Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности эволюции вирусов гриппа в период 1986-98 гг.
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Особенности эволюции вирусов гриппа в период 1986-98 гг."
На правах рукописи
ИВАНОВА Валерия Тимофеевна
ОСОБЕННОСТИ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА В ПЕРИОД 1986-98 гг. (ИНДИКАЦИЯ, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА)
(03.00.06 вирусология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва -1998
Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской АМН.
Научный консультант: Заслуженный деятель науки Российской Федерации, профессор, доктор
медицинских наук А.Н.Слепушкин
Официальные оппоненты:
Член корреспондент Российской АМН, академик
Российской академии естественных наук, профессор,
доктор медицинских наук Ф.И.Ершов
Профессор, доктор медицинских наук Ю.З.Гендон
Доктор биологических наук Г.К.Воркунова
Ведущая организация - Государственный научно-исследовательски институт стандартизации и контроля биологических препарате им. Л.И.Тарасевича Министерства здравоохранения РФ.
Защита состоится " ^ _1998 года
в / часов на заседании специализированного совета Д001.20.02 при НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской АМН по адресу (г.Москва, 123098, ул.Н.Ф.Гамалеи, д. 16).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской АМН.
Автореферат разослан "/О" //£>¿<^-1 1998 года.
Ученый секретарь Специализированного Совета доктор
медицинских наук Н.П.Косякова
Актуальность проблемы
Заболеваемость Гриппом относится к одной из важнейших проблем медицинской науки и здравоохранения, т.к. грипп является массовой и неуправляемой инфекцией, ежегодно регистрируемой в различных частях земного шара. Несмотря на огромные усилия, предпринимаемые отечественными и зарубежными учеными, проблема гриппа еще далека от своего решения (Жданов и др., 1978, Киселев, 1997, Lamb, 1989, Lvovet al.,1993, Сох et al.,1995, Hay, 1997a).
Основная причина этого связана с естественной изменчивостью возбудителя, которая выражается в вариабельности первичных структур и соответственно свойств вирионных белков. К настоящему времени антигенный дрейф выявлен у вирусов гриппа А и В. Возникающие новые варианты преодолевают иммунитет населения, быстро распространяются, вызывая вспышки заболевания и эпидемии. В случаях появления совершенно нового вируса гриппа типа А человечество вовлекалось в пандемию гриппа А. Во время "обычной"эпидемии заболевает около 10% населения, при пандемии -80-100%.
Основными направлениями борьбы с гриппом являются надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика возбудителя и профилактика заболевания.
Россия и страны СНГ, входившие в состав СССР, занимают огромную территорию Евразии. Соседство со странами Юго-Восточной Азии, где впервые выделено большинство эпидемических и пандемических штаммов (Sholtissek et al.,1987, Webster et al.,1992), обусловливает быстрое проникновение и распространение новых вирусов на территории нашей страны, а затем и в мире. Поэтому изучение циркуляции вирусов гриппа в таком регионе земного шара, каким является Россия и страны ближнего зарубежья, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Надзор за распространением гриппа в нашей стране уже более 30 лет проводится в НИИ вирусологии РАМН, который сотрудничает по
гриппу с ВОЗ. Для успешного проведения этой работы используются отечественные штаммы из Государственной коллекции вирусов, Центра экологии и эпидемиологии гриппа, а также эталонные штаммы, рекомендованные и присланные ш Центров ВОЗ по гриппу.
Углубленное изучение эпидемических штаммов вирусов гриппа позволяет определить основные тенденции изменчивости вирусов гриппа А и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими и возникающими вновь в различных регионах земного шара. Результаты исследования не только расширяют наши теоретические знания об РНК-содержащих вирусах, но также имеют большое практическое значение как для расшифровки текущих, так и для прогнозирования грядущих эпидемий и пандемий.
Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы для проведения профилактических мероприятий (вакцинопрофилактики, создания противогриппозных вакцин, разработки специфических диагностических тест-систем). Успех вакцинопрофилактики зависит от многих факторов, в том числе от сходства антигенных детерминант вакцинных и эпидемических штаммов, иммуногенности вакцинных штаммов. Представляет определенный интерес исследование возможного влияния на изменчивость вирусов иммунитета, возникающего у привитых после вакцинопрофилактики с помощью живых и инактивированных гриппозных вакцин.
Особую роль в проблеме гриппа играет разработка новых методов диагностики вирусных инфекций. К началу наших исследований было известно ограниченное число тест-систем, используемых в иммунологических методах (РИА и ИФА). Были выявлены как достоинства, так и недостатки. Это побудило нас обратится к поиску и разработке новых диагностических систем. Нами впервые были использованы модификации флуоресцентных методов анализа для создания более совершенных и чувствительных методов индикации вирусов гриппа в биопробах.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлся этиологический надзор над распространением вирусов гриппа А и В в России и сопредельных государствах на протяжении 12 лег (1986-98) с последующим изучением молекулярно-биологических основ изменчивости вирусов гриппа и возможного влияния на нее поствакцинального иммунитета. В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило -определение этиологии эпидемий и подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ на территории России и сопредельных государств (СНГ, Чехия, Словакия);
-изучение вирусных популяций: сравнительный анализ антигенных, молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа А, В, изолированных в России со свойствами полипептидов референс штаммов,
-исследование свойств вирусов, изолированных из локальных вспышек и от спорадических случаев заболевания, не получивших широкого распространения;
-изучение влияния поствакциналъного иммунитета, возникшего после прививок живой или инактивированной вакциной на свойства эпидемических штаммов вируса гриппа;
-отбор наиболее активных изолятов для последующего детального изучения антигенной структуры их полипептидов и генома;
-создание вирусной коллекции из наиболее аюуачьных эпидемических штаммов, циркулировавших в Росит в последние 12 лет и эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ;
-разработка и адаптация методов и лабораторных тест-систем для индикации и исследования вирусов гриппа в различных материалах.
Разрабатываемая тема включена в планы научно-исследовательских работ НИИ вирусологии им .Д.И.Ивановского Российской АМН, комплексную программу борьбы с гриппом, программы работ по проблеме "Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение" Российской АМН и международного сотрудничества стран СЭВ по проблеме N4 "Грипп", в программу сотрудничества ВОЗ.
Работа была поддержана Международным научным фондом грант МА 3000,МА 3300; Российским фондом фундаментальных исследований грант N 93-04-7343 . Положения, выносимые на защиту
1. На основании анализа вирусов гриппа, вызвавших в России и странах СНГ за последние 12 лет эпидемические подъемы заболеваемости гриппом и ОРВИ, установлена активная циркуляция вирусов гриппа А и В, с периодами одновременной циркуляции вирусов с различной антигенной формулой. Выявлено антигенное родство вирусов гриппа А (Н1Ы1),А(НЗШ) и В, изолированных в России со штаммами, циркулирующими в Евразии, особенно в государствах Азиатско-Тихоокеанского региона.
Антигенный дрейф поверхностных белков зарегистрирован у вирусов гриппа А и В, однако характер эволюционного процесса имел свои особенности для вирусов гриппа -линейный для А/НШ1, А/НЗК2 и мультиплетный для В.
2. Определена и изучена новая ветвь эволюции вирусов гриппа В, циркулировавших в России с 1990г (В/Ямагата/16/88-подобные). Идентифицированные впервые в России в эпидемический сезон 1990-1991гг., эти вирусы доминировали в последующих эпидсезонах: 1992-93, 1995-96гг. заменив ранее эпидемически активные штаммы подобные В/Виктория/2/87. Новые штаммы имели существенные отличия в антигенных свойствах и первичной структуре поверхностных белков от штаммов подобных В/Виктория/2/87. Определены нуклеотидные и аминокислотные последовательности гемагтлютининов вирусов гриппа В- представителей обеих групп, выделенных в 1987-97 гг. Построена общая картина эволюционных связей генов гемагтлютининов вирусов гриппа В, изолированных с 1983 по 1993г. в России, Америке и Евразии.
3. Установлено, что вирусные белки у циркулировавших в последнее 12-летие штаммов А(НЗШ) характеризовались вариабельностью у внутренних белков и изменчивостью, носившей линейный характер у поверхностных полипептидов.
-Антигенный дрейф поверхностных белков соответствовал дрейфу в белках эталонов, расположенных в следующей последовательности: АУШанхай/11/89-А/Гуандонг/39/89-АУПекин/353/89-А/Пекин/32/92-А/Иогаш1есбург/33/94-АЛ1анчанг/933/95-А/Сидней/5/97.
-Впервые определены аминокислотные последовательности гемагглютинина у некоторых эпидемических штаммов 1993,1997г. изоляции.
-Вьивлена вариабельность в структуре NP и М белков у вирусов, изолированных в разные эпидемические сезоны, и общие эпитопы NP вирусов гриппа человека и животных с помощью моноклональных антител методом ИФА, ТФ РИА.
4. Выявлена особенность эволюционного процесса у вирусов гриппа A/H1N1 за последние 12 лет: после 5-летнего перерыва возврат в активную фазу в эпидемическом сезоне 1995-96гг. Вирусы A(H1N1) социркулировали с вирусами A(H3N2) и В, сохраняя ведущую роль в заболеваемости детей и молодых людей в сезоне 1995-96.
-Антигенный дрейф гемагглютинина изолятов A/HlNl-(95-98) соответствовал дрейфу в НА эталонов А/Тайвань/1/86 -А/Техас/36/91-А/Иоганнесбург/82/9б, подобный А/Байерн/95.
-Анализ антигенной активности НА и NP, проведенный с помощью моноклональных и поликлоналъных антител, показал гетерогенность вирусных популяций в одном эпидемическом сезоне.
5. Впервые при изучении иммуногенности гриппозных вакцин в широком эпидемиологическом наблюдении была использована предложенная нами модификация лектин-теста. Установлена высокая активность нейраминидазного компонента у отечественных живой и инактивированной гриппозных вакцин. Процент сероконверсий к нейраминидазе колебался в пределах 50% в зависимости от вида вакцин -ЖГВ А,ИГВ А, ЖГВ В и практически совпадал с сероконверсией к гемагглютинину.
6. Впервые показано, что для получения вирионных белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших высокую антигенную и иммуногенную активность, может быть использован электрофорез в агарозе. Предложенная модификация (введение предварительного этапа ферментативной обработки) позволяет получать внутренние белки (М и КР), сыворотки к которым специфичны, активны при изучении вирусов гриппа современными методами: радиоиммунным (ТФ РИА), иммуноферментным (ИФА) и иммунофлуоресцентным (ФИА).
7. Впервые для идентификации вируса гриппа в растворах были использованы новая флуоресцентная метка копропорфирин и высокоочшценные иммуноглобулины
выделенные из антисывороток к вирионным белкам с помощью каприловой кислоты. Чувствительность метода ФИА достигала 0,4 нг/мл вирусного белка. При использовании моноклональных антител к внутренним белкам в методе ФИА ВР максимальная чувствительность достигала 20 нг/мл вирусного белка. Научная новизна
В результате изучения молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа, циркулировавших в России в последнее десятилетие, установлены основные направления современной эволюции вирусов гриппа.
Впервые на территории России вьивлена новая ветвь эволюции вируса гриппа В -появление в России В/Ямагата/16/88-подобных штаммов, вызвавших эпидемии в 1990-91,1992-93, 1994- 1995 гг.
Определена структура гена гемаггаютинина впервые изолированных в Ри зарегистрированных в последующих эпидемиях представителей вирусов гриппа В нового направления изменчивости. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов и зарегистрированы заЫ 2278.
Выявлены особенности антигенного дрейфа вирусов гриппа А. Установлено, что изменчивость вирусов гриппа А/НЗШ продолжается в одном направлении, приводя к возникновению эпидемических подъемов гриппа в различных регионах страны.
Выявлен возврат в активную циркуляцию в 1995г. вирусов гриппа A/H1N1 после пятилетнего перерыва. В сравнении с вирусами A/H3N2 вирусы A/H1N1 характеризовались меньшей скоростью изменчивости и большими периодами затишья. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов и зарегистрированы за N 2331.
В процессе надзора за распространением гриппа в стране от больных ОРВИ изолированы парамиксовирусы ПМВ-2 антигенно родственные А/Цыпленок/Юкейпа/56.
Впервые метод лектин-тест был использован для изучения структуры иммунного ответа у вакцинированных (в частности антител к нейраминидазе). Показана высокая корреляция в динамике выработки антител к гемагтлютинину и нейраминидазе при вакцинации ИГВ и ЖГВ вакцинами.
Впервые показано, что модифицированный нами метод электрофореза в агарозе может быть использован для получения чистых внутренних белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших антигенную и иммуногенную активность.
Впервые, для индикации вирусов гриппа методом ФИА в растворах предложена оригинальная система, в которой использовались иммуноглобулины IgG, выделенные с помощью каприловой кислоты из антисывороток к белкам вируса гриппа и меченные новой флуоресцентной меткой копропорфирином. Чувствительность метода достигала 0.4 нт/мл вирусного белка. Практическая ценность
Полученные данные по идентификации вирусов гриппа, циркулировавших на территории СССР, России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции вирионных белков этих вирусов полезны в практическом плане при прогнозировании эпидемий и возможных пандемий. Отбор кандидатов в вакцинные штаммы основывался на характеристиках эпидемических штаммов.
Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств текущих штаммов вирусов гриппа включаются в информации, посылаемые в ВОЗ и органы
практического здравоохранения, Министерство здравоохранения РФ, областным, городским центрам Госсанэпиднадзора.
В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылаются ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входят в состав коллекций вирусов этих центров. В свою очередь, присылаемые из Центров ВОЗ эталонные штаммы после анализа включаются в Коллекцию вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа и наряду с отечественными штаммами используются для определения этиологии эпидемий гриппа в России.
В Государственную коллекцию вирусов депонированы 5 оригинальных штаммов, определивших новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа (регистрационные N 2016,2017,2132,2133,2278).
Коллекция вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа пополнилась штаммами (около 350), наиболее характерными для вирусных популяций ежегодных эпидемий гриппа (в течение 12 лет).
Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.
Практический результат диссертационной работы заключается также в усовершенствовании методов получения очищенных вирионных белков вирусов гриппа А, В, С, сохранивших антигенные и иммуногенные свойства, для последующего получения к ним иммунных сывороток. Полученные сыворотки используются для индикации и изучения свойств наружных и внутренних белков вирусов гриппа А, В и С (методические рекомендации были утверждены на Ученом Совете НИИ вирусологии и описаны в научных публикациях). Предлагаемая нами методика выделения иммуноглобулинов ^О из этих сывороток и меченных новой меткой копропорфирином может быть использована для индикации вирусов гриппа в флуоресцентном иммунном анализе.
Публикация работ
Основные положения диссертации отражены в 32 статьях, 8 тезисах докладов на международных и союзных конгрессах, съездах и конференциях, а также в методических рекомендациях. Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на 5 Республиканском съезде эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и гигиенистов ЭССР (Таллин, 1987), 6 Всесоюзном съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), Международной конференции "Выбор средств борьбы с гриппом 11"(Куршевиль, Франция, 1993), 9 Всемирном конгрессе по вирусологии (Глазго, Шотландия, 1993), 3 конгрессе Европейского общества по ветеринарной вирусологии (Интерлекин, Швейцария, 1994), 3 Азиатско-Тихоокеанском конгрессе по медицинской вирусологии (Пекин, Китай 1994 ), 25 Всемирном ветеринарном конгрессе (Йокогама, Япония 1996),7 съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва 1997), XXX Юбилейной международной конференции " Грипп -ХХ1век ", С.Петербург, 1997 .
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с А.Н.Слепушкшшм, Я.Закстельской, М.А.Яхно, Т.А.Оскерко, Е.А.Говорковой, Е.И., Бурцевой, Н.П.Обросовой-Серовой, Г.Н.Трушинской, Е.И.Исаевой, А.Л.Беляевым, О.В.Любовцевой, Т.Н.Власовой (НИИ вирусологии РАМН), А.П.Савицким (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также учеными из других стран: АКендал, М Хемпфилл (СДС, США), К Камерон, А.Хей (Национальный институт медицинских исследований Англия), Б.Тумовой, И.Кубиновой (Институт гигиены и эпидемиологии Чешской республики), Г.Русс, Е.Варичковой (Институт вирусологии САН, Словакия). Автор глубоко благодарен и признателен своим соавторам. Особую благодарность выражаю научному консультанту проф., дмн А Н Слепушкину и сотрудникам группы по надзору Т.А.Оскерко и ст. лаборанту О.А.Александровой.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоявшего из 84 работ отечественных и 315 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 274 страницах текста включая 43 таблицы и 26 рисунков.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы
В работе использовали вирусологические, серологические, иммунологические, молекулярно-биолотческие методы исследований. В исследованиях использовали эталонные штаммы :вирусов гриппа А, В и С, полученные из ВОЗ, и отечественные штаммы из Коллекции центра Экологии и эпидемиологии гриппа при НИИ вирусологии РАМН. Исследования проводились с помощью поликлональных сывороток, приготовленных нами к эталонным и эпидемическим штаммам, а также к изолированным полипептидам. Кроме этого, для изучения антигенных свойств наружных и внутренних белков были использованы моноклональные антитела, любезно предоставленные др. Р Вебстером (США) и др. Г Русс (Словакия).
Нуклеотидный и аминокислотных состав гемагглютинина вирусов гриппа А и В определяли в СДС Атланта США (др.А.Кендал) и в Институте медицинских исследований, Лондон, Англия (др.А.Хей).
РАЗДЕЛ А. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ПРИРОДЕ 1. Определение этиологии эпидемий гриппа в России в 1986-98гг.
На протяжении изучаемого периода (1986-98гг.) проводилось исследование гемагглютинирующих изолятов, поступавших из разных районов бывшего СССР в эпидемические периоды (обычно с декабря по март). В результате работы была определена этиология эпидемий в России и странах СНГ с 1985-97гг.(рис. 1, табл. 1).
% 100
90
70
60
• :Т
с-
лч;
V.
<Л\
л
•У-
ги
п
Обозначения вирусов гриппа:
А(Г11N1)
А(НЗН2)
В
ВЗ 1
Рис.¡Результаты идентификации вирусных изоляторов, поступивших в лабораториюэтиологиииэпидемиологии
гриппа в 1986- 91г г .
Таблица 1. Результаты идентификации вирусных изолятов, поступивших для исследования в период 1986-98гг.
Эпидсезон- Получено изолятов Идентифицировано вирусов Заложено в коллекцию
Всего А(НШ1) А(НЗК2) В Не грипп
число % число % число % число %
1986-87 136 78 59 73 14 18 5(ПМВ-2Х 55
1987-88 132 101 1 1 51 50 49 48 56
1988-89 97 71 51 71 5 7 15 21 35
1989-90 186 168 167 99 1 0,5 58
1990-91 97 86 5 5,8 1 1,1 79 91,8 57
1991-92 82 68 68 100 28
1992-93 64 9 9 100 9
1993-94 21 12 12 100 11
1994-95 33 29 29 100 14
1995-96 28 13 9 70 2 15 2 15 12
1996-97 23 8 1 12,5 3 37 4 50 6
1997-98 41 41 22 53 19 46 32
Итого 940 683 142 20,7 351 $2 179 26,2 5 373
Видно, что спектр доминирующих возбудителей менялся в зависимости от сезона, включая от 1 до Зх различных вирусов гриппа: А/НШ1, А/НЗШ, В. Определение антигенной структуры 683 идентифицированных изолятов показало, что 52% оказались вирусами А/НЗМ2, 20,7%-А/НШ1, 26,2% составляли вирусы гриппа В (рис.2).
СГЗ в (26.6%) I I НС грипп (0.9%)
Рис. 2. Спектр идентифицированных вирусных изолятов, поступивших для исследования в период 1986-1998' гг.
Анализу их свойств посвящены материалы дальнейших разделов. Следует отметить, что по данным вирусологических и серологических исследований было установлено, что в последние 2 эпидемические сезона в стране циркулировали одновременно 2 подтипа вирусов гриппа А(А/Н1М1, А/НЗШ) и вирус гриппа В. Аналогичные данные были получены в НИИ Гриппа Сомининой и др.,(1997г.)
Следует отметить, что после окончания эпидемического сезона наиболее интересные штаммы были лиофилизированы и депонированы в Коллекцию вирусов Центра экологии и этиологии гриппа, в Государственную коллекцию вирусов, а также в порядке обмена пересылались в Центры ВОЗ по гриппа в СДС (США), Институт
медицинских исследований Лондон, (Англия) и в социалистические страны во время двухсторонних соглашений.
В процессе эпидемического надзора были идентифицированы вирусы-анахронизмы, родственные А/Гонкснг/1/68 (H3N2). Исследование их антигенных свойств и полипептидого состава показало, что выделенные в 1986гг штаммы, являлись вариантами эталона А/Гонконг/1/68. Дальнейшие исследования аминокислотного состава гемашпотинина, анализ вирусов с помощью моноклональных антител подтвердили их принадлеяшость к вариантам A/H3N2, изолированным в 1968nr.(Yakhno et al.,1990, Lvov et al.,1993)
В 1986 г. при расшифровке вспышки ОРВИ в Мурманске бьиш изолированы 5 штаммов парамиксовирусов птиц типа 2, близких эталону А/цыпленок/Юкейпа/56 по антигенным свойствам и полипептидному составу. Аналогичные штаммы выделялись достаточно редко в нашей стране (0сидзе,1990, Саятов и др.,1992). Точных объяснений причин выделения парамиксовирусов пока не установлено, но в числе вероятных является возможность эпизоотий среди кур на ферме, откуда поступали эмбрионы для идентификации изолятов от больных. Не исключена также вертикальная передача. Штаммы вируса A/H3N2, подобные А/Гонгонг/1/68, и парамиксовирусы ПМВ2 дальнейшего распространения не имели. Следует отметить, что выделение в процессе надзора за распространением гриппа необычных вирусов-анахронизмов или птичьих вирусов явление крайне редкое, но тем не менее происходящее. Так в 1997г. Гонконге было обнаружено 18 случаев заболевания людей и было изолировано несколько штаммов вирусов гриппа, содержащих геном птичьего вируса A/H5N1 (MMR, 1997).
2. Изменчивость и особенности распространения вирусов гриппа A/H1N1
Вернувшись в человеческую популяцию в 1977г. (Закстельская и др.,1978) вирусы гриппа A/H1N1 сначала ежегодно, затем с интервалами циркулировали в разных странах. Они вызвали эпидемии в 1986-89гт., изолировались в спорадических случаях в 1990-94п\, затем были одним из основных эпидемических факторов в 1995-96гг. в
разных странах (\УЕ11,1996). Следует отметить, что основной контингент заболевших как у нас, так и за рубежом были дети.
2.1. Сравнительный анализ белков эпидемических штаммов, вызвавших эпидемии в 1986-87гг., 1988-89гг. в странах, имеющих общие границы с СССР.
Возврат в человеческую популяцию вирусов А/НШ1 поставил перед исследователями много вопросов, одним из которых явился следующий: каковы особенности этих вирусов в странах, имеющих общие границы. Проведенные нами исследования вирусов, изолированных в СССР и ЧССР в эпидемические периоды 1986-87,1988-89гг., показали, что эпидемические штаммы имели как сходство, так и отличия. Так все штаммы обнаруживали только одностороннее родство с прежним эталонами А/СССР/90/77, А/Чили/1/83, ингибиция гемагглютинации наблюдалась только с сыворотками А/Тайвань/1/86, А/Сингапур/6/86 .
Штаммы 1988-89гг выделения наиболее активно реагировали с антителами к А/Тайвань/1/86 и А/Сичуань/4/86. Однако у штаммов 1988-89гг выявлялась большая гетерогенность во взаимодействии с этими сыворотками. Колебания наблюдались в пределах от 1 до 1/8 гомологичного титра (табл.2).
Таблица 2. Антигенный дрейф НА вирусов гриппа А (H1N1) (РТГА).
Эпид Вирусы Сыворопш к штаммам
сезон
Эталонным Эпидемическим
Эталоны А/90/ А/Чил/ А/Тай/ А/Сич/ А/Тех/ А/361/ А/365/ А/51/ A/M/
77 83 86 88 91 86 86 88 95
А/СССР/90/77 Ш ■ ■ 1 1 в ■ И
А/Чили/1/83 i ■ ■ Б
А/Сннгапур/6/86 ■ 1
А/Тайвань/1/86 ■ и й
Отечественные штаммы периода 1986-89гг. находились как бы между тупиковой ветвью, представленной А/Чили/1/83 и доминирующей в настоящее время ветвью, маркированной А/Тайвань/1/86 (Сох е1 а1.,1993). Гетерогенность вирусной популяции в отношение антигенных свойств гемагглютинина была подтверждена в ИФА с помощью моноклональных антител к НА А/Сингапур/6/86. Взаимодействие вирусов с МКА варьировало от 1/2 до 1/8 гомологичного титра. При этом были обнаружены штаммы, которые МКА не опознавались.
Нейраминидаза штаммов 1988г была более гомогенна, чем гемагглютинин. Тем не менее и в ИА были выявлены антигенные детерминанты, отсутствующие у прототипа А/Чили/1/83 и свидетельствующие об изменчивости этого белка.
Анализ антигенной структуры ЫР изученных штаммов показал, что структура сайта № изменилась в процессе дрейфа вирусов А/НШ1. Вирусы 1977-83гг. изоляции взаимодействовали с МКА к № в 10 раз слабее, чем штаммы 1986г. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали, что в один эпидемический сезон в соседних странах могут циркулировать как одинаковые штаммы, так и штаммы, отличающиеся по антигенным и биологическим характеристикам белков. Это могло быть причиной различий в характере эпидемических ситуаций, которые наблюдались в СССР и ЧССР в 1986-89гг.
2.2. Возврат вирусов гриппа А/Н1К1 в эпидемический процесс 1995-96гг.и социркуляция их со штаммами А/НЗШ и В.
После 1989г. нами были изолированы 5 штаммов в спорадических случаях в эпидемический сезон 1990-91гг. Анализ этих штаммов показал, что 2 из них А/СССР/3/91 и А/СССР/4/91 антигенно близки прежним эталонам А/СССР/90/77 и А/Чили/1/83. У двух других вирусов выявлен сложный спектральный состав антигенных сайтов, так как они взаимодействовали не только с указанными эталонами прошлых лет, но и с сывороткой к эталону А/Техас/36/91. Между НА эталонов А/Тайвань/1/86 и А/Техас/36/91 выявлены отличия не только в антигенных свойствах,
но и в структуре НА (по 8 позициям аминокислот (57, 74, 135, 139, 153, 207 (Нау,199б).
Второй возврат в активную циркуляцию вируса гриппа A/H1N1 имел место в эпидемический сезон 1995-96гг., но они уже не доминировали как в 1977г. (Яхно и др., 1978), а социркулировали с вирусами гриппа A(H3N2) и В, о чем свидетельствовали данные по исследованию парных сывороток от переболевших. Так количество сероконверсией к A/H1N1 у обследуемых больных составляло 34% , а к A(H3N2) 31,9%.
Анализ вирусных изолятов A/H1N1/95 показал, что все они являются вариантами А/Техас/36/91. Вирусные популяции 1995г. были гетерогенны. Часть из вирусов А/Липецк/6/95, А/Липецк/7/95 были родственны по антигенным свойствам НА к эталонам А/СССР/90/77 и А/Чили/1/83.
Исследование штамма А/Лагайск/1/97 показало, что антигенные свойства его гемагглютинина близки к НА штаммов 1997г. Антигенный дрейф НА вирусов гриппа A(H1N1), представлен в табл.2.
Как показали наши исследования (табл.3), штамм А/Лагайск/1/97 отличался по структуре НА от А/Тайвань/1/86 по 14 аминокислотам и был сходен с А/Техас/36/91 (отличия по 7 аминокислотам: 47 Иле-Ала, 146 Арг-Лиз, 153 Лиз-Гли,18б Гли-Арг, 222 Гли-Асп, 261 Фен-Лей, 273 Асп -Гли ). НА А/Лагайск/1/97 также близок к НА А/Иоганесбург/82/96, отличаясь от последнего по 6 аминокислотам в позициях 35 Асн-Асп, 98 Гис-Тир,153 Глу-Гли, 186 Гли-Арг, 261 Фен-Лей, 273 Асн-Гли. Изменения происходили в позициях аминокислот соответствующих антигенных сайтов: 74-Cb,135-Ca2,153- Sb,157-Sa,222-Ca2.
Таблица 3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гемагглютинина НА1 вирусов гриппа A/H1N1
№ позиции Эталоны Эпид штаммы Антигенный
А/Тайвань/ А/Техас/ А/Иоган/ А/Лагайск/ сайт
1/86 36/91 82/96 1/97
35 D D N D
47 I I Т Т
57 I V V V
74 К Е Е Е СЬ
85 S Р Р Р
98 Y Y Н Y
135 А S S S Са2
139 К N N N
146 R R К К
153 Е К Е G Sb
157 S L L L Sa
186 G G G R
207 N S S S
222 G G D D Са2
261 F F F L
273 D D N G
В отличие от большинства изученных штаммов изменения у А/Лагайск /1/97 были в позициях в 190 и 202.( Hay at al., 19976). в районе антигенного сайта Sb по классификации сайтов НА Yates et al.,(1990). Следует отметить, что Sa и Sb являются сайтами, где наиболее активно происходили изменения в НА штаммов A/H1N1 195057 и 1977-83гг выделения (Raymond et al., 1986).
Сравнение НА штаммов A/H1N1, изолированных в разных точках земного шара, и эталонов А/Тайвань/1/86, А/Техас/36/91, показало, что изменения, регистрируемые у этих изолятов, выявлены также у НА штаммов, изолированных в Гонгонге (позиции 47 Иле, 146 Apr). В то же время были случаи, когда аминокислота, например, Иле (позиция 57), встречающаяся у НА штамма А/Тайвань/1/86, присутствовала у штаммов, изолированных в Европе и Австралии и отсутствовали у вирусов,
изолированных в Гонконге. В то же время у НА изолятов, поступивших из Гонконга, определяли оригинальные замены в позициях 43 Лей ,71 Иле, 80 Вал, 133 Сер, которые не наблюдались в НА изолятов, выделенных в других частях света (Нау, 19976). Возможно, в дальнейшем подобные штаммы получат распространение.
Таким образом, анализ вирусов гриппа A(H1N1), изолированных в 1995-97гг., показал, что они бьош антигенно родственны эталону А/Техас/36/91, эволюционно связанному со штаммом А/Тайвань/1/86. По-видимому, мутации, происходящие в молекуле НА А/Тайвань/1/86, были столь эпидемически актуальны, что его дрейфовые варианты -А/Техас/36/91-подобные штаммы приобрели эпидемическую значимость для: всех регионов мира. Анализ штаммов A(H1N1), изолированных в один и тот же эпидемический сезон в сопредельных государствах, выявил наличие в вирусных популяциях как одинаковых штаммов, так и штаммов, отличающихся по антигенным и биологическим свойствам поверхностных белков, что может быть обусловлено различиями в гене НА этих изолятов.
Что касается второго поверхностного белка -нейраминидазы, то анализ эпидемических штаммов показал антигенный дрейф NA в направлении А/Чили/1/83 -А/Тайвань /1/86 -А/Техас/36/91. Об изменениях в структуре NA современных штаммов свидетельствует также отсутствие взаимодействия сыворотки А/Техас/36/91 с NA штаммов 1977-83 гг.
Выявленная нами гетерогенность внутреннего белка NP также свидетельствует о процессе изменчивости в этом консервативном белке, что согласуется с данными, представленными в работе Goiman et al.,(1991).
Таким образом, проведенные исследования показали, что циркуляция вирусов A/H1N1 представляет волнообразный процесс: наблюдаются периоды активизации и затишья. Эволюционная изменчивость наиболее выражена у поверхностных белков НА и NA отечественных штаммов. Аналогичные данные были получены (Сох, Bender., 1995) при изучении вирусов выделенных в других точках земного шара. Следует отметить, что антигенный дрейф белков современных вирусов А/Я INI
является продолжением антигенного дрейфа, зафиксированного ранее в периоды 1977-1986гг. различными методами: ТФ РИА (Трушинская и др., 1983), олигонуклеотидным картированием (Сох й а1.,1987), секвенированием Сох е1 а1.,1993).
В настоящее время отмечается продолжение антигенного дрейфа в штаммах, циркулирующих как в нашей стране, так и за рубежом в направлении эталона А/Берн/7/95. Выделение штаммов А/Юхань/3 71/95 и А/Пекин/262/95, сыворотки к которым слабо взаимодействуют с А/Техас/36/91 (1:32 и 1:64), дало основание включить штамм А/Пекин /262/95 в состав противогриппозных вакцин, рекомендованных ВОЗ на 1997-98гг (ЛУБЯ, 1997, N9).
Согласно нашим данным, только один штамм А/Москва/17/98 из поступивших в 1997-98гг обладал аналогичными антигенными свойствами. В основном же популяции вирусов А(НШ1) состояли из штаммов, родственных А/Иоганесбург/82/96, который существенно отличался от А/Пекин/262/95 (на 1:32 гомологичного титра). Серологические данные, полученные на базе 2-х городов - Новгорода и Владимира, подтвердили вирусологические. В частности, прирост антител в сыворотках переболевших наблюдался только к А/Иоганесбург/82/95. Редкая регистрация вариантов аналогичных А/Пекин/262/95 в сезоне 1997-98гг. была отмечена также Литвиновой и др. (1998), анализировавшей изоляты, поступившие из разных регионов нашей страны. Совокупность полученных данных предполагает возможность активной циркуляции этого штамма в сезоне 1998-99гг.
3. Сравнительное изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа А/Н3№, выделенных в эпидемиях 1986-98гг. 3.1. Изучение антигенного дрейфа поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы с использованием поликлональных и моноклональных антител.
Изменчивость, как свойство полипептидов наиболее выражена у вирусов гриппа с антигенной формулой А(НЗШ). В период 1989-1988г. подъемы заболеваний, вызванные этим вирусом, наблюдались в 6 раз: 1989-90, 1991-92, 1992-93, 1993-94, 1995-96, 1996-97, 1997-98гт. На протяжении изучаемого периода 1986-98гг. было
идентифицировано 351 штамм A(H3N2). Предварительно проведенный анализ выявил активный дрейф молекулы гемагглютинина, штаммы с разницей в годах изоляции в 5 лет практически не содержат антигенных детерминант, опознаваемых с помощью поликлональных сывороток к эталонным штаммам последующих лет.
Анализ вирусных популяций исследуемого периода лет показал, что в основном штаммы одного эпидемического сезона, близкие одному референс штамму, несколько отличались по антигенным свойствам, то есть, для вирусов гриппа A(H3N2) характерна гетерогенность. Аналогичные данные были получены Yakhno et al.,(1990) при изучении вирусов гриппа A(H3N2) в предыдущие периоды наблюдения. Несколько иная ситуация была в 1991-1992гг., когда вирусная популяция условно могла быть разделена на две группы: большую составляли штаммы, подобные А/Пекин/353/89, а меньшую - родственные А /Шанхай/16/89.
В исследуемый период антигенный дрейф в молекуле НА наблюдался в направлении изменений НА эталонов: А/Шанхай/11/89- Гуандонг/39/89-АУПекин/353/89-А/Пекин/32/92- А/Иоганнесбург/33/94- А/Нанчанг/933/95 (табл. 4). Аналогичные данные были получены при исследовании изолятов из других частей света (Сох, Bender, 1995,). Анализ штаммов эпидемий последних лет позволил отметить, что с наряду с ярко выраженным антигенным дрейфом, у штаммов 199597гг. присутствовали антигенные детерминанты эталона А/Гуандонг/39/89. Выявлены также штаммы, такие как А/Могилёв/97, которые были как бы переходными между двумя эталонами А/Иоганнесбург/33/94 и А/Нанчанг/933/95 (табл.4).
Антигенный дрейф НА был также подтвержден в РТГА с набором моноклональных антител (МКАТ) к НА эталона А/Филиппины/2/82. Анализ штаммов, изолированных в период 1977 - 1994гг., показал наличие эпитопов двух типов: первые регистрировались только с 1980 по 1987гг., и вторые, чья структура окончательно изменилась в 1993-94гг.
Таблица 4. Антигенный дрейф гемаггшотишша вирусов гриппа А (НЗК2) (1968 - 1997) (РТГА).
Эпид сезон Сыворотки Штамм А/ гк /1/68 А/ П.Чал /1/73 М Тех /1/79 А/ Бан /2/82 А/ Фил /2/87 А/ С ич /2/87 А/ Шан /11/88 А/ Шан /16/89 А/ Пек /353/ 89 А/ Гуан /32/89 А/ Пек /32/92 А/ Шанг /9/93 А/ Иоган /33/94 А/ Нанч /933/ 95 А/ Москва/ 2/97
А/ГК/1/68 11 £ > 1 ¡1 а ■
А/П.Чал/1/73 ' Ь 'Л Я 53 13 1 1 л 1 ц
А/Гех/1/77 Г , т-,1 'Л а 1 И и 1 1 С]
А/Баи/1/79 з а 1 ^ I ■ II 1 I 1 ¿•Л
1986-87 1987-88 А/Фил/2/82 1 в д 1 Л Я 9 « II1
1987- 88 А/Сич/2/87 1 1 ьъЛ Р ' ■ ж I» рз я
1989 -90 А/Шанх/11/87 1 1 I 1 •■ а р1 и - А Ч
¡991 -92 АуШанх/16/89 * 1 в ¡3 Ш а
1991 »92 Л/Пск/353/89 I 1 1 и . 1 ОЫ мА и
А/Гуап/39/89 ■ 9 1 И £1
1992-93 А/Пек/32/92 1 1 ч 1 Р Г □ я
1993 - 94 А/Шонг/9/93 1 1 5 ! а ш ■ н ш а
1995-96 АЛ1огап/33/94 I в 1 * 9 Г Г Г Г а
1996-97 А/Нанч/933/95 1 * Л 3 Г Г Г Г а м Л
1995 А/М1ШСК/452/95 й ■ > 3 г Г Г Г а НС НС й!
АУМш1ск/466/95 1 » Ё Е 2 К и | Л НС НС
1996-97 А/Москва/1/97 I 1 г 1 Г Г Г У Л р НС 'йи
АУМосква/2/97 * 1 ! р г Г £-3 л У НС
А/Мопшсв/97 1 1 1 " г Г Г | нс | НС НС
Выявленный ранее дрейф молекулы NA (Масалова,1988) продолжался активно и изучаемый период. NA эпидемических штаммов взаимодействовали с сыворотками к эталонам А/Шанхай/16/88 и А/Гуандонг/39/89 и не взаимодействовали с сывороткой к А/Сичуань/2/87, являющимся эталоном предыдущих лет. 3.2.0собенности структуры гемагглютинина эпидемических штаммов.
Исследование гена гемагглютинина эталонньк вариантов A(H3N2) показало, что эти штаммы находятся на одной эволюционной ветви, начало которой маркируется штаммом А/Пекин/353/89. Появление очередного варианта характеризовалось одновременной заменой по 4-м позициям аминокислот, расположенных в 3-х антител-связывающих сайтах (Сох et al., 1993).
Сравнительное изучение гемагглютинина отечественных штаммов и эталонных, выявило отличия в антигенных свойствах, которые могли отражать структурные изменения в молекуле НА.
Анализ аминокислотной последовательности НА1 эталона А/Пекин/32/92 и отечественного штамма А/Н.Новгород/3/93 выявил замены в следующих позициях: 121 Иле - Лиз, 186 Арг-Глу (сайт В). В то же время у штамма А/Владимир/5/93 были выявлены дополнительные замены относительно НА эталона: позиции 135 Гли -Лиз (сайт А), 226 Асн-Асп. Существенно отметить, что у обоих отечественных штаммов отсутствовал Сер позиция 156 (сайт В) и Тре позиция 214.
Одинаковое количество замен в НА1 не сопровождается одинаковым изменения во взаимодействии с антителами. Так уменьшение взаимодействия с антителами к А/Пекин/32/82 (до 1/2 титра) наблюдалось только у штамма А/Н.Новгород/3/93, хотя число замен было одинаково- 6, как у НА А/Владимир/5/93. Из этого следует, что антигенные отличия, выявляемые с помощью поликлональных антител (крысиных сывороток), зависят от места и числа мутаций в генах гемагглютинина.
Степень близости антигенных свойств НА эпидемических штаммов и эталонов коррелирует с числом замен в аминокислотной последовательности НА.
Гемагглютишш штамма А/Москва/2/97 отличается от НА эталона А/Иоганнесбург/33/94 по 16 аминокислотам, от НА А/Нанчанг/933/95 по 3 аминокислотам в позициях 80 Глн-Лиз, 92 Лиз-Тре, 275 Гли-Асп, от НА А/Юхань/359/95 по 3 аминокислотам в позициях 190 Асп-Вал, 194 Иле-Лей, 275-Гли-Асп. Изменения регистрировались в следующих антигенных сайтах: А, В.Д и в соседних аминокислотах (274,277) сайта С (табл.5). Сходство структуры НА А/Москва/2/97 с НА А/Нанчанг/933/95 соответствовало активности антител в сыворотках к А/ Нанчанг/933/95 с А/Москва/2/97. Так НА штамма А/Москва/2/87 полностью нейтрализовался антителами к А/Нанчанг /933/95 и только на 1/4 с антителами к А/Иоганнесбург /33/94.
Сравнении НА вирусов A/H3N2, изолированных в эпидемический сезон 1996-97 в различных странах, и эталонов показало, что наиболее часто изменения происходят в позициях 57 Apr- Глн, 80 Глн-Лиз, 92 Лиз-Тре район 121-122-124, 133 Асп-Лиз, в районе 194-198, 227 Глн-Иле и 275.
Таблица 5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей НА1 вирусов гриппа А/НЗЫ2
Подобных А/Пекин/32/92 Подобных А/Нанчанг/933/95
№ Эталоны Эпид. штаммы Ант. № Эталоны Эпид. штамм Ант.
позиции А/Англия /261/91 А/Пек/ 32/92 А/Н.Нов/ 3/93 А/Влад/ 5/93 Сайт позиции А/Иог/ 33/94 А/Нан/ 933/95 А/Юх/ 359/95 А/Мос /2/97 сайт
121 I I К I 47 Р Б Б Б
135 в в в К А-137 80 с> 0 К Е
157 Ь Б ь ь В 92 К К к т
189 Б Я <2 Б 120 I Т Т т Т
214 I Т I I 125 N Р р р Р
226 Ь <3 ь О 136 К Т т т А-137
246 N N N Б 141 N К к к
276 N Т N N С-277 172 О О й о
190 Б V Б V В
194 Ь ь I ь В
197 К с> 0 0 в
216 о N N N 0-217
219 У Б Б Б Б-220
226 0 I I I
262 N Б Б Б
275 в в в О
278 Б N N N С-277
Примечание А/Пек/-А/Пекин/, А/ Нов/-А/Нижний Новгород/, А/Влад/ А/Владимир/, А/Иог/-А/Иоганнесбург/, А/Нан/-А/Нанчанг/, А/Мос/-А/Москва/
3.3. Антигенная вариабельность внутренних белков.
Известно, что внутренние белки М и NP вируса гриппа А характеризовались наличием нескольких антигенных сайтов (Van Wyke et al., 1980,1984). Проведенные нами исследования выявили наибольшие изменения в NP белках вирусов A(H3N2)1989-1993rr. изоляции в сайте, опознаваемым моноклоном 5/1. Это свидетельствовало об изменении структуры соответствующего сайта за рассматриваемый период
Что касается более консервативного белка М, то небольшие изменения в его структуре были выявлены в сайте, взаимодействующем с 3 МКА.
При рассмотрении внутренних белков NP вирусов гриппа А человека и животных, выделенных в период с 1934 по 1990гг ,была установлена общая детерминанта, которая не регистрировалась у вирусов гриппа А, начиная с 1980г. выделения. Полученные данные свидетельствуют об эволюционных изменениях NP белка, и коррелируют с данными Webster et al.,(1992).
3.4. Анализ штаммов и сывороток от больных, ранее привитых противогриппозными вакцинами.
В литературе в основном предоставлены результаты изучения штаммов, изолированных от больных во время эпидемических подъёмов, которые как правило ранее не были вакцинированы. Мы провели исследования биопроб (вирусов и сывороток) от лиц, вакцинированных осенью 1989 и 1990гг. живой и инактивированной гриппозными вакцинами, содержащими штаммы, подобными А/Сичуань/2/87 (H3N2) и А7Тайвань/1/86(НШ1).
Анализ изолятов, показал, что поствакцинальный иммунитет не влиял на антигенную характеристику вновь изолированных штаммов. У вакцинированных детей были изолированы штаммы аналогичные А/Сичуань/2/87 и новые, подобные эталонному штамму А/Шанхай/11/87. Популяция вирусов была гетерогенна как по антигенным, так и биологическим свойствам.
Влияние вакцинации было выявлено при изучении иммунологических сдвигов в парных сыворотках от больных. Как показали результаты переболели дети, не получившие после вакцинации защитного титра антител к эпидемическому штамму > 1:40.
3.5. Использование лектин- теста для определения динамики роста антител к нейрамшшдазе при вакцинации школьников.
Обычно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается по интенсивности выработки противовирусных антигемагглютининов в РТГА. Несмотря на то, что антинейраминидазные антитела, играют важную роль в формировании прививочного иммунитета к ЖГВ (Найхин и др.,1985, Slepushkin et al.,1971) сложность, возникающая при использовании стандартных методов (трудоемкость, набор редких реактивов и т.д.), привела нас к предположению о возможности использования в этих целях лектин-теста, предложенного (Luther et al., 1979, Любовцева, Закстельская,1984) для анализа антигенной структуры NA эпидемических штаммов.
Разработанная нами модификации лектин теста, была апробована при исследовании сывороток детей вакцинированных противогриппозными вакцинами. Согласно полученным данным, после вакцинации ЖГВ и ИГВ наблюдался достоверный прирост антител. В случае с ЖГВ типа А-он регистрировался в 48%, ЖГВ типа В -51%, что коррелировало с приростом антител к гемагтлютшпшу. В зависимости от групп наблюдений процент совпадений результатов колебался для ЖГВ типа А в пределах 62-88% и 92 % для ЖГВ типа В.
В случае с ИГВ также регистрировался прирост антител к обоим типам нейраминидаз, он был статистически достоверен -t = 5,00 , 5,66. И здесь результаты коррелировали с данными РТГА, процент совпадений варьировал от 81% до 89%.
Полученные данные указывают, что лектин-тест благодаря простоте постановки позволяет проводить большие объёмы исследований при изучении иммуногенности гриппозных вакцин типа А и В, наряду с традиционными РТГА и современными методами- иммуноферментным и микро-нейтрализацией (Obrosova-Serova et al.,1990).
4.Новое направление эволюции вирусов гриппа В
4.1.Сравнительный анализ эпидемически активных вариантов (В/Виктория-подобных) и новых (В/Ямагата-подобных) вирусов гриппа В, вызвавших эпидемию в 1990-91гг. в России.
На основании изучения антигенных и молекулярно-биологических свойств вирусных изолятов 1940-1987гг. Yamashita и др.,(1988) показали, что эволюционный процесс вирусов гриппа В можно представить в виде дерева с разветвленной кроной. Согласно этой модели одновременно могут социркулировать вирусы, принадлежащие различным эволюционным ветвям. Одним из таких вирусов смог стать, штамм В/Ямагата/16/88, изолированный впервые в мае 1988г. в Японии во время 2-х локальных вспышек (WER ,1989). В Европе и в США этот вирус был впервые зарегистрирован в период 1990-91 гг. Антигенные варианты этого вируса нами были впервые зарегистрированы в Москве в декабре 1990 г. и отосланы в Международные центры по гриппу в США и Англию (Иванова и др., 1993). Всего за этот период было идентифицировано 69 вирусов гриппа В. Анализ антигенных свойств вирусов гриппа В, циркулировавших в России и за рубежом в этот период, выявил сходство в составах вирусных популяций (Rota et al., 1992).
Согласно нашим данным эпидемия 1990-91гг. в России была вызвана социркуляцией вариантов нового штамма В/Ямагата/16/88 и вирусов, подобных ранее циркулировавшим ранее штаммам В/Виктория/2/87. Данные полученные в НИИ гриппа при анализе изолятов 1991г (Черноокая и др.,1993, Гринбаум и др.,1994), а та клее в других странах (WER,1991, Rota et al.,1992) подтвердили наши исследования.
Изучение антигенных свойств гемагглютинина эпидемических штаммов показало, что они делятся на 2 группы, одна из которых представлена штаммами родственным предшествующему эталону В/Виктория/2/87 (табл.6).
Таблица 6. Антигенные и биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа В, изолированных в СССР в 1990-91 гг.
РТГА сыворотки нормальные Термо-
сыворотки чувст.
Штаммы В/СССР/ В/Энн В/Вик/ В/Ям/ В/Гуан/ В/Мое/ кро- кры- 56°С
100/83 Арбор / 1/86 2/87 16/88 55/89 2/90 лич. син.
Т1 Т2
Эталоны
В/СССР/100/83 640 20 40 <20 <20 <20 40 <20 64 32
В/Эн Ар/1/86 80 320 40 <20 <20 <20 20 <20 64 32
В/Викт/2/87 <20 40 320 <20 <20 <20 40 <20 64 64
В/Ям/16/88 80 40 <20 2560 2560 1280 20 <20 64 32
В/Гуан/55/89 <20 <20 20 640 2560 1280 <20 <20 128 16
В/Моск/2/90 20 <20 20 640 640 1280 20 <20 128 16
В/Вик/2/87-подобные
В/Нов/60/91 160 80 640 <20 <20 <20 НС не 256 0
В/Нов/53/91 80 40 160 <20 <20 <20 80 <20 128 0
В/Нов/58/91 40 20 160 <20 <20 <20 160 <20 64 0
В/Моск/5/91 40 40 160 <20 <20 <20 80 20 64 8
В/Влад/41/91 80 20 80 <20 <20 <20 80 20 128 128
В/Нов/12/91 40 20 80 <20 <20 <20 40 <20 64 0
В/Нов/21/91 40 20 80 <20 <20 <20 80 20 512 0
В/Моск/46/91 20 20 40 <20 <20 <20 80 <20 64 64
В/Моск/47/91 20 <20 40 <20 <20 <20 2560 640 64 64
В/Влад/71/91 <20 <20 40 <20 <20 <20 80 320 64 0
В/В лад/79/91 <20 <20 40 <20 <20 <20 640 640 128 0
В/Ямагата/16/88-подобные
В/В лад/40/91 НС НС НС 1280 2560 1280 не НС 128 8
В/Костр/49/91 <20 20 <20 1280 2560 640 320 160 64 16
В/Костр/50/91 <20 80 <20 2560 2560 640 40 160 64 64
В/Костр/51/91 <20 40 <20 1280 2560 640 320 80 64 64
В/В лад/42/91 <20 40 20 640 2560 1280 320 160 128 32
В/В лад/70/91 20 20 40 640 1280 640 40 20 128 0
В/Нов/19/91 40 <20 <20 320 640 640 40 <20 256 128
В/Чеб/68/91 . 20 <20 <20 320 320 160 40 <20 512 0
В/Нов/11/91 40 <20 <20 160 640 640 160 <20 128 0
В/Нов/16/91 20 <20 <20 160 320 320 40 <20 128 128
В/Моск/48/91 НС НС <20 160 320 320 НС НС 64 64
Другая группа штаммов была близка к эталону В/Ямагата/16/88. Следует отметить, что внутри каждой группы штаммы были неоднородны по антигенным и биологическим свойствам (степень нейтрализации варьировала от 1 до 1/16 гомологичного титра). Нейраминидазный компонент также претерпел определенные антигешше изменения и опознавался сыворотками к эталонам на 1/3 гомологичного титра. Анализ эпидемических штаммов с помощью моноспецифических антител, выявил как общие сайты, так и оригинальные, специфические сайты для В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88-подобных вариантов.
Анализ данных по взаимодействию МКА к НА в/0регон/80 с представителями обеих групп вирусов показал, что активность вирусов родственных В/Ямагата/16/88 понижается или не проявляется вообще по сравнению с В/Виктория/2/87-подобными вариантами.
4.2. Структурные изменения в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа В в процессе естественной изменчивости.
Эталонные штаммы В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 отличаются друг от друга по 27 аминокислотам. Основные изменения в аминокислотной последовательности НА1 выявлены в основном в области между позициями аминокислот 100 и 200 (Rota, Hemphill et al., 1992).
HA1 антигенного варианта В/Новгород/21/91 отличался от прототипа В/Виктория/2/87 по 8 аминокислотам (табл.7). Сходные изменения наблюдались в других В/Виктория -подобных штаммах, циркулировавших в течение 1989-90гг. Они регистрировались в позициях 73 Мет-Тре, 137 Вал-Иле. Кроме того, уникальные изменения в позиции 129 Тре-Лиз и в позиции 172 Про-Сер были обнаружены еще в изоляте В/Виктория/19/89, который отличался от В/Новгород/21/91 по 6 аминокислотам (Rota и др., 1992).
Таблица 7. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гемагглютинина НА1 вирусов гриппа В
Подобных В/Викто рия/2/87 Подобных В/Ямагата/16/88
№ Эталон Эпидемич штамм № Эталон Эпидемич штамм № Эталоны Эпидемич штамм
позшщи В/Виктор/ 2/97 В/Новг/ 21/91 позиции В/Ямаг/ 16/88 В/Моск/ 2/90 позиции В/Пан /45/90 В/Пек/ 184/93 В/Моск/ 1/97
73 М Т 37 М V 42 А G А
81 А V 129 R G 56 N N Т
129 Т К 197 D N 75 Т Т I
137 V I 199 Т А 111 Н Н К
172 р S 203 К N 121 R К К
197 Б н 230 D G 146 V А А
202 V А 298 А Е 147 Т Т S
330 К N 320 К N 150 D S S
184 G G Е
197 D N N
233N D D D
268 V V I
199 К К Е
Примечание : В/Викгор-В/Викгорня, В/Новг-В/Новгород, В/Пан-В/Панама-,В/Ямаг-В/Ямагата, В/Пек-В/Пекин,
В/Моск-В/Москва
- БАИПШЮ163/90 -ЯМАГ.У1 А/1 6/88 ГОНГКОНГ/22/89 МОСКВЛ/2ЛО ВИКТОРИЯЛОЗ/89 ГОИГКОНГ/Н/8Я ВИКТОРИЯ/2Л7
i-НОВГОРОД/21/91
L- ВИКТОРИЯ/19/89 1— СССР/2/87 I- ОГАЙО/КШ
• ПЕКИН/1/87
СИНГАПУР/222/79
Размер: 8 мугаиии
Рис. 3. Эволюционные связи гена НА вирусов гриппа В (1983-1993)
Эволюционная картина связей гена гемагглютинина вирусов гриппа, изолированных в нашей стране, в период с 1983-93гг. и эталонов представлена на рис.3. Гемагглютинин штамма В /Москва/2/90 отличался от В/Ямагата/16/88 по 8 аминокислотам (16 нуклеотидов). Наиболее близок он был к штаммам В/Гонконг /14/88 и В/Викгория/103/89. Наряду с утпсальным изменением в позиции 129 Арг-Глн он отличался от В/Гонконг/14/88 и В/Виктория/103/89 по 3 аминокислотам (Rota, Walis, 1990 г)
Сравнительный анализ НА1 штаммов 1940-8бгг изоляции показал, что в молекуле НА1 вирусов гриппа В наиболее вариабельные участки находятся в позициях 70-90, 120-203, 235-240, 265-270 (Bootman, Robertson, 1988). Полученные нами данные
показывают, что изменения в этих зонах приводят к появлению новых вариантов вирусов в последующих эпидемических сезонах (1986-97).
При исследовании аминокислотной последовательности НА штамма В/Москва/1/97 и соответствующих эталонов оказалось, что она наиболее близка к НА В/Пекин/184/93, отличаясь от него по 8 позициям (42,56,75,111,147,184,268,299).
При сравнительном анализе изменений в НА изолятов 1997г, полученных из других стран мира, установлено, что в основном у штаммов, изолированных в Европе, изменения относительно эталонов зарегистрированы в позиции 179 Тир-Гис. Изменения в аминокислотной последовательности в других местах НА зависели от штамма. Интересно отметить, что Вал (позиция 181), присутствующий в эталонах В/Панама/45/90 и В/Пекин/184/93, отсутствовал у НА вирусов, изолированных в разных точках земного шара в этом эпидемическом сезоне (Нау, 19976). 4.3. Антигенный дрейф поверхностных белков у В/Ямагата-подобных вирусов, доминирующих в настоящее время в вирусных популяциях.
Анализ вирусов гриппа В, изолированных 1993-97 г., показал, что эти вирусы гриппа не обладают антигенной детерминантой типичной для В/Виктория/2/87. В самом НА штаммов родственных В/Ямагата/16/88- происходили дальнейшие изменения, в результате которых штаммы 1995-97гг. взаимодействовали с сыворотками к эталонам этой группы В/Ямагата/16/89 и В/Панама/45/90 в основном от 1/4 до 1/16 гомологичного титра. Вирусная популяция 1997г была неоднородна по антигенным свойствам, так как взаимодействие вирусов с сывороткой к В/Владимир/ 5/95 варьировало от 1/16 до полного титра в зависимости от штамма.
Что касается нейраминидазы, то она также претерпела эволюционные изменения с 1986г. Если эталоны В/Виктория/12/87 и В/Эн Арбор/1/86 обнаруживали взаимное родство на 1/4 титра, то со штаммами группы В/Ямагата/16/88 сгауация иная. В этой группе вирусов антигенный дрейф привел к тому, что взаимодействие новых штаммов с сыворотками к В/Виктория/2/87 -подобным штаммам не превышало 1/32 гомологичного титра.
Исследования NA внутри группы В/Ямагата/16/89 показали, что наиболее ярко изменения проявляются по-видимому с 1993г. Так NA штаммов 1995г. слабо взаимодействовали с сыворотками эталонов прежних лет (до 12%). Таким образом, проведенные исследования показали, что у выявленной нами новой ветви гриппа В вирусов шел интенсивный антигенный дрейф поверхностных белков, активизировавшийся в последнее время.
На основании анализа гемагглютинина различных штаммов гриппа В 1979-91гг изоляции установлено, что скорость изменений в нуклеотидной последовательности для НА1 составляет 0,236% НА ,196 2% в год, однако скорость аминокислотных замен составляет 9,30% в год по сравнению с 0,056% для НА2. Скорость замен для вирусов гриппа В на 30% меньше, чем для вирусов гриппа A (Rota, Hemphill et al.,1992).
Следует отметить возможность эпидемий, обусловленных не запрограммированным эволюционным процессом анахронизмами. Так весной 1997г. по данным ВОЗ (WER, 1997а) в Китае были выделены .антигенные варианты В/Гуандонг/ 5/95, родственные В/Виктория/2/87). Аналогичные вирусы продолжают выделять в Китае и в настоящее время (WER, 19976).
4.4. Анализ материалов, полученных от школьников, привитых противогриппозными вакцинами, содержащих В/Виктория-подобный вакцинный штамм, в эпидсезон 1990-91гг.
В данном разделе представлены результаты изучения возможного влияния поствакцинального иммунитета на циркуляцию и свойства вновь изолированных вирусов гриппа типа. Объектом исследования стати штаммы, выделенные от больных в Новгороде во время эпидемического сезона 1990-1991гг*. Как было отмечено ранее, эпидемия 1990-91гг. в России была вызвана социркуляцией двух антигенно отличных вирусов гриппа В. В городе было изолировано 44 штамма, среди которых 12 от больных вакцинированных осенью 1990г. тривакциной (табл.8).
Таблица 8. Штаммы, изолированные от вакцинированных в Новгороде в 1991 г.
Вирусы Сыворотки к вирусам (РТГА) Тип вакц. Термочувствит. (РТГА) Нормальные сыворотки
В/Вик/ 2/87 В/Ям/ 16/88 В/Гуан/ 55/89 В/СССР/ 2/90 Т1 Т2 Кролич крыс мыш
В/Нов/30/91 320 0 0 0 НТВ 64 0 40 <20 <20
В/Нов/23/91 160 0 0 0 НТВ 128 128 НС НС НС
В/Нов/24/91 160 0 0 0 ИГВ 128 16 20 <20 <20
В/Нов/26/91 80 0 0 0 ИГВ 128 0 20 <20 <20
А/Нов/59/91 80 0 0 0 ИГВ 128 0 НС НС НС
В/Нов/27/91 0 320 640 640 ИГВ 256 64 НС НС НС
В/Нов/32/91 40 320 640 640 ИГВ 128 64 НС НС НС
В/Нов/66/91 40 320 640 640 ИГВ 64 64 80 40 <20
В/Нов/55/91 20 320 320 320 ИГВ 64 32 80 <20 <20
В/Нов/56/91 40 160 320 320 ИГВ 64 64 80 <20 <20
В/Нов/65/91 20 160 320 320 ИГВ 128 0 80 40 <20
В/Нов/39/91 40 640 1280 1280 жгв 128 32 1280 640 <20
и)
оо
Примечание: В/Нов/-В/Новгород, А/Вик/-В/Виктория, /Ям/-В/Ямагата, В/Гуан-В/Гуандонг; сыворотки: крол-кроличьи, крыс-крысиные, мыш-мьппиные, Т1, Т2 -титры вирусов до и после прогревания при 56° С
Результаты антигенного анализа выделенных вирусов показали, что они являются дрейф вариантами эталонов В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88. Обе группы были неоднородны по свойствам. Следует отметить, что в основном штаммы были изолированы от вакцинированных убитой вакциной, и только один штамм В/Новгород/39/91 от привитой ЖГВ Полученные результаты не выявили влияния поствакцинального иммунитета на антигенные свойства эпидемических вирусов гриппа В
Возможно, такой результат объясняется следующим. В состав вакцин входил штамм В/Виктория/2/87-подобный, который стимулировал продукцию антител yi привитых к обоим эталонам-типоспецифический иммунитет, описанный ранее (Gretescu et al., 1987). При этом уровень антител к В/Виктория/2/87 был выше, чем к В/Ямагата/16/88. Однако, сформированный к В/Виктория/2/87 иммунитет был недостаточен и полная защита организма от этого вируса не достигалась.
^Прививки проводили в г. Новгороде осенью 1990 г. В состав трёхвалентной вакцины входили штаммы, подобные А/Тайвань/1/86 (H1N1), А/Сичуаш>/2/87 (H3N2) и В/Виктория/2/87. Работу осуществляли совместно с Новгородским городским центром Госсанэпиднадзора.
РАЗДЕЛ В.РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ И МОДИФИКАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ И ТЕСТ СИСТЕМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА. 5. Получение и анализ сывороток к полипептидам вирусов гриппа А, В и С. 5.1. Электрофоретическое разделение и получение полипептидов вирусов гриппа, сохранивших антигенные и иммуногенные свойства.
Основной целью данного раздела исследований стала разработка метода выделения полипептидов вирусов гриппа и приготовление к ним высокоспецифичных сывороток. Используемые ранее методы изоляции белков (Gregoriades,1972, Phillips et
а1.,1982, Загидулин и др., 1985 ) с помощью детергентов, электрофореза в ПААГе, обладали рядом недостатков, в том числе трудоёмкостью, влиянием реагентов на нативные свойства полипептидов.
За основу мы взяли метод разделения вирионных белков в агарозе, предложенный ЬесопИе, Сго1еаи (1981). Проведенные нами исследования показали, что электрофоретическое разделение вирионных белков зависит от типа вируса гриппа: у вирусов А и В формируются 3 полосы, у вирусов гриппа С -2. Идентификация полос проводилась с помощью анализа белковых элюатов из агарозы при электрофорезе в ПААГе.
Применение дополнительного этапа обработки элюата вирионов ферментом бромелина по методу 8кеЬе1, (1972), позволило получить очищенные внутренние полипептиды, свободные от гемагтлютинина для вирусов гриппа А и В.
Изучению стабильности антигенных и иммунологических свойств у изолированных белков были посвящены дальнейшие исследования. С этой целью к ним были получены сыворотки, которые были изучены в различных реакциях. 5.2. Вирус гриппа А(НШ1): Характеристика сывороток к внутренним полипептидам ОТ, М и индикация вирусов методами ТФ РИА, ИФА.
При анализе антисывороток к внутренним белкам вируса гриппа А/СССР/90/77 было установлено отсутствие в них антител к НА ( РТГА ) и ЫА (лектин - тест). Сыворотки, как к КЫР, так и М белку не взаимодействовали в ИФА с вирусом гриппа В. Титры для анти КОТ сывороток колебались в пределах 1:400 - 1:800, для белка М ( 1:6400 - 1:12800 ), однако, в ТФ РИА наблюдалось некое взаимодействие с вирусом гриппа В, что, по-видимому, обусловлено присутствием во внутренних белках хозяйских компонентов. Далее в ИФА использовались планшеты, на которых были сорбированы сыворотки морской свинки, содержащие антитела только к белкам вируса гриппа А, культивированного на мышах.
Были проведены исследования по определению вирусов гриппа в носовых секретах вакцинированных людей. Опыты показали, что в изолягах, в которых по РГА
гемагглютинин не обнаруживался, анти М и анти RNP сыворотки одинаково выявляли вирус гриппа А. Наличие вируса выявлено в 7 случаев из 12, в том числе у 3 привитых наблюдался прирост антител.
Итак анализ сывороток к полипептидам вирусов гриппа А, выделенным из агарозы после электрофоретического разделения, показал, что они достаточно специфичны и могут быть использованы для индикации вируса.
5.3. Вирус гриппа В: Анализ сывороток к внутренним полипептидам NP, М, исследование их антигенных свойств методом ТФ PIIA.
Исследования сывороток к внутренним белкам вируса гриппа В/СССР/14/80, приготовленным по схеме согласно разделу 5.1, показал отсутствие антител к поверхностным белкам. Из полученных данных следует, что обе сыворотки к М и RNP работали с вирусами в разведении от 10 2 до 10 , при этом, как и в случае гриппа А (раздел 5.2.), сыворотки к RNP были слабее, чем к М белку. Обе сыворотки не работали с вирусом гриппа А. При исследовании аллантоисной жидкости титры вирусов находились в пределах 0,7x10 "2 - 4x10 "2. Итак, анализ сывороток к полипептидам вируса гриппа В выявил,что они также специфичны, как и в случае сывороток к гриппу А. Таким образом, сыворотки к внутренним полипептидам вирусов гриппа А и В, приготовленные по предложенному нами методу, могли быть использованы для индикации вирусов гриппа в аллантоисных препаратах и в носовых секретах у вакцинированных.
Следует отметить, что диагностика гриппа с помощью поликлональных сывороток к внутренним белкам имеет преимущество перед использованием моноклональных антител. В последнем случае следует контролировать активность МКА, так как антигенные сайты внутрешшх белков могут изменяться и возможно отсутствие взаимодействия с соответствующим МКА. Такое явление мы наблюдали при изучении вирусов гриппа А, выделенных в 1934-1983гг с набором МКА к NP в ТФ РИА. Одно из МКА не взаимодействовало со штаммами, изолированными после 1980г.
5.4. Вирус гриппа С: Характеристика сывороток к наружным НА и внутренним белкам (NP+M), исследование различных штаммов в РТГА, ИФА.
Следует отметить, вирусы гриппа С к началу наших исследований были изучены, значительно меньше, чем вирусы гриппа А и В. Как было установлено ранее (раздел.5.1), разделение полипептидов вирусов гриппа С при электрофорезе в агарозном геле отличается от раделения полипептидов вирусов гриппа А и В. У вирусов гриппа С обнаружено две зоны. Первая зона содержала гемагглютинин, вторая-комплекс внутренних белков, К элюированным белкам были получены ангисыворотки. Обе сыворотки взаимодействовали с вирусами гриппа С в РТГА ( первая сыворотка) и ИФА (вторая сыворотка) и незначительно, как и в предыдущих случаях (разделы 5.2,5.3), с вирусами А и В. Последнее объясняется наличием хозяйского компонента в выделенных из агарозы полипептидах.
Таким образом, в результате проделанной работы было показано, что метод разделения белков при электрофорезе на агарозе может быть с успехом использован как маркер для дифференциации вирусов. Кроме того, сходство электрофореграмм вирусов гриппа А и В вносит дополнительные показатели более близкого родства вирусов гриппа А и В между собой и их отличия от вирусов гриппа С (Webster, 1992). После разделения вирусных белков в агарозе выделяются белки, которые обладают иммуногенной и антигенной активностью. Сыворотки, приготовленные к ним, выявляют антигены вирусов гриппа в различных материалах.
6. Индикация и исследование вирусов гриппа в различных реакциях с использованием иммуноглобулинов IgG и моноклональных антител к вирионным белкам.
6.1. Сравнительный анализ активности и чистоты IgG, выделенных из иммунных сывороток с помощью каприловой кислоты (IgGK) и другими методами.
В современных иммунологических методах (ТФ РИА, ИФА, ФИА) для повышения специфичности и чувствительности вместо сывороток используются
иммуноглобулины 1§0 , играющие важную роль в противогриппозном иммунитете. Анализируя результаты методов получения из сьшороток с помощью сульфата аммония, полиэтиленгликоля, гельфильтрации на сефадексе в 200 и др., мы остановились, на методе, предложенном 51ешЬисЬ, Аигап (1969), который ранее в вирусологических исследованиях не применялся. В этом методе получали с использованием каприловой кислоты.
Мы изолировали к поверхностным и внутренним полипептидам вирусов гриппа. Выделенные к наружним белкам НА и NA и внутренним белкам, сохраняли способность взаимодействовать с вирусными антигенами. Удельная специфическая активность препаратов в расчёте на белок возрастала в 6-10 раз по сравнению с удельной активностью сывороток. Выход по белку составлял 3,5%. Важно отметить, что при выделении с помощью каприловой кислоты ингибиторы гемагтлютинации после центрифугирования оказывались в осадке, в то время как присутствовали в надосадке, Поэтому результаты РТГА не зависели от обработки с помощью РДЭ.
Лиофилизированные сохраняли свою активность, однако, она была примерно в 2 раза ниже, чем у жидких препаратов.
Сравнительные исследования ^О, выделенных из иммунных сывороток с помощью различных методов, и ^вк, изолированных с использованием каприловой кислоты, показало, что последние обладают значительно меньшим количеством примесей. Они регистрировались как дополнительные пики при жидкостной хроматографии (рис.4) или в виде белковых зон при электрофорезе ^О на ацетате целлюлозе (рис.5). Поэтому использование каприловой кислоты при выделении ^О может быть рекомендовано в вирусологических исследованиях.
I14 I22
Рис. 4. Анализ в жидкостном хроматографе препаратов , изолированных различными методами из сывороток к полипептидам вируса гриппа: А/ССС Р/90/77
а-^й -жидкие,каприловая кислота б-^О-лиофилизированные,каприловая кислота д-1£0-жидкие .сульфат аммония г-^й-жидкие, полиэтиленгликоль
Рис. 5. Элекгрофоретическое разделение белков сьшоротки и иммуноглобулинов к вирусу А/СССР/90/77 на ацетатделлюлозе: а-кроличья сыворотка, б-1§0-(каприловая кислота)- жидкие, в- осадок при получении (каприловая кислота), г-1^0 (каприловая кислота ), лиофилизированные,
д-ДО (ПЭГ),
е-1£0, (сульфат аммония)
6.2. Индикация вирусов гриппа в растворах с помощью ^вк, меченных копропорфирином, во флуоресцентном иммунном анализе (ФИА).
Несмотря на то, что современные высокочувствительные методы РИА, ИФА позволяют определить малое количество вещества в растворах, они обладают рядом недостатков, которые заставляют исследователей проводить как усовершенствование имеющихся методов, так и поиск новых альтернативных. Для нас представляла интерес новая флуоресцентная метка копропорфирин (рис.6), которая на модельных системах позволяла получать чувствительность как в РИА и в ИФА (Савицкий и др., 1987). В отличие от традиционно использованных меток (ФИТЦ, родамин и других) копропорфирин обладает большим сдвигом между волной возбуждения А,=400 им и флуоресценции X =620 им. Это позволило свести к минимуму влияние светорассеяния на результаты наблюдений.
Лр= 620 им
ДО
Микроплапшет
Рис. 6. Схема твердофазного иммунофлюоресцентного анализа:
К — метка-копропорфирин — иммуноглобулин
—вирус гриппа
Мы исследовали выделенные с помощью каприловой кислоты иммуноглобулины к цельному вирусу - IgGv, внутренним белкам M-IgGM и NP-IgGn. Установлена активность всех выделенных IgG, меченных копролорфирином. Специфическое связьшание бьшо получено также при использовании IgG, меченных копропорфирином, как очищенных, так и неочищенных на хроматографе от несвязанного копропорфирина. Проведённые эксперименты выявили, что в работе могут быть использованы только свежеприготовленные конъюгаты. При хранении > 48 часов возможно неспецифическое связывание.
Определение чувствительности метода показало, что наименьшая концентрация антигена, регистрируемая в методе ФИА по конкурентной схеме, достигала 3 нг/мл в случае IgGn, и 10 нг/мл при использовании IgGv.
6.3. Изучение активности пула МКА к вирусам гриппа А и В во флуоресцентном иммунном анализе с временным разрешением (ФИА ВР).
К началу наших методических исследований появились единичные работы по использованию ТФ ФИА ВР для изучения вируса гриппа сначала за рубежом (Hallonen et al., 1985), а затем отечественными исследователями (Христова и др., 1989). Целью наших исследований было определение возможности индикации вируса гриппа этим методом с использованием моноклональных антител (МКА) к внутренним белкам вируса гриппа. Использовались коммерческие наборы МКА к внутренним белкам вирусов гриппа А и В, (МКА А и МКА В), приготовленные в центре по борьбе с заболеваниями CDC&P, Атланта, США и любезно предоставленные д-ром А. Кендалом. Для работы были взяты эпидемические штаммы вируса гриппа А и В, изолированные в России.
Как показали исследования, МКА А и МКА В обладали разной активностью: МКА А взаимодействовали с вирусом гриппа А/СССР/90/77 до разведения 1:25 ООО, что соответствовало концентрации МКА 1.6 хЮ '3 мг/мл; МКА В взаимодействовали с вирусом В/СССР/2/87 до разведения 1:200 ООО , что соответствовало концентрации
МКА 2x10"4 мг/мл. При этом была выявлена неспецифическая сорбция на аллантоисный белок для МКА А и значительно меньшая у МКА В. При разведении вируссодержащей жидкости 1: 100 и более аллантоисные белки не мешали взаимодействию МКА с вирусами гриппа. Это же разведение, как показали исследования, и являлось максимальным разведением аллантоисного вируса, при котором регистрировался вирус гриппа В/СССР/4/87.
Согласно проведенным расчетам в выбранной системе регистрируется не менее 2 гемагтлютинирующих единиц. Наибольшая чувствительность метода, определенная с использованием растворов очищенных вирионов, составляла 20 нг/мл, при концентрации МКА В 7.8 мкг/мл. Полученная в наших исследованиях чувствительность, достигнутая в методе ФИА с меткой копропорфирином, находилась в пределах 0,4-90 нг/мл и отличалась от чувствительности ИФА-0,5 нг/мл (Букринская и др.,1985), и ФИА BP (0,1 нг/мл) в "сандвич" анализе (Wall et al.,1986).
В работе также был поведен сравнительный анализ активности отечественных и приготовленных фирмой LKB коньюгатов, а также способности к иммобилизации антигена в отечественных и фирмы EFLAB разборных микропланшетах. Установлено, что оба коньюгата могут быть использованы при вирусологических исследованиях, однако, в случае отечественной системы (коньюгат + михропланшет) достигалось лучшее соотношение сигнал/фон.
Проведенные нами исследования показали, что метод ФИА BP с использованием МКА к внутренним белкам может быть применен для детекции вируса гриппа в вируссодержащих растворах. Моноклональные антитела к NP белку были в дальнейшем с успехом использованы для детекции вируса гриппа методом ИФА (Соминина и др.,1994, Филипова и др.,1994). Следует отметить, что использование МКА к внутренним белкам имеет преимущество перед панелью МКА к НА, так как детекция вируса гриппа в этом случае может не происходить в силу изменчивости вируса гриппа (Буссе и др.,1990) и поэтому необходимо вносить постоянные изменения в набор регистрирующих МКА.
Сравнение методов ФИА с новой меткой копропорфирином и ФИА ВР с коньюгатами, содержащими ионы лантанидов, показало, что каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Проблемы, возникающие при использованием лантанидов в ФИА, связаны с нестабильностью комплексов редких земель с иоликарбоновыми кислотами, высокой чувствительностью к загрязнению образцов, происходящие из-за нековалентной связи лантанидов с антителами.
Поэтому в настоящее время идет активный поиск новых методов или их модификаций. В частности, разрабатывается фосфоресцентный метод, обладающий достоинствами метода ФИА ВР и содержащий фосфоресцентные метки -металлопроизводные копропорфирина, которые являются высокостабильньши, устойчивыми к действию кислот, щелочей соединениями (Савицкий, 1997). ВЫВОДЫ
1. На основании результатов изучения гемагглютинирующих изолятов, поступивших из 21 города установлено, что эпидемии гриппа в России и странах СНГ в период 1986-97г были вызваны активной циркуляцией и частой социркуляцией различных сочетаний вирусов гриппа А/НШ1, А/НЗК2 и В. Изучено 940 гемагглютинирующих агентов, идентифицировано 683, из которых 20,7% являлись вирусами гриппа А/Н1Ш/, 52%, - А/НЗШ/ и 26,2% - вирусами гриппа В. Выявлен ряд особенностей в циркуляции, а также антигенного дрейфа в поверхностных белках вирусов гриппа с различной антигенной формулой. Обнаружена тесная антигенная связь отечественных штаммов со штаммами, изолированными от больных в странах Азиатско-Тихокеанского региона.
2. Вьивлена мультиплетность в эволюционном процессе у вирусов гриппа В. Определена новая ветвь эволюции вирусов гриппа В, впервые вызвавших эпидемию гриппа в России в период 1990-91гг. Установлен феномен социркуляции антигенно различных вирусов, подобных В/Виктория/2/87 (старого) и В/Ямагата/16/88 (нового) направления изменчивости. Показано, что вирусы гриппа В нового направления
преобладали в вирусных популяциях гриппа В в последующих эпидемических сезонах 1992-93, 1995-96, 1996-97гг.
3. Впервые определена нуклеотидная и аминокислотная последовательность гемагглютинина 6 отечественных штаммов гриппа В обеих эволюционных групп:
-Построена общая картина эволюционных связей вирусов гриппа В, изолированных в России и за рубежом, начиная с 1983г.
-Выявлен антигенный дрейф в молекулах гемагглютинина и нейраминидазы вирусов гриппа В у штаммов, изолированных с 1990г.
4. Определен линейный характер эволюции поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) вирусов гриппа А :А/НШ1/, А/НЗЫ2/:
-выявлена меньшая скорость изменчивости у НА и 1чА вирусов гриппа А/НШ1, чем у А/Н3№;
-определены аминокислотные последовательности НА четырех штаммов А/Н1N ], А/НЗЫ2, изолированных в 1993-97гт, выявлены отличия по нескольким позициям аминокислот от НА соответствующих эталонов;
-обнаружена вариабельность в структуре внутренних белков ЫР и М вирусов гриппа А.
5. Установлен возврат в эпидемический процесс 1995-9бгг. вирусов гриппа А/Н1Ш/ и последующая активная социркуляция с вирусами А/НЗЫ2 и В, после большого периода неактивной фазы (весна 1989-1995гг.).
6. При исследовании вакцинопрофилактшш у школьников было установлено:
- лектин-тест может быть применен для изучения спектра поствакцинального ответа (при определении уровня антител к нейраминидазе в сыворотках у привитых);
- сходство в антигенной структуре и свойствах гемагглютининов у вирусов гриппа, изолированных от больных, независимо от ранее перенесенной вакцинации.
7. Показано, что для получения вирионных белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших высокую антигенную и иммуногенную активность, может быть использован электрофорез в агарозе. Его модификация- введение предварительного
этапа (обработка вируса бромелином) позволяет получать внутренние белки (ЫР и М), сыворотки к которым специфичны, активны и могут быть использованы для идентификации вируса гриппа современными методами: ТФ РИА, ИФА, ФИА. 8. Показано, что для идентификации вируса гриппа могут быть использованы две модификации флуоресцентного иммунного анализа: ФИА с новой меткой-копропорфирином и ФИА ВР (временным разрешением), с моноклональными антителами к внутренним белкам вируса гриппа. Основные публикации по итогам работы
1. Иванова В.Т., Закстельская Л.Я., Трушинская Г.Н., Шендерович С.Ф., Любовцева О.В. "Использование агарозы для изоляции белков вируса гриппа, сохранивших высокую иммуногенность. "Вопр. вирусологии, 1983,N 4,стр.32-35.
2. Иванова В.Т., Закстельская Л.Я. " Использование агарозы для изоляции белков ортомиксовирусов". Методические рекомендации, утвержденные на Уч.совете НИИ вирусологиии РАМН пр.Ы 14 от 5/12-1983.
3. Шендерович С.Ф., Закстельская Л.Я., Иванова В.Т., Трушинская Г.Н., Слепушкин А.Н., Обросова-Серова Н.П., Зайдес В.М., Березин В.Э., Жданов В.М. "Тест-система для индикации и дифференциации вируса гриппа". Вопр. вирусологии 1984 ,Ы.4,стр.459-463.
4. Иванова В.Т., Закстельская Л.Я. Использование агарозы для изоляции белков ортомиксовирусов. Сборник - Методические рекомендации по применению современных методов исследований в общей и медицинской вирусологии. Москва,1984.стр.46-52.
5. Иванова В.Т., Говоркова Е.А., Закстельская Л.Я." Сравнительная характеристика биофизических свойств белков гриппа А, В, С." Вопр. вирусологии. 1984,N 3.стр.687-691.
6. Говоркова Е.А., Иванова В.Т., Закстельская Л.Я., Миллер Г.Г." Седиментационные характеристики вирионов и субвирусных частиц вирусов гриппа С". Вопр. вирусологии. 1984,N 6.стр.687-691.
7. Шендерович С.Ф., Говоркова Е.А., Иванова В.Т., Любовцева О.В., Закстельская Л.Я. "Использование иммуноферментного анализа для индикации и дифференциации вирусов гриппа А, В и С. "Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии", 1985,N 1,стр.85-90.
8. Любовцева О.В., Говоркова Е.А., Иванова В.Т., Закстельская Л.Я." Изучение подвижности белков вируса гриппа С в электрофорезе на ацетатецеллюлозы." Вопр. вирусологии. 1985,N б.р 668-671.
9. Trushinskaya G.N., Ivanova V.T. Russ G., Polakova K., Isachenko V.A, Zakstelskaya L.Y."Indication and study of antigenic properties of influenza virus internal proteins by means of monoclonal antibodies. "Acta virol.1985, N.29,p.426-431.
Ю.Иванова В.Т., Говоркова Е.А., Любовцева О.В., Закстельская Л.Я." Характеристики субвирусных частиц вирусов гриппа С." Вопр. вирусологии. 1986,N 2,стр.234-236. П.Шендерович С.Ф., Феклисова Л.В., Говоркова Е.А., Иванова В.Т., Закстельская Л.Я." Выявление вирусов гриппа А, В, и С в носовых секретах людей методом ИФА." Вопр. вирусологии. 1986,N 2.стр.7-11.
12.Иванова В.Т., Любовцева О.В., Стафеева O.A., Савицкий А.П., Варечкова Э., Яхно М.А. "Получение и исследование свойств IgG из антисывороток к белкам вируса гриппа. "Вопр. вирусологии 1987 .N 1,стр.39-44.
13.Иванова В.Т., Стафеева O.A., Савицкий А.П. "Использование твердофазного флюоресцентного иммунологического анализа для индикации вируса гриппа А. "Вопр. вирусологии 1988, N.3,стр.362-365.
14.Иванова В.Т., Любовцева О.В., Яхно М.А. "Получение с помощью каприловой кислоты иммуноглобулинов из сывороток лабораторных животных, иммунизированных белками вируса гриппа". Сборник Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. Москва,1988,стр.97-100.
15.Яхно М.А., Иванова В.Т., Говоркова Е.А. Ямникова С.С., Исаченко В.А., Семенова Н.П., Оскерко Т.А., Закстельская Л.Я., Львов Д.К., Жданов В.М." Антигенные и
биологические характеристики штаммов вируса гриппа A(H3N2),подобных вирусу А/Гонконг/1/68".Вопр. вирусологии 1988 ,N.6, стр.663-669.
16.Иванова В.Т., Яхно М.А., Тумова Б., Штумпа А., Говоркова Е.А., А.Н. Слепушкин. "Сравнительный анализ эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1),изолированных в СССР и ЧССР в 1986г." Вопр. вирусологии 1989, N 4 ,стр.423-426.
17.Иванова В.Т., Понамарева И.В., Шаханина К.Л., Яхно М.А., Слепушкин А.Н., Савицкий А.П. "Исследование вирусов гриппа методом флюоресцентного анализа с временным разрешением". Вопр. вирусологии 1990, N.2, стр.115-117,.
18.Yakhno М.А., Govorkova Е.А., Kubinova I., Ivanova V.T., Stumpa A., Tumova В." The source of avian paramyxoviruses isolated during an outbreak of influenza among children". Acta viral. 1990 N.34, p. 184-186.
19.Иванова В.Т., Яхно М.А., Солярикова Л., Штумпа А., Варичкова Э., Слепушкин А.Н."Изучение антигенных и биологических свойств вирусов гриппа A(H1N1), изолированных в СССР и ЧССР в 1988-89гг". Вопр.вирусологии 1991, К5,стр. 378380.
20.Говоркова Е.А., Иванова В.Т., Яхно М.А., Штумпа А., Кубинова И., Ямникова С.С., Слепушкин А.Н. "Сравнительное изучение парамиксовирусов птиц, изолированных в СССР в 1986 году." Вопр.вирусологии 1991 п.1,стр. 59-61.
21.Иванова В.Т., Слепушккин А.Н., Бурцева Е.И., Баландин Д.И., Варечкова Э., Руденко Л.Г., Обросова - Серова Н.П." Использование лектин-теста для выявления антинейрамидазных антител в сыворотках вакцинированных". Вопр.вирусологии. 1991,N 6.стр.469-471.
22.Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н., Обросова - Серова Н.П., Иванова В.Т., Ермаченко Т.А. и др." Прививочные свойства кандидатов в вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины типа В для детей." Тезисы докладов VI Всесоюзного съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов.том. И г. Нижний Новгород, 1991,стр. 165-166.
23.Баландин Д.И., Иванова В.Т., Бурцева Е.И. и др. " Использование лектин теста в изучении свойств гриппозных вакцин". Тезисы докладов VI Всесоюзного с'езда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов.том. 11 г. Нижний Новгород, 1991,стр 195-196.
24.Бурцева Е.И., Иванова В.Т., Обросова - Серова Н.П., Слепушкин А.Н." Применение лектин-теста для изучения антинейраминидазного иммунитета у привитых гриппозными вакцинами". Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. Сб. Москва 1992,Институт вирусологии РАМН.стр.154-159.
25.Голубева Л.И., Клевзова Г.А., Иванова В.Т., Беляев A.JI., Оскерко Т.А., Слепушкин А.Н." Выделение вирусов гриппа в Новгороде в 1990-1991г." Воггр.вирусологии 1993,N 1,стр.7-8.
26.Иванова В.Т., Яхно М.А., Оскерко Т.А., Говоркова Е.А., Джапаридзе Н.Г., Слепушкин А.Н." Характеристика эпидемических штаммов вирусов гриппа В, вызвавших эпидемию гриппа в 1990-91гг. в СССР." Вопр. вирусологии. 1993 N 2, стр.83-85.
27.Исаева ЕЛ., Ровнова З.И., Лхно М.А., Иванова В.Т., Платонова А.Л., Алипова Т.А. "Антигенная структура вирусов гриппа В, выделенных в 1991 г." Вопр. вирусологии 1993,N3,стр. 107-110.
28.SlepushMn A.N.,Rudenko L.G. ,kendal A.P. Monto A.S.,Belljaev A.L. Burtseva E.I.,Ivanova V.T.et al"Comparativ studies of live and inactivated vaccines in Novgorod Description of study desigh and results of reactogenicity and immunogenicity of vaccines" Options for Control of Influenza 11 ed Hannon C..Kendal A.P., Klenk H.D., Ruben F.L., Excerpta Media,Amsterdam,London-NYork -Tokio 1993,p 91-96.
29.Иванова В.T., Слепушкин A.H., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А., Голубева Л.Н., Беляев А.Л." Результаты исследования материалов, полученных от больных,вакцинированных ранее различными гриппозными вакцинами". Вопр.вирусологии. 1994, N2, стр. 66-68.
30.HemphiU M.L,Rota Р.А., Ivanova У.Т., Slepuskin A.N ,Kendal A.P "Antigenic and genetic analyses type В viruses isolated in Russia from 1987-1991".Epidemiology and Infection 1994,111 (3), p. 539-546.
31.Ivanova V.T., Cameron R., Hemphill M., Oskerko T.A., Govorkova E.A., Vlasova T.N., Slepushkin A.N. "The evolution of Influenza A and В viruses in Russia in 1989-94."-Immunobiology of viral infection". Proceedings of the 3rd Congress of the European Society for veterinary virology, Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994, p.53 8-541. 32.Ivanova V.T, Skehel J.J., Vlasova T.N. Oskerko T.A., Govorkova E.A , Slepuskin A.N." Comparative evolution of influenza A virus in Russia and China in 1989-94".Third Asia-Pascific Congress jf Medical virology .Deijing China .October 23-28, 1994,p.306 . 33 Исаева Е.И., Иванова B.T., Ровнова З.И., Оскерко Т.А., Алипова Т.А., "Картирование сайтов гемагглютинина вирусов гриппа H3N2 1990-93." Вопросы вирусологии 1994,N 2,стр.62-б5
34.Иванова В.Т., Оскерко Т.А., Говоркова Е.А., Власова Т.Н., Ямникова С.С., Слепушкин А.Н., Камерон К., Хемлфил М." Эволюция вирусов гриппа в России (1989-94) " Вестник РАСХН, 1995, N 3, стр.53-55.
35.Иванова В.Т., Оскерко Т.А., Власова Т.Н. ,Слепушкин А.Н. "Особенности антигенного дрейфа полипептидов вирусов гриппа, изолированных в России в 198595гг." Сборник ЕНИИВИ, Екатеринбург, 1995,стр. 98-104
36.Ivanova V.T., Hemphill М., Oskerko Т. A., Vlasova T.N., Slepuskin A.N. "Influenza virus in Russia in 1986-95." World Veterinary Congress, 3-9 September, 1995, Yokohama, Japan, Abstracts FC7.2.5.
37. Ivanova V.T., Oscerko T.A., Vlasova T.N., Smirnov A.S., Slepushkin A.N. "Characterization of influenza viruses isolated in Russia in 1986-96 ",10 International congress of virology, Jerusalem,Israel, 11-16 August,1996, Abstract, p.190.
38. Иванова B.T., Слепушкин A.H., Оскерко T.A., Власова Т.Н. "Основные направления изменчивости вирусов гриппа, изолированных в России в 1990-
96".Материалы 7 съезда всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.1997,т.1,стр. 17-18 .
39. Слепушкин А.Н., Беляев A.JL, Бурцева Е.И., Иванова В.Т., Оскерко Т.А. "Современные тенденции в эпидемиологии и профилактике гриппа и ОРЗ" Материалы XXX Юбилейной международной научной конференции "Грипп -XXI век" ,1997, стр. 35.
40. Slepuskin A.N., Beljaev A.L., Ivanova V.T., Burtseva E.I, Oskerko T.A, Influenza virus surveillance and prevention in Russia.Program and Abstracts of 4th Asia-Pacific Congress of Medical Virology 1997, November 3-5, Seoul, Korea, p.70.
41.Слепушкин A.H., Львов Д.К., Маринич И.Г., Беляев А.Л., Бурцева Е.И., Иванова В.Т "Эпидемиологические особенности гриппа последних лет", Вопр.вирусол. 1998,N2 стр.59-62.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
жгв ншвая гриппозная вакцина
ИГВ Инактивированная гриппозная вакцина
ИФА твердофазнный иммуноферментный анализ
МКА моноклональные антитела
ПААГ Полиакриламидный гель
ПМВ Парамиксовирус
РГА реакция гемагглютинации
РТГА реакция торможения гемагглютинации
РПНА реакция торможения нейраминидазной активности
ТФ РИА твердофазный радиоиммунный анализ
ТФ ФИА флуоресцентный иммунный анализ
ТФ ФИА ВР твердофазный иммунный анализ с временным разрешением
ФИТЦ Флуоресцеин
НА Гемагглютинин
НА1 тяжелая цепь гемагглютинина
НА2 легкая цепь гемагглютинина
ДО Иммуноглобулины
ДОк Иммуноглобулины, выделенные с использованием каприловой кислоты.
М матриксный белок
ЫА Нейраминидаза
ЫР Нуклеопротеин
РНК рибонуклеиновая кислота
ИЧР Рибонуклеопротеид
АМИНОКИСЛОТЫ
Обозначение
Полное Краткое Латинское краткое
Алании Ала А
Аргинин Арг Я
Аспарагиновая кислота Асп 0
Аспарагин Асн N
Валин Вал V
Гистидин Гис н
Глицин Гли в
Глутамин Глн <3
Глутаминовая кислота Глу Е
Изолейцин Иле I
Лейцин Лей Ь
Лизин Лиз К
Метионин Мет м
Пролин Про р
Тирозин Тир У
Треонин Тре т
Триптофан Три
Фенилаланин Фен и
Серии Сер Б
Цисте ии Цис С
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Иванова, Валерия Тимофеевна, Москва
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
НИИ ВИРУСОЛОГИИ имени Д.И.ИВАНОВСКОГО На правах рукописи
ИВАНОВА Валерия Тимофеевна
ОСОБЕННОСТИ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА В ПЕРИОД 1986-98 гг. (ИНДИКАЦИЯ, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА)
(03.00.06 вирусология)
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант доктор медицинских наук Заслуженный деятель науки РФ профессор А.Н. Слепушкин
Москва - 1998
ОГЛАВЛЕНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ГЕНОМА ВИРУСОВ, СВОЙСТВА КОДИРУЕМЫХ ИМ БЕЛКОВ.
1.1. Классификация вирусов гриппа. 18
1.2. Структура вирусов гриппа. 19
1.3. Геном вируса гриппа. 20
1.4. Структура и свойства поверхностных и внутренних вирионных белков.
1.4.1. белки полимеразного комплекса (РВ1,РВ2,РА). 20
1.4.2. гемагглютинин (НА). 22
1.4.3. нуклеопротеин (NP). 26
1.4.4. нейраминидаза (NA). 30
1.4.5. матриксный белок (Ml, М2). 33
1.4.6. неструктурные белки (NS1, NS2). 35 ГЛАВА 2. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ЕСТЕСТВЕННЫХ 38 УСЛОВИЯХ.
2.1. Молекулярные механизмы изменчивости вирусов гриппа. 39
2.2. Реверсия вирусов гриппа A(H1N1) 44
2.3. Особенности структуры и антигенных свойств вирусов гриппа A(H2N2), 49 циркулировавших в период 1957-1967гг.
2.4. Циркуляция вирусов гриппа A/H3N2 в биосфере. 52
2.4.1. Основные направления изменчивости вирусов гриппа A(H3N2). 52
2.4.2. Связь между вирусами гриппа с гемагглютинином НЗ, изолированными 55 из разных источников.
2.5. Две ветви эволюции вирусов гриппа В. 57 ГЛАВА 3. ПРОИСХОЖДЕНИЕ ПАНДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ВИРУСОВ ГРИППА.
3.1. Циркуляция в биосфере вирусов гриппа А.
Реассортация генов в природных резервуарах. 64
3.2. Ограничительные механизмы межвидового перехода (host range). 71
3.3. Гипотезы происхождения пандемических штаммов.
3.1. Зооантропонозная теория 75
3.1. Альтернативные гипотезы 80
ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ГРИППА.
4.1. Особенности противогриппозных вакцин. 83
4.2. Сравнительное изучение прививочных свойств ИГВ и ЖГВ. 86
4.3. Методы ранней диагностики гриппа. 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 95
РАЗДЕЛ А. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ПРИРОДЕ ГЛАВА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТИОЛОГИИ ЭПИДЕМИЙ ГРИППА В РОССИИ В 1986-98гг.
1.1. Анализ циркуляции вирусов гриппа А и В. 110
1.2. Индикация и свойства вирусов, изолированных в процессе надзора и не 113 имевших эпидемического значения.
1.2.1 .Исследование вирусов гриппа A(H3N2), подобных А/Гонконг/68 115
изолированных от детей в СССР в 1986г.
1.2.2.Антигенные и биологические свойства парамиксовирусов птиц, изолированных во время подъема заболеваемости гриппом в 1986г. ГЛАВА 2. ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА A/H1N1 В ИССЛЕДУЕМЫЙ ПЕРИОД (1986-98гг).
2.1. Сравнительный анализ белков эпидемических штаммов, вызвавших 121 эпидемии в 1986-87гг., 1988-89гг. в странах, имевших общие границы с СССР.
2.2. Возврат вирусов гриппа A/H1N1 в эпидемический процесс 1995-96гг. и 129 социркуляция их со штаммами A/H3N2 и В в 1996-98гг..
ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ И МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ГРИППА A/H3N2, ВЫДЕЛЕННЫХ В ЭПИДЕМИЯХ.
3.1. Изучение антигенного дрейфа поверхностных белков гемагглютинина и 141 нейраминидазы с использованием поликлональных и моноклональных антител.
3.2. Особенности структуры гемагглютинина эпидемических штаммов. 155
3.3. Антигенная вариабельность внутренних белков. 160
3.4. Анализ штаммов и сывороток от больных, ранее вакцинированных противогриппозными вакцинами.
3.4.1. Антигенная характеристика штаммов,изолированных от 163 вакцинированных.
3.4.2. Использование лектин- теста для определения динамики роста антител 166 к нейраминидазе при массовой вакцинации школьников.
ГЛАВА 4. НОВОЕ НАПРАВЛЕНИЕ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА ТИПА В.
4.1. Сравнительный анализ эпидемически активных вариантов В/Виктория- 170 подобных) и новых (В/Ямагата-подобных), вызвавших эпидемию гриппа
1990-91гг. в России.
4.2. Антигенный дрейф поверхностных белков вирусов гриппа, 177 доминирующих в настоящее время в вирусных популяциях.
4.3. Структурные изменения в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа В в 181 процессе естественной изменчивости.
4.4. Анализ материалов, полученных от школьников, привитых 188 противогриппозными вакцинами, содержащими В/Виктория-подобный
вакцинный штамм, в эпидсезон 1990-91гг.
РАЗДЕЛ В. РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ И МОДИФИКАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ И ТЕСТ СИСТЕМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА.
ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ СЫВОРОТОК К ПОЛИПЕПТИДАМ ВИРУСОВ ГРИППА А, В И С.
5.1. Электрофоретическое разделение и получение полипептидов вирусов 194 гриппа, сохранивших антигенные и иммуногенные свойства.
5.2. Вирус гриппа А(НШ1). Характеристика сывороток к внутренним 202 полипептидам ИР, М и индикация вирусов методами ТФ РИА, ИФА.
5.3. Вирус гриппа В. Анализ сывороток к внутренним полипептидам КР,М, 203 исследование их антигенных свойств методом ТФ РИА.
5.4. Вирус гриппа С. Характеристика сывороток к наружным НА и внутренним 207 белкам (ЫР+М), исследование различных штаммов в РТГА, ИФА.
ГЛАВА 6. ИНДИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА В РАЗЛИЧНЫХ РЕАКЦИЯХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 1аС И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРИОННЫМ БЕЛКАМ.
6.1. Сравнительный анализ активности и чистоты ^О, выделенных из иммунных 210 сывороток с помощью каприловой кислоты О^Ок) и другими методами.
6.2. Индикация вирусов гриппа в растворах с помощью ^вк, меченных 214 копропорфирином, во флуоресцентном иммунном анализе (ФИА).
6.3. Изучение активности пула МКА к вирусам гриппа А и В во флуоресцентном 220 иммунном анализе с временным разрешением (ФИА ВР).
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 230
ВЫВОДЫ. 250
ЛИТЕРАТУРА. 252
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
жгв Живая гриппозная вакцина
ИГВ Инактивированная гриппозная вакцина
ИФА Твердофазнный иммуноферментный анализ
МКА Моноклональные антитела
ПААГ Полиакриламидный гель
ПМВ Пар амиксовирус
РГА Реакция гемагглютинации
РТГА Реакция торможения гемагглютинации
РПНА Реакция торможения нейраминидазной активности
ТФ РИА Твердофазный радиоиммунный анализ
ТФ ФИА Флуоресцентный иммунный анализ
ТФ ФИА ВР Твердофазный иммунный анализ с временным разрешением
ФИТЦ Флуоресцеин
НА Гемагглютинин
НА1 Тяжелая цепь гемагглютинина
НА2 Легкая цепь гемагглютинина
Иммуноглобулины
Иммуноглобулины,выделенные с использованием каприловой кислоты.
ДОа Иммуноглобулины,выделенные с использованием сульфата аммония
М1 Матриксный белок
М2 Мембранный белок
ЫА Нейраминидаза
М> Нуклеопротеин
N81 Неструктурный белок 1
N82 Неструктурный белок 2
РВА Белки полимеразного комплекса
РВ1
РВ2
РНК Рибонуклеиновая кислота
Рибонуклеопротеид
АМИНОКИСЛОТЫ
Обозначение
Полное Краткое Латинское краткое
Алании Ала А
Аргинин Арг К
Аспарагиновая кислота Асп Б
Аспарагин Асн N
В алии Вал V
Гистидин Гис н
Глицин Тли О
Глутамин Глн
Глутаминовая кислота Глу Е
Изолейцин Иле I
Лейцин Лей Ь
Лизин Лиз К
Метионин Мет м
Пролин Про р
Тирозин Тир У
Треонин Тре т
Триптофан Три
Фенилаланин Фен Б
Серин Сер 8
Цистеин Цис С
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Заболеваемость Диплом относится к одной из важнейших проблем медицинской науки и здравоохранения, т.к. грипп является массовой и неуправляемой инфекцией, ежегодно регистрируемой в различных частях земного шара. Несмотря на огромные усилия, предпринимаемые отечественными и зарубежными учеными, проблема гриппа еще далека от своего решения (Жданов и др., 1978, Киселев, 1997, Lamb, 1989, Lvov et al.,1993, Cox et al.,1995, Hay, 1997a).
Основная причина этого связана с естественной изменчивостью возбудителя, которая выражается в вариабельности первичных структур и соответственно свойств вирионных белков. К настоящему времени антигенный дрейф выявлен у вирусов гриппа А и В. Возникающие новые варианты преодолевают иммунитет населения, быстро распространяются, вызывая вспышки заболевания и эпидемии. В случаях появления совершенно нового вируса гриппа типа А человечество вовлекалось в пандемию гриппа А. Во время "обычной"эпидемии заболевает около 10% населения, при пандемии -80-100%.
Основными направлениями борьбы с гриппом являются надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика возбудителя и профилактика заболевания.
Россия и страны СНГ, входившие в состав СССР, занимают огромную территорию Евразии. Соседство со странами Юго-Восточной Азии, где впервые выделено большинство эпидемических и пандемических штаммов (Sholtissek et al.,1987, Webster et al.,1992), обусловливает быстрое проникновение и распространение новых вирусов на территории нашей страны, а затем и в мире. Поэтому изучение циркуляции вирусов гриппа в таком регионе земного шара, каким является Россия и страны ближнего зарубежья, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Надзор за распространением гриппа в нашей стране уже более 30 лет проводится в НИИ вирусологии РАМН, который сотрудничает по гриппу с ВОЗ. Для успешного проведения этой работы используются отечественные штаммы из Государственной коллекции вирусов,
Центра экологии и эпидемиологии гриппа, а также эталонные штаммы, рекомендованные и присланные из Центров ВОЗ по гриппу.
Углубленное изучение эпидемических штаммов вирусов гриппа позволяет определить основные тенденции изменчивости вирусов гриппа А и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими и возникающими вновь в различных регионах земного шара. Результаты исследования не только расширяют наши теоретические знания об РНК-содержащих вирусах, но также имеют большое практическое значение как для расшифровки текущих, так и для прогнозирования грядущих эпидемий и пандемий.
Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы для проведения профилактических мероприятий (вакцинопрофилактики, создания противогриппозных вакцин, разработки специфических диагностических тест-систем). Успех вакцинопрофилактики зависит от многих факторов, в том числе от сходства антигенных детерминант вакцинных и эпидемических штаммов, иммуногенности вакцинных штаммов. Представляет определенный интерес исследование возможного влияния на изменчивость вирусов иммунитета, возникающего у привитых после вакцинопрофилактики с помощью живых и инактивированных гриппозных вакцин.
Особую роль в проблеме гриппа играет разработка новых методов диагностики вирусных инфекций. К началу наших исследований было известно ограниченное число тест-систем, используемых в иммунологических методах (РИА и ИФА). Были выявлены как достоинства, так и недостатки. Это побудило нас обратится к поиску и разработке новых диагностических систем. Нами впервые были использованы модификации флуоресцентных методов анализа для создания более совершенных и чувствительных методов индикации вирусов гриппа в биопробах Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлся этиологический надзор над распространением вирусов гриппа А и В в России и сопредельных государствах на протяжении 12 лет (1986-98) с последующим изучением молекулярно-
биологических основ изменчивости вирусов гриппа и возможного влияния на нее поствакцинального иммунитета.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило -определение этиологии эпидемий и подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ на территории России и сопредельных государств (СНГ, Чехия, Словакия);
-изучение вирусных популяций: сравнительный анализ антигенных, молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа А, В, изолированных в России со свойствами полипептидов референс штаммов,
-исследование свойств вирусов, изолированных из локальных вспышек и от спорадических случаев заболевания, не получивших широкого распространения;
-изучение влияния поствакцинального иммунитета, возникшего после прививок живой или инактивированной вакциной на свойства эпидемических штаммов вируса гриппа;
-отбор наиболее активных изолятов для последующего детального изучения антигенной структуры их полипептидов и генома;
-создание вирусной коллекции из наиболее актуальных эпидемических штаммов, циркулировавших в России в последние 12 лет и эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ;
-разработка и адаптация методов и лабораторных тест-систем для индикации и исследования вирусов гриппа в различных материалах.
Разрабатываемая тема включена в планы научно-исследовательских работ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН, комплексную программу борьбы с гриппом, программы работ по проблеме "Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение" Российской АМН и международного сотрудничества стран СЭВ по проблеме N4 "Грипп", в программу сотрудничества ВОЗ.
Работа была поддержана Международным научным фондом грант МА 3000, МА 3300; Российским фондом фундаментальных исследований грант N 93-04-7343
Положения, выносимые на защиту
1. На основании анализа вирусов гриппа, вызвавших в России и странах СНГ за последние 12 лет эпидемические подъемы заболеваемости гриппом и ОРВИ, установлена активная циркуляция вирусов гриппа А и В, с периодами одновременной циркуляции вирусов с различной антигенной формулой. Выявлено антигенное родство вирусов гриппа А (H1N1),A(H3N2) и В, изолированных в России^ со штаммами, циркулирующими в Евразии, особенно в государствах Азиатско-Тихоокеанского региона.
Антигенный дрейф поверхностных белков зарегистрирован у вирусов гриппа А и В, однако характер эволюционного процесса имел свои особенности для вирусов гриппа -линейный для A/H1N1, A/H3N2 и мультиплетный для В.
2. Определена и изучена новая ветвь эволюции вирусов гриппа В, циркулировавших в России с 1990г (В/Ямагата/16/88-подобные). Идентифицированные впервые в России в эпидемический сезон 1990-1991гг., эти вирусы доминировали в последующих эпидсезонах: 1992-93, 1995-96гг. заменив ранее эпидемически активные штаммы подобные В/Виктория/2/87. Новые штаммы имели существенные отличия в антигенных свойствах и первичной структуре поверхностных белков от штаммов подобных В/Виктория/2/87. Определены нуклеотидные и аминокислотные последовательности гемагглютининов вирусов гриппа В- представителей обеих групп, выделенных в 1987-97 гг. Построена общая картина эволюционных связей генов гемагглютининов вирусов гриппа В, изолированных с 1983 по 1993г. в России, Америке и Евразии.
3. Установлено, что вирусные белки у циркулировавших в последнее 12-летие штаммов A(H3N2) характеризовались вариабельностью у внутренних белков и изменчивостью, носившей линейный характер у поверхностных полипептидов.
-Антигенный дрейф поверхностных белков соответствовал дрейфу в белках эталонов, расположенных в следующей последовательности: А/Шанхай/11/89-А/Гуандонг/39/89-А/Пекин/353/89-А/Пекин/32/92-А/Иоганнесбург/33/94-А/Нанчанг/93 3/95- А/Сидней/5/97.
-Впервые определены аминокислотные последовательности гемагглютинина у некоторых эпидемических штаммов 1993, 1997г. изоляции.
-Выявлена вариабельность в структуре NP и M белков у вирусов, изолированных в разные эпидемические сезоны, и общие эпитопы NP вирусов гриппа человека и животных с помощью моноклональных антител методом ИФА, ТФ РИА.
4. Выявлена особенность эволюционного процесса у вирусов гриппа A/H1N1 за последние 12 лет: после 5-летнего перерыва возврат в активную фазу в эпидемическом сезоне 1995-96гг. Вирусы A(H1N1) социркулировали с вирусами A(H3N2) и В, сохраняя ведущую роль в заболеваемости детей и молодых людей в сезоне 1995-96.
-Антигенный дрейф гемагглютинина изолятов A/HlNl-(95-98) соответствовал дрейфу в НА эталонов А/Тайвань/1/86 -А/Техас/36/91-А/Иоганнесбург/82/96, подобный А/Байерн/95.
-Анализ антигенной активности НА и NP, проведенный с помощью моноклональных и поликлональных антител, показал гетерогенность вирусных популяций в одном эпидемическом сезоне.
5. Впервые при изучении иммуногенности гриппозных вакцин в широком эпидемиологическом наблюдении была использована предложенная нами модификация лектин-теста. Установлена высокая активность нейраминидазного компонента у отечественных живой и инактивированной гриппозных вакцин. Процент сероконверсий к нейраминидазе колебался в пределах 50% в зависимости от вида вакцин -ЖГВ А,ИГВ А, ЖГВ В и практически совпадал с сероконверсией к гемагглютинину.
6. Впервые показано, что для получения вирионных белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших высокую антигенную и иммуногенную активность, может быть использован электрофорез в агарозе. Предложенная модификация (введение предварительного этапа ферментативной обработки) позволяет получать внутренние белки (М и NP), сыворотки к которым специфичны, активны при
изучении вирусов гриппа современными методами: радиоиммунным (ТФ РИА), иммуноферментным (ИФА) и иммунофлуоресцентным (ФИА).
7. Впервые для идентификации вируса гриппа в растворах были использованы новая флуоресцентная метка копропорфирин и высокоочшценные иммуноглобулины IgG, выделенные из антисывороток к вирионны
-
Иванова, Валерия Тимофеевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1998
-
ВАК 03.00.06
- Эволюционная изменчивость вирусов гриппа A(H3N2) и B в период 2003-2013 гг. в РФ
- Молекулярно-эпидемиологический мониторинг гриппа в Азиатской части России
- Анализ эволюционной изменчивости и биологических свойств вирусов пандемического гриппа A(H1N1) pdm09, циркулировавших в России в период с 2009 по 2013 гг.
- Эволюционная изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа B, циркулировавших в России в период с 2004 по 2012 гг.
- Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом
