-26.

3. В.Ф. Иванов, В.Т. Иванова, М.Г. Томилин, P.O. Ракутина (Матюшина), A.A. Исакова, М.Ю. Яблоков. Оптический метод диагностики вирусов гриппа на основе нематических жидких кристаллов.// Оптический журнал, том 73, №8, август 2006, с.90-92.

4. В.Т. Иванова, P.O. Ракутина (Матюшина), А.Н. Слепушкин, Е.И. Бурцева, Т.А. Оскерко, Е.С. Шевченко, Н.В. Федорова, JI.B. Кордюкова, C.B. Трушакова, Е.Г. Черкасов, JI.H. Меркулова, E.JI. Феодоритова. Свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в эпидемическом сезоне 2004-2005 гг. в России.// Вопросы вирусологии, 2006, №6, с.27-30.

5. В.Ф. Иванов, В.Т. Иванова, М.Г. Томилин, P.O. Ракутина (Матюшина), М.Ю. Яблоков. Способ определения вирусов гриппа. Патент РФ № 2290444,2006.

6. Zagorskaya Yu.V., Ivanova V.T, Bourtseva E.I, Kordyukova L.V, Oskerko T.A., Rakutina (Matyushina) R.O., Slepushkin A.N. Influenza viruses: properties and sérodiagnostics.// In poster presentations of VI International Symposium on respiratory viral infections, 18-21 March 2004, Sanibel Harbour Resort& Spa, Fort Myers, USA, p. 19.

7. Ivanova V.T., Burtseva E.I., Zagorskaya Yu.V., Oskerko T.A., Shevchenko E.S., Rakutina (Matyushina) R.O., Kordyukova L.V., Feodoritova E.L., Slepushkin A.N. Influenza viruses in Russia during the 2003-2004 epidemic seasons.// In Abstract Book " The First International Conference on Influenza Vaccines for the World", 24-26 May 2004, Lisbon, Portugal.

8. Иванова B.T., Бурцева Е.И., Слепушкин A.H., Кордюкова JI.B., Федорова Н.В., Черкасов Е.Г., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Шевченко Е.С., Машкова С.А., Феодоритова Е.Л., Ракутина (Матюшина) P.O. Изменчивость вирусов гриппа, циркулировавших в России в последние годы.//Тезисы на Международную конференцию «Актуальные вирусные инфекции- теоретические и практические аспекты», 2-5 ноября 2004г., С.-Петербург, с.25.

9. Слепушкин А.Н., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Беляев А.Л, Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Феодоритова Е.Л., Шевченко Е.С., Ракутина (Матюшина) P.O., Львов Д.К. Результаты

исследований Центра экологии и эпидемиологии гриппа в 1994-2004 гг.// Тезисы на Международную конференцию «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты», 2-5 ноября 2004г., Санкт-Петербург, с. 19.

10. Ivanova V.T., Burtseva E.I., Slepushkin А. N.. Kordyukova L.V., Fedorova N.V, Oskerko T. A., Zagorskaya J. V., Rakutina (Matyushina) R.O., Shevchenko E.S. Evolution of human influenza viruses at the boundary of XX and XXI century in Russia // In Abstract book of 5th Louis Pasteur Conference on Infectious Diseases, 17-20 November 2004, Institute Pasteur, Paris, France, p.22.

11. Загорская Ю.В., Иванова B.T., Щелканов М.Ю., Бурцева Е.И., Черкасов Е.Г., Феодоритова Е.Л., Ракутина (Матюшина) P.O., Шевченко Е.С., Слепушкин А.Н. Циркуляция вирусов гриппа в России в эпидсезон 2003-2004 гг.// Тезисы Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», 1-2 декабря 2004 г., Санкт-Петербург, с.98-99.

12. Ю.В.Загорская, В.Т.Иванова, Е.И.Бурцева, Т.А.Оскерко, И.А.Ходякова, Е.Л.Мельник, P.O. Ракутина (Матюшина), А.Н.Слепушкин. Значение серологического обследования больных гриппом и острыми респираторными инфекциями.// Научные труды Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана «Факторы риска и здоровье населения в регионах России». Выпуск 13. Липецк, 2004, с.390-394.

13. В.Т. Иванова, P.O. Ракутина (Матюшина), А.Н.Слепушкин, Е.И.Бурцева, Т.А. Оскерко, Л.В. Кордюкова, Н.В. Федорова, Е.Г. Черкасов, С.В. Трушакова. Современные методы исследования эпидемических штаммов вирусов гриппа // Труды Всероссийской научной конференции < Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций > с.145-146.

14. V.T. Ivanova, R.O. Racutina (Matyushina), E.I. Bourtseva, L.V. Kordyukova, V.F. Ivanov, N.V. Fedorova, T.A. Oskerco and A N. Slepushkin. Influenza viruses in Russia in epidemic season 2004-2005.// Advance method of virus investigations.3rd Orthomyxovirus Research Conference July 28th-31 st 2005, Queens' College, Cambridge UK Abstract booklet, abstract 41.

15. V. Ivanov, M. Yablokov, O. Gribkova, A. Isakova, A. Vannikov, V.Ivanova, M. Tomilin, R. Racutina (Matyushina). Indused optical activity of polyaniline interpolymer complexes and their use in virology and medicine.// European polymer congress 2005, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia, june 27-july 1,2005. P2.2-7. Ref 4119, p.133.

16. P.O. Ракутина (Матюшина), С.В. Трушакова, В.Т. Иванова, А.А. Тарасова, О.О. Магаршак, В.Б. Полищук, М.П. Костинов, А.Н. Слепушкин. Формирование противогриппозного иммунитета вакцинами Гриппол и Ваксигрип у детей с вторичными иммунодефицитами.// Материалы Четвертого конгресса детских инфекционистов <Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей>, Москва, 14-16 декабря, 2005 г.

17. Матюшина P.O., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А., Меркулова Л.Н., Трушакова С.В., Загорская Ю.В., Курочкина Я.Е., Слепушкин А.Н. Биологические свойства

эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, изолированных в России в сезоне 20052006 гг.// Тезисы на Междунар. конференции в Ульяновске в июле 2006 г., с.245-248.

18. P.O. Матюшина, В.Т. Иванова, А.Н. Слепушкин. Исследование антител в сыворотках животных и человека при гриппозной инфекции и вакцинации методом иммуноблота.// Тезисы на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21-22 ноября 2006 г., с. 63.

19. A.A. Тарасова, М.П. Костинов, Т.В. Скочилова, P.O. Ракутина (Матюшина). Иммунологическая эффективность вакцины "Гриппол" у детей с сахарным диабетом 1 типа в зависимости от возраста.// Материалы V Российского конгресса детских инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей". Приложение научно-практического журнала Ассоциации педиатров-инфекционистов "Детские инфекции". 4-6 декабря 2006, с. 168.

20. V.T. Ivanova, R.O. Racutina (Matyushina), А N. Slepushkin, E.I. Burtseva, L.V. Kolobuhina, T.A. Oskerko, J.V. Zagorskaya, S.V. Trushakova. Peculiarity of human influenza viruses at the beginning of XXI century in Russia.// Euroconferences <Infections and digestive tract diseases>. Institute Pasteur, Paris, Desember 7-8,2006.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям - доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику Ивановой Валерии Тимофеевне и доктору медицинских наук, Заслуженному деятелю науки РФ, профессору Слепушкину Анатолию Николаевичу за научное руководство.

Основные результаты получены в соавторстве с д.м.н. Е.И. Бурцевой, с.н.с. Т.А Оскерко, д.б.н. A.A. Маныкиным, (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), к.б.н Н.В. Федоровой (Институт физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова), к.х.н. В.Ф. Ивановым (ГУ НИИ физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН), A.A. Тарасовой, О.О. Магаршак (ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН). Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам.

За консультативную помощь автор выражает глубокую благодарность д.б.н. A.A. Шилову и к.б.н. И.Т. Федякиной (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

Подписано в печать 16.04.2007 г. Исполнено 17.04.2007 г. Печать трафаретная.

Заказ № 372 Тираж: 120 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru