Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и использование моноклональных антител к вирусу катаральной лихорадки овец

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение и использование моноклональных антител к вирусу катаральной лихорадки овец"

РГ8 Ой

, 3 \ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

АСПИРАНТ

СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич

УДК 619:616.988.7:578.833.21-085.371

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ ОВЕЦ

03.00.06. — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

Работа выполнена во Всероссийском Научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАСХН И. Ф. ВИШНЯКОВ

Ведущее учреждение: Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии (ВИЗВ), г. Москва.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор ветеринарных наук Н. А. ЛАГУТКИН,

кандидат биологических наук Л. А. ЩЕТНИКОВА.

Защита диссертации состоится 9 июня 1994 г. в 13 00 час. на заседании специализированного совета Д-120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120' г. Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ^Ь » ^¿гС^- 19-^^ г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Г. П. ФЕДОРОВ

■ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'iliSSM^opl.ii-IS'iii

Распространение катаральной лихорадки овец КШ до 1940 года ограничивалось Африканским континептогх К настозпзгцу Ереиеня ареал заболевания значительно рзсяиролся. Болезнь, о^назщы гсзнгашуз в регионе, приобретает стационарный характер я в нзстжп^е время стационарные очага Оолезю: еуагствуяг на scex кштааентах. В РФ КДо зарегистрирована з республике Бурятия. Наи&ш>гая угроза заноса возбудителя КЛО в вго-западяув часть № существует со стороны Турции, Ирана и ре-спуб.тлк Закакгазьп - Ар;.'.ЭЕ"1, Грузии и Азербайджана, на границах е которыми в РФ раепохаггется зона развитого сЕиеполстса.

Вирус КЛО по cEOffii биоязгячесгаш свойствам ¡мэет высокую степень генетического и антигенного родства с вярусамя эпизоотической геюррапгчеексй бохазаи оленей (ЭГШ) я болезни Шараш (БИ). йгоус КДО вызывает ■ ярегшусгственнэ заболевгзяе свеп, вирусы ЗГБО я Бй - забодесзакя о-гэней и KPG. соотаететаенЕо (Inaba, 1975). Одна5® антитела, скщфгаш к вирусу КШ, достаточно часто вша-жшг г КРС и слеша, а здтитеха, мгепЕфзчша к.вяррсац ЭГВО п El, обнарулазает при экспэришнтажюм зарааквы у овед (Luedke, 1970,1984, Carpfcell, 1335). Appleton and Lstchsarth (1SS3) показал!,!, что ц?дзу Еирусазли ЯЯЭ, ЗГВО а богьзаа Шадззш вшется ан-ткгекта родство, поэтому пщязжятеяьше результаты ■опредегеаия антител к вирусаа KJK), ЭГШ я Ш лзвбшл конвешшваяздаы еершогя-жяа методам, за искшавняеи резкаия неатрагазацот» не ш®1 едузать однозначным астазазгельствсм гв&агзро&заяоста овец таезгао вирусом КЛО, да я© вирусом ЗГБО ига ифуссы Щ. Зикишягельной трудностью точной ящеэтифякации вируса является, с одной егереяы,

существование 24- х серотшов вируса FJIO (Schultz, Gried-эг , 1987), что крайне усложняет проведение и интерпретацию РН, а, с друтой стороны, практически полное сходство вирусов KJIO, ЭГЕ-0 и БИ по физико-химическим свойствам ( Inaba, Í975) исключает возможность их дифференциации физика-химическими методами, в том числе методами электронной микроскопии.

Для лабораторной диагностики КЛО, ЭГЕО и БИ разработаны РН, РДП, РСК , ¡'ФА и ТФ ИФА основе полиспецифических антител (Howell. 1966: Metealf, 1970; P. И. Ыетелева, 1971; X Я Олейник, 1972; Carbrev, 1975; Jochim, 1975; Lemings, 1980; Omori, 1969,1970; Inaba, 1975; Campbell,. 1978; Tokuhisa, 1983; Я Б. Новикова, 1992; A.B. Луницйн, 1993). Однако каждый из указанных методов имеет недостатки в плане чувствительности, специфичности,, воспроизводимости, экспрессности и простоты постановки. Эти недостатки обусловлены тем. что в реакциях используют поликлональные антитела из ишушасцитических жидкостей или сывороток крови иммунных животных. Taraje реагенты гетерогенны, варьируют по иммунологическим свойствам в зависимости от вида животного - донора, способа иммунизации, очистки. Получение препаративных количеств гомогенных антител из сывороток . или иммуноасцитических жидкостей требует больших материальных затрат и чрезвычайно трудоемко.

Б настояоее время для изучения свойств возбудителей различных заболеваний кадит широкое применение методы , связанные с использованием шноклональных антител (МЛ)(Jochim, Jones, 1987). Paspa-, ботанный в 1975 г штод получения MA (Kohler and Milstein, 1975) сделал возможным получение биохимически относительно гомогенных, специфичных к одной определенной антигенной детерминанте , стабильных по специфичности к авидиоеуи иммунных реагентов. Такие свойства ЫА позволяют использовать их для ' повышения чувствитель-

ности и специфичности серологических реакций и разработки высоко Эффективных методов молекулярного анашша. Таким образом, в настоящее время 14Д ягияюгеа наиболее перспективными реагентами для изучения молекулярной биологии вирусов и для разработки и совершенствования на их основе новых методов лаоораторной диагностики вирусных инфекций. Решить задачу дифференциальной диагностики ЮЮ от заболеваний, вызываемых близкородственными возбудителями рода Орбивирусов, ».южно с использованием методов лабораторной диагностики. разработанных на основе моноспецифических препаратов, которыми являются моноклинальные антитела. ,

Цель и задачи исследования. Целью гааатх исследований являлось получение линий гибридных клеток , стабильно секретирухних Ш к грулпоспецифическим и типоспештфическим антигенам вируса ката-, ральной лихорадки овец, и совершенствование на' их основе средств а методов лабораторной диагностики Ш>.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: •

1. Разраоотать технологию получения выеокоочивгенного антигена вируса КЛО с максимальным сохранением груплосцецифических и ти. поспецифи«еских детерминант вируса

I -у

2. Разработать схемы получения НА к группо- и тшюспецифкчес-ким детерминантам вируса МО, вклвчащце иммунизацию ыш&й - до-дороЕ иммунных еллепопитов; оптимизации условий постановки РУГА, РЛ, непрямого ТФ ИФА, метода' иягибировашм ТФ ИФА для скрининга МА. нужной специфичности; стандартизация манокдональяых иммунорла-гентов. ,

3. Определять оптимальные условия постановки сэндвич-варианта ТФ УЛ'А для обнаружения группо- и типоспецифических антигенов вируса КЛО . и оптимальные условия постановки метода нни'иСирэвааия ТФ

КЗД.ДЛЯ обааруавзния в сыворотках крови животных антител к группа-и типоспецифическим детерминантам Еируса КЛО.

4. Определить пригодность разработанных вариантов ТФ МА. для дйфферейЦкальной диагностики КЛО от' болезни Кбараки и ЭГ20.

Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных кселз доваиай:

получены двадцать шесть новых клонов гибридных клеток, которые секретирут ЫА к антигенам вируса КЛО 14 серс-типа;

- установлено, что антигенные детерминанты белка VP-9 внутреннего капсида вируса КЛО с молекулярной массой 43 КД, распознаваемы» моноклонавьнш! антителами клонов 15Е10.2 , 18ЕИ.2 и 17Е2.2, присуши всем Изученный серотипаы вируса FJSO. Такие детерминанты отсутствуют у антигенов близкородственных вирусов рода Orbivirus, что позволяет использовать специфические к этим детерминантам МА для дифференциальной диагностики КЛО;

- установлено, что антигенные детерминанты белка VP-2 наружного капсида вируса КЛО 14 серотипа с молекулярной массой '92 КД, распознаваемые ыонавдокалькьвд антителами клонов 14F11.2 и 15В1.2, присуши тодько вирусу КЛО 14 серотипа. Такие детерминанты отсутствуют у других серотипов вируса катаральной лихорадки овец. Это позволяет использовать специфические к этим детерминантам МА для титрования возбудителя- в сэндвич варианте ТФ ИФА;

- разработан способ получения очищенного кудътурадьногэ ге-магглютиннрующего антигена вируса КЛО; разработаны РГА н РОГА для обнаружения геыагглотшгарующх антигенов вируса КЛО и антител к этим антигенам на примере вирусов КЖ> 1, 2. 3. 12. и серотипов;

- сэндвич-вариант ГФ JKA. разработанный на основе монокле-нальяьгх антител клона 16Е11.2чпозволяет обнаруживать группоспеш-

- б -

фические антигены вируса ГШ); сэндвич-вариант ТФ ГШ, разраОотан-ный на основе моноклональных антител кленов 14Р11.2 я 1601.2 позволяет обнаруживать типоспепифические антигены вируса Ю10 14 се-ротипа.

- метод двухфазного ингибйроваиия ТФ ИИ, разработанный на основе моноклональных антител клока 16Е11.2, позволяет обнаружить антитела к группсспецифичеекш антигенам вируса КЛО.

Практическая значимость. На основании экспериментальных исследований разработана и рекомендованы для включения в схему диагностики катаральной лихорадки овец чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ КФЛ на основе МА, предназначенные для выявления грутшоспецкфичесгсого антигена вируса КЛО в вируссодерхаших культурзльных нате риалах, Мозге зараженных мышат 2-3 дневного возраста, кровн зараженных гивотных, а так хз для обнаоужения специфичных к вирусу ЮГО антител в сыворотках косен переболевши лнвотных. разработана нормативно-техническая документация на "Нзбор диагностических препаратов для выявления грушоспецифических антигенов вируса КЛО и антител к грудаоспеци-фическим эпитопам вируса КЛО твердофазным яшуноферыентныи анализом на основе моноклональных антител" (ременная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и Наставление по применению) и "Методические указания по применению "Набора диагностических препаратов для для выявления группоспещзфяческях антигенов вируса КЛО и антител к груяпоспецифическиы зпитопаы вируса КЛЭ твердофазным иммунафермзнттм анализом на основе моноклональных антител", утвержденные директором ВНШВШ'Х

Разработанные методы ТФ ША успеино применяли во ЩИВЕгйГ при исследовании экспертизного материала, отобранного при вспыязке бо-

- ? -

лезни овец в Республике Бурятия. Используя сэндвич-вариант ТФ ИФА на основе гругоюспецифических МА клона 16Е11.2, в крови больных животных обнаружили специфические антигены вируса КЛО. В сыворотках крови животных методом двухфазного ингибирования ТФ ИФА на основе МА клона 16Е11.2 обнаружили антитела к грулпоспешфическиы антигенам вируса' КЛО.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

1. Данные по изучению оптимальных услоеий получения очищенного культурального антигена вируса КЛО с максимальным сохранением группо- к типоспецифических детерминант вируса для иммунизации доноров лимфоцитов и постановки РГА И РЗГА.

2. Результаты экспериментов по определению оптимальных условии получений МА к группо- и типоспещфичес-ккы эпитопам вируса РЛО, пригодных для применения в лабораторной диагностике КЖ> методами ТФ ИФА.

3. Результаты исследований по разработке сэндеич-варианта ТФ ИФА на основе соответствующих моно1слональных антител, позволяющих выявлять в исследуемых материалах группо- и типослецифические антигены вируса КЛО,а тага® метода двухфазного ингибирования ТФ ИФА для выявления антител к группоспецифическим антигенам вируса КЛО.

4. Результаты апробации методов ТФ ИФА, разработанных на основе полученных НА, на полевых материалах при вспышке катаральной лихорадки овец в Бурятии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВЙШВЕиМ (г. йжров 1991, 1992), Научно-практической конференции "Биотехнология ветеринарных препаратов" (г. Харьков

1593) и на заседаниях ученого совета ВТШВВиМ (1990-1894гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ.

Обгзм работа Диссертация излол»яа ьа 1-13 листах машинописного текста к включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выгоды, практические предложения и список литературы ( 222 историков , в том числе 23 отечественных). Работа иллюстрирована 19 таблицами.и дополнена приложениями.

2. СОБСТВЕННЫЕ. КСОЛЕДОКУНИЯ

Материалы и методы. В качестье специфических антигенов вирусов КЛО г, 2, 2, б, 12, и 14 серотипов, , ЭГБО штамм Альберта и штамм Нью-Лжерсч, ЕЯ использовали лизаты инфицированных Клеточных, культур, препараты очищенного вируса и суспензии мозга зараженных мынат-сосуноЕ. Для контроля специфичности прямого и сандвич-вариантов ТФ ИФА служили антигены, приготовленные из незара-^нных культур клеток, а также антигены гетерологичных вирусов лихорадки долины Рифт (ЛДР), африканской чумы лошадей (АЧЛ), болезни Найроби ГБН), болезни Акабане СБА), чумы КТО (ЧКРС).

Для клинического воспроизведения КЛО, получения вируссодерма-щего материала, специфических и антияидовш сывороток в экспериментах использовали клинически здоровых животных: ов^ц породы "прекос" в возрасте 2-6 месяцев; мши белье нелинейные; мыши линии ВАЬВ/о 3-4 недельного возраста массой 10-15 г;- мыеи линчи ВАЬВ/с взрослые рожавшие сайки массой 25-30 г; мышата-сосуны ил-линейные 1-2 даевные. Животных получали иг научно-экспериментальной базы лабораторных животных, питомников "Ссетлые ,'гори" и

"Столбовая" АМН СССР, а также из хозяйств Владимирской области. До начала эксперимента животных выдерживали под наблюдением в течение 10-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами.

Для выделения, культивирования и титрования вируса катаральной лихорадки оЕец использовали двухсуточные культуры клеток: почки сибирского горного козерога, линия С-35 (ПСГК) - суспензионный трофовариант; линия ПОГК-бО, монослойный трофовариант-, почки зеленой мартыики ICV-1); почки сайги (ПС). Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культуры клеток с .музеем клеточных штаммов" ВНИИВЕиМ. При получения ИАЖ мышей использовали клетки саркомы мыши 1 80 - TG, хранящиеся в. жидком азоте. Б качестве партнера зля слияния при получении гибридом использовали дефектную по гипок-сантмн-гуанин-фосфорибозил • трансферазе.миеломную лини» клеток Sp 2/0-Ag 14.1 CSp 2/0), полученную из НИЛБТ Ю СССР.

Для получения гибридом мышей линии BALB/c - доноров спленоци-тов иммунизировали препаратами очищенногс. вируса КЛО. Введения антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно, ьнутривенно и внутркселезеночно в определенные сроки с использованием полного и неполного адьювакта Фрейнда и без адыовантов, сочетая сроки и способы введения по различным схемам. Слияние клеток проводили по методу Kohler a MiLstein (1975) в модификации Fazekas & Scheídeggsr .i 1980), используя в качестве партнера для слияния миеломную линию клеток SP 2/0 А?14 и В-лимфоциты селезенки мыол, иммунной к вирусу КЛО. Гибридизацию проводили при соотношении спленоиитов с миеломными клетками 5:1 в присутствии 40%-ного растЕора ЮГ-4000. Гибридные iüic-tkj: культивировали в селективной среде ГАТ в течение 21 суток, затем переводили на ростовув среду

ÜMEM с 15% iO, 2 Ш. г луг амина, 1 мМ пирувата натрпя,. i г/л глюкозы, 1 мг/л амфотерицина, 50 мг/л гентамиияна. Нсскедаваяке кудь-■уральных жидкостей гибридных клонов (скрининг) Еа грисутстБпе штител. к вирусспецифическим антигенам, проводила чгтгз 10 - 15 Шей после начала клонообразования три раза с грехдяеггкмз; ютер-!алами. Скрининг проводили методами ингибирсвания Ш ЙфА, в соот-¡етстЕии с рекомендациями Anderson 1984; РЗГА по методу Hubschle 1980), адаптированному в нашей модификаций для скрининга ilk к ■емагглотиниоуютим эпитопам вируса катаральной лихорадки овец; ксспресс-микровариантом РН и непрямым методом ТФ ИФА, руководс-вуясь рекомендациями Appleton (1983), в нашей модификации.- НЛо-ирование гибридных клеток проводили в полужидком агаре по методу boding- (1980).

