Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом"

На правах рукописи

Хашин Олег Валентинович

РАЗРАБОТКАНАБОРАРЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА А КУР ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ.

03.00.23 - биотехнология 16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Шелково - 2004 г.

На правахрукописи

Хашин Олег Валентинович

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА А КУР ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ.

03.00.23 - биотехнология_

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат

диссертации на соискание учепой степени кандидата биологических наук.

Шелково - 2004 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук и Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина.

Научные руководители:

доктор биологических наук Дмитрий Павлович Кузнецов

заслуженный работник высшей школы, лауреат премии Правительства РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Раиса Васильевна Белоусова. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Владимир Иванович Смоленский. кандидат биологических наук Владимир Глебович Лунин

Ведущее учреждение—Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Защита состоится 10 сентября 2004 года в 12 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

с5

августа 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Ю.Д.Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с сохранением в нашей стране крупных птицеводческих хозяйств, остается актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации птицы часто проявляется у кур. Грипп - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней кур при промышленном птицеводстве. Изучение гриппа кур в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшения качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

з

Для получения антивидовых иммуноглобулинов кур, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в класса.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам птиц они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов высокоочищеными антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Быстрый и точный диагноз гриппа кур является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели изадачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора реагентов на основе очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, используемых в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в им-муноферментном анализе.

Решались следующиезадачи: 1.2.1. Репродукцровать вирус гриппа А птиц, штаммы: А/утка/Альберта/35/76 (ИШ1); А/утка/Германия/1215/73 (И2Ш); А/утка/Украина/1/63 (И3Ш); А/утка/Чехословакия/56 (И4№); А/крачка/Южная Африка/61 (И5Ш); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (И6Ш); А/курица/СССР/315/70 (И6Ш); А/индюк/Онтарио/6118/68 (И8Ж); А/индюк/Висконсин/1/66 (И9Ш);

А/цыпленокДермания/49 (И10Ш); А/угка/Англия/56 (И1Ш6); А/угка/Апьберта/60/16 (И12№) и А/черноголовый хохо-тун/Астрахань/1421/79 (И13Ш) в 9 — 11 дневных 8РБ куриных эмбрионах.

12.2. Определить условия репродукции, вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (И1Ш) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (И9ГО) в. первично-трипсинизированной культуре клеток 8РБ куриных эмбрионов.

1.2.3. Разработать метод получения очищенных и концентрированных антигенов

вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/угка/Альберга/35/76 (И1Ш) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (И9Ш), репродуцированных в культуре клеток 8РБ куриных эмбрионов.

1.2.4. Получить панель антисывороток к 13 сероподтипам ((И1Ш), (И2№), (И3Ш), (И4Ш), (И5Ш), (И6Ш), (И7Ш), (И8Ш), (И9Ш), (И10Ш), (И1 Ш6), (И12Ш) и (И13Ш)) вируса гриппа А кур на 8РБ петухах.

1.2.5. Определить уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа А в

полученых антисыворотках и степень перекрестных реакций с гомологичными штаммами в РТГА

1.2.6. Выделить IgG кур, получить анти-^в кур антисывротки на кроликах, выделить анти-^в кур антитела и синтезировать анти-^в кур иммуноперокси-дазный коньюгат.

1.2.7. Разработать компоненты набора для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе.

1.2.8. Изучить воспроизводимость результатов по определению уровня антител к вирусу гриппа А, полученных с использованием разработанного иммуно-ферментного набора.

1.2.9. Исследовать специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур.

1.2.10. Провести сравнительную оценку чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной, переболевшей и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.

1.3. Научная новизна.

- В результате проведенной работы, определены условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 (Н1Ш) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (Н9Ш) в первично-трипсинизированной культуре клеток 8РБ куриных эмбрионов.

- Разработан метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (Н1Ш) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (Н9Ш), репродуцированных в культуре клеток 8РБ куриных эмбрионов.

- Разработана технология изготовления набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе.

- Определена воспроизводимость результатов и специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур,

- При изучении ретроспективного ответа на заражение вирусом гриппа птиц (НШ1, Н9Ю) установлено, что 60% цыплят имели положительные значения показателя отношения адсорбции образца к позитиву (о/п) в разработанном ИФА тесте через 2 недели после заражения, на пятую неделю после заражения - 90%. Результаты, полученные с помощью РТГА в этот период были негативными. Ответ в ИФА значительно увеличился на бустер-инъекцию к 25 неделе, и в РТГА к этому времени результаты были на 100% положительны. Эти данные свидетельствуют о возможности выявления анти-гриппозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА.

б

1.4. Практическаязначимостьработы.

Разработан набор для индикации и количественного определения антигриппозных антител в сыворотках крови кур.На основании результатов проведенных исследований разработана «Инструкция по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе» и проект нормативной документации.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном-анализе позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья кур, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

7.5. Апробацияработы.

Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на 2-ой международной учебно-методической и научно-практической конференции посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва (2004 г.), на международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию доктора ветеринарных наук профессора Кон-дюрина Н. Г.: «Актуальные вопросы микробиологии и инфекционной патологии животных», г. Омск (2004 г.).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены

на 132 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 65 отечественных и 136 зарубежный источников и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 20 рисунками и 3 схемами.

Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы иметоды

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук и Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина в 2002 -2004 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2000 - 2004г.

В работе использовали:

Вирус гриппа А птиц, штаммы: А/утка/Альберта/35/76 (Н1Ш); А/утка/Германия/1215/73 (Н2ГО); А/утка/Украина/1/63 (Н3Ш);

А/утка/Чехословакия/56 (Н4№); А/крачка/Южная Африка/61 (Н5№); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (Н6ГО); А/курица/СССР/315/70 (Н6Ш); А/индюк/Онтарио/6118/68 (Н8Ж); А/индюк/Висконсин/1/66 (Н9Ш); А/цыпленок/Германия/49 (Н10Ш); А/утка/Англия/56 (Н1Ш6);

А/утка/Альберта/60/16 (Н12№) и А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (Н13Ш), репродуцированные в 9 - 11 дневных 8РБ куриных эмбрионах и пер-вично-трипсинизированной культуре клеток 8РБ куриных эмбрионов.

Питательные среды: среда Игла, 199, ГЛАХ (институт полиомиелита, г.Москва); сыворотка КРС для культуральных работ (ООО Фуро), фетальная сыворотка коров (ООО Фуро).

Животные: 8РБ петухи массой 1-1,5 кг, кролики массой 2,5 - 3,0 кг. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

Концентрирование вируса гриппа А проводили осаждением ПЭГ с молекулярной массой 6000 кД, 40% сульфатом аммония, ультрацентрифугированием и методом ультрафильтрации на ячейках ФМ02-200 и ФМ02-1000 с использованием полупроницаемых мембран с пределом исключения 3 и 10 кД.

В работе по очистке вируса гриппа А от клеточных белков использовали ультрацентрифугирование в линейном градиенте сахарозы и Фиколла-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL (Польша) по заранее составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали культу-ральную среду с незаряженной вирусом гриппа А первично-трипсинизированной культурой клеток SPF куриных эмбрионов. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

Электронную микроскопию препаратов вируса гриппа А кур проводили методом просвечивающей микроскопии с использованием электронного микроскопа JEM-100 В при ускоряющем напряжении 80KV И инструментальных увеличениях от 40 до 300 тысяч раз.

Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26 (СССР).

Гемагглютинирующую активность определяли по методу Крюкова Н.Н. с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. Формалинизированные эритроциты петуха отмывали физиологическим раствором с рН 7,2. Готовили 0,5 - 1 % суспензию и равный объем ее добавляли к двукратным разведениям исследуемых препаратов. Затем оставляли на 6 часов при температуре 4 - 8 °С и учитывали реакцию. За титр гемагглютинации принимали высшее разведение вирус-содержащей суспензии, агглютинирующей эритроциты (на + ). В качестве контроля использовали физиологический раствор рН 7,2, к которому добавляли равный объем суспензии куриных эритроцитов.

Определение титра инфекционности вируса проводили по ЭИД/мл на куриных эмбрионах. Результаты оценивали по специфическому воздействию вируса на зародыши (множественные кровоизлияния, вплоть до гибели эмбриона) через двое - трое суток после заражения и рассчитывали титр вируса по методике Аш-марина и Воробьева.

Электрофорез в ПААГ и ДСН - ПААГ проводили по методу Лаэмли.

Электроперенос белков после окончания электрофореза в ДСН - ПААГ осуществляли по методике Тоубина.

Иммуноиндикацию белков на нитроцеллюлозных мембранах проводили в непрямом методе ИФА

Гипериммунные антисыворотки к IgG кур получали на кроликах по методу, разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из желтка куриных яиц путем двукратного переосаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с м.м. 6000 Д и центрифугированием при 14000 g с последующей доочисткой препарата IgG гель-фильтрацией на колонках с сефадексом G-200

Очистку анти-IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrCN-Сефарозу 4В очищенными иммуноглобулинами.

Контроль чистоты препаратов IgG осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ).

Однородность и специфичность препаратов IgG проверяли с помощью им-муноэлектрофореза.

Для получения коньюгатов анти-IgG кур с пероксидазой из хрена использовали перийодатный метод Nakane P. При проверке активности коньюгатов использовали метод прямого твердофазного ИФА. Рабочее разведение коньюгата определяли согласно инструкции по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, утвержденной Главбиопромом Агро-прома СССР в 1986г. Реакцию учитывали на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weemen и др. Результаты анализа учитывали визуально и фотометрически через 10-15 минут после внесения субстратного раствора.

Для расчета величины откорректированного позитивного контроля среднее значение адсорбции нормальной контрольной сыворотки вычитали из среднего значения адсорбции позитивного контроля.

Отношение адсорбции образца к позитиву (о/п) вычисляли путем вычитания среднего значения адсорбции нормальной контрольной сыворотки из среднего

10

значения адсорбции каждого образца. Разницу делили на откорректированный позитивный контроль.

(средняя адсорбция образца) - (средняя адсорбция нормальной контрольной S)

(адсорбция откорректированного позитивного контроля)

Титр исследуемой сыворотки вычислении с помощью следующего уравнения:

lg титра = (1,53 х lg о/п) + 3,087

Титр = антилогарифм lg титра

Результаты исследований обрабатывали статистически по таблицам Фишера, Стьюдента и программе Microsoft Excel.

2.2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Репродукция вируса гриппа А птиц вкуриныхэмбрионах.

Репродукцию вируса гриппа А птиц проводили на куриных эмбрионах. Заражение куриных эмбрионов 10-ти дневного возраста в аллантоисную полость проводили по общепринятой методике из расчета

Зараженные эмбрионы инкубировали в термостате при 37°С (оптимальная температура для вирусов типа А). После 48-часовой инкубации частично охлажденные (в течение 40 мин при -15-18°С) эмбрионы вскрывали в стерильных условиях и наличие вируса в амниотической и аллантоисной жидкости определяли с помощью реакции гемагглютинации. Определение титра инфекционности вируса проводили по на куриных эмбрионах. Результаты оценивали по специ-

фическому воздействию вируса на зародыши (множественные кровоизлияния, вплоть до гибели эмбриона) через двое - трое суток после заражения и рассчитывали титр вируса по методике Ашмарина и Воробьева.

Известно, что вирус гриппа, введенный в аллантоисную полость 10-11-дневного куриного эмбриона размножается прежде всего в эндотелиальных клетках хорион-аллантоисной оболочки, хотя вирус можно обнаружить также в клет-' ках амниотической оболочки и респираторных путей. Накопление вируса гриппа А птиц в полости аллонтоиса имеет очевидные преимущества, поскольку получа-

ется большой объем вируссодержащего материала. Однако гемагглютинирующая и инфекционная активность репродуцированного вируса зависит от его подтипа.

Формалинизированные эритроциты петуха отмывали физиологическим раствором с рН 7,2. Готовили 0,5 - 1 % суспензию и равный объем ее добавляли к двукратным разведениям исследуемых препаратов. Затем оставляли на 6 часов при температуре 4 - 8 °С и учитывали реакцию. Наилучшие результаты были получены при использовании 0,5% суспензии. Все дальнейшие реакции по определению ГА активности вируссодержащих жидкости проводили при этой концентрации формалинизированных эритроцитов петуха.

Выявить гемагглютинирующую активность исходного вируса (в аллантоис-ных жидкостях) удалось в при первом заражении исходным лиофилизированным препаратом. Опыты показали, что вирус гриппа А, штамм ГП1-А/угка/Апьберта/35/76 (И1Ш), накопленный в аллантоисной жидкости, обладает большей ГА-активностью по сравнению со штаммом ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (И9№), выращенным в тех же условиях. Титры в РГА 1:64 и 1:32, соответственно.

Дальнейшее пассирование вируса в 10-дневных куриных эмбрионах позволило увеличить титр гемагглютинирующей активности на 5-м пассаже до 1:4096 — 1:8192.

Несмотря на различия по гемагглютинирующей активности, оба исследуемых подтипа вируса гриппа А птиц оказались одинаково инфекционно активными: титр вируса составил 7 ^ ЭИД50/МЛ при первичном заражении и 7 - 8 на уровне 5-го пассажа в куриных эмбрионах.

При изучении специфичности разрабатываемого Набора необходимо наличие всех зарегистрированных на территории РФ сероподтипов вируса гриппа А птиц. Для этого все 12 полученные из контрольного института штамма: А/утка/Альберта/35/76 (И1Ш); А/утка/Германия/1215/73 (И2ГО); А/утка/Украина/1/63 (И3Ш); А/утка/Чехословакия/56 (И4Ш); А/крачка/Южная Африка/61 (И5Ш); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (И6Ш); А/курица/СССР/315/70 (И6Ш); А/индюк/Онтарио/6118/68 (И8Ж); А/индюк/Висконсин/1/66 (И9Ш);

А/цыпленок/Германия/49 (Ш0Ш); А/утка/Англия/56 '(НИ N6);

А/утка/Альберта/60/16 (H12N5) и А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (Ш3№) (кроме подтипа H7N1) были репродуцированы в 9 - 11 дневных SPF куриных эмбрионах.

Все репродуцированные штаммы работали в реакции гемагглютинации от 1024 до 16384.

2.2.2. Репродукцияs вируса гриппа А в первично-трипсинизированноп культуре клеток куриных эмбрионов.

Вирус гриппа А, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66, репродуцировали в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов (ККЭ) (1-й субпассаж).

Клетки выращивали на культуральной среде содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.

После образования монослоя клеток его трижды отмывали раствором Хен--кса и инокулировали вирус гриппа, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 в течение 1 часа при 20 °С из расчета 1-2 ИЭД5о/мл на клетку. Затем добавляли бессывороточную среду ГЛАХ, содержащую 40 единиц гентамицина на литр среды.

После проявления 50% 1ДПД культуральную жидкость сливали и объединяли соответственно штаммовой принадлежности. Клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 5000 об/мин в течение часа.

Надосадочную вирус-содержащую среду исследовали на инфекционную и гемагтлютинирующую активности.

Следующие пассажи на культуре ККЭ проводили при десятикратном разведении культуральной вируссодержащей среды.

Вирус, выращенный в культуре ККЭ, при первичном заражении проявляется в реакции ГА в титрах 1:4 - 1:16, обладает инфекционностью на уровне 6,8 -

8,0 ^ ИЭД50/МЛ. Однако величины этих различий от опыта к опыту были не однозначными и варьировали в значительном диапазоне.

В образцах первично-трипсинизированной культуры клеток ЭК, инфицированных дозой 1—2 ИЭД 50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса гриппа А птиц морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.

2.2.3. Очистка и концентрирование вируса гриппа А птиц.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса гриппа А птиц использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержа-щих суспензий.

При концентрировании вируса гриппа А птиц изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был испытан ПЭГ с различным молекулярными массами (м.м): 3000,6000 и 20 000 дальтон (Д) в концентрации 5,0,7,5 и 10,0%.

При концентрировании вируса гриппа А птиц ПЭГ очистка вируса достигает 88,1 - 97,9%. Потеря вируса равна 36,9—84,2%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7,5%. Очистка вируса равна 97,2 - 97,9%, а потеря 36,9%.

Для концентрирования вируса гриппа А птиц также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония—(N£14)2804.

Результаты свидетельствуют о том, что до 80% вируса гриппа А птиц осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 91,6%.

В вирусологических исследованиях для концентрирования вирусов все более широкое применение находит метод ультрафильтрации. Принцип метода основан на отделении вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенным пределом исключения по молекулярной массе.

Разделение вируса и культуральной среды на мембране происходит под действием разности рабочего и атмосферного давления по обе стороны мембраны.

Через полупроницаемую мембрану проходит культуральная среда и молекулярные соединения с м.м менее 10 тысяч дальтон, вирусные частицы задерживаются.

Концентрирование вируссодержащей суспензии проводили с использованием мембран УПМ 10 (НТЦ «Владипор») с пределом исключения 10 кД. Перед использованием фильтров визуально проверяли их целостность и затем опытным путем соответствие водопроницаемости паспортным данным.

В препаратах культурального вируса гриппа А птиц до и после концентрирования определяли общий белок и гемагглютинирующую активность. Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты вируса гриппа А птиц в 10-50 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на полупроницаемых мембранах является снижение в концентрате количества общего белка. При концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 -50 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 85,0 - 87,4%. При концентрировании препарата в 10 раз потерь вируса не наблюдалось, с повышением кратности концентрирования до 50 раз потеря вируса составляла 20,4%.

Гемагглютинирующая активность препарата вируса гриппа А птиц по мере концентрирования ультрафильтрацией достоверно увеличивается: в РГА с 1:81:32 в исходной суспензии до 1:64 - 1:256 при 50 - кратном концентрировании.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования полупроницаемых мембран для концентрирования вируса гриппа А птиц и перспективности дальнейших исследований в этом направлении.

Наряду с концентрированием вируса гриппа А птиц вышеописанными методами испытывали также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 100 000g в течение 1,2,3,4 и 5 часов.

Высокоскоростное центрифугирование при 100 000g в течение 4 часов позволяет практически полностью без потерь осадить вирус гриппа А птиц из ви-руссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 97,5 - 98,6%.

Концентрированный и частично очищенный вирус гриппа А птиц центрифугировали при lOOOOOg в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции определяли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и титр в ИФА.

Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 63,08%. Одновременно происходит очистка вируса гриппа А птиц на 97,1%.

Определение плавучей плотности вируса гриппа А птиц позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на «подушке» сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. На дно центрифужной пробирки помещали «подушку» из 55% сахарозы с плотностью 1,25г/см3, затем наслаивали 45% сахарозу с плотностью 1,20г/см3, а сверху - 25% сахарозу с плотностью 1,10г/см3. На такой преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 161000g в течение 90 минут.

Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 88,4% (3,2мг/мл белка в исходном препарате и 1,9мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 6 - 7 раз. Выход вируса составил 55,4%.

Таким образом, ультрацентрифугирование вируса гриппа А птиц в градиенте плотности 15% - 55% и на «подушке» сахарозы позволяет получить высоко-очищенный и концентрированный препарат вируса граппа А. Плавучая плотность вируса гриппа А птиц в растворе сахарозы равна 1,20г/см3.

Была также определена плавучая плотность вируса гриппа А птиц в градиенте Фиколл - 400. Для этого очищенный и концентрированный вирус на этапе осаждения ПЭГ М-6000 ресуспендировали в 0,06М трис-HCl буфере, содержащем 0,1 М NaCI и 1мМ ЭДТА (THE буфер), рН 7,3 и осветляли низкоскоростным цен-

трифугированием при 5000g в течении 10 минут. Вирус из надосадка осаждали ультрацентрифугированием при lOOOOOg в течение 4 часов. Осадок ресуспенди-ровали в THE буфере и наносили на линейный 10% - 40% градиент Фиколла-400. Центрифугирование проводили щи lOOOOCg в течение 4 часов.

По окончании центрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции определяли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и активность в непрямом твердофазном ИФА.

Вирус гриппа А птиц концентрировался в зоне, соответствующих 21 % -29% Фиколла-400 с плотностью 1,15 - 1,20г/см3, так как здесь были наивысшие титры инфекционности вируса, его гемагтлютинирующая активность, и активность в ИФА.

Фракции, содержащие вирус гриппа А птиц, объединяли. Степень очистки определяли по отношению титра инфекционности вируса к количеству общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен в 156 раз, потери составили 49%.

Таким образом, в линейном 10% - 40% градиенте плотности Фиколла-400 вирус гриппа А птиц располагался в зоне с плавучей плотностью 1,15 - 1,20г/см3.

Любой метод очистки вируса оценивается по степени чистоты полученных препаратов. Наиболее полные сведения об однородности полученного препарата вируса может дать одновременное исследование его несколькими методами.

Анализ результатов электронно-микроскопических исследований и сопоставление их с вирусологическими данными, показывает, что высокие и стабильные показатели биологической активности вируса, репродуцированного в пер-вично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов, обусловлены прохождением вирионами полного цикла морфогенеза и образованием ультраструктур, ответственных за гемагглютинирующую, инфекционную и в значительной мере антителообразующую активность.

Характерной чертой морфологии ортомиксовирусов является их гетерогенность - неоднородность размеров и форм вирионов. Свежевыделенные штаммы вируса гриппа, как правило, имеют нитевидную (филаментозную) форму. Эти

частицы часто изогнуты, имеют диаметр 70-80 нм и длину 200-300 нм, могут значительно превышать по длине размеры сферических частиц. В результате повторных пассажей вирус гриппа приобретает однородность и содержит в основном сферические и овальные формы частиц диаметром от 80 до 120 нм.

Таким образом, получены препараты вируса гриппа А кур, которые использовали в качестве антигена для сенсибилизации иммунологических планшетов при исследовании уровня антител к вирусу в сыворотках больной, переболевшей и вакцинированной птицы.

2.3.4. Получениепанели антисыворотокк 13 сероподтипам вируса гриппа А птиц.

Ввиду чрезвычайного антигенного дрейфа вируса гриппа А, для проверки специфичности разрабатываемой тест-системы необходимо было получить панель, подтипоспецифических сывороток. Для этого все 13 полученные из контрольного института штамма (кроме подтипа Н7Ш) были репродуцированы в куриных эмбрионах. Поскольку штамм ГП7-А/вирус чумы птиц/Росток/34 (Н7Ш) чрезвычайно патогенен для птиц, он был получен в инактивированном виде. Затем полученными препаратами вируса гриппа были иммунизированны 8РБ петухи (группы по 5 птиц) из расчета 1290 гемагглютинирующих единиц на птицу. После пятикратной внутримышечной иммунизации с интервалом в три дня и бустер -иммунизации через 21 день петухи были тотально обескровлены, и сыворотки проверены в перекрестной реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки к гомологичным антигенам имели титры в РТГА от 1:128 до 1:2048, с гетерологич-нымиот 1:4 до 1:32.

2.3.5. Получениеконьюгата анти-1§@кур спероксидазой изхрена

Для получения коньюгата анти-^О-Кур с пероксидазой из хрена необходимо наличие чистых препаратов ^О кур.

Способ выделения желточных антител путем двукратного переосаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с м.м. 6000 Д и центрифугированием при 14000 g с последующей доочисткой препарата ^О гель-фильтрацией на колонках с сефа-дексом О-200 дает возможность получить чистый препарат.

Контроль чистоты препаратов ¡яО проводили с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) в слабощелочной среде. О чистоте, препарата свидетельствует наличие одной полосы, располагающейся ближе к катодной части столбика.

Однородность и специфичность препаратов ¡яО проверяли в иммуноэлек-трофорезе. На специфичность препарата указывает наличие одной дуги преципитации, характерной для ¡яО.

Гипериммунную анти-^О кур сыворотку крови получали от кроликов массой 2,5 - 3,0 кг, приобретенных из благополучного по инфекционным болезням, хозяйства и прошедших 12-дневный карантин. В качестве антигена использовали • очищенный ¡яО кур.

При определении преципитирующей активности антисыворотки за титр активности препарата принимали последнее разведение, дающее видимую полосу преципитации в геле. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:64 - 1:128 и выше.

Специфическую активность полученной антисыворотки. определяли в им-муноэлектрофорезе.

Очистку анти-^О проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на ВгСп-Сефарозу, очищенными иммуноглобулинами кур.

Для получения коньюгатов анти-^О кур с пероксидазой из хрена использовали модифицированный периодатный метод Кякяпе.

Рабочее разведение полученного конъюгата определяли в прямом твердофазном ИФА титрованием с гомологичным (¡яО кур) и гетерологичным (¡яО кролика) иммуноглобулинами, адсорбированными в лунках полистерольных микроплат.

В рабочем разведении величина ОП450 в реакции с гомологичным иммуноглобулином составила 1,5, с гетерологичным - 0,02 оптические единицы.

После определения рабочего разведения коньюгата его лиофильно высушивали со стабилизатором (Декстран Т-70) в 10мл флаконах из расчета последующего разведения до рабочей концентрации в 10мл.

2.3.6. Разработка наборареагентов для определенияуровня антител к вирусу гриппаАкур в иммуноферментном анализе.

Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:100.

Оптимальное разведение антигена составило 1мкг/мл, что обеспечило высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.

Достоверно регистрируемое различие в показаниях оптической плотности наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:100. При разведении ниже 1:100 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции

Таким образом, была определена концентрация вируса и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для определения уровня антител к вирусу гриппа А иммуноферментным методом.

При разработке иммунологического контроля для подтверждения эффективности тест-системы использовалось несколько важных критериев — таких как воспроизводимость, чувствительность и специфичность.

В тесте на воспроизводимость использовали 5 планшетов для ИФА, сенсибилизированных антигеном вируса гриппа птиц. Высокоактивная, средне - и низкоактивная позитивная контрольная сыворотка проверялась на 30 из 96-ти лунок каждого из 5-ти планшетов. Данные были собраны по 15-ти планшетам и проанализированы. Коэффициент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени абсорбции положительной и нормальной контрольных сывороток были определены для оценки внутри- и межпланшетной воспроизводимости.

Среди лунок коэффициент вариации составил от 3 до 6%. Для адсорбции специфических антител на планшетах вариация составила около 4%. Коэффици-

ент вариации между отдельными планшетами был менее 4% для любой сыворотки и незначительно отличался между отдельными лунками.

При определении чувствительности тест-системы планшеты были сенсибилизированы антигеном вируса гриппа птиц. Высокоактивная антигриппозная сы-воротка-была разбавлена нормальной контрольной сывороткой в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,1:32,1:64 и 1:128. Эта калибровочная сыворотка была протестирована на ИФА планшетах, сенсибилизированных антигеном вируса гриппа птиц (5 копий на планшет).

С помощью разработанной тест-системы по выявлению антител к вирусу гриппа А птиц была продемонстрирована полная корреляция между разбавления и 1о§2 показателя отношения адсорбции образца к позитиву (коэффициент корреляции г2=98). ИФА был способен обнаружить специфические антитела к вирусу гриппа птиц в 5-7 разведениях высокоактивной антигриппозной сыворотки. РТГА может обнаружить специфические антитела только в первых трех разведениях. Все остальные разведения были негативны в РТГА.

Во втором опыте 16-ти недельные 8РР-цыплята были иммунизированы коммерчески доступной вакциной против гриппа А птиц в возрасте 16, 18 и 21 недели. Конечная бустер-инъекция была сделана цыплятам в возрасте 25 недель. У птиц в возрасте 16,18,21,23 и 27 недель брали образцы крови.

Каждая сыворотка была протестирована как с использованием ИФА, так и с помощью традиционного метода РТГА

При изучении ретроспективного ответа на заражение вирусом гриппа птиц (НШ1, Н9К2) установлено, что 60% цыплят давали позитивные значенияя показателя отношения адсорбции образца к позитиву (о/п) в разработанном тесте по выявлению антител к вирусу гриппа А птиц с через 2 недели после заражения. Четыре недели спустя после иммунизации титры продолжали расти. На пятую неделю после заражения 90% птиц показали положительные значения о/п. В этот период результаты, полученные с помощью РТГА, были негативными. Ответ в ИФА значительно увеличился после бустер-инъекции в возрасте 25 недель. К этому сроку результаты в РТГА были на 100% положительны. Эти данные свидетельст-

вуют о возможности выявления антигриппозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА

При исследовании специфичности тест-системы была протестирована полученная нами панель моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур. Показатели о/п колебались во всех образцах сывороток от 0,52 до 1,07, что значительно превосходит показатель о/п отрицательного контроля -0,15. Эти результаты свидетельствуют о том, что ИФА является высокоспецифичной реакцией, как и РТГА. Разброс в о/п значениях составил около 6% из-за вариаций между отдельными постановками опыта (на планшетах и в лунках).

Сыворотки, полученные из 4-х птицехозяйств, благополучных по гриппу птиц и предварительно проверенных в РТГА, были исследованы с помощью разработанного нами ИФА теста.

Данные показывают, что имеет место менее 1,6% случаев ложно положительных результатов (значение показателя о/п больше 0,499). Можно предположить, что ложно положительные образцы обычно были загрязнены бактериями или липидами. Для определения вероятности наличия ложно отрицательных результатов, необходимо получение большего количества данных полевых исследований стад, позитивность образцов сывороток которых установлена.

Таким образом в результате проведенных исследований были получены компоненты для проведения ИФА при определении уровня антител к вирусу гриппа А птиц, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость, чувствительность и специфичность разработанного теста.

З.Выводы.

3.1. Отработаны условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП-1 -А (утка/Альберт/15/76) (Н1Ш) и ГП-9-А (индюк/Висконсин/1/66) (Н9Ш) в первично трипсинизированной культуре клеток 8РГ куриных эмбрионов. Вирус (Н1Ш) имел большую ГА-активность по сравнению с (Н9№) и был равен 1:64 и 1:32, соответственно. К 5 пассажу титр ГА-активности увеличивался до 1:40961:8192. Титры инфекционности были равны 7 ^ ЭИД50/МЛ и 7-8 ^ ЭИД50/МЛ.

3.2. Разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса гриппа А, включающий осаждение ПЭГ М-6000 7,5%, высокоскоростное и градиентное центрифугирование, который позволил получить препараты с титром инфекционности выше, чем в исходной суспензии на 1,6-2,0 ^ ЭИД50/МЛ Очистка вируса от балластных белков достигла 98-99%.

3.3. Получена панель к 13 сероподтипам вируса гриппа A: (ШШ), (И2Ш), (ЮШ), (И4Ш), (ЮШ), (И6Ш), (ШШ), (И8Ш), (H9N2), (H10N2), (H11N6), (H12N5) и (Ш3Ш). Сыворотки к гомологичным антигенам имели титр в РТГА от 1:128 до 1:2084, с гетерологичными от 1:4 до 1:32.

3.4. Разработаны компоненты набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в иммуноферментном анализе, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость, чуствительность и специфичность разработанных реагентов для постановки ИФА.

3.5. Определен коэффицент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени адсорбции положительной и нормальной сывороток для оценки внутри- и межпланшетной воспроизводимости. Среди лунок кэффицент вариации составил 3-6%, для адсорбции специфических антител на планшетах - 4%, между отдельными планшетами - менее 4%.

3.6. Установлена при определении чуствительности метода полная корреляция между разбавлением сыворотки и показателем отношения адсорбции образца к позитиву (коффециент корреляции 1^=98). ИФА способен обнаружить специфические антитела к вирусу гриппа птиц в 5-7 разведениях антигри-позной сыворотки. РТГА выявляла специфические антитела только в первых трех разведениях.

3.7. При сравнительной оценке методов ИФА и РТГА для определения уровня антител в сыворотке было установлено, что 60% цыплят давали положительную реакцию в ИФА через 2 недели после заражения вирусом гриппа, через 5 недель после заражения - 90%, результаты в РТГА в этот период были негативными. Ответ в ИФА увеличивался на бустер - инъекцию к 25 неделе, к этому сроку результаты в РТГА были положительны на 100%. Это свидетельствует о воз-

можности выявления антигрипозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА

4. Практическиепредложения.

На основе проведенной работы представлен проект нормативной документации:

«Временная инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе» утверждена директором ВНИТИБП (25.06.04).

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Проект «Временного наставления по применению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Списокработу опубликованньжпотемедиссертации

1. Хашин О.В., Ярыгина Е.И., Кузнецов Д.П. //«Адаптация вируса гриппа А птиц к первичной культуре клеток куриных эмбрионов». Материалы 2-ой международной учебно-методической и научно-практической конференции посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. 2004 г. Том 2, стр. 115-119.

2. Хашин О.В., Ярыгина Е.И., Кузнецов Д.П. // «Репродуция вируса гриппа А птиц в первичной культуре клеток и аллантоисной полости куриных эмбрионов». // Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию доктора ветеринарных наук профессора Кондюрина Н. Г.: «Актуальные вопросы микробиологии и инфекционной патологии животных» Сборник научных трудов, г. Омск, 2004,. стр.451-454.

3. Ярыгина Е.И., Хашин О.В., Кузнецов Д.П., // «Репродуция вируса гриппа А птиц в аллантоисной полости и первично-трипсинизированной культуре клеток куриных 8РБ-эмбрионов». // «Доклада: Российской академии сельскохо-зяйственых наук», № 6.

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. № 101 тир. 100

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хашин, Олег Валентинович

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Общая характеристика семейства ортомиксовирусов

2.1.1. Грипп А

2.1.2. Структура и функция гемагглютинина

2.1.3. Структура и функция нейраминидазы

2.1.4. Структура и функция липидов

2.1.5. Структура и функция М белка

2.1.6. Структура и функция NP белка

2.1.7. Структура и функция белков-полимераз

2.2. Структура генома

2.3. Антигенная изменчивость вирусов гриппа 21 2.3.1. Антигенная структура гликопротеидов вирусов гриппа

2.4. Этапы репликации вируса гриппа 25 2.4.1. Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А

2.5. Лабораторная диагностика гриппа птиц

2.5.1. Выделение вируса 31 2.5.1.1 .Взятие и подготовка материала 31 2.5.1.2. Заражение куриных эмбрионов

2.5.2. Серодиагностика и ретроспективная диагностика

2.5.3.1.РТГА

2.5.2.2.РСК

2.5.2.3. Реакция радиального гемолиза

2.5.2.4.Иммуноферментный метод для диагностики гриппа птиц

2.6. Очистка и концентрирование вируса гриппа А и его структурных компонентов

2.7. Профилактика гтриппа типа А 43 2.7.1. Серологическая оценка поствакцинального иммунитета

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом"

1.1. Актуальность темы.

Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с сохранением в нашей стране крупных птицеводческих хозяйств, остается актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации птицы часто проявляется у кур. Грипп - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней кур при промышленном птицеводстве. Изучение гриппа кур в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшения качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов G, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам птиц они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Быстрый и точный диагноз гриппа кур является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, использзуемых в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в иммуноферментнм анализе.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Репродукцровать вирус гриппа А птиц, штаммы: А/утка/Альберта/35/76

H1N1); А/утка/Германия/1215/73 (H2N3); А/утка/Украина/1/63 (H3N8); А/утка/Чехословакия/56 (H4N6); А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (H6N2);

А/курица/СССР/315/70 (H6N2); А/индюк/Онтарио/6118/68 (H8N4); А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2); А/цыпленок/Германия/49 (H10N7); А/утка/Англия/56 (H11N6); А/утка/Альберта/60/16 (H12N5) и А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (H13N2) в 9 - 11 дневных SPF куриных эмбрионах;

1.2.2. Определить условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП1

А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

1.2.3. Разработать метод получения очищенноых и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированного в культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

1.2.4. Получить антисыворотки к 13 сероподтипам ((H1N1), (H2N3), (H3N8),

H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N7), (H11N6), (H12N5) и (H13N2)) вируса гриппа А кур на SPF петухах;

1.2.5. Определить уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа

А в полученых антисыворотках и степень перекркстных реакций с гомологичными штаммами в РТГА;

1.2.6. Выделить IgG кур, получить анти-IgG кур антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG кур антитела и синтезировать анти-IgG кур иммунопероксидазный коньюгат;

1.2.7. Разработать компоненты набора для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе;

1.2.8. Определить воспроизводимость результатов по определению уровня антител к вирусу гриппа А полученных с использованием разработанного иммуноферментного набора;

1.2.9. Исследовать специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур;

1.2.10. Провести сравнительную оценку чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.

1.3. Научная новизна.

- В результате проведенной работы, определены условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

- Разработан метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированного в культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

- Получена панель антисывороток к 13 сероподтипам ((H1N1), (H2N3), (H3N8), (H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N7), (H11N6), (H12N5) и (H13N2)) вируса гриппа А кур на SPF петухах; Определен уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа А в полученых антисыворотках и степень перекркстных реакций с гомологичными штаммами в РТГА;

- разработана технология изготовления набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе;

- Определена воспроизводимость результатов и специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур;

- Проведена сравнительная оценка чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-гриппазных антител в сыворотках крови кур.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья кур, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Обшая характеристика семейства ортомиксовирусов.

Вирусы гриппа принадлежат семейству Orthomyxoviridae [62]. Это семейство включает в себя четыре рода: род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа А, род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа В, род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа С, и род Thogotovirus. Такая классификация вирусов гриппа получила свое применение с 1990-х годов при участии Международного Комитета Таксономии Вирусов [150].

Вирионы ортомиксовирусов имеют липидосодержащие наружные оболочки, на которых расположены большие поверхностные выступы («шипы»). Вирусные оболочки окружают спиральный нуклеокапсид, имеющий диаметр от 9 до 15 нм. Характер укладки нуклеокапсида в вирионе неизвестен. Геном ортомиксовирусов состоит из восьми молекул одноцепочечной негативной РНК и имеет суммарную молекулярную массу 5 - 106 Да [175]. Все вирусы семейства имеют от семи до десяти главных полипептидов. Вирусы обладают гемагглютинирующей активностью, обусловленной наличием гликопротеинового комплекса поверхностных «шипов». Репродукция ортомиксовирусов происходит в ядре и в цитоплазме, а сборка включает этап отпочковывания от плазматической мембраны. При смешанном заражении вирусы этого семейства могут обмениваться сегментами генома. Это явление получило название реассортации сегментов или рекомбинации вирусов гриппа.

Обнаружено, что ортомиксовирусы распространены в природе чрезвычайно широко, как в плане географическом, так и в плане круга хозяев вируса. Важность вирусов, входящих в это семейство настолько велика для гуманитарной (грипп занимает третье место по наносимому ущербу [109]) и ветеринарной медицины, а сами вирусы настолько интересны своей антигенной и генетической структурой, что вирус гриппа стал одной из наиболее часто встречающихся моделей в исследованиях по иммунологии, молекулярной биологии и генетике. Следствием такого внимания к ортомиксовирусам стал огромный по объему и значению поток информации по различным аспектам их биологии [20, 25, 62, 229]. Однако, подавляющее большинство получаемых данных и в настоящее время относится к вирусам гриппа человека. Это естественно, учитывая его уникальную роль в патологии человека, но существенно затрудняет понимание общих закономерностей, свойственных природе вирусов гриппа в целом. Только в последнее десятилетие сформировалось понимание тех фактов, что циркуляция вирусов гриппа в природе - это целостный процесс, в который вовлечены вирусы гриппа целого ряда видов животных и человека; что генетический обмен между штаммами вирусов гриппа [29, 30], поражающих разные виды хозяев, - это не экзотика, а каждодневная реальность; что очаги и пути распространения эпидемически и эпизоотически опасных штаммов и вариантов нельзя выявить, изучая только вирус гриппа человека, равно как только вирус гриппа любого другого вида животных.

Всех хозяев вируса гриппа можно условно разделить на три группы в первую - попадают животные - эндемики, во вторую - животные, кочующие в естественных условиях пли перемещаемые человеком, в третью -самую интересную - сам человек, птицы, в первую очередь перелетные и домашние, и, в меньшей степени, морские сезонно мигрирующие млекопитающие. Важностью последней группы и обусловлен выбор объекта исследований -вируса гриппа птиц - в настоящей работе.

Многочисленные исследования свидетельствуют о необычайной способности вируса изменять антигенную структуру и биологические свойства своих поверхностных гликопротеидов в процессе циркуляции [18, 24, 151, 203, 201, 214]. Изменчивость приводит к формированию и постоянной замене антигенных детерминант поверхностных антигенов другими, что обеспечивает гетерогенность возбудителей, и, вероятно, основной механизм противодействия популяционному иммунитету. В результате качественных изменений гемагглютинина (НА) и нейраминидазы {NA} возникают новые подтипы вируса гриппа, обусловливающие возникновение пандемий, эпизоотии гриппа. Каждая новая пандемия или эпизоотия вызывается возбудителем, антигенная структура которого в той или иной степени отличается от структуры возбудителя предыдущей вспышки гриппа [50].

Характерной чертой современных эпизоотий гриппа является возможность одновременной циркуляции на протяжении одного и того же периода в одном и том же ареале хозяина нескольких вариантов вируса гриппа, различающихся по антигенной специфичности гликопротеидов.

2.1.1. Грипп А

Вирус гриппа типа А, вызывающий заболевание человека, свиней, лошадей и птиц, представлен рядом типов. Типы включают в себя антигенные варианты, которые различаются по составу поверхностных гликопротеидов - НА и NA. В настоящее время различают 14 подтипов вируса гриппа по гемагглютинину и 9 noNA [142, 143, 155, 189, 213].

Характерной чертой морфологии ортомиксовирусов является их гетерогенность - неоднородность размеров и форм вирионов. Свежевыделенные штаммы вируса гриппа, как правило, имеют нитевидную (филаментозную) форму. Эти частицы часто изогнуты, имеют диаметр 70-80 нм и длину 200-300 нм, могут значительно превышать по длине размеры сферических частиц. В результате повторных пассажей вирус гриппа приобретает однородность и содержит в основном сферические и овальные формы частиц диаметром от 80 до 120 нм.

Структура вирионов вируса гриппа в настоящее время достаточно подробно изучена и обобщена во многих литературных обзорах [20, 36, 37, 42, 67, 83, 93, 128, 133, 157, 206, 216].

Структурными компонентами вируса гриппа являются одноцепочечная фрагментированная РНК (0,8-1,1 %), белки (70-75 %), липиды {20-24 %) и углеводы (5-8 %}.

Вирус гриппа представлен нуклеокапспидом со спиральным типом симметрии и наружной оболочкой, имеющей сложную пространственную организацию [201,229].

Поверхностный слой вириона вируса гриппа образован множеством пепломеров, представляющих собой экстрамембранные части гликопротеидов - НА и NA. Внутримембранные части этих двух белков и липидный бислой, происходящий из плазмалеммы клеток-хозяев, образуют мембрану вириона. Непосредственно к ее внутренней поверхности примыкает слой, образованный М-белком, находящимся в непосредственном контакте с С- и N-концевыми фрагментами гликопротеидов. Таким образом, вирусная оболочка сформирована тремя белками и липидным бислоем. Сердцевина вириона представлена нуклеокапсидом, образованным спиралью рибонуклеопротеида, состоящего из фрагментированной вирионной РНК, и нуклеопротеинов.

Функциональная роль компонентов вириона, в общих чертах, известна. Мембранная оболочка определяет форму и целостность вириона, обеспечивает защиту вирионного рибонуклеопротеидного комплекса от воздействий внешней среды.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Хашин, Олег Валентинович

6. Выводы

6.1. Отработаны условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП-1-А (утка/Альберт/15/76) (H1N1) и ГП-9-А (индюк/Висконсин/1/66) (H9N2) в первично трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов. Вирус (H1N1) имел большую ГА-активность по сравнению с (H9N2) и был равен 1:64 и 1:32, соответственно. К 5 пассажу титр ГА-активности увеличивался до 1:4096-1:8192. Титры инфекционности были равны 7 lg ЭИД50/мл и 7-8 lg ЭИД50/МЛ.

6.2. Разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса гриппа А, включающий осаждение ПЭГ М-6000 7,5%, высокоскоростное и градиентное центрифугирование, который позволил получить препараты с титром инфекционности выше, чем в исходной суспензии на 1,6-2,0 lg ЭИД50/мЛ- Очистка вируса от балластных белков достигла 98-99%.

6.3. Получена панель к 13 сероподтипам вируса гриппа A: (H1N1), (H2N3), (H3N8), (H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N2), (H11N6), (H12N5) и (H13N2). Сыворотки к гомологичным антигенам имели титр в РТГА от 1:128 до 1:2084, с гетерологичными от 1:4 до 1:32.

6.4. Разработаны компоненты набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в иммуноферментном анализе, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость, чуствительность и специфичность разработанных реагентов для постановки ИФА.

6.5. Определен коэффицент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени адсорбции положительной и нормальной сывороток для оценки внутри- и межпланшетной воспроизводимости. Среди лунок кэффицент вариации составил 3-6%, для адсорбции специфических антител на планшетах - 4%, между отдельными планшетами - менее 4%.

6.6. Установлена при определении чуствительности метода полная корреляция между Iog2 разбавлением сыворотки и Iog2 показателем отношения адсорбции образца к позитиву (коффециент корреляции г =98). ИФА способен обнаружить специфические антитела к вирусу гриппа птиц в 5-7 разведениях антигриппозной сыворотки. РТГА выявляла специфические антитела только в первых трех разведениях.

6.7. При сравнительной оценке методов ИФА и РТГА для определения уровня антител в сыворотке было установлено, что 60% цыплят давали положительную реакцию в ИФА через 2 недели после заражения вирусом гриппа, через 5 недель после заражения - 90%, результаты в РТГА в этот период были негативными. Ответ в ИФА увеличивался на бустер - инъекцию к 25 неделе, к этому сроку результаты в РТГА были положительны на 100%. Это свидетельствует о воз-можности выявления антигрипозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА.

7. Практическая значимость

На основе проведенной работы представлен проект нормативной документации:

Временная инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе» утверждена директором ВНИТИБП (25.06.04).

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Проект «Временного наставления по применению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хашин, Олег Валентинович, Шелково

1. Баречкова Е . , Любовцева О.Е., Русс Г., Стик Б., Закстельская Л. Я., Яхно М.А // Анализ нейраминидазы вируса гриппа с помощью лектинового теста и моноклональных антител /.//Acta virol.- Vol. 30, №4.-P. 281-288.(1)

2. Варич Н.Л. // Механизм синтеза РНК вируса гриппа. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989,4: 3-13. (2)

3. Вебстер Р., Лейвер В., Эйр Г. // Антигенные вариации // Генетика вирусов гриппа. М., 1986,- С.123-160. (18)

4. Вебстер Р.Г, Лейвер В.Г. // Антигенная изменчивость вируса гриппа // Вирусы гриппа и грипп / Под ред. Е.Д. Килбурна 1978.- С.309-354. (17)

5. Гендон Ю. 3. // Молекулярные основы изменчивости эпидемических штаммов вируса гриппа человека // Молекул, генет., микроби-ол. и вирусол. 1985,- №8,- С.3-12. (24)

6. Голубев Д.Б. // Происхождение пандемических штаммов вируса гриппа А // Вопр. вирусол. 1932.- №3. - С. 130-135. (29)

7. Голубев Д.Б., Константинов В.К. // Современные аспекты учения об антигенной изменчивости вируса гриппа // Актуальные проблемы иммунологии, вирусологии, химиотерапии и эпидемиологии инфекционных заболеваний. -Л.,1373,- С.140-144. (33)

8. Голубев Д.Б., Константинов В.К., Парамонова М.С. // Биологические и молекулярные аспекты антигенной изменчивости вируса гриппа // Этиология, эпидемиология, лечение и профилактика гриппа и других респираторных инфекций.- Л., 1978.- С.5-13. (32)

9. Голубев Д.Б., Медведева М.Н. // Экспериментальное моделирование антигенной изменчивости вируса гриппа при персистенции // Профилактика и лечение гриппа. Л., 1976,- С.38-49. (31)

10. Голубев Д.Е. // Происхождение пандемических и эпидемических штаммов вируса гриппа // Обзорная информация. Медицина и здравоохранение. Серия: эпидемиология, вирусология и инфекционные заболеваний.- ВНИИМИ, 1985. Вып.1.- 70с. (30)

11. Гринбаум Е.Б. // Изучение иммунологических взаимоотношений нейраминидаз различных штаммов вируса гриппа А // Проблемы гриппа и острых респираторных заболеваний. Л.,1973.- №3 . -С.84-89. (35)

12. Гурачевская Л.П. // Достижения науки в изучении структуры вируса гриппа // Научно-технический прогресс и медико-биологические аспекты охраны окружающей среды, рациональное использование природных ресурсов,- Душанбе, 1983.- С.25-27. (37)

13. Дубова Е.А. , Саятов М.Х., Ямникова С. С. // Изучение антигенного дрейфа вирусов гриппа различного происхождения с использованием

14. Жансеитова М.Т. // Изоляция и изучение свойств вирусов гриппа А, ассоцниорованных с дикими птицами и членистоногими . // Авто-реф.дисс. канд . мед . наук : 03.00.06,- Алма-Ата.: 1983 .- 23с. (40)

15. Жданов В.М. // Проблемы гриппа и генная инженерия // Молекул, генетика, микробиол. и вирусология.- 1984,- N-7 . С. 3-6. (41)

16. Жилинская И.Н.//Структура вируса гриппа //Успехи современной биологии. 1983.- Т.95, №3. - с.с. 373-382. (42)

17. Жирнов О.П. // Аномальные изоэлектрические свойства матриксного белка Ml вирусов гриппа. // Вопросы вирусологии, 1991, 36(3): 191194. (7)

18. Жирнов О.П. // Белки вируса гриппа: получение растворимого полипептида Ml посредством поэтапной депротеинизации вирионов. // Молекулярная биология, 1991, 25: 375-379. (6)

19. Жуматов К. X. и др. Докл. АН Респ. Казахстан, 1992, 4,4 :48.(1)

20. Жуматов К.Х. // Антигенная композиция гемагглютининов вирусов гриппа // Биология вирусов гриппа. Тр. инст. микр. и ви-русол. АН КазССР.- 1987.- Т. 32.- С. 74-90. (43)

21. Закстельская JI. Я. // Некоторые методологические особенности изучения роли птиц в экологии вирусов гриппа //Экология вирусов, связанных с птицами. Минск, 1374.- С. 12-13. (45)

22. Закстельская Л. Я., Исаченко В. А., Оскерко Т. А., Шендеро-вич С.Ф. // Изменения в антигенной композиции гемагглютинина вирусов гриппа A (H1N1) в 1977-1982гг, выявленные с помощью моноклональных антител //Вопр. вирусол.- 1934.-Т.29,№.1.- С. 62-66. (49)

23. Закстельская Л. Я., Яхно М.А., Исаченко В.А., Антонов И.В. // Изменчивость вирусов гриппа А и ее значение в эпидемическом процессе // Актуальные вопросы общей и медицинской вирусологии.-М., 1986.-С. 104-1 15.(50)

24. Закстельская Л.Я., Молибог Е.В., Хлюстов С.В., Исаченко В. А. // Штаммовые различия в специфичности нейраминидазы подтипа N1. // Вопр. вирусол. 1977,- N-6. - С. 67 9-682. (135)

25. Иванова В.Т., Закстельская Л.Я., Трушинская Г.Н., Шендерович С.Ф., Любовцева О.В. // Использование агарозы для изоляции белков вируса гриппа, сохранивших высокую иммуногенность. // Вопр. Вирусологии, 1983,4: 32-34. (13)

26. Исаева Е.И., Белкина Т.С., Ровнова З.И. // Антигенное маркеры в гемагглютининах вирусов гриппа типа A(H1N1) различных периодов циркуляции // Вопр. вирусол.- 1983.- №6.- С.702-706. (56)

27. Исаева Е.И., Ровнова З.И., Полякова Т.Г., Подчерняева Г.Я. // Новые сайты в составе гемагглютининов эпидемических вариантов вируса гриппа A(H3N2) 1989-1990гг. //Вопр. вирусол.-1991.-N5.- С.368-371. (88)

28. Исаева Е.М., Иванова В.Т., Ровнова З.И. // Картирование сайтов гемагглютинина вирусов гриппа H3N2 1990-1993гг выделения // Вопр. вирусол. 1994. - №2. - С,62-65. (68)

29. Исаева Е.С., Чувакова З.К., Березин В.Э. // Гликопротеиды ортомиксовирусов. Алма-Ата, 1988,- С.1-168. (62)

30. Исмайлова И.М. // Антигенный состав гемагглютининов вируса гриппа типа А2 H2N2. // Дисс. канд. мед. наук.03.00.06.-М. ,1984.-170с. (64)

31. Каверин Н.В., Варич Н.Л., Склянская Е.И. // Молекулярные механизмы смешанной гетеротипической гриппозной инфекции. // Сборник "Молекулярная биология вирусов", 1985, стр. 20-27. (14)

32. Карпухин Г.И. // Грипп.- // Л.«Медицина,1986.- 346с. (67)

33. Карпухин Г.И. // Грипп: (Руководство) Л.Медицина,1986.- 352с.:ил. (36)

34. Килбурн Э.Д., Шоппин П.В., Компанс Р.В. // Вирусы гриппа и грипп // Под ред. Э.Д. Килбурна; Пер. с англ. И.Г.Харитоненкова и др.; Под ред. Д.К.Львова.- М.:Медици-на,1978.- 585с.:ил. (20)

35. Кингсбери Д.У. // Генетика вирусов гриппа: // Пер. с англ. Под ред.П.Пейлиза,.- М.:Медицина,1986.- 336 с.:ил. (25)

36. Косяков П.Н., Панкратов B.C., Ровнова З.И. // Антигены гемагглютинина вирусов гриппа, выделенных от человека и птиц // Вопр. вирусол.- 1979,- №3.- С.242-246. (74)

37. Кущ А.А., Цой Л.А., Исаева Е.П. // Изучение гибридом, продуцирующих моноклинальные антитела к вирусам гриппа // Вопр.вирусол.- 1985.- №1,- С.22-24. (53)

38. Лашкевич В.А. // Использование моноклональных антител в вирусологии // Вопр.вирусол.- 1983,- №5,- С.648-655. (77)

39. Лузянина Т. Я . , Голубев Д . Е ., Иванова Н.А. // Антигенный профиль нейраминидазы вирусов гриппа А, выделенных в 1957-73гг // Acta virologica-1974.-Т. 18,Вып.6.-G 479485. (8)

40. Львов Д.К., Подчерняева Р.Я., Вебстер Р. // Получение рекомбинантов, антигенно идентичных циркулирующим в природе штаммам вируса гриппа // Вопр. вирусол.- 1979.- №5.-С.493-497. (102)

41. Маркушин С.Г. // Актуальные вопросы молекулярной генетики вируса гриппа А // Молекул, генетика, микробиол. и вирусология.-1984.- №8.- С.3-12. (82)44