Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов

Власов, Николай Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов"

Р V Б ид

Па правах рукописи

УДК 619. 578.824.21

Власов Николай Анатольевич

Физико-химические свойства и антигенная структура вируса Геморрагической болезни кроликов

03.00.06. - Вирусология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Покров, 1998 г.

Работа выполнена во Всероссийском Научно-Исследовательском Институте Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии (ВНИИВВиМ

Научный консультант - доктор ветеринарных наук

Шевченко A.A. (ВНИИВВиМ)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Середа А.Д. доктор биологических наук, ВНИИ Ветеринарнс

Вирусологии и Микробиологии

Бурлаков В.А. профессор, доктор ветеринарных наук.

Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им. К.И.Скрябина

Псрсвозчикова H.A. доктор биологических наук, ВНИИ Защиты Животных

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Всероссийский Институт

Экспериментальной Ветеринарии

Защита состоится 17 сентября 1998 года в 12Ящсов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (601120, г. Покров Владимирской области).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « « L' о 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.П.Федоров.

. Общая характеристика работы

. 1. Актуальность темы

В 1984 году в Китае была обнаружена новая болезнь кроликов, которая по своим арактерисгикам может быть отнесена к категории особо опасных инфекционных болез-:ей, т.е. к болезням того типа, которые, если не применят!, эффективные методы борьбы с [ими, могут вызвать тотальное уничтожение поголовья чувствительных животных.

Впервые болезнь выявил и описал Liu с коллегами в 1984 году, когда она возникла реди импортированных из Германии ангорских кроликов. В последующие годы вспышки >олезни с подобными клиническими признаками и патоморфологией были описаны в ряде трап Европы и Северной Америки. Эта болезнь давала огромные потери во всех странах, де она имела место. В нашей стране первая вспышка болезни была зарегистрирована в 986 год)' в пограничном с Китаем районе Хабаровского края. Диагноз поставлен не был, роликов из заболевшего стада убили, а шкурки отправили на фетровую фабрику Московкой области. В результате этого в центре страны возник вторичный очаг болезни Из него юлезнь распространилась к 1987 году по 20 областям и краям России, а затем ¡фактически ся территория СССР стала неблагополучной.

Даже в начале изучения болезни и характеристик ее возбудителя данные, ка-ающиеся клинических признаков, патоморфологии и других деталей болезни, как и дан-ше по ультраструктуре внеклеточных- вирионов, пе имели каких-либо серьезных противо-«чий. Это приводит к заключению о том, что во всех странах, упомянутых выше, болезнь мзывалась одним и тем же вирусом. В противоположность этому, данные, касающиеся ¡иохимии вируса, первоначально были очень противоречивы. Так, Deng с коллегами оста-ювились на выводе, что этиологический агент этой болезни принадлежит к калицивиру-ам. С другой стороны, немецкие ученые Gregg & House заключили, что он является пар-ювирусом.

В связи с возникновением нового патогена стало необходимым проведение его ком-шексного изучения клиническими, патологоанатомическими, вирусологическими, имму-гохимическими, биохимическими и другими методами. Необходимо было изучить патоге-юз и иммуногенез болезни, установить физико-химические характеристики и биохимиче-кий состав вируса, решить ряд других вопросов, в том числе о таксономическом положе-пш и происхождении вируса. Этим обусловлен выбор цели работа.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью работы было изучить физико-химические, антигенные свойства и морфоло-ию вируса ГБК, патогенез вызываемой им болезни. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

.. Определить константу седиментации, плавучую плотность, нолипептидный состав, массу вирионов.

!. Изучить чувствительность вируса к физическим и химическим воздействиям. !. Изучить гемагглютинирующую активность вируса.

к Изучить ультраструктуру вирионов и степень гетерогенное™ вирусных популяций по

этому параметру, их физико-химический полиморфизм. >. Изучить полипептидньш состав вирионов, антигешюсть структурных белков. ). Изучить параметры репродукции вируса в зараженных клетках и вирусное цитопатиче-

2__Общая характеристика работы

скос действие (ЦПД).

7. Изучить клиническую и патологоанатомическую картииу болезни, основные патогенетические факторы и возможности модификации течения болезни с использованием химиотерапевтических препаратов и других лекарственных средств.

8. Выявить и охарактеризовать вирусный протективный антиген, обладающие иро-тективным потенциалом эффекторы иммунитета, действующие при этой болезни.

9. Изучить шггигенную структуру вирусного протсктивного антигена и на этой основе разработать улучшенные диагностические тест-системы на основе моноклональ-ных антител.

1.3. Научная новизна работы

Научная новизна работы заключается в получении следующего ряда новых (выделены курсивом) или уточненных в приложении к изучавшемуся штамму В-87 данных о вирусе ГБК, его циркуляции среди животных и вызываемым им патологическом процессе, иммунологическом ответе на данный патоген.

Изучены физико-химнческие свойства вируса. Определены конста1Гта седиментации, плавучая плотность вирионов, стоксов радиус вириона, параметры растворимости в растворах солей и полимеров.

Изучена устойчивость к денатурирующим агентам и физическим факторам. Нативные вирионы не чувствительны к действию растворителей липидов, жесткой протеолитической обработке, стабильно сохраняют инфекционность и ге-магглютинирующую активность в диапазоне рН от 3 до 9. Вирус ГБК обладает высокой термостабильностыо (сохраняет инфекционность, гемагглютинирующую активность, форму вириона и его полипептидный состав в ходе инкубации при 56°С в течение не менее чем 30 минут), термостабилъность возрастает в средах, обогащенных белками и полисахаридами, и падает в средах, обогащенных одновалентными ионами. При прогревании до 5б"С и выше происходит изменение конфор-мации поверхностного белка вирионов, в результате чего он становится чувствителен к трипсиноваму протеачизу. Вирус ГБК чувствителен к щелочам и хлорсо-держащим дезинфектантам, новому дезипфектанту для ветеринарных целей - Тео-тропипу. Вирус в процессе длителыюго хранения при низких температурах в жидкой среде или лиофилыю высушенном состоянии может утратить гемагглютинирующую активность, сохранив при этом инфекционность.

Изучена морфология вирионов и их морфологический полиморфизм. Установлено, что внеклеточные частицы вируса ГБК могут представлять собой б морфологических форм. Первая - «стандартный» вирион - икосаэдрическая частица диаметром 36 нм с электрошюпрозрачной сердцевиной, имеющая палочкообразные выросты на поверхности, содержащая полный вирусный геном. Вторая - частица с неполным геномам, отличающаяся от «стандартного» вириона наличием элек-тронноплотного ободка, окружающего сердцевину. Третья - «пустая» частица - вирусный капсид, не содержащий генетического материала, отличающаяся от «стандартного» вириона элетрошюплопюй сердцевиной. Четвертая - «голая» частица, отличающаяся от стандартной отсутствием выростов па поверхности. Пятая - «вирусный кор» - обособившийся в результате «разламывания» капсида -сердцевина «стандартного» вирионаШестая - «малая форма» - фрагменты капсида - агрегат-

Общая характеристика работы_3_

сапсашров - частица диаметром около 20 им с характерными выростами па поверхности, но без сердцевины.

Изучена степень полиморфизма еириопое по плавучей плотности, консташх: сегментации, поведению в фазовых системах. Седимептируя в средах с низкой плотно-;гью, вириошл разделяются на 2 фракции - «стандартных» вирионов и «пустых» частиц, шстично перекрывающихся пвфокой зоной часпщ с неполным геномом; при изопикниче-:ком центрифутировании пирионы разделяются подобным образом, при распределении в разовых системах частицы первых трех морфологических питое ne разделяются, что 'оворит об идентичности свойств их поверхностного белка.

Изучены параметры репродукции вируса в различных органах и тканях зара-кенных животных. Вирус репродуцируется в клетках печени, легких, тимуса, головного юзга и проникает в клетки многих других органов. При репродукции в клетках этих че-пырех органов вирус образует цитспчазматические скопления, в том числе - паракри-•тал'шческие, и не обнарухсивается в кчеточных ядрах. Максимальный выход вирионов ta одну зараженную клетку составляет более 10 ООО. Вирус }т имеет неспецифического 1еханизма экзоцитоза и покидает тетки после их распада. Наиболее высокие абсолютное уровни накопления вируса отмечают в печени и легких, причем раннее и относитель-ю высокое накопление вируса в этих органах имеет место у животных, гибнущих в ранте сроки после заражения.

Изучение клиннческнх и патологоанатомнческих признаков ВГБК показачо, то основным патогенетическим механизмам ВГБК является тромбогеморрагический ■ипдром, приводящий к повышению фибринолитической активности сыворотки, что 'вляется причиной фибринолиза микрослоя фибрина па стенках кровеносных сосудов, последний приводит к увеличению их проницаемости, выражающейся в образовании ■ровоизчияний различных типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной мерти при острой форме болезни являются субдуралъпые кровоизлияния в головном юзге, которые представляют собой патогномонический признак данной формы ВГБК.

Изучен полипептидный состав и антигенность белков вирионов, которые кпочают 5 полипептидов с молекулярными массами 60, 54, 42, 37, 16 кДа, в том числе -«полной капсидный белок Vp60, на долю которого в составе вирионов приходится более '0% по массе.

Показано, что эти полипептиды взаимодействуют с антителами из сывороток рекон-алесцентнык кроликов. Устано&чено, что основным протективным антигеном вир\>са вляется УрбО, иммунизация которым (даже в денатурированном виде) индуцирует Ьормирование невосприимчивости к болезни. Формирование иммунитета низкой папря-кенности также вызывает Vp37. Установлено, что в составе УрбО имеется минимум 3 •итигенных района, а его антигенная структура стабильна у изолятов, циркулирующих природе и при длительном пассировании таких изолятов в лабораторных условиях. Остановлено, что в формировании иммунитета к вирусу ГБК играют роль как антитело-ависимые, так и антителонезавиашые механизмы, которым принадлежит основная юль в защите от инфекции в поздние сроки после вакцинации.

'.4. Практическая значимость результатов

В практике проведения НИР могут был. использованы разработанные или адапти-ованные в отношении вируса ГБК методические приемы: экстракция вируса га заражениях тканей с использованием трипсинового протсолиза, очистка вируса, вирусных поли-[ептидоп.______________

4_Общая характеристика работы

В ходе работы охарактеризован по физико-химическим свойствам, антигенно-сти и ряду других параметров штамм В-87 вируса ГБК, принятый рсфсрспс-ипаммом данного вируса для России (авторское свидетельство на изобретешь № 294945 с приоритетом от 09.03.88 ).

Получен и охарактеризован клон гибридных клеток, продуцирующих монокло-падьные антитела к УрбО вируса ГБК (линия клеток депонирована и запатентована, патент № 2007452 с приоритетом от 16.01.92. ).

На основе этих моноклональпых антител разработаны и испытаны усовершенствованные диагностические наборы для выявления вирусных антигенов и противовирусных антител (составлены методические указания по диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов иммунофермешным методом с использованием моноклональпых антител, утвержденные 30.10.1992 г.).

Разработан новый химиотерапевтический препарат для профилактики и лечения бактериозов и бактериальных осложнений после вирусных заболеваний Абактан (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВП1КИ, проводится патентование); бактериозов и болезней, вызываемых РНК-содержащими вирусами Абактан Р (положительное решение о выдаче патента № 97104338/13 с приоритетом от 20.03.97, комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ); новый химиотерапевтический препарат для лечения бактериозов и болезней, вызываемых ДНК - содержащими вирусами, Абактан Д (положительное решение о выдаче патента на изобретение № 97104650/13 (004921) от 19.01.1998 г. с приоритетом от 25.03.1997 г., комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ), новый дезинфектант для ветеринарии Теотрогшн (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ. производится патентование), а так же методы их применения для ветеринарных целей.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения патогенеза ВГБК, показавшие, что основным механизмом патогенеза острой формы болезни является следующий. Репродукция вируса в клетках вызывает выброс в кровоток нрокоагулшггов. Это приводит к повышеншо фибринолитической активности сыворотки, что является причиной фибринолиза мшфослоя фибрина ш стенках кровеносных сосудов. Фибринолиз приводит к увели-ченшо проницаемости сосудистой стенки, выражающейся в образовании кровоизлияний различных типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной смерти при острой форме болезни являются субдуральные кровоизлияния в стволовой части головного мозга. Терапевтические воздействия, предотвращающие образование тромбоза при ВГБК, противодействуют развитию геморрагий, что приводит к добро-качетвешому течению инфекциошюго процесса.

2. Основным протективным антигеном вируса ГБК является УрбО - мажорный капсидиый белок вириона, имеющий в своем составе не менее 3 а1 пшенных регионов. Структура данного полипептида стабильна, имеющиеся вирусные изоляты анти-гешю не различимы. Система иммунологической защиты при ГБК включает антите-лозависимые и антителонезависимые иммунологические механизмы. Последние играют основную роль в отдаленные сроки после иммунизации.

3. Вирус ГБК обладает структурным полиморфизмом, заключающимся в суще-

Эбщая характеристика работы_5_

;твовании нескольких форм вириопоп, различающихся между собой содержанием нуклеиновой кислоты, размером частиц. Н&тичие различных форм вириопов отражается в полиморфизме вирусной популяции по физико-химическим свойствам -плавучей плотности, «шетапте седиментации. Формирование вириопов той или иной структуры зависит от люйств организма животного, в котором происходит их репродукция, и некоторых параметров инфекционного процесса. На морфологическом уровне это выражается в возможности формировашм вирусных популяций, основная часть которых представлена вирио-тами, не содержащими нуклеиновой кислоты или содержащими ее в меньшем, чем в стандартных вирионах, количестве.

4. Сумма свойств морфологических (структура вириопов), физико-химических 'константа седиментации, плавучая плотность, «молекулярная» масса, степень устойчивости к факторам внешней среды), биохимических (количество полипептидов, тип и структура нуклеиновой кислоты), биологических (трудность адаптации к репродукции в культурах клеток, гемагглютинирующая активность) показывают, что вирус ГБК обладает чертами сходства с калици- и пикорнавирусами, но существенно отличается от прототипных представителей обоих семейств.

1.6. Апробация результатов

Материалы исследовшшй были заслушаны и обсуждены на трех тучных конференциях (г. Покров 1988, 1990, 1992 гг.) и заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (19881995 г.), международной конференции (г. Харьков 1995 г.). международной конференции 'г. Москва, 1998 г.), лабораторном совещаши научных созрудников (г. Покров 1998 г.), иежлабораторпой апробации диссертации (г. Покров 1998 г.).

1.7. Публикация результатов исследований

По результатам экспериментальных работ, выполненных по теме диссертации, имеется 19 публикаций, в том числе авторское свидетельство, патент, три положительных эешения о выдаче патентов, обзорный доклад.

1.8. Внедрение результатов исследований

Охарактеризовашшш штамм вируса ГБК В-87 используется в качестве референс -птамма и производственного штамма при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. Внедрены в ветеринарную практик}' Наборы ятя диагностики ГБК с применением ионоклональных антител, химиотерапевтические препараты Абактан, Абактан Р, Абактан Ц, Теотропин.

1.9. Благодарности

Планирование экспериментальной части работ, теоретический анализ и обобщение полугенных результатов экспериментальных исследований, анализ литературных данных, ос-говная часть экспериментальных исследований проведены автором самостоятельно. Ко-дакхиошпле и производственные испытания разработанных биопрепаратов, химиотера-тевтических средств и методов дезинфекции проведены при участии специалистов Ураль-жого политехнического института. Института органичес кой химии РАН, Октябрьской тгицефабрики, ряда сельскохозяйственных предприятий Смоленской и Владимирской ¡бластей, за что автор выражает им глубокую признательность.

Отдельные фрагменты экспериментальных работ выполнены совместно со следую-цими сотрудниками ВНИИВВиМ, за что автор выражает им сердечную благодарность.

_6_Общая характеристика работы

Кандидат петеринариых наук, старший научный сотрудник Зубаиров М.М. (разработка и испытание химиотсрапевтичсских препаратов), кандидат ветеринарных наук, старший тучный сотрудник Малоголовкин С.А., заведующий лабораторией (патологоанатомические исследования и гибридомная технология), кандидат биологических наук, научный сотрудник, Малахова М.С. (электрошюмикроскопическис исследования), кандидат биологических наук, научный сотрудник. Черных А.А. (гибридомная технология).

При выполнении экспсримеш-альных работ проведение целого ряда аппаратурных исследований было бы невозможно без превосходного технического содействия, оказываемого автору m протяжении ряда лет Смирновым А.В., Гусевым Н.Г.

В ходе оформления диссертации автор получил значительную помощь, заключавшуюся в конструктивной критике материалов от старшего научного сотрудника, специалиста в области эпизоотологии Книзе C.B., старшего научного сотрудника, специалиста в облаете патоморфологии Малоголовкша С.А, старшего научного сотрудника, специалиста в области иммунологии Новикова Б.В, старшего научного сотрудника, специалиста d области иммунологии и биотехнологии Дмигренко В В., научного сотрудника, специалиста в области цитологии Черных Н.В., за что выражает им глубокую признательность.

Автор выражает глубокую признательность профессору Макарову Владимиру Владимировичу - под руководством которого работал над данной темой в течение первых 7 лет ее выполнения и своему научному консультанту Шевченко Александру Алексеевичу.

1.10. Объем и структура работы

Диссертационная работа написана по традиционной форме. Состоит из 219 страниц машинописного текста, 33 таблиц, 56 рисунков, списка цитированной литературы (905 наименований), приложения, выполненного в виде отдельного тома. Диссертация включает следующие разделы: Аннотация (2 стр. текста). Оглавление, Список сокращений (2 стр. текста), Введение (8 стр. текста). Обзор литературы (49 стр. текста, 1 таблица), Собственные исследования (102 стр. текста, 30 таблиц, 49 рисунков). Обсуждение (44 стр. текста, 2 таблицы , 7 рисунков), Вывода. Практические предложения, Список цитированной литературы, Приложения. «Обзор литературы» подразделяется на 6 глав, в том числе - заключение по обзору литературы. «Собственные исследовашм» разделены на две части: «Материалы и методы», «Результаты». Часть «Материалы и методы» включает 2 раздела: «Материалы», имеющий в своем составе 5 глав, «Методы», имеющий в своем составе 7 глав в которых сгруппированы методы в соответствии с целями их использования. Часть «Результаты» разделена на 5 глав названия которых соответствуют названиям первых пяти глав автореферата. Обсуждение разделено на 6 глав. В пяти первых главах обсуждаются и сравшшаются с имеющимися в литературе данными полученные в ходе работы экспериментальные результаты. В шестой главе «Обсуждения» представлены суммированные данные по таксономическим признакам вируса, полученные в ходе работы и данные анализа генома вируса ГБК по результатам литературы. Приложения, выполненные в виде отдельного тома, состоят из копий патентов и

нтд.

2. Собственные исследования

2,1. Материалы и методы. 2.1.1. Материалы.

В работе использовали: кроликов разных пород и возрастов, мышей линии ¡BALB/c), штамм В-87 вируса ГБК, другие изоляты этого вируса, сырья.

При проведении исследований использовали следующие питательные среды и выворотки: среда Игла MEM без L-глютамина, жидкая; среда Игла MEM без лейцина и L-глютамина, жидкая; среда Игла MEM без метиошша и L-глютамина. жидкая; среда DMEM, сухая, без бикарбоната натрия , среда DMEM, жидкая; мясопснтонный бульон ;МПБ); мясопептоннмй агар (МПА); бульон Хоттингера; агар Хоттингера; (ЛБ); 200 мМ раствор L-глютамина в деионизированной воде; 100 мМ раствор пирувата натрия; 7,5%-11ый раствор бикарбоната натрия; 40%-ный раствор глюкозы; раствор гентамиципа (40 мг/мл); раствор амфотеррицина В (250 мкг/мл); раствор ГАГ, 50-кратный кош^птрат J5000 ?М гипоксантина, 20 ?М аминоптерипа и 800 ?М тимидина); раствор ГТ, 50-кратный концентрат (5000 ?М пптоксанпша и 800 ?М тимндиш); 0,02%-ный раствор версена 'натриевой соли ЭДТК); 0,25% раствор трипсина; 0,83%-ный раствор хлорида аммония; XI5 М ЗФР pH 7,2 - 7,4; сыворотку крови крушюго рогатого скота, стерильную, без консерванта; эмбриональную сыворотку крушюго рогатого скота; эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота, проверенную на способность поддерживать рост гибридом; сыворотки и образцы дефибринированпой плазмы крови кроликов интактных, иммунизированных против ВГБК, вакцинированных инактивированнмми вакщнами и зараженных после иммунизации кроликов, не вакцинированных кроликов выживших после заражения.

В работе использовали реактивы отечественные квалификации ч.д.а., х.ч. и о.с.ч. и импортные:

Адьюванты Фрейнда, полный и неполный; бакто-агар, глицерол; 8-азагуашш, боро-гидрид натрия: бычий сывороточный альбумин, кристаллический; гипоксантин (6-гидрок-:инурин), глютамин, глютаровый альдегид, 2-меркаптоэтанол, октич-р-О-глюкопиранозид [октилглюкозид), Твин-20, Твин-80, Тритон Х-100, 2,2|-азииоди-(3-гшпбензтиазолин-;ульфоновой кислоты) диаммопиевая соль; амишптерин (4-амшгофолиепая кислота, 4-амипоптероилглютаминовая кислота), глицин (аминоуксусная кислота), нериодат натрия, мета; пероксидазу хрена, тип VI; пристан (2, 6,10,14-тетраметилиентадекан), реактив Фо-липа-Чиокальтеу, хлорид аммония; диметилсульфоксид, казеин для биохимических исследований, краситель Гимза, метанол, полиэтиленгликоль-4000, сахарозу; Sephadex G-25 coarse; Scphacryl S-200 superfine; CNBr-activated Sepharose 4B; Protein A-Sepharose 4B; N-:\тацппшидил-3(2-1гаридилдитио) пропинат; фетуип; ацетон; фсшп[1'1С]и,5отиоцианат, N-а-(р-тозилН--аргишш[3Н]метилового эфира гидрохлорид; N-сукцшшмидил [2,3-3И]нро1ш-энат; диализные мембраны, нигроцеллюлозные мембранные фильтры, филыровальная бумага ЗММ, рентгеновская аченка РМ-В, фотопленка Микрат-300 Тасма.

При проведении исследований использовали следующее оборудование.

С02-1Шкубатор (ASSAB Medicin AB, Швеция). Шкаф с вертикальным ламинарным потоком стерильного воздуха (BABCOCK-BSH, ФРГ). Центрифуги высокоскоростные ;MSE-65, Великобритания: Beckmann, США). Центрифугу шгзкоскоростную (Т-23, ГДР). Микроскоп инвертированный люминесцентный (IMT-2 Olympus, Япоши). Мшфоскоп ипверти ропанный (СК-2 Olympus, Япоши). Суховоздупшый термостат, жидкостный тер-

_Материалы и методы

мостат (ГГЖ-0-03). Низкотомиершурный холодильник (Reveo. США). Холодильник бытовой. Ультразвуковой дезинтегратор Soniprep-150 (MSE, Великобритания). Оборудование для хроматографии, включающее проточный абсорбциометр Uvicord Ш, 6-канальный самописец и коллектор фракций Ultrorak (LKB, Швеция), набор хромато-графических колонок с принадлежностями и перистальтический насос Р-3 (Pharmacia. Швеция). Хроматографическую систему среднего давления (FPLC, Pharmacia. Швеция). Прибор для электрофореза Multiphor с источником питания и принадлежностями (LKB, Швеция). Установку дня лиофилыюй сушки Lyovac GT-2 с вакуумным насосом и принадлежностями (Lowbord Heraeus. ФРГ). Фотоэлектроколориметр (КФК-2-УХЛ4.2). Восьмиканальный фотометр Titertek Multiscan (Flow. Великобритания). рН-мстр милливольтметр рН-121. Магнитную мешалку. Весы аналитические, 0-10 мг. Весы лабораторные аналитические (ВЛА-200г-М). Весы технические (ВТ-200) с разновесами. Многоканальные (4-, 8-, 12-каиалы1ые) пинетки с диапазоном объемов 50-200 микролитров (Flow Laboratories. Великобритания). Гомогенизаторы стеклянные.

2.1.2. Методы

В работе использовали следующие методы: комплекс стандартных методов клинического и патологоанатомического обследования;

культивирования вируса ГБК на кроликах, в тканевых эксплантатах, культурах клеток;

высоко- и низкоскоростного дифференциального, высоко и низкоскороспюго зонально-скоростного, высокоскоростного равновесного и неравновесного изогшкни-ческого центрифугирования; гельпроникающей и аффинной хроматографии, аналитического и препаративного электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих и певосста-навливающих условиях в системе Лэммли, в непрерывной буферной системе, электродиализа и электропереноса; твердофазного (на полистироловых планшетах и нитроцеллюлозе) иммунофермепг-ного анализа в системах ДАС-ИФА, непрямой и прямой, конкурентного имму-ноферментного анализа для эгагшгшого картирования, иммуноэлсирофореза, иммуноэлектроосмофореза, иммунопреципитации, радиоиммунопреципита-ции;

электронпомикроскопических исследований: негативного и позитивного контрастирования, ультратонких срезов, напыления тяжелыми метшими; методы синтеза иммуноферментных коныогатов (по Тиссену и Накане), полимеризо-

ва1шых белков и иммуносорбентов (CNBr-актиивированная сефароза); кошшекс методов гибридомной технологии;

комплекс методов клинического и патологоанатомического исследования; методы математической обработки и моделирования реализовали с использованием коммерческих (DNASIS, PROSIS, MatLab, MsExel) и оригинальных компьютерных программ.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов

2.2.1.1. Пути передачи вируса

При моделировании фекалыю-оральной передачи вируса ГБК было установлено, что вирус регулярно передается от зараженных кроликов здоровым, вызывая у большей части из них летальную форму болезни. Было также обнаружено, что мыши, в организме которых вирус ГБК не репродуцируется, могут быть источником инфекции после поедания инфицированных кормов, в результате которого они выделяют вирус с экскрементами. Эти данные иллюстрируются табл. 1.

Экспериментально установлено, что при любом способе парентерального заражения болезнь на взрослых серопегативных животных воспроизводится регулярно, причем, как правило, его способ и повышенная но сравнению со стандартной (0.5-1.0 мл 10%-ной суспензии печени павшего от острой формы ГБК кролика) доза заражения слабо влияют 1и динамик)' и характеристики инфекционного процесса. Высокая эффективность интрана-зальпого заражения, особенно низкими дозами вируса, указывает на то, что он в начале инфекционного процесса приживляется в лимфоидной ткани носоглотки и быстро распространяется из первичных очагов по чувствительным органам и тканям. Тпвчшт 1

Результаты изучения передачи вируса ГБК посредством экскрементов.

№ ОПЫ1 а Вид животного, от которою получены экскременты Результаты тестирования вируса в экскрементах: РГЛ электронная микроскопия пало/в опыте 1'еакци сутки гибел и я кроликов титр сывороточных антител в РЗГА у выживших животных

1 мыши не выявлен не выявлен 0/3 <1:2; <1:2; <1:2

2 мыши 1:4 не выявлен 2/3 4,6 1:128

3 мыши не выявлен не выявлен 1/4 8 <1:2; <1:2; 1:1024

1 кролики 1:8 не выявлен 1/2 2 1:4096

2 кролики 1:64 106# 2/5 2.3 1:16384; 1:4096; <1:2

# - приблизительное количество вириоиов в миллилитре.

Показательно, что в тщательно вычищенных и вымытых клетках, не подвергавшихся дезинфекции, вирус сохраняется в течение нескольких месяцев.

Эффективность перезаражения в том случае когда непосредственного контакта между зараженным! и интактными кроликами не было указывает на то, что аэрозольное заражение играет существенную роль в передаче возбудителя болезни в колониях кроликов, в том числе - в производственных условиях и у словиях частных подсобных хозяйств.

2.2.1.2. Клинические признаки и патогенез болезни

При изучении клинической картины и механизмов патогенеза болезни установлено следующее. Обнаружена тенденция породной чувствительности, выражающаяся только в различиях продолжительности сроков выживания после заражения. Различия в уровне смертности среди кроликов разных пород после заражения отсутствовали. В чувствитель-

10_Результаты Собственные исследования

поста к болезни имеются четкие возрастные различия. Заметный процент падежа обнаружен в группах животных, начиная с трехмесячного возраста. Среди младших возрастных групп (3-6 месяцев) с возрастом также уменьшается и срок от заражения до гибели.

В результате определения уровней и динамики накопления вируса в различных органах и тканях установлено следующее. Относительные уровни накопления вируса в различных органах связаны с продолжительностью жизни животного: в некоторых органах (печень, мышцы, тимус, мозг) повышенное накопление вируса характерно дтя кроликов, гибнущих в ранние сроки, повышенное накопление в других органах наблюдается у животных гибель которых наступает позднее. Характер динамики и соотношения титров вируса по каждому конкретному органу через различные промежутки времени после заражения у животных, павших от ВГБК, имеет' черты своеобразия в зависимости от органа. Накопление вируса в легких и коже происходит «хаотично» - могут встретиться практически любые значения титра у кроликов, павших в любые сроки. Совсем иной характер распределения показан в печени, головном мозге и лимфатических узлах. Частотный анализ показывает, что в этих трех органах уровень накопления имеет тенденцию связи со сроком жизни после заражения, а в первых двух - указывает на отсутствие такой связи.

Анализ частоты встречаемости клинических и патологоанатомических признаков болезни показал, что в целом картина болени представляет из себя, с учетом только тех признаков частота встречаемости которых превышает 50%, следующее. Сверхосграя форма: Судорожные явления перед смертью (100); Изменения в головном мозге (100); Изменения в печени (60,9); Изменения в тимусе (56,3). Острая форма: Судорожные явления перед смертью (100); Изменения в головном мозге (92,8); Изменения в тимусе (78,6); Изменения в селезенке (69); Изменения в легких (66,7); Изменения в почках (52,4); Гиперемия слизистых(50). Подострая форма: Изменения в печет! (100); Изменения в почках (100): Изменения в желудке (75); Изменения в коже (66,7); Изменения в мышцах (66,7); Угнетение (56,1); Судорожные явления перед смертью (50).

Касаясь типов наблюдавшихся в тех или иных органах изменений, следует отмстить, что геморрагические явления, особенно частые в печени и легких, представляли собой наиболее обычную черту по которой на вскрытии различались зараженные и незараженные животные. Геморрагии наблюдали самых различных форм. Отмечено, что в ряде случаев при свсрхострой форме течения болезни у части животных геморрагический синдром во внутренних органах как таковой вообще отсутствовал. У всех животных, павших от острой и сверхострой форм болезни, у которых проводили патологоанатомическое освидетельствоваше мозга, были обнаружены повышенное кровенаполнение его сосудов, обширные кровоизлияния в его стволовой части, что, несомненно и являлось непосредственной причиной их гибели. Сами же кровоизлияния можно рассматривать как проявления геморрагического синдрома.

2.2.1.3. Изменения в тканях зараженных животных на ультраструктурном уровне

Патологические изменения в органах шггактных кроликов локализованы, как пра-вило, в почках, в печени и желудке, однако их частота невелика. Эти изменения весьма разнообразны, но в большинстве случаев заключаются в вакуолизации цитоплазмы и/или образовании большого количества гранулированного материала._

Гиперплазию аппарата Гольджи наблюдали, но не во всех клетках, где выявлены вирусные скопления. Иногда отмечали аномальную коцденсащпо хроматина и пикноз ядра. В некоторых случаях л таких органах, как печень и селезенка, отмечали образование на ва-куолизированных клетках многочисленных длинных выростов. У кроликов, убитых после заражения ультраструктурные изменения часто наблюдали в печени, тимусе, лимфатических узлах. У кроликов, павших в результате заражения, с наибольшей частотой поражения встречали в печени, продолговатом мозге, тимусе.

При определении типов изменений клеток и сравнении выявляемых картин пораже-шгй было установлено, что никаких специфичных поражений и/или изменений в ультраструктуре клеток не имеется. Установленные поражения - вакуолизация цитоплазмы, пикноз ядра характерны для клеток, зараженных целым рядом вирусов и пораженных различными патологическими процессами неинфекционного характера. Отмечаемая гиперплазия аппарата Гольджи характерна для клеток с повышенной синтетической акгивностыо, которая всегда наблюдается при интенсивном синтезе белков, в частности -вирусных белков в клетке, где имеется продуктивный инфекционный процесс. Таким образом, единственное специфическое изменение, которое можно истолковать однозначно, - ото наличие характерных скоплений вирионов в зараженных клетках.

Выявленные в ходе экспериментов скопления вирионов в зараженных клетках были представлены тремя топами. Первый - диффузное распределение многочисленных вирионов в цитозоле. Второй - скопления вирионов в непосредственной близости от мембранных структур цитоплазмы в которых вирионы как бы оконтуривают эти мембранные структуры. Третий - паракристаллические скопления в участках цитозоля. ограниченных мембранными структурами. Примеры таких структур показаны па рис. 1.

Количественный анализ уровней накопления вируса в зараженной клетке (электронная микроскопия с использованием серийных ультратонких срезов) показал следующее. Наличие в клетке скоплений - это показатель вирусной репродукции: Образование скоплений околомембранных и/или паракристаллических связано с количеством вирионов, находящихся в клетке в данный момент времени (они часто встречаются вместе в одной клетке), тогда как образование диффузных скоплений связано скорее всего именно с физиологией клетки и состоянием ее цитозоля (содержание вирионов в таких клетках и клетках, содержащих только околомембранные скопления, очень близко), скорее всего отражая интенсивную деструкцию клетки по типу гвшюза (но не вакуолизации). Наличие в клетках единичных вирионов отражает не процесс накопления в ней вирусного потомства, а процесс зндоцитоза вируса, показывая тем самым, что in vivo по крайней мере в поздние периода развития болезни частым является заражение клетки с очень большой множественностью - несколько сотен вирионов на клетку.

2.2.1.4. Изучение возможности модификации течения ГБК

Целью исследований, описанных в данном разделе было изучение вопроса о том, каким способом можно изменить течише болезни, вызываемой вирусом ГБК в сторону отягчения или облегчения ее течения. При получении положительных результатов они представляют интерес при разработке средств лечения и профилактики болезни.

Первым этапом работ было изучение влияния специфических антител на течение ГБК. При планировании экспериментов учитывали выраженное защитное действие специфических антител при ГБК с одной стороны и возможное наличие антитслозависимого усиления болезш! с другой.