Получение препаративных количеств МА в виде асцитических пре-аратов проводили по стандартной методике. Иммуноглобулины из ас-ятячеекой жидкости высаливали сульфатом аммония яри 50Ж-ком на-ыщении. Конъюгирование моноклоналышх антител с аероксидазой рена проводили по методу периодаткого окисления Тjissen (1985). зотип секретируемых гибрйдомнкми клонами моноклональяых антител пределали методом ТФ ИФА с использованием набора "Calbiochem vbridorna Sub-Isotyping Kit Kfouse" в соответствии с рекомендация-и поставщика

Шлипептидную специфичность МА определяли методом ишунобдот-

« I

инга и радиоиммунопрецшнггащш. йммуноэлектрооскофорэз проводили ак описано Mivake et all Г1980).

Результаты исследований

Волучеюю sifGpifjpu. Для иммунизации мышей и скрининга гибрн-эм, секретируших МА к гемагглютннирушкм (типоспепифяческкм)

- и -

зпитопам вируса КЛО 14 сероткпа, были получены препараты очиеэн-ного вируса КЛО с активностью в РГА до 1:2048. Для скрининга МА к группоспе цифическим и тияоспецифическиы зпитопам вируса КЛО вариантами ТФ ИФА готовили концентрированные культуральные антигены вируса КЛО из лизатов клеток ПСГК и СТ-1, заражённых вирусом КЛО на уровне 5-12 пассажей с активностью в РДП 1:-8-1:1б; в РСК 1:123 -1:256; непрямом ТФ ИФА 1:78125.

При гнлериммунизации мышей - доноров В-лимфоцитов наивысшие титры антител выявили в сыворотках мышей После четырех введений антигена, когда два последние введения осуществляли внутрь селезенки. Причем, если после введения бустер-доза антигена внутривенно титр антител к геыаггяютинирующим зпитопам вируса увеличивался вдвое I как и титр антител в РДП и непрямом ТФ ИФА), то введение антигена Ьнутрь селезенки вызывало увеличение титра ,чн-тител к гемагглютинируюшям зпитопам в десять раз, при увеличении титра антител в РДП и непрямом ТФ ИФА только вдвое. Таким сора-зом. эта схема является оптимальной при необходимости получения максимального иммунного ответа на гемагглютинируювде (типоспеци-фические) антигены вируса кло.

Скртшг МА

Для скрининга гибридом, секретирукэдих МА нужной специфичности, были адаптированы экспрессные и чувствительные методы, обеспечивающие обнаружение ид в культуральных жидкостях гибридом: непрямой вариант и вариант ингибирования ТФ ИФА, РН и РЗГА. Зти методы позволили, во-первых, обнаружить МА, специфичные к тем антигенам вируса КЛО, которые определяют его групповую принадлежность и серотип, и, во-ЕТорых, при первичном скрининге позволили отобрать клоны гибридом, еекретирующие такие МА, которые были пригод-

ны для применения в диагностике заболевания методами ТФ Ш.

Непрямым методом ТФ ИФА выявили 136 клонов гибридом, которые секретировали МА, реагирующие с антигенами вируса катаральной лихорадки овец 14 серотипа и не реагирующие с нормальным антигеном. Процент специфического клонообразования составил 62Х. Из них двадцать три клона гибридом продуцировали МА, которые реагировали с антигенами всех перечисленных серотипов вируса КТО и не реагировали с антигенами вируса ЭГЕО и вируса ЕИ, т. е. имели специфичность к групповым антигенам вируса КЛО. Три клона гибридом (14П1.2, 15ВЗ. 2, 16В1.2) секретировали МА, которые-реагировали только с антигенами вируса КЛО 14 серотипа, и не реагировали с антигенам! других серотипов вируса КЛО и антигенами вируса ЭГБО л вируса БИ, т.е. имели серогшювую специфичность. .Скрининг гибридом, секретируювих МА к гемагглюгкнируюдам эпитопам вируса КЛО 14 серотипа в РЗГА, показал, что три клона Гибридом Ц4Г11.2, 15В3.2, 16В1.2) секретировали МА,. способные задерживать гемаггл*>-тинашпо эритроцитов морской свинки вирусом ГЛО 14 серотипа. Скрининг вируенейтрализуадих МА проводили в мйкроварианте экспресс-метода РЕ Обнаружили два 1Шна гибридом (14Р11.2, 16В1. 2), которые секретировали МА, способные нейтрализовать инфекционную активность вируса КЛО 14 серотипа в культуре клеток ПСГК

■ Методом ингибирования ТФ ЙФА .осукзэствлядн поиск МА, способных конкурировать со специфичными к вирусу КЛО антителами сывороток крови иммунных животных за связывание с грулпо- и типоепецйфичео-№ми антигенами вируса КЛО. Положительными считали те виды НА, которые не связывались со специфическим антигеном вируса катаральной лихорадки'оЕец, обработанным специфической к этому вирусу сывороткой овцы, и связывались со специфическим антигевом в лунках. обработанных нормальной и тетерологичными сывороткаыя овец.

При скрипжгэ пйридом ыетолом инпйирования обнаружили четыре клона гкбрпдои (14FU.2, 16В1.2, 15Е10.2» 16Е11.2). котэрио еек-рэтмровэди МА, способные конкурировать, с сывороточными акиггелаш за ссязшзшк с грулпо- к тшаепецкфическтга антигена-»« вируса BJSX Эти МА использовал» в дальнейшем при разработке вариантов ингибкросаниз и двухфазного ингибировация ТФ ИФА для обнаружения вирусагаинфичесют антител в сыворотках крови жиеотных, иммунных к вирусу КЛО.

йзучшв €ЮЙСТВ Ш

Йэсл© получения препаративных количеств МА был проведен конкурентный йпалг.э в есэ ыа объединили в десять групп по способности еьазыглгъся с одной и той же антигенной детерминантой вируса КЛО. В дадьн&йа&й работе использовали десять видов МА - по одному из кагдай 'группы Выбор МА определялся максимальной их активность» в непрямом варианте ТФ ИФА и изотипом антител. Предпочтете 6ц» отдано антителам специфичным к линейным детерминанта:,) с B3QTKHQM

При изучении полипептидной специфичности МА методом кшуноб-яоташ'га ■ и радиоидаунопрешшитации определили, что пять ви-BJS. МА .(14F11.2, 16Е11. 2, 17Е2.2, 16В1.2, 14D2. 2) связываются о К0шзенщ1аш»ш антигенными детерминантами, расположенными на по-ЯЖГептвдзх VP1, VPS, VP9 вируса КЛО 14 серотипа. Три вида МА ШЕЛ, г, ISE10, 1ЩЗХ1,") связываются с конформзционно-зависиш-ш детерааакшама, обгюзаезшшвд «буш ыэдгша« кратенаааа Д*Р2 наружного капсяяа) и VPS С белок сердцевины? вируса катаральной -ШКФЭДКЙ овец,

Vferoao« Шйуао^хектроосмофореза (ВЭОФ) и б реакции диффузионной преципитации tJffi» Обнаружили, что МА клона 17Е2.2 способны

СЕягкватьеь' с прецигс.'тгрувда1.« зпитопaict вируса ДЯ> в титре з ИЗО* !: 20 э РЛП 1:3. Сопоставив полученный результат с данными по определению полипептидной специфичности установили, что

антигенные детерминанты вируса КЛО, по которым стределяго групповую принадлежность вируса в РДП расположены на бел?® сердцевины VP9 вируса КЛО.

Активность МА, способных нейтрализовать инфекццонность вируса КЛО 14 серотипа, определяли в микроварианте экспресс метода реакции нейтрализации. ОСнарушли, что МА клонов 14F11.2 и 16Б1.2 нейтрализуют инфекционную активность вируса катаральной лихорадки овец 14 серотипа в титре 1:64 и 1:16, соответственно.

Активность МА, способных задеретвать агглютинацию эритроцитов вирусом КЛО 14 серотипа, определяли в реакции задержи гемагглэ-тинации. Обнаружили, что МА клонов 14F11.2. 16В1. 2 и 15ВЗ. 2 обладают способностью задерживать агглютинацию эритроцитов морской свинки вирусом ■ катаральной лихорадки овец 14 серотипа в тотре 1:512, 1:64 и 1:16, соответственно. Сопоставив полученные результаты с данными по определению полипептидной специфичности Ш этих ¡слонов, а также их способности нейтрализовать инфекционную активность вируса, установили, что гемагглютинирующие антигены вируса КЛО 14 серотипа одновременно обусловливает и его инфекционную активность. Эти антигенные детерминанты расположены на белке кардного капсида вируса VP2. - <

ОтСор МА и разработка, вариантов ТФ МА для лайгрогоркой

диагностики КЛО

(Отбор i£A, пригодных для применения в диагностике катаральной •;:л.:г.-ски овец, проводили одновременно с разработкой: вариантов ТЗ И5А для лабораторной диагностики КШ. Кссяеговаккя вела в дзух

направлениях:

1. Разрабатывали прямой вариант ТФ ИФА и сэндвич-вариант Т4 ИФА для обнаружения антигенов вируса КЛО в зараженных культурах клеток, мозговом материале мышат, зараженных вирусом КЛО, в крови и органном материале животных при вирусоносительстве. При разработке указанных вариантов ИФА изучали:

- пригодность МА клонов 14Р11.2 и 16В1.2 для выявления серо-типоспецифических антигенов вируса КЛО 14 серотипа-,

- пригодность МА клонов 16Е11.2, 16Е8.2 и 15Е10.2 для выявления грушюспецифических антигенов, обидах для всех серотипов еиру-са катаральной -лихорадки овец и отсутствующих у вирусов других серогрупп, включая близкородственные вирусы ЭГБО и болезни Ибара-ки.

2. Разрабатывали варианты ингибирования и двухфазного ингиби-рования ТФ ИФА для обнаружения антител к антигенам вируса катаральной лихорадки овец в сыворотках крови животных, иммунных к вирусу КЛО. При разработке указанных вариантов ИФА изучали:

- пригодность МА клонов 14Р11. 2 и 1681.2 для выявления антител к типоспевдфическим антигенам ' вируса катаральной лихорадки овец 14 серотипа в сыворотках крови иммунных животных;

- пригодность ЫА клонов 15Е11.2 и 15Е10. 2 для выявления антител к группоспецифическим антигенам вируса катаральной лихорадки овец.

Для определения чувствительности и специфичности прямого варианта ТФ ИФА в опьгг брали специфические, нормальные и гетероло-гичные антигены близкородственных вирусов ЭГБО, болезни Ибараки, африканской чумы лошадей и других вирусов. Определяли их титр и возможные перекрёстные реакции. При постановке прямого варианта ТФ ИФА установили , что данный метод позволяет обнаруживать груп-

по- к типоспецадичеекие антигены вируса катаральной лихорадки огец в концентрированных кульгуральных антигенах в титре до 1: 7230, в 10% суспензии мозга 2- 4-дневных мышат, зараженных вирусом КЛО, в титре до 1:128. Однако, при исследовании антигенов в прямом метода ГФ 1Ш имеют место высокие фоновые пок.чзатели для нормальных и гетерологичных антигенов (1:10 - 1:30). Это делает реакцию менее наглядной, кроме того, затрудняет обнаружение мшго-малькых количеств вирусспецифических антигенов в низких разведениях Еируссодергкацих препаратов (1:10 - 1:30) при необходимости исследования материалов с небольшим уровнем накопления возбудите- ■ ля.

Б процессе определения оптимальных условий постановки сэндвич-варианта ТФ ИФА определяли сочетания МА ¡пары >'\). которые проявляют активность в данном методе. При этом первый вид МА использовали для сенсибилизации ТФ, а второй вид МА, коныогироваи-ных с ПХ, для выявления специфических антигенов,- связанных на ТФ перЕкм видом МА. Обнаружили, что активность в сэндвич-варианте ТФ ИМ для обнаружения антигенов вируса КЛО проявляет пары таких МА, которые специфичны к антигенным детерминантам, расположенным на одном полипептиде вируса катаральной лихорадки овец, или на различных полипептидах, но находящихся в прочной связи. Кроме того, в сэндвич-варианте ТФ ИФА в качестве вторых антител проявил активность перокслдазннй конъюгат специфических к вирусу КЛО полик-лональнкх иммуноглобулинов из ИАН мшей. При выборе оптимальных сочетаний МА для сэндеич - варианта ТФ ИФА исключили пары МА, которые представлены антителами к одному и тому хе эшггопу вируса В этом случае антитела на ТФ связывают те' те эпитопы антигена, к которым должны присоединяться МЛ, конъюгировонные с ПХ, что ведет к уменьшению чувствительности реакции. Исключил! пары таких МА.

которые специфичны к антигенным детерминантам, расположенным на двух, разных полипептидах вируса КЛО (VP2 и VPS) находящихся в прочной связи, как непригодные для применения в диагностических методах ТФ ИФА.

В дальнейшей работе по изучению специфичности и чувствительности сэндвич варианта ТФ ИФА использовали следующие сочетания ИД:

- МА клонов 14F11. 2 и 16В1. 2, как гапоспецифические по ре-аультатам прямого ТФ ИФА и специфичные к двум различным детерминантам белка внешнего капсвда VF2 вируса катаральной лихорадки овец 14 серотипа;

- Ш. клонов 16Е11.2 и 17Е2.2. как группоспецифические по результатам прямого ТФ ИФА и специфичные к двум различным детерминантам белка сердцевины VP9 вируса КЛО;

. - МА клона 16Е1.1,2 для сенсибилизации ТФ, как группоспецифи-Ческие по-результатам прямого ТФ ЙФА и пероксидазный ксныогат спеда^есках к вирусу КДО поликлональных иммуноглобулинов из ИАЖ мшей, который способен повысить чувствительность сэндвич-варианта ТФ Щ,

В результате проверки чувствительности и специфичности разработанного сэндвич-варианта ТФ ИФА* определили:

- при сенсибилизации ТФ МА клона 14F11.2 к использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона 16В1.2 метод позволяет обнаружить тилоспецифические антигены вируса катаральной лихорадки овец 14 серотипа в концентрированных кудътуралышх антигенах вируса КЛО в титре до 1:2430, в 1 ОХ-ной суспензии мозга зараженных 2-4-дневных мышат в титре до 1:64. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов всех исследованных нами возбудителей КЛО других серотипов.

близкородственных вирусов ЭГЕО 1 и 2 серогипа , болезни Ибараки, африканской чумы лошаде-й, а так ле от антигенов вирусов других семейств;

- при сенсибилизации ТФ МА клона 16Е11.2 и использовании для выявлении связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона 17Е2.2 метод позволяет обнаружить группоспецифическиэ антигены вируса КЛО всех исследованных наш серотипов вируса в концентрированных культуральннх антигенах в титре от 1;810 до 1:7290, в íO't-HoiT суспензии мозга зараженных 2- 4-дневных мышат в титре до 1:64, в культуральной жидкости зараженной культуры клеток в титре до !: 30. ГТг-и этом метод позволяет дифференцировать данный антиген 5т антигенов близкородственных вирусов ЭГБО 1 и 2 серотипа, болезни Ибараки, африканской чумы лошадей, а так ле от антигенов вирусов других семейств;

- при сенсибилизации ТФ МА клона 16Е11.2 и использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата специфических поликлон.чльных антител из ИАЖ мыши метод позволяет обнару-;|а;ть груплоспецифические антигены всех исследованных наш серотипов вируса КЛО в концентрированных кудьтуральных антигенах оЕец в титре до 1:21870, в 1ОХ-ной суспензии мозга зараженных 2-4-х дневных мушнт в титре до 1:128, в культуральной жидкости зараженной культуры клеток в титре 1:90, в крови животных в титре 1:21:22. Использование такого сочетания антител в сэндвнч-варианте

• <

ТФ ¡!ФА позволяет дифференцировать данный антиген от антигенов близкородственных вирусов ЭГБО 1 и 2 серотипа, болезни Ибараки, африканской чумы лошадей, а так де от антигенов вирусов других

семейств.

Для выявления антител к антигенам вируса КЛО был разработан sai иант двухфазного ингибирования ТФ ЖГА на основе МА. Суть мето-

да заключается в следующем.- взаимодействие специфического антигена с антителами исследуемых сывороток происходит в жидкой фазе. Это позволяет специфическим сывороточным антителам ингибировать связывание антигена с на ТФ при переносе.прореагировавших образцов на твердую фазу, сенсибилизированную этими МА. Кроме того, ингибируется связывание специфического пероксидазного коньюгата с антигеном. Этот метод, в отличие от метода ингибирования. позволяет применять пероксидазные конъюгаты поликлональных специфических к вирусу ШЮ иммуноглобулинов.

Для определения чувствительности и специфичности варианта двухфазного'ингибирования ТФ ИФА в опыте использовали: сыворотки крови овец, специфичные к вирусу КЛО 1-20 серотипов (лиофилизи-рованные) из лаборатории "Музей вирусных штаммов" БНИИВВиМ; сьво-ротки крови овец и КРС специфичные к вирусу КЛО щташ Ильичевский (нативные), сыворотки крови овец, специфичные к вирусам болезни Найроби, болезни Шараки, ЭГБО, болезни Акабане, ЛДР.

При исследовании сывороток вариантом двухфазного ингибирования ГФ ИФА способностью ингибировать связывание специфического антигена с грушоспецифическимн МА клонов 15Е10.2-й 16Е11.2, сорбированными на ТФ, обладают только сыворотки овец и КРС, иммунных к вирусу ЕЛО. Нормальные и гетеродогичные сыворотки крови овец и КРС не ингибируот такое связывание, начиная с первого разведения (1:2).

На основании проведенных .исследований даляо сделать заключение, что метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА для обнаружения антител к. группоспецифическим антигенам вируса КЛО с применением МА клона 16Е11.2 для сенсибилизации ТФ и специфических к вирусу КЛО пояшшшалькых иммуноглобулинов, коньюгированных с пероксода-зой хрена, специфичен и пригоден для ретроспективной диагностики

КЛО и дифференциации ее от ЭГВО и болезни Йбараки.

При разработке вариантов ингибяропания и двухфазного ингиби-рэвания обнаружили, ^тс способностью ингибировать связывание ти-поспеи;4«ческого антигена вируса КЛО 14 серотипа с типоспецифи-ческиии для этого Еируса МА клонов 14F11.2 и 16В1.2, сорбированными на обладают не только сыворотки, специфичные к вирусу КЛО 14 серотйпа (Как предполагал}:), но и сыворотки овец и КРС, иммунных к другим серотипам вируса КЛО. Нормальные и гетерологич-ные сыворотки крови овец и КРС не ингибируют taitoe связывание, начиная с первого разведения (3:2).

Эти результаты совпадают с дачными Lee (1931), полученными при исследовании реовпруса человека. Он обнаружил, что при связывании соответствующих антйтел с белком сердцевины Л 2, который образует шип на поверхности виржжа (аналог груплоелецифического белка VP0 сердцевины вируса КЛОК блокируется связывание МА с ге-магглютинируюшим злитопом белка di - аналогом белка VP2.наружного капсида вируса КЛО. Этот фага свидетельствует о пространственной сближенности гемагглютинирутаего зтйФпа белка наружной оболочки с шипами бежа сердцевины реовируса Таким образом, труп-поспецифические антитела из сыворотки крови давотных, иммунных к вирусу КЛО любого серотипа, способны блокировать связывание ЫА с гипоспепифическими (т.е. геиагглютннирухэдими и вызывакиими образование нейтрализугадх антител) эпитопами. Это не позволяет применить типоспецифические МА клонов 14F11.2 и 16В1.2 для обнару.те-яия в сыворотках крови Животных антител к типоспецифическим антигенам вируса КЛО 14 серотипа вариантами изгибирования и двухфазного ингибированкя ТФ ИФА.

Лрамшгеэ чэтомов ТФ ИФА на основе МА для экслертнзяых

жемемэва£з8

' - Вз основе разработанных наш: вариантов ТФ ИФА был создан "Набор диагностических препаратов для обнаружения группоспецифичес-ких антигенов и антител к группоспецифическим эпитопам вируса КЛО твердофазным иммуноферментным анализом на основе МА". Данный "Набор... " прошел успешные испытания при зкспергизных исследованиях патологического материала при вслыввсе КЛО в Бурятки. При проведении исследований использовали следующий материал:. пробы крови, печени, селезенки, л/узлов, кишечника и мышц овец с явными клиническими признаками болезни. Используя сэндеич вариант ТФ ИФА на основе UA клона 16Е11.2, впервые при КЛО выявили специфический антиген вируса непосредственно в пробах крови в титре 1:32, печете в титре 1: 2- 1: 4 и селезенки в титре 1:2. Диагноз по результатам сэндвич-варианта ТФ ЩА на основе МА бьш ¡¡оставлен в течение четырех часов. .Шсле выделения вируса на культуре клеток и на 2-3 дневных щстс, приготовили культуральный и сахарозо-ацетоновый антигены. В этих антигенах в сэндвич-варианте ТФ ИФА на основе ЫА обнаружили антиген вируса КЛО в титре 1:256.

Обнаружение специфических антител проводили методом двухфазного ингибирования ТФ КФА на основе МА клона 16Е1]. 2. В сыворотках крови овец пораженной отары специфические к вирусу КЛО антитела о^наруаш! у 25% животных; в сыворотках крови овец из соседних отар - у 19%: в-сыворотках крови КРС, выпасавшихся совместно с овцаад - у 2,3% тавотных. Установленный диагноз - КЛО был подтвержден в дальнейшем и другими диагностическими методами.

Таким образом» в результате проведенных исследований разработана методология получения МА. к г^уппо- и типоспециФическпм ант л -• генам вируса KJIO, изучены некоторые шлекулярно-биологические

свойства этого возбудителя и соЕерсенствованн средства и методы лабораторной диагностики КЛО, позволяющие дифференцировать ее от вирусов ЭГЕО и БИ.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы получения МА к антигенам, определяющим групповуь и типовую принадлежность возбудителя КЛО. Получены 3 линии гибридных клеток мыипюго происхождения, стабильно продуци-рутоаяе МА к двум различным типоспецифическш антигенным детерминантам вируса КЛО 14 серотипа и 23 линии гибридных клеток местного происхождения стабильно . продуцируювде МА к восьми различным груяпоспецифическим антигенным детерминантам вируса КЛО.

2. определены оптимальные условия получения очищенного куль-турального антигена с максимальным сохранением группоспецифичес-ких и типоспецифичесгах детершшант вируса для иммунизации доноров лимфоцитов и постановки РГА и РЗГА с активностью в РГА -1:512 - 1:2043. Определены оптимальные условия постановки РГА для выявления гемагглютинирувдих антйгенсв вируса К® и РЗГА для выявления антител к таким антигенам, а тзкж скрининга гибридом, продуцирующих МА к гемагглюгяншац вируса КЛО.

3. Установлено, что высококонсервативннэ детерминанты белка УР9 внутреннего капсида вируса. КДЭ (молекулярная пасса 43 100, выявляемые моноклонадьныш антителами клонов 16Е11.2 и 17Е2.2. присутствуют у всех изученных атакмэв вируса КЖ> различных серо-гипов к отсутствуют у антигенов близкородственных вирусов рода ЭгЬШгиз, что позволяет использовать специфические к этим детерминантам МА для дифференциальной диагностики КЛО;

4. Установлено, что некоторые участки бежа VP-2 наружного калсида вируса КЖ> 14 серотипа (молекулярная масса 92 КД), выявляемые шноклональныш! антителами клоков 14F11.2 и 36В1.2, являются эпигонами, которье обусловливают гемагглигин^фующто активность вируса и его нейтрализацию Гомологичными сыворотками. Эти эпитопы определяет принадлежность возбудителя к одному из 24-х серотипов вируса КЮ. Шяокпональньге антитела, которые нейтрализует инфекционную активность вируса и, вместе с тем, задерживают агглютинацию вирусом эритроцитов животных являются типоспецифи-ческиш и пригодны для тжирования возбудителя КЛО в ТФ ША.

5. Разработан сэндвич-вариант ТФ ИФА на основе моноклональных антител, для обнаружения типоспецифическ£.х антигенов вируса КЛО 14 серотипа и для обнаружения группоспецифических антигенов виру-cá КЮ. Ыетод позволяет выявлять, специфический антиген вируса FJIO в вируссодеряащдас культуральных материалах в титрах от 1:4 до 1:64; . в мозговом материале зараженных мызват в тигре от 1:2 до 1: 128; в крови зараженных овец на стадии виремии в титре от 1:2 до 1:32.

6. Разработан метод двухфазного ингибирования ТФ ЯФА на основе моноклональных антител для обнаружения антител к группоспеци-фическим антигенам вируса КЛО. Метод позволяет обнаружить такие антитела в сыворотках крови животных, иммунных к вирусу КЛО, в титре от 1; 4 ДО 1:1024.

7. Варианты ТФ КФА. разработанные на основе полученных МА, пригодны для применения в лабораторной диагностике КЛО и дифференциации КЛО от эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни КЗ араки.

ПРАКТЙЧЕСГиЖ Гь-'ЕЛЛОШНИЯ

1. В результате проведения экспериментальных'исследований получены данные, позволяющие рекомендовать для дифференциальной диагностики НЛО от болезни Лбараки и ЭГЕО чувствительные, специфичные. высокопроизводительные и экспрессные методы ТФ ИФА на основе МА.

/ .

2. Разработан и предложен : "Набор диагностических препаратов для обнаружения грушосяецифических антигенов вируса КЛО а антител к группоспецифическим эплтопам вируса КЛО твердофазны;,« ишу-ноферментным анализом на основе моноклокальных антител" и соответствующая нормативно-техническая документация ( Временная инструкция по изготовлению-и контролю, Технические условия, Настав-. ление по применению и Методические указания по применению набора) , утвержденная директором института

СПИСОК ОПУБЛЖОВАНШХ РАБОТ

1. Шушщ А. В., .ЧИчнкш А.-КХ-, ОгрнЕзкоп А. А., Вшгакоа К.Ф., Оакаотш А. Я. ВхдарокзЕедапш ЭГЮ на благородных оленях// Теь. докл. науч. конф. ВНШВВаН. -Шкров. -1S92. -С. 251-255.

2. Реутова. ¿.Г. ,Сургучева IIU. .Стрягаков &.А. .Солавкина IL М. . йтшскаа Т. П., Льюка R11 Сравнительная оценка различных методов кшункззшш при получений гибридом и моноядонаяькых антител к ан-гч»текам вирусов.//Тез. докл. науч. конф. ВШШВВиМ. -Покров. -1902.

-а. 344. *

3. Стриуаксг А. А. Получение гибридом, продуцирующих монокло-нзлькш ачтктела к вирусу КЛ0//Тез. докл. науч. конф. внииввиМ. -Пскров. -192S. -С. 339.

4. Сгрюгштав А. А. ' Использование ■ маноклональних антител для

, лаборзяориой диагностика катаральной лихорадки овец, методом ТФ . HívWTes. дока. науч. -крзкг. конф. "Биотехнология ветеринарных прйпадаоа -УкрНШВ. -ХарькоЕ. -1993. -с, 228.

5. Стрижаков A. L Шаокдакадьнш аа-гатела к антигенам вируса КДй//Тез. дока науч, -пракх. "Шотехкодогш ветеринарках препарадов 8, -1ЩЗ, -0.50.

й. Вшшксз it & .Стршакоз А. А., Швтагва U Б., Д^шциа &. В., Ярраиноз В.В.» Карпов Г.М. Ьиелгниг, идеагв^ажацва и тажфзвгагк-з вируса МО В'Бурятии^/ Те®. науч.-нрает, конф. -ЙШ. -Огар. -1394. -С. 123.