Эволюционная изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа B, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг.

Прокопец, Александра Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эволюционная изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа B, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг.
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционная изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа B, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг."

На правах рукописи

ПРОКОПЕЦ Александра Владимировна

ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕМАГГЛЮТИКИНА ВИРУСОВ ГРИППА В, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД С 2004 ПО 2012 ГГ.

03.02.02. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ОКТ 2013

005535544

Санкт-Петербург - 2013

005535544

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения

Российской Федерации

Научный руководитель:

Лобова Тамара Геннадиевна, кандидат медицинских наук Официальные оппоненты:

Ленёва Ирина Анатольевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток» им. И.И. Мечникова РАМН, зав. лаб. экспериментальной вирусологии

Киселева Ирина Васильевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии им. A.A. Смородинцева

Ведущая организация: «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучию человека Российской Федерации

Защита диссертации состоится «25» ноября 2013 года в_часов на заседании

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.131.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16)

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Автореферат разослан « » октября 2013 г.

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) продолжают занимать первое место в структуре всех инфекционных заболеваний человека. Ежегодный экономический ущерб от гриппа в России, в среднем, составляет примерно 75-86% от экономических потерь, наносимых инфекционными заболеваниями. Масштабы гриппозных эпидемий выдвигают необходимость борьбы с этой инфекцией в число наиболее актуальных проблем современной медицины [Карпова Л.С. с соавт., 2010; Киселев О.И. с соавт., 2010; Львов Д.К. с соавт., 2010; Слёпушкин А.Н., 2003;Pariani et al., 2012; www.52.rospotrebnadzor.ru;www.who.intl.

Эпидемический процесс при гриппе, начиная с 1977 года характеризуется одновременной циркуляцией вирусов гриппа А двух антигенных подтипов и вируса гриппа типа В. Для вирусов гриппа В двух последних десятилетий характерно появление в циркуляции представителей антигенно отличных эволюционных ветвей - Викторианской (эталон В/Виктория/2/87) и Ямагатской (эталон В/Ямагата/16/88) [Иванова В.Т., 1998; Иванова В.Т. с соавт., 2003; Матюшина P.O., 2007; Kanegae et al., 1990; Che et al., 2003; Hay et al., 2001; McCullers et al., 2004; Shih et al., 2005].

Дивергентный характер эволюции вирусов гриппа В отразился на интенсивности циркуляции этого возбудителя среди населения: если до 1988 года эпидемии гриппа В регистрировались примерно один раз в 3-4 года, то в настоящее время они возникают практически ежегодно [Иванова В.Т., 1998; Литвинова О.М. с соавт., 2001; Коновалова Н.И., 2009; Belshe, 2010; Hemphill et al., 2003].

Удельный вес вирусов гриппа В в этиологической структуре гриппозных эпидемий в различных странах довольно высок [Иванова В.Т. с соавт., 2009; Львов Д.К. с соавт., 2010; Соминина А.А. с соавт., 2012; Belshe, 2010; Camillioni et al., 2010; Chan et al., 2004; Dapat et al., 2009; Goni et al., 2007; Jian et al., 2008], a заболевания, вызываемые этими возбудителями, могут протекать тяжело не только у детей, но и у взрослых, сопровождаясь

развитием большого числа осложнений [Афанасьева О.И., 2009; Ambrose & Levin, 2012; Hite et al., 2007; Liu et al., 2012; Peltola et al., 2003; Seale et al., 2009; Zaraket et al., 2009].

Причиной постоянной циркуляции вирусов гриппа среди населения являются непрерывные антигенные изменения этих возбудителей преимущественно в молекуле гемагглютинина (НА). Вирусы гриппа В не имеют природного резервуара, поэтому не способны к реассортации с вирусами гриппа животных и не вызывают пандемий, а их успешное выживание происходит за счет смены представителей 2-х эволюционных ветвей и возникновения реассортантов между ними [Lindstrom et al., 1999; Nerome et al., 2002; Ivshina et al., 2004; McCullers et al., 2004; Chi et al., 2005; Shih et al., 2005].

Выраженная изменчивость вирусов гриппа затрудняет создание эффективных лечебных, профилактических и диагностических средств. Этим обусловлена важность непрерывного этиологического мониторинга, изучения процессов эволюционной изменчивости возбудителей гриппозной инфекции, проводимых на базе Национальных центров по гриппу [Соминина А.А. с соавт., 2012; Ambrose & Levin, 2012; Belshe, 2010].

В связи с вышеизложенным изучение особенностей циркуляции вирусов гриппа В, их антигенных и молекулярно - биологических свойств является актуальным и имеет не только теоретический интерес, но и важно с практической точки зрения.

Цель исследования: изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа В, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг., и выявление направления изменчивости у представителей 2-х эволюционных ветвей этого возбудителя. Задачи исследования.

1. Определить удельный вес вирусов гриппа В в структуре вирусной популяции в эпидемические по гриппу сезоны в России в период с 2004-2012 гг.

2. Изучить антигенные свойства гемагтлютинина российских вирусов гриппа В 2004-2012 гг. выделения, определить их эволюционные связи с эталонными и эпидемическими штаммами, циркулировавшими в мире в разные годы.

3. Определить основные аминокислотные позиции в молекуле гемагглютинина, изменения в которых повлияли на антигенные свойства современных российских вирусов гриппа В с помощью серологических и молекулярно-генетических методов.

4. Выявить направленность антигенного дрейфа вирусов гриппа В Викторианской и Ямагатской разновидностей, циркулировавших в России в период с 2004-2012 гг.

5. Адаптировать метод антигенной картографии для анализа эволюционной изменчивости современных российских изолятов вируса гриппа В с использованием крысиных сывороток.

Научная новизна работы.

Впервые проанализировано свыше 900 штаммов вируса гриппа В, изолированных на территории России в 49 опорных базах Национального центра по гриппу на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России в период с 2004 по 2012 гг. Продемонстрирована смена представителей эволюционных ветвей за 8 эпидемических сезонов. Определено преобладание вирусов гриппа В Викторианской разновидности в период с 2004 по 2012 годы с достоверностью Р=0,95. Определены направления изменчивости представителей 2-х эволюционных ветвей этого возбудителя.

Зарегистрирована циркуляция на территории России реассортантного вируса гриппа В - штамма В/С.Петербург/14/06, содержащего НА Викторианской и ЫА Ямагатской ветвей, а также реассортантов между филогенеическими группами «Малайзия/2506» и «Брисбен/60» внутри одной (Викторианской) ветви - штаммов В/С.Петербург/27/12 и

В/С. Петербург/44/12.

Впервые в России был применен метод антигенной картографии для анализа эволюционной изменчивости современных вирусов гриппа В

Ямагатской и Викторианской групп, показана возможность использования крысиных сывороток.

Практическая значимость работы.

В период с 2004 по 2012 гг. производилась изоляция и идентификация вирусов гриппа, па основании которых была определена этиология эпидемий гриппа в России. В результате проведенных исследований проведено типирование свыше 900 вирусов гриппа В. Изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств этих изолятов позволило установить основные направления изменчивости представителей двух эволюционных ветвей, что важно для заблаговременного обновления штаммового состава гриппозных диагностикумов и вакцин.

Установлено несоответствие вакцинных штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения, подготовленных на основе референс-вирусов В/Шанхай/361/02, В/Малайзия/2506/04, В/Флорида/4/06 циркулировавшим изолятам в 2005-2006, 2007-2008, 2008-2009 эпидемических сезонах

[www.hpa.org.uk/web/HP Aweb&HPAwebStandard/HPAweb_C/l 195733812968# north0506],

В рамках сотрудничества со Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) 125 вирусов гриппа В за восьмилетний период передано в референс-лаборатории (CDC&P, Атланта, Джорджия, США и NIMR, Лондон, Англия) с целью международного мониторинга за гриппом, два из которых -В/Челябинск/306/07 и В/Новосибирск/2/12 были выбраны ВОЗ в качестве репрезентативных штаммов [MRC., National Institute for Medical Research., WHO Influenza Centre., 2007. - h ttp:// www. ni mr. mrc. а с. uk/wi c/rep ort/].

На основании проведенных исследований 6 изолятов (В/Хабаровск/14/05, В/Астрахань/1/07, В/СПб/40/09 - вирусы Викторианской линии, В/Хабаровск/36/05, В/Флорида/4/06, В/Висконсин/1/10 - вирусы Ямагатской линии) были выбраны и использованы в качестве диагностических штаммов в коммерческих наборах, изготовляемых ООО «ППДП».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На территории России в период с 2004 по 2012 годы ежегодно циркулировали вирусы гриппа В одновременно с вирусами гриппа А, удельный вес вирусов гриппа В в составе вирусной популяции колебался от 8 до 50,3% и составил, в среднем, 1/3 (939 штаммов) от общего количества (2817 штаммов) выделенных вирусов гриппа.

2. За исследуемый период наблюдалась как поочередная, так и одновременная циркуляция в течение одного эпидемического сезона представителей двух эволюционных ветвей вируса гриппа В -Ямагатской и Викторианской. Выявлена более активная циркуляция на территории России вирусов гриппа В Викторианской линии.

3. Определены аминокислотные позиции в НА1, изменения в которых повлияли на антигенные характеристики вирусов. Аминокислотные замены затронули все известные для вирусов гриппа В антигенные сайты: 120-петля, 150-петля, 160-петляи 190-спираль.

4. Для вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской линий выявлены антигенные сайты, наиболее подверженные позитивной селекции, это 150-петля и 160-петля у Ямагатской группы, 120-петля и 160-петля у Викторианской группы.

5. Использованный для анализа современных российских вирусов гриппа В модифицированный метод антигенной картографии позволяет наглядно оценить эволюционные тенденции в изменчивости большого количества вирусных изолятов.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном выполнении работы по типированию и изучению антигенных свойств вирусов, анализу первичных последовательностей молекулы НА, построению антигенных карт. Секвенирование штаммов и филогенетический анализ выполнены сотрудниками лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа. Все материалы, представленные в диссертационной работе, обобщены и проанализированы автором.

Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ФБГУ «НИИ гриппа» МЗ РФ и были поддержаны международным грантом МНТЦ № 3070 «Дальнейшее усовершенствование надзора за гриппом в России. Вклад в глобальную подготовку к пандемии гриппа».

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были представлены на Седьмой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» СПб., 2004 г.; Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» СПб., 2004 г.; конференции "Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook" СПб., 2007.; «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» СПб., 2008 г.; Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням СПб., 2009 г.; Options for the control of influenza VII, Hong Kong, China, 2010 г.; 2-nd International Influenza Meeting, Munster, Germany, 2010 г.; на X научно-практической конференции МЧС РФ «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций. Оценка рисков возникновения чрезвычайных ситуаций» Москва, 2010 г.; Всероссийской международной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» СПб, 2010 г.; Всероссийской научной конференции молодых ученых, посвященной 120-летию НИИЭМ СЗО РАМН, СПб., 2010 г.. Результаты исследований были представлены Комиссии по вакцинным и диагностическим штаммам вируса гриппа и использованы в производстве вакцин и диагностических препаратов МЗ РФ.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 11 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 156 источников. Из них 42 на русском и 114 на иностранных языках. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусу. В работе использовались референс-штаммы вируса гриппа B¡ из Международных центров по гриппу ВОЗ (CDC&P, Атланта, США и NIMR, Лондон, Англия), а также эпидемические изоляты, выделенные в ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ и базовых вирусологических лабораториях в период с 2004 по 2012 гг.

Сыворотки. При идентификации эпидемических изолятов использовались гипериммунные диагностические сыворотки крупного рогатого скота или овец, присылаемые ежегодно референс-центром ВОЗ (CDC, Атланта, США). Хорьковые антисыворотки к вирусам гриппа В предоставлены профессором Дж. МакКоли (Европейский Сотрудничающий Центр по гриппу ВОЗ — National Institute for Medical Research, Лондон, Великобритания).

Для антигенного анализа были использованы гипериммунные крысиные сыворотки, полученные к эпидемическим и референс-штаммам вируса гриппа В разных лет выделения.

Системы выделения и накопления вируса гриппа. Изоляцию и накопление вируссодержащей жидкости проводили на клеточной культуре MDCK, полученной из референс-центра ВОЗ (CDC, Атланта, США) и на 10-дневных куриных эмбрионах, поставляемых ООО «Племрепродуктор».

Животные. Для получения диагностических сывороток были использованы белые беспородные крысы, весом 300-400 г. Животные предоставлены питомником АМН РФ «Рапполово».

Методика изоляции и идентификации вируса гриппа. Выделение и идентификацию вируса гриппа проводили согласно рекомендациям ВОЗ [WHO manual on influenza diagnosis and surveillance 2011] и методическим рекомендациям «Выделение вирусов в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» [СПб, 2006 г.]. Идентификацию вируса проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором диагностических сывороток ВОЗ.

1 Vi

Антигенный анализ. Антигенный анализ проводили в РТГА с использованием гипериммунных крысиных сывороток, полученных к эпидемическим и референс-штаммам вируса гриппа В разных лет выделения. Реакцию ставили по методике, рекомендованной ВОЗ и методическим рекомендациям «Выделение вирусов в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» [СПб, 2006 г.].

Антигенную картографию выполняли по методу, приведенному в работе [Smith DJ. et al., 2004] с использованием программного обеспечения (h t t p: //a ti t i и с n i с-с a rt о й ra phу. о г иЛ.

Молекулярно-биологический анализ. Определение нуклеотидного и аминокислотного состава гемагглютинина проводили в институте медицинских исследований (NIMR, Лондон, Англия) и в лаборатории генной инженерии ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ. Амплификация фрагментов кДНК с геномной РНК вирусов гриппа В проводили методом ОТ-ПЦР с помощью наборов и реагентов производства ФГУ «ЦНИИ эпидемиологии», Роспотребнадзора РФ, согласно рекомендациям фирмы производителя. Секвенирования последовательности выделенных фрагментов проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100-Avant («Applied Biosystems», США) с использованием наборов «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit», согласно протоколу фирмы производителя.

Филогенетический анализ. Филогенетический анализ осуществляли с использованием программы Vector NTI 8,0 (Invitrogen) и MEGA 5 (PSU, США) методом «ближайших соседей» или Kimura. Для построения филогенетического дерева использовали фрагменты нуклеотидных последовательностей гена НА референс-штаммов вирусов гриппа В, депонированных в международной базе данных GenBank rwww.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эпидемиологические особенности и антигенные свойства вирусов гриппа В, выделенных в период с 2004 по 2012 гг.

В период с 2004 по 2012 годы на территории России была зарегистрирована ежегодная совместная циркуляция вирусов гриппа В с вирусами гриппа А двух подтипов (рис.1). Доля возбудителей гриппа В структуре вирусной популяции колебалась от 8,0 до 50,3% (табл.1).

В одном эпидемическом сезоне представители двух эволюционных линий вируса гриппа В - Ямагатской и Викторианской - сменяли друг друга или социркулировали совместно. Показано, что в исследуемый период среди вирусов гриппа В доминировали вирусы гриппа В Викторианской линии - их удельный вес составил 64,4% от общего количества выделенных вирусов гриппа В.

Были определены основные направления эволюционной изменчивости вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской ветвей 2004-2012 годов выделения. Антигенный дрейф российских изолятов в основном совпадал с антигенным дрейфом в мире и проходил в направлениях: В/Виктория/2/87—>В/Шандонг/7/97, В/Гонконг/330/01 В/Малайзия/2506/04 —» В/Брисбен/60/08 для Викторианских штаммов:

В/Сычуань/379/99 ->В/Шанхай/361/02, В/Джангсу/10/03 -> В/Флорида/4/06 —>В/Бангладеш/3333/07, В/Висконсин/1/10 для Ямагатских штаммов.

Существенные антигенные изменения в Викторианской группе на эволюционных отрезках (В/Шандонг/7/97, В/Гонконг/330/01 -В/Малайзия/2506/04) и (В/Малайзия/2506/04 - В/Брисбен/60/08) вызвали широкое распространение В/Малайзия/2506/04-подобных штаммов в эпидемические сезоны 2005-2006 и 2006-2007 годов (33,6% и 18,45% соответственно) и В/Брисбен/60/08-подобных изолятов с 2008 по 2012 годы (25,6%; 8,0%; 43,8%; 17,7% соответственно).

Появление вирусов гриппа В Ямагатской группы в 2004-2005 и 20072008 годах сопровождалось обширными эпидемиями (50,3% и 43,8% соответственно).

ТОО

боо

500

■х 400 t

g 100

3 в

/ ^ / /// * /> / > > ^ ✓

I ВГВ Ямагатской разновидности • ВГВ Викторианской разновидности I Вирусы гриппа Л

Рисунок I. Структура популяции вирусов гриппа, выделенных в России в период с 2004 по 2012 гг.

В связи с одновременной или поочередной циркуляцией вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской линий в последнее десятилетие, прогнозирование появления вирусов той или иной антигенной разновидности в следующем эпидемическом сезоне является сложной, практически не выполнимой задачей. На протяжении 2004-2012 годов для гриппа В в трех случаях из восьми наблюдалось несоответствие вакцинного штамма циркулирующим эпидемическим изолятам (эпидемические сезоны 2005-2006, 2007-2008, 2008-2009 гг.) (табл.1). Таким образом, возникает необходимость введения в состав сезонной гриппозной вакцины представителей двух эволюционных линий вируса гриппа В.

Установлено для современных российских вирусов гриппа В, что система выделения и накопления для последующей иммунизации оказывает влияние на результаты антигенного анализа в РТГА. Были установлены причины различий в антигенных свойствах у изученных вирусов, изолированных в различных системах выделения. Обнаружено, что адаптация вирусов гриппа В к куриным эмбрионам привела к потере сайта глнкознлирования (N-x-T) в позициях 196-198 у Ямагатских изолятов и в позициях 197-199 у Викторианских штаммов в молекуле HAI. У вирусов гриппа В Ямагатской группы, изолированных на куриных эмбрионах.

Таблица 1. Циркуляция вирусов гриппа В в России в период с 2004 по 2012 гг. (по данным Национального центра по гриппу на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России).

Эпидемический сезон, гг. Период взятия материала, месяц Количество выделенных штаммов вируса гриппа В % от общего количества выделеины х вирусов гриппа Антигенная принадлежность выделенных штаммов Вакцинный штамм вируса гриппа В, на основе следующих вирусов

2004-2005 декабрь -апрель 100 50,3% В/Шанхай/361/02-подобные (46,4%) (Ямагатская линия) В/Гонконг/330/01-подобные (53,6%) (Викторианская линия) В/Шанхай/361/02-подобные (Ямагатская линия)

2005-2006 январь -май 109 33,6 % В/Малайзия/2506/04-подобпые (100%) (Внкторианская линия) В/Шанхан/361/02-подобные (Ямагатская линия)

2006-2007 январь — май 95 18,45% В/Малайзия/2506/04-подобные (94,7%) (Викторианская линия) В/Флорида/07/04-подобные (5,3%) (Ямагатская линия) В/Малайзия/2506/04-подобные (Викторианская линия)

2007-2008 январь — май 278 40,6% В/Флорида/04/06-подобные (99,3 %) (Ямагатская линия) В/МалаГпня/2506/04-подобные (0,7%) (Викторианская линия) В/Малайзия/2506/04-подобные (Внкторианская линия)

2008-2009 январь — май 145 25,6% В/Брисбен/60/08-подобные (100%) (Викторианская линия) В/Флорида/04/06-подобные (Ямагатская линия)

2009-2010 февраль -май 36 8,0% В/Брисбен/60/08-подобные (100%) (Викторианская линия) В/Брисбен/60/08-подобные (Викторианская линия)

2010-2011 декабрь -апрель 136 43,8% В/Брисбен/60/08-подобные (100%) (Викторианская линия) В/Брисбен/60/08-подобные (Викторианская линия)

2011-2012 январь -май 40 17,7% В/Брисбен/60/08-подобные (Викторианская линия) (80%) В/Висконсин/1/10-подобные (20%) (Ямагатская линия) В/Брисбен/60/08-подобные (Викторианская линия)

Всего 939 64,4%-Викторианская линия 35,6%-Ямагатская линия

были зафиксированы аминокислотные замены N1960 и N1968, у Викторианских изолятов - аминокислотные замены N1970 и Т1991. Все аминокислотные замены произошли в области рецептор-связывающего сайта.

Современные подходы к проведению и представлению результатов антигенного анализа.

Изучена возможность применения метода антигенной картографии для анализа эволюционной изменчивости современных российских изолятов вируса гриппа В.

Поскольку метод антигенной картографии был предложен разработчиками с использованием хорьковых антисывороток, было проведено сравнение антисывороток хорьков и белых крыс по их способности выявлять антигенный дрейф (антигенные изменения в сравнении с эталонными штаммами) у современных вирусов гриппа В в РТГА. Для всех исследованных вирусов наблюдалась очень высокая степень корреляции результатов РТГА, полученных с хорьковыми и крысиными антисыворотками, коэффициент корреляции составил от 0,724 до 1,0.

Антигенная карта, построенная для российских изолятов, отражала общие тенденции эволюционной изменчивости вирусов гриппа В Викторианской разновидности, которые были отмечены при проведении антигенного анализа методом РТГА: за исследуемый период произошла смена В/Малайзия 2506/04-подобных штаммов на изоляты, подобные эталонному штамму В/Брисбен/60/08 (рис.2).

Антигенная карта, построенная для вирусов Ямагатской разновидности, также сопоставима с основными эволюционными процессами, происходившими за последние 8 лет (рис.3). На карте отражены основные группы вирусов, родственных эталонным штаммам В/Флорида/07/04, В/Бангладеш/3333/07 и В/Висконсин/1/10, последовательно сменявшим друг друга в ходе эволюционной изменчивости вирусов гриппа В Ямагатской линии, которые не были четко выявлены методом РТГА.

Штаммы-2004-2006- гг

Штаммы-2006-2007- гг

/ И

_к.

Ал"» а

У'

а е

9, ,

В/Малайзия /2506/04

В/Брисбен/бОЛ

Штаммы-2008-2012- гг

Рисунок. 2. Антигенная карта для современных эталонных вирусов и российских вирусов гриппа В Викторианской разновидности (275 антигенов и 12 сывороток).

Рисунок. 3. Антигенная карта современных эталонных вирусов и российских вирусов гриппа В Ямагатской разновидности (93 антигена и 18 сывороток).

Молекулярно-генетический анализ вирусов гриппа В 2004-2012 гг.

выделения.

В результате проведенных молекулярно-генетичееких исследований у вирусов гриппа В Викторианской группы в период с 2004 по 2012 годы зафиксировано 10 аминокислотных замен, из которых 9 находятся в антигенно значимых областях. Две замены расположены в области рецептор-связывающего сайта.

В эпидемический сезон 2004-2005 годов в России циркулировали вирусы гриппа В, подобные эталонным штаммам В/Гонконг/330/01 и В/Шандонг/7/97 (филогенетическая группа «Шандонг/7»). Вирусы отличались набором аминокислотных замен от родоначальника Викторианской линии эталона В/Виктория/2/87 [ВЕ (T75N), ВС (A81V), BD (Т129К- 120-петля), ВА (V137I - 120-петля) и в 190-петле (V202A)] (рис.4).

На рубеже 2005-2006 годов в Викторианской группе вирусов гриппа В произошли существенные изменения антигенных свойств. Отечественные изоляты приобрели аминокислотные замены, характерные для эталонного штамма В/Малайзия/2506/04 - в антигенном сайте ВС - К48Е и K80R, и BD -K129N (120-петля) (филогенетическая группа «Малайзия/2506») (рис.4).

В последующие годы аминокислотные изменения в НА1 у вирусов гриппа В Викторианской линии были незначительными и не оказали влияния на антигенные свойства вирусов.

Изучение аминокислотных последовательностей НА1 вирусов 20082009 годов выделения выявило дальнейшие мутационные изменения в Викторианской группе. Российские изоляты приобрели 3 существенные замены в антигенных сайтах ВЕ (N75K), ВА [V146I (150-петля)] и ВВ2 [N165K (160-петля)], характерные для эталонного штамма В/Брисбен/60/08, полностью утратив антигенное родство с В/Малайзия/2506/04-подобными вирусами 2005-2008 годов выделения (филогенетическая группа «Брисбен/60»), Все штаммы 2008-2009 годов приобрели замену S172P (рис.4).

Генетический анализ изолятов 2009-2010 годов выявил общую замену для всех исследованных вирусов Викторианской линии - I146V, которая не повлияла на антигенные свойства вирусов. Все российские изоляты 2010-2012 годов выделения обладали аминокислотной заменой L58P.

Таким образом, за в период с 2004 по 2012 гг. у представителей Викторианской ветви генетические изменения дважды привели к смене антигенных свойств вирусов.

У вирусов гриппа В Ямагатской группы на эволюционном отрезке В/Джангсу/10/03; В/Флорида/4/06 -> В/Бангладеш/3333/07 -» В/Висконсин/1/10 выявлено 11 аминокислотных замен, из которых 6 являются существенными. В этой группе возникает потенциальный сайт гликозилирования, одна из аминокислотных замен произошла в позиции, составляющей основу рецептор-связывающего сайта.

В эпидемический сезон 2004-2005 годов циркулировали вирусы, антигенно подобные эталонным штаммам В/Шанхай/361/02 и В/Джангсу/10/03.

Штаммы, выделенные в Хабаровске, обладали аминокислотной заменой V251M, характерной для филогенетической группы «Флорида/4» и аминокислотными заменами Р108А, R48K, характерными для эталонного штамма В/Брисбен/3/07. Вирусы, изолированные в Калининграде, имели аминокислотные замены, типичные для эталонного штамма В/Джангсу/10/03: K129N, D232A и G255R.

В эпидемический сезон 2006-2007 гг. вирусы Ямагатской линии, изолированые в Новосибирске и Челябинске, обладали заменой V251M, характерной для референс-вируса В/Флорида/4/06 и входили в филогенетическую группу «Флорида/4» (рис.5).

Изоляты, полученные из Новосибирска, можно считать промежуточным звеном между вирусами 2005 и 2008 годов выделения, поскольку они уже обладали аминокислотной заменой N165Y, но еще не приобрели аминокислотные замены S1501 и G229D, характерные для

&КаНп1пдгасМ21/2011 В5а1п<-Ре1вге&игд/44/20« ВИгКиМИПО

»Екп1вппЬиго/2/Ю

— ВЖопд Копд/514/2009

-В/Моуо«Ыгак/04/2011

£»-&УогопеШ01/2011

■-В/5«1п1-Ре»ег5ЪигдШ.'2010

ЕВ/АШЛа пд«1$КЛ)1/2010 'аэпоОап'ОТГСОИ _ . «угоро1/07/2011

— В/Моасо»/аз/2011 Ь'0тьк,'09/:012

В/Ба >п(-Р«1в гвЬигд/1 8/2013

-»и1ап-СМе'01/2012

В/1 гки Ы^ 01 /2012

&'Вг15ЬапегЪ&7003

01Э а гцЬигд/218/М

гГВ

. I В/!

В/Бэ ¡Ш-Рв1е геЬигд.'23в^

В.'Ка!1п1пдгай/65'09

5/Ка11п!пд га <№62/99

Группа "Брисбен/

■ В"/1с№г1а;з04/2006 ■ ЕУ ККв Ьа гоу&к/Об '2007 .В/А«гвкПвп/8$У2007 , В/МО«О*/02/200в

, в/$а!п(-р«1бг<Ьигв/2е/гоое

• В/5в(п»-Рв1рг8ЬигоМГ/2006 » В/ТШа/03/2007 - О/Нопд Копд/45/2005

-Г"

л а/

.В/М01 {.8,8 471— в

В/Ма1аув1аГ2506/2004 -ВК«|1п|пд™Л06/2005 I

Групп» "М»яай»»«/2506'*

Группа "Ш«идоиг/7"

- т1>зтк>П2>07/1997 - В/Нопд Копд/ЗЗОЛО01 -В/У1сЮПа/02/1987

Рисунок 4. Филогенетическое дерево вирусов гриппа В Викторианской линии, выделенных в России в период с 2004 по 2012 гг. Филогенетическое дерево вирусов гриппа В построено на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего НА.

В/Бангладеш/ЗЗЗЗ/07-подобных штаммов. К филогенетической группе «Бангладеш/3333» относится большинство штаммов 2007-2008 годов выделения (рис.5).

В 2012 году на территории России начали циркулировать вирусы существенной аминокислотной заменой в 190-й петле — N2028.

Замена N2028 расположена в области рецептор-связывающего сайта. Выявлены замены, типичные только для российских изолятов: Ш16К [ВС (120-петля)], К298Е, Е312К (филогенетическая группа «Висконсин/1»)

(рис.5).

\U6K

H2>JSS 471 B/Novosibirsk/03/2012

К29ИЬ 471' C312K

B/Novosl Ы rsk/02.'2012 B'Novoslbirsk,'01/2012

8AWsconsto/D1/2010 TieiK r B/Salnt-Petersburg/42/2012 L B/Saint-Petersburg/24/2012 B.'Saint-Peteraburg/S4/2û08 l—B.'Kallningrad/45.'2008 B/Tver/04'2008 B/Vologda/57/2008

/49/2008 8/Ka I i ni ngrad/12/2008 ,—B/Tul a/65/2008

-B'Vdeocia/87/2008

B/Samara/SÔ.'200â B/Samara/97/2008

se I— B/Astr8khan/B1/2008

— B/Bangladesh/3333/2007

- B/Che lya Ы nsk/306/2007 Bi'Novo»birsk/02/20Q7

— B/Khabarovsk'36/2005

- B/UI a n-Ude/05/2008

4 B/Brl sba ne Î3/2Q07

- BfFiùrkSan/2004 -B/Florida/04/2006

- B/Moscow/16/2002

— B/Uan-Ude/fi/2003

B/Jiangsu/10/2003 -B/Kaliningrad,'04/200$

Групп« ^Виаазншн/1"

Группа

"Бангладеш/эзэз"

Группа"Фпорида/41

Группа "Джангсу/10"

-B/Shanghai/361/2002

- B/Sichuan/379/1999

- B/Yamagata/16/1988

Рисунок 5. Филогенетическое дерево вирусов гриппа В Ямагатской линии, выделенных в России в период с 2004 по 2012 гг. Филогенетическое дерево вирусов гриппа В построено на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего НА.

Таким образом, в Ямагатской группе за исследуемый период

существенные генетические изменения, приведшие к смене антигенных характеристик вирусов, происходили также 2 раза.

В ходе исследования были установлены аминокислотные позиции, изменения в которых оказали влияние на антигенные свойства вирусов. В Викторианской группе это аминокислотные позиции, находящиеся в антигенных сайтах: ВС (К48Е, K80R), ВЕ (N75K), BD (K129N - 120-петля), ВВ2 (N165K - 160-петля). А в Ямагатской группе - ВА (S150I - 150-петля) и ВВ2 (N165Y - 160-петля).

Нами было выявлено 2 типа реассортации, характерных для вирусов гриппа.

ВЫВОДЫ

1. Определена доля участия вируса гриппа В двух эволюционных групп в каждой из эпидемий в период с 2004 по 2012 годы в России. В исследуемый период преобладали вирусы гриппа В Викторианской линии-64,4%.

2. На территории России зафиксировано появление двух новых антигенных групп вирусов Викторианской разновидности, подобных вирусам В/Малайзия/2506/04 и В/Брисбен/60/08, что коррелирует с циркуляцией вирусов гриппа В этой линии в мире.

3. Зарегистрирована поступательная смена антигенных характеристик у вирусов гриппа В Ямагатской группы в эпидемические сезоны 20042005 гг., 2007-2008 гг. и 2011-2012 гг. Большинство вирусов 2011-2012 гг. сохранило антигенное родство с референс-вирусами В/Флорида/4/06 и В/Флорида/7/04.

4. Установлены аминокислотные позиции в молекуле гемагглютинина изменения в которых повлияли на антигенные свойства вирусов. В Викторианской группе это аминокислотные позиции, находящиеся в антигенных сайтах: ВС (К48Е, K80R), ВЕ (N75K), BD (K129N - 120-петля), ВВ2 (N165K - 160-петля). А в Ямагатской группе - В A (S150I -150-пстля) и ВВ2 (N165 Y - 160-петля).

5. Впервые применен модифицированный метод антигенной картографии для анализа эволюционной изменчивости современных российских изолятов вируса гриппа В.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Иванова A.B. Сравнительный анализ вирусов гриппа В викторианской линии по антигенной структуре и биологическим свойствам / A.B. Иванова // Материалы Седьмой Всероссийской медико-биологической конференции

молодых исследователей «Человек н его здоровье». СПб. —■ 2004 г. — 18 апреля. — С.102-103.

2. Иванова A.B. Сравнительный анализ вирусов гриппа В викторианской линии по антигенной структуре и биологическим свойствам / A.B. Иванова, И.Б. Ягловская, Т.Г. Лобова // Материалы Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты». СПб. — 2004 г. — 2-5 ноября. — С.26.

3. Соминина A.A. К вопросу о штаммовой композиции гриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон / A.A. Соминина, Н.И. Донская, М.Ю. Еропкин, О.М. Литвинова, Н.И. Коновалова, Т.Г. Лобова, Т.М. Гудкова, С.М. Щеканова, A.B. Иванова, И.Б. Ягловская // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2005. — Т.23.№4. — С.3-7

4. Sorokin E.V. Determination of epitopes in nucleoprotein of influenza В virus / E.V. Sorokin, T.R. Tsareva, T.D. Smirnova, T.G. Lobova, A.V. Ivanova, Sominina A.A. // International Conference «Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook», Sankt-Petersburg. — 2007. — 15-17 March. —P.32-33.

5. Коновалова Н.И. Мониторинг эволюции вируса гриппа человека в России как часть системы подготовки к вероятной пандемии // Н.И. Коновалова, В.А. Григорьева, Т.М. Гудкова, С.М. Щеканова, Д.М. Байбус, A.B. Иванова и др. / Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. — 2008. — т.23, №3, приложение 2, часть II. Конгресс «Экофорум 2008». — С.305

6. Иванова A.B. Характеристика современных эпидемических штаммов вируса гриппа В, циркулирующих в России / A.B. Иванова, Д.М. Байбус // Материалы конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». — СПб. — 2008 г. — 15 мая. — С.56.

7. Еропкин М.Ю. Антигенные и генетические особенности современных вирусов гриппа в России / М.Ю. Еропкин, М.П. Грудинин, Н.И. Коновалова, М.М. Писарева, Т.М. Гудкова, В.А. Григорьева, Д.М. Байбус, A.B. Иванова

и др. // Материалы Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. — 2009. — 30 марта-1 апреля. — С.67.

8. Коновалова Н.И. Этиологическая характеристика эпидемий гриппа 20062009 гг. в Российской Федерации (по данным НИИ гриппа СЗО РАМН) / Н.И. Коновалова, М.Ю. Еропкин, Т.М. Гудкова, В.А. Григорьева, Д.М. Даниленко, А.В. Иванова и др. // Вопр. вирусол. — 2010. — Т.55.№.4. — С.9-16.

9. Danilenko D. Differential cell culture susceptibility to influenza viruses of various origin including pandemic 2009 A(H1N1)V / D. Danilenko, A. Ivanova, T. Smirnova // Options for the control of influenza VII. Hong Kong, China. —

2010. — 3-7 September. — P.100.

10. Eropkin M. Results of influenza epidemic season 2009-2010 in Russia: isolation, biological properties and antigenic analysis of viruses / M. Eropkin, D. Danilenko, A. Ivanova et al. // Options for the control of influenza VII. Hong Kong, China. — 2010. — 3-7 September. — P. 100.

11. Baibus D. Antigenetic variety and biological properties of influenza В viruses circulating in Russia in 2006-2010 / D. Baibus, A. Ivanova // 2nd International Influenza Meeting. Munster, Germany. — 2010. — 12-14 September. — P.54.

12. Eropkin M.Y. Pandemic influenza 2009 in Russia: isolation, antigenic analysis and biological properties of viruses / M.Y. Eropkin, D.M. Danilenko, N.I. Konovalova, A.V. Ivanova et al. // Influenza and Other Respiratory Viruses. —

2011. —№5 (Suppl.l). — P.416-418.

13. Иванова А.В. Динамика изменчивости вирусов гриппа В в период с 2007 по 2010 гг. / А.В. Иванова, Д.М. Даниленко, Т.Г. Лобова // Материалы Всероссийской международной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». СПб. — 2010. — 21-22 декабря. — С. 140.

14. Иванова А.В. Антигенные и биологические свойства вирусов гриппа В, выделенных в России в 2006-2010 гг. / А.В. Иванова, Д.М. Даниленко, Т.Г.

Лобова и др. //Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. — 2011. —Т.56.№1. — С.4-8.

15. Лобова Т.Г. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших в Российской Федерации с 2005 по 2012 гг. / Т.Г. Лобова, A.B. Прокопец, А.Б. Комиссаров и др. // Вопр. вирусол. — 2012. — Т.57.№6. —С.22-26.

16. Даниленко Д.М. Возможности использования поликлональных крысиных антисывороток в антигенном анализе вирусов гриппа человека / Д.М. Даниленко, Н.И. Коновалова, A.B. Прокопец и др. // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. —2013. —№1 (68). —С.73-79.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю и глубокую благодарность своему научному руководителю кандидату медицинских наук Лобовой Тамаре Геннадиевне и всему коллективу лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа в особенности Даниленко Дарье Михайловне за практическую помощь на всех этапах работы. Автор выражает признательность сотрудникам лаб. молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа, в особенности Комиссарову Андрею Борисовичу, за предоставление сиквенсов штаммов вируса гриппа В и проведения филогенетического анализа. Автор благодарит Громову Марину Константиновну за возможность совместной работы по выбору диагностических штаммов (лаб. биотехнологии диагностическихпрепаратов ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ).

Отпечатано: ООО «Сан Принт» Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 54, тел. 234-22-22 Бумага офсетная. Формат 60x84, 1/16. Заказ от 8 октября 2013г. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокопец, Александра Владимировна, Санкт-Петербург

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи

04201452125

ПРОКОПЕЦ Александра Владимировна

ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСОВ ГРИППА В, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД С 2004 ПО 2012 ГТ.

03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат медицинских наук Лобова Т.Г.

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................5

Глава 1: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................12

1.1 Система глобального надзора за гриппом...........................................12

1.2 Механизмы изменчивости вирусов гриппа В..................................13

1.2.1 Инсерции и делеции.................................................................15

1.2.2.Реассортанты..........................................................................16

1.2.3 Межтиповая реассортация.........................................................20

1.3 Эволюция вирусов гриппа В Викторианской и Ямагатской линий.........21

1.3.1 Антигенные свойства и распространение вирусов гриппа В Викторианской и Ямагатской линий в мире..........................................21

1.3.2 Молекулярная эволюция гемагглютинина вирусов гриппа В.............30

1.4 Рецепторная специфичность и системы выделения для вирусов гриппа В .................................................................................................44

1.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................53

Глава 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................54

2.1 Материалы..............................................................................54

2.1.1 Вирусы.................................................................................54

2.1.2 Сыворотки............................................................................54

2.1.3 Среды..................................................................................54

2.1.4 Системы для выделения и накопления вирусов..........................................................................................................55

2.2 Методы..................................................................................55

2.2.1 Выделение вирусов гриппа........................................................55

2.2.2 Выделение вирусов гриппа на клетках МЕ)СК................................55

2.2.3 Накопление вируссодержащей культуральной жидкости....................56

2.2.4 Накопление вируссодержащей аллантоисной жидкости...................56

2.2.5 Выделение вирусов гриппа на куриных эмбрионах..........................57

2.2.6 Реакция гемагглютинации (РГА)................................................58

2.2.7 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)...............................58

2.2.8 Идентификация вируса............................................................59

2.2.9 Получение гипериммунных крысиных антисывороток....................59

2.2.10 Антигенный анализ...............................................................60

2.2.11 Антигенная картография........................................................60

2.2.12 Молекулярно-биологические методы.........................................60

2.2.12.1 Выделение вирусной РНК.....................................................60

2.2.12.2 Синтез кДНК и ПЦР............................................................60

2.2.12.3 Секвенирование.................................................................60

2.2.12.4 Филогенетический анализ.....................................................60

2.2.13 Статистическая обработка результатов........................................61

Глава 3: СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................62

3.1 ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСЬ ВИРУСОВ ГРИППА В.............62

3.1.1 Интенсивность циркуляции и антигенный анализ вирусов гриппа В, выделенных в России в 2004-2012 гг..................................................62

3.1.2 Циркуляция представителей 2-х эволюционных линий вирусов гриппа В в эпидемический сезон 2004-2005 гг. Появление возбудителей, подобных антигенному варианту В/Малайзия/2506/04 и их дальнейшее распространение в 2005-2007 гг.........................................................64

3.1.3 Распространение вирусов гриппа В Ямагатской линии, подобных эталонному штамму В/Бангладеш/3333/07- возбудителей эпидемии гриппа 2007-2008 гг................................................................................69

3.1.4 Антигенный дрейф вирусов гриппа В Викторианской линии, циркулировавших в 2008-2012 гг......................................................70

3.1.5 Возвращение вирусов гриппа В Ямагатской группы в эпидемический сезон 2011-2012 гг..........................................................................71

3.1.6 Изучение антигенных свойств вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской линий с использованием крысиных антисывороток, полученных к современным вирусам гриппа В, выделенным на куриных эмбрионах (КЭ) и культуре клеток МГ)СК (МБСК)................................72

3.1.7 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................76

3.2 СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПРОВЕДЕНИЮ И ПРЕДСТАВЛЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ АНТИГЕННОГО АНАЛИЗА.....................................78

3.2.1 Сравнение способности крысиных и хорьковых антисывороток выявлять антигенный дрейф у современных вирусов гриппа В в РТГА........73

3.2.2 Антигенные карты вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской линий 2004-2012 гг. выделения........................................................83

3.2.3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................86

3.3 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В

В ПЕРИОД С 2004 ПО 2012 гг..........................................................87

3.3.1 Молекулярно-генетическая характеристика вирусов гриппа В Викторианской линии разновидности В/Шандонг/7/97, В/Малайзия/2506/04 и В/Брисбен/60/08............................................................................88

3.3.2 Анализ аминокислотного состава НА вирусов гриппа В Ямагатской линии в период с 2004 по 2012 годы...................................................93

3.3.3 Регистрация реассортантных штаммов вируса гриппа В..................98

3.3.4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................99

ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................101

ВЫВОДЫ...................................................................................112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................113

ПРИЛОЖЕНИЕ...........................................................................130

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) продолжают занимать первое место в структуре всех инфекционных заболеваний человека. Ежегодный экономический ущерб от гриппа в России, в среднем, составляет примерно 75-86% от экономических потерь, наносимых инфекционными заболеваниями. Масштабы гриппозных эпидемий выдвигают необходимость борьбы с этой инфекцией в число наиболее актуальных проблем современной медицины [Карпова JI.C. с соавт., 2010; Киселев О.И. с соавт., 2010; Львов Д.К. с соавт., 2010; Слёпушкин А.Н., 2003; Pariani et al., 2012; www.52.rospotrebnadzor.ru: www.who.int1.

Эпидемический процесс при гриппе, начиная с 1977 года характеризуется одновременной циркуляцией вирусов гриппа А двух антигенных подтипов и вируса гриппа типа В. Для вирусов гриппа В двух последних десятилетий характерно появление в циркуляции представителей антигенно отличных эволюционных ветвей - Викторианской (эталон В/Виктория/2/87) и Ямагатской (эталон В/Ямагата/16/88) [Иванова В.Т., 1998; Иванова В.Т. с соавт., 2003; Матюшина P.O., 2007; Kanegae et al., 1990; . Che et al., 2003; Hay et al., 2001; McCullers et al., 2004; Shih et al., 2005].

Удельный вес вирусов гриппа В в этиологической структуре гриппозных эпидемий в различных странах довольно высок [Иванова В.Т. с

соавт., 2009; Львов Д.К. с соавт., 2010; Соминина А.А. с соавт., 2012; Belshe, 2010; Camillioni et al., 2010; Chan et al., 2004; Dapat et al., 2009; Goni et al., 2007; Jian et al., 2008], а заболевания, вызываемые этими возбудителями, могут протекать тяжело не только у детей, но и у взрослых, сопровождаясь развитием большого числа осложнений [Афанасьева О.И., 2009; Ambrose & Levin, 2012; Hite et al., 2007; Liu et al., 2012; Peltola et al., 2003; Seale et al., 2009; Zaraket et al., 2009].

Цель исследования: изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа В, циркулировавших в России в

период с 2004 по 2012 гг., и выявление направления изменчивости у представителей 2-х эволюционных ветвей этого возбудителя.

Задачи исследования.

2. Изучить антигенные свойства гемагглютинина российских вирусов гриппа В 2004-2012 гг. выделения, определить их эволюционные связи с эталонными и эпидемическими штаммами, циркулировавшими в мире в разные годы.

Научная новизна работы.

гриппа В Викторианской разновидности в период с 2004 по 2012 годы с достоверностью Р=0,95. Определены направления изменчивости представителей 2-х эволюционных ветвей этого возбудителя.

В/С.Петербург/44/12.

Впервые в России был применен метод антигенной картографии для анализа эволюционной изменчивости современных вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской групп, показана возможность использования крысиных сывороток.

Практическая значимость работы.

В период с 2004 по 2012 гг. производилась изоляция и идентификация вирусов гриппа, на основании которых была определена этиология эпидемий гриппа в России. В результате проведенных исследований проведено типирование свыше 900 вирусов гриппа В. Изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств этих изолятов позволило установить основные направления изменчивости представителей двух эволюционных ветвей, что важно для заблаговременного обновления штаммового состава гриппозных диагностикумов и вакцин.

[www.hpa.org.uk/web/HP Aweb&HPAwebStandard/HPAweb_C/l 195733812968# north0506].

Основные положения, выносимые на защиту.

3. Определены аминокислотные позиции в НА1, изменения в которых повлияли на антигенные характеристики вирусов. Аминокислотные

замены затронули все известные для вирусов гриппа В антигенные сайты: 120-петля, 150-петля, 160-петляи 190-спираль.

«Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» СПб., 2008 г.; Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням СПб., 2009 г.; Options for the control of influenza VII, Hong Kong, China, 2010 г.; 2-nd International Influenza Meeting, Munster, Germany, 2010 г.; на X научно-практической конференции МЧС РФ «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций. Оценка рисков возникновения чрезвычайных ситуаций» Москва, 2010 г.; Всероссийской международной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» СПб, 2010 г.; Всероссийской научной конференции молодых ученых, посвященной 120-летию НИИЭМ СЗО РАМН, СПб., 2010 г.. Результаты исследований были представлены Комиссии по вакцинным и диагностическим штаммам вируса гриппа и использованы в производстве вакцин и диагностических препаратов МЗ РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 156 источников. Из них 42 на русском и 114 на иностранных языках. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 10 рисунков.

Глава 1: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роды Influenzavirus А, Influenzavirus В И Influenzavirus С

подразделяются на основании отсутствия антигенной кросс-реактивности между внутренними белками. Вирусы гриппа В поражают в основном человека и в редких случаях морских млекопитающих. Они не имеют природного резервуара и различных типов НА и NA, поэтому не способны к реассортации с вирусами гриппа животных, следовательно, не обладают пандемическим потенциалом. Основным механизмом изменчивости для вирусов гриппа В является антигенный дрейф.

Вирусы гриппа В обладают дивергентным ха

Информация о работе

Прокопец, Александра Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.02.02

Диссертация

Эволюционная изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа B, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы