Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование иммунологических препаратов ранней этиологической диагностики вирусных ОРЗ на основе гибридомной технологии

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование иммунологических препаратов ранней этиологической диагностики вирусных ОРЗ на основе гибридомной технологии"

На правах рукописи

МОНАЕНКОВ Анатолий Олегович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ РАННЕЙ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ОРЗ НА ОСНОВЕ ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

03. 00. 06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа Российской академия медицинских наук. Директор института - доктор биологических наук О.И. Киселев.

Научные руководители: доктор медицинских наук A.A. Соминина кандидат медицинских наук В.Б. Климович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор O.A. Аксенов доктор медицинских наук Н.В. Яковлева

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится "¿о" эилА&р^ 1997 г. в " часа заседании Диссертационного совета Д 001.46.01 при Научно-исследовательс институте гриппа РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ гриппа РАМН.

Автореферат разослан ¿^"^fcujp^ 1996 г-

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук С^^// Е.Е.Покровская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование средств и методов диагностики вирусных ОРЗ приобретает в последние годы всё большую практическую и теоретическую значимость в связи с разработкой новых средств этиотропной терапии, химиопрофилактики и необходимостью осуществления эпиднадзора за гриппом. Точный анализ эпидемического процесса невозможен без расшифровки природы и структуры вирусных ОРЗ.

К наиболее важнейшим, эпидемически значимым возбудителям ОРЗ, как известно, принадлежат вирусы гриппа [Жданов,1958, А.А.Смородинцев, 1984], респираторно-синцитаалъный вирус (PCB) [Chanock К., 1957, Дрейзин P.C.,1968, Zhdanov V.M.,1974] и аденовирус (AB) [Дрейзин P.C., 1962, Дяченко Н.С.,1988]. Успех специфической терапии этих инфекций с применением химиопрепаратов или иммуноглобулинов направленного действия, прежде всего, зависит от правильной и быстрой идентификации возбудителя вирусного заболевания. Наиболее чувствительными и специфичными иммунологическими тестами обнаружения вирусных антигенов в настоящее время являются иммуноферментный (ИФА), иммунофлуоресцентный (ИФЛ), радиоиммунный анализы (РИА), в меньшей степени иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Наибольшее практическое распространение получили простые и доступные практике методы ИФЛ и ИФА. ИФЛ выгодно отличается от других методов быстротой анализа (1-2 часа с момента поступления материалов), тогда как достоинством ИФА является возможность одновременного исследования большого числа клинических образцов. ИФА позволяет, кроме того, проводить количественное определение вирусных антигенов, что удобно для проведения мониторинга инфекционного процесса. Материалы, подлежащие анализу, могут достаточно долго сохраняться в замороженном состоянии.

Поликлональные иммуноглобулины, ранее используемые при постановке этих реакций, характеризуются гетерогенностью состава сывороточных антител, что таит в себе эпасность перекрестной неспецифической реактивности с хозяйскими антигенами. Получаемые в результате иммунизации животных препараты антител трудно поддаются стандартизации в силу отличий составляющих популяцию антител по аффинитету и эпитопной направленности.

Многие из этих проблем успешно решаются при использовании в диагностике ;шмунореагентики моноклонального типа. Моноклональные антитела (МКА), впервые эазработанные Келлером и Милынтейном в 1975 г., в отличие от поликлональных антител 'ПКА), характеризуются высокой степенью гомогенности как по изотипам антител, так и шитопной направленности, аффинитету, специфичности, что особенно важно при использовании высокочувствительных тестов [А.М.Егоров, 1991]. Гибридомная технология эткрывает возможности препаративного накопления больших количеств МКА при юкращении затрат на их изготовление.

Подготовка панели МКА с охарактеризованной эпитопной направленностью не только существенно расширяет возможности диагностических реакций, для которых, как ■фавило, отбираются антитела с широким спектром реактивности [Walls H.H., 1986], но эткрывает новые перспективы для углубленной характеристики антигенной структуры зирусных изолятов и изучения путей эволюции возбудителя [Webster R.G., 1981; Lu B.L., 1982].

Известно, что МКА способны распознавать одиночные аминокислотные замены в ;оставе отдельных вирусных детерминант, что, естественно, невозможно при использовании толиклональной иммунной сыворотки [Arbiza J. et.al.l992].

Высокая специфичность МКА исключительно ценна для создания усовершенствованных диагностических препаратов, повышения чувствительности и точности методов идентификации вирусов. Существуют возможности получения антител к отдельным эпитопам, характерным для данного штамма вируса. Использование МКА открывает новые, еще мало исследованные возможности и в понимании механизмов^ и мишени действия новых антивирусных соединений.

Цель и задачи исследования. Главная цель исследования заключалась в разработке новых и совершенствовании существующих средств и методов диагностики вирусных ОРЗ, для чего потребовалось решить следующие основные задачи.

1. Разработать новые и изучить свойства полученных ранее моноклональных антител к наиболее значимым возбудителям вирусных ОРЗ (грипп А, грипп В, респираторно-синцитиальный вирус и аденовирус).

2. Разработать и провести сравнительные исследования различных методов ранней диагностики вирусных ОРЗ (ИФЛ, ИФА в планшетном и дот - мембранном исполнении).

3. Оценить эффективность теста микропланшетного культивирования вирусов с оценкой уровня их репродукции в ИФА (ММК-ИФА), возможности его использования для первичной индикации возбудителей ОРЗ, а также для оценки ингибирующего воздействия противовирусных субстанций (специфических антител, химиопрепаратов).

Основные положения, выносимые на защиту

Новые препараты МКА к вирусам гриппа типа В, респираторно-синцитиальному вирусу и аденовирусу, впервые разработанные в России, являются перспективными иммунореагентами, которые могут быть использованы в различных иммунотестах детекции вирусных антигенов.

Применение разработанных в ходе исследования МКА открывает новые возможности в повышении чувствительности и специфичности диагностических тестов, включая новый вариант микропланшетного культивирования вирусов с ИФА оценкой уровня их репродукции.

Разработка метода ИФЛ на основе МКА обеспечивает повышение стандартизации иммунореагентики и надежности диагностики за счет отчетливой локализации специфического свечения, облегчающей интерпретацию результатов.

Использование определенных типов МКА в иммуноферментных реакциях полностью устраняет развитие неспецифических реакций взаимодействия с Ьоз^компонентами при повышении уровня специфического сигнала, что обеспечивает высокую чувствительность и специфичность тестов.

Использование моноклональных антител 4Н7, обладающих вируснейтрализующей активностью и направленных к субъединице ГА2 молекулы гемагглютинина вируса гриппа В показало, что в составе вирусов гриппа В имеется эпитоп, характерный для эволюционной ветви вирусов, берущей свое начало от эталона В/Ямагата/16/88.

Научная новизна работы

Впервые в России получены панели моноклональных антител к наиболее значимым возбудителям вирусных ОРЗ - вирусам гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу и аденовирусам.

Впервые дана характеристика эпитопной направленности, биологических и диагностических свойств полученных МКА.

Впервые определено, что моноклональные антитела 4Н7 к молекуле гемагглютинина вируса гриппа В, 9С5 к Б-протеину респираторно-синцитиального вируса, 7Р1 и 1ЕП к гексонному антигену аденовирусов, 1С6 и Б8 к нуклеопротеину вируса гриппа А являются

перспективными реагентами для использования в диагностических иммунофлуоресцентных и иммуноферментньгх реакциях.

Впервые экспериментально установлено, что моноклональные антитела 4Н7 (к вирусу гриппа В), а также моноклональные антитела 8С5 и 8В10 (к PC-вирусу) обладают вируснейтрализующей активностью, что представляет интерес для разработки новых средств антивирусной терапии, а также структурной детерминации доменов, ответственных за индукцию вируснейтрализующих антител.

Впервые показано, что параллельное использование моноклональных антител 1С6 к консервативной детерминанте нуклеопротеина вируса гриппа типа А и моноклональных антител 33F11 к молекуле гемагглютинина вируса гриппа типа A (H3N2), реагирующих в пределах субтипа, позволяют осуществлять типовую и субтиповую идентификацию изолятов вирусов гриппа типа А в микропланшетном варианте ИФА.

Практическая значимость работы. Изучение набора МКА по признакам, существенно важным для диагностических целей (специфическая активность, стабильность свойств при реклонировании и рекультивировании, при лиофилизации и хранении, возможность конъюгации с флуоресцеин-изотиоцианатом - ФИТЦ и пероксидазой хрена) показало, что в наибольшей мере этим требованиям отвечают моноклональные антитела 4Н7 - для диагностики гриппа типа В, 1С6 - гриппа типа А 9С5 - респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и моноклональные антитела 7F1 и 1Е11 - для распознавания заболеваний аденовирусной этиологии (в реакциях ИФЛ и ИФА). Результаты клинической апробации свидетельствуют о том, что МКА 33F11 могут быть использованы для субтиповой диагностики гриппа А методом микропланшетного культивирования (ММК-ИФА); моноклональные антитела 4Н7 оказались эффективным иммунореагентом для ранней диагностики гриппа типа В прямым иммунофлуоресцентным методом. Моноклональные антитела 9С5 к респираторно-синцитиальному вирусу, меченые ФИТЦ, давали наиболее высокие результаты при ранней диагностике РСВ-инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом. Использование ММК-ИФА с применением моноклональных антител к вышеперечисленным возбудителям позволяет проводить первичный скрининг противовирусных препаратов.

Моноклональные антитела 4Н7 целесообразно использовать в изучении антигенного дрейфа вирусов гриппа типа В, показывая независимый путь эволюции вирусов ямагатской ветви от викторианской линии. При исследовании вирусов гриппа 55-летнего периода циркуляции установлено, что эпитоп, к которому направлены МКА 4Н7, впервые обнаруженный в составе вируса В/Ямагата/16/88, сохраняется у большинства изолятов последних лет выделения.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции "Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов" (Санкт-Петербург, 1994), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (1996 г.), а также представлены на международных конференциях "Progress in clinical virology" (Прага, 1995) и Xth International Congress of Virology (Иерусалим, 1996).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в отечественном журнале и тезисы в трудах симпозиумов и двух международных конгрессов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц и 24.. рисунка . Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения и списка литературы. Список литературы включает^.?.. источников на русском и/££~на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моноклональные антитела. Совместно с ЦНИИРРИ (г.Санкт-Петербург) получены 5 типов МКА (9С5, 8С5, 8В10, 10D8 и 7ВЗ) к респираторно-синцитиальному вирусу, совместно с ВНИИВВиМ (г. Покров) получены 5 типов МКА (4Н7, All, 2F4, G12, BIO) к вирусу гриппа типа В, и проведено исследование иммунологических свойств 6 типов МКА (1Е11, 7F1, ЗН8, ЗВ1, 1Е8 и 3F1) к аденовирусу, полученных из ВЦМДиЛ, (г.Москва). Моноклональные антитела к вирусам гриппа А (1С6, F8 и 33F11) были получены в ВНИИВВиМ (г. Покров), ВЦМДиЛ (г.Москва) и НИИОЧБП (г.Санкт-Петербург), соответственно.

Вирусы. В работе использовали вирусы гриппа типа А человека с антигенной формулой H1N1 и H3N2 и вирусы гриппа типа В (полученные из музейной коллекции лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа НИИ гриппа РАМН), а также штамм респираторно-синцитиального вируса Long и аденовирус 6 серотипа, штамм Tonsill (из музея лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН).

Вирусы гриппа А и В размножали в аллантоисной полости куриных эмбрионов в течение 48 и 72 часов при 37° и 32е, соответственно, при дозе заражения 102 - 103 ЭИД50-PCB и AB выращивали в роллерной культуре HeLa в среде Игла МЭМ, с множественностью инфицирования 0,01 - 0,001 ТЦД50. Продолжительность цикла культивирования - 3-4 суток для PCB (до развития выраженного симпластообразования в клеточном монослое) и 2 - 3 суток для AB (до формирования характерного ЦПД в виде гроздеобразных скоплений клеток).

Содержание инфекционного вируса гриппа определяли титрованием на куриных эмбрионах, вирусов ОРЗ - титрованием в пробирочных культурах клеток M-HeLa (клон 7886), титры выражали в lg ТИД50 [по Reed and Muench, 1938]. Концентрацию гемагглютининов в вируссодержащей жидкости определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием 1% суспензии эритроцитов кур.

Метод микропланшетного культивирования вирусов использовали для накопления вирусных антигенов в инфицированных клеточных культурах с их последующей детекцией в иммунопероксидазной реакции [Ziegler Т.,1995]. Для этого в лунки 96-луночных планшетов (Sarstedt, Newton, США) с культурой клеток MDCK или МА-104 вносили клинические материалы или контрольные референс-вирусные препараты. Планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в течение 10 мин. для выравнивания pH, и затем центрифугировали при 1500 об/мин. 60 минут. Через 48 часов инкубации при 37° в термостате с подачей СО2 среду удаляли, монослой фиксировали 80% холодным ацетоном. Моноклональные антитела к вирусам гриппа типа А, В, PCB и AB разводили в ФСБ, содержащем 5% обезжиренного сухого молока до оптимальных для ИФА концентраций и вносили в соответствующие лунки планшета. Для детекции антигенов вирусов гриппа и ОРЗ использовали пероксидазный кроличий антимышиный конъюгат, а в качестве субстрат-хромогенной смеси - 3,3',5^5' тетрамегилбензидин (ТМБ) в концентрации 0,1 мг/мл в присутствии 0,005% перекиси водорода. В качестве стоп - реагента использовали 2н H2SO4. Результаты учитывали на иммуноферментном анализаторе фирмы "ANTHOS" при длине волны 450 нм.

Антивирусную активность МКА к PC-вирусу на стадии адсорбции вируса к клеткам и на стадии проникновения вируса в клетку проводили, согласно Mufson, 1985. Изучение нейтрализующей активности МКА 4Н7 к вирусу гриппа В/Панама/45/90 в реакции гемадсорбции проводили, согласно Johnson, 1971.

Иммуноферментный анализ, В зависимости от задач экспериментов в работе использовали различные варианты твердофазного ИФА. В качестве антигенов использовали культуральные жидкости вирусов гриппа и ОРЗ и препараты тех же вирусов, очищенных методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Выделение фракции IgG МКА из асцитической жидкости проводили согласно методу Wolfson, 1948 (с использованием сульфата аммония) или по методу Franek, 1986, с использованием 3% раствора риванола. Аффинную хроматографию на Protein А - Sepharose 4В (Pharmacia) использовали по методике, предложенной Еу et all., 1978. Пероксидазные конъюгаты на основе МКА (МКА*Пох) готовили по методу Nakane, 1974 и Tijssen, 1985.

Для титрования МКА и поликлональных гнпериммунных кроличьих сывороток, а также для определения нарастания титра специфических антител в парных сыворотках больных, использовали непрямой ИФА с пресорбированными на твердой фазе (ТФ) вирусными антигенами, на которые наносили испытуемые антивирусные антитела и затем Пох - конъюгаты антивидовых иммуноглобулинов.

Для определения специфической активности пероксидазных конъюгатов противовирусных антител использовали прямой вариант с пресорбированными на ТФ вирусными антигенами.

Для индикации вирусных антигенов и определения лимита чувствительности иммуноферментных тест - систем (ИФТС) использовали прямой и непрямой варианты ИФА, при котором на ТФ сорбировали противовирусные антитела.

Для определения эпитопной направленности МКА использовали конкурентный вариант ИФА.

Метод флуоресцирующих антител (ИФЛ). Использовали прямой [Coons, Kaplan, 1950] и непрямой [Weiler, Coons, 1954] вариант ИФЛ с применением МКА или ПКА для детекции вирусных антигенов в клеточных культурах и клинических материалах.

Определение титра и уровня противовирусных антител. Содержание антител в крови пациентов определяли с помощью РТГА и ИФА в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995). Для ИФА использовали ИФТС, разработанные в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН [Voyscechoyskaya EM., et. al, 1991] при использовании конъюгатов МКА к IgG и IgM человека (Климович В.Б. и др., 1988). Эти ИФТС предназначены для дифференциальной диагностики гриппа типов А и В, а также РС-вирусной и аденовирусной инфекции. При исследовании парных сывороток от больных диагностически достоверным считали 4-х и более кратный прирост титров антител (в РТГА) или увеличение оптической плотности (ОП) продуктов ИФА не менее чем на 0,3 ед.

Клинические материалы. С помощью ИФЛ были исследованы носоглоточные смывы (НГС) от 265 пациентов, госпитализированных в различные клиники Санкт-Петербурга с диагнозом гриппа и ОРЗ, от больных во время эпидемических вспышек в детских коллективах, а для контроля - от больных с соматической патологией без признаков ОРЗ. НГС получали в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995), суспендировали в 1,5 мл. ФСБ и хранили до исследования при -25°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение иммунологических свойств моноклонапьных антител к респираторно -синцитиальному вирусу.

Моноклональные антитела к PC-вирусу были получены до начала настоящего исследования в результате совместной работы лаборатории гибридомной технологии ЦНИИРРИ и лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН.

После процедур слияния и клонирования, проведенных М.П.Самойлович, для дальнейшей работы было отобрано 5 гибридом. По результатам проведенного исследования установлено, что полученные МКА к респираторно-синцитиальному вирусу (9С5, 8С5, 8В10 и 10D8) являются высокоспецифичными иммунореагентами, отличающимися друг от друга по способности взаимодействовать с цельновирионными (РСВо) и субвирусными (РСВкж) структурами. В составе культуральной (КЖ) и асцитической (АЖ) жидкости МКА 9С5 и ЗВ10 взаимодействовали преимущественно с очищенным концентратом PC-вируса (РСВо) -[ группа, а МКА 8С5 и 10D8 - с культуральной жидкостью PC-вируса (РСВкж) - II группа 'рисунок 1). Моноклональные антитела к PCB сохранили свою способность взаимодействовать с РСВо или РСВкж и после их конъюгации с пероксидазой. Контроль ;пецифичности анти-РСВ МКА проводили при помощи непрямого варианта ИФА с гспользованием КЖ вирусов гриппа и других ОРЗ, иммобилизованных на твердой фазе. Для ¡сех МКА уровень неспецифического реагирования при взаимодействии с вирусами laparpunna 1-3-типов, AB и вирусами гриппа типа А и В соответствовал фоновому (рисунок '.), МКА 7ВЗ после реклонирования утратили способность специфически реагировать с PCB I стали неспецифически взаимодействовать с препаратами HeLa, вследствие чего из (альнейшего исследования были исключены ( см. рисунок 1).

Сказанное позволило предположить, что МКА первой группы направлены к шитопам поверхностных структур вируса, тогда как МКА второй группы, вероятнее всего, оаимодействуют с эпитопами, которые в цельных вирионах не экспонированы, но обильно федставлены в составе РСВкж, где присутствуют "растворимые антигены" PCB, федставляющие собой вирусные полипептиды, не включенные в состав вирнонов, ¡ыходящие в культуральную среду по мере развития вирусного ЦПД, которые могут сличаться от выявляемых в ИФА антигенов цгльновирионных суспензий по :онформационному состоянию белков и уровню погружения эпитопов, реагирующих с ЛКА. Представляло интерес изучение эпитопной направленности полученных МКА, [меющее важное значение для целей диагностики, т.к. это позволяет выбрать МКА, 1еагирующие с антигенными детерминантами, менее всего подвергающимся изменениям. 1о данным иммуноблотгинга, проведенного совместно с И.А.Ивановой, МКА 8С5 заимодействовали с белком, имеющим M около 90,000 Д, что соответствует белку G. Специфичность МКА 9С5 была установлена при использовании конкурентного ИФА при равнении с МКА 131-2А и 92-11С, полученных из Центра по контролю заболеваемости Atlanta, USA) с уже охарактеризованной эпитопной направленностью (таблица 1).

По степени конкуренции МКА к респираторно-синцитиальному вирусу были азделены на 3 группы:

К первой из них относились МКА 8С5 и 10D8, отличающиеся своей реактивностью сключительно с РСВкж. Они имели общую эпитопную направленность, отличную от МКА С5 и 8В10.

Во вторую группу вошли МКА 9С5, которые, судя по результатам выраженной онкуренции с МКА 131-2А и умеренной конкуренции с МКА 92-11С, были направлены к дному и тому же эпитопу (Fla), локализованному на F - белке [Anderson, 1986].

гтр" МКА 3!

Р С В о + М К А к ж

1тр МКА

7 В 3 8 В10 8 С 5 9 С 5 10 О 8

Шифры МКА

РСВ о * М К А аж

7 В 3 8 В10 8 С 5 9 С 5 10 О 8

Шифры МКА

ТитрМКА

РСВ к ж + М К А кж

Титр-1 МКА

7 В 3 8 В10 8 С 5 9 С 5 10

Шифры МКА

РСВ кж+МКАаж

7 В 3 8 В10 8 С 5 905 10 0

Шифры МКА

'исунок 1. Специфическая активность культуральной жидкости МКА и очищенной фракции МКА из асцитной жидкости в непрямом варианте ИФА.

Обозначения:

3 - РСВо или РСВкж

лизаты клеток Не!_а или КЖ не инфицированных клеток НеЬа

490

10 Э 8

гриппА 7В,

8 В10

Шифры МКА

Рисунок 2. Результаты исследования перекрестного реагирования монклональных антите респираторно-синцитиальному вирусу с другими возбудителями ОРВИ методом ИФА.

К третьей группе были отнесены МКА 8В10, которые не конкурировали ни с одним из МКА»Пох., кроме гомологичного.

Таблица 1

Эпитогткая направленность моноклональных антител к РС-вирусу по данным конкурентного ИФА.

ШИФРЫ НЕМЕЧЕНЫХ ШИФРЫ МЕЧЕНЫХ МКА

МКА 8С5 10D8 8В10 9С5

8С5 шщш /îî>> -

10D8

8В)0

,9С5

92-11С

131-2А EssSîi

Примечание:

Смеси меченых и немеченых МКА инкубировали в планшетах с иммобилизованным РС-вирусом. В качестве антигена, иммобилизованного на твердой фазе, для МКА 8С5 и 10D8 использовали РСВкж, для МКА 8В10 и 9С5 -РСВо.

Уровни ингибиции

более 60%

30% - 60%

менее 30%

Дальнейшие исследования были посвящены изучению вируснейтрализующей активности трех МКА - 8С5, 9С5 и 8В10. Оказалось, что МКА 8В10 и 8С5 в большей степени обеспечивают блокирование адсорбции PCB к клетке, чем на стадии проникновения, что свидетельствует, с одной стороны, в пользу их функционального родства, а с другой, подтверждает их направленность к G - белку, ответственному за связывание с рецепторами клеток. МКА 9С5 к белку слияния проявляли свою активность преимущественно на стадии проникновения PCB в клетку.

Следующим разделом работы было конструирование ИФТС на основе моноклональных антител к PC-вирусу. Один из наиболее распространенных на практике методов детекции вирусных антигенов основан на применении иммобилизованных на твердой фазе антител на стадии захвата и меченых ферментом специфических антител на стадии детекции. При этом МКА, направленные к определенным эпитопам на поверхности вирусного белка, позволяют создавать тест - системы повышенной чувствительности и специфичности. В то же время и комбинированное использование ПКА на стадии

иммобилизации и моноклональных антител на стадии детекции позволяет достич] достаточно высокие результаты при выявлении вирусных антигенов [Doller С., 1992]. Е нашей работе для конструирования ИФТС были использованы различные сочетания МК/ на стадии иммобилизации и МКА*Пох на стадии детекции, а также комбинацщ иммобилизованных ПКА с детекторными МКА*Пох. Положительной считалась проба значение ОП490 которой превышало среднее значение ОП490 отрицательных контрольны; проб на 35 и более.

Для МКА 8С5, иммобилизованных на твердой фазе, достаточно высокие показател! специфической активности были получены при использовании импортных планше' высокой сорбционной емкости и гомологичных пар МКА и МКА меченых пероксидазой Данная система позволяла выявить РСВкж в разведении до 10 ТТЩ/50 при отсутствш неспецнфического реагирования с антигенами HeLa. Наилучшие результаты при выявленш РСВо были получены при использовании гомологичной пары МКА9С5 + МКА*Пох9С5. I этой ИФТС удавалось определять до 10 нг/мл очищенной вирусной суспензии. Bei остальные комбинации моноклональных антител и пероксидазных конъюгатов на их ochobi оказались менее эффективными при выявлении РСВо или РСВкж. Чувствительност! системы ПКА к PCB + МКА*Пох9С5 оказалась равноценной системе МКА9С5 -МКА*Пох9С5 (рисунок 3). Преимущество ИФТС поли - моноклонального типа состоит i том, что при ее конструировании было возможно использовать планшеты отечественной производства, в то время как для ИФТС МКА9С5 + МКА*Пох9С5 пригодными оказание] лишь планшеты высокой сорбционной емкости (фирм "Титертек" или "Костар") Чувствительность ИФТС на основе сочетания гетерологичных пар МКА + МКА*По: оказались ниже (по сравнению с гомологичными).

1 5 °тп 4 ' °

МКА S С 9 + МКАхПОХ 8С5

о | ■!■ I |ДГШН I |ДМ1—иДШ—U- I иш^—тш—

1000 100 10 ТЦД80РСВ кж

вп.,,

1 .........." " " х П О X 9 С 5

1 • а I 1«« 1« нг/мл рсво

Рисунок 3. Иммуноферментные тест-системы на основе моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусу.

£ - РСВкж или РСВо

I I - культуральная жидкость контрольных не инфицированных клеток НеЬа

2. Получение и характеристика МКА к вирусу гриппа типа В.

Моноклональные антитела к вирусу гриппа типа В, штамм В/Панама/45/90, был] получены совместно с ВНИИВВиМ, г. Покров.

По результатам повторного скрининга по высокому уровню специфическо; активности было отобрано гать клонов. Моноклональные антитела были очищены мегодо-аффинной хроматографии и исследованы в непрямом варианте ИФА. Титр МКА очищенным вирусом гриппа В, сорбированным на ТФ составлял 105 - I06. Уровен неспецифического реагирования с аллантоисным вирусом гриппа А/Ленинград/3 85/8' (H3N2) не превышал фоновых значений.

Препараты четырех клонов (All, BIO, 2F4 и G12) после конъюгации с пероксидазо! по методу Tijssen, 1985, приобрели способность взаимодействовать с вирусом гриппа t аллантоисного происхб^ения, которая была не свойственна исходным препаратам МКА связи с чем они были исключены из дальнейшего исследования. Для целей детекции вирус использовали МКА 4Н7, сохранившие специфическую активность после конъюгации пероксидазой.

В целях повышения чувствительности и специфичности ИФТС детекции антигено вируса гриппа В дальнейшие исследования были посвящены выбору оптимальны концентраций иммунореагентов в составе ИФТС, а также оценке возможкост; использования в качестве антител "захвата" кроличьих ПКА к вирусу гриппа типа Е Шахматным титрованием установлено, что при использовании планшет АО "Медполимер наибольший специфический сигнал при детекции низких концентраций вируса (в диапазон от 60 до 7,8 нг/мл) достигается при высокой концентрации МКА на стадии "захвата (концентрация насыщения 40 мкг/мл) и конъюгата МКА 4Н7 в разведении 1:500. При эти условиях лимит чувствительности ИФТС составил 7 нг/мл вирусного белка (рисунок 4' Необходимость использования высоких концентраций МКА удорожает стоимость тест системы. В этой связи проведен анализ возможности конструирования ИФТС пола моноклонального типа, в которой на стадии "захвата" использовали ПКА полученные результате иммунизации кроликов высокоочшценной суспензией вируса В/Панама/45/9( Оказалось, что отдельные серии ПКА (например, 588, 369) в сочетании с конъюгатом МК, 4Н7 обеспечивают достижение того же лимита чувствительности как и ИФТ< моноклонального типа при полном сохранении специфичности реагирования (рисунок 5 Вместе с тем другие серии ПКА оказались не пригодными для ИФА в силу низког специфического сигнала.

Сказанное позволяет рекомендовать для дальнейшего использования ИФТС н основе моноклональных антител 4Н7 и соответствующего конъюгата МКА при услови использования большой концентрации МКА (не менее 40 мкг/мл) на стадии иммобилизаци планшет. Альтернативным решением является конструирование ИФТС с использованием н стадии иммобилизации специально подобранных серий поликлональных иммуноглобулине к вирусам гриппа и пероксидазного конъюгата МКА 4Н7 на стадии детекции.

Принципиально важным оказался раздел исследования, связанный с изучение возможности применения ИФТС с использованием конъюгатов МКА 4Н7 для детекци вирусов гриппа разных лет выделения. Оказалось, что современные вирусы В/Санк-Петербург/209/95 и В/Иоханнесбург/26/94 выявляются этими же МКА в тех я концентрациях, что и вирус-иммуноген (В/Панама/45/90). В этой связи представляв интерес оценить эпитопную направленность МКА 4Н7 с использованием иммуноблоттинг выполненного совместно с И.А.Ивановой, результаты которого показали, что МКА 4Н направлены к эпитопам, локализованным на малой субъединице гемагглютинина - ГА2.

весовое количество вируса гриппа весовое количество вируса гриппа

Рисунок 4. Сравнительные данные детекции вируса гриппа Рисунок 5. Сравнение чувствительности ИФТС при В/Панама/45/90 при различных (10 и 40 мкг/мл) концентрациях использовании на стадии иммобилизации поли или

иммобилизованных моноклональных антител в ИФА . моноклональных антител и конъюгата МКА*Пох 4Н7 на стадии

детекции.

Д-А

- детекция очищенного градиентным центрифугированием вируса гриппа В/Панама/45/90

- контрольные пробы (вирус гриппа А в тех же концентрациях)

Как известно, в составе молекулы гемагглютинина находятся как изменчивые, так и высоко консервативные детерминанты, которые могут принимать участие в агглютинации куриных эритроцитов или не участвовать в этом процессе. В связи с вышесказанным, следующий раздел исследований был посвящен изучению антигемагглютинирующей и вируснейтрализующей активности полученных препаратов МКА. Моноклональные антитела 4Н7 обладали выраженной ингибирующей активностью в РТГА (вплоть до разведения 1:20480) и обладали нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа В/Панама/45/90 до титра 1:160. Исследован спектр реагирования МКА 4Н7 с большим набором (43 штамма) вирусов гриппа В 1940 - 1995 г.г. выделения, существенно отличающихся по антигенной характеристике гемагглютинина. Согласно данным перекрестной РТГА, любезно предоставленных в.н.с. лаборатории эволюционной изменчивости НИИ гриппа О.М.Литвиновой, все исследованные штаммы условно могли быть разделены на 13 групп, каждая из которых включала антигенно родственные вирусы, соответствующие одному из эталонов ВОЗ. Взаимодействие с ними МКА 4Н7 оценивали с помощью РТГА и ИФА.

По данным РТГА гемагглютинирующая активность штаммов 1988-1995 г.г. выделения, ведущих свое происхождение от штамма В/Ямагата/16/88, как правило, подавлялась МКА 4Н7 в высоких разведениях (до 1/10240 - 1/20480). Только в группе штаммов, подобных В/Квиндао/102/91 (12 группа) встречались отдельные штаммы, слабо реагирующие с МКА 4Н7, титр (1:10 - 1:2560), тогда как другие штаммы этой группы ингибировались МКА 4Н7 в разведениях до 1:20480. В целом полученные данные свидетельствуют о нарастании гетерогенности в 12 группе и дрейфе вирусов, захватывающем эпитоп, с которым реагируют МКА 4Н7. У штаммов, составляющих группы с 1 по 9 (1940 - 1991 г.г. выделения) в РТГА не обнаружено никакого взаимодействия с МКА 4Н7. Данные ИФА тесно коррелировали с данными РТГА: в ИФА выявлялись лишь те штаммы вируса гриппа В, чья гемагглютинирующая активность ингибировалась МКА 4Н7 в РТГА.

Таким образом, штаммы, взаимодействующие с МКА 4Н7 в РТГА и ИФА, являются дрейф-вариантом вируса гриппа В/Ямагата/16/88. В то же время ни один из вирусов гриппа, относящийся к эволюционной ветви вирусов гриппа типа В, берущих свое начало от вируса В/Виктория/2/87 (группа 9), или штаммов, выделенных . ранее (группы 1-8) не взаимодействовал с МКА 4Н7 ни в РТГА, ни в ИФА (рисунок 6). Это свидетельствует о том, что в составе вирусов гриппа В в 1988 году появился новый эпитоп, типичный для вирусов 1988 - 1995 г.г. выделения. Судьба этого эпитопа в будущем не известна, однако появление новых штаммов, слабо реагирующих с МКА 4Н7, не исключает возможности изменения его антигенной структуры (или конформационной перестройки молекулы ГА2). Сказанное определяет необходимость дальнейших исследований по расширению панели МКА, включающих антитела к высоко консервативным детерминантам внутренних белков вируса гриппа В.

3. Иммунологическая характеристика монооональных антител к аденовирусу.

МКА к аденовирусу 2 типа были разработаны к началу наших исследований В.К.Сологубом в ВЦМД и Л (г.Москва). По данным автора, разработанные препараты МКА

были направлены к гексонному антигену, общему для всех типов АВ человека. Как показали

наши исследования, все МКА (1Е11, ЗН8, ЗВ1, 1Е8 и 7F1), за исключением 3F1, обладают высокой специфической активностью в отношении очищенного концентрата аденовируса (АВо) и культуральной жидкости аденовируса (АВкж) - титр антител в ИФА 1:105 - 1:106. Ни у одного из МКА не обнаружено способности к неспецифическому реагированию с

/ I I

I/

В/С-Пегерб/130/95«« В/С-Петерб/93/95» В/С-Петерб/89/95» В/Москаа/91 /95 »»• В/Н.Новг/291/95...

В/С-Петерб/72/95« В/С-Петерб/182/95»»»

В/С-Петрб/142/94»»» В/С-Петрб/144/94«»«

В/Иоханн/26/94«»« В/Харбин/7/94»»» В/С-Петерб/212/94»««

1994

1993

1991

1990

1989

1988

1987

1986

1985

1983

1979

Рисунок 6. Антигенный дрейф вирусов гриппа типа В, изученный с помощью МКА 4Н7. ■ ■ - дрейф вирусов гриппа В ("Ямагатская ветвь") Степень реагирования с МКА

- дрейф вирусов гриппа В ("Викторианская ветвь") - не реагируют

• эталонный вирус - основной представитель группы

| - группы вирусов гриппа В

*** - высокая (1/10т - 20т)

** - средняя (1/2т - 1/5т) * - низкая ( менее 1/2)

клетками хозяина. Отработана технология получения пероксидазных конъюгатов МКА аденовирусу. Исследование их специфической активности в прямом варианте ИФ. показало, что для целей приготовления конъюгатов с пероксидазой в наибольшей степей пригодны МКА 1Е11, 1Е8, 7F1 и ЗВ1. Конъюгаты МКА ЗН8 приобрели способность связыванию с РСВ, а МКА 3F1 оказались слабоактивными.

Дальнейшие исследования были направлены на конструирование ИФТС детекци аденовирусного антигена на основе использования описанной выше моноклонально реагентики. Методом "сэндвич"-ИФА когда МКА использовали в качестве антите. иммобилизованных на поверхности планшет, а для детекции использовали гомологична МКА меченые пероксидазой, установлено, что минимальные количества антигенов АВ (д 1,5 нг/мл) удавалось выявить при использовании МКА 1Е11 в качестве антите; иммобилизованных на твердой фазе, и этих же антител, меченых пероксидазой. Уровеи неспецифического реагирования с РСВо и НеЬа соответствовал фоновому значении Сравнение чувствительности ИФТС с использованием планшет производства различны фирм показало, что лимит чувствительности ИФТС, сконструированных на планшета повышенной сорбционной емкости фирмы "Labsystem" в 4-8 раз выше, чем на планшета АО "Медполимер" при соблюдении прочих равных условий. Четырехкратное увеличени концентрации захватывающих антител для сорбции на планшетах АО^Медполимер4'н позволило достигнуть показателей чувствительности, регистрируемых на полистирол высокой емкости фирмы "Labsystem" (рисунок 7). Все остальные пары МКА (1Е8, ЗВ1, 7F1 ЗН8), сорбированных на твердой фазе и гомологичных МКА меченых пероксидазой, "сэндвич"-варианте ИФА проявили высокий уровень неспецифического реагирования РСВо и HeLa, и по этой причине не могли быть использованы для выявления минимальны количеств АВ.

В этих исследованиях была показана также возможность замены канцерогенног субстрата ортофенилендиамина, отдельные партии которого к тому же обладали низко активностью в ИФА, на препарат отечественного производства 3,3',5,5' тетраметилбензиди (ТМБ).

Изучение спектра перекрестной реактивности МКА к аденовирусу в конкурентно] ИФА показало, что все исследованные пары МКА*Пох - конъюгат (1Е8, 7F1, 1Е11, ЗВ1, ЗН и 3F1) отличались друг от друга по спектру реагирования (таблица 2) и по результата] конкуренции они условно могли быть подразделены на 3 группы.

I - Моноклональные антитела ЗН8 составили отдельную группу, поскольку не влиял на связывание с антигеном конъюгатов остальных МКА а реакцию конъюгата МКА*По ЗН8 не подавляло ни одно из немеченых МКА;

II - Моноклональные антитела 3F1, как и МКА I группы, не влияли на связывание антигеном конъюгатов остальных МКА но реакция конъюгата МКА*Пох 3F ингибировалась всеми представленными МКА;

III - Моноклональные антитела 1Е8, 7F1, 1Е11 и ЗВ1 проявляли в разной степей выраженную способность к перекрестной ингибиции связывания конъюгата с антигеном.

В результате выполненных исследований сформирован вариант высок чувствительной ИФТС на основе использования импортных планшет высокой сорбционно активности, МКА 1Е11 и их конъюгата с пероксидазой, а также неканцерогенного-субстрат - 3,3'-5,5'- тетраметилбензидина. Лимит чувствительности ИФТС достигал 1,5 нг/мл. П результатам конкурентного ИФА установлено, что исследованные пулы МКА отличалис друг от друга по спектру перекрестного реагирования и направлены, по крайней мере, к различным сайтам гексона аденовируса.

весовое количество аденовируса

Рисунок 7. Сравнение чувствительности ИФТС -моноклональной иммунореагентики.

оп

1,5 т <30

1,2 аэ

ЦЗ

АО"Медполимер"

N

-20 ш/ш

N

к-

ч

О 1Ю 55 3 125 §25 31 1,® н^л

весовое количество аденовируса

детекции аденовирусных антигенов с использованием

Таблица 2

Спектр перекрестного реагирования моноклональных антител к гексонному компоненту аденовирусов

Примечание:

Смеси меченых и немеченых MICA инкубировали в планшетах с иммобилизованным аденовирусом.

Уровни ингибиции

более 60%

30%-60%

менее 30%

4. Оценка диагностических свойств иммунофлуоресцентного метода с использованием МКА.

Было проведено изучение возможности использования полученных МКА при быстрой диагностике вирусных ОРЗ прямым иммунофлуоресцентным методом. Для этих исследований были приготовлены конъюгаты МКА с флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) к вирусам гриппа А и В, респираторно-синцитиальному вирусу и аденовирусу. Дифференциальную диагностику гриппа и ОРЗ с использованием МКА, меченых ФИТЦ, проводили путем исследования назофарингиальных эпителиальных клеток от детей с ОРЗ во время эпидемических вспышек заболеваний. Для сравнения использовали ГША, меченые ФИТЦ, выпускаемые ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", получившими высокую оценку специалистов при сравнении с диагностическим набором МКА для непрямого метода ИФЛ, представленных ВОЗ. Совместно с н.с. лаборатории экологической эпидемиологии НИИ гриппа РАМН Э.А. Зибиной было исследовано 265 клинических материалов. Результаты оценки чувствительности и специфичности представлены в таблицах 3 и 4. Сравнение двух МКА к нуклеопротеину вируса гриппа А показало, что использование МКА 1С6 обеспечивает большую чувствительность метода по сравнению с использованием МКА Б8 (74,2% и 60%, соответственно). Чувствительность ИФЛ-метода с использованием МКА 9С5 к Б-белку респираторно-синцитиального вируса и МКА 7Р1 к гексонному антигену аденовируса составляла 80% и 71,4%, соответственно. Полное совпадение результатов тестирования антигенов вируса гриппа В было получено при использовании ФИТЦ-ПКА и ФИТЦ-МКА 4Н7. В этом случае чувствительность и специфичность теста составляла 100%.

Таблица 3

Выявление антигенов вирусов гриппа и ОРЗ в клинических материалах прямым иммунофлуоресцентным методом с использованием МКА.

ФИТЦ - поликлональные антитела ФИТЦ - моноклональные антитела

F8 к NP вируса гриппа А 4Н7 к ГА2 вируса гриппа В 9С5 к F-белку РСВ 7F1 к гексс аденовиру

+ - + - + - +

+ 3 2 18 3 12 3 5

- 1 57 2 40 4 44 - 1

Чувствительность* 60% 85,7% 80% 71,4%

Специфичность* 98,2% 95,2 92,1% 100%

Позитивный прогноз** 75% 90% 75% 100%

Негативный прогноз** 96,6% 93% 94% 90%

Таблица 4

Выявление антигелов вирусов гриппа А и В в клинических материалах прямым иммунофлуоресцентным методом с использованием МКА.

ФИТЦ-моноклональные антитела

ФИТЦ - поликлональные 1С6 к NP вируса 4Н7 к ГА2 вируса

антитела гриппа А гриппа В

+ - + -

+ 23 8 13 0

- 3 168 0 189

Чувствительность* 74,2% 100%

Специфичность* 98,2% 100%

Позитивный прогноз** 88,4% 100%

Негативный прогноз** 95,4% 100%

+ - наличие антигена в пробе * - по методу Buck and Gard, 1968

— отсутствие антигена в пробе ** - согласно Stout, 1989

S. Использование МКА для субгиповой дифференциации вирусов гриппа типа А в клинических материалах в условиях микропланшетного культивирования вирусов гриппа с ИФА оценкой уровня их репродукции (ММК-ИФА"),

Самостоятельным разделом работы явилось усовершенствование метода микропланшетного культивирования вирусов гриппа в клеточных культурах MDCK и МА104 с количественной ИФА оценкой результатов. Были проведены работы по субтиповой диагностике вирусов гриппа типа А в 113 носоглоточных смывах, полученных от заболевших детей в период эпидемических вспышек гриппа и ОРЗ. В работе использовали МКА 1С6 (направленные к нуклеопротеину вируса гриппа А) и МКА 33F11 (полученные С. А.Синевой и направленные к НЗ вируса гриппа А). В ходе исследований для каждого типа МКА экспериментально была определена нижняя граница позитивных проб (гК+) Для подтверждения диагноза, поставленного в ММК-ИФА} использовали

совокупность традиционных методов (РТГА и ИФЛ), а также впервые разработанную в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН иммуноферментную тест-систему детекции противовирусных антител класса и ^М (совместно с Э. А.Зибиной и Е.М.Войцеховской).

Для МКА 1С6 проба считалась положительной, если специфический сигнал в 3.8 и более раз превышал значения К" (гК+ > 3.8К~), для МКА ЗЗБ11 гК+ > 1.44. Установлено, что чувствительность и специфичность ММК - ИФА с моноклональными антителами 1С6 при сравнении с совокупностью вышеуказанных методов, применявшихся для диагностики гриппа А, составляет 77,2% и 86,9%, соответственно. Субгиповую принадлежность изолятов определяли по совокупному характеру их реагирования с МКА 1С6 и ЗЗР11. Пробы, положительные с обоими типами МКА, относили к субтипу А(НЗЫ2), позитивные только с МКА 1С6 (не реагирующие с ЗЗИ1) считали принадлежащими к другим субтипам (вероятнее всего - к А(НШ1), как второму из реально циркулирующих в настоящее время субтипов вируса гриппа А. Хотя при иной эпидемической обстановке это могут быть и другие субтипы возбудителя. Из 113 образцов, подвергнутых субтиповой диагностике, 17 были определены как относящиеся к субтипу А(НШ1) и 25 образцов были отнесены к субтипу НЗ (15,2 и 22,3%, соответственно). Результаты субтиповой дифференциации вирусов гриппа типа А(НЗШ) с использованием моноклональных антител 3 ЗР11 в ММК-ИФА свидетельствовали о меньшей (64,2%) чувствительности при сохранении его специфичности (84,7%) - таблица 5, что было связано с относительно слабой активностью этих МКА.

Таблица 5

Сравнительные данные диагностики гриппа с использованием микропланшетного варианта ИФА и традиционных диагностических тестов

Совокупность традиционных диагностических тестов (РТГА, иммунофлуоресцентный метод и ИФА определение противогриппозных антител) 1С6 kNP вируса гриппа типа А 33F11 к ГА вирус гриппа H3N2

+ - + -

+ 34 10 18 10

- 9 60 13 72

Чувствительность* 77,2% 64,2%

Специфичность* 86,9% 84,7%

Позитивный прогноз** 79% 58%

Негативный прогноз** 85,7% 87,8%

+ -наличие антигена в пробе * - по методу Buck and Gard, 1968

- - отсутствие антигена в пробе ** - согласно Stout, 1989

ВЫВОДЫ

1. В цепях создания высокочувствительных и специфичных тест-систем детекции антигенов вирусов гриппа и других ОРЗ впервые в России получены и охарактеризованы в диагностических реакциях панели моноклональных антител к возбудителям гриппа, РС-вирусной и аденовирусной инфекции.

2. Методом конкурентного ИФА и иммуноблоттинга показано, что МКА 9С5 и 8С5 направлены к эпнтопам поверхностных протеинов респираторно-синцитиального вируса (F и G, соответственно) и способны ингибировать симпластообразование (9С5) и репродукцию (8С5) респираторно-синцитиального вируса.

3. Моноклональные антитела 9С5 и 8В10 к РС-вирусу обладали наиболее высокой активностью в иммуноферментных реакциях при взаимодействии с очищенным вирусом - в отличие от МКА 8С5 и 10D8, которые преимущественно реагировали с "растворимыми" антигенами вируса в составе вируссодержащей культуральной жидкости.

4. Разработан вариант ИФТС моноклонального и поли-моноклонального типа, позволяющий выявлять до 10 нг/мл очищенного белка РС-вируса. Показана перспективность использования МКА 9С5, меченных флуоресцеин-изотиоцианатом, для быстрой диагностики РСВ-инфекции иммунофлуоресцентным методом.

5. Экспериментально доказано, что моноклональные антитела ЗН8, 1Е11, 7F1, 1Е8, ЗВ1 и 3F1 к аденовирусу направлены к трем разным эпитопам на поверхности гексонного антигена. Моноклональные антитела 7F1 рекомендованы для лабораторной диагностики аденовирусной инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом, а МКА 1Е11 -иммуноферменгным методом.

6. Установлено, что моноклональные антитела 4Н7, направленные к эпитопу субъединицы ГА2 гемагглютинина вируса гриппа типа В, обладают выраженной антигемагглютинирукпцей и вируснейтрализующей активностью. Эти МКА после конъюгации с флуоресцеин-изотиоцианатом могли быть с успехом использованы для быстрой диагностики гриппа В, а их конъюгаты с пероксидазой - для индикации антигенов вируса гриппа типа В в иммуноферментных реакциях.

7. Экспериментально доказано, что моноклональные антитела 4Н7 активно реагируют в ИФА с вирусами гриппа типа В 1988-1995 гг. выделения, но не взаимодействуют ни в ИФА ни в РТГА с вирусами, выделенными до 1988 г., а также штаммами, антигенно родственными В/Виктория/2/87.

8. Моноклональные антитела к нуклеопротеину вирусов гриппа А (1С6) и гемагглютинину вируса гриппа H3N2 (33F11) предложено использовать для типирования гриппа А разных субгипов методом микропланшетного культивирования с ИФА-оценкой уровня репродукции вируса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. АА.Соминина, Л.П.Сухубаевская, М.П.Самойлович, В.Б.Климович, А.О.Монаенков, И.В.Амосова, С.Д.Бубнова, Э.А.Зибина, И.В.Острова Характеристика моноклональных антител к PC-вирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях// Вестник Российской Академии Медицинских Наук.-1995-№9.-С. 49-54

2. А.О.Монаенков, А.А.Черных, АА.Соминина, М.К.Громова, И.М.Сургучева, Н.А.Власов Спектр реактивности моноклональных антител клона 4Н7 к гемагглютинину вируса гриппа В в РТГА и ИФА //В сб. Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов. Тез. докл. Симпозиума. Санкт-Петербург, 5-7 октября 1994г.- Санкт-Петербург.-1994 -С. 61

3. А.А.Черных, А.О.Монаенков, И.М.Сургучева, Н.А.Власов, А.А.Соминина Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусу гриппа В/Панама/45/90 //В сб. Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов. Тез. докл. Симпозиума. Санкт-Петербург, 5-7 октября 1994г.-Санкт-Петербург,-1994.-С. 62-63

4. A.O.Monaenkov, A.A.Chemykh, A.A.Sominina, O.M.Litwinova Reactivity spectrum of monoclonal antibodies 4H7 to influenza B/Panama/45/90 virus// Progress in clinical virology,-1995,-Praga.-P. 250

5. A.A.Sominina, E.Filippova, A.O.Monaenkov, E.M.Voizechovskaya, E.A.Zibina, E.B.Chepic New generation of ELISA tests in investigation of influenza infection among hospitalized patients// Xth International Congress of Virology,-1996,- Jerusalem.-P.189

Сдано в набор 23.12.96. Подписано в печать 24.12.96. Формат набора 60x80 V Бумага офсетная. Гарнитура "Тайме". Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Зак. №34. ООО "Каре", Санкт-Петербург, Россия