Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционная изменчивость вирусов гриппа A(H3N2) и B в период 2003-2013 гг. в РФ

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционная изменчивость вирусов гриппа A(H3N2) и B в период 2003-2013 гг. в РФ"

На правах рукописи

СИЛУЯНОВА ЭЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА А(НЗГО) и В в ПЕРИОД 2003-2013 гг. в РФ.

03.02.02-вирусология 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

5 ИЮН 2014

005549549

Москва-2014

005549549

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Бурцева Елена Ивановна, доктор медицинских наук Альховский Сергей Владимирович, кандидат биологических наук Официальные оппоненты:

Ярыгина Елена Игоревна, доктор биологических наук, зав. кафедрой ветеринарной вирусологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», г. Москва.

Гамбарян Александра Сергеевна, доктор биологических наук, зав. лабораторией молекулярной биологии вирусов гриппа ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, г. Москва.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт-Петербург

Защита состоится имя в ■/г .00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России По адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16)

Автореферат разослан

»дом

Учёный секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции остаются одними из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. В России ежегодно регистрируют от 26 до 34 миллионов случаев острых респираторных вирусных инфекций, при этом грипп занимает в структуре ОРВИ до 5-10%. В отличии от других возбудителей ОРВИ вирусы гриппа А и В практически ежегодно вызывают эпидемические подъемы заболевания, а для вирусов гриппа А известны пандемические формы распространения.

Изучение молекулярной эволюции вирусов гриппа предоставляет важную информацию по их генезизу и особенностям распространения в разных странах мира. Вирус гриппа A(H3N2) начал циркулировать среди людей с 1968 года, вызвав пандемию «гонконского гриппа» и продолжает оставаться одним из доминирующих в этиологии эпидемий последнего десятилетия. Исследования филогенетических дендрограмм домена НА1 гемагглютинина подтипа НЗ показали, что эволюционная изменчивость вируса гриппа A(H3N2) была представлена в виде кактус - подобной структуры, в которой большинство генетических линий исчезает в течение нескольких лет их циркуляции и только одна линия продолжает существовать между эпидемиями (Smith et al., 2004, Ghedin E., 2005). Интересным является факт появление вирусов подобных эталонному штамму А/Фуцзян/411/02 в сезоне 2003-2004, в следствие так называемого «прыжка» в эволюции вирусов A(H3N2), которые стали причиной значительной эпидемии и полностью вытеснили социркулирующие с ними вирусы гриппа A(H1N1) и В (Chi S.X., 2005, Barr I.G., 2005). Такой результат, вероятнее всего, оказался последствием селекционного давления, происходящего в результате непрекращающейся эволюции в ключевых антигенных сайтах (антигенный дрейф) (Lin Y.P., 2004).

Вирусы гриппа В также представляют определённый интерес, т.к. являются

активными участниками многих эпидемических процессов. С 1988 г. произошло «раздвоение» популяции вируса гриппа В на две антигенно различные ветви -В/Виктория/2/87-подобные и В/Ямагата/16/88-подобные. С тех пор вирус гриппа В эволюционирует двумя социркулирующими эволюционными линиями (Kanegae Y. et al., 1990; Rota P.A., 1990). До 2001 г. преимущественное распространение в мире получили штаммы, подобные В/Ямагата/16/88, между тем как В/Виктория/2/87- подобных представителей детектировали только на территории Юго-Восточной Азии (Chen R., 2008). С 2001 г. стали регистрировать совместную циркуляцию двух эволюционных линий, что привело к формированию реассортантов между ними, которые циркулировали во всем мире в период с 2002 по 2005 гг. (Matsuzaki Y., 2004, McCullers J., 2004).

Ежегодно вирусы гриппа вызывают эпидемии в обход уже существующему иммунитету благодаря постоянной мутационной изменчивости (антигенный дрейф) в гемагглютинине (НА), т.к. он является основной целью для антител, а также изменениям в NA и М-белке, связанных с чувствительностью к противовирусным препаратам. Поэтому большинство исследований молекулярно-генетического строения НА, NA и М-белка посвящено их эволюционным изменениям, в результате появления новых значимых мутаций.

С 1959 г. на ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ возложены функции одного из Национальных центров по гриппу, сотрудничающих с ВОЗ. В связи с этим, основными направлениями научно-практической деятельности центра являются: мониторинг циркуляции вирусов гриппа в России, изучение антигенных, биологических и молекулярно-генетических свойств. Проводимые нами молекулярно-генетические исследования циркулирующих в России вирусов гриппа являются неотъемлемой частью мониторинга гриппа в мире и используются ВОЗ при формировании состава гриппозных вакцин и рекомендаций по применению противовирусных препаратов.

В связи с вышесказанным, целью исследования было изучение молекулярно-генетических характеристик и особенностей эволюционной изменчивости вирусов гриппа А(НЗ№) и В, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в период 2003-2013гг. в России.

Цели и задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить долевое участие вирусов гриппа А(НЗ№) и В в период эпидемических подъемов заболеваемости 2009-2013гг.

2. Подобрать репрезентативную выборку штаммов вирусов гриппа А(НЗИ2) и В, циркулировавших в РФ в период 2003-2013гг.. для изучения их эволюционной изменчивости.

3. Разработать протоколы секвенирования генов вирусов гриппа А(НЗЫ2) и В, кодирующих НА, ИА и М-белок. С использованием разработанных протоколов получить геномные данные для изучаемых штаммов.

4. Модифицировать и адаптировать лабораторный вариант тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации эволюционных линий вируса гриппа В, с учётом особенностей циркулирующих в настоящее время штаммов.

5. На основе анализа полученных нуклеотидных последовательностей эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗК2) и В, идентифицировать в ЫА и М2-белке мутации, ответственных за устойчивость к противовирусным препаратам.

6. На основе полученных данных провести филогенетический анализ исследуемых штаммов вируса гриппа А (НЗЫ2) и В.

Научная новизна

1. Определено долевое участие вирусов гриппа A(H3N2) и В в этиологии эпидемических подъемов заболеваемости в период 2009-2013гг., особенности их антигенных, биологических и молекулярно-генетических свойств, направления эволюционной изменчивости в период 2003-2013гг. в РФ.

2. С использованием разработанных протоколов для секвенирования полноразмерных генов, кодирующих НА, NA и М-белок, определены молекулярно-генетические характеристики изучаемых штаммов.

3. Определены специфические замены в последовательностях НА (Т10М, Q57H, VI821) и NA (P154S, T434N) штаммов вируса гриппа A(H3N2), характерные только для российских штаммов.

4. Модифицирован лабораторный вариант тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации двух эволюционных линий вируса гриппа В (В/Виктория-подобных и В/Ямагата-подобных) с использованием двух специфических зондов IBHYpr и IBHVpr, меченных красителями FAM и HEX.

5. Составлены сравнительные филогенетические дендрограммы последовательностей НА , NA и М-белка штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В, выделенных на территории РФ и в других странах мира, в том числе рекомендованных экспертами ВОЗ в качестве эталонных.

Научно-практическая значимость работы. Сопоставление результатов изучения антигенных, биологических и молекулярно-генетических свойств циркулировавших на территории РФ в период 2003-2013гг. штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В позволили выявить особенности их эволюционной изменчивости, в частности, соответствие свойствам вакцинных штаммов и чувствительность к противовирусным препаратам. Полученные данные молекулярно-генетического анализа являлись основанием для замены вакцинных штаммов и рекомендацией к использованию антивирусных препаратов.

Модифицирован лабораторный варианта тест-системы на основе ПЦР в реальном времени с использованием двух зондов (1ВНУрг и ШНУрг) для дифференциации эволюционных линий вирусов гриппа В, что позволило уточнить долевое участие штаммов вирусов гриппа В в эпидпроцессе.

Разработка протоколов секвенирования полноразмерных генов, кодирующих NA и М, позволили получить данные о частоте встречаемости специфических мутаций, ответственных за устойчивость к противовирусным препаратам -озельтамивиру и ремантадину. Данные о генетических маркёрах чувствительности к противовирусным препаратам были представлены на сайт Европейского Регионального Бюро ВОЗ (http://www.euro.who.int').

Полноразмерные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих гемагглютинин (НА), нейраминидазу ^А) и матриксный белок (М) штаммов вирусов гриппа А(НЗИ2) были депонированы в базу СепВапк (.1(3988024-.1(3988050).

В период 2009-2013гг. 39 штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2) и 59 штаммов вируса гриппа В были переданы в два Международных центра по гриппу, сотрудничающих с ВОЗ - Национальный Институт по медицинским исследованиям (ММЯ), Лондон, Великобритания и Отдел гриппа Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (СОС&Р). Атланта, США для включения в международный мониторинг и выработке рекомендаций по составу гриппозных вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Появление в 2009г. в активной циркуляции пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т09 изменило долевое участие штаммов вирусов гриппа А(НЗ№) и В в эпидемическом процессе в РФ: А(НЗЫ2) был не активен в сезоне 2009-2010гг. и доминировал только в одном из последних четырех сезонов (2012-2013гг.); штаммы вируса гриппа В, вызвавшие вторую волну подъема заболеваемости

зимой 2010г., циркулировали в последующие сезоны с долевым участием от 17% до 47%.

2. Популяция циркулировавших штаммов вируса гриппа В в период 2009-2013гг. была гетерогенна и представлена штаммами обеих эволюционных линий, причем штаммы линии В/Виктория-подобных были активными в трёх из четырех последних сезонов (исключение составил сезон 2012-2013гг.).

3. Эволюция вирусов гриппа А(НЗМ2) и В в РФ в 2003-2013гг. шла в направлении, сравнимом с особенностями изменчивости этих вирусов в мире в целом.

4. Разработанные протоколы для секвенирования позволяют получать полноразмерные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих НА, ЫА и М-белок эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НЗЫ2) и В, что необходимо для проведения молекулярно-генетического анализа в отношении них, с целью выявить значимые аминокислотные замены.

5. Модифицированный лабораторный вариант тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации эволюционных линий вирусов гриппа В позволяет в короткие сроки установить принадлежность штаммов вируса гриппа В к той или иной линии, что повышает уровень мониторинга вируса гриппа В в России.

Личный вклад автора состоит в выполнении исследований по ПЦР-диагностики гриппа в клиническом материале, участию в изучении антигенных свойств эпидемических штаммов вирусов, молекулярно-генетическому анализу последовательностей молекул гемагглютинина, нейраминидазы и М-белка, построению филогенетических дендрограмм. Все материалы, представленные в диссертационной работе, были изучены и проанализированы автором.

Внедрение результатов работы. Все исследования соответствовали плановым научным тематикам лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России: тема №1

«Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности: эволюция новых (высоковирулентный вирус H5N1, новый пандемический вирус HlNlpdm09) и сезонных вирусов гриппа рода Ortomyxoviridae и других вирусов. Сохранение и пополнение Государственной коллекции вирусов», тема № 6 «Разработка и оценка новых противовирусных препаратов» лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа, тема № 7 «Молекулярная медицина: фундаментальные и прикладные аспекты» и были поддержаны международными грантами «Укрепление и совершенствование надзора за гриппом с разработкой ответных мероприятий» (Договор № 5U51IP000527-02, заключенный между ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России и Центрами по контролю за заболеваемостью и профилактике, Атланта, США (Centers for Diseases Control and Prevention, CDC&P, Atlanta, USA)) и « Глобальная госпитальная сеть эпидемиологического надзора за гриппом» (FLU-22-EXT Санофи Пастер, Леон, Франция).

Апробация результатов исследования. Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: International Conference ISIRV Severe Influenza: Burden, Pathogenesis and Management (Hanoi, Vietnam,2012); X и XI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства», Москва, 2012, 2013; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013», Москва, 2013; International Conference Options for the Control of Influenza VIII, Cape Town, South Africa, 2013; XII Конгресс детских инфекционистов России, Москва, 2013.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 статей в журналах реферируемых ВАК, 10 тезисов.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 212 источников, состоящий из 25 работ отечественных и

187 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 16 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпидемические штаммы вирусов гриппа. В исследование были включены 122 эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В, циркулировавших в России в период с 2003 по 2013 гг., в том числе: изолированных от пациентов поступивших в Инфекционную клиническую больницу №1 г. Москвы и выделенных в лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» г. Москвы; в вирусологических лабораториях ФБУЗ «Центров гигиены и эпидемиологии» и в вирусологических лабораториях ряда городов России.

Изоляция эпидемических штаммов вирусов гриппа. Штаммы вирусов гриппа A(H3N2) и В были выделены при заражении носоглоточными смывами монослоя клеток культуры ткани MDCK по методу Davies HW с соавт. с добавлением в поддерживающую среду TPCK-treated trypsin XIII fraction, Sigma, в конечной концентрации 2,0 мкг/мл., согласно рекомендации ВОЗ.

Изучение антигенных свойств вирусов гриппа проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием эталонных штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В и подготовленным к ним специфических высокоиммунных сывороток.

Вирусную РНК выделяли из штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В с помощью наборов Viral RNA Kit, Рибо-преп (вариант 100) и Проба-НК, согласно инструкции производителя.

Обратную транскрипцию проводили набором «Реверта-L» (Amplisens

Biotechnologies), согласно инструкции производителя в амплификаторе (Rotor Gene) или в термостате «Гном» при 37 °С 30 минут или использовали ПЦР смесь в объёме 20 мкл с праймером 5'Uni (AGCRAAAGCAGG). Реакцию проводили в термостате при 42 °С в течении 30 минут.

Детекцию вирусов гриппа A(H3N2) и В методом ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) проводили коммерческими тест-системами

(«АмплиСенс® Influenza virus А-тип-FL», «АмплиСенс® Influenza virus А и В-тип-FL», «Комплект реагентов для проведения ПЦР - амплификации кДНК нейрамииидазы N2 вирусов гриппа A(H3N2)».

Тест-системы для определения принадлежности штаммов вируса гриппа В к эволюционным линиям. Для дифференциации вируса гриппа В на две эволюционные линии (B/Yamagata/16/1988-подобных и B/Victoria/2/87-подобных) использовали две тест-системы: 1. Модифицированный лабораторный вариант тест-системы. 2. «Комплект реагентов для дифференциации эволюционных линий гриппа В» фирмы «ДНК-технология.

Определение нуклеотидных последовательностей генов НА, NA, М осуществляли на автоматическом секвинаторе ABI 3130 (Applied Biosystems, США) по методу Сэнгера. Для выравнивания и анализа нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет прикладных программ Lasergene Core Suite (DNASTAR Inc.,USA) и Mega 5.2.

Построение филогенетических дендрограмм производили с помощью алгоритма Align by Clustal W из пакета программ MEGA 5.2. Филогенетический анализ осуществляли на основе алгоритмов «ближайшего соседа» (Contruct/Test Neighbor-Joining Tree) и «максимального схожести» (Máximum Likelihood Tree) в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000 - кратным ресэмплингом с помощью программ MegAlign ((DNASTAR Inc.,USA) и Mega 5.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эволюционная изменчивость вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших на территории России с 2003 по 2013 гг.

Активность вируса гриппа A(H3N2), как этиологического агента эпидемических подъемов заболеваемости в период 2009-2013гг.

В эпидемическом сезоне 2009-2010 гг. штаммы вируса гриппа A(H3N2) не детектировали ни одним из методов. В течение трёх остальных сезонов (20102013 гг.) наблюдалась совместная циркуляция вирусов гриппа A(H3N2), A(HlNl)pdm09 и В: в 2010-2011 гг. вирусы гриппа A(H3N2) детектировались в спорадических случаях (3,3 %); в сезоне 2011-2012 гг. их долевое участие составило 72 %, а в 2012-2013 гг. 34% (рис. 1).

Антигенные свойства вирусов гриппа A(H3N2), циркулирующих в 20092013 гг. Детальное типирование эпидемических штаммов было проведено в лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И .Ивановского» Минздрава России.

2010-2011 гг.: антигенный анализ 32 штаммов вирусов гриппа A(H3N2) определил родство 29 из них с вакцинным вирусом - А/Перт/16/09 (H3N2) и только 3 штамма представляли собой его антигенные варианты и взаимодействовали со специфической сывороткой к эталону до 1/8 гомологичного титра.

2011-2012 гг.: детальное типирование 115 штаммов вируса гриппа A(H3N2)

2009-2010 2010-2011 2011-2012 2012-2013

Рис.1 Долевое участие вирусов гриппа в эпидемических сезонах в 2009-2013 гг.

определило их родство с эталоном А/Перт/16/2009. Специфическая сыворотка подавляла гемагглютинирующую активность большинства штаммов (76%) до 1 -1/2 гомологичного тира; 23% штаммов взаимодействовали с сывороткой к А/Перт/16/2009 (НЗЫ2) до 1/4 гомологичного титра и только 2 штамма - до 1/8 титра. 2012-2013 гг.: антигенный анализ, проведённый в отношении 108 штаммов вируса гриппа А(НЗШ) показали, что популяция на 88% была близкой по родству с эталонным вирусом - А/Виктория/361/2011, при этом только 6 (5,5%) штаммов отличались более чем на 1/16 от гомологичного титра эталона.

Молекулярно-генетический и филогенетический анализы генов НА, NA и М эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗШ). Для исследования было выбрано 70 эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗШ), выделенных в разных городах РФ в период 2003-2013 гг.; при отборе учитывали особенности антигенных свойств штаммов.

В эпидемическом сезоне 2003 - 2004 штаммы вируса гриппа А (НЗЫ2) сформировали две филогенетические группы представленные эталонным штаммом А/Фуцзянь/411/02 с общей для всех заменой в479Е в НА и А/Веллингтон/1/04 с

Ё A/Toms к/05/2013 АЛ" omsk/04/2013 А/Tomsk/12/2013 Moscow/102/2013 omsk/13/2013 WTver/135/2013 .., . omsk/08/2013

, A/Moscow/39/2013 -J— A/Moscow/103/2013

i- A/Perm'116/2003 ■ ** A/VeHky_Novgoro<l/73/2003 ' 4 L A/Kiabarovsk/97/200 =

I-♦ A/Fujian/411/20C2

' ▼ AUlan Ude/0!/200C

A/Moscow/10/1999 A'Moscov./346/2003

1-A

1160M P162S R261Q

L- A/Moscow/84/2012 A/Y aroslavl/1/2012 A/Moscow/02/2012 A/Lipetsk|l 17/2012 - A/Cheboksaiy/40/2012 — ♦ A/Texas/50/2012

-♦ A/Victoria/361/2011

A/Vladívostok/03/2012

A/Moscow/83/2013 A/Moscow/38/2013 A/Orenbuig/46/2012 A/Orenburg/50/2012 A/Orenburg/39/2012 A/Moscow/03/2012 A/Tomsk/07/2013

A/Tomsk/1/2012

-A/Moscow/21/2009

A/Moscow/24/2012 — ♦ A/Pert^16/2009

-AATadivostok/11/2010

-AAOadh'Ostok/4/2011

A/Vladivostok/10/2010 ■ A/Vladivostok/3/2010

I A/Vladivostok/1 /2010 A/Vladivostofc/10/2011 A/Vladivostok/4/2010 - A/Moscow/30/2009 A/Moscow/24/2009 A/MosCOw/26/2009 A/Lipetsk/303/2009 — A/Lipetsk/346/2009 A/Lipetsk/225/2009 A/Lipetsk/321/2009 .дутя A/Vladivostok/l 9/2008 fi— A/Vladivostok/4/2008 J, A/Moscow/39/2007

4j-А/Asrffahan/48/2008

J j A/Yekaterinbura/4/2008

-A/Yakutia/85/2008

L A/Yakutia/83/2008 A/Vladimir/84/2007

А/Реша/55/2008 A/Brisbane/10/2007 A/Yaroslavl/127/2007

- A/Via divos tok/2/2010

- A/Yaroslavl'54/2003 ► A/Wisconsiiv'67/2»05

АЛ1уа2ап/24/20С4 ♦ А/Weffington/1/2004

-A/Omsk/21/2004

■ A/Lipetsk/202/2003 4— A/Yaroslavl/4/2004 " |j— A/Moscow/211/2СОЗ

' A/Tomsk/27/2004 - A'Yekateriabuig/1/2005

-A/Moscow/7/2005

- ♦ A/Catfomia'7/2004

- A/Vladimir/7/2007 - A/Yaroslav/127/2007

— A/Vladivostok/6/2008 f A/Virgmia/0i/2IK)7 f A/Uruguay/716/2007 ] A/Mo scow/3 9/2 00 7

- A/Viadrvostok/19/2008

- A/Vladimir/S4/20C7 ► A/Brisbane/10/2007

- А/VTadivostok/10/2008 -A/Penza/55/2008

f AHong Kong/H090-755-V31/2009 - ♦ A'Wisconsm/I 5/2009 ► A/Vic toña/210/2009 ♦ A/Perth/16/2009 A/Moscow/30/2009 j— A/Moscow/21 /2009

4-▼ A/Kovosibirsk'707/2009

A/MOS COW/24/2009

-AATadivostok/11/2010

-A/Vladivostok/4/2011

- AATadivostok'10'2010 A/Vlad.-vostok/10/2011 I A/Vladivostok'4/2010 J AATadKostok'1/2010 I j- A/Vladivoslok/2/2C 10 ^j— AATadivosrok'3/2010 »1— ▼ A/Novos¡fersk/76K/2011

- A/Yekaterinburj/4/2008

- A/Yakutia/83/200S

- A/Yakutia/85/2008 - A/Astrakhan/2/2008

M Al.ipctsk/303/2009 j A/Lipetsk/225/2009 » A/Lip«tsk/228/2009

- A/Moscow/26/2009

|— A/Vladn

sst——

R142C I- + A

R173I GSOE

»8 1 A/Vladimir/7/2007

-♦ A/Wisconsin/67/2005

soi— A/Yekaterinburg/1/2005 Л A/Moscow/7/2005 Jl— ♦ A/CaHfomia/7/2004 JjA/Yaroslavl/13/2005

A/Omsk/21/2004 A/Moscow/211/2003 A/Tomsk/27/2004 A/Y aroslavl/4/2004

J A/!

На/ Iar

"I »A,

■цр

G47PE I-А/

- ♦ A/Weffington/1/2004

► A/Moscow/10/1999

— A/Moscow/23/2012 -A/Tomsk/1/2012

- ^ A/Saint Petersburg/RII63.'2012

— A/Moscow/14/2012

- A/Moscov./02/2012

-A/OrenrJurg/39/2012

A/Oreoburg/46/2012

— A/Yaroslavl/81 '2012 A/Moscow/i 3/2013

■V/Í8/2013

- А/Orenburg/50/2012

- A'Moscow/03/2012 -f AATadñ ostok/3/2012

- ATomsk/07/2013 W A'Petrozavodsk/RIIO 1/2012

I A/Lipetsk/117/2012

"FT-A/MOSCOW/07.'2012

П-A/Mo scow/08/2012

|_ - A/Cheboksaiy/4CV2012 !* - ▼ A/Tyumen/O3/2012

-A/Moscow/10/2012

A/Moscow/39/2013 ' A/Moscow, ; А/Tvcr/135/2013

- A/Cbeboksary/18/2012

' A/Fujian/411/2002

• A/Vefflcy_Novgorod/73/2003

A/Penn/116/2003 G479E "1—A/Khabarovsk/97/2003

- A/Tomsk/l 3/2013

[OSCOw/; 0^2013

A/TotESlc'05'2013 A/Tofnsfc'04/2013 A/Tomsk/12/2313

irai

Рис. 2. Филогенетическое сравнение последовательностей гемагглютинина вирусов гриппа А(НЗ№), циркулировавших период 2003-2013гг.

Рис.3. Филогенетическое сравнение последовательностей нейраминидазы вирусов гриппа А(Н31Ч2), циркулировавших в период 2003-2013гг.

характерными заменами Y159F и S189N в антигенном сайте В и S227P в последовательностях НА, N93D, Е199К в NA и I219V в М-белке. (рис. 2, 3). Изменения в последовательностях НА, NA и М-белка у штаммов, циркулировавших в период с 2004 по 2006 гг. определили их филогенетическую принадлежность к референс-штамму А/Калифорния/7/04. Все изоляты несли замены K145N в антигенном сайте А и V226I в молекуле HAI, Е221К в NA. Вирусы гриппа A(H3N2), полученные в 2006-2007 гг. из Владимира, Ярославля и Москвы несли замены S193F в антигенном сайте В и D225N в молекуле НА1 и L370S в NA и принадлежали клайду А/Брисбан/10/07. Генетический анализ штаммов 2007-2009 гг. показал, что они также входили в клайд А/Брисбан/10/07-подобных вирусов, с характерными для него заменами K140I в антигенном сайте А и G50E и N387K и H150R в NA , кроме того у всех вирусов 2008-2009гг. были найдены генетические маркёры эталонного штамма А/Брисбан/10/07 в антигенном сайте D в НА и D147N в NA. Все последовательности генов М-белка вирусов гриппа A(H3N2), циркулирующих с 2005 года несли замену S31N, отвечающую за устойчивость к адамантанам.

Штаммы вируса гриппа A(H3N2) эпидемического сезона 2010-2011, выделенные в г. Владивостоке претерпели значительные мутационные изменения и представляли новый клайд А/Перт/16/09 - подобных вирусов с ключевыми заменами I260M и R261Q в последовательностях НА и L338F, N342D, и D127M в NA. Дальнейшие изменения в молекулах НА и NA привели к тому, что вирусы 2011-2012 гг. филогенетически были близки эталону А/Виктория/361/11, а вирусы 2012-2013 гг. референс - штамму А/Техас/50/12. Изоляты этих двух сезонов отмечались общими заменами S45N, T48I, A198S, V223I, N312S в НА и L338F, N402D, К369Т, S367N и I464L в NA (рис. 2 и 3).

Все последовательности М-белка штаммов, циркулирующие в период с 2009 по 2013гг. несли замену R174K.

Анализ последовательностей нейраминидазы у исследованных нами российских штаммов на наличие мутаций Е119У, Я292К, N2948, ответственных за резистентность к ингибиторам, не выявил.

Таким образом, изучение аминокислотного состава последовательностей гемагглютининов вирусов гриппа А(НЗЫ2) показало, что основные изменения затронули субмолекулу НА 1, и в частности антигенные сайты, располагающиеся в глобулярной части НА. Наибольшее количество изменений было зарегистрировано в двух антигенных сайтах А и В, что указывает на тот факт, что они в большей мере подвержены действию положительной селекции. Вместе с тем, несмотря на высокий уровень гомологии российский изолятов, среди них были вирусы, которые несли специфические замены в последовательности НА (Т10М, С?57Н, У1821) и Р1548, Т434Ы в последовательностях КА.

Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших на территории России с 2003 по 2013 гг.

Активность вируса гриппа В, как этиологического агента эпидемических подъемов заболеваемости в период 2009-2013гг.

Штаммы вируса гриппа В вызвали вторую волну подъема заболеваемости в феврале-апреле 2010г., определив моноэтиологичность эпидемии, где их долевое участие составило 5,5%. В 2010-2011 гг. на долю вируса гриппа В пришлось 17,0%, в 2011-2012 гг. их долевое участие составило В 27,0%, а в 2012-2013 гг. 22% (рис. 1).

Антигенные свойства вирусов гриппа В, циркулирующих в 2009-2013 гг.

Детальное типирование эпидемических штаммов было проведено в лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И .Ивановского» Минздрава России.

2009-2010 гг.: 70 исследуемых штаммов вирусов гриппа В взаимодействовали с сывороткой к эталону В/Брисбен/60/2008 в пределах от 1 до 1/4 гомологичного титра. Один штамм, выделенный во Владивостоке, был определен как В/Ямагата-

подобный и взаимодействовал с сывороткой к В/Флорида/04/06 до 1/64 гомологичного титра.

2010-2011 гг.: результаты типирования 118 штаммов вирусов гриппа В показали, что 109 из них (92,4%) были подобны вакцинному вирусу В/Брисбен/60/07 (линия В/Виктория-подобных), а 9 штаммов - эталону В/Флорида/04/06 (В/Ямагата-подобных).

2011-2012 гг.: основную массу составляли В/Брисбен/60/2008-подобные вирусы (99 штаммов - 89%) и 12 штаммов (11,0%) представляли В/Висконсин/1/2010 - подобные вирусы.

2012-2013 гг.: популяция вируса гриппа В была представлена штаммами обеих эволюционных линий, при этом штаммы, подобные В/Висконсин/О 1/09 (линия В/Ямагата-подобных) в подавляющем большинстве отличались от референс-штамма на 1/8 и более гомологичного титра (74 штамма или 68,0%). В тоже время, в популяции штаммов, подобных В/Брисбен/60/08 (линия В/Виктория-подобных) такие варианты встречались значительно реже (3 штамма или 9,0%).

Молекулярно-генетический и филогенетический анализы генов НА и NA эпидемических штаммов вируса гриппа В. Для исследования было выбрано 52 эпидемических штамма вируса гриппа В, выделенных в разных городах РФ в период 2003-2013 гг.; при отборе учитывали особенности антигенных свойств штаммов.

Молекулярно-генетический анализ, проведённый в отношении штаммов вирусов гриппа В В/Ямагатской и В/Викторианской линий, циркулирующих с 2003 по 2013 гг. показал, что за этот период в последовательностях НА и NA произошло множество аминокислотных изменений.

Ямагатские штаммы 2004-2006 гг. были подобны эталонным штаммам В/Шанхай/3 61/2002, и В/Цзянсу/10/03 и обладали четырьмя заменами K129N в петле 120, D232A, G256R и H40Y в НА и замены Р42Т, L73F, D342N в NA. В эпидемический сезон 2007-2008 исследуемые вирусы Ямагатской линии являлись

R4IK F108A S1SI

7

BTomstMOU -ЕТопиМЮОЦ -ВТошИ152013 В.ТОШИ7Я013

-RMoscow/ÍMOU

—BTomskaiaou

кптлшш влмиьшмз

_ГША| L t BMlmchiistttrira 012 I-SMostow^SIOlJ

~-шпвктат

B4TidiíosMMO,2M8

К1шШ.1т

♦ KBrisbiitJIMl?

ВЛгавЫШШ ,yE'Astrillll3;200J "T-BaunUiiSMiioi

— ♦EB.IflaÍBimn007 —BSimiraSíldOS B'Oreibül^'L7008 -♦RIlgLudHS:« —a'NIdiiTNovgorodSlíMIS В"Ммсо*гМ0!3 RMoicowMOU EVtUtyNoi-soroiHSlOU ♦ BTVisraisMWOlO

RTomskimOU

BEiisMK'3/07 dldt

ПЩ Míffi

n B"Mo иГПЯ'Цпя»

I-RVtü

BBugUítilraOT di de

BWÍSMKM,2010 dldt

-BTirasliriiaOU - ♦ BTloridlD+ÍOOÍ

LSÍR

ra

-♦ ВХшри'ШМЗ

p— EHviial7300S B4DY BEOTIQ/7/2005 I» B^IO!COW'L71)05 -BAIoscow.3.7004 f BShugtli'361/2002

♦ BHlrtlüTW»

- ♦ B'Sicbüan 379 1999

ВМжстШНЗ S5Iim»71_2013

втыгюитщ -ВМиож7ШЗ —В51«™яаи МоятгЖШ КМиотЮП

80rab«j7aill

д|-ШоШ1>1Ш2

I—ЮЬтЧЗШ ■в-Миотзыт ,\7Щс|—ШивйИОМ

"-ИмотЗШИ

фЫпЬтЛОД! ВВлйаеШИ

■Шю&т ■ 1ТШ32Ш ШпкЫШ иДОЯШ въшАдж

ЮИиКочяШИВ

^J— 4aírébue

T-в

BEmbuí'ÓOTiS dldt

C|-в

J-♦ ВШгокЯЮТИ

I-♦íYktuM«™

BlblireMSOÍW dldt

,—ВШшлпШПОО] BitatmM

BtaMOTJ S'BBibirmLEH»! -♦iSladnij 7¡1»7

ТИш Rtissortinl

-♦EYimigatiI6M8

-tBrmúrnm

-фмчвдпгш

Рис. 5. Филогенетическое сравнение последовательностей гемагглютинина вирусов гриппа В В/Ямагатской линии, циркулировавших в период 2003-2013гг.

Рис. 6. Филогенетическое сравнение последовательностей гемагглютинина вирусов гриппа В В/Викторианской линии, циркулировавших в период 20032013гг.

дрейф-вариантами вирусов подобных эталонному штамму В/Флорида/04/2006, т.к. несли в своих последовательностях характерную мутацию V252M, но уже приобрели генетические маркёры вирусов представляющих генетический клайд В/Бангладеш/3333/07 S150I, N165Y, G229D и Р108А в последовательностях НА и Q42P, D463N и А465Т в NA (рис. 5). Штамм В/Москва/93/2012 (2011-2012 гг.) относился к филогенетической группе В/Висконсин/О 1/10, но являлся дрейф-вариантом вирусов, подобных В/Бангладеш/3333/07, т.к. генетического маркёра N202S эталона В/Висконсин/1/10, который располагается в 190 спирали, не нёс. Данную значимую аминокислотную замену в последовательностях НА несли штаммы, циркулирующие в 2012-2013 гг. и представляющие клайд В/Висконсин/1. Они также несли замены А68Т, K186R и D340N в NA. Другая часть штаммов показала филогенетическую близость с эталонным штаммом В/Массачусетс/02/2012 и обладала характерными заменами Т181А в НА и R65H в NA. Данные молекулярно-генетического и филогенетического анализа штаммов вируса гриппа В В/Викторианской линии показали, что эпидемические сезоны 2003 - 2005 гг. характеризовался циркуляцией реассортантов вирусов гриппа В, которые с одной стороны несли в своем составе гемагглютинин от В/Викторианской линии (вирусы подобные В/Гонконг/330/2001) с характерной заменой I121T, а нейраминидазу от В/Ямагатской линии (вирусы подобные В/Сичуань/379/1999) с заменами Т389А и I248V (рис.6). В период с 2005 по 2009 гг. в последовательностях НА и NA штаммов вирусов гриппа В В/Викторианской линии произошли существенные изменения - они приобрели аминокислотные замены, свойственные эталонному штамму В/Малайзия/2506/2004 K129N в петле 120 и R48E , K80R в НА, а также 1248V, K125N, E320D и V2711 в NA. Штамм В/Москва/5/2009 эпидемического сезона 2008- 2009 являлся дрейф вариантом, занимающим промежуточное положение между В/Малайзия/2506 - подобными вирусами и В/Брисбан/60-подобными

вирусами, т.к. нёс в НА характерную для эталонного штамма В/Брисбан/60/2008 замену N75K.

В 2009-2010 гг. в ходе антигенного дрейфа викторианские штаммы приобрели две значимые замены в НА N165K в петле 160 и V146I в петле 150, характерные для эталонного штамма В/Брисбен/60/2008. Дальнейшие изменения в последовательностях НА и NA привели к тому, что российские штаммы 20102011 гг. приобрели дополнительные замены L58P, S172Ph K200Qb190 спирали в НА и E320D в NA; в 2011-2012 гг. замены H122N и K136N в петле 120 в НА и N220K в последовательностях нейраминидазы, а в 2012-2013 гг. вирусы, изолированные в Москве отметились заменами N197D (спираль 190) в НА и D329N в NA.

Таким образом, эволюционная изменчивость вирусов гриппа шла одновременно по двум линиям — В/Ямагата и В/Виктория. За исследуемый период в последовательностях гемагглютинина и нейраминидазы вирусов гриппа В были установлены важные аминокислотные замены в четырех антигеннозначимых областях. Наибольшее количество замен было зафиксировано в петле 120, что подтверждает факт того, что именно эта область подвергается большему действию позитивной селекции.

Применение модифицированного лабораторного варианта тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации эволюционных линий гриппа В (Barbara Biere, 2010).

Дифференциация штаммов вируса гриппа В по двум эволюционным линиям является актуальной задачей, т. к. в состав гриппозной вакцины входит представитель только одной эволюционной линии. Для решения этой задачи была модифицирована тест-система для дифференциации эволюционных линий вируса гриппа В, разработанная Барбарой Бьер, необходимость в которой была связана с отсутствием подобных коммерческих систем в РФ. Для исследований были модифицированы праймеры зондов (НЕХ-

CGAAAAATCCGMTY TTACTGGTAG - BHQ1 и FAM-AAATCCGTT TCCATTGG TAATGT-BHQ1), т.к. участок НА, на который были подобраны зонды, российских штаммов вируса гриппа В имел отличия от последовательности НА штаммов, подобранных для разработанной тест-системы. Кроме того был заменен краситель Vic на FAM, используемый для детекции вирусов гриппа В/Викторианской линии. Праймеры, используемые для амплификации были универсальными и подошли для всех исследуемых российских штаммов.

С помощью модифицированной тест-системой мы детектировали и дифференцировали двадцать штаммов вирусов гриппа В и получили следующие результаты: семь штаммов принадлежали В/Викторианской линии и тринадцать В/Ямагатской. Четырнадцать образцов носоглоточных смывов были протестированы тест-системой «ДНК-технологии» и лабораторным вариантом тест-системы. Полученные результаты двух систем оказались аналогичными: семь образцов принадлежали В/Ямагатской линии и семь В/Викторианской.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что долевое участие вирусов гриппа A(H3N2) и В в эпидемическом процессе с 2009 года изменилось с появлением и активным распространением пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09: штаммы вируса гриппа A(H3N2) в 2009-2010 гг. были не активны, а с 2010 по 2013 гг. социркулировали с вирусами гриппа В и A(HlNl)pdm09. В популяции вируса гриппа В отмечена активность представителей обеих эволюционных линий с доминированием штаммов, подобных В/Виктория - подобных в 2009-2012г., исключение составил сезон 2012-2013гг.

2. Установлено, что все исследованные штаммы вируса гриппа A(H3N2) в период с 2003 по 2013 гг. по своим антигенным свойствам и принадлежности к

генетическим клайдам и группам соответствовали рекомендациям ВОЗ по составу гриппозных вакцин.

3. Молекулярно-генетический анализ показал, что эволюционная изменчивость вируса гриппа A(H3N2) сопровождалась последовательной сменой антигенных клайдов, что было связано с аминокислотными заменами в НА и NA, которые повлияли на антигенные свойства штаммов. Определены специфические замены в НА (Т10М, Q57H, VI821) и NA (P154S, T434N) российских штаммов, которые не встречались у штаммов, циркулировавших в других странах мира.

4. В NA штаммов вируса гриппа A(H3N2) изменения не привели к формированию резистентности к антинейраминидазным препаратам. В последовательностях М2-белка штаммов вируса гриппа A(H3N2) сохраняется замена S31N, связанная с резистентностью к адамантанам (амантадину и ремантадину).

5. Было установлено, что исследуемые штаммы вируса гриппа В двух эволюционных линий, как по своим антигенным свойствам, так и по принадлежности к генетическим клайдам и группам соответствовали рекомендациям ВОЗ по составу гриппозных вакцин в соответствующие годы.

6. Показано, что штаммы вируса гриппа В эволюционировали двумя линиями-В/Виктория-подобные и В/Ямагата-подобные, изменения в которых были связаны с аминокислотными заменами, во всех антигенных областях (петля 120, петля 150, петля 160 и спираль 190). Наибольшее количество аминокислотных изменений было выявлено в петле 120,которую относят к наиболее изменчивой области.

7. Все штаммы вируса гриппа В сохранили чувствительность к препаратам с антинейраминидазной активностью.

8. Установлено, что лабораторный вариант тест-системы на основе ПЦР в реальном времени с использованием двух зондов (IBHYpr и IBHVpr), меченных красителями FAM и HEX, является специфичным и пригодным для детекции и

дифференциации эволюционных линий вируса гриппа В и может быть использован для мониторинга в лабораторных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Силуянова Э.В. Эволюционная изменчивость вируса гриппа A(H3N2) в период 2007-2012гг./ Силуянова Э.В. Альховский С.В., Бурцева Е.И.// Вопросы вирусологии, 2013,- №6.- С.27-31.

2. Бурцева Е.И. Особенности социркуляции вирусов гриппа в постпандемический период 2010-2011гг. по итогам деятельности Центра экологии и эпидемиологии гриппа ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России./ Бурцева Е.И Львов Д.К., Силуянова Э.В. // Вопросы вирусологии, 2012,- №1.-с. 20-28.

3. Львов Д.К. Развитие эпидемии гриппа в сезоне 2011-2012гг. на отдельных территориях России. Итоги деятельности Центра экологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России./ Львов Д.К. Бурцева Е.И., Силуянова Э.В. // Вопросы вирусологии, 2013,-№2,- С. 15-20.

4. Шевченко Е.С. Эффективность изоляции вирусов гриппа А и В из носоглоточных смывов, взятых в пробирки ^-Virocult® (М40 Compliant, SigmaVirocult) и Virocult® (М40 Compliant, Virocult), в эпидемическом сезоне 2010-2011гг./ Шевченко Е.С., Бреслав Н.В., Силуянова Э.В // Вопросы вирусологии, 2013.- №3,- С. 42-45.

5. Львов Д.К. Особенности эпидемии гриппа на отдельных территориях В России в эпидемическом сезоне 2012-2013 гг. Доминирование штаммов вируса гриппа A(HlNl)pdm09 в странах Европы./ Львов Д.К. Бурцева Е.И., Силуянова Э.В. // Вопросы вирусологии, 2014,- №2,- С.5-10.

6. Силуянова Э.В. Эволюционная изменчивость штаммов вируса гриппа A(H3N2), циркулировавших в России в период 2007-2012гг./ Э.В. Силуянова, С.В. Альховский, Е.И. Бурцева // Тезисы докладов X научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». Москва -2012г.- 2-3 октября- с. 71.

7. Лаврищева В.В. Этиология эпидемии гриппа в сезоне 2011 -2012гг./ Лаврищева В.В., Е.А. Мукашева, Э.В. Силуянова // Тезисы докладов X научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». Москва. - 2012 г.-2-3 октября- с. 50.

8. Burtseva Е. Influenza A(HlNl)pdm09 virus as the Case of Lethal Pneumonía in Russia, 2009-2011: Epidemiological, biological and Genetic properties. / Elena Burtseva, Valentina Lavrischeva, Elina Silujanova // ISIRV Severe Influenza: Burden, Pathogenesis and Management, Hanoi, Viet Nam. - 2012 - 29-31 October.

9. Силуянова Э.В., Молекулярно-генетическая характеристика вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших в России в 2007-2012 гг./ Силуянова Э.В., Альховский С.В.//Тезисы докладов XIX Международной конференции «Ломоносов-13».Москва-2013 г.- 8-13 апреля- с.75.

10. Колобухина Л.В. Грипп: клинико-эпидемиологические особенности эпидсезона 2012-2013гг. (Результаты госпитального мониторинга в ИКБ №1 Департамента здравоохранения г. Москвы)./ Колобухина Л.В., Львов Д.К., Силуянова Э.В. // Тезисы XI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». Москва- 2013 г. - 1-2 октября- с.29-32.

11. Краснослободцев К.Г. Новые молекулярно-генетические технологии в диагностике гриппозной инфекции./ Краснослободцев К.Г., Альховский С.В., Силуянова Э.В. // Тезисы XI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». Москва- 2013 г. - 1-2 октября- с.39.

12. Siluyanova E. The evolutionary mutability of influenza A(H3N2) and B viruses circulating in Russia during 2007-2013./ E Siluyanova, E Burtseva , E Kirillova // International Conference "Options for Influenza VIII". Cape Town, South Africa -2013-5-10 September - P. 164.

13. Burtseva E., Influenza A(HlNl)pdm09 virus as the cause of lethal pneumonia in Russia, 2009-2013: epidemiological, biological, and genetic properties./ E Burtseva, L Kolobukhina, E Silujanova // International Conference "Options for Influenza VIII". Cape Town, South Africa - 2013 - 5-10 September - P.465-466.

14. Krasnoslobodtsev K„ Subtyping and H275Y oseltamivir-resistant HlNlpdm09 influenza virus detection by xTAG fluorescent beads technology./ K. Krasnoslobodtsev, S Alkhovsky, E Silujanova // International Conference "Options for Influenza VIII", Cape Town, South Africa- 2013-5-10 September - P.478.

15.Trushakova S., Monitoring of influenza viruses in Moscow region, 2009-2013./ Trushakova, E Mukasheva, E Siluyanova // International Conference "Options for Influenza VIII". Cape Town, South Africa - 2013- 5-10 September - P.561

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю доктору медицинских наук Е. И. Бурцевой за возможность проведения исследований по молекулярно - генетическому анализу вирусов гриппа, за предоставленную помощь на всех этапах проведённой работы, за ценные указания в ходе написания диссертации и всему коллективу лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ. Автор выражает признательность научному руководителю кандидату биологических наук Альховскому C.B. за участие и помощь при проведении научных исследований и всему коллективу лаборатории биотехнологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, в особенности Щетинину Алексею Михайловичу за практическую помощь в проведение филогенетического анализа.

Подписано в печать 23.04.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 3852 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Силуянова, Элина Владимировна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201458474

СИЛУЯНОВА ЭЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА А(НЗГО)

и В в ПЕРИОД 2003-2013 гг. в РФ.

03.02.02-вирусология 03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук Бурцева Е.И. кандидат биологических наук Альховский C.B.

Москва - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................7

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................9

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................16

ГЛАВА 1. Классификация и строение вируса гриппа................................16

1.1 Структура вириона вируса гриппа.....................................................17

ГЛАВА 2. Характеристика вируса гриппа А(НЗМ2).................................20

2.1 История вируса гриппа А(НЗШ).......................................................20

2.2.Антигенная характеристика штаммов вируса гриппа А(НЗШ) в период с 2003 по 2013 гг., циркулировавших в мире..............................................22

2.3. Антигенная характеристика штаммов вируса гриппа А(НЗИ2) в период с 2003 по 2013 гг., циркулировавших в РФ.....................................................24

2.4. Молекулярно-генетическое строение НА, МА и М-белка вируса гриппа А(НЗШ)..........................................................................................25

2.4.1. Структура белка НА.............................................................25

2.4.2. Структура белка ИА..............................................................27

2.4.3. Структура М-белка................................................................29

2.5. Изменения в последовательностях НА и их влияние на свойства штаммов вируса гриппа А(НЗМ2), циркулировавших в мире с 2003 по 2013 гг..............30

2.6. Изменения в последовательностях НА и их влияние на свойства штаммов вируса гриппа А(НЗК2), циркулировавших в России с 2006 по 2012 гг............34

2.7. Изменения в последовательностях ИА и их влияние на свойства

вирусов гриппа А(НЗК2), циркулирующих с 2003 по 2013 гг. в мире...............38

2.8. Замены в последовательностях белка нейраминидазы, связанные

с резистентностью к лекарственным препаратам........................................39

2.9. Изменения в последовательностях М-белка и их влияние

на свойства вирусов гриппа А(НЗК2)......................................................40

ГЛАВА 3. Характеристика вируса гриппа В..........................................43

3.1 История вируса гриппа В.................................................................43

3.2 Антигенная характеристика штаммов вируса гриппа В,

циркулировавших в мире в период 2003 - 2013 гг.......................................46

3.3. Антигенная характеристика штаммов вируса гриппа В, циркулировавших в России в период 2003 - 2013 гг...................................48

3.4. Молекулярно-генетическое строение НА и КА вирусов гриппа В...........49

3.4.1 Структура белка НА.....................................................................49

3.4.2. Структура ^............................................................................50

3.5. Изменения в последовательностях НА и их влияние на

свойства вирусов гриппа В, циркулировавших в мире в период 2003-2013.......51

3.6. Изменения в последовательностях НА и их влияние на свойства вирусов гриппа В, циркулировавших в РФ в период 2003-2013.....................53

3.7. Изменения в последовательностях КА и их влияние на

свойства вирусов гриппа В...................................................................58

3.7.1. Замены в последовательностях белка нейраминидазы вируса

гриппа В, связанные с резистентностью к лекарственным препаратам............60

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................61

РАЗДЕЛ 2. Результаты собственных исследований................................64

ГЛАВА 1. Материалы и методы.........................................................64

1.1 Эпидемические штаммы вирусов гриппа............................................64

1.2 Методы изучения антигенных свойств штаммов вируса гриппа

А(НЗШ) и В.....................................................................................66

1.2.1 Изоляция эпидемических штаммов вирусов гриппа............................66

1.2.2. Изучение антигенных свойств вирусов гриппа.......................................66

1.3 Методы изучения молекулярно-генетических свойств

эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НЗК2) и В.................................67

1.3.1. Выделение вирусной РНК из исследуемого материала......................67

1.3.2. Обратная транскрипция..............................................................68

1.3.3. Тест-системы для детекции вирусов гриппа А(НЗЫ2) и В

методом ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).....................................68

1.3.4. Тест-системы для определения принадлежности штаммов

вируса гриппа В к эволюционным линиям................................................68

1.3.5. Модифицирование лабораторного варианта тест-систем на основе ПЦР в

реальном времени для дифференциации эволюционных линий гриппа В.......69

1.3.6. Пробоподготовка.........................................................................69

1.3.7. Определение нуклеотидных последовательностей генов

НА, ЫА, М.......................................................................................70

1.3.8. Построение филогенетических дендрограмм....................................71

ГЛАВА 2. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа

А(НЗМ2, циркулировавших на территории России с 2003 по 2013 гг............71

2.1 Активность вируса гриппа А(НЗ№) как этиологического агента эпидемических подъемов заболеваемости в период 2009-2013гг.

и его антигенные свойства....................................................................71

2.2. Характеристика штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2),

выделенных на отдельных территориях РФ в 2003-2013гг. и

отобраных для проведения молекулярно-генетического анализа....................73

2.3 Молекулярно-генетический анализ гена НА эпидемических

штаммов вируса гриппа А(НЗМ2)...........................................................76

2.3.1. Подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования полноразмерных последовательностей гена НА эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗ№)...........................76

2.3.2 Анализ аминокислотной последовательности гемагглютинина эпидемических штаммов вируса гриппа

А (НЗШ), циркулировавших в 2003-2013гг.....................................................79

2.3.3 Филогенетический анализ последовательностей гемагглютинина эпидемических штаммов вируса

гриппа А(НЗЫ2), циркулировавших в период 2003-2013гг...........................83

2.4 Молекулярно-генетический анализ гена КА эпидемических

штаммов вируса гриппа А(НЗИ2)...........................................................87

2.4.1 Подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования полноразмерных последовательностей гена ЫА эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗК2)...........................87

2.4.2 Анализ аминокислотной последовательности белка нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа

А (НЗЫ2), циркулировавших в период 2003-2013гг....................................88

2.4.3 Филогенетический анализ последовательностей нейраминидазы эпидемических штаммов вируса

гриппа А(НЗМ2), циркулировавших в период 2003-2013гг...........................93

2.5. Молекулярно-генетический анализ гена белка М эпидемических

штаммов вируса гриппа А(НЗМ2)..........................................................96

2.5.1. Подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования полноразмерных последовательностей гена белка М эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2).....................96

2.5.2 Анализ аминокислотной последовательности белка М эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2).......................................97

2.5.3 Филогенетический анализ последовательностей белка М эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2), циркулировавших

в период 2003-2013гг...........................................................................98

ГЛАВА 3. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших на территории России с 2003 по 2013 гг........................101

3.1. Активность вируса гриппа В как этиологического агента эпидемических подъемов заболеваемости в период

2009-2013гг. и его антигенные свойства.................................................101

3.2. Характеристика штаммов вируса гриппа В выделенных на отдельных территориях РФ в 2003-2013гг. и отобранных для проведения молекулярно-генетического анализа........................................................................103

3.3. Молекулярно-генетический анализ гена НА эпидемических

штаммов вируса гриппа В...................................................................106

3.3.1. Подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования полноразмерных последовательностей гена НА эпидемических штаммов вируса гриппа В..............................................106

3.3.2. Анализ аминокислотной последовательности

гемагглютинина эпидемических штаммов вируса гриппа В,

циркулировавших в 2003-2013гг............................................................108

3.3.3 Филогенетический анализ последовательностей гемагглютинина эпидемических штаммов вируса гриппа В/Ямагатской

линии, циркулировавших в период 2003-2013гг......................................111

3.3.4. Филогенетический анализ последовательностей гемагглютинина эпидемических штаммов вируса гриппа

В/Викторианской линии, циркулировавших в период 2003-2013гг.................114

3.4. Молекулярно-генетический анализ гена МА эпидемических

штаммов вируса гриппа В..................................................................116

3.4.1. Подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования полноразмерных последовательностей

гена КА эпидемических штаммов вируса гриппа В...................................116

3.4.2. Анализ аминокислотной последовательности нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа В,

циркулировавших в 2003-2013гг...........................................................117

3.4.3. Филогенетический анализ последовательностей нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа

В/Ямагатской линии, циркулировавших в период 2003-2013гг......................121

3.4.4. Филогенетический анализ последовательностей нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа

В/Викторианской линии, циркулировавших в период 2003-2013гг...............123

3.5. Модификация лабораторного варианта тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации эволюционных

линий гриппа В........................................................................................................125

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................132

ВЫВОДЫ......................................................................................146

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВОЗ (WHO) - Всемирная Организация Здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

к-ДНК - комплиментарная ДНК

н.о. - нуклеотидный остаток

ОТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией

ОТ-ПЦР-РВ - ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ПЦР - полимеразно - цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЦЭЭГ - центр экологии и эпидемиологии гриппа

ВМ2- мембранный белок вируса гриппа В

СМ2 - мембранный белок вируса гриппа С

CDC&P- Центр по контролю за заболеваемостью и профилактики

FAM- 6-карбоксифлуоресцин

НА - гемагглютинин

НА1 - субмолекула гемагглютинина

НА2- субмолекула гемагглютинина

HI - гемагглютинина первого типа

НЗ- гемагглютинина третьего типа

HEX - флуорохром

IBHYpr - зонд для вирусов гриппа В В/Ямагатской линии IBHVpr - зонд для вирусов гриппа В В/Викторианской линии Ml - матричный белок М2 - мембранный белок

MDCK — перевиваемая линия ткани почки собак культура клеток (Madin-Darby Canine Kidney)

MMLV - обратная транскриптаза NIMR - Национальный институт Медицинских

Исследований (Лондон)

NA - нейраминидаза

NP- нуклеопротеидный белок

NS1 и NS2 - неструктурные белки

NB-трансмембранный гликопротеид вируса гриппа В

N2 -нейраминидаза второго типа

РВ1 и РВ2 - полимеразные белки

Список нуклеиновых оснований:

Сокращение полное название

английское русское

А А Аденин

G Г Гуанин

С Ц Цитозин

Т Т Тимнн

и У Урацил

Список аминокислот

Аминокислота Сокращение

русское английское однобуквенный код

Глицин Гли Gly G

Алании Ала Ala А

Валин Вал Val V

Лейцин Лей Leu L

Изолейцин Иле Ile I

Пролин Про Pro P

Фенилаланин Фен Phe F

Тирозин Тир Туг Y

Триптофан Трп Trp W

Серии Сер Ser S

Треонин Тре Thr т

Аспарагиновая кислота Асп Asp D

Глутаминовая кислота Глу Glu Е

Аспарагин Асн Asn N

Глутамин Глн Gin Q

Цистеин Цис Cys С

Метионин Мет Met M

Гистидин Гис His H

Лизин Лиз Lys к

Аргинин Apr Arg R

ВВЕДЕНИЕ Актуальность

Грипп и другие респираторные вирусные инфекции остаются одними из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. В России ежегодно регистрируют от 26 до 34 миллионов случаев острых респираторных вирусных инфекций, при этом грипп занимает в структуре ОРВИ до 5-10%. В отличие от других возбудителей ОРВИ вирусы гриппа А и В практически ежегодно вызывают эпидемические подъемы заболевания, а для вирусов гриппа А известны пандемические формы распространения.

Изучение молекулярной эволюции вирусов гриппа предоставляет важную информацию по их генезизу и особенностям распространения в разных странах мира. Вирус гриппа A(H3N2) начал циркулировать среди людей с 1968 года, вызвав пандемию «гонконского гриппа» и продолжает оставаться одним из доминирующих в этиологии эпидемий последнего десятилетия. Исследования филогенетических дендрограмм домена НА1 гемагглютинина подтипа ИЗ показали, что эволюционная изменчивость вируса гриппа A(H3N2) была представлена в виде кактус - подобной структуры, в которой большинство генетических линий исчезает в течение нескольких лет их циркуляции и только одна линия продолжает существовать между эпидемиями (Smith et al., 2004, Ghedin E., 2005). Интересным является факт появления вирусов подобных эталонному штамму А/Фуцзян/411/02 в сезоне 2003-2004, в следствие так называемого «прыжка» в эволюции вирусов A(H3N2), которые стали причиной значительной эпидемии и полностью вытеснили социркулирующие с ними вирусы гриппа A(H1N1) и В (Chi S.X., 2005, Barr I.G., 2005). Такой результат, вероятнее всего, оказался последствием селекционного давления, происходящего в результате непрекращающейся эволюции в ключевых антигенных сайтах (антигенный дрейф) (Lin Y.P., 2004).

Вирусы гриппа В также представляют определённый интерес, т.к. являются активными участниками многих эпидемических процессов. С 1988 г.

произошло «раздвоение» популяции вируса гриппа В на две антигенно различные ветви - В/Виктория/2/87-подобные и В/Ямагата/16/88-подобные. С тех пор вирус гриппа В эволюционирует двумя социркулирующими эволюционными линиями (Kanegae Y. et al., 1990; Rota P.A., 1990). До 2001 г. преимущественное распространение в мире получили штаммы, подобные В/Ямагата/16/88, между тем как В/Виктория/2/87- подобных представителей детектировали только на территории Юго-Восточной Азии (Chen R., 2008). С 2001 г. стали регистрировать совместную циркуляцию двух эволюционных линий, что привело к формированию реассортантов между ними, которые циркулировали во всем мире в период с 2002 по 2005 гг. (Matsuzaki Y., 2004, McCullers J., 2004).

Ежегодно вирусы гриппа вызывают эпидемии в обход уже существующего иммунитета благодаря постоянной мутационной изменчивости (антигенный дрейф) в гемагглютинине (НА), т.к. он является основной целью для антител, а также изменениям в NA и М-белке, связанных с чувствительностью к противовирусным препаратам. Поэтому большинство исследований молекулярно-генетического строения НА, NA и М-белка посвящено их эволюционным изменениям, в результате появления новых значимых мутаций.

С 1959 г. на ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ возложены функции одного из Национальных центров по гриппу, сотрудничающих с ВОЗ. В связи с этим, основными направлениями научно-практической деятельности центра являются: мониторинг циркуляции вирусов гриппа в России, изучение антигенных, биологических и молекулярно-генетических свойств. Проводимые нами молекулярно-генетические исследования циркулирующих в России вирусов гриппа являются неотъемлемой частью мониторинга гриппа в мире и используются ВОЗ при формировании состава гриппозных вакцин и рекомендаций по применению противовирусных препаратов.

В связи с вышесказанным, целью исследования было изучение молекулярно-генетических характеристик и особенностей эволюционной

изменчивости вирусов гриппа А(НЗШ) и В, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в период 2003-2013гг. в России.

Цели и задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить долевое участие вирусов гриппа А(НЗШ) и В в период эпидемических подъемов заболеваемости 2009-2013гг.

2. Подобрать репрезентативную выборку штаммов вирусов гриппа А(НЗМ2) и В, циркулировавших в РФ в период 2003-2013гг., для изучения их эволюционной изменчивости.

3. Разработать протоколы секвенирования генов вирусов гриппа А(НЗК2) и В, кодирующих НА, ИА и М-белок. С использованием разработанных протоколов получить геномные данные для изучаемых штаммов.

4. Модифицировать и адаптировать лабораторный вариант тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации эволюционных линий вируса гриппа В, с учётом особенностей циркулирующих в настоящее время штаммов.

5. На основе анализа полученных нуклеотидных последовательностей эпидемических штаммов вируса гриппа А(НЗК2) и В, идентифицировать в КА и М2-белке мутации, ответственных за устойчивость к противовирусным препаратам.

6. На основе полученных данных провести филогенетический анализ исследуемых штаммов вируса гриппа А (НЗШ) и В.

Научная новизна

1. Определено долевое участие вирусов гриппа А(НЗК2) и В в этиологии эпидемических подъемов заболеваемости в период 2009-2013гг., особенности их антигенны