Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург"

^ На правах рукописи

СТРЕЛЬЦОВА МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА

Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург.

03. 00. 06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически:-: наук

Кольцово, 1998

l'aooia выполнена n Наун:'* исслед^и.;: -льском инстип ie молекулярной 6и»>Л1Ч ни 1 • >с\о нлччно. •> lu'iupa вир>сологии и пи«>)е.ч!!"Л1М 1*и "Вектор" Mnii4c:e;vi»a Чраноохранения Россииа.мл Федерации.

liayinue р\ко1юлшели

• .шдидаг медицинских м iv v Г.M.l1rn.iTi,ciï

л.исгор медицинских i: iv,-. кр Н,\\\'<-". /М.С. Utу^евьега

Официальные оппоненты:

ликтор медицинских наук- М Л Орлогскг.я

доктор биологических паук А H Сергеев

Ведущая ор> антання- шкти'ут »чрчео-ьм -лл иv . .1.Ï ' • : я -iw ;••!»• РАМН, г. Москва.

Защита сосюшся '26" XJ 15>}>К:. В часов н. -чемиил

диссертационно! о совета Д 07-î '¡'0' Гос\ и;чтченп м о чаушч • > цен ipa вирусологии и олончн 'л.4'»и 'Вектор' Мшшс i ере nia здравоохранения Рос cuir,v.iii Федерпг'н .то адресу: f>.U| я<> Ко.ч -ц.• •. Новосибирский облас ' ;;.

С диссертацией можг - ■ннак^мш; v i '""¡t" гнотеке ГНЦ В1> 'Вектор".

Автореферат разослан Ученый секретарь

диссер i ационного совета H. II

H.IllvoHiia

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лихорадка Марбург является тяжелым высококонтагиозным заболеванием с высокой смертностью. Отсутствие средств быстрой диагностики, профилактики и лечения при расширении международных связей создают угрозу проникновения вируса на неэндемичные территории. Кроме того, существует целый ряд вирусных геморрагических лихорадок, клиника и патогенез которых имеет общие черты с геморрагической лихорадкой Марбург и которые достаточно широко распространены в некоторых районах мира. Специфические средства лечения и профилактики геморрагических лихорадок, как правило, отсутствуют. В настоящее время очень мало известно об иммунопатогенезе лихорадки Марбург и филовирусных геморрагических лихорадок в целом. Однако, не вызывает сомнения что иммунологические факторы играют важную роль в патогенезе этих заболеваний. Поэтому при создании профилактических препаратов важно изучить механизмы взаимодействия иммунной системы организма с живым и инактивированным вирусом, а также механизмы формирования иммунного ответа и факторы, влияющие на этот процесс.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования было определение подходов к созданию протективного инактивированного препарата вируса Марбург, оценки его иммуногенных свойств, * изучение иммунопатогенеза экспериментальной лихорадки Марбург у иммунизированных этим препаратом животных, а также исследование возможности лечения этого заболевания в эксперименте.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Получение инактивированного препарата вируса Марбург.

2. Оценка протективных и иммуногенных свойств инактивированного препарата вируса Марбург.

-23. Исследование динамики изменения иммунологических показателей у животных при моделировании лихорадки Марбург.

4. Изучение показателей неспецифического и специфического иммунного ответа у животных, иммунизированных инактивированным препаратом вируса Марбург, после заражения их гомологичным вирусом.

5. Изучение возможности лечения экспериментальной лихорадки

I

Марбург некоторыми противовирусными препаратами и препаратами -антагонистами фактора некроза опухоли.

Научная новизна. Показано, что иммунизация животных инактивированным препаратом вируса Марбург приводит к формированию специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. Исследование иммуногенных свойств инактивированного препарата вируса Марбург на морских свинках и обезьянах позволило установить различную динамику изменений показателей иммунного ответа у зараженных иммунных погибших и выживших животных. Впервые показано,' что процесс развития лихорадки Марбург у морских свинок и обезьян сопровождается повышением активности неспецифических факторов иммунитета (ФНО, интерферона, НК) на 5-7 сутки после заражения, которое продолжается вплоть до момента гибели животных. Показано, что препараты интерлейкина-2 оказывают негативное влияние на течение лихорадки Марбург. Впервые показано, что применение препаратов -антагонистов фактора некроза опухоли при лихорадке Марбург оказывает терапевтический эффект в экспериментах на животных.

Практическая ценность работы. Получен патент Российской Федерации "Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммунологической и протективной активностью" (1Ш 2029561 С1). Получен протективный препарат против геморрагической лихорадки Марбург, который

прошел доклинические исследования согласно РД 42-28-8-89 (отчет о "Доклинических испытаниях..." прилагается). Препарат удовлетворяет по своим характеристикам требованиям иммунологической безопасности. Для углубленного изучения качества инактивированного препарата вируса Марбург были проведены исследования показателей иммунитета у привитых животных после заражения. У части иммунных животных была установлена иммунологическая реакция, потенцирующая развитие заболевания. Полученные материалы были использованы в "Отчете о доклинических испытаниях вакцины лихорадки Марбург", который был представлен в Комитет по МИБП. В своем заключении Комитет по МИБП согласен с мнением авторов о качестве инактивированного препарата против геморрагической лихорадки Марбург и важности дополнительных исследований при оценке специфической активности и безопасности вакцинных препаратов (выписка прилагается). .

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работы, докладывались или были представлены на: Международном симпозиуме "100 лет вирусологии". Санкт-Петербург, 1992. IX . Международном конгрессе по вирусологии , Глазго, 1993.

Международной конференции "Новые направления в развитии вакцин" (NAVD'95). Вена, 1995. YIII Международной конференции антивирусных исследований, Санта-Фе, Нью-Мексика, США, 1995. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, получен I патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и семи глав: обзора литературных данных (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований и обсуждения (главы 3-8), а также выводов и списка цитируемой литературы (178 ссылок). Работа изложена на 181 странице машинописного текста, включая 27 рисунков и 11 таблиц.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ "Вектор" к.м.н. Игнатьевым Г.М.. к.б.н. Агафоновым А.П., Кашенцевой Е.А., н.с.лаборатории электронной микроскопии Жуковой H.A.

Использованные сокращения: А Т- антитела; БСА - бычий сывороточный альбумин; ВМ - вирус Марбург; ГЛМ - геморрагическая лихорадка Марбург; ДФО - дефероксамин; ИАМ - инактивированный антиген вируса Марбург; ИГ1М - инактивированный препарат вируса Марбург; ИЛ-1 - интерлейкин-1; ИР( - индекс резистентности; ИО -иммунный ответ; ИС - индекс стимуляции; ИФА - нммуноферментный

I

анализ; ИФН - интерферон; Кон А - конканавалин А; НК - натуральные киллеры; РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов; РД -регламентирующий документ: СП - спонтанная пролиферация; СПЖ -средняя продолжительность жизни павших животных; ФНО - фактор некроза опухоли.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Нами были проведены . исследования по разработке инактивироьанного препарата против вируса Марбург . Для этого был использован вирус Марбург штамма Popp, охарактеризованный и депонированный в Государственную коллекцию вирусов при Институте Вирусологии им. Д.И. Ивановского. Вирус культивировали на культуре клеток Л-68, сконцентрировали методом ультрафильтрации, инактивировали формалином. В результате был разработан и запатентован " Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью".

Предложенный нами метод позволяет получить препарат со сравнительно низким содержанием неспецифического белка (менее 1,5

Таблица I

Характеристика инактивированного препарата вируса Марбург, аттестованного в соответствии с требованиями Комитета по МИБП.

Определяемые параметры Характеристика препарата

Общий белок (мг/мл) 0,42±0,15

Специфический белок (мкг/мл) 6,5+0,5

Специфическая безвредность безвреден

Индекс резистентности не менее 2

Титр специфических антител в ИФА у морских свинок 1:320-1:640

Специфический клеточный иммунитет(РБТЛ у морских свинок) Отмечена стимуляция

мг/мл). не обладающий пирогенностью, токсичностью и аллергенностью. Были отработаны оптимальные доза (7мкг/животное) и схема (двукратно, через 14 сут) иммунизации. Характеристика препарата представлена в таблице 1.

При определении индексов резистентности нескольких серий препарата на морских свинках мы столкнулись с феноменом ранней гибели иммунизированных животных (табл. 2). Т.е. средняя продолжительность жизни иммунных животных была ниже, чем у контрольных, зараженных той же дозой ВМ. Мы предположили, что усугубление патологического процесса произошло вследствие предшествующей иммунизации.

На Совещании Экспертов Европейского сообщества, занимающихся разработкой и оценкой вакцинных препаратов, в 1992 году было определено, что особенно важными при оценке безопасности вакцин явлляются исследования иммунопатогенеза инфекций, правильная

Таблица 2.

Индексы резистентности и средняя продолжительность жизни погибших животных при испытании 2-х серий препарата.

N серии ИР Доза Количество • СПЖ

заражения павших (по Мейнелу)

_ (ЛД 50) животных

1 2,1 10^ 10 5,8±0,2

10' 8 6,3±0,4*

10л- 5 5,2±0,2*

10 1 5,0

2 2,6 8 5,5±0,5

103 6 5,0±0,3*

102 5 5,5±0,3*

10 0 -

контроль 103 10 7,3±0,2

10- 10 7,9±0,5

10 _ 9 7,1±0,5

1 6 7,6±0,3

* - различия по сравнению с контролем достоверны при р<0,05

стратегия иммунизации и оценка риска вакцинации. Результаты этих 1 исследований могут позволить ответить на вопрос будет ли вакцина не ■ только специфически иммуногенна, но и безопасна.

В связи с этим при оценке иммуногенности ИПМ мы расширили спектр исследуемых иммунологических показателей по сравнению с теми требованиями, которые предъявляют существующие документы по контролю безопасности вакцин. Выбор дополнительных иммунных параметров мы осуществляли на основании данных литературы по клинике и патогенезу геморрагических лихорадок, которые свидетельствуют, что в развитии этих заболеваний важную роль играют некоторые иммунные факторы. Таким образом, мы исследовали не только стандартные показатели специфического иммунитета (титр АТ и ИС в ответ на специфический антиген в РБТЛ), но и изменение активности таких неспецифических показателей как ФНО, ИФН и НК у морских свинок и обезьян.

При оценке иммуногенности полученного инактивированного препарата на морских свинках 25 животных были проиммунизированы двукратно на 0 и 14 сутки ИПМ в дозе 7 мкг специфического белка на животное. Контроль за иммунными параметрами проводили в течение 28 сут после первой иммунизации. Данные по формированию специфических АТ, представленные на рис. 1(А), показывают, что по данному показателю специфического иммунитета наиболее активно ответили 16 морских свинок (группы 1 и 2). У 7-ми животных (группа 3) титр АТ был ниже, чем у животных 1-й и 2-й групп. 2 морских свинки (группа 4) никак не ответили на иммунизацию продукцией АТ. При оценке показателей клеточного специфического иммунитета (рис.2) отмечено повышение пролиферативного ответа на специфический антиген на 21-28 сут у животных первых Зх групп и его полное отсутствие у 2х животных 4й группы.'

350 * ■ 300 ■• 250" 200 150100 ■• 50 ■■ 0

■I

0 7 14 21 23

Время поел« иммунизацж <сужи)

В Группы 1 и 2 (№16) □ Группа 4 (N=2) .

О Группа 3 (N>7)

< 700 т 0

X 600 -а

§ 500 -| 400

со

& 300--

¡5

« 200 -I 100

ни

1к

-н

0 7 14 21 28 Время после иммунизации (сутш) ■ Обез. N1-3 ПОбез. N4 □ Обез. N5 ПОбез. N &-8

А

В

□

2000 т

| 1500

I 1000

£ 500

0

1

3

5 7

10

Время посла инфицирования (сули)

■ Группа 1 (выжили)

□ Группа 2 (СПЖ=7.1)

□ Группа 3 (контроль, СПЖ=8,3)

3000 у

2500 -

<

в

X а 2000 -

с

г 1500 -

V 1 1000 •

1= 50С-

к к ,!|» ,1

1

7 10

0 13 5 Время после иммунизации (суп«) .^уобез.1-3) □ Обез . N5

Рис. 1 Титр вирусспецифических АТ в сыворотке крови иммунных животных до и после заражения. А - морские свинки и В - обезьяны после иммунизации. С - иммунные морские свиноки и Д - иммунные обезьяны после заражения вирусом Марбург.

Группа I (N=10)

т 20

0 7 14 21 2S 28 Время после нммушпшши (с\ гкн) СЗЭМар6}рг mCon А —»—СП

16,0 -• 14,0 •• 12,0 ■• 10,0 ■• 8,0 ■• 6,0 4,0 •■ 2,0 ■ ■ -0,0

.а

Гр>ппа 2 (N=6)

т 20

■• 15

-• 10^

О 7 14 21 28 Время после иммузтзацнн (сутки)

ЮЗМарбург ГТПСоч А —•—СИ

Группа 3(N =7)

Гр>ппа 4 (N=2)

О 7 И 21 28 Время после иммунизации (сутки) ЕЗЭМарбург Г*~^Соп А -«—СП

16,0 14,0 ■■ 12.0 ■■ 10,0 8,0 •6,0 ■ • 4,0 ■■ 2,0 0,0

0 7 14 21 28 Время после иммунизации (сутки)

SEI Марбург ЕГЯЗСоп А —о—СП

Рис. 2 СП и ИС в ответ на специфический антиген лимфоцитов морских свинок, иммунизированных инактивированным антигеном вируса Марбург в РБТЛ. Представлены средние значения. Коэффицнет вариации по СП <10%, по ИС < 7%. * обозначает достоверные сгличия от исходных параметровпри р< 0,05.

Показатедн неспецифического иммунитета (рис. 3) у животных первых трех групп в процессе формирования ИО изменялись довольно интенсивно, достигая максимальных значений на 1 -5 сутки как после 1, так и после 2-й иммунизации. Однако по абсолютным значениям этих показателей животные 1 и 2 групп, име:сщие одйййкоаые титры специфических АТ, отличались друг от друга. Это и позволило разделить их на 2 группы. У 10 из них (группа 1) уровень ФНО был ниже и перед иммунизацией, и в прсцсссе формирования ИО. Продукция же ИФН и активность НК, несмотря на практически ' одинаковые исходные и конечные значения у животных 1 и 2 групп, в динамике формирования ИО также отличались: у штатных 1-й группы реактивность по этим показателям была ниже, чем у животных 2-й группы. У животных 3-й группы неспецнфические показатели занимали среднее положение по сравнению с показателями животных первых двух групп и достоверно не отличались ни от тех, ни от других. У животных 4-й группы нсспецифические показатели вообще не изменялись в процессе иммунизации. Таким образом, ретроспективный анализ данных позволил выделить 4 группы животных в зависимости от степени выраженности поствакцинального иммунитета.

Подобные результаты получены нами при иммунизация б обезьян Macaca Mulatta тон же дозой препарата и по той же схеме. Представленные на рис. 1(В) данные свидетельствуют о том, что у пяти из шести иммунизированных обезьян развила; специфический гуморальный ИО у одних в большей, у других в меньшей степени. У трех из них по всем исследуемым параметрам не было достоверных различий, что позволило объединить их в одну группу. Животное 6, не ответившее на иммунизацию . также 2 контрольных животных, иммунизированных препарат срзЕпешш, были отнесены в другую, неиммуннук> группу. Обет ¡ы 4 И 5 по своим показателям не попадали ни в ту, ни в друг груявы.

0 3 7 14 17 21

Врс^я ГЮСЛО гЛЖиХ^ЗЗЦИМ (сутки)

Группа 4 (К=2) —л—Группа 2 (N=5)

-Группа 1 (N=10) -Группа 3 (N=7)

Ркс.3 Изменение показателей кеспецифического иммунитета у морских саикок после иьшукизации их инактивированным препаратом вируса Марбург.

Представлены средние значения. Коэффициент вариации по всем параметре?,« < 10%. * обозначает достоверность различий показателей животных 1 и 2 групп (р<0,05).

В РБТЛ (рис. 4) у 5-ти сенсибилизированных животных обнаружено увеличение ИС на специфический А Г, что свидетельствовало о развитии специфического клеточного ИО. ИС в ответ на СопА снижался у них к 21 сут. Это говорит о снижении функциональной активности лимфоцитов.

Как видно из представленных на рис. 5 данных по неспецифическим показателям ИО, у 5-ти обезьян отмечалось увеличение активности НК и ИФН на 1-5 сут как после первой, так и после второй иммунизации. Причем интенсивность изменения этих показателей у обезьян 1-3 была ниже, чем у остальных животных. Показатели ФИО после иммунизации у всех опытных животных практически не изменялись.

При изучении динамики изменения количества лимфоцитов CD4 и CD8 (табл.3) установлено, что эти показатели в динамике изменяются совершенно индивидуально, однако, у "Всех обезьян, за исключением пятой, к 21 суткам возросло количество CD8 лимфоцитов. Возможно, это произошло за счет фракции Т-супрессоров, что объясняет снижение ИС в РБТЛ в ответ на митоген у этих животных. У шестой обезьяны и обезьян контрольной группы, иммунизированных препаратом сравнения, эти показатели не изменялись.

Таким образом, при изучении формирования поствакцинального иммунитета было установлено, что при введении ИПМ происходит изменение показателей как специфического, так и неспецифического иммунитета, однако, не все животные реагируют одинаково на введение антигена.

Для изучения влияния поствакцинального иммунитета на течение и исход заболевания после заражения мы в дальнейшем заражали иммунных животных активным вирусом Марбург и проводили контроль за иммунными параметрами. Для этого 16 иммунных морских свинок с одинаковыми показателями специфического, но с разными уровнями неспецифического иммунитета (1 и 2 группы из

/X

60

55

. . 50

..»5 о

40 Г х

" I t30 5

■ 25 g . 20 15 10

О 5 7 10 I» 21 28 Время после иммуюпати (супси)

Н Марбург ■ г »СопЛ -

/

'4 0 .

0 5 7 10 14 21 28 Время после ишунииюш (сутан)

I Марбург

СепЛ

-СП

0 5 7 10 14 21 28 Время после кммуннтш (сулеи) ■ Марбург I IC'onA ^•■"СП

60

55

50

15 п

я

40

к

15

30 я

25 О О

20

15

10

,0 5 7 10 14 21 28 Время после жмумоадон (суткн)

I Марбург

Сеж А

•CII

Обеэ. N I I

I )ñci. N 4

2.0

Рис. 4 СП и ИС в ответ на специфический АГ и Соп А лимфоцитА обезьян, иммунизированных инактивированным АГ вируса Марбург. Представлены средние значения. Коэффициент вариации для СП <10%, для уС < 6%. * обозначает достоверность различия с исходными показателями (р< 0,05).

Время после иммунизации (сугки)

Время после иммунизации (сутки)

Ш> 06и. N6-8 —о— Обез. N1-3 —л -Обм. N 4 —Обоз. N 5

Рис.5 Изменение показателей неспецифического иммунитета у о-.^ьян после иммунизации их инактивированным препаратом вируса Марбург. Представлены средние значения. Коэффициент вариации по обоим параметрам <15%. * обозначает достоверность различий показателей животных :-3 по сравнению с показателями животных 4 и 5.

Таблица 3.

Количество лимфоцитов, несущих маркеры CD4 и CD8 (%), у обезьян, иммунизированных инактивированным препаратом вируса Марбург.

Обезьяны Рецептор Дни после з а р а ж е н и

0 5 7 10 14 21 28 32

i CD4. 19 16 24 33 36 20 16 12*

CD8 9 12 8 13 16 16 10 13

CD4/CD8 2.1 1.3 3.0 2.5 2.3 1.3 1.2 1.3

2 CD4 36 30 37 25 28 24 1-1 16*

CD8 10 12 12 14 10 ¡9* 10 8

CD4/CD8 3.6 2.5 3.1 1.8 2.8 1.3 1.4 2.0 ,

3 | CD4 30 34 23 20 ' 24 34 16 18*

CD8 10 15 19 19 18 22* 16 13

CD4/CD8 3.0 2.3 ¡1.2 1.1 1.3 1.5 1.0 1.2

4 CD4 19 20 ! 15 1 21 24 14 12 13*

I CD8 9 13 ;ю 10 8 14* 14 10 •

CD4/CD8 2.1 1.5 1.5 2.1 3 1.0 0.8 1.3

5 CD4 34 22 26 29 28 20 12 13*

CD8 20 р 19 20 12 16 18 18

CD4/CD8 1.7 1.3 1.4 i.5 2.3 ;.з 0.7 0.7

6 CD4 20 26 24 26 24, ' 18 12 14*

CD8 10 9 15 15 12 8 9 8

CD4/CD8 2.0 3.2 1.6 1.7 2.0 2.3 1.7 1.8

* - обозначает достоверность разлитой по сравнению с исходными

показателями (р<0,05).

предыдущего эксперимента) на 28 сут после иммунизации были заражены в/б летальной дозой 10ЛД50 вируса Марбург. Контрольные животные предварительно были иммунизированы по той же схеме препаратом сравнения и их заражение активным вирусом проводили одновременно с иммунными животными. В результате заражения животные 1й группы выжили, животные 2й и Зй (контрольной) групп -погибли. Причем, СПЖ иммунных погибших животных была ниже, чем у контрольных.

Следует отметить, что у животных первой группы титр вирусспецифических АТ (Рис. 1(С)) увеличивался более интенсивно, чем у животных второй группы, и уже на 3 сутки превосходил аналогичный показатель у животных второй и контрольной групп. Однако, АТ, определяемые методом ИФА, не обладали вируснейтрализующим действием в реакции нейтрализации на животных. Рис. 6 представляет данные по пролиферативной активности лимфоцитов. СП у выживших животных 1 группы не изменялась в течение всего срока наблюдения. При этом не выявлено снижения ИС в ответ на специфический антигеном или митоген. У животных второй группы спонтанная пролиферация достоверно увеличивалась к 3-м суткам и продолжала нарастать вплоть до момента гибели. У них же отмечено снижение ИС как на инактивированный антиген, так и на митоген. Аналогичная картина наблюдалась и у животных контрольной группы.

Анализ данных неслецнфнческнх показателей иммунного ответа (рис.7) показал абсолютно различную динамику изменений этих параметров у выживших и погибших животных. Из графика видно, что значения ФНО и ИФН в 1-е сутки после заражения у животных первой группы превосходили аналогичные показатели у животных второй и контрольной групп . С 5-х суток эти показатели постепенно снижались, приближаясь к исходным к концу наблюдения (10 сутки).

Груши I (вмжклн)

Группа 2 (П 1Ж=7.|)

16.0 14.0 • . 12.0 . . 10,0 Я.О 6.0

и-» I

X

) 1 5 5 7 10 Врой после лара*гшм (су-туи)

■ Марбург 1 л

О I } 5 7 10 Врсыя после мрамнмя (сутки) Ш Марбург — а ^ ; -

4.0

Группа 3(СПЖ=8.3)

0 I 3 5 7 ю Прсыя после мрахсюя (сутки)

I Марбург

СопА

Рис. 6. СП и ИС в ответ на специфический антиген и СопА лимфоцитов иммунны морских свинок, зараженных вирусом Марбург.

Представлены средние значения. Коэффициент вариации для СП < 15%. для ИС <7%. обозначает достоверность различий показателе* по сравнению с исходными (р<0,05).

О 1 3 5 7 10 Время после инфицирования (сутки)

— Группа 1 -о- Группа 2 —•— Группа 3

Т=»Н-1-1-н

0 13 5

Время после инфицирования (сутки)

Групп* 1 л Группа 2

Группа 3

Время после инфицирования (сутки) Группа 1 (выжили) -Ь- Гр^„ » 2<С ПЖ=7.1) —•—Группе 3 (СПЖ=>8 3)

Рис.7 Измененне показателей неспецифического иммунитета у иммунных морских свинок после заражения их вирусом Марбург. Представлены средние значения. Коэффица*ит вариации по всем параметрам <- 15" о. обозначает достоверность различий показателей животных 1 группы по сравнению с показателям» животных 1 н 3 групп.

Абсолютные показатели ФНО, ИФН. НК у животных второй и третьей групп, напротив, нарастали медленнее, однако, к 7-м суткам превосходили аналогичные показатели первой группы, достигая своего максимума на момент гибели . Необходимо отметить, что у погибших иммунных животных абсолютные значения ФНО и ИФН к 7-м суткам после заражения были выше, чем у контрольных. Таким образом, несмотря па одинаковые поствакцинальные уровни специфического НО исход заболевания у морских свинок 1 и 2 групп оказался прямо противопо южным.

После шрчжения иммунных обезьян вирусом Марбург в дозе 200 ЛД50 ятя морских свинок обезьяны 1-3 выжили, а 4, 5. 6 и две контрольные (N7 и 3) обезьяны - погибли. При этом гибель 5-Й обезьяны наступила раньше, чем животных контрольной группы.

При анализе изменении гуморального иммунитета (Рис. 1 (И>)) отмечено увеличение ип^ов вируссасиифических ЛТ у пыливших обсчьян. Однако, эти ЛТ не осматин пируснейтрализующей активностью. У погибших животных пгм.к >"а А Г не наблюдалось. В РБ'ГЛ (рис. 8) у трех живсчных I т руппы ре выявлено изменения ИС в ответ на митоген и специфический ачтиге;: . значения спонтанной пролиферации увеличивались на 1-5 сутки, затем возвращались к исходным значениям. Рашггие инфекции ■ погибших животных сопровождалось увеличением спошаннои кл-чочной пролиферации, которая достигала своею максимума па сутки, в это же время отмечалось снижение ИС в ответ на митоген и специфический антиген.

Динамика изменений показателей неспецифического ИО у выживших 1 ,2 и 3 обоьян (рис.9) отличалась от таковой у других животных . Так, максимальные значения этих показателей у них были на 1-3 сутки после заражени > потом снижались и к 7-9 суткам возвращались к исходным. У погибших обезьян эти показатели изменялись совершенно по-другому. «Здесь значения ФНО, ИФН, НК

Группа 1 (Обет. N 1-3)

Обс1. N 4

10,0 8,0 ■• 6,0 ■ •

I

: 4,0 2,0 0,0

т 140

■ 130

■ 120

■■•110 О

■■ 100 а

■•90 5

-80 а

■■70 £

■•60 ■50 Я

■ 40 о о

■-30

■■20

10

О 1,3 5 7 10 Время после нммунтаиии (сутки) ^ИМарбур! СЗСоп Л • СП

О 5:

ю.о т 8,0 6,0 4,0 ■■

т«

0,0

щш

л

т 140

■■ 130

-■ 120

■ ■ по О

■ ■ юо я

• 90 7

-•80 а

-■70 5

■•60 X

••50

- • 40 С! о

•■30

•■20

-■ 10

О 1 3 5 7 10 Время после имму шпации (сутки)

■■Марбург ЕГЭСоп А —•—СП

Об«. N 5

Группа 2 (Обе!. N 6-8)

т 140 •- 130 120 ■■110п ■ • юо а

.-90 2 •■80 ? --70

4,0 ■■ 2,0 •{-, 0,0

" 0 1 3 5 7 10 Время после иммунизации ■Ж Марбург А * СП

0 1 3 5 7 10 Время после иммунизации (сутки)

■М Марбург СЖШСоп А • СП

Рис. 8 СП и ИС в ответ на специфический АГ и СопА лимфоцитов иммунных обезьян в РБТЛ после заражения.

Представлены средние значения. Коэффициент вариации для СП < 15%, для ИС< Т/о.* обозначает достоверность отличия показателей по сравнению с исходными (р<0,05).

\

Время поел* инфицирования (сутки) 8р«мя после инфицирования (сутки)

Время посла инфицирования (сутки) СГТ3306.Ы6-8(СПЖ=10.5) —О—Об. N1-3 (выжили) —А —Об.N4 (9) —»—Об.N5 (8)

Рис. 9 Изменение показателей неспецифического иммунитета у иммунных обезьян после заражения их вирусом Марбург (в скобках - день гибели).

Представлены средние значения. Коэффициент вариации для всех параметров < 15%. * обозначает лостоверность различий показателей жизотных 1-3 по сравнению с остальными.

возрастали на всем протяжении ннфекцни, достигая своего максимума на 5-7 сутки, т.е. к началу проявления клинических симптомов заболевания. Необходимо отметить, что уровень цитокинов в 1-2 сутки после заражения у вьшивших животных был выше, чем у погибших, а у погибшей раньше других иммунной обезьяны N5 предельно высокий уровень цитокинов наблюдался в более ранние сроки, чем у других.

Анализ изменения количества лимфоцитов CD4 и CD8 (табл. 4) показывает, что у погибших обезьян увеличение количества лимфоцитов CD8 произошло к 7 суткам после заражения одновременно со снижением ИС в РБТЛ. Эти данные могут косвенно свидетельствовать об активации в этот период Т-супрессоров. Таким образом, наши данные свидетельствуют, что динамика изменений иммунных показателей после заражения активным вирусом Марбург различна у выживших и погибших животных. Если у выживших животных активация неспецифических параметров происходит на 1-3 сутки после заражения, а потом возвращается к исходным значениям, то у погибших эти показатели растут на более поздние сроки (4-5 сутки) и продолжают нарастать вплоть до момента гибели. Возможно, усиление неспецифического иммунитета на ранних сроках после заражения сыграло свою положительную роль в предотвращении размножения вируса в организме. Затем, вероятно, свою роль в защите играют и специфические AT, которые возрастают в динамике у выживших морских свинок и обезьян.

Исходя из полученных нами данных можно предположить, что формирование специфического протективного иммунитета против ВМ возможно, однако реакция иммунной системы организма как на инактивированный антиген, так и на живой вирус внутри гетерогенной популяции неоднородна. Проявление протективного иммунитета у зараженных животных, вероятно, зависит от динамики определяемых нами иммунных показателей как в процессе иммунизации, так и после

Таблица 4.

Количество лимфоцитов, несущих маркеры CD4 и CD8 (%) у иммунных обезьян после заражения их вирусом Марбург.

Обезьяны Рецептор Дни после заражен и

0 1, 3 5 7 9

1 CD4 16 26" 26* 23 20 15

CD3 13 20* 19* 18 10 9

CD4/CD8 1.2 1.3 1,3 1.3 2.0 1.7

2 CD4 15 28* 28* 20 15 15

CD8 8 19* 19* 14 14 9

CD4/CD3 2.0 1.5 1.5 1.4 1.1 1.7

3 CD4 18 26* 24* 20 20 20

CD8 13 14* 25* 23 18 12 .

CD4/CD8 1.5 1.1 1.0 0.9 1.1 1.7

4 CD4 13 16 16 18 18 10

CD8 10 10 10 13 20* 18

CD4/CD3 1.3 1.6 1.6 1.4 0.9 0.5

5 CD4 13 16 17 16 20

CD8 18 10 10 15 26*

CD4/CD8 0.7 1.6 1.7 1.1 0.8

6 CD4 14 14 16 18 18 12

CD8 18 10 9 15 27* 18

CD4/CD8 0.8 ¡.4 i.8 1.2 0.7 0.7

7 CD4 ¡8 20 18 18 17 15

CD8 10 Г 7 10 19* 19

CD4/CD8 1.8 4.8 23 1.8 0.9 0.8

8 CD1 26 16 16 14 14 12

CD8 16 10 8 14 16 19

CD4/CD8 1.6 1.6 2 1.0 0.9 0.6

* - обозначает досгсгерность различий по сравнению с исходными показателями (р<0,05).

заражения. Поэтому традиционные методы оценки протективности препарата в данном случае недостаточны и требуют дальнейшей доработки.

Несомненно, что для борьбы с геморрагическими лихорадками важно отрабатывать не только профилактику, но и способы лечения этих заболеваний.

Как показывают наши результаты, экспериментальная ГЛМ у морских свинок сопровождается значительным повышением ФНО на 5-7 сутки после заражения. Кроме того, из данных литературы известно, что в клинике эндогенного шока, который наблюдается при геморрагических лихорадках, важную роль играют цитокины ФНО и ИЛ-1. Можно предположить, что влияя на активность ФНО при экспериментальной ГЛМ, можно влиять и на течение инфекционного процесса. На рис.10 представлены результаты изучения влияния анти-ФНО сыворотки на течение экспериментальной ГЛМ у морских свинок при заражении их летальной дозой вируса (10 ЛД50). Анти-ФНО сыворотку вводили на 4, 5, 6. 7 сутки.

Из рис. 10 видно, что лечение данной дозой анти-ФНО сыворотки, привело к 50% защите морских свинок от летальной дозы ВМ. Кроме того, средняя продолжительность жизни погибших леченных морских свинок превышала среднюю продолжительность жизни контрольных животных. Это происходило на фоне снижения концентрации ФНО в сыворотке крови леченных животных.

Аналогичный эффект наблюдался при изучении влияния препарата десферал на течение экспериментальной ГЛМ у морских свинок (рис. 11). Согласно литературным данным ДФО является антагонистом ФНО и ИЛ-1. Десферал вводили по той же схеме, что и анти-ФНО сыворотку, в дозе 5 мг/животное. В этом эксперименте также происходило снижение ФНО в сыворотке крови, при» этом наблюдалась 50% защита зараженных леченных животных и удлинение

0 1 7 10

Срок после заражения (сут)

О Группа 1 (СПЖ=7,в) В Группа 2 (СПЖ=9,0) □ Группа 3 (выжили)

Группа 1-контроль (N=6)

Группа 2 - животные, печенные анти-ФНО сывороткой (N=3) Группа 3 - животные, леченные анти-ФНО сывороткой (N=3)

Титр вируса на 7 сут 5.7+0.518 БОЕ/МЛ 5.4+0.41« БОЕ /ил 5.0+0.4 БОЕ /мл

Рис. 10 Концентрация ФНО в сыворотке крови зараженных вирусом Марбург (10ЛД50) морских свинок после лечения анти-ФНО сывороткой

Срок после заражения (сут).

■ Группа 1 (СПЖ=7.5) ■ Группа 2 (СПЖ=8.6) □ Группа 3 (выжили)

Титр вируса на 7 сут

Группа I - контроль (N=6) 5.9+0.4 lg БОЕ/мл

Группа 2 - животные, леченные ДФО (N=3) 5.5+0.5 БОЕ /мл

Группа 3 - животные, леченные ДФО (N=3) 4.8+0.4 БОЕ /мл

Рис. 11 Концентрация ФНО в сыворотке крови зараженных вирусом Марбург (10 ЛД50) морских свинок после лечения ДФО

средней продолжительности жизни леченных погибших животных. Эти результаты подтверждают значительную роль ФНО в патогенезе экспериментальной ГЛМ и позволяют заключить, что выбор средств лечения при этом заболевании должен основываться не только на оценке противовирусной активности препарата, но и на его влиянии на показатели иммунитета, которые играют важную роль при этих инфекциях.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана оригинальная технология получения концентрата вируса Марбург, обладающего иммуногенной и протективной активностью" (Приложение к диссертации - Патент РФ 1Ш 2029561 С1, Россия, 1995).

2. Получен концентрированный инактирированный препарат вируса Марбург, аттестованный согласно регламентирующим документам подкомитета. по МИБП (ФС 42-344 ВС-90) и Фармкомитета РФ. Препарат обеспечивает ИР у иммунных морских свинок не ниж4 2 при дозе иммунизации 7 мкг на животное и схеме иммунизации -двукратно, через 14 суток.

3.. Впервые показано, что иммунизация препаратом инактивированного вируса Марбург приводит к формированию специфического клеточного и гуморального иммунного о+вега у морских свинок и обезьян. Введение инактивированного препарата вируса Марбург этим животным активирует продукцию цитокинов (ФНО и ИФН) и повышает активность натуральных киллеров.

4. Впервые установлено, что развитие экспериментальной лихорадки Марбург у морских свинок и обезьян после введения летальных доз вируса сопровождается повышением активности сывороточного ИФН, ФНО, НК на 3-5 сутки после заражения. Рост этих параметров продолжается до момента гибели животных.

-285. Впервые показана различная динамика изменений сывороточного ИФН, ФНО и активности НК у выживших и погибших иммунных животных после заражения их летальной дозой вируса Марбург. У выживших морских свинок и обезьян рост этих параметров происходит на 1-2 сутки после заражения, затем их активность снижается и возвращается к исходным значениям на 7-9 сутки наблюдения. У погибших животных показатели сывороточного ИФН, ФНО и активности НК увеличиваются с 3-х суток после заражения и растут до момента гибели.

6. На основе полученных нами данных о росте концентрации ФНО в сыворотке крови морских свинок в процессе развития лихорадки Марбург впервые предложена и экспериментально показана возможность патогенетического лечения этого заболевания у морских свинок препаратами-антагонистами ФНО - дссфералом (ДФО) и анти-ФНО сывороткой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А. Агафонов А.П., Кузьмин В.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам. //Вопросы вирусологии, 1991. N 2, С. 421-423.

2. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Чувствительность культур клеггок различных линий к вирусу Марбург.//Вопросы вирусологии, 1991. N 5. С. 437-438.

3. Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Чепурнов А.А., Прозоровский Н.С. и др. Влияние индуктора интерлейкина 2 диуцифона на течение геморрагической лихорадки, вызываемой вирусом Марбург. //В кн: "Интерферон-92", М. 1992 г.

4. Ignatyev G.M., Agafonov А.Р., М.А. Streltsova, S.V. Netesov. Study of immunological properties ofinactivated Marburg virus.// Abstracts IXth

Intemational congress of virology.- Glasgow Scotland.- 1993,- Р52-6,- p. 300.

5. Agafonov A.P.. M.A. Streltsova. Kashentseva L:.A., G.M. Ignatyev. Possible mechanism of immunosuppression for filoviruses infection. //International Journal of Immunorehabilitation. N1, Supp. 1994

6. Игнатьев Г.М., Стрельцова M.A., Агафонов А.П., Жукова Н.А.. Кашенцева Е.А., Воробьева М.С. Некоторые показатели иммунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, после заражения гомологичным вирусом. //Вопр.вирусол.. 1994, N 1, с.13-17.

7. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Прозоровский Н!С„ Жукова Н.А., Кашенцева Е.А.. Воробьева М.С. Иммунологические показатели у морских свинок прп моделировании геморрагической лихорадки Марбург. //Вопр.вирусол.. 1994. N 4 или 5, с. 169-171.

8. G.M.Ignatjev, M.A.Streltsova. S.A.Kaliberov. A.P.Agafonov, E.A. K.ashentse\a, I.V.Patrusheva. L.S.Sandakhchiev. " The possibility of development of inactivated vaccines against haemorrhagic fever. "New approaches of vaccine Development". Vienna. 11-14. 04.95.

9. Игнатьев Г.М.. Стрельцова M.A.. Агафонов А.Г1.. Кашенцева E.A. Механизмы протективного иммунного ответа при моделировании лихорадки Марбург на обезьянах. //Вопр.вирусол., 1995, N 3, с. 109113.

10. Ignatyev G.M.. Agafonov А.P., Streltsova М.А., Kashentseva E.A. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys.//J. of Biotechnology.- 44. 1996, P. 111-118.

11. Патент РФ RU 2029561 CI (Россия) (1995). Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью ./НПО

"Вектор"; авт. йзобрет. Агафонов А.П., Стрельцова М.А.. Игнатьев Г.М. и соавт. Заявл. 14. 10.91. N 5004595/14.

12. Ignatyev G.M.. Streltsova М.А., Agafonov А.P., Kashentseva E.A. Immunity indeces in the personnel involved in Marburg virus investigation. //Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.-1996-Vol. 90,-N 5.-p. 471.

• 13. Игнатьев Г.М., Стрельцова M.A., Агафонов А.П., Кашенцева Е.А., Прозоровский Н.С. Экспериментальное изучение возможности лечения геморрагической лихорадки Марбург десфералом, рибавирином и гомологичным интерфероном.// Вопр.вирусол., 1996, N 5. с. 206-209. -

14. Ignatyev G.M., Streltsova М.А., Kashentseva Е.А., Patrushev N.A., Ginko S.I., Agafonov A.P. Immunity indeces. in the personnel involved in haemorrhagic virus investigation. In book: Proceedings of the 1996 ERDEC Scientific Conference on Chemical and Biological Defense Research. Ed. D. A.Berg, 1997., Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5423. P. 323-330.

9

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стрельцова, Марина Алексеевна, Кольцово

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ "ВЕКТОР" НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Стрельцова Марина Алексеевна

Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург.

03.00.06 - Вирусология.

Научные руководители: кандидат мед. наук Г.М. Игнатьев доктор медицинских наук проф. Воробьева М.С.

ТОЙ 1

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список использованных сокращений ................................................5

Введение..................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................15

1.1 Эпидемиология, клиника и патогенез вирусной лихорадки Марбург............................................................................................15

1.2 Особенности состояния иммунной системы при геморрагических лихорадках.......................;........................21

1.2.1 Гуморальный ответ при вирусных геморрагических лихорадках ......................................................................................21

1.2.2 Роль клеточного звена иммунного ответа при вирусных геморрагических лихорадках................................................24

1.2.3 Некоторые иммунопатогенетические аспекты развития вирусных геморрагических лихорадок................................2?

1.3 Формирование иммунитета при вакцинации против вирусных инфекций..............................................................................35

1.4 Профилактические препараты против вирусных геморрагических лихорадок........................................................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................43

2.1. Материалы....................................................................................43

2.2. Методы..........................................................................................47

2.2.1. Культивирование вируса......................................................4?

2.2.2. Получение антигена вируса Марбург................................48

2.2.2.1 Концентрирование и очистка вируса.............................49

2.2.2.2. Определение инфекционной активности ви-

о <С

русной суспензии.............................. 50

2.2.2.3 Определение биологической активности вируса методом негативных колоний ..................... 51

2.2.2.4. Инактивация вируса............................ 53

2.2.2.5. Определение концентрации специфического белка. 53

2.2.2.6. Определение специфической безвредности инакти-вированного препарата вируса Марбург.......... 53

2.2.2.7. Определение протективной активности инактиви-рованного препарата вируса Марбург..............54

2.2.2.8. Методы физико-химической характеристики инак-тивированного препарата вируса Марбург...........55

2.2.3. Методы иммунологической характеристики инактиви-рованного препарата вируса Марбург.................56

2.2.4. Статистическая обработка результатов...............62

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ИНАКТИВИРОВАННОГО КОНЦЕНТРИРОВАННОГО ОЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ВИРУСА МАРБУРГ.......................64

3.1. Получение препарата................................ 64

3.2. Инактивация препарата................................68

3.3. Проверка препарата на специфическую безвредность.....69

3.4. Оценка протективных свойств препарата на животных... 69

ГЛАВА 4. ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ИНАКТИВИРОВАННОГО ВИРУСА

МАРБУРГ...................................................75

4.1. Изучение динамики развития гуморального и клеточно го иммунитета после иммунизации морских свинок инак-тивированным препаратом вируса Марбург...............78

4.2. Изучение динамики развития гуморального .и клеточного иммунитета после иммунизации обезьян инактивирован-ным препаратом вируса Марбург........................88

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА У ЖИВОТНЫХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ИНАКТИВИРОВАННЫМ ПРЕПАРАТОМ ВИРУСА

МАРБУРГ, ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ ИХ ГОМОЛОГИЧНЫМ ВИРУСОМ..........98

5.1. Некоторые показатели иммунитета у морских свинок, иммунизированных инактивированным препаратом вируса Марбург после заражения..............................99

5.2. Некоторые показатели иммунитета у обезьян, предварительно иммунизированных инактивированным препаратом вируса Марбург, после заражения......................112

•• ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА ИЛ-2 НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА

ПРИ РАЗВИТИИ ЛИХОРАДКИ МАРБУРГ У МОРСКИХ СВИНОК...........125

ГЛАВА 7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ

ИНФЕКЦИИ МАРБУРГ У МОРСКИХ СВИНОК.........................133

7.1. Изучение эффективности лечения экспериментальной лихорадки Марбург у морских свинок препаратами ри-бавирин и интерферон.................................134

7.2. Изучение эффективности лечения экспериментальной лихорадки Марбург у морских свинок препаратом дес-ферал................................................135

7.3. Изучение эффективности лечения экспериментальной лихорадки Марбург у морских свинок анти-сывороткой

к ФНО-альфа человека................................137

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................142

Выводы....................................................159

Список использованной литературы..........................161

Список использованных сокращений

АГ - антиген АТ - антитела

БОЕ - бляшкообразующая единица "ВСА - бычий сывороточный альбумин ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечны синдромом ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия ДФО - дефероксамин ИЛ-1 - интерлейкин-1 ИЛ-2 - интерлейкин - £ ИЛ-6 - интерлейкин - 6 МО - иммунный ответ ИР - индекс резистентности ИС - индекс стимуляции ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон Кон А - конканавалин А

КГЛ '*- Конго-крымская геморрагическая лихорадка

ЛЛ - лихорадка Лаоса

ЛХМ - лимфоцитарный хориоменингит

МЗ - множественность заражения

МА - моноклональные антитела

НК - натуральные киллеры

ОЗМЧ - острый энцефаломиелит человека

ПААГ - полиакриламидный гель

РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов РД- регламентирующий документ РНК - рибонуклеиновая кислота СП - спонтанная пролиферация

ЧСШ - средняя продолжительность жизни павших животных ТИФА - твердофазный кммуноферментный анализ ТЦПД50 - 50%, тканевая цитолатогенная доза ФГА - фитогемагглютинин ФНО - фактор некроза опухоли ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты ELAM-1 - endothelial leucocyte adhesion rnolecule-1 IgG - иммуноглобулин G Igfvl - иммуноглобулин M IL-Ira - антагонист рецептора ИЛ-1

МНС - Major Histocompatibility Complex (главный комплекс гистосовместимооти)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Лихорадка Марбург представляет собой острое высококонтагиозное заболевание, протекающее тяжело, с вы-4 сокой летальностью (22-33%) 111.

Можно предположить, что природный резервуар вируса находится на территории Африки [2,3,4]

Расширение международных связей создает возможность проникновения вируса Марбург и других особоопасных вирусов на неэндемичные территории как с человеком, так и с импортируемыми лабораторными животными [51. Высокая контагиозность заболевания, вызываемого вирусом Марбург, возможность заноса возбудителя этой лихорадки на неэндемичные территории, безопасность персонала, работающего с вирусом, требуют всестороннего изучения иммунопатогене-за заболевания и разработки средств профилактики. Одним из таких средств может являться вакцина. Работы по разработке инактивиро-ванной вакцины против представителя семейства ШоуШбае - вируса Эбола, проводимые Ьир1оп и соавторами [6] в начале 80-х годов, закончились неудачно. Этот препарат снижал остроту лихорадки в группе вакцинированных животных, однако полной защиты от клинических проявлений инфекции на экспериментальной модели не было. Авторы считали, что неудовлетворительные результаты связаны с недостаточной концентрацией антигена в вакцинной дозе. Однако, совершенствование технологии культивирования филовирусов, как и методов их очистки, не привели к появлению публикаций относительно дальнейшего тестирования данной вакцины. Одним из объяснений неэффективности этого препарата является то, что инактивация фор-

малинам вызывает сильное уменьшение антигенности поверхностных белков вируса [6]. Поэтому были предприняты попытки получить инактивированную вакцину на основе гамма-облученного вируса [73. Клиническое течение заболевания после заражения животных (обезь-ян-резус), вакцинированных данным препаратом, и контрольных животных, было идентичным в обеих группах. Наблюдалось непродолжительное подавление виремии у иммунных животных, однако титры вируса в крови и органах у этих животных и животных контрольной группы в терминальной стадии инфекции были одинаковыми. По мнению авторов сомнительна возможность индукции иммунитета с помощью инактивированных препаратов вируса Эбола. Таким образом, все выше сказанное свидетельствует об актуальности разработки вакцинных препаратов против филовирус-ных инфекций, в том числе и геморрагической лихорадки Марбург.

Совершенствование требований к аттестации вакцинных препаратов, отраженных в РД 42-28-8-89, определяет подробное изучение на этапе доклинических исследований специфической активности, токсичности, влияния на ЦНС, аллергизирующих свойств, иммунологической безопасности. В то же время РД 42-28-8-89 регламентируют изучение вакцинных препаратов на интактных животных, не учитывая изменения в иммунном организме после заражения. Рост требований, предъявляемых к вакцинным препаратам и, прежде всего, к безопасности и эффективности вакцин, определили концепцию изучения вакцин, сформулированную на Конференции по безопасности и эффективности новых поколений вакцин (Лиль, ноябрь 1992). Одним из постулатов этой концепции является то, что вакцина не должна обладать потенцирующим заболевания эффектом (это понятие включает не только активацию в ответ на иммунизацию хронических инфекций, но и

протекание специфического заболевания у привитых с более тяжелой клинической картиной, в отличии от непривитых), а так>же изучение эффективности вакцины с учетом особенностей иммунопатогенеза инфекции.

Некоторые данные о патогенезе геморрагических лихорадок, в 4 том числе лихорадки Марбург, позволяют предположить, что создание эффективных профилактических препаратов против этих инфекций невозможно без учета влияния некоторых факторов иммунитета на течение и исход заболевания.

В настоящее время опубликован^ ряд работ, информирующих об участии клеточного иммунитета в защите от инфекций, вызванных вирусами геморрагических лихорадок, которые показывают важность этого звена иммунитета на самых ранних стадиях инфекции. Например, высокая и стойкая виремия на фибрильной стадии заболевания, задержка выработки нейтрализующих антител и одновременное наличие как вируса, так и специфических антител при лихорадке Ласса свидетельствовали о том, что смертельный исход этого заболевания может быть результатом выраженного дисбаланса функций клеточного иммунитета [8].

Существуют данные, что Т-клеточное звено играет, скорее, негативную роль при заражении новорожденных мышей вирусом Хунин. Так, в результате тимусэктомии и вливания антитимоцитарной сыво-

•у

ротки уменьшались тяжесть клинических проявлений и число погибших мышей-сосунков, инфицированных вирусом Хунин. У выживших тимусэк-томированных животных вирус размножался в мозге в таких же титрах, что и у контрольных, что свидетельствовало об иммунологической (Т-клеточной) основе неврологических симптомов зараженных животных С9].

Необходимо отметить, что традиционные подходы к оценке поствакцинального иммунитета при использовании профилактических препаратов не всегда учитывают подобное влияние инфекционного агента на клетки иммунной системы. Об эффективности вирусных вакцин часто судили по показателям гуморального иммунитета у привитых. Однако показано, что некоторые вирусы геморрагических лихорадок могут инфицировать моноцитарные клетки in vitro [103. Добавление же к культуре клеток специфической сыворотки вызывало резкое усиление репликации вируса в этих клетках. Подобный эффект in vivo вызывали моноклональные антитела к вирусу желтой лихорадки, когда выживаемость животных, обработанных перед заражением неспецифическими моноклональными антителами, была значительно выше, чем в группе, получившей специфические моноклональные антитела СИЗ.

Известно, что при вирусных геморрагических лихорадках, в том числе лихорадке Марбург, огромное значение имеет ДВС-синдром, который является причиной геморрагий [12,133. Он всегда связан с нарушением гемостатических функций эндотелиальных клеток [14,103. Эти функции могут нарушаться некоторыми иммунными медиаторами, такими как ИЛ-1, ФНО и ИНФ, выработка которых усиливается при вирусных инфекциях и которые обладают широким спектром действия на эндотелиальные клетки и способствуют разрушению стенок сосудов [15,16,173.

Таким образом, сложность иммунопатогенеза геморрагических лихорадок не вызывает сомнения. Создание профилактических и лечебных препаратов без учета этих фактов невозможно. Поэтому одной из основных целей нашей работы было изучение изменений иммунологических показателей у животных, чувствительных к вирусу Марбург, при развитии у них геморрагической лихорадки, вызванной этим ви-

русом. На этом этапе важно было определить те параметры, которые в большей степени влияют на течение и исход заболевания.

Очевидно, что для заболеваний с таким сложным иммунопатоге-не^ом, как лихорадка Марбург и другие геморрагические лихорадки, не приемлем традиционный подход к оценке эффективности поствакцинального иммунитета (РД 42-28-10-90). В связи с этим нами были изучены изменения иммунного ответа после иммунизации животных инактивированным препаратом вируса Марбург, а также влияние показателей поствакцинального иммунитета на течение и исход заболевания после заражения иммунных животных гомологичным вирусом. В процессе этого мы попытались определить вклад неспецифических факторов иммунитета в защиту иммунного организма от заражения летальными дозами вируса.

Вирусные геморрагические лихорадки, некоторые из которых распространены в России и во всем мире (ГЛПС, КГЛ и др.) [183, несомненно, имеют общие звенья развития заболевания, в который вносят свой вклад гуморальные и клеточные факторы иммунитета. Изучение иммунопатогенеза лихорадки Марбург, предпринятое нами, важно как для получения ясной патогенетической картины развития геморрагических лихорадок, так и для разработки эффективных средств профилактики и лечения.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования было определение подходов к созданию протективного инактивирован-ного препарата вируса Марбург, оценки его иммуногенных свойств, изучение иммунопатогенеза экспериментальной лихорадки Марбург у иммунизированных этим препаратом животных, а также исследование возможности лечения этого заболевания в эксперименте.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Получение инактивированного препарата вируса Марбург.

2. Оценка протективных и иммуногенных свойств инактивированного препарата вируса Марбург.

3. Исследование динамики изменения иммунологических показателей у животных при моделировании лихорадки Марбург.

4. Изучение показателей неспецифического и специфического иммунного ответа у животных, иммунизированных инактивированным препаратом вируса Марбург, после заражения их гомологичным вирусом.

5. Изучение возможности лечения экспериментальной лихорадки Марбург некоторыми противовирусными препаратами и препаратами- антагонистами фактора некроза опухоли.

Научная новизна.

Показано, что иммунизация животных инактивированным препаратом вируса Марбург приводит к формированию специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. Исследование иммуногенных свойств инактивированного препарата вируса Марбург на морских свинках и обезьянах позволило установить различную динамику изменений показателей иммунного ответа у зараженных иммунных погибших и выживших животных.

Впервые показано, что процесс развития лихорадки Марбург у морских свинок и обезьян сопровождается повышением активности неспецифических факторов иммунитета (ФНО, интерферона, НК) на 5-7 сутки после заражения, которое продолжается вплоть до момента гибели животных.

Показано, что препараты интерлейкина-2 оказывают негативное влияние на течение лихорадки Марбург.

Впервые показано, что применение препаратов-антагонистов фактора некроза опухоли при лихорадке Марбург оказывает терапевтический эффект в экспериментах на животных.

Практическая ценность работы. Получен патент Российской Федерации "Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммунологической и протективной активностью" (Ш 2029561 С1). Получен протективный препарат против геморрагической лихорадки Марбург, который прошел доклинические исследования согласно РД 42-28-8-89 (отчет о "Доклинических испытаниях..." прилагается). Препарат удовлетворяет по своим характеристикам требованиям иммунологической безопасности. Для углубленного изучения качества инактивированного препарата вируса Марбург были проведены исследования показателей иммунитета у п