¡а

Рис. 1. Паракристаллические скопления вируса в зараженных клетках. Ультратонкие срезы, нагативное контрастирование (2% фосфорновольфрамовая кислота рН 6.2), увеличение: А и Б - 8000 раз, врезки -16000 раз. Паракристаллические скопления (показаны стрелками от маркерной таблички с цифрой 1), обнаруживаемые в клешах печени (А) и головного мозга (Б), имеют различную форму (показаны на выносках). Форма скоплений, в отличие от скоплений пикорна-, парво- и калицивирусов, в подавляющем большинстве случаев сложная, и не имеет вида тфисталла с поверхностью приближающейся к сферической. Судя по имеющимся наблюдениям такая форма обусловлена топографией мембран эвдоплазматического ретикулума.

Из данных, представленых в табл. 2, видно, что введение значителыплх количеств специфической сыворотки предотвращает гибель животных гаи сокращает процент гибели вне зависимости от того, вводится ли сыворотка и вирус раздельно или в смеси. При высоких разведениях (>1:100 ООО) сыворотка не оказывает никакого влияния на сроки выживания кроликов после заражения. В зоне промежуточных юнщентраций антител (1:1 000-1:10 000) при раздельном введении сыворотки и вируса наблюдается некоторое (на 32 %) сокращение сроков выживания, что свидетельствует о наличии эффекта аититслозави-симого усиления.

Таблица 2.

Влишдквведд ди ндммч дплм краппом ai nmei прошв ВГБЮ и леча дie и 1схрд болед и

Доза и активность сыворотки Введение сыво- Исход заражения

Титр Разве- Доза ротки и вируса Пало В % Сроки гибе-

РЗГЛ дение (мл) опыте гибели ли в сугках.

(среднее)

1:128 цельная 2 Раздельно, 0 4 0

1:64 цельная 1 внутримышечно, 0 3 0

1:128 цельная 0.2 за 1 сутки перед 1 4 25 5

1:8 цельная 2 заражением 3 4 75 2;2;3 (2.3)

контроль без сыворотки (опыт 1) 11 12 92 (2.7)

1:64 1:10 I Раздельно, внутри- 3 4 75 1;3;4 (2.7)

1:64 1:100 1 мышечно, за 1 сут- 3 3 100 1;2;3 (2.0)

1:64 1:1000 1 ки перед заражением 3 3 100 1;2;2 (1.7)

контроль без сыворотки (опыт 2) 2 2 100 2:3(2.5)

1:128 1:10000 1.5 Раздельно, внутри- 3 3 100 1;2;2 (1.7)

1:128 1:100000 1.5 мышечно, за 1 сут- 3 3 100 2;4;5 (3.7)

1:128 1:1000000 1.5 ки перед заражением 2 2 100 2;4 (3.0)

контроль без сыворотки (опытЗ) 2 2 100 2:3 (2.5)

1:128 цельная 0.5 Смесь после 1-часо- 0 2 0

1:128 1:10000 1.5 вой инкубации. 3 4 75 2;2;6(3.3)

1:128 1:100000 1.5 внутримышечно 3 4 75 2.2:2 (2.0)

контроль без сыворотки (опыт 4) 7 8 100 (2.1)

Это положение подтверждается данными патшогоапатомического вскрытия. У всех кроликов из опытов 2 и 3, павших по истечению первых суток после заражения патологические изменения в легких, печени, ночках и селезенке были значительно более выраженными по сравнению с контрольными (зараженные серонегативные, антитела не вводили) животными.

В том случае если малые количества антител перед введением инкубировали с вирусом, они не оказывали никакого влияния ни на продолжительность жизни после заражения. mi на патологоанатомичсскуга картину, ни на накопление вируса в органах и тканях зараженных животных.

Поскольку все попытки создания системы культивирования вируса in vitro, как паши. так и других авторов, до сих пор остались безуспешными, то иммуногенез и влияние иммунологических реакций на патогенез проводили почти исключительно клиническими

методами.

Была проведена специальная серия экспериментов по оценке роли антителопе-зависимых иммунологических механизмов в формировании устойчивости (см. Табл. 3). Эту оценку проводили, сравшшая уровень устойчивости, достигаемый пассивной иммунизацией, с таковым в поздние сроки после активной иммунизации.

Таблица 3

Исход инфекционного процесса после заражения активно и пассивно иммунизиро-

ванных животных

Груши животных Номер животного нал/выжил (время гибели сутки) Результат % падежа в группе аражения средняя продолжительность периода от заражения до гибели

Активно иммунизированные (вакцина) 1 2 3 4 Выжил. Выжил. Выжил. Выжил 0 Не определена

После введения плазмы иммунных животных 1 2 3 4 Выжил. Выжил. Выжил. Выжил 0 Не определена

После введения лейкоцитов иммушплх животных 1 2 3 4 Выжил. Пал (2) Пал (2) Выжил 50 2 суток

Ко1ггроль 1 2 3 Пат (2) Пат (2) Пат (3) 100 3.3 суток

Установлено, что высокие уровни противовирусных антител предотвращают гибель и, видимо, приживление вируса. Эго заключение основано на отсутствии сс-рокошерсии в результате заражения пассивно иммунизированных животных вирулентным вирусом. У животных (группа из 6 кроликов), зараженных в отдаленные сроки (через 14 месяцев), ни непосредственно перед, ни после иммунизации не удалось обнаружить антител ни в РЗГА, ни в ИФА, они выжили после контрольного заражения и не выявили каких-либо признаков болезни, но у них отмечена четко выра-жеппая ссроконверсия. В эксперименте у животных, которым вводили аллогенные лейкоциты гипериммунных животных, сформировался иммунитет низкой напряженности (50% падежа), а в результате заражения обнаружена ссроконверсия.

Учет всех этих фактов приводит к вывод)' о том, что в ранние сроки после активной иммунизации ведущую роль в обеспечешш иммунологической защиты играют4 вируснейтрализующис ашитела и друтие антигелозависимые иммунологические механизмы, которые в состоянии предотвратил! не только гибель и болезнь в результате заражения, но и приживление вируса.

В более поздние сроки, после окончания циркуляции антител, (1) основную роль в защите ш~рают клеточные факторы иммунитета, причем в большей степени, очевидно, (2) подверженные рестрикции по главному комплексу гистосовместимости.

Собственные исследования. Репыьтати 15

Это (1) видно из результатов заражения кроликов в отдаленные после активной иммунизации сроки, когда антител явно недостаточно (судя по данным опытов по пассивной иммунизации разными дозами антител) для обеспечения защиты только аитителозависи-мыми механизмами. Сказанное в отношении рестрицированиых но главному комплексу гистосовместимости (2), естественно, экспериментальными данными не подтверждено и является предположением, обоснованным общими сведениями по организации иммунной противовирусной защиты против безоболочечных вирусов.

Вторым этапом работ было исследование влияния обработки животных различными препаратами на продолжительность жизни и характер течения болезни (см. Табл. 4).

Влияние медикаментозной обработки на исход заражения кроликов ВГБК

Таблица 4

№ Обработка зараженных кроликов 11ало/в Смерт- Время жизни

опыте ность в часах у павших

<°'о) М ш п

1 Лбактан Р. 10 мг/кг, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 4/4 100 28, 5 13, 3 4

2 Лбактан Д. 200 мг/кг, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 3/4 75 32, 0 13, 8 3

3 ФГЛ**. 1 мг/кг, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 2/2 100 36, 0 16, 9 2

4 Ясс 1п1".*** 100 ед./голову, в/.м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 3/3 100 40, 0 13, 8 3

5 Циклофосфан. 2 мг/кг, в/м, 3 суток или менее в случае гибели 2/2 100 27, 0 12, 7 2

6 РНК-аза. 30 мг/кг, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 СУТОК. 3/3 100 30, 0 15, 8 3

7 ДНК -аза. 30 мг/кг, в/ч, ежедневно о г заражения до гибели или 7 суток 3/3 100 32, 0 13, 8 3

Гипотиазид/ограничение жидкости. 20 мг/кг, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 3/4 75 30, 0 15, 8 3

У Гепарин. 1000 ед./голову, в/м, ежедневно от заражения до гибели или 7 суток 1/4 25 24, 0 НО 1

1 0 Контроль (заражение без обработки) 14/18 78 31, 7 И, 8 1

** - фитогемагглютишш, *** - человеческий рекомбинашный интерферон, НО - не определено

В экспериментах изучали действие Абактана Р, в состав которого входит ингибитор РНК-зависимых РНК-полимераз, Абактана Д, п состав которого входит ингибитор ДНК-гиразы, фитогемагглютгашна (проверка гипотезы о возможном влиянии поликлональной активации пролиферации клеток), человеческого лейкоцитарного интерферона, циклофос-фана (патогенное действие эффекторов иммунитета). РНК-азы и ДНК-азы (влияние на вирусную нуклеиновую кислоту), гипотиазида в сочетании с ограничением потребления жидкости (влшпше водного баланса на течешю болезни), гепарина (уменьшение свертываемости крови в связи с гипотезой о роли диссиминировапного внутрисосудистого свертывания).

Как видно из приведенных в Табл. 4. данных, обработка животных Абактаном Р, Абактаном Д, РНК-азой, ДНК-азой, интерфероном, циклофосфаном и гипотиазидом не

оказала заметного влияния на продолжительность жизни и уровень смертности зараженных животных по сравнештю с контролем. Не было отмечено отличий между контрольными и опытными животными и по патологоанатомической картине. При применении гепарина уровень смертности снизился примерно в три раза. Это сниже-1ше подтвердило справедливость гипотезы о ведущей роли синдрома рассеянного внутрисосудистого свертывания в патогенезе ВГБК.

2.2.2 Структура и свойства вирионов и гетерогенность вирусной популяции но этим признакам

В экспериментах, описанных в данном разделе, изучали свойства вирионов и гетерогенность вирусной популяции по этим свойствам.

Гетерогенность вируса по коэффициету седиментации изучали с использованием зонально-скоростного центрифугирования в изокинетических градисшах плотности - вязкости сахарозы.

По плавучей плотности - с использованием изопикнического ценгрифугирова-ния в самоустанавливающихся градиентах плотности хлорида цезия в равновесных условиях.

По морфологии вирионов - с использованием электронной микроскопии.

Уже в самых первых экспериментах (1988 год) стало очевидным, что вирус ГБК является мелким безоболочечным вирусом, имеет на поверхности вирионов выросты, удовлетворительно котгграстируется (как негативно - ФВК, так и позитивно -уранилацетатом), склонен к агрегации (даже если его суспензии обогащены белком) с образованием паракристаллон, в том числе и многослойных. В дальнейших экспериментах было установлено, что процесс образования паракристаллов зависит от рН среды таким образом, что в достаточно широкой (7.8 - 9.6) зоне щелочных рН кристаллы не образуются, что свидетельствует об участии в их формировании не только гидрофобных связей, но и ионогенных групп в формировании связей между вириона-ми, входящими в состав паракристаллов. Примеры ультраструктуры паракристаллов приведены на рис.3.

При анализе индивидуальных препаратов вируса, полученных от различных животных, было установлено, что в них присутствует несколько типов вирионов, соотношение которых может меняться от препарата к препарату. Эти типы различаются размерами, формой поверхности и степенью электронной плотности внутренних областей вириона. Все указанные различия четко выявляются при негативном контрастировании. При напылении тяжелыми металлами заметны формы вирионов, различающиеся размерами.

При изучении морфологии вирионов, проводившемся с использованием нега тивного, позитивного контрастирования и напыления тяжелыми металлами (платина-палладий), было обнаружено несколько, различающихся по деталям морфологии, типов частиц. Примеры различных форм вирионов и модель, показывающая взаимосвязь между ними показаны на рис. 2.

Первый из них, обозначенный нами как стандартный, исходя из того, чго в препаратах вируса от большинства животных, составляет основную часть вирусной популяции, морфологически представлял собой частицы кубической симметрии с диа метром 35-37 нм. Поверхность частиц четко контрастировала«) фосфорновольфрамо-вой кислотой, имела в зависимости от ориентации 4, 6 или 7 теней сферической формы, заполняющихся контрастирующим агентом._

А Б

с Г ' V ■* \

11 ' * ^ $ * Л « В

В Г Д Е

а'

Рис. 2. Различаю формы вирионоп, обнаруживаемые в препаратах вируса ГБК и модель :го строения.

Стандартный вирион с неповрежденной оболочкой и цельным геномом (а и А левый), ;тандартный вирион с неполным геномом (Б и а'), обособившиеся в результате утраты эболочки (возможшлй механизм процесса показан на фотографии Е) кор (д и Д), частицы в «ггорые при сборке не включены молекулы, образующие выросты на поверхности вирио-:юв (в и В), «сколлапсировавшая» оболочка вириона с выростами (г и Г).

Рис. 3. Визуализация вируса ГБК методом электронной микроскопии. Негативное контрастирование (фосфориовольфрамовая кислота 1% рН 6.2) масштабные полоски на фотографиях соответствуют 100 им.

А - вирус в сыром экстракте печени. Б - многослойный паракристалл в нейгральном конценгрировашюм растворе очищешюго вируса, В - тот же препарат вируса, что и на фотографии Б, но сорбированный из аликвоты суспензии в которой рН был доведен до 8.0, Г - препарат получен аналогично ггрепарату на фотографии В и спят с большим увеличением. На врезках на фотографиях Б и Г показаны фрагменты инверсионного изображения, показывающего не собственно вирионы, а форму кристаллической решетки, которую они образуют.

Собственные исследования Результаты 19

По периферии вирионов выявляются 10 палочковидных выростов дайной 6 им.

Второй тип частиц отличался от стандартного тем, что центр вириона был элек-тронноплотным. Такая картина при использованном методе контрастирования может быть обусловлена только проникновением контрастирующего агента внутрь вириона. Наличие подобных частиц однозначно указывает на то. что вирионы при созревании могут не содержать вирусной нуклеиновой кислоты.

Третий тип частиц отличается от стандартного тем. что в центре вириона просматривается структура, подобная ядру, имеющая диаметр 15-20 нм, окруженная тонким элек-гронноплотным ободком. Такой тип контрастирования указывает на то, что между внешним слоем капсида и внутренними слоями вириона имеется морфологически выраженная полость очень небольшой толпщны. Такая полость может возникнуть по двум причинам. Первая - формирование вирионов с включением в их состав нуклеиновой кислоты по размеру меньшей, чем размер полного генома. Вторая - наличие в вирионс двух морфологических слоев с полостью между ними. Зрительно это можно представить в виде шара, за-ключешюго в сферу.

Четвертый тип частиц отличатся от стандартного меньшим диаметром, равным 2628 нм, и отсутствием палочковидных выростов на поверхности. Обращает на себя внимание, что диаметр частиц этого типа равен „диаметру стандартных вирионов за вычетом длины палочковидных выступов. Если рассматривать частицы данного типа как разновидность тех же самых вирионов, то очевидна возможность альтернативного пули сборки вирионов, при котором капсид по аналогии, например, с капсидом аденовирусов, состоит из "пенгонов" и не содержит "гексонов".

Пятый тип частиц наиболее сильно отличался по морфологии от стандартных вирионов. Диаметр частиц составлял 20 нм, на поверхности четко выраженные палочковидные выросты тишиной для вируса морфологии и размеров. По аналогии с четвертым типом частиц, логично предположить, что эти частицы представляют собой агрегата, условно говоря, "гексонов".

Шестой тип частиц - лишенные выростов сферические, а не икосаэдрическис, частицы диаметром 20-25 нм. Морфология и размеры этих частиц в точности соответствуют таковым вирусных "ядер".

В начальных экспериментах было обнаружено, что во всех препаратах вирионы со стандартной морфологией, как уже отмечалось, составляют большинство. Дальнейшие исследования показали, что это не всегда так. Когда количество препаратов, полученных от различных животных, стало исчисляться десятками, было установлено, что эти препараты, полученные от разных животных, могут очень сильно различаться по относительным концентрациям вирионов того или иного типа. В одних преобладают частицы со стандартной морфологией, в других они могут оказаться лишь малой частью всей популяции вирионов.

Для определения гетерогенности вируса по плавучей плотности и константе седиментации использовали препараты концешрированного вируса.

Данные определения гемагглютишгрующей активности и морфологии частиц показывают, что стандартные частицы имеют наибольшую плавучую плотность в хлориде цезия и отделяются от остальных тагов частиц. Пика, соответствующего третьему типу частиц, вы-явить не удалось, что может быть обусловлено недостаточно высокой разрешающей :посо бностыо метода или тем, что как такового пика этот тип частиц не образует, являясь гетерогенным по п

иавучей плотности Для проверки инфекционности фракций (см. табл. 5)_

обнаруженных двух пиков седиментограммы были проведены дополнительные эксперименты. Из данных, представленных в табл. 5, следует, что вирулентность частиц, собранных в двух указанных пиках, идентична. Таблица 5

Результаты заражения животных препаратами вируса ГБК, обогагцеипыми час-

Препарат 1 Препарат 2

Гемагглютинирующая активность 1:512 1:512

Относительное содержа! ше частиц, типа 1 >99% 2.3%

типа 2+3 <1% 97.7%

Исход заражешм (пал/выжил) в 2/0 (2,3) 2/0 (2,5)

скобках - время жизни после зара-

жения

Г1ри зонально-скоростном ультрацешрифутироваши в изокинстических градиентах сахарозы установлено следующее. Имеются две фракции вируса, различающиеся по константе седиментации. Обе фракции содержали частицы всех трех типов, но в одной из них основное количество частиц имели стандартную морфологию, в другой находились в основном вирионы второго типа.

Гетерогешюсть вируса по гидрофильно-гидрофобному балансу и заряду изучали с использованием фазовых систем, в состав которых входили полимерные органические соединения и неорганические соли. Было испытано несколько фазовых систем (сульфат аммония - иолиэтиленгликоль (ПЭГ-6000); ПЭГ-6000 - Декстрансульфат Т-2000 при рН 8.4 (буферная система Трис-НС1), 7.4, 6.2 (фосфатная буферная система), ПЭГ-6000 - Декстрансульфат Т-2000 - хлорид натрия при концентрации последнего 0.15. 0.5,1.0 и 1.5 М, ПЭГ-6000 - фосфат натрия при нейтральном рН)

В этих экспериментах установлено следующее. Сульфат аммония в концентрациях до 55 % не влияет на морфологию вирусных частиц, фазовая система ПЭГ -сульфат аммония позволяет эффективно проводить концентрирование вируса ГБК, причем, манипулируя концентрацией компонешш, можно добиться различных профилей распределения вируса и относительного изменения объема фаз. При низких концентрациях ПЭГ и сульфата аммония большая часть вируса локализуется в верхней фазе, а при высоких - в шггерфазе. Вместе с тем, поведение вирусных частиц в данной фазовой системе не различается в зависимости от их морфологии. Это доказывает отсутствие различий в степени гидрофильности и топографии распределения заряда по поверхности вирионов в зависимости от их морфологии.

Взаимосвязь морфологии вирионов и их гемагглютинирующей активности изучали с использованием очищенных препаратов вируса, которые после очистки были подвергнуты дополнительному фракционированию в градиенте плотности хлористого цезия.

При проведении статистического анализа исходили из предположения о том, что если 4-6-й тины частиц представляют собой вирионы контаминантного вируса, тоотсутствие каких-либо различий по тканевому тропизму между вирусом ГБК и этим гипотетическим копгаминантным вирусом чрезвычайно маловероятно и относительные концентрации данных частиц в различных органах одного и того же животного должны различаться._

Установлено, что по относительной частоте встречаемое™ стандартных частиц органы одних и тех же животных не различаются. Практически такой же вывод можно сделать и для частиц второго типа. Относительно частиц третьего тина - обнаружено, что в паренхиматозных органах существеиш.гх различий нет, хота значения коэффициентов корреляции существенно ниже, чем в двух предыдущих случаях, по такие различия весьма вероятны для внугрстпшх органов и кожи.

Таким образом показано, что нет1 оснований предполагать наличия в препаратах каких-либо коптамипатных вирусов, равно как и считать, что вирус репродуцируется в различных органах и тканях с наличием особенностей сборки, выражающихся в формировании альтернативных форм вирионов.

Из этих наблюдений следует заключение о том, что появление частиц различной морфологии является физиологическим процессом, реализующимся па уровне взаимодействия вирусной популяции и организма хозяина с присущими этому организму чертами индивидуальности. Это заключите иллюстрируется дашгыми табл. 6.

В экспериментах, когда серопегативиых кроликов заражали вируссодержащими материалами, существенно различающимися по относительному содержанию стандартных частиц, установлено, что различия по времени жизни, уровшо смер тности и содержанию частиц различных типов между грутшами зараженных животных отсутствуют. Следовательно, образование в организме кролика частиц различных типов обусловлено физиологическими особенностями этого организма, а не свойствами вирусного изолята.

2.2.3. Физико-химические свойства вируса геморрагической болезни кроликов и ею чувствительность к факторам окружающей среды

2.2.3.1 Чувствительность вируса к физическим, химическим, биологическим факторам и средствам дезинфекции

В экспериментах но изучению влияния различных температурных режимов хранения установлено следующее. При температурах хранения, не превышающих -25°С, время сохранения ипфекционности превышает 2 года. Титр вируса в РГЛ несколько (не более, чем в 2 раза) уменьшается в процессе замораживания. Устойчивость вируса к повышенной температуре довольно велика. Гемагглютинирующая активность при повышенных температурах более стабильна, чем инфекционная. Вместе с тем. при длительном хранении вируса ГБК в у словиях низких температур имело место явление, заключавшееся в том, что вирусные препараты, начисто лишенные гемап лютшшрующей активности, практически полностью сохраняют инфекциогаюсть.

При определении влияния состава среды на термостабильность вируса использовали в качестве компонентов вируссодержагцего раствора белок (бычий сыворточный альбумин), углевода (лактоза, глюкоза), декстран (декстран Т-20) и неорганические соли (№С1, (Ш4)2504, ^НРОУКаРТРО., при нейтрал!,пом рН).

Установлено, что характерных особенностей по отношению стабильности вируса в средах различного состава не обнаружено. Как и подавляющее большинство других вирусов, вирус ГБК более стабилен в средах, обогащенных бачком, во всем диапазоне темпе нератур. В области высоких температур сахариды и декстран несколько повышают его стабильность, а неорганические соли в высоких ко1щентрациях - снижают. В то же самое время эта вещества практически не оказывают влияния на сохраняемость вируса при более низких температурах. рП-оптимум хранешга вируса располагается в слабокислой зоне 6.26.6,-

Таблица

Средине показатели процентного содержат« вирусных частиц разных типов в организ ме зараженных животных

Номер Доза зараже- Исход болезни Процентное содержание во всех препаратах

животного ния ГАЕ полученных от животного части тина

1 2 3

24 1024 Пал на 2 сутки 97,91 1,29 0,29

23 2048 Пал на 1 сутки 97,74 1,17 0,54

10 256 Пал на 1 сутки 97,60 0,90 0,57

2 2048 Пал на 2 сутки 97,45 0,99 0,84

22 1024 Пал на 2 сутки 97,42 1,48 0,69

17 512 Пал на 2 сутки 97,26 1,73 0,49

5 1024 Пал на 3 сутки 97,16 1,41 0,75

11 1024 Пал на 2 сутки 97,01 2,08 0,39

1 512 Пал на 1 сугки 95,78 1,28 2,10

7 2048 Пал на 3 сутки 95,78 2,63 1,28

19 128 Нал на 2 сутки 95,49 2,74 1,20

16 2048 Пал на 4 сутки 95,14 3,20 0,65

14 2048 Пал на 2 сутки 95,05 3,77 0,62

27 512 Пал на 3 сутки 94,63 2,88 2,08

15 512 Пал на 1 сутки 94,27 4,38 0,89

8 512 Пал на 2 сутки 92,55 5,15 1,71

28 2048 Убит на 1 сутки 91,24 6,28 1,97

6 1024 Пат на 5 сутки 89,39 8,63 1,75

21 1024 Пал на 2 сутки 86,35 7,67 5,35

12 1024 Пал на 3 сутки 85,21 8,11 5,79

26 128 Убит на 3 сутки 80,26 11,38 7,86

25 256 Пал на 2 сутки 79,33 13,38 6,59

3 10240 Убит на 6 сутки 78,26 15,57 5,61

13 256 Пал на 4 сутки 76,97 15,70 6,59

20 10240 Пал на 3 сутки 73,66 18,30 7,32

9 1024 Убит на 6 сутки 37,11 42,83 19,35

18 256 Пал на 4 сутки 34,61 47,78 16,89

4 2048 Убит на 5 сутки 28,62 45,29 25,93

Определение чувствительности вируса к действию дезинфектантов проводили в растворе и на поверхностях материалов с различными свойствами.

Собственные исследования Ретитаты 23

В данных экспериментах, кроме обычных дезинфектантов, использовали и перспективные экстрагснты, которые, как можно было бы полагать, примегашы в ходе выделения и очистки вируса из биологического материала.

Использованные в экспериментах химические вещества чегко разделились га три грушш. Первая эффективно инактивирует гемагглютшгарующуло активность (глутаровый альдегид, гинохлорид, щелочь, хлорамин), вторая - пет (эфир, фреон), а для веществ трелей группы этот эффект зависит от их концентрации (Теотропин, формальдегид). Из этого следует, что вещества первой группы - эффективные дезинфектапты, второй - эффективные экстрагенты, третьей - перспективны как инактиваторы для конструирования вакцин.

При испытании эффективности действия дезинфектантов на вирус ГБК установлено, что хлорамин и щелочь наиболее эффективны при комнатной температуре и для инактивации вируса в растворе. Они надежно убивают вирус в течение 6 часов. При пониженных температурах наиболее эффективна щелочь. При испытании действия дезинфектантов в зависимости от обрабатываемого материала установлено, что наиболее эффективной для дезинфекции пористых поверхностей является щелочь, а для аэрозольной дезинфекции помещений - Теотропин.

2.2.3.2 Кинетические характеристики вириопов

Целью исследований, результаты которых описаны в настоящем разделе и следующем, было определение седиментационпых и хроматографических характеристик вирио-нон вируса ГБК, исходя из того, что они важны для определештя систематического положения вируса и разработки методов получения препаратов очищенного вируса, а также чувствительности вирионных белков к действию ферментов, поскольку эти данные важны для понимания структуры поверхностных слоев вируса.

Подходы к определению седиментационпых характеристик были тривиальными.

Установлено, формальный максимум распределения вируса в градиенте соответствует плавучей плотности 1,367 г/см3 . Оценка разброса данной величины показала, что истинное значение изоплотпости вирионов вируса ГБК заключено в диапазоне 1.353 -1,381 г/см3.

При определетш константы седиментации также использовали широко известный юдход, предусматривающий использование изокииетнческих градиентов илопюсти-шзкости сахарозы (для контроля процесса седимстации использовали вирус болезни Тенена (160 Э), и иммуноглобулин М (9 Б). Вирус болезни Тешена определяли в градиенте титрованием в культуре клеток по ЦПД, пенгамер иммуноглобулина М свиньи - в иммуно-электрофорезе. На финальной стадии для уточнения полученных результатов проводили шалитичсское центрифугирование очищенного вируса в дистиллированной воде со сканирующей рефрактометрией в ходе цсшрифутировашм.

Установлено, что значешк константы седиментации вируса ГБК находится в преде-их 165.4-178.6 Б.

Для определения «молекулярной» массы вириопов проводили гельпроникающуто фоматографию на Сефарозе 2В. Гемагглютиниругощая активность вируса связана только ; одним высокомолекулярным пиком. В этом же и только этом пике методом электронной микроскопии установлено наличие вируса. Этот факт можно объяснить двумя путями. Терпый - в исследованных препаратах отсутствует гемагпнотишш в виде, не ассоцииро-шнном с вириопами.

24_"_Результаты Собственные исследования

Второй (более вероятный но аналогии с другими гемагглютинируютцими вирусами) - если молекулы гемагтлютинина и могут существовать в виде несвязанных с вирионами «мономерных» частиц, то они. даже сохраняя способность связываться с соответствующими рецепторами на мембране эритроцитов, не способны агглютинировать последние из-за своей моновалентности. Вирус элюируется одним пиком, масса его соответствует 13 МДа.

2.2.4 Биологические свойства вируса ГБК

2.2.4.1 Адаптация вируса к репродукции in vitro

Начиная эксперименты по данному вопросу, мы имели информацию об исключительной трудности, с которой вирус ГБК адаптируется к культурам клеток. Эти данные мы получили га двух источников. Первый - работы зарубежных, в основном китайских и итальянских, ученых, опубликованные в специальной литературе. Второй - результаты очень обширного цикла исследовашш по подбору культуральных систем для репродукции вируса ГБК, выполненной во ВПИИВВиМ под руководством В.И. Жестерева.

Из анализа опубликованных данных стало очевидно, что адаптация вируса ГБК тривиальными способам не реальна. В связи с этим были сформулированы проблемы, которые теоретически могли бы обусловливать такую ситуацию и способы, которыми можно проверить возникшие предположения.

Вирус не репродуцируется in vitro потому, Адаптация к растущим культурам почки что для его репродукции клетки должны зеленой мартышки (CV-I), почки сибирского находиться в S-фазе клеточного цикла. горного козерога (ПСГК), почки свиньи (ПК-

¡5) и мышиной миеломе SP2/0 Вирус репродуцируется in vitro, но индуци- Попытки выявить абортивную репродукцию рует в культурах не продуктивную, а ла- или латентное инфицирование культур CV-I тентную инфекцию и ПСГК

Вирус не репродуцируется потому, что для Адаптация к культуре ПСГК зараженной репродукции ему необходим вирус - по- аденовирусом (штамм Cornell-2 вируса гепа-

мощник тита собак.

Вирус не репродуцируется в перевиваемых Адаптация вируса к первичнотрипсишзиро-культурах клеток (по любой причине) ванным клеткам печени, почки и альвеоляр-

ным макрофагам кролика Вирус не репродуг^ируется потому, что для Адаптация вируса к культуре ПСГК в при-репродущии или заражения чувствитель- сутствии гепаринизированой плазмы кролика ных клеток ему необходимо присутствие с неудаленной фракцией тромбоцитов кроличьих факторов свертывания крови

Вирус не репродуцируется потому, что для Выращивание вируса в тканевых зкепланта-репродукции ему необходим (ы) коротко- max печени при заражении этих экспланта-живущий (е) фактор (ы), который вира- тов in vitro и in vivo батывается не теми клетками, в которых вирус репродуцируется

Эксперимеш~алыыя часть работ была посвящена именно проработке этих проблем, а не перебору большого количества различных культур клеток.

В экспериментах были сделаны попытки адаптации вируса к репродукции в растущих клетках. Эти эксперименты дали полностью отрицательные результаты для культур клеток С V, ПСГК, ГЖ-15, SP2/0.

Следующая серия экспериментов была посвящена тому, чтобы определить, проникает ли вирус внутрь клеток и, если проникает, то следуют ли за этим проникновением депротеинизация нуклеиновой кислоты и другие стадии абортивной инфекции. _

Собственные исследования_Результаты_25

Данные показали, что вирус достаточно эффективно проникает в клетки CV и Г1СГК и некоторое время сохраняется в mix в неразрушенном виде, что установлено при использовании РГЛ. Постепенное уменьшение титра в РГА можно было бы трактовать как стандартную депротеинизацию вирионов, однако данные ИФА этого не подтверждают. Нарастания титра в ИФА, происходящего параллельно с уменьшением титра в РГА отмечено не было, как не было отмечено и абсолютного прироста титра вирусного антигена в ИФА. Из этого следует заключешге о том, wo адсорбция вируса на клетках и эндоцитоз в этих системах вирус-клетка происходят, но цикл репродукции прерывается до стадии образования вирусной субгеномной или матричной РНК, когда вирусные белки еще не синтезируются.

В опытах по испыташпо потешщи вируса гепатита плотоядных в качестве вируса помощника проводили попытки совместного культивирования вируса гепатита плотоядных (Cornell П) и вируса ГБК (В-87) в культуре клеток ПСГК. Результат экспериментов был полиостью отрицательным.

При экспериментах с первичными культурами кроличьих ¡слеток испытывали два подхода. Первый - клетки печени (суспешия с концентрацией 4-5x10° клеток в 1 мл) получали от интактных серонегативных кроликов, и в культуральных матрасах (емкость 100 мл, 10-15 мл культуры) заражали с адсорбцией и без отмывки (поскольку значительная часть клеток оставалась не тгрикреаленпой к стеклу) вирусом ГБК. Ку.нлтгвировати в присутствии 10% дефибринированиой аутолоптчной плазмы крови в культуратьной среде ДМЕМ при 37оС в течение 4 суток. Второй - клетки печени получали от кроликов, зараженных за 2 сугок до этого вирусом ГБК в стандарпплх условиях и без повторного зара-жешгя, культивировали при тех же условиях, но с добавлешем сыворотки шгтактиых кроликов. Динамику «накопления» вируса в культуре определяли с использованием РГА и электронной микроскопии.

Из полученных данных следует, что репродуктивного цикла вирусной инфекции не удалось выявить ни при заражении первичных клеток печешг in vilro, mi при культиви-ровашш ткани печени кролика зараженного in vivo, поскольку по ходу культивирования титры вируса не повышались, а падали. Важно отметить, что титры вируса в культуре гкаш1 зараженных животных падали уже на протяжении первых суток их культивирования. В связи с этим, учитывая данные по ультраструктуре зараженных тканей и наличию несомненных свидетельств репродукции вируса в печени, стало очевидно, что при приготовлении культуры тканей этого органа в ней отсутствуют какие-то факторы, необходимые для репродукции вируса и имеющиеся в организме зараженного животного.

При изучении гипотезы о роли факторов свертывания в индукции инфекционного процесса культуру клеток ПСГК в монослое в культуральных матрасах емкостью 50 мл (57 мл среды) заражали с адсорбцией, но без удаления препарата, которым проводили заражение, внося 2 мл вируссодержащего препарата. Вируссодержащий препарат получали следующим образом.

У цитатного серонегативпого кролика стерильно, шприцем, содержащим гепарин, отбирали из сердца 10-20 мл крови. Кровь вносили в силиконизированные пешщил-лгаювые флаконы на 20 ли и выдерживали в течение 2 часов в термостате при 37оС. Стерильно пипеткой или шприцем аспирировали около 30% объема отстоявшейся гепарини-знрованой крови сверху, не захватывая осевших форменных элементов. К полученной жидкости добавляли очищенный вирус ГБК до конечного титра, по данным РГА равного 1:512-1:2048, и полученную смесь немедленной использовали для заражения.

26_Результаты Собственные исследования

Результаты, как и в предыдущих случаях, были полностью отрицательными в гшане выявления репродукции вируса. Титр его при культивировании в течение недели прогрессивно падал с исходшлх величин, составлявших 1:128-1:32, практически до нуля (1:4 - 0).

При изучении возможности культивирования вируса в тканевых эксплантатах печени и селезенки придерживались следующей схемы проведения экспериментов. Как и в случае первичных культур клеток кролика эксплантаты получали либо от итактпьгх кроликов и инфицировали их in vitro, либо от инфицированных кроликов без заражения in vitro. Накопления вируса элсктропномикроскоиически (ультратонкис срезы непосредствешю эксплантатов), и, после гомогенизации, в РГЛ выявлено не было.

2.2.4.2 Вирусный гемагглютипии и параметры реакции гемагглютипации, вызываемой вирусом ГБК

В экспериментах использовали препараты концентрированного вируса, которые имели титр в РГЛ не ниже 1:163 840, очищенного - не ниже 1:327 680.

При первичном изучении условий постановки реакции в осветленной суспензии определяли титр вируса в РГА с эритроцитами человека различных групп крови, эритроцитами различных видов животных и птиц. Установлено, что вирус ГБК проявляет (из числа испытанных) гемагглютшшрующую активность но отношению к эритроцитам человека всех четырех групп крови, барана, курицы, утки и, в меньшей степени - КРС. В отношении эритроцитов КРС было отмечено, что от одного донора эритроцитов к другому тигры одного и того же препарата вируса менялись многократно сильнее, чем при смене доноров эритроцитов других видов, в том числе и человека. Возможно, это связано с тем, что эритроциты не всех групп крови, присущих КРС, активны в данной реакции, но, поскольку в нашем распоряжении не было системы определения групп крови КРС, то это предположение осталось не проверенным.

Следующим этапом работы было определение рН - оптимума реакции гемагглютипации. В экспериментах использовати эршроциты человека группы 1 и осветленную вирусную суспензию. Установлено, что рН - оптимум РГА с вирусом ГБК и эритроцитами человека находится в слабокислой зоне рН 6.2-6.6. Гемагглютинация имеет место при рН ниже 8.

В следующей серии экспериментов испытывали влияние различных веществ на эффективность РГА с вирусом ГБК. Было обнаружено, что галактопиранозид ип-гибирует, а манноииранозид усиливает реакцию, причем эти эффекты были зависимы от концентрации указашшх утлеводов. Это указывает на участие гликозитированпых белков пли гликолинидов в процессе образования комплекса вирус-мембрана эритроцита. Причем, поскольку в составе вириона гликозилированпых белков не имеется и обработка гликозидазами вируса не уменьшает его гемагглютинирующей активности, то из этого следует, что в процессе гемагглютипации вирус взаимодействует с обогащенными гатактозными остатками гликозильными цепями мембранных компонентов эритроцитов.

При определении термостабилыюсти вирусного гемагглютшшна установлено, что она весьма велика и приближается к термостабилыюсти наиболее устойчивых к прогреванию белков сыворотки крови (см. табл. 7).

Таблица 7

Стабильность гемап лютигаша i

Время инкуба- Тая lepaiypa, i pi которой проводилась и куба щ ОС)

ции (часы) 20 37 56 65 80* 90*

1 1:128 1:128 1:128 1:32 1:16 1:8

2 1:128 1:128 1:64 1:8 1:4 0

3 1:128 1:128 1:64 1:4 0 0

5 1:128 1:128 1:64 0 0 0

7 1:128 1:128 1:64 0 0 0

9 1:128 1:128 1:64 0 0 0

11 1:128 1:128 1:64 0 0 0

13 1:128 1:128 1:64 0 0 0

15 1:128 1:128 1:64 0 0 0

18 1:128 1:64 1:16 0 0 0

20 1:128 1:64 1:16 0 0 0

23 1:128 1:64 1:8 0 0 0

Данные в таблице представляют собой модальную величину титра из четырех параллельных определений.

* при нагревании наблюдалось образование преципитата, "пет" означает отсутствие гемагглютинирующей активности.

Для определения количества вируса, связываемого эритроцитами, готовили суспензию эритроцитов с ко1щентрацией 73 500 ООО клеток/мл. Вирус разводили для получения суспензии, имеющей татр в РТА 1:4096. В результате экспериментов установлено, что 50% вируса, содержащегося в 1 мл суспензии при его титре 1:4096, связывают эритроциты, содержащиеся в 50 мкл суспензии. Таким образом, 1 эритроцит связывает 0.001 ГАЕ (точность определения в пределах точности титрования вируса в РГА).

Изучите кинетики взаимодействия вируса с эритроцитами дало следующие результаты. Связывание вируса с эритроцитами происходит за 1-2 минуты (достижение равновесного состояния), элюция вируса с эритроцитов при непермиссивных для i емагглютина-ции pH происходит за 3-5 минут. Константа диссоциации комплекса вирион-эритроцит составляет 3,3x10"°, а ошибка ее определения - 1,5x10^.

При определении количества вирионов, соответствующего 1 ГАЕ, использовали титрование в РГА и подсчет физических частиц вируса под электронным микроскопом. Установлено, что соотношение физические частицы/гемадсорбирующие едшплрл составляет 1/350000-1/410000 и не различается для очищенных «стандартных» вирионов и смеси частиц типа 2 и 3.

Таким образом, наличия примерно 4х108 вирусных частиц в 1 мл достаточно для того, чтобы агглютинировать примерно 7,3x10' эритроцитов. Из этого следует, что при со-отношешш примерно 6 вирионов на эритроцит происходит агглютинация последних. Тогда, учитывая, что один эритроцит связывает около 0.001 ГАЕ вируса, 1 эритроцит может связать примерно 4х105 вирионов.

2.2.5 Полипентиднмй состав и ангигенность вируса

Первым этапом работ в данном направлении была разработка методов очистки вируса. Определение оптимальных режимов их реализации было проведено с использованием данных по физико-химическим свойствам вирионов и чувствительности гемагглютинации, вызванной вирусом ГБК, к физико-химическим факторам.

2.2.5.1 Разработка методов очистки вируса

Исходит,1е требования к методам очистки существсшю различались в зависимости от тех целей, для которых предполагалось использовать препараты очищенного вируса. Например, при использовании препаратов очищенного вируса как сырья для выделения вирусной нуклеиновой кислота состояние поверхностных белков вириона практически не имеет значения. Основным требованием является чистота полученного препарата и отсутствие примесей нуклеаз. что предполагает использование протсолитических ферментов, которые разрушают нуклеазы. С другой стороны, при использовании вируса для выделения или изучения поверхностных белков вириона применение жестких процедур при очистке, в частности - обработки протеазами, нежелательна, по крайней мере до тех пор, пока не доказано, что такая обработка не изменяет структуры и свойств этих белков.

При разработке мягкого способа очистки вируса за основу была взята разработанная в лаборатории Диагностики ВНИИВВиМ Г.М. Карповым методика сорбции - элюции вируса на эритроцитах человека, которая была нами в дальнейшем модифицирована с учетом нриведешшк выше данных по чувствительности комплекса вирус-эртроцит к составу среды и рН.

Метод дават отличные результаты в отношении чистоты вирусных препаратов и их сохранности в процессе очистки, по был не свободен от недостатков. Первый из них - непринципиальный - зависимость от наличия и качества эритроцитов. Второй - значительный для экспериментов, когда очистке подвергаются большие (сотни грамм - единицы килограмм тканей зараженных животных) количества вируссодержащсго сырья. При этом количество добавляемых к вируссодержащей суспензии эритроцитов гак велико, что отмывка их становиться технически трудно реализуемой, так как требуются большие препаративные роторы, которые комплектуются широкими сосудами (в них происходит «закручивание» осадков 1гри остановке ротора и т.п.), большие объемы буферных растворов, необходимые для отмывки эритроцитов, а после элюирования вируса из состава комплекса объем элюатов становится так велик, что необходимо применять промежуточное копцентрироваше перед использованием для дальнейшей очистки ультрацентрифугирования. По этой причине, не смотря на то, что уже был разработан вполне удовлетворительный метод «аналитической» очистки, исследования в данном направлении были продолжены с целью разработки препаративной методики.

Очищенные с применением сорбции-элюции на эритроцитах препараты вируса использовали для изучения влияний на его морфологию, полипептидный состав и гемагглкшширую1цую активность тех процедур и веществ, которые планировалось использовать при разработке методов препаративной очистки вируса. При этом было установлено следующее. Морфология и полииептидый состав вируса не изменяются при его обработке в фазовых системах Фреон-113 - вода и хлороформ - вода и после -обработки Тритоном-ХЮО в концентрации до 0.5% в течение 1 часа.

Собственные исследования Результаты 29

Вирус резистентен к действию трипсиш (до 4000 ед./мл, 37'С, 18 часов рН 5.0). В том случае, если вирус предварительно прогревали при телптсратурах выше 60°С, он становился чувствительным к действию трипсина (20 ед./мл, рН 7.0, 1 час, 37°С), в результате которого мажорный капсидный белок УрбО расщеплялся на несколько крупных фрагментов, которые оставались связанными с вирионами. Поверхность последних в результате такой обработки лишалась характерных выростов.

Учитывая нечувствительность гаггактного вируса ГБК к трипсину, была разработана схема экстракции вируса из тканей зараженных кроликов. Для ткани печени выход вируса (по сравнению с применением гомогенизации органа и трехкратного замораживашга и оттаивания) увеличивался в 4 раза.

Полученные первоначально на ткани печени данные в этом смысле были подтверждены в дальнейшем в эксперимеш-ах по выделению вируса из селезенки, лимфоидной ткани и мышц. При выделении вируса из ткани легких, почек и мозга прироста тигра вируса после обработки суспензий ткани трипсином отмечено не было. Кроме того, при такой обработке ткани мозга получали препарат, похожий на эмульсию жира в воде, которую практически не удавалось осветлить перед-последующим концентрированием без предварительной экстракции фреоном или липидорастворителями.

2.2.5.2 Полипептидпый состав вируса ГБК.

Полипептидный состав вируса изучали с использованием электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, иммуноблотинга, радиоиммунопреципи-тации. В качестве вируссодержащих препаратов использовали лизаты клеток печени зараженных кроликов, препараты вируса, очищенного различными методами. Лнтигенность вирусных белков изучали с помощью иммунологических реакций (РДП, ИЭОФ, РСК, ИФЛ, РГЛ/РТГЛ, иммуноэлектрошюй микроскопии), а также с использованием очищенного вируса и лизатов зараженных тканей.

На первом этапе экспериментов определяли полипептидный состав вируса с использованием стандартного электрофореза в ДСП-ПЛАТ по Ьаетт1у в восстанавливающих условиях. В результате в препаратах очищенного вируса была выявлена единственная мажорная нолипеитидная полоса (60 кДа) и две шторных. Затем был проведен ряд экспе-риметов, когда использовали восстанавливающие и ^восстанавливающие условия и существенную - до 32 раз - перегрузку гелей общим белком препарата, что позволило вы-явип. ряд дополнительных полипептидов. Результаты представлены на рис. 4.

В целом полипептидный состав очищенного вируса характеризовался следующим. Один мажорный полипептид с молекулярной массой 59.6 кДа (УрбО), три высокомолекулярных (Ур54, Ур42, Ур37) и два пизкомолекулярных (Ур16, Ур14.5) полипептида, представленные в достаточно больших количествах и несколько минорных с массами 57, 51, 49, 47, 41.5, 37.5, 29 и 18 кДа. Вирусная специфичность УрбО, Ур54, Ур42, Ур37 и Ур16 была подтверждена методами иммуноблотинга и радиоиммупопрецишгтации. Ур14.5 не взаимодействовал с антителами кроличьих гипериммунных сывороток при использовании обоих этих методов. Вместе с тем, его регулярно обнаруживали в препаратах очищенного вируса. Причины этого остались не установленными. Возможно этот полипептид представляет собой белок клеток кролика, л которых репродуцируется вирус и который включается в состав вириоиа, либо неиммуногенный вирусный белок. Четко подтвердить или отвергнуть вирусную специфичность минорных белков не удалось 1ш по их ангигенности, ни том более по

- 92-

—УрбО - 67- .УрбО

— 45«

- 30_ »Ж ■т"

-14- и

Рис. 4. Характеристика полипетидного состава и антигснностивируса ГБК методом ДСН-ПААГ-электрофореза, нммуноблотинга и радиопммунопрецитгтации.

На рисунке показаны иммуноблотограммы (А и Б), электрофор еграымы (В и Г) и радиоавтограф после радиоиммунопреципигации (Д) полипетидов вируса ГБК моноклональньш анппелом 4С11.

к иммупогенности, гак как не удалось получить их очищенные препарата в достаточных щя такого определили количествах.

Интересно отмстить, что гюлипеггшд Ур37 в состав вириона входит в виде гомопо-'.имерной структуры, поддерживаемой дисульфидными связями. Это весьма редкое явле-гас. Обычно структуры, поддерживаемые Б-Б связями - это гсгерополимеры (например gG), а гомополимеры (например, тример гемагглютигапш ортомиксовирусов) поддержи-шотся нсковаленгиыми связями.

Таким образом, в результате проведенных экспсримештт было установлено, что в :оставе препаратов очшцишых вирионов обнаруживается несколько полипептидов, как пшимум один из которых является в вирионе полимеризованным. все полипеигиды име-эт относительно невысокую (<60 кДа) молекулярную массу. Аналогии с качественным юлипептидным составом вирионов мелких безоболочечных вирусов (пикорна- - 4 поли-юшида, иарво- - 3 нолипетида, калици- - 2 полипептида и т.д.) подсказывали, что такое голичество структурных полипептидов слишком велико для вируса такого размера, даже :сли вссти речь только о тех 6 полипептидах вируса ГБК, вирусная специфичность кото-1ых была подтверждена методом иммуноблотиша.

По этой причине встал естественный вопрос о том, не являются ли эти полипетиды покой молекулярной массы фрагментами УрбО. Поскольку аппаратуры для проведения юптидпого сиквенса мы не имели, то проверку данного предположения пришлось целиком сновать только на иммунологических методиках. Для се проведения использовали три гадхода.

Первый - получение напели моноююнальных антител на УрбО и оценка сродства юлученпых моноклональных антител к другим нолипептидам. выявляемым в составе ви-|усных препаратов.

Второе - очистка индивидуальных нолипептидов методом препаративного электрофореза, иммунизация очищенными полипентидами кроликов с последующим тесгировани-:м иммуногешюсти данных нолипептидов и изучением перекрестных реакций антител, юлучипплх па эти иолипепгады с другими полипептидами, в том числе и УрбО.

Третье - получение поликлональпых и моноклональных антител на полипешиды и к тестироваште методом имммуноэлектрошюй микроскопии с цельными вирионами раз-!ичных типов. Описаште этих данных приведено не в настоящем разделе, а в следу тощих, юскольку оно органично сочетается с изучением антигенных и иммупогенных свойств ируса.

'.2.5.3 Получение моноклональных антител к вирусу ГБК

Кроме резонов, показавишх необходимость получеши панели моноклональных ан-ител на УрбО вируса ГБК, касающихся необходимости углубленного изучения полипен-идного состава, было очевидно следующее. С появлением повой нозологической единицы озникла необходимость детального изучения вируса ГБК, разработки средств и методов юниторгап а вируса в природе, включая создание современных средств диагностики, в том исле, с использованием моноклональных антител. Перспективность использования моно-лональных антител для этой цели неоднократно освещалась в научной литературе и уже ¡с вызывает ни у кого сомнений. Это и стало целью исследований, результата которых редставлены в настоящем разделе.

Начиная эти исследования (1988 год), мы уже имели информацию о том, что выявление вируса ГЪК в серологических реакциях и РГА в типичных случаях (правильно отобранный патологический материал и т.п.) не представляет никакой проблемы с использованием традиционных методов, как и выявление сывороточных шггител (вакцишфованные животные и реконвалесценты для ретроспективной диагностики). Вместе с тем. использование РГА и РСК имеет существенные ограничения как в случае применения свежих эритроцитарных препаратов (необходимость постоянного их получения, проблема стандартизации), так и в случае консервированных эригрощггарных препаратов - фиксированных и лиофильно высушенных (фоновая агглютинация и др.). Прочие диагностические методы, разработашале для выявления вируса, достаточно длительны в постановке, а часть из них не может быть реализована, если пробы патологического материала ие отвечают ряду достаточно жестких требований к отбору и транспортировке проб.

Отдельную проблему, с трудом решаемую при использовании РГА, представляет собой возможное наличие в патологическом материале гемагглютишрутощих агентов не имеющих отношения к вирусу ГБК, особенно в том случае, если они присутствуют в пробе вместе с последним. Методы выявления противовирусных антител также не вполне свободны от сходных недостатков. Еще одну проблему в этом случае представляет собой практически неконтролируемый состав сывороточных иммуноглобулинов но своей антигенной специфичности, что является основой для появления ложных результатов серологических реакций, хорошо известных из практики.

Целью исследований было получение и характеристика панели моноклональ-ных антител на основной капсидный белок, который, как было показано выше, является иммунодоминангаым и, следовательно, наиболее применимым для диагностических целей как в смысле выявления факта наличия вируса в пробах патологического материала, так и обнаружения и количественной характеристики иммунного ответа на вирус у вакцинированных и рскопвалесцептных животных. Работы по гибридом-ной технологии проводили по обычным схемам.

В результате этих экспериментов было получено 15 гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусу ГБК. Характеристика последних представлена в табл. 8.

Определение полинептидной специфичности методом радиоиммунопрецшш-тации показало, что все получешше гибридомы секретируют МКАт к мажорному вирусному белку УрбО.

При изучении свойств МКАт и пероксидазпых коньюгатов на их основе в конкурентом ИФА установлено, что МКАт можно разделить на 4 самостоятельных группы. Моноклональные антитела из одной группы не конкурируют с моноклональными антителами из трех других групп, но конкурируют (уровень 33-100%) между собой.

Таким образом, были обнаружены четыре неперекрывающиеся антигенные регионы в составе молекулы УрбО. Тонкая структура трех регионов не была изучена, поскольку на каждый из них было получено лишь по одному МКАт. В составе третьего региона были обнаружены три частично перекрывающихся антигенных детерминанты. Методом ДСН-ПААГ электрофореза по Гаетт1у в восстанавливающих условиях было показано, что все 15 мопоклональных антител распознают денатурированный вирусный антиген, следовательно, соответствующие эпитопы представляют собой линейные

Собственные исследования_Результаты_33_

пептидные детерминаши, либо, что менее вероятно, фрагменты вторичной структуры полипептидной цени, жестко заданные его первичной структурой и потому восстанавливающиеся в ходе электропереноса после полной денатурации молекулы.

В дальнейшем стало очевидно, что эти эпигоны экспотгрованы на поверхности молекулы Vp60 и поверхности вириопа, поскольку нативный белок эффективно распознается ими, а антитела эффективно распознают их в составе очищенного вируса при проведешш ИФЛ в режиме двойного антигельного сэндвича. Для моноклональпых антител 4С11и 3D8 это было подтверждено методом иммуноэлектронпой микроскопии. Интересно, что аффинность связывания аштггел соответствуюпшми детерминантами антигена не изменялась после денатурации - ренатурации молекул последнего, что подтверждено и в системе ДАС-ИФЛ при сравнении количественных характеристик реакции с нативпым антигеном и антигеном, обработанным ДСП в восстанавливающих условиях.

2.2.5.4 Усовершенствование методов серологической диагностики на основе моноклональпых антител

Вирусспецифические моноклональшле антитела клонов, проявляющих высокую активность в непрямом варианте ТФ ИФА, были применены для выявлешгя антигена вируса ГБК в сэндвич - варианте ТФ ИФА при различном сочетшгии МКАт, сорбировашп.к на твердой фазе, и перокевдазных копъюгатов на их основе.

Проведенные исследования показали, что МКАт, секретируемые двумя клонами (4С11 и 3115), позволяли очень эффективно выявлять специфический антиген в сэндвич -варианте ТФ ИФА. Вместе с тем, при сравнении эффективности применения даже этой пары моноклональпых антител с эффективностью другой системы проведения ДАС-ИФА, когда моноклональные антитела используются в качестве антител захвата, а конмогат готовят из поликлональных антител, было установлено преимущество последней системы по чувствительности практически без ущерба для специфичности и в плане уровня фонового сигнала.

Для окончательной отработки этой системы в ней были испытаны все полученные моноклональные антитела. Наиболее приемлемыми были результаты, полученные с аши-телами клона 4С11, который в сочетании с пероксидазным конъюгатом на основе политональных антител позволял обнаруживать антиген вируса ГБК (серия из более, чем 100 различных вируссодержащих препаратов) в тигре до 1:6561, что превышало чувствительность РГ'А в отношении данных препаратов в 5 раз. Причем данный вариант ИФА выявлял специфический антиген не только в су спензии из печени павших от ВГБК кроликов, но и в вакцгашых инакгивированных препаратах.

Специфичность метода подтверждена при исследовании с гетерологичными антигенами (печень здорового кролика, пастереллез. миксоматоз). Данные одного из экспери-McirroB представлены в табл. 8.

Данный вариант ИФА был взят за основу при разработке ДАС-ИФА, позволяющего выявлять антитела в сыворотках крови больных и вакцинированных кроликов. Испытания показали, что разработанный метод обладал специфичностью и позволял выявлять вирус-специфические антитела в сыворотках крови кроликов.

Сравнительное изучение сэндвич - варианта ИФА и РГА, а также ДАС-ИФА и РЗГА, подтвердило пригодность методов ТФ ИФА на основе МКАт в качестве сигнальных экспресс - методов в схеме диагностики ВГБК и их преимущество по чувствительности.

Табли

Результаты обнаружения антигена виру са ГБК в сэндвич - варианте ИФА и антител 1 сыворотках крови кроликов методом ДАС-ИФА с помощью моноклональных антитс:

Исследуемый материал Титр в сэндвич-ИФА или в ДАС-ИФА Титр в РГА али в РЗГА

10%-ная суспензия печени кролика, зараженного ВГБК 1:6561 1:1280

вакцина против ВГБК, ипактивиро-вагшая. лиофилизированная 1:2178 1:320

10%-ная суспензия печени здорового кролика 0 0

10%-ная суспензия печени кролика, зараженного пасгсреллезом (Р.ти1ккпс1а) 0 0

10%-ная суспензия печени кролика, зараженного вирусом миксомы 0 0

Сыворока кролика, вакцинированного против ВГБК 1:12800 1:512

Сыворотка кролика, больного ВГБК* 1:6400 1:256

Сыворотка здорового кролика 0 0

Сыворотка кролика, больного пасте-реллезом 0 0

Сыворотка кролика, больного миксо-матозом 0 0

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность предложенных методов на основе МКАт позволяет рекомендовать их как для обнаружения вирусного антигена, так и для ретроспективной диагностики ВГБК и определения иммунного статуса вакцинированных животных.

Следующим этапом работ было изучение полученных моноклональных антител в РЗГА с вирусным антигеном. Для этого асцитические препараты моноклональных антител титровали по отдельности и в составе двухкомпонептных смесей в РЗГА. В ходе экспериментов было установлено, что ни одно из полученных моноклональных антител не блокирует на вирионе сайта связывания эритроцитов. Так, например, антитела клона 2А2 при титре в ИФА, превышающем 1:106 в РЗГА (асцитические антитела), имели в РЗГА титр 1:4, а антитела клопа 1А11 (титр в ИФА 1:6400) вообще не выявлялись.

Завершающим этапом работ в этом направлении стали комиссионные опыты по испытанию приготовлешгых диагностических тборов, которые впоследствии были внедрены в производство. Клон гибридных клеток, использованный для их приготовления, был депонирован во Всесоюзной Коллекции Клеточных Культур, запатентован. Был приготовлен и утвержден комплект соответствующей пормативно-техничес-кой документации.

2.2.5.5Лисит гетерогенности вирусных июлятов по их антигенной структуре с использованием моиоклопальных антител

Следующим этапом работ с использованием моиоклопальных антител был анализ имевшихся в нашем распоряжешш «вариантов» вируса. Целью экспериментов было решение вопроса о формировании антигенных различий в УрбО у «дивергентных» препаратов вируса. Для этого проводили количественное выявление вируса в материалах различшлх изолятов вируса. Затем концентрации вируса выравнивали по копце1гграции препарата реферпс-штамма В-87 и в сранителыюм аспекте определяли тилры всех пятнадцати моиоклопальных антител с обоими препаратам!.

Установлено, что ни с одним из 28 (различные изоляты, различные пассажные уровни) испытанных препаратов вируса его тигр с каждым из 15 использовашплх моиоклопальных антител, выровненный с учетом абсолютной концентрации ашигена, чем на 78 % от титра с данным моноклопальным антителом музейного варианта вируса. Средние показатели антигенного родства но всем четырем антигенным регионам между каждым данным вирусным препаратом и музейным штаммом составляют от 90 до 110 %, что укладывается в погрешность измерения, которая составляет 33%. Ни одно из моиоклопальных антител, полученных на вирус В-87 второго пассажа, не имеют пошгжеиного сродства к любому из испытанных вариантов (минимальный показатель 94% при ширине доверительного интервала 133-78%). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что антигенных вариатхш вируса не было выявлено.

Особое внимание привлекает то, что в экспериментах была пара препаратов - исходный изолят 1988 года и вирус, прошедший в течение последующих 7 лет 18 серийных пассажей на кроликах. За это время между ними не возшясло никаких антигенных различий но всем 6 анализированным антигенным детерминантам в составе четырех регионов. 2.2.5.6 Изучение иммуногенпости вирусных полипептидов

Учитывая несомненное значение идентификации протективного вирусного антигена, а также данные, приведашые в разделе, посвященном собственно определению полипептидного состава (слишком большое количество выявленных полипептидов), была проведена серия экспериментов по определению иммуногешости полипептидов вируса.

При приготовлении препаратов вирусных полипептидов использовали широко известный методический подход, основанный па очистке соответствующих полипептидов с использованием препаративного ДСН-ПААГ электрофореза.

Кроликов предварительно проверяли па наличие антител к вирусу ГБК. В опыт брали только животных, у которых такие антитела отсутствовали по данным РЗГА и ИФА. Затем кроликам трехкратно с промежутком 2 недели вводами испытуемые препараты, первый раз в эмульсии с равным объемом полного адъюванта Фрейнда внутримышечно, второй раз - в эмульсии в неполном адыованте Фрейнда подкожно, третий раз - без адъюванта внутримышечно. Через две недели у кроликов отбирали кровь для приготовления сыворотки, после чего животных заражали (0.5 мл 10%-ной суспензии печени кролика, павшего от ВГБК) внутримышечно. За зараженными животными вели клинические наблюдения в течение 2 недель после заражения. Павших животных вскрывали и готовили пробы печени для выявления вируса в данном органе. Затем у выживших в течение 2 педаль животных повторно отбирали кровь для получения сыворотки, животных убивали и проводили патологоанатомическое вскрытие. Сыворотки титровали в ИФА, РЗГА и использовали для постановки иммуноб.тотинга с препаратом очищенного вируса, а так же для тестирования в_

иммуноэлектрогаюй микроскопии. Полученные результаты показали, что основным нротективным антигеном вируса ГБК является УрбО.

Иммунизация этим белком, даже существенно денатурированным, в сравнительно небольших дозах индуцирует у кроликов защиту от болезни и гибели. Вместе с тем она не предотвращает приживление вируса, поскольку после кшггрольного заражения имеет место сильно выраженная сероконверсия. Наиболее вероятно, что этот факг свидетельствует о том, что данный антиген является не единственным вирусным антигеном, обладающим нротективным потенциалом. Вместе с тем, данный эксперимент не доказывает однозначно этого, поскольку нельзя утверждать определенно, что при очистке данного антигена не были безвозвратно утеряны конформа-ционшлс иммунодоминантные антигенные детерминанты в результате денатурации при прогревании в присутствии ДСП.

Кроме УрбО иммупогенность была установлена для Ур54 и гомонолимерной формы Ур37. Антитела в сыворотках иммунизированных этими тремя очищенными полипепгидами кроликов не взаимодействовали с белками печени незараженного кролика и сывороточными белками кроликов.

Антитела из сывороток кроликов, иммунизированных смесью низкомолскуляр-ных полипептидов, распознавали соответствующие вирусные антигены в препаратах очищенного и разрушенного вируса, лизатах печени зараженного кролика, но не распознавали антигенов поверхности вирионов в иммуноэлектронлой микроскопии.

При изучении перекрестных реакций антител, полученных на тс или шиле полипептиды с другими шлипегггидами установлено, что три мажорных антигена (УрбО, Ур54 и Ур37) не имеют между собой антигенных перекрестов, т.е. Ур54 и Ур37 не являются продуктами деградации УрбО. В то же самое время антитела на УрбО и Ур54 взаимодействуют с низкомолекулярными полипепгидами, а антитела, полученные на комплекс этих полипептидов, распознают оба этих белка. Это свидетельствует о наличии в составе вирионов низкомолекулярных пептидов, представляющих собой по сути фрагменты высокомолекулярных белков, причиной чему может быть посттрансляционный протеолиз либо в ходе расщепления полипрогеина -предшественника, либо «незаконный» протеолиз зрелых форм структурных вирусных белков.

Последний аспект полученных данных, который следует отмстить - вопрос о том, какой из полинептидов ответственен за прикрепление к мембранам эритроците!!, т.е. является вирусным гемагглютишшом. Полученные данные указывают на то, что этим белком является УрбО, однако, сыворотки на Ур54 также проявляли активность в данной реакции, хотя она была выражена гораздо слабее. Вероятно, активность в РЗГА антител, полученных на Ур54, обусловлена не собственно блокированием сайта связывания с эритроцитами на молекуле данного белка, а созданием стерических препятствий для связывания данного центра с соответствующими молекулами на поверхности эритроцитов, т.е. явлением, описанным для различных вирусов как образование «шубы» из молекул антител на поверхности вирионов.

2.2.6 Таксономическое положение вируса ГБК

В настоящее время вирус ГБК официально отнесен к семейству калицивирусов вместе с близкородственным ему вирусом коричневой печени европейских зайцев и новым, еще не получившим своего официального названия вирусом «близкородственным иммуно-логически вирусу ГБК, но соверпгешо не патогенным»1. К этому же семейству отнесены вирус, именуемый калицивирусом кошек, вирусы группы Norwalk. В ходе работ с вирусом ГБК высказывались мнения о его принадлежности к шпсорна-, калици и парвовирусам.

Весьма ценную, хотя и косвенную, информацию о таксономии конкретного вируса и определения его филогенетического родства с другими вирусами дает изучение биологических свойств вируса. Из накопленных данных однозначно вытекает, что биологические свойства вируса связаны с деталями биохимических процессов, которые он реализует, а последние зависят от ферментативных и других биохимических свойств вируса. Эти свойства, в свою очередь, однозначно задаются геномом вируса и, обычно, весьма сходны у близкородственных филогенетически вирусов.

Учитывая полученные нами результаты и данные других авторов, накопленные за последние пять лет, в табл. 9 приведено сравните свойств вируса ГБК, конвенциальных калицивирусов, вирусов группы Norwalk. В этой таблице таксономические признаки общие для калицивирусов. асгравирусов и вируса ГБК располагаются в затемненных строках. Таких признаков 20 из 39 используемых. Названия таксономических признаков по которым вирус ГБК отличается и от калицивирусов и от асгравирусов выделены жирным шрифтом. Таких признаков 6 из оставшихся 19. Названия признаков по которым вирус ГБК сходен с калицивирусами и отличается от асгравирусов сформатированы по левой стороне первого столбца. Таких признаков 2 из 19. Признаки, объединяюпще вирус ГЪК с астравирусами и отличающие его от калицивирусов сформатированы по левой стороне столбца. Таких признаков 7.

Из представленных в таблице данных видно, что отнесение вируса ГБК к семейству калицивирусов далеко не бесспорно. Это следует из несхожести между конвенциальными калицивирусами и вирусами грушты ВГБК (вирус ГБК, вирус коричневой печени европейских зайцев, новый вирус) по большинству таксономических признаков. Это заключение согласуется с некоторыми мнениями в настоящее время осторожно звучащими в литературе.

Такое заключите согласуется с некоторыми мнениями в настоящее время осторожно звучащими в литературе. Например, Chasey из Центральной ветеринарной лаборатории (Surrey, UK) пишет: «ГБК вызывается калицивирусом антигешю ... отличающимся от других известных калицивирусов». Wirblich et al из Федерального исследовательского цешра (Tubingen, Germany) пишут: «Карта3 показывает близкое сходство между калицивирусами4 и пикорнавирусами в отношении числа и порядка расположения генов»5.

1 Цлтщ)) unu iij ja.üu)nt Bul и', ил un J pi l/.iiiii. ui j l/i hi ил'и i-т'.ш и/и ли н i nihil lüíilu'd ii.i i u/uliii i'u

rabbit hemorrhagic disease virus but nonpathogenic., опубликованной сотрудниками Института экспериментальной зоопрофилактики Capucci et al. декабре 1996 года в Journal of Viroljgy.

2 "RHD is caused by a cahcivirus, antigenically... distinct from other knovn calicmruses".

3Авторы имеют ввиду генетическую карту вируса.

4 Авторы подразумевают не кажщивирусы вообще, а вирусы ГБК и EBHS

5 "The тар reveals a remarkable similarity between calicmruses and picornaviruses with regard to the num-

ber and order of the genes".

Таблица 9 Сравнительная характеристика вируса ГБК и представителей семейств кашщи и астравирусов по таксономическим признакам, рекомендованным МКТВ

Признак или евоасггюо Вирус 1ЬА Калшщвирусы Астравирусы

Морфология Размер вириона 36-38 нм Характер поверхности вириона Выросты, характерная форма звезды.......... Симметрия и структур а к апсид а Икосаэдрическая 30-38 нм 28-30 нм 32 углубления Выросты, характерная характерной формы формазвезды Otvfmewt Oftiffts-tsisöt Отсутствует Отсутстауаг Икосаэдрическая Сферическая

Фшихо-хияшяеские свойства «Молекулярная масса» вириона 11-15МДа ШИйШ» ¡йфиФЯз. 3?г»Ш Коэффициент седиммтации внрионов 165-169 3 Устойчивость к различным рН Стабильны прирН отЗ до 9 Устойчивость к нагреванию Термостабильны Стабильность в присутствии Стабильны двухвалентных катионов Устойчивость к протеазам Устойчив ^¡шшшшж^ 15 МДа , 8МДа 1,33-1 170-187 S 155-165 S Не стабиль ны пр и pH Стаб иль ныприрНотЗ ниже 5 до 9 Термолабильны Термостабильны Чувствительны Стабильны Чувствительны Чувствительны MSlÄl^^eäitoB.............................

Спфуш11ура генома Та» РЕК Язае^иая |0£в дазда Ли иг^раг? Огеуттт ййяичие ачшйрон ' Ншша язомэд» щш Ил етсй -бу&вйойа м Открытые рамки считывания (ОЯЕ) 1: 011Р1 неструктурные и структурные белки ШС РНК 7,4-7 7 t-o Сдвщетлеящя ^яодещи^ная ;:Позн1ЯЕная Йвзвтйннгк ОнгугстуКй- Оиигтсшукж ¡й§»«<& субшкяяш; Идют* evfeaensasft 3: ORF 1-не структурные 3: ORFi-геликаза, белки, OREi-капсидный протеаза, NLS, ORF2-белок, OP.F3-основной полимераза, ORF3-протеин структурные белки Ütwcmyit Не аязтеи».

Таблица9 (окончание)

Признак или свойство

Вирус ГЕК

Кшящитфусы

Астравирусы

ИНУУКЯ-'

Белковый состав Структурные белки

liMTp-yKiymte

Специфическая активность белков

ЩШЖШШшШШЙШЙ:'

Капсидные: 60, 54,42, 37 кДа. Связанный с РНК15кДа. .

жмо» в^йддаетаеешаасй

Геликаза, протеаза, РНК-зависимая РНК-полимер гв а

■йШШ-геукя1_;

Капсвдный 60 кДа. Свяганный с РНК 15 кДа

4, Йи? SW3

дастт^иурнш: банков,

Геликаза, протеаза, РНК-зависимая РНК-полимераза, основной протеин.

Капсидные 3 с массами 29-39 к Да

кладам: «жяажи

НерТр^ХТурЩЫХ И .

«рукшяш; §«да>»

Геликаза, щ>отеаза, РНК-зависимая РНК-полимер аз а

Лшшды

Улзрлодм

ЖттШ&щт

1 •. . -

Биологические свойства

Г'.,.- .

Тип передачи

Вектор передачи

Патогенно стъ

Тканевой тр опюм Гист опатолопи

Фекально-оральная, пасс1шные переносчики, контактная, предметы, аэр оэ о л и, ппщ а, во д а Необязательный -мелкие грызуны Пшагмаетяв а с

когяе» Высокая

Печень, мозг, тимус.

Поражение внутренних органов в виде геморрагий_

:ir;ui

}>астр!вднд> Контактная, предметы, аэрозоли, пища, вода.

Отсутствует

^авароетрдвенаэстьЬз SMS«»

Высокая (ВВС) или низкая

Кожа (ВВС), эпителий слизистых - остальные Поражения кожи и слизистых - везикулы, омертвение_

Фекально-оральная, пассивные переносчики, контактная, пища, вода

Необязательный -меткие г^шуны Иквсемвггно в

¡'.рашржтрая еанйк:ыс>«

аЩиШЯШОШШШ:® Низкая

Эпителий желудочно-кишечного тракта Поражения ворсинок кишечного эпителия

Рис. 5. Сравнение структуры вирионов вируса ГБК с структурой вирионов другш мелких безоболочечных вирусов. А - вирус напиломы человека. Б-вирус гепатита А (2) В - полионирус

Г - вирус везикулярной экзантемы

Д - типичная фотография препарата очищенных вирионов вируса ГБК. Е - паракристалл вируса гепатита не А не Б Ж - фрагмент паракристалла, образуемого вирусом ГБК. 3 - вирус Norvalk. В - парвовирус Н-1.

Все фотографии даны в одном и том же масштабе - с увеличением примерно в 30000С раз. Фотографии Д и Ж получены нами, остальные скопированы из книги Virology под редакцией д-ра Fields.

D другой своей работе, посвященной изучению генома вируса EBHS, эти авторы ришли к заключению: «Организация этого генома близка к ВГБК, но не к организации еномов других калицивируеов»1. Georg MeyTes с коллегами из Федерального исследова-ельского центра (Tubingen, Germany) в своей статье сообп;ают такие данные го структурой гомологии нуклеотидных последовательностей одного из самых консерватившлх ре-ионов генома вируса ГБК. Гомология с относящимися к семейству калицивируеов кали-рвирусом кошек, вирусом Norwalk и вирусом гепатита Е составляет 56, 30 и 19%, а с редставитслями семейства пикорнавирусов - вирусами гепатит А, ящура и энцефаломио-ардита - 27, 25 и 21%.

Проведенный нами с использованием опубликованных дагшых секвснирования ДНК вируса ГБК анализ нуклеотидной последовательности так же привел к заключению том, что то структуре организации генома и стратегии его экспрессии этот вирус гораздо лиже к пикорпавирусам, чем к калици- и астравирусам.

Строеше капсида вируса ГБК имеет черты (см. рис. 5), отличаюпще его от иредста-ителей, ио крайней мере - типичных представителей, калицивируеов: ни при каюк усло-иях кошрастировашм и уровнях увеличения/разрешения па нативных капсидах вируса ам ие удавалось выявить структур, напоминающих калике.

Только в случае использования жестких денатурирующих процедур на их поверхно-ги возникали углубления, которые, однако, по форме существенно отличались от каликса. I то же время строеше капсида вируса ГБК совершенно не сходно со строением пикорпа-ирусных кансидов. В наибольшей creneini структура поверхности капецдов вируса ГБК ходна с астравирусами и вирусами группы Norwalk, но размеры вирионов вируса ГБК начительно больше, чем указанных вирусов.

Само по себе группироватше в составе семейства кал!щивирусов таких существенно азличаклцихся групп как калицивирусы (конвенциальные), вирусы группы Norwalk, ка-ицивирус кошек, вирусы группы ВГБК, основываясь на тех же дашплх. по нашему мне-:ию не оправдано. Даже разделение семейства калицивируеов на рода (такие предложе-:ия таюке высказывались), видимо ие сделает эту группу вирусов стройно и логично орга-изованпой.

"This genome organization is shared by RHD V but not by other cahcivmtses ".

3. Выводы

1. Вирус геморрагической болезни кроликов представляет собой безоболочечный вирус диаметром 36 нм с плавучей плотностью вирионов 1,367 г/см3 в хлориде цезия, константой ссдимстащш 162 Б, массой 13 МДа, не содержанрш в своем составе лишодов и углеводов.

2. Вирус геморрагической болезни кроликов устойчив к действию липидораствори-тслей, рН в диапазоне 3-9, замораживагшю-оттаивапию, повышенным температурам: при 65°С - сохраняет инфекционную и гемагглютинирующую активность в те-чение 3 часов, при 37°С - не менее 2 недель. При 20°С - ею гемагглкггинирующая и инфекционная активность сохраняется неизменной в течение не менее, чем 4 педаль, температурах шоке 0°С - не менее, чем 6 месяцев.

3. Вирус чувствителен к действию известных дезинфектантов (щелочь, хлорамин) и новому дезинфектапту Теотрогашу, который может быть использован для дезинфекции продуктов кролиководства и помещений в присутствии животных.

4. Вирус геморрагической болезни кроликов при нейтральных, слабощелочных и слабокислых значениях рН агглютинирует эритроциты человека вне зависимости от группы крови, а также эритроциты барана, курицы, утки и. в меньшей степени -эритроциты КРС, свиньи и собаки. Гемагглютипирующая активность не связана непосредственно с инфекционной - образцы вируса, утратившие при хранении гемагглютинирующую активность, могут сохранить инфекционность.

5. Гемагглютинином вируса геморрагической болезни кроликов является капсидный белок УрбО. Гемагтлютшшн устойчив к прогреванию (утрачивает активность полностью только при инкубации в течение 3 часов 1гри 65°С) и протеолигическим ферментам (активность не изменяется при инкубации с трипсином в течение 18 часов при его концентрациях до 4000 Ед./мл при 37°С.).

6. Взаимодействие вируса ГБК с эритроцитами человека группы О характеризуется следующими параметрами:

• соотношение физических и гемашпотшшрующих единиц вируса составляет около 4x108 вирионов на 1 ГАЕ (рН 6.8);

• один эритроцит может связать до 4x105 вирионов;

• сорбция вируса на эритроцитах эффективно происходит при рН 5.6-

7.6;

• элюция вируса, сорбированного на эритроцитах происходит при рН>7.8:

• константа диссоциации комплекса вирус эритроцит при рН 7.2 составляет 3,29x10"6+1,51 х 10"6,

• вирус ГБК можно выявить в РГА, если его концентрация в образце

составляет не менее 400 млн вирионов на 1 мл;

• сорбция вируса на эритроцитах происходит за 1-2 минуты при перемешивании смеси вирус - эритроциты;

• элюция 1!пруса с эритроцитов при рН выше 8 происходит за 4-8 минут;

• после элюирования сорбированного вируса с эритроцитов рецептор, расположенный па их поверхности, остается интактным и эритроциты могут адсорбировать на себе новые порции вируса.

Вирус геморрагической болезни кроликов обладает морфологическим полиморфизмом, выражающимся в формировании капсидов шеста форм.

• Первая - «стандартный» вирион - икосаэдрическая частищ с палочкообразными выростами на поверхности.

• Вторая, отличающаяся при просмотре под электронным микроскопом от

«стандартного» вириона наличием олектрошгоплошого ободка, окружающего сердцевину, включает нуклеиновую кислоту в меньшем, чем стандартный вирион количестве.

• Третья - «пустая» частшщ - вирусный капсид, не содержащий генетического материала.

• Четвертая - «голая» частшщ, отличающаяся от стандартной отсутствием

выростов на поверхности.

• Пятая - «вирусный кор» - обособившийся в результате «разламывания»

капсида - сердцевина «стандартного» вириона.

• Шестая - «малая форма» - фрагменты капсида - агрегат капсомеров -

частица диаметром около 20 нм с характерными выростами на поверхности.

Морфологический полиморфизм вируса геморрагической болезни кроликов обусловливает наличие полиморфизма вирионов по плавучей плотности и константе седиментации, но не по физико-химическим свойствам поверхности вирионов, которые у основных форм вирионов не отличаются. При фракционировании вируса при зонально-скоростном и изошшшческом цешрифугировании он разделяется на две фракции, первая из которых представлена стандартными вирионами, вторая - пустым! капсидами. Эти фракции перекрываются растянутой зоной, в которой локализуются вириопы, содержащие нуклеиновую кислоту в метшем, чем полный размер генома, количестве.

В состав вирионов вируса геморрагической болезни кроликов входит 5 полипептидов с молекулярными массами 60, 54,42, 37.5 и 16 кДа. Эти полипептиды взаимодействуют с антителами из сывороток реконвалесценгпых кроликов, и антигенно неродствешол друг другу - иммунизация их очищенными препаратами серонегативпых кроликов вызывает у последних синтез антител, которые взаимодействуют с соответствующим нолипептидом и не взаимодействуют с остальными, причем Ур54, Ур37 и УрбО экспонированы на поверхности вирионов.

). Вирус геморрагической болезни кроликов проникает в клетки различшлх органов заражешплх животных, репродуцируется в цитоплазме клеток печени, головного мозга, тимуса и легких. При репродукции образует паракристаллические и околомембрашпле цитоплазматические скопления. Выход вирусного потомства составляет до 14000 вирионов на одну зараженную клетку. Специфический механизм экзоцитоза и специфическое цитопатогенное действие отсутствуют, причем основными изменашямн в зараженных клетках являются гиперплазия аппарата Гольджи и митохондрий, а также пикноз клетки.

11. Заражение вирусом геморрагической болезни кроликов штамм Воронеж-87 взрослых серонегативш.гх животных вызывает у них болезнь, характеризующуюся высокой - около 100% летальностью (гибель большинства зараженных животных наступает через 18-72 часа), основным патогенетическим механизмом которой является тромбогеморрагический синдром, приводящий к повышению фибршю-литической активности сыворотки крови, чго является причиной фибринолиза микрослоя фибрина на стенках кровеносных сосудов. Последний приводит к увеличению их проницаемости, выражающейся в образовании кровоизлияний различиях типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной смерти при острой форме болезни является остановка дыхания вследствие повреждения дыхательного центра, вызванного субдуральпыми кровоизлияниями в продолговатом мозге, которые представляют собой натогномонический признак данной формы ВГБК, регистрируемый у всех животных, иогибпшх от острой формы болезни. Профилактическое или лечебное введение гепарина, предотвращающего тромбообразованис в сосудах, смягчает течение вирусной геморрагической болезни и значительное - до трех-четырех раз - снижение смертности.

12. Установлено, что УрбО является протективным антигеном вируса геморрагической болезни кроликов. Иммунизация животных очищенным УрбО вызывает иммуно-логический ответ, характеризующийся образованием вируснейтрализующих англ-тел и актива!щей атителонезависимых эффекторов иммунитета, которые играют основную роль в защите животных в поздние сроки после иммунизации. Введение животным экзогенных вирусспецифических антител в малых количествах может вызывать эффект антителозависимого усиления инфекции.

13. С использованием приготовленной панели моноклональных антител к УрбО:

• разработаны диагностические тест - системы для выявления вируса и

противовирусных антител, характеризующиеся более высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с ранее применяемыми;

• показано, что антигенная структура данного белка характеризуется

наличием не менее, чем шести антигенных детерминант в составе трех антигенных регионов;

• установлена антигешшя гомогенность изолягов вируса геморрагической болезни кроликов, циркулировавших в России в 1986 - 1996 годах, и их антигенное тождество с эталонным штаммом Воронеж-87, используемым для приготовления вакцин против этой болезни.

I. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

. Авторское свидетельство № 294945. Штамм Воронсж-87 вируса геморрагической болезни кроликов. 1988 г. Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Балабанов В.А., Карасева ЕМ., Князев В.П., Карпов Г.М., Власов H.A., Малахова М.С., Новикова М.Б.

'.. Власов НА. Вирус геморрагической болезни кроликов. Материалы международной научной конференции «Общая эпизоотология, иммунологические, экологические и методологические проблемы». Харьков. 1995 г., с.322-325.

!. Власов H.A. Геморрагическая болезнь кроликов. Ветеринарная газета № 3,1994 г. с. 2.

I. Власов H.A.. Бакулов H.A.. Шевченко A.A., Васильев ДА. Учебное пособие "Геморрагическая болезнь кроликов". Акад. вег. наук. Ульяновск 1998 г., 72 с.

>. Власов H.A.. Зубаиров М.М., Васильев ДА., Козин А.И. Учебное пособие "Антибиотики и химиопрепараты для борьбы с инфекционными болезнями животных". Акад. вет. наук. Ульяновск 1997 г., 66 с.

|. Макаров В.В., Вишняков И.Ф., Власов H.A., Малахова М.С. Вирус геморрагической болезни кроликов: физические и структурные характеристики. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1992 г., №4, с. 49-52.

Малахова М.С., Власов НА. Вишняков И.Ф., Макарон В.В. Вирус геморрагической болезни кроликов. Тез. Докл. Науч. конф. "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии". Покров, 1990 г., с. 79-81.

i. Малоголовкин С. А., Власов H.A., Черных A.A. Анализ мажорного белка вируса геморрагической болезни кроликов с помощью моноклональных антител в конкурентном ИФА. Материалы Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйствешгых животных». Москва, 1996 г., с. 14-15.

). Малоголовкин С.А., Черных A.A., Власов НА. Моноклональные антитела к вирусу геморрагической болезни кроликов. Доклады PACXII, 1997 г., №3, с.35-38.

0. Малоголовкин CA., Черных A.A., Власов H.A. Моноклональные антитела к вирусу геморрагической болезни кроликов. Тезисы научной конференции «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных живолшлх и птиц. Краснодар. 1996 г., с. 73.

1. Малоголовкин CA., Черных A.A., Власов H.A., Применение моноклональных антител для диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов. Тезисы докладов тучной конферешрш «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных». Владимир. 1995 т.. с.71.

2. Методические рекомендации по диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов методом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Черных A.A., Малоголовкин С.А., Власов H.A., Покров, 1992,18 с.

3. Отчет о НИР «Изыскать подходы к созданию рекомбинангной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов». Власов H.A., Власова H.H., Дмигренко В.В., Сенечкина Е.К , Черных Н.В., Черных A.A. Покров 1995 г. 130 с.

14. Отчет о ПИР «Разработать средства диагностики и индикации возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов на основе моноклональных антител». Ба-лышева В.И., Власов H.A., Власова H.H., Малоголовкин С.А., Черных A.A. Покров 1995 г., 80 с.

15. Отчет о НИР «Разработка средств и методов диагностики, специфической профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов». Аверин С.А., Архипов Н.И., Балабанов В.А., БалышеваВ.И., Бесхлебнов В.А., Бузун А.И., Витина С.А., Власова Т.И., Власов H.A. и др. Покров. 1988 г. 276 с.

16. Патент № 2007452 Штамм гибридных культивируемых клеток Mus Musculus -продуцент' моноклональных ai потел, используемых для диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов. 1992 г. Черных A.A., Малоголовкин С.А., Власов H.A.

17. Положительное решение о выдаче патента на новый дезинфсктант для ветеринарии Теотропин (№ 97104843/13 с приоритетом от 25.03. 1997 г.) Зубаиров М.М., Киселев A.B., Власов H.A., Вишняков И.Ф. Селиверстов В.В., Гаврилов В.А., Ког-ляров В.М., Числов Ю.В., Стрижаков A.A., Кузнецов А.И., Миколайчук C.B., Ру-добельский Э.В., Срыбный Н.И.

18. Положительное решаше о выдаче патента па новый химиотерапевтический препарат для профилактики и лечения бактериозов, вызванных РНК-содержащими вирусами и бактериальных осложнений после вирусных заболеваний Абактан Р (№ 97104338/13 с приоритетом от 20.03.97). Зубаиров М.М., Киселев A.B., Власов H.A.. Вишняков И.Ф. Селиверстов В.В., Гаврилов В.А., Котляров В.М., Числов Ю.В., Стрижаков A.A., Чупахин O.II., Чарушин В Н., Русинов В.Л., Мосип В.М.

19. Положительное решение о выдаче патента на новый химиотерапевтический препарат для профилактики и лечения бактериозов, вызванных РНК-содержащими вирусами и бактериальных осложнений после вирусных заболеваний Абактан Д (№ 97104650/13 с приоритетом от 25.03.1997 г.). Зубаиров М.М., Киселев A.B., Власов H.A., Вишняков И.Ф. Селиверстов В В., Гаврилов В.А., Котляров В.М., Числов Ю.В., Стрижаков A.A., Чупахин О.Н., Чарушин В Н., Русинов В.Л., Хохлов ПС.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Власов, Николай Анатольевич, Покров

И '>$9-3/91-

экз. №

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

Власов Николай Анатольевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов

03.00.06. - Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор ветеринарных наук Шевченко А. А.

г. Покров, 1998 г.

1. Аннотация в

2. Список сокращений 8

3. Введение ю

3.1. Актуальность темы 10

3.2. Цель и задачи исследования 11

3.3. Научная новизна работы 11

3.4. Практическая значимость работы 14

3.5. Основные положения, выносимые на защиту 15

3.6. Апробация результатов 16

3.7. Публикация результатов исследований 16

3.8. Внедрение результатов исследований 17

3.9. Благодарности 17

4. Обзор литературы 19

4.1. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов и ее этиологический агент 19

4.1,1. История выявления ВГБК, начальная стадия

изучения болезни и вируса 20 *т. i.^i л Kjpui/vmnu средств диагнсстики и

профилактики болезни 23

4.1.3. Адаптация вируса к культурам клеток 24

4.1.4. Разработка и испытания вакцин 25

4.1.5. Изучение антигенности вируса и разработка диагностических реакций 27

4.2. Распространение вирусной геморрагической болезни кроликов в настоящее время 28

4.2.1. Пути передачи вируса 29

4.2.2. Возможность формирования стационарных эпизоотических очагов в природе за счет проникновения вируса ГБК в популяции зайцев и кроликов 34

4.3. Свойства вируса ГБК 37

4.3.1. Структура вириона 37

4.3.2. Данные ультраструктурного анализа по вопросам изучения цитопатического действия вируса и поиска клеток-мишеней для вирусной репродукции in vitro 38

4.3.3. Физико-химические характеристики вируса 38

4.3.4. Нуклеиновая кислота 39

4.3.5. Вирусные белки 40

4.3.6. Таксономия вируса 42

4.4. Характеристика болезни, вызываемой вирусом ГБК 44

4.4.1. Клинические признаки болезни 45

4.4.2. Патологоанатомическая картина 46

4.4.3. Цитопатоморфологические изменения 48

4.4.4. Сведения о механизмах патогенеза 49

4.5. Краткий сравнительный обзор молекулярной биологии мелких безоболочечных вирусов 53

4.5.1. Рагуоутйае (СЪогйорагуоутпае) 5 5

4.5.2. Ркогпаут4ае 58

4.5.3. СаИстпйае 61

4.5.4. А$ШуМ(1ае 64

4.5.5. агсоут(1ае 65

4.5.6. Неклассифицированные мелкие безоболочечные вирусы 65

4.6. Заключение по обзору литературы 66

5. Результаты собственных исследований 69

5.1. Материалы и методы 69

5.1.1. Материалы 69

5.1.1.1. Животные и вирусы 69

5.1.1.2. Питательные среды и растворы 70

5.1.1.3. Сыворотки 71

5.1.1.4. Реактивы 71

5.1.1.5. Оборудование 73

5.1.2. Методы 74

5.1.2.1. Физико-химические методы для изучения свойств, фракционирования и очистки вируса 74

5.1.2.2. Методы изучения белков 76

5.1.2.3. Методы изучения ультраструктуры клеток и вирусов 78

5.1.2.4. Иммунологические методы 79

5.1.2.5. Методы гибридомной технологии 83

5.1.2.6. Методы клинического и патологоанатомического анализа 87

5.1.2.7. Методы статистической обработки результатов и математического моделирования 87

5.2. Результаты 88

5.2.1. Характеристика вирусной геморрагической болезни

кроликов 88

5.2.1.1. Изучение возможности опосредованной передачи вируса 88

5.2.1.2. Клинические признаки и патогенез болезни 92

5.2.1.3. Изменения в тканях зараженных животных на ультраструктурном уровне 101

5.2.1.4. Изучение возможности модификации течения ГБК113

5.2.2. Структура и свойства вирионов и гетерогенность вирусной популяции по этим признакам 121

5.2.3. Физико-химические свойства вируса геморрагической болезни кроликов и его чувствительность к факторам окружающей среды 147

5.2.3.1. Чувствительность вируса к физическим, химическим, биологическим факторам и средствам дезинфекции 147

5.2.3.2. Изопикническое центрифугирование и определение плавучей плотности вируса 157

5.2.3.3. Зонально-скоростное центрифугирование и определение константы седиментации вируса 159

5.2.3.4. Гельпроникающая хроматография и определение «молекулярной массы» вируса 168

5.2.4. Биологические свойства вируса ГБК 171 5.2.4.1. Адаптация вируса к репродукции in vitro 171 5,7 4 J Wh""'"" t« гемагглютинин и параметры реакции

гемагглютинации, вызываемой вирусом ГБК 180

5.2.5. Полипептидный состав и антигенность вируса 196

5.2.5.1. Разработка методов очистки вируса 196

5.2.5.2. Полипептидный состав вируса ГБК 215

5.2.5.3. Получение моноклональных антител

к вирусу ГБК 222

5.2.5.4. Усовершенствование методов серологической диагностики на основе моноклональных антител 231

5.2.5.5. Анализ гетерогенности вирусных изолятов по их антигенной структуре с использованием моноклональных антител 233

5.2.5.4. Изучение антигенности вирусных полипептидов 237

6. Обсуждение 242

6.1. Обсуждение данных по изучению клинической картины, патологоанатомических изменений и патогенеза ГБК 242

6.2. Обсуждение данных по изучению ультраструктуры вируса ГБК и его морфологической гетерогенности 252

6.3. Обсуждение данных по изучению физико-химических свойств вируса ГБК 269

6.4. Обсуждение данных по изучению молекулярно-биоло-гических характеристик вируса ГБК 274

6.5. Обсуждение данных по изучению антигенной структуры вируса ГБК и усовершенствованию

средств диагностики болезни 286

6.6. Обсуждение данных по таксономической

принадлежности вируса вируса ГБК 291

7. Выводы 298

8. Практические предложения 302

9. Список цитированной литературы зоз

Приложения в отдельном томе.

1. Аннотация

В диссертационной работе представлены материалы изучения новой опасной вирусной болезни - Вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК) и ее возбудителя.

В результате проведенных исследований изучены основные механизмы патогенеза болезни и определены перспективные пути модификации ее течения. Изучены основные клинические и патологоанатомические признаки болезни, установлен патогномонический признак, по которому может проводиться постмортальная диагностика. Определены пути распространения вируса в организме, органы и ткани, в которых он размножается, выявлены внутриклеточные фабрики сборки вирионов, изучены их формы, характер цитопатогенного действия вируса. Изучена ультраструктура вирионов и их морфологический полиморфизм. Установлены такие физико-химические характеристики вируса, как плавучая плотность, константа седиментации, размеры вирионов, их хроматографические характеристики, профиль распределения в фазовых системах полимеров. Определена чувствительность инфекционной и гемагглютинирующей активности к ряду физических и химических факторов внешней среды. Изучена сохраняемость вируса в различных средах, определена возможность фекально-оральной передачи вируса. Изучен химический состав вирионов, определен их полипептидный состав, анти-генность, выявлен и охарактеризован вирусный протективный антиген, характеристики присущей вирусу гемагглютинирующей активности и определены условия и факторы, влияющие на ее экспрессию, степень антигенной гетерогенности вирусных популяций, антигенная стабильность имеющихся штаммов.

На основе полученных данных разработан ряд методик, которые могут быть использованы при работе с этим и другими безоболочечными вирусами. В том числе - методы очистки вируса, выделения и очистки вирусных полипептидов.

В ходе выполнения работы созданы новые биологические (специфичные к вирусу ГБК моноклональные антитела), химиотерпевтические препараты (препараты Абактан, Абактан Р, Абактан Д) и методы их применения (применение Абактана Р, Абактана Д для лечения вирусных и бактериаль-

ных болезней, методы применения Теотропина для дезинфекции). Получены новые линии гибридных клеток (линии мышиных гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к вирусу ГБК), разработаны диагностические тест-системы (для выявления антигенов вируса ГБК в пробах патологического материала и объектах санитарного надзора и для выявления противовирусных антител в сыворотках крови иммунизированных и реконвалесцент-ных животных), которые успешно прошли или с положительным результатом проходят испытания на практике, разработаны соответствующие комплекты НТД, проведено патентование части результатов.

Применение разработанных препаратов, тест систем и методов позволило получить положительный эффект, выражающийся в совершенствовании средств диагностики ВГБК, повышении сохранности поголовья сельскохозяйственных животных ряда видов при различных бактериальных и вирусных болезнях.

Полученные результаты подвергнуты всестороннему анализу, обсуждению, сопоставлению с имеющимися в мировой научной литературе данными, сделаны обоснованные полученными результатами выводы, отражающие основное содержание работы, ее теоретическую и практическую значимость.

2. Список сокращений

АВТ8 2, 2'-азиноди-(3-этилбензтиазолинсульфоновой кислоты) ди-

аммониевая соль

АЗКЦ антителозависимая клеточноопос редов анная цитотоксич-

ность

БСА бычий сывороточный альбумин

В87 название штамма вируса геморрагической болезни кроликов

(Воронеж -87)

ВАЬВ/с название линии мышей

ВГБК вирусная геморрагической болезни кроликов

ГБК геморрагическая болезнь кроликов

ДАС-ПФА иммуноферментный анализ в режиме двойного антительного

сэндвича

ДСН додецилсульфат натрия

ДСН-ПААГ пластинчатый полиакриламидный гель для проведения элек-

трофореза по Ьаетш1у, содержащий додецилсульфат натрия

ЕНВ8 синдром коричневой печени европейских зайцев

ЗФР забуференный (0.01М рН 7.2-7.4) фосфатами физиологиче-

ский раствор

ИФА иммуноферментный анализ

КЗЦ комплементзависимый цитолиз

ЛБ среда Лурия-Бертрана

МКАт моноклональное антитело

МПА мясопептонный агар

МПБ мясопептонный бульон

НЦЛ листы нитроцеллюлозы

ПААГ полиакриламидный гель

ПЭГ полиэтиленгликоль

ПЦР полимеразная цепная реакция

РВС рассеянное внутрисосудистое свертывание

РГА реакция гемагглютинации

РДП реакция диффузионной преципитации (Оухтерлони)

РЗГА реакция задержки гемагглютинации

РТГА реакция торможения гемагглютинации

СТЕ буферный раствор, содержащий 20 мМ Трис, рН 8.0 и 1 мМ

ЭДТА

ТАБ трис-ацетатный буферный раствор 0.1 М, рН 8.6 (если в тек-

сте не отмечены иные значения молярности и рН)

ТКФБР фосфатный буферный раствор (Ка-Ма), содержащий 0.05%

Т\уееп-20 и 2% казеина

Трис-НС1 трисгидроксиметиламинометана гидрохлорид

ТФБР фосфатный буферный раствор (Ыа-Ыа), содержащий 0.05%

Т\\'ееп-20

ФБР 0.01 М фосфатный буферный раствор (Ка-Ыа), рН 7.0 (если

по тексту не отмечено иное значение рН) ФВК фосфорновольфрамовокислый калий в виде 2% раствора, рН

6.2 (если в тексте не указаны другие значения рН и концентрации)

ФСБ фосфатно-содевой буферный раствор (0.1 М Ка-Иа-фосфат,

рН7.0, содержащий 0.15 М ШС1 ЦТЛ цитотоксические Т-лимфоциты

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ЭДТК этилендиаминтетрауксусная кислота

3. Введение

3.1 Актуальность темы

В 1984 году в Китае была обнаружена новая болезнь кроликов, которая по своим характеристикам может быть отнесена к категории особо опасных инфекционных болезней, т.е. к болезням того типа, которые, если не применяются эффективные методы борьбы с ними, могут вызвать тотальное уничтожение поголовья чувствительных животных.

Впервые болезнь выявил и описал Liu с коллегами в 1984 году, когда она возникла среди импортированных из Германии ангорских кроликов. В последующие годы вспышки болезни с подобными клиническими признаками и патоморфологией были описаны в ряде стран Европы и Северной Америки. Эта болезнь давала огромные потери во всех странах, где она имела место. В нашей стране первая вспышка болезни была зарегистрирована в

1986 году в пограничном с Китаем районе Хабаровского края. Диагноз поставлен не был, кроликов из заболевшего стада убили, а шкурки отправили на фетровую фабрику Московской области. В результате этого в центре страны возник вторичный очаг болезни. Из него болезнь распространилась к

1987 году по 20 областям и краям России, а затем практически вся территория СССР стала неблагополучной.

Даже в начале изучения болезни и характеристик ее возбудителя данные, касающиеся клинических признаков, патоморфологии и других деталей болезни, как и данные по ультраструктуре внеклеточных вирионов, не имели каких-либо серьезных противоречий. Это приводит к заключению о том, что во всех странах, упомянутых выше, болезнь вызывалась одним и тем же вирусом. В противоположность этому, данные, касающиеся биохимии вируса, первоначально были очень противоречивы. Так, Deng с коллегами остановились на выводе, что этиологический агент этой болезни принадлежит к кали-цивирусам. С другой стороны, немецкие ученые Gregg & House заключили, что он является парвовирусом.

В связи с возникновением нового патогена стало необходимым проведение его комплексного изучения клиническими, патологоанатомическими, вирусологическими, иммунохимическими, биохимическими и другими методами. Необходимо было изучить патогенез и иммуногенез болезни, устано-

вить физико-химические характеристики и биохимический состав вируса, решить ряд других вопросов, в том числе о таксономическом положении и происхождении вируса.

Этим обусловлен выбор цели работы.

3.2. Цель и задачи исследований

Целью работы было изучить физико-химические, антигенные свойства и морфологию вируса ГБК, патогенез вызываемой им болезни. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи. 1 .Определить константу седиментации, плавучую плотность, полипептидный состав, массу вирионов.

2. Изучить чувствительность вируса к физическим и химическим воздействиям.

3. Изучить гемагглютинирующую активность вируса.

4. Изучить ультраструктуру вирионов и степень гетерогенности вирусных популяций по этому параметру, их физико-химический полиморфизм.

5. Изучить полипептидный состав вирионов, антигенность структурных белков.

6. Изучить параметры репродукции вируса в зараженных клетках и вирусное цитопатическое действие (ЦПД).

7. Изучить клиническую и патологоанатомическую картину болезни, основные патогенетические факторы и возможности модификации течения болезни с использованием химиотерапевтических препаратов и других лекарственных средств.

8. Выявить и охарактеризовать вирусный протективный антиген, обладающие протективным потенциалом эффекторы иммунитета, действующие при этой болезни.

9. Изучить антигенную структуру вирусного протективного антигена и на этой основе разработать улучшенные диагностические тест-системы на основе моноклональных антител.

3.3. Научная новизна работы

Научная новизна работы заключается в получении следующего ряда новых (выделены курсивом) или уточненных в приложении к изучавшемуся штамму В87 данных о вирусе ГБК, его циркуляции среди животных и вызы-

ваемым им патологическом процессе, иммунологическом ответе на данный патоген.

Изучены физико-химические свойства вируса. Определены константа седиментации, плавучая плотность вирионов, стоксов радиус вириона, параметры растворгшости в растворах солей и полимеров.

Изучена устойчивость к денатурирующим агентам и физическим факторам. Нативные вирионы не чувствительны к действию растворителей липидов, жесткой протеолитической обработке, стабильно сохраняют инфекционность и гемагглютинируюгцую активность в диапазоне рН от 3 до 9. Вирус ГБК обладает высокой термостабильностью (сохраняет инфекционность, гемагглютинируюъцую активность, форму вириона и его полипептидный состав в ходе инкубации при 56°С в течение не менее чем 30 минут), термостабильность возрастает в средах, обогащенных белками и полисахаридами, и падает в средах, обогащенных одновалентными ионами. При прогревании до 56°С и выше происходит изменение конформации поверхностного белка вирионов, врезультате чего он становится чувствителен к трипсиновому протеолизу. Вирус ГБК чувствителен к щелочам и хлорсодержащим дезинфектантам, новому дезинфектанту для ветеринарных целей - Теотропину. Вирус в процессе длительного хранения при низких температурах в жидкой среде или лиофильно высушенном состоянии может утратить гемагглютинируюгцую активность, сохранив при этом инфекционность.

Изучена морфология вирионов и их морфологический полиморфизм. Установлено, что внеклеточные частицы вируса ГБК могут представлять собой б морфологических форм. Первая - «стандартный» вирион - икосаэдрическая частица диаметром 36 нм с электроннопрозрачной сердцевиной, имеющая палочкообразные выросты на поверхности, содержащая полный вирусный геном. Вторая - частица с неполным геномом, отличающаяся от «стандартного» вириона наличием электронноплотного ободка, окружающего сердцевину. Третья - «пустая» частица - вирусный капсид, не содержащий генетического материала, отличающаяся от «стандартного» вириона электронноплотной сердцевиной. Четвертая - «голая» частица, от-

личающаяся от стандартной отсутствием выростов на поверхности. Пятая - «вирусный кор» - обособившийся в резул�

Информация о работе

Власов, Николай Анатольевич
доктора биологических наук
Покров, 1998
ВАК 03.00.06

Диссертация

Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы