Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург

Иванова, Алла Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург"

004613803

Иванова Алла Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ УР40 ВИРУСА ЭБОЛА И УР40, УР35 ВИРУСА МАРБУРГ

03.01.03. - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Кольцове-2010

004613803

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный руководитель: к.б.н. Качко Алла Васильевна

Официальные оппоненты:

д.б.н. Карпенко Лариса Ивановна

к.б.н. Белавин Павел Александрович

Ведущая организация:

Новосибирский государственный университет.

Защита диссертационной работы состоится « 3 » декабря 2010 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан« » 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.б.н. Г. П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусы Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ), вызывающие геморрагические лихорадки (ГЛ), были открыты более 30 лет назад, однако до настоящего времени эффективных средств специфической профилактики этих заболеваний для людей не разработано. Филовирусы способны вызывать геморрагические лихорадки у человека с крайне тяжелым течением заболевания и высоким уровнем летальности (до 90%) (Baron R.C., 1977).

Симптомы, характеризующие ГЛ ВЭ и ВМ в первые несколько дней инфекции, являются неспецифическими и во многом схожими с клинической картиной характерной для ряда заболеваний, вызванных другими вирусами, бактериями или простейшими (желтая лихорадка, лихорадка JIacca, дизентерия, тиф, чума, малярия и т.д. (Gear J.H., 1979), что усложняет раннюю симптоматическую диагностику. Высокая патогенность данных вирусов весьма затрудняет экспериментальные работы по созданию методов лечения, профилактики и диагностики, потому что исследования ВЭ и ВМ, относящихся к I группе патогенности, требуют специально сконструированных лабораторий с максимальным уровнем биологической защиты BSL-4, биоохраны и специальной подготовки персонала. Тем не менее, для проведения многих видов исследований нет необходимости проводить работы с живым вирусным агентом, а достаточно использовать лишь его генетический материал. Длительное и безопасное хранение генетического материала РНК-содержащих вирусов, а также его наработка в стандартных лабораторных условиях, возможны при создании геномных библиотек, представляющих собой коллекцию гибридных плазмид, содержащих фрагменты вирусного генома.

Филовирусные геморрагические лихорадки являются эндемичными заболеваниями (в основном это страны центральной Африки), но их завоз на территорию РФ возможен в связи с поставками экзотических животных для нужд учреждений и частных лиц, а также с увеличивающимся людским потоком между государствами, обусловленным расширяющимися туристическими и экономическими связями со странами африканского континента. В случае возникновения вспышки филовирусных лихорадок в пределах РФ необходимо иметь эффективные средства диагностики данного вида заболеваний.

Наряду с методом ПЦР-диагностики основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, а именно иммунодиагностике, базирующейся на выявлении специфических антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. В качестве антигенов для определения титров специфических антител могут быть использованы рекомбинантные вирусные белки, несущие в своём составе антигенные структуры, узнаваемые специфическими антивирусными антителами (Saijo M., 2001). С использованием рекомбинантных белков открываются новые возможности для создания тест-систем, неотъемлемой частью которых является наличие библиотек генов рекомбинантных плазмид, кодирующих полноразмерные копии генов этих высокопатогенных вирусов.

Создание библиотек полноразмерных генов позволит надёжно законсервировать в биологически безопасной форме генетический материал для будущих исследований. Поддержание и пополнение клонотек полноразмерных генов ВЭ и ВМ, а также продуцентов рекомбинантных вирусных белков, создаёт предпосылки для их использования в обратной генетике и изучения репликации вирусов. Фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, входят в число основных направлений деятельности ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», в связи с чем целью настоящего исследования являлось получение рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ и исследование их иммунохимических свойств, с помощью поликлональных (ПАТ) и моноклональных антител (МКА), специфичных к филовирусам и пополнение коллекции гибридных плазмид, содержащих полноразмерные копии генов филовирусов.

Основные задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать экспрессирующие гибридные плазмиды, содержащие полноразмерные копии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;

- оптимизировать условия экспрессии генов, кодирующих белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;

- получить аффинно-очищенные препараты полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург;

- исследовать антигенную специфичность и иммуногенность продуктов экспрессии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург.

Научная новизна работы и практическая значимость работы.

В результате проведенной работы сконструированы гибридные плазмиды, кодирующие полноразмерные копии генов VP40, NP вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург, пополняющие коллекцию библиотеки полноразмерных генов филовирусов.

Были оптимизированы условия экспрессии генов в составе плазмид pQE30-Р40, pQE30-NP ВЭ и pQE31- Р40, pQE31-VP35 ВМ в штамме Е. coli JM103. Были наработаны и выделены с помощью аффинной хроматографии полноразмерные рекомбинантные белки филовирусов.

Показано, что аффинно-очищенные препараты рекомбинантных белков сохранили антигенную структуру, сходную со структурой нативных природных белков, что позволило использовать данные препараты в качестве антигенов для выявления специфических противовирусных антител, а также в качестве положительного контроля при конструировании лабораторных тест-систем.

Новизна и приоритет данной разработки подтверждены патентами РФ (патенты № 2395575, № 2395576, № 2395577).

Библиотеки клонов гибридные плазмиды и рекомбинантные белки высокопатогенных вирусов могут быть использованы для обеспечения работ по изучению генетической организации вирусов, а также при разработке современных методов экспресс-диагностики геморрагических лихорадок.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гибридные плазмиды, кодирующие полные гены ИР, УР40 ВЭ и УР40, 35 ВМ белков вирусов Эбола и Марбург обеспечивают эффективную продукцию данных белков в прокариотической системе экспрессии.

2. Полученные нами рекомбинантные белки обладают иммуногенностью и индуцируют в сыворотке крови иммунизированных мышей синтез специфических антител с высоким титром (1:2 ООО ООО).

3. Рекомбинантные белки УР40, ВЭ и УР40, УР35 ВМ антигенно подобны вирусным белкам ВЭ и ВМ и могут быть использованы при конструировании иммунодиагностических тест-систем для обнаружения вирусных антигенов и противовирусных антител.

Апробация работы н публикации. Результаты диссертационной работы представлены автором в форме доклада на VI Международной конференции РФФИ «Результаты фундаментальных исследований для инвестиций», г. Пущино 2001 г.; II Научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г. Новосибирск, 29-31 мая 2002 г.; Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», г. Минск, Беларусь, 22-23 октября 2009 г. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для кандидатских диссертаций. Получено 5 патентов РФ на изобретение.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 8 таблиц. Библиография включает 167 наименований, из которых 38 отечественных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Часть первая «Конструирование плазмид, несущих полноразмерные копии генов VP40, NP ВЭ и VP40, VP35 ВМ» посвящена разработке и получению конструкций гибридных плазмид, обеспечивающих высокий уровень продукции штаммов-продуцентов в клетках Escherichia coli.

С целью получении полноразмерных копий генов VP40 и NP ВЭ была построена кДНК методом обратной транскрипции геномной РНК ВЭ (суммарная РНК ВЭ была любезно предоставлена Субботиной Е. JL). Амплификацию фрагментов вирусной кДНК проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, рассчитанных по последовательности генома ВЭ с помощью компьютерной программы OLIGO: для VP40:

5' - AAAAGGATCCATGAGGCGGGTTATATTGCCTAC - 3' 5' - AAAAAAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA - 3' для№:

5' - AAAAGGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCTGG - 3' 5' - AAAAAAGCTTTCACTGATGATGTTGCAGGATTG-3' Для различных комбинаций праймеров использовались программы, имеющие отличие на стадии отжига праймеров. Полученные ПЦР-продукты были очищены и обработаны эндонуклеазами рестрикции BamHl и Hindill.

А. Б.

Рис. 1. Схематическое изображение рекомбинантных плазмид pQE30-VP40 (А) и pQE30-NP ВЭ (Б). Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции Ват Ж, Avail, Hindm, Bsp17201, промотор фага Т5, ген устойчивости к ампициллину (ArnpR), orí репликации ColEl и клонированные полноразмерные гены NP и VP40 ВЭ.

В линеаризованную и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE-30, гидролизованную рестриктазами BamHl и Hindlll были встроены фрагменты, содержащие полноразмерные копии генов NP и VP40 ВЭ. С помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHl, Avail, из множества клонов произвольно были отобраны по 10 клонов обеих

гибридных плазмиц, содержащие необходимые вставки (Рис. 2). Таким образом, были получены плазмиды р()Е30-\Ф40 (Рис. 1 А) и р(ЗЕЗО-№ (Рис. 1 Б), которые должны были обеспечивать экспрессию полноразмерных генов в Е.соН .ТМ 103.

А.

Б.

М 1 2 3 Л 5 6 1

^ВтРШДИМ -251$ 710 —

?.!8 = ЩШйЖ 550 — 525 489 — 404-

296 — 190 — »7 — 296 — 212- 190 - 147 —

ПО — 67 — 42 — 14 — -84 67 — 42 - 34 -

811.1

600

4S5

Рис. 2. Электрофореграмма ДНК рекомбинантных плазмид, обработанных эндонуклеазами рестрикции BamHl и Avail в ПААГ. Размеры фрагментов в п.н. приведены справа, размеры фрагментов маркёра - слева.

A) pQE30-VP40 ВЭ. М - маркёр молекулярного веса, 1-7 - гибридная плазмида (f2518, 777, 577,229,222,84).

Б) pQE30-NP ВЭ. М - маркёр молекулярного веса, 1-5 - гибридная плазмида (f 2518, 811; 600,485,222),6-контрольная плазмидаpQE30 (f 2463,777,222).

В результате встройки плазмиды содержали открытые рамки трансляции (ОРТ), кодирующие белок длиной 338 аминокислотных остатков (а.о.) для VP40 ВЭ и 751 а.о. дляКРВЭ.

Следующим этапом работы было получение плазмиды pQE-31-VP40 и pQE-31-VP35 ВМ. Аминокислотная последовательность гена VP40 ВМ (штамм Popp) составляет 911 пар оснований (п.о.). ОРТ содержит 303 а.о. и кодирует полипептид с расчетной массой 33734 Да.

На первых этапах сборки полноразмерных копий генов VP40 и VP35 ВМ была использована библиотека клонов, клонированная по сайту Pstl плазмидной ДНК pBR322 и несущих специфические фрагменты генома ВМ (Bukreyev A.A., 1995).

Для конструирования полноразмерной копии гена VP40 ВМ, фрагмент плазмиды рМВСт 4-48 из геномной библиотеки, несущий кДНК-фрагмент XbaVBgill (с 4550 по 5659 нуклеотид (н.) по геномной РНК ВМ) генома ВМ штамм Popp с 3863 по 5864 н. (GenBank Accession No. Z29337), был встроен в полилинкер промежуточной плазмиды pMTL22 по соответствующим сайтам рестрикции в обратной ориентации.

В результате была получена плазмидная конструкция pMTL22(rev)-VP40 ВМ, со встроенным фрагментом, включающим полноразмерную кДНК гена VP40

ВМ. Правильность сборки данной конструкции была проверена гидролизом эндонуклеаз рестрикции.

А.

Б.

Т5 промотр

Т5 промотор

Со1Е1 Orí

COIE1 Orí

Рис. 3. Схематическое изображение рекомбинантной илазмиды pQE31-VP40 (А) и pQE31-VP35 (Б) ВМ. Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции ВатЖ, Avail, Ps/1, Bsp 17201, HindiII, промотор фага Т5, ген устойчивости к ампициллину (AmpR), orí репликации ColEl и клонированные полноразмерные гены белков VP40 и VP35 ВМ.

Для получения экспрессирующей конструкции полноразмерного гена VP40 ВМ фрагмент плазмиды pMTL22(rev)-VP40BM, длиной 1105 п.о. по сайтам BamHVBspimi, был встроен в линеаризированную и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE31 по соответствующим сайтам (Рис. 3 А).

Наличие вставки целевого гена в структуре плазмиды pQ31-VP40 было определено с помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции ВатЖ-Avall-Pstl и из множества клонов произвольно были отобрано 6 клонов (Рис. 4 А).

На следующем этапе работы была получена плазмида pQE31-VP35 ВМ. Аминокислотная последовательность гена V35 ВМ (штамм Popp) составляет 789 п.н. ОРТ содержит 329 а.о. и кодирует полипептид с расчетной массой 36149 Да.

Фрагмент музейной плазмиды pMBG 8-25 Bgíll-Psñ с 3272 по 3965 н. по геномной РНК ВМ (GenBank Accession No. Z29337) был встроен в плазмиду pMBG2-26 по сайтам BgIñ-Zsp21l(Nsil).

В результате была получена промежуточная плазмидная конструкция pMBG226/825, несущая фрагмент кДНК геномной РНК ВМ с2374 по 3965 н. Далее фрагмент кДНК Sspl-Hpal (1066 п.о.) плазмиды pMBG226/825 встраивали в линеаризованную по сайту Smal и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pQE31 (Рис.3 Б).

С помощью рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHl-Avall-Hindlll, из множества клонов произвольно были отобраны 6 клонов, содержащие необходимые вставки (Рис. 4 Б).

Рис. 4. Электрофореграмма ДНК рекомбинантных плазмид в ПААГ, Размеры фрагментов в п.н. приведены слева, размеры фрагментов маркёра - справа. А) р<ЗЕ31-УР40 ВМ, обработанная эндонуклеазами рестрикции ВатЖ-АуаИ-РэГ!. М - маркер молекулярного веса, 1-6 - гибридная плазмида (Т 2864, 779, 691, 439, 222, 21), 7 - контрольная плазмида рС>ЕЗ 1 ^ 779, 222, 38).

Б) р<ЗЕ31-УР35 ВМ, обработанная эндонуклеазами рестрикции ВатШ-ШпсКИ-ЛгаП.

М - маркер молекулярного веса, 1-6 — гибридная плазмида (Т 2421, 779, 485, 329,279, 222, 15;, 7 - контрольная плазмида рС^ЕЗ! (1'779,222,42).

Таким образом, были получены плазмиды р<ЗЕ31-УР40 и рС>Е31-УР35, которые должны были обеспечивать экспрессию полноразмерных генов в Е.соН М 103.

В результате встройки плазмиды содержали ОРТ, кодирующие белок длиной 331 а.о. для УР40 ВМ и 370 а.о. для УР35 ВМ.

А. Б.

"79,691 439

Нуклеотидные последовательности рамок считывания целевых генов в плазмидах pQE30-NP, pQE30-VP40, pQE31-VP40 и pQE31-VP35 были определены секвенированием на автоматическом анализаторе ДНК Beckman CEQ2000XL, используя набор реактивов CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit с использованием специфических праймеров для pQE, согласно инструкциям фирм-производителей.

Часть вторая «Оптимизация условий экспрессии и очистка Ni-хелатной хроматографией рекомбинантных белков» описывает получение расчётных характеристик рекомбинантных полипептидов для оптимизации условий экспрессии генов, кодирующих белки филовирусов, подбор условий экспрессии штаммов-продуцентов и получение аффинно-очищенных препаратов полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ.

Расчёт характеристик рекомбинантных белков и профилей гидрофильности-гидрофобности проводили с помощью программы «Vector NTI 8»

Таблица 1.

Расчетные характеристики рекомбииаитных полипептидов, полученных в E.coli.

№ Рекомбинантный белок Расчетная длина белка (а.о.) Расчетная молекулярная масса белка (Да) Изоэлектрическая точка белка (pl)

1 VP40 ВЭ 338 36579.31 8,97

2 NP ВЭ 751 84679.78 5,14

3 VP40 ВМ 331 36941.29 9,01

4 VP35BM 370 40931.02 9,49

У белков, как у амфотерных соединений величина и знак заряда определяется соотношением аминокислотного состава и рН раствора. Величина изоэлектрической точки (р1) белка - это значение рН, при котором суммарный заряд белка равен 0. Белки в изоэлектрическом состоянии характеризуются: минимальной устойчивостью и вязкостью в растворе, отсутствием подвижности в электрическом поле, максимальной способностью к осаждению.

У большинства белков р1 лежит в слабокислой среде, однако имеются белки и с резким преобладанием щелочных свойств. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в слабокислой среде (рН 4,8 - 5,4), что свидетельствует о преобладании в их составе дикарбоновых аминокислот. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной.

Отношение кислотных и основных а.о. в белках УР40 филовирусов и УР35 ВМ, имеющих изоэлектрическую точку с резким преобладанием щелочных свойств (8,97(для УР40 ВЭ), 9,01 (для УР40 ВМ) и 9,49 (для УР35 ВМ) говорят о преобладании остатков основных аминокислот. Данные белки являются сильно основными и связываются с нуклеиновыми кислотами за счёт электростатического взаимодействия с фосфатными остатками нуклеиновых кислот. Первичная структура этих белков в большей степени является гидрофильной (Рис. 5 А, В, Г), что говорит о хорошей растворимости белков.

А.

Б.

Рис. 5. Профиль гидрофобности - гидрофильности. А) рек. белок УР40 ВЭ; Б) рек. белок № ВЭ; В) рек. белок УР40 ВМ; Г) рек. белок УР35 ВМ. Гидрофобные районы находятся выше разделительной линии (0), гидрофильные - ниже. Профили построены с интервалом 9 а.о. Н. ед. - номинальные единицы.

Белок № ВЭ имеет изоэлектрическую точку в слабокислой среде 5,14, что говорит о преобладании в его составе дикарбоновых аминокислот. Аминокислотная последовательность ИР ВЭ имеет гидрофобную >1-концевую область и гидрофильный С-конпевой район (Рис. 5 Б).

Согласно литературным данным длина полипептида УР40 ВЭ составляет 326 а.о. Как упоминалось ранее, в результате генно-инженерных манипуляций, полученная гибридная плазмида р(2Е-УР40 ВЭ содержит ОРТ, кодирующую белок длиной 338 а.о. (с шестью остатками гистидина, обеспечивающими последующее выделение белка на №-хелатном носителе и остатками полилинкера векторной плазмиды рОЕ) под контролем промотора фага Т5.

Клетки Е.соИ Ж 103 трансформировали плазмидами р(^>Е30-УР40, р(^Е31-УР40 и рОЕ31-\Ф35, индуцировали индуктором Еас-оперона ЕРТв, обеспечивающим высокоэффективную транскрипцию с промотора фага Т5, в среднеарифметической стадии роста (ОП=0,8) с последующим культивированием в течение 4 часов при 30 °С. Отбор клонов-продуцентов проводили по наличию экспрессируемого белка в 15% 8Б8-ПААГ. В качестве контроля использовали

полученный аналогичным способом лизат клеток штамма Е.соИ .ТМ103, содержащий векторную плазмиду р(}Е30 (для р<ЗЕ30-УР40) и р<ЗЕ31 (для р(ЗЕ31-УР40ирС)Е31-УР35).

А. Б. В.

I 2 3 4 5 < " 8 9 10 М 1 2 3 4 5 Mi 2 3 4 5

Рис. 6. Электрофореграмма лизатов E.coli JM103, содержащих плазмиды: pQE30-VP40 (A), pQE31-VP40 (Б) и pQE31-VP35 (В) в 15% SDS-ПААГ.

A) 1-9 - лизаты клеток, несущих плазмиду pQE30-VP40;

10 - лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE30 (контроль бактериальных клеток), М - маркер молекулярной массы (Sigma); Б) 1 - лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE31 (контроль бактериальных клеток), 2-5 - лизаты клеток, несущих плазмиду pQE31-VP40

B) М - маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, М3913),1 - лизат клеток E.coli JM103, несущий плазмиду pQE31-VP35 ВМ до индукции IPTG, 2-4 - лизаты клеток Е. coli JM103, несущие плазмиду pQE31 -VP35 ВМ, 5 - лизат клеток E.coli JM103, несущие плазмиду pQE31 (контроль бактериальных клеток).

Электрофоретическая подвижность синтезируемых рекомбинантных белков совпадала с нашими теоретическими расчётами (Рис. 6 А, Б, В).

Для получения рекомбинантного белка NP использовали иную стратегию культивирования и индукции синтеза белка. Как отмечалось ранее, гидролиз эндонуклеазами рестрикции ВатШ-Нindlll-A voll с последующим электрофоретическим разделением в ПААГ произвольно выбранных клонов рекомбинантной плазмиды pQE30-NP ВЭ, а также определение нуклеотидных последовательностей, показывали наличие в их составе вставок целевых генов. Однако, при стандартной схеме культивирования штаммов-продуцентов, электрофорез лизатов в 10% SDS-ПААГ визуально не выявлял продуктов экспрессии гена NP ВЭ (Рис. 7).

Мы предприняли попытки получить экспрессию гена и провели эксперимент по наработке отдельно взятых клонов с поверхности агаризованной среды LB для ночного культивирования и последующей дневной индукцией синтеза в течение 5-6 часов при пониженной (25 °С) температуре. Экспрессия рекомбинантного белка различными клонами E.coli была проанализирована

электрофорезом в 10% SDS-ПААГ. По результатам электрофореза были выбраны клоны с 8 по 13 (Рис. 7).

1 : 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рис. 7. Электрофореграмма лизатов E.coli JM103, содержащих плазмиду: pQE30-NP в 10% SDS-ПААГ.

1-6 — лизаты клеток E.coli .TM 103, несущих плазмиду pQE30-NP после дневного культивирования и индукции IPTG, 7 - лизаты клеток E.coli JM103, несущих плазмиду pQE30 после дневного культивирования с дневной индукцией IPTG, 815 - лизаты клеток E.coli , несущих плазмиду pQE30-NP ВЭ после ночного культивирования и дневной индукции IPTG.

Полученные клоны штаммов-продуцентов были наработаны и клеточные лизаты E.coli JM103, несущие плазмиды pQE30-NP, pQE30-VP40, pQE31-VP40 и pQE31-VP35 были проанализированы методом ИФА со специфическими иммунными сыворотками.

Как упоминалось ранее, все полученные конструкции содержали кластер из 6 остатков His в N-концевой части белка, включающая полигистидиновый тракт (6xHis-tag), что позволило нам очищать рекомбинантные белки филовирусов с помощью Ni-хелатной хроматографии. Цифровая обработка электрофореграмм показала, что чистота белков после Ni-хелатной хроматографии достигает от 67 до 88 %.

Очищенный рекомбинантный белок VP40 ВЭ представлен единичной полосой и имел молекулярную массу 37 кДа, что соответствовало нашим расчётам (Рис. 8 А).

А. Б. В.

М 1 2 М 1 2 IM

VP40 ВЭ

тф

NP ВЭ

- üf f

VP35BM VP40BM

— :{1

Рис. 8. Электрофореграмма очищенных рекомбинантных белков. А) Рекомбинантный белок VP40 ВЭ в 15% SDS-ПААГ, М - маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, М3913), 1 - очищенный рекомбинантный белок VP40 ВЭ, 2 - лизат клеток Е. coli, несущих плазмиду pQE30-VP40 ВЭ; Б) белок ВЭ в 10% SDS-ПААГ. М - маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, М3913), 1 - лизат клеток Е. coli, несущих плазмиду pQE30-NP ВЭ; 2 - очищенный рекомбинантный белок NP ВЭ; В) Рекомбинантный белок VP40 и VP35 ВМ в 15% SDS-ПААГ. М -маркер молекулярной массы (Sigma-Aldrich, М3913), 1 - очищенный рекомбинантный белок VP35 ВМ, 2 - очищенный рекомбинантный белок VP40 ВМ.

Электрофоретический анализ рекомбинантного белка NP ВЭ показал, что его электрофоретическая подвижность (приблизительно 115 кДа) не соответствовала расчетной молекулярной массе (Рис. 8 Б). При картировании NP ВЭ в 2006 r.Watanabe S. с соавторами показали, что две области этого белка, ограниченные а.о. 439-492 и 589-739, изменяют подвижность NP ВЭ в SDS-ПААГ на 5 и 15 кДа, соответственно.

Полученные рекомбинантные белки VP40 и VP35 ВМ имели большую электрофоретическую подвижность, чем нативные белки (Рис. 8 В), что соответствует нашим расчётам (табл. 1) и объясняется наличием дополнительных и.о., оставшихся после генно-инженерных манипуляций.

Концентрацию белков в полученных стоках измеряли при помощи набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре UVmini 1240 при длине волны 495 им и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 М растворе мочевины (Lowry О. Н., 1951).

Уровень синтеза рекомбинантных полипептидов оценивался до 70 мг на 1 литр культуральной среды с выходом целевого белка от 25 до 40% от суммарного клеточного белка.

Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков NP и VP40 ВЭ соответствовала расчётным данным и была сравнима с подвижностью дативных

вирусных белков. Рекомбинантные УР40 и УР35 ВМ имеют большую электрофоретическую подвижность, чем нативные белки, как упоминалось ранее, за счет дополнительных нуклеотидов, оставшихся после генно-инженерных манипуляций (Рис. 9).

Все полученные нами, аффинно-очищенные рекомбинантные белки были использованы для получения моносывороток.

1 2 3 4 5 6 М

Рис. 9. Электрофореграмма очищенных рекомбинантных и вирусных белков ВЭ и ВМ.

1. - рекомбинантный белок VP35 ВМ, 2. - рекомбинантный белок VP40 ВМ, 3. - препарат инактивированного ВМ. 4. - препарат инактивированного ВЭ, 5. - рекомбинантный белок VP40 ВЭ, 6. - рекомбинантный нуклеопротеин ВЭ, М - маркер молекулярного веса (Bio-Rad).

Часть третья «Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств белков филовирусов» содержит характеризацию полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ с помощью поликлональных и МКА, специфичных к филовирусам. На данном этапе работы очищенные рекомбинантные белки NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ были использованы для иммунизации, а также для исследования антигенных свойств методами ИФА и иммуноблота (ИБ). С этой целью нами была использована коллекция МКА, полученных при иммунизации инактивированными препаратами ВМ и ВЭ и поликлональные иммунные сыворотки.

А. 12345678 Б. 1 2 3 4 5 6 78

Рис.10. Иммуноблот МКА с нативными и рекомбинантными белками ВЭ. А) 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2, 2 - препарат ВЭ, обработан МКА 1С , 3 - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 4А2, 4 - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА ICI, 5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А2 (отрицательный контроль), 6 - препарат ВМ, обработан МКА ICI (отрицательный контроль), 7 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 4А2 (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, обработан МКА ICI (отрицательный контроль). Разведение 1 : 10 000.

Б) 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2, 2 - препарат ВЭ, обработан MICA. 7В11, 3 - рекомбинантный NP, обработан МКА 1В2, 4 - рекомбинантный NP, обработан МКА 7В11, 5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2 (отрицательный контроль), 6 -препарат ВМ, обработан МКА 7В11 (отрицательный контроль), 7 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 1В2 (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, : обработан МКА 7В11 (отрицательный контроль). Разведение 1 : 500.

Полученные в денатурирующих условиях рекомбинантные белки распознавались специфическими МКА, полученными к нативным белкам ВЭ и ВМ. Что позволило предположить о сохранении линейных детерминант в рекомбинантных белках. Так специфичность рекомбинантных белков NP и VP40 ВЭ была показана при связывании с МКА 4А2 и ICI для белка VP40 ВЭ (Рис. 10 А), а 1В1 и 7В11 для белка NP (Рис. 10 Б). Аналогично предыдущим белкам, рекомбинантный белок VP40 ВМ распознавался двумя МКА 7 НЮ и 7В8 (Рис. 11 А), полученными ранее к нативному препарату ВМ. Рекомбинантный VP35 ВМ, так же как и вирусный антиген, распознавался МКА 3F9 (Рис. 11 Б).

Это свидетельствует о подобии линейных эпитопов на рекомбинантных и природных белках NP,VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ.

Данные ИБ позволяют заключить, что полученные продуценты гибридных белков сохраняют иммунохимические свойства природных антигенов ВЭ и ВМ. Антитела моносывороток, специфичные к рекомбинантным белкам, выявляют соответствующие им белки - аналоги в инактивированных вирусных препаратах, что свидетельствует о подобии антигенных детерминант, представленных на поверхности рекомбинантных и природных белков УР40 ВЭ и \Ф40,\Ф35 ВМ.

А. 12345678 Б. 1 234

VP35 — g

Рис.11. Иммуноблот МКА с нативными и рекомбинантными белками ВМ в разведении 1:500.

А) 1 - препарат ВМ, обработан МКА 7Н10, 2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8, 3 - рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 7Н10, 4 -рекомбинантный белок VP40, обработан МКА 7D8, 5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль), 6 - препарат ВЭ, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль), 7 - лизат клеток E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль), 8 - лизат клеток E.coli, обработан МКА. 7D8 (отрицательный контроль).

Б) 1 - препарат ВМ, 2 - препарат ВЭ (отрицательный контроль на антиген), 3 -лизат клеток E.coli. (отрицательный котроль для рекомбинантного белка), 4 -очищенный рекомбинантный белок VP35. Все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9.

Для сравнения иммуногенности природных и рекомбинантных белков VP40 и NP ВЭ были использованы мышиные антисыворотки, исследованные на специфичность, динамику наработки антител в организме и перекрестную реактивность с исследуемыми белками в ТИФА и ИБ.

По результатам ТИФА (таблица 2) видно, что в результате иммунизации мышей антигенами, содержащими рекомбинантные белки или белки в составе цельновирионного инактивированного препарата ВЭ, у всех животных на данные белки формировался специфический иммунный ответ.

Таблица 2.

Иммунохимические свойства различных антигенов ВЭ и ВМ в ТИФА

Антитела Иммуног ен Кони ентра ЦИЯ (мг/ мл) Вирусный белок-мишень в иммуноблоте Конечные разведения антител (обратные величины)

Антигены для ТИФА

Вирус Эбола Рек. NP ВЭ >ек. VP40 ВЭ Вирус Марбург Рек. VP40 ВМ Рек. VP35 ВМ

лошади Инфекц. ВЭ 90 NP, VP40, VP35 656100 656100 656100 24300 <100 <100

АС кролика ВЭ 90 NP, VP40, VP35, VP30, VP24 218700 656100 218700 2700 <100 <100

АС крысы ВЭ 50 NP 218700 218700 218700 <100 <100 <100

АС мыши ВЭ 90 NP, VP40, VP35, VP30, VP24 218700 218700 218700 2700 <100 <100

АС мыши рек. VP40-B3 90 VP40 656100 <100 1968300 <100 <100 <100

АС мыши рек. NP-ВЭ 90 NP 656100 1968300 <100 <100 <100 <100

МКА1Е5 ВЭ 6,3 NP 218700 243000 <100 <100 <100 <100

МКА 1В5 ВЭ 5,7 VP40 72900 <100 656100 <100 <100 <100

АС человека инфекц. ВМ 50 GP, NP, VP35, VP40, VP30, VP24 900 <100 <100 24300 8100 2700

лошади инфекц. ВМ 90 GP, NP, VP35, VP40, VP30 2700 <100 <100 218700 72900 218700

АС кролика ВМ 18,5 н.о. <100 <100 <100 24300 24300 24300

АС мыши ВМ 50 GP, NP, VP35, VP40, VP30, VP24 300 <100 <100 24300 24300 8100

АС мыши рек. VP40 ВМ 14 VP40 <100 <100 <100 72900 1968300 <100

АС мыши рек. VP35 ВМ 11,8 VP35 <100 <100 <100 24300 <100 656100

МКА 7Н10 ВМ 8 VP40 <100 <100 <100 729000 729000 <100

Отрицательный контроль <100 <100 <100 <100 <100 <100

Примечание:

ЧС - сыворотка человека, переболевшего лихорадкой Марбург, IgG лошадей, иммунизированных инфекционными препаратами ВМ и ВЭ (г. Сергиев Посад), MAC -мышиные антисыворотки, КАС - антисыворотка кролика, иммунизированного инактивированным антигеном ВМ или ВЭ, Кр-АС-ВЭ - антисыворотка крысы, иммунизированной инактивированным антигеном ВЭ, концентрация антигенов 100 нг/лунка.

Полученный рекомбинантный белок VP40 ВЭ при иммунизации мышей ICR индуцировал синтез специфических антител с высоким титром (1:1 968 300).

Антитела мышиных моносывороток, полученных к рекомбинантному белку VP40 ВЭ также эффективно распознавали аналогичный белок в инактивированном препарате ВЭ в ИФА и титр антисывороток против VP40 достигал 1 : 656 100. Согласно полученным данным ИБ и ИФА, очищенный рекомбинантный белок VP40 эффективно распознавался специфическими МКА, полученными против нативного ВЭ, а также другими иммунными сыворотками и гипериммунными сыворотками (лабораторные животные, иммунизированные инактивированным ВЭ). Это говорит о том, что рекомбинантный и вирусный белок VP40 ангигенно подобны.

В соответствии с полученными данными (табл. 2) рекомбинантный белок NP ВЭ, также использованный при иммунизации мышей ICR, высокоэффективно индуцировал синтез специфических антител к рекомбинантному белку NP. Титр антител достигал 1 : 1 968 300, что также позволяет говорить о высокой иммуногенности данного белка. Полученная поликлональная сыворотка эффективно взаимодействовала с антигеном ВЭ в разведении 1 : 656 100. Интересно отметить, что и другие специфические МКА из нашей коллекции, связывающиеся с природным NP ВЭ, также распознают рекомбинантный аналог. Это позволило сделать заключение, что рекомбинантный белок NP сохранил основные антигенные эпитопы, тождественные вирусному белку NP.

Аффинно-очшценные рекомбинантные белки VP40 и VP35 ВМ также оказались хорошими иммуногенами и сохранили свою антигенную структуру, что было показано методами ТИФА и ИБ с использованием набора сывороток крови животных, иммунизированных очищенным препаратом ВМ или рекомбинантным белком. Результаты тестирования (таблица 2) демонстрируют, что рекомбинантные аналоги вирусных белков VP40 и VP35 ВМ тоже обладают иммуногенностью, вызывая синтез антител в организме иммунизированных мышей и выявляют специфические антитела к ВМ в сыворотках иммунизированных животных и переболевшего человека, то есть обладают антигенными свойствами.

Необходимо отметить, что оба рекомбинантных белка распознавались серопозитивной сывороткой рековалесцента, которая содержит противовирусные антитела, индуцированных иммунной системой человека в течение естественной инфекции. Таким образом, рекомбинантные белки VP40, VP35 ВМ содержат антигенные детерминанты распознаваемые противовирусными антителами человека. Аналогично вышеописанным рекомбинантным аналогам ВЭ, белки VP40 и VP35 ВМ распознаются коллекцией моноклональных антител и поликлональных сывороток. Таким образом, данные белки при иммунизации аутбредных мышей линии ICR, индуцируя синтез специфических антител к рекомбинантным белкам VP40 и VP35 ВМ в высоком титре (1:2 000 000 - для VP40 и 1 : 656 000 для VP35) способны с высокой чувствительностью выявлять маркёры ВЭ и ВМ.

Следовательно, иммунохимические исследования рекомбинантных белков показали, что рекомбинантные белки VP40, NP ВЭ и VP40, VP35 ВМ антигенно подобны вирусным белкам ВЭ и ВМ и могут использоваться в качестве антигенов для выявления специфических противовирусных антител. Серопозитивная

сыворотка рековалесцента, оказалась очень ценным препаратом для исследования рекомбинантного белка, так как содержит противовирусные антитела, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции.

Следующим этапом, была характеризация полученных рекомбинантных белков по их способности распознаваться в ИФА формата «сэндвич».

В нашем исследовании чувствительность выявления рекомбинантных антигенов разными парами МКА колебалась до 150 нг/мл. Для примера были выбраны две пары МКА, наиболее эффективно выявляющие как очищенный вирусный антиген, так и рекомбинантный аналог с чувствительностью 1 нг/мл. Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ и пара МКА 4А2 и ICI, специфичные к белку VP40 ВЭ. Выбранные нами пары МКА строго специфичны к структурным вирусным белкам VP40 и NP ВЭ, и не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными антигенами (Рис. 10).

Для выявления антигена ВМ мы выбрали МКА, узнающие антигенные сайты рекомбинантных белков, совпадающих по аминокислотному составу с антигенными сайтами аналогичных вирусных белков. Для примера были выбраны две пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенный вирусный антиген, так и рекомбинантный аналог с чувствительностью в нашей системе менее 1 нг/мл. Это пара МКА, очищенных 7D8 и меченных биотином 7Н10, специфичных к белку VP40 ВМ (Рис. 11 А).

МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве «захватывающих» антиген, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления антигенов VP35 ВМ (Рис. 11 Б). В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (Hevey M., 1997) и штамм Popp (Ручко C.B., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9 к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.

Данные Вестерн-блот анализа позволяют заключить, что полученные продуценты гибридных белков сохраняют иммунохимические свойства природных антигенов ВЭ и ВМ. Антитела моносывороток, специфичные к рекомбинантным белкам, выявляют соответствующие им белки - аналога в инактивированных вирусных препаратах, что свидетельствует о подобии антигенных детерминант, представленных на поверхности рекомбинантных и природных белков NP, VP40 ВЭ и VP40,VP35 ВМ.

А.

Б.

В.

« |KRo»5raiaimiHfi бают VP40 вируса Эбола

чрнцательнын контроль

-»-вирус МарЗург

JKrKOMÔI [НИН I ный V&-10K \~P4i» вируса Марбург

-*- от рщатспьньш кощроль

2500 1250 625 <12,5 156.25 "8.12 39.6 19.S 9.9 4.05 2.4" 1.23 Кониопрлда антигенов нгш

—Eiipvc ЭСч»ла

ж рскомбггнангнын

иукяеопротдот « NP \ -sfc~ огршш гяьный контроль

2500 1250 625 312.? 156 25 "8.12 39.6 1S».S 9S 4.95 2.4' 1.23 Хощентр.ири ЗНТНГсНоЕ нг МП

вирус Марбург

-ж-рёкомбпнангнып белок VP 35 вируса Марбург

i-. N -*-отр1шагельнып контроль

2500 1250 625 312.5 156 25 "8.12 39.6 19.8 93 4.95 2,4" 1.23 Кощснтраии дни irснов нгмл

Рис. 12. Кривая титрования вирусных антигенов и рекомбинантных белков ВЭ и ВМ с МКА в системе ИФА формата «сэндвич».

A) Антиген ВЭ и рекомбинантный белок VP40 ВЭ. МКА - 4А2 и ICI*. Отрицательный контроль - МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ

Б) Антиген ВЭ и рекомбинантный белок NP ВЭ. МКА - 1В2 и 7В11*. Отрицательный контроль - МКА 9С7 и 5F11 *, специфичные к белку NP ВМ,

B) Антиген ВМ и рекомбинантный белок VP40 ВМ. МКА - 7D8 и 7Н10*). Отрицательный контроль - МКА 4А2 и ICI*, специфичные к белку VP40 ВЭ,

Г) Антиген ВМ и рекомбинантный белок VP35 ВМ. МКА - 3F9 и 3F9*). Отрицательный контроль - МКА 1С7, специфичные к белку VP35 ВЭ. Исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл, * - индикаторные МКА, меченые биотином. концентрация МКА для «захвата» антигенов - 10 мкг/мл, концентрация индикаторных МКА, меченых биотином - 1 мкг/мл.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы экспрессирующие гибридные плазмиды, содержащие гены полноразмерных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург и подобраны условия, обеспечивающие эффективную наработку данных белков в прокариотической системе экспрессии с выходом целевого белка от 25 до 40% от суммарного клеточного бедка.

2. Были получены полноразмерные рекомбинангные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург с чистотой 67-88%. При иммунизации аутбредных мышей ICR данные рекомбинантные белки вызывали индукцию

антител, которые специфически связывались с природными антигенами вирусов Эбола и Марбург.

3. Рекомбинантные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург эффективно распознаются как моноклональными антителами так и поликлональными сыворотками, специфичными к вирусам Эбола и Марбург в иммуноблоте и иммуноферментном анализе. Таким образом, данные белки подобны по своим антигенным свойствам вирусным белкам.

4. Методом иммуноферментного анализа в формате «сэндвич» показано эффективное выявление рекомбинантных белков моноклональными антителами, не имеющими перекрёстной реактивности с гетерологичными антигенами вирусов Эбола и Марбург, с чувствительностью 1 нг/мл, что позволяет использовать полноразмерные рекомбинантные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург в качестве положительного контроля при конструировании иммунодиагностических тест-систем.

Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы:

1. Сорокин A.B., Казачинская Е.И., Качко A.B., Иванова A.B.. Букреев A.A., Разумов И.А.. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. // Вопросы вирусологии. - 1999. - № 5. -С. 206-213.

2. Качко A.B., Чеусова Т.Б., Сорокин A.B., Казачинская Е.И., Чешенко И.О., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Иванова A.B.. Разумов И.А, Рябчикова Е.И., Нетесов C.B. Сравнительное изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург. // Молекулярная биология. - 2001. - № 3. - С. 1-8.

3. Sorokin А.V., Kazachinskaya E.I., Ivanova A.V.. Kachko A.V., Netesov S.V., Bukreev A.A., Loktev V.B., and Razuinov I.A. Mapping of two dominant sites of VP35 Marburg virus. // Viral Immunology. - 2002. - Vol.15. - № 3. - P. 481-92.

4. Казачинская Е.И., Иванова A.B.. Сорокин A.B., Качко A.B., Субботина ЕЛ., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Медицинская иммунология. - 2010.- № 3. - Том 12. - С. 177-190.

Доклады и тезисы конференций:

1. AB. Качко, A.B. Сорокин, Е.И. Казачинская, A.B. Иванова. Е.Ф. Беланов, И.А. Разумов, A.A. Букреев, P. Collins, Нетесов C.B. // г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. -С. 140.

2. I.A. Razumov, A.V. Sorokin, E.I. Kazachinskaia, A.V. Ivanova. A.V. Kachko,

5.V. Netesov, A.A. Bukreyev, V.B. Loktev, Mapping of Two Dominant Sites of VP35 of Marburg Virus. // In "The world of microbes. ХГ1'Ь International Congress of Virology", 27 July - 01 August, Paris. - 2002. - Abstract Book. - P. 460.

3. Казачинская Е.И., Иванова A.B., Сорокин A.B., Качко A.B., Субботина ЕЛ., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Международная научно-практическая конференция «Современные проблемы инфекционной патологии человека», г. Минск, 2009. -Сборник научных трудов. - С. 277-280.

Список патентов, оформленных по теме диссертации:

1. Сорокин A.B., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Качко A.B., Иванова A.B.. Мишин В.П., Букреев A.A., Локтев В.Б., Негесов C.B. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQt35M, кодирующая гибридный полипетид ß5M, обладающий антигенными и иммуногенными свойсвами белка VP35 вируса Марбург, способ ее получения, и штамм бактерий Esherichia coli сверхпродуцент рекомбинантного полипептида ß5M. // Патент РФ № 21445665, приоритет изобретения от 12.11.1998. Опубликован 20.01.2000 в БИ № 2.

2. Казачинская Е.И., Сорокин A.B., Иванова A.B.. Качко A.B., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 3F9 - продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата «сэндвич» для выявления белка VP35 вируса Марбург и моноклональные антитела 3F9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток. // Патент РФ № 2393220, приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.

3. Казачинская Е.И., Сорокин A.B., Иванова A.B.. Качко A.B., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител дая выявления белка VP40 вируса Марбург (штамм Popp) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Popp). // Патент РФ № 2395575, приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.

4. Казачинская Е.И., Перебоев A.B., Иванова A.B.. Качко AB., Субботина Е.Л., Чепурнов А.А, Разумов И. А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1В2 -продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395576, приоритет изобретения от от 16.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.

5. Казачинская Е.И., Иванова A.B.. Качко A.B., Субботина Е.Л., Чепурнов A.A., Разумов И.Л.., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. -продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты) и набор для иммуноферментной системы формата «сэндвич» для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395577, приоритет изобретения от 18.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.

Благодарности

Автор выражает благодарность всем коллегам за поддержку данной работы и за сотрудничество: научному руководителю к.б.н. Качко A.B., u.c. Сорокину A.B., к.б.н. Казачинской Е.И., к.б.н. Субботиной Е.Л., д.б.н. Локтеву В.Б., д.б.н., профессору Нетесову C.B., к.ф.-м.н. Швалову А.Н., за техническую помощь лаборанту-исследователю Кавериной Г.Б., лаборанту-исследователю Плетнёвой Е.В. За предоставленные для исследования препараты: д.б.н. Чепурнову A.A. за инактивированный вирус Эбола и сыворотку крови иммунизированного кролика, к.б.н. Беланову Е.Ф. за инактивированный вирус Марбург. За ценную консультативную помощь при написании диссертации Дадаевой A.A.

Подписано в печать 29.10.2010. Заказ № 85. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Алла Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Таксономия семейства Филовирусов.

1.2. Морфология и структура вирионов.

1.3. Организация генома, структура и функции белков филовирусов.

1.3.1. Ну кл еопротеин (ИР).

1.3.2. Основной матриксный белок (УР40).

1.3.3. Компонент полимеразного комплекса (УР35).

1.3.4. Гликопротеин (вР).

1.3.5. Минорный компонент нуклеокапсида (УРЗО).

1.3.6. РНК-зависимая РНК-полимер аза (Ь).

1.3.7. Минорный матриксный белок (УР24).

1.4. Предполагаемый природный резервуар возбудителей филовирусной инфекции.

1.5. Клинические симптомы геморрагических лихорадок.

1.6. Использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике заболеваний.

1.7. Конструирование гибридных плазмид и получение рекомбинантных белков.

1.8. Рекомбинантные белки как антигены для иммунодиагностики.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург"

Вирусы Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ), вызывающие геморрагические лихорадки (ГЛ), были открыты более 30 лет назад, однако до настоящего времени эффективных средств специфической .профилактики этих заболеваний для людей не разработано. Филовирусы способны вызывать геморрагические лихорадки у человека с крайне тяжелым течением заболевания и высоким уровнем летальности (до 90%) [57,155].

Вирусы Эбола и Марбург относятся к семейству Filoviridae, включающему в себя два рода: Marburgvirus и Ebolavirus fhttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/ICTVdb/Ictv/index, htm). К роду Ebolavirus относятся четыре вида вирусов: Zaire ebolavirus, Sudan ebolavirus, Res ton ebolavirus, Ivory Coast ebolavirus и, возможно, недавно описанный Bundibugyo ebolavirus [72,158] Род Marburgvirus, второй представитель семейства, включает в себя единственный вид Lake Victoria marburgvirus. Геном филовирусов представлен линейной одноцепочечной РНК негативной полярности, 18959 нуклеотидов для ВЭ и 19112 нуклеотидов для ВМ. Вирионы филовирусов имеют характерную - сложную структуру, сформированную белками (NP, VP30, VP40, VP35, L-белок (РНК-зависимая РНК-полимераза) - нуклеокапсид), и вирусная частица покрыта наружной липидной оболочкой, в которой локализуется 2 структурных белка (VP24 и гликопротеин (GP)) [69]. Структурные белки - нуклеопротеин (NP), матриксный белок VP40 и кофактор вирусной полимеразы (белок VP35), являясь основными компонентами нуклеокапсида вирусов Эбола и Марбург, составляют 17%; 37,7% и 24,5% от массы вириона [69] и являются основными иммуногенами.

Симптомы, характеризующие ГЛЭ и ГЛМ в первые несколько дней инфекции, являются неспецифическими и во многом схожими с клинической картиной характерной для ряда заболеваний, вызванных другими вирусами, бактериями или простейшими (желтая лихорадка, лихорадка Ласса, дизентерия, тиф, чума, малярия и т.д. [81]), что усложняет раннюю 6 симптоматическую диагностику. Высокая патогенность данных вирусов весьма затрудняет экспериментальные работы по созданию методов лечения, профилактики и диагностики, потому что исследования ВЭ и ВМ, относящихся к I группе патогенности, требуют специально сконструированных лабораторий с максимальным уровнем биологической защиты В8Ь-4, биоохраны и специальной подготовки персонала. Тем не менее, для проведения многих видов исследований нет необходимости проводить работы с живым вирусным агентом, а достаточно использовать лишь его генетический материал. Длительное и безопасное хранение генетического материала РНК-содержащих вирусов, а также его наработка в стандартных лабораторных условиях, возможны при создании геномных библиотек, представляющих собой коллекцию гибридных плазмид, содержащих фрагменты вирусного генома.

Наряду с методом ПЦР-диагностики основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, а именно иммунодиагностике, базирующейся на выявлении специфических антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. В качестве антигенов для определения титров специфических антител могут быть использованы рекомбинантные вирусные белки, несущие в своём составе антигенные структуры, узнаваемые специфическими антивирусными антителами [137]. С использованием рекомбинантных белков открываются новые возможности для создания тест-систем, неотъемлемой частью которых является наличие библиотек генов рекомбинантных плазмид, кодирующих полноразмерные копии генов этих высокопатогенных вирусов.

Целью настоящего исследования являлось: Получение рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург и исследование их иммунохимических свойств, с помощью поликлональных (ПАТ) и моноклональных антител (МКА), специфичных к филовирусам и пополнение коллекции гибридных плазмид, содержащих полноразмерные копии генов филовирусов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Сконструировать экспрессирующие гибридные плазмиды, содержащие полноразмерные копии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург.

2. Оптимизировать условия экспрессии генов, кодирующих белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург.

3. Получить аффинно-очищенные препараты полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург. J

4. Исследовать антигенную специфичность и иммуногенность продуктов экспрессии генов NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы сконструированы гибридные плазмиды, кодирующие полноразмерные копии 8 генов УР40, ЫР вируса Эбола и УР40, УР35 вируса Марбург, пополняющие коллекцию библиотеки полноразмерных генов филовирусов.

Были оптимизированы условия экспрессии генов в составе плазмид рСХЕЗО- Р40, рС>ЕЗ(ШР ВЭ и рС^ЕЗЬ Р40, рдЕ31-УР35 ВМ в штамме Е. соИ ДМЮЗ. Были наработаны и выделены с помощью аффинной хроматографии полноразмерные рекомбинантные белки филовирусов.

Новизна и приоритет данной разработки подтверждены патентами РФ (патенты № 2395575, № 2395576, № 2395577).

Практическая ценность работы. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные копии генов ИР, УР40 вируса Эбола и УР40, УР35 вируса Марбург, что позволяет пополнить библиотеку генов гибридных плазмид высокопатогенных вирусов. Штаммы-продуценты Е. соИ позволяют наработать и выделить с помощью аффинной хроматографии полноразмерные рекомбинантные белки филовирусов для исследовательских целей и для получения различных типов иммунобиологических препаратов и вакцин.

Библиотека клонов гибридные плазмиды и рекомбинантные белки представляют собой стандартные препараты, которые могут быть использованы для обеспечения работ по изучению генетической организации вирусов, а также при разработке современных методов экспресс-диагностики геморрагических лихорадок.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гибридные плазмиды, кодирующие полные гены NP, VP40 ВЭ и VP40, VP 35 белков вирусов Эбола и Марбург, обеспечивают эффективную продукцию данных белков в прокариотической системе экспрессии.

3. Рекомбинантные белки NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ антигенно подобны вирусным белкам ВЭ и ВМ и могут быть использованы при конструировании иммунодиагностических тест-систем для обнаружения вирусных антигенов и противовирусных антител. Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены автором в форме доклада на VI Международной конференции РФФИ «Результаты фундаментальных исследований для инвестиций», г. Пущино 2001 г.; II Научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г. Новосибирск, 29-31 мая 2002 г.; Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», г. Минск, Беларусь, 22-23 октября 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для кандидатских диссертаций. Получено 5 патентов РФ на изобретение.

Вклад автора. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены диссертантом, а именно: конструирование гибридных плазмид полноразмерных копий генов под руководством к.б.н. Качко A.B. и совместно с н.с. Сорокиным A.B. Генно-инженерные манипуляции с кДНК, подготовка векторов, получение гибридных плазмид, определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК, оптимизация условий экспрессии, получение штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и очистка белков в денатурирующих условиях выполнены лично автором. Иммунологическая характеризация продуктов экспрессии рекомбинантных белков выполнена под руководством к.б.н. Казачинской Е.И.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванова, Алла Владимировна

выводы

2. Были получены полноразмерные рекомбинантные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург с чистотой 67-88%. При иммунизации аутбредных мышей ICR данные рекомбинантные белки вызывали индукцию антител, которые специфически связывались с природными антигенами вирусов Эбола и Марбург.

3. Рекомбинантные белки NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 , вируса Марбург эффективно распознаются как моноклональными антителами так и поликлональными сыворотками, специфичными к вирусам Эбола и Марбург в иммуноблоте и иммуноферментном анализе. Таким образом, данные белки подобны по своим антигенным свойствам вирусным белкам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные молекулярно-биологические исследования вирусов основаны на знаниях о структуре их генома, нуклеотидных последовательностях отдельных вирусных генов и свойствах структурных и неструктурных вирусных белков. Клонирование отдельных вирусных генов, получение вирусных белков является основой для многих прикладных исследований направленных на усовершенствование генетической и иммунологической диагностики вирусных патогенов. При проведении исследований особо опасных вирусов, относящихся к I и II группам патогенности, требуются соблюдение мер специальной биобезопасности. Как правило, требуется проведение исследований в лабораториях с максимальным уровнем биологической защиты ВБЬ-З и В8Ь-4, что существенно затрудняет проведение исследований и повышает стоимость проведения работ. В этом случае молекулярно-биологические исследования предоставляют возможность избежать объёмных работ с высокопатогенным вирусным агентом. Работа с фрагментами вирусного генома и отдельными вирусными генами позволяет обеспечить безопасность работ и при этом обеспечивает создание геномных библиотек, представляющих собой коллекцию гибридных плазмид, содержащих фрагменты вирусного генома. Создание таких коллекций позволяет проводить весь комплекс исследований направленных на совершенствование диагностики, на разработку новых вакцин и даже создание новых антивирусных препаратов.

Одной из задач данного исследования было получение коллекции плазмид, несущих полноразмерные копии вирусных генов УР40 ВЭ и УР40, УР35 ВМ. С этой целью мы использовали плазмиды серии рС^Е, которые могли обеспечить эффективный синтез соответствующих рекомбинантных белков с использованием штамма Е.соИ 1М103. Данный вектор позволяет синтезировать большие количества рекомбинантных белков с использованием штамма Е.соИ 1М103 в качестве хозяина. Плазмиды серии pQE содержат сильный промотор фага Т5, селективный маркерный ген (ген ß-лактамазы), кластер из шести остатков His и короткий участок с несколькими уникальными сайтами, распознающимися ферментами рестрикции - полилинкер. Эффект репрессии обусловлен наличием в промоторной области плазмиды pQE двух копий последовательности оператора lac-оперона, являющихся объектом действия белка-репрессора Lacl. Действие репрессора в индуцибельной системе снималось работой индуктора (ИПТГ).

В 1995 году во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» были созданы геномные библиотека ВЭ и ВМ в виде рестрикционных фрагментов, полученных гидролизом ДНК-копии полноразмерных геномов ВЭ и ВМ в составе плазмиды pBR322 в клетках E.coli JM103. Нами были получены соответствующие препараты кДНК и на их основе проведено конструирование плазмид, содержащих полноразмерные гены NP, VP40 ВЭ и VP40, VP35 ВМ. Правильность сборки плазмид, несущих встройки соответствующих вирусных генов, была подтверждена секвенированием. Для обеспечения высокого уровня продукции вирусных белков были отобраны клоны штаммов-продуцентов, обеспечивающие наиболее высокий уровень экспрессии вирусных белков по данным иммунологического тестирования с использованием специфичных МКА. Данные клоны в дальнейшем использовались для наработки рекомбинантных вирусных белков в прокариотической системе экспрессии.

Рекомбинантный белок VP40 ВЭ был наработан, очищен и процентный выход целевого белка от суммарного клеточного белка составил около 25%. Электрофоретическая подвижность рекомбинантного белка VP40 ВЭ составляла 37 кДа и соответствовала расчётной. Полученный рекомбинантный белок при иммунизации мышей ICR индуцировал синтез специфических антител к рекомбинантному белку в высоком титре (1:1968300). Антитела мышиных моносывороток, полученных к рекомбинантному белку VP40 ВЭ также эффективно распознавали

102 аналогичный белок в инактивированном препарате ВЭ в ИФА, причем титр антисывороток против VP40 достигал 1:656100. Более того, согласно полученным данным ИБ и ИФА, очищенный рекомбинантный белок VP40 эффективно распознавался специфическими МКА к ВЭ, а также другими иммунными и гипериммунными поликлональными сыворотками (лабораторные животные, иммунизированные инактивированным ВЭ). Эти результаты показывают, что рекомбинантный белок VP40 и вирусный белок VP40 антигенно подобны.

Значительную экспрессию рекомбинантного белка NP ВЭ удалось получить только после проведения оптимизации условий экспрессии. В этом случае доля индуцированного белка NP ВЭ составляла до 40% от общего клеточного белка. В известной нам литературе не удалось найти описание получения полноразмерного рекомбинантного аналога белка NP ВЭ. Данный белок был очищен Ni-хелатной хроматографией и использован для иммунизации мышей ICR. Он также высокоэффективно индуцировал синтез специфичных антител к рекомбинантному белку NP. Титр антител достигал 1:1968300, что позволило говорить о высокой иммуногенности данного рекомбинантного белка. Полученная поликлональная сыворотка эффективно взаимодействовала с антигеном ВЭ в разведении 1: 656100. Интересно отметить, что 10 видов МКА, связывающихся с NP ВЭ, также эффективно распознают рекомбинантный аналог этого белка. Это позволило сделать заключение, что рекомбинантный белок NP сохранил основные антигенные эпитопы, тождественные вирусному белку NP.

Рекомбинантные белки VP35 и VP40 ВМ были получены и очищены способом, аналогичным получению рекомбинантного белка VP40 ВЭ. Выбранные клоны обеспечивали синтез рекомбинантных белков VP35 и VP40 и их получение в препаративных количествах. Аффинно-очищенные рекомбинантные белки VP40 и VP35 ВМ также оказались высокоиммуногенными для лабораторных животных и сохранили свою антигенную структуру. Интересно отметить, что оба рекомбинантных белка эффективно распознавались сывороткой человека рековалесцента. Это позволило предположить, что рекомбинантные белки УР40, УР35 ВМ содержат антигенные детерминанты распознаваемые иммунной системой человека. Также как и рекомбинантные белки ВЭ, белки УР40, УР35 ВМ являются хорошими иммуногенами и сохраняют антигенную структуру характерную для этих вирусных белков.

Антигенная схожесть рекомбинантных белков ЫР, УР40 ВЭ и УР40, УР35 ВМ с нативными вирусными белками позволяет считать, что эти белки могут быть использованы в качестве антигенов для выявления специфических антител к филовирусам. В этом случае полученные нами полноразмерные филовирусные рекомбинантные белки могут быть использованы для конструирования тест систем для выявления вирусспецифических антител методами ИФА и ИБ. Простота получения и низкая стоимость получения этих белков позволяет их использовать для конструирования других иммунологических тестов для оценки В и Т клеточного иммунного ответа против филовирусов или даже для последующего конструирования вакцин против филовирусных инфекций.

Все полученные рекомбинантные белки сохранили способность взаимодействовать с антивирусными МКА. Это позволило сконструировать лабораторные варианты тест-систем с использованием рекомбинантных антигенов и МКА для выявления вирусных антигенов. Оценка чувствительности этих методов показала, что они способны выявлять УР40 и М5 ВЭ и УР40, УР35 ВМ с высокой чувствительностью и специфичностью. Эти экспериментальные иммуноферментные тест-системы на основе МКА антител и рекомбинантных антигенов позволяли выявлять вирусный антиген в концентрации до 1 нг/мл. В наших экспериментах мы использовали меченные биотином МКА для выявления иммунных комплексов. Использование систем иммунодетекции с усилением окраски иммунных комплексов позволяет надеяться на повышение чувствительности предложенных методов иммунодетекции до пикограммового уровня. Также важно отметить, что для филовирусных инфекций характерен высокий уровень концентрации вирусных антигенов в сыворотке крови, что делает иммунологическую детекцию этих инфекций весьма эффективной.

Таким образом, нами были клонированы копии вирусных генов NP, УР40 ВЭ и УР40, УР35 ВМ. Полученные конструкции гибридных плазмид обеспечивали уровень синтеза рекомбинантных полипептидов с выходом целевого белка от 25 до 40% от суммарного клеточного белка. Наличие таких положительных особенностей, как высокий уровень синтеза, технологичность очистки и адекватные антигенные свойства данных белков делают перспективным использование полученных нами рекомбинантных белков для научно-исследовательских работ, в частности для изучения иммунологии филовирусных инфекций, и для создания нового поколения иммунодиагностических тест-систем на основе рекомбинантных антигенов и МКА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Алла Владимировна, Кольцово

1. Бажутин Н.Б., Беланов Е.Ф., Спиридонов В.А. Влияние способов экспериментального заражения вирусом Марбург на особенности протекания болезни у зеленых мартышек. // Вопросы вирусологии. 1992. Т. 3. С. 153-156.

2. Борисевич И.В., Михайлов В.В., Краснянский Б.П. Разработка и изучение свойств иммуноглобулинов против лихорадки Эбола. // Вопросы вирусологии. 1996. Т. 41. № 6. С. 270-273.

3. Букреев A.A., Скрипченко A.A., Гусев Ю.М., Фролов В.Г., Кандрушин Е.В., Красницкая И.М., Шестопалов A.M. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург // Вопросы вирусологии. 1995. Т. 4. С. 161-165.

4. Владыко A.C., Чепурнов A.A., Быстрова С.И., Лемешко H.H., Лукашевич И. С. Выявление антигена вируса Марбург методом твердофазного иммуноферментного анализа // Вопросы вирусологии. 1991. Т. 36. № 5. С. 419-421.

5. Гончар Н.И., Пшеничнов В.А., Походяев В.А., Лопатов К.Л., Фирсова И.В. Чувствительность к вирусу Марбург различных экспериментальных животных. // Вопросы вирусологии. 1991. Т. 5. С. 435437.

6. Дрыга С.А., Святченко В.А., Микрюкова Т.П., Дрыга С.А., Святченко В.А., Микрюкова Т.П., Фурсова Е.Ю., Киселев H.H., Гончаров

7. A.M., Фролов И.В., Колыхалов A.A., Агапов Е.В., Нетесов C.B. Получение и исследование рекомбинантных штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, экспрессирующих ген preS2-S гепатита В. // Вопросы вирусологии. 1996. Т. 41. № 3. С. 100-102.

8. Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И., Суслопаров М.А., Лосев М.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. // Сибирский медицинский журнал. 2005. Т. 20. № 2. С. 53-55.

9. Казачинская Е.И., Перебоев A.B., Чепурнов A.A., Беланов Е.Ф., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург. // Вопросы вирусологии. 2000. Т. 45. № 3. С. 40-44.

10. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Нетесов C.B., Чепурнов A.A., Разумов И.А. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. // Вопросы вирусологии. 2001. Т. 46. № 5. С. 25-31.

11. Кизимов Н.В., Луб М.Ю., Черный Н.Б., Беланов Е.Ф. Использование иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаруженияантигена вируса Марбург. // Межведомственная конференция "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" 1993. Кольцово

12. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянков О.В., Пьянкова О.Г., Петрищенко В.А., Котляров Л.А. Некоторые патогенетические характеристики заболевания обезьян, аэрогенно инфицированных вирусом Марбург. //Вопросы вирусологии. 1995. Т. 4. С. 158-161.

13. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Котляров Л.А. Клинико-вирусологические характеристики заболевания морских свинок, аэрогенно нфицированных вирусом Марбург. // Вопросы вирусологии. 1995. Т. 40 . № 3. С. 119-121.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // Москва: Мир, 1984. С. 241-242.

15. Мерзликин Н.В., Чепурнов A.A., Истомина H.H., Офицеров В.И., Воробьева М.С. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола // Вопросы вирусологии. 1995. Т. 40. № 1. С. 31-35.

16. Мертвецов Н.П., Беклемишев А.Б., Савич И.М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Новосибирск: Наука, 1987.

17. Нетёсов C.B. Филовирусы загадка XX века // Соросовский образовательный журнал. 1999. Т. 8. С. 24-29.

18. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. Москва: Наука, 2000. С. 830

19. Плясунов И.В., Суслопаров М.А., Суслопаров И.М., Бахтина М.М., Махова Н.М., Гришаев М.П., Терещенко А.Н., Смердова М.И. Получение рекомбинантного антигена рЮО герпесвируса человека 6-го типа. // Биотехнология. 2004. Т. 6. С. 83-88.

20. Походаев В.А., Гончар Н.И., Пшеничнов В.А. Экспериментальное изучение контактной передачи вируса Марбург. // Вопросы вирусологии. 1991. Т. 6. С. 506-508.

21. Пузаков С.А. Химия. Москва: Медицина, 1995.

22. Пьянков О.В., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г. Патологические изменения в организме приматов, аэрозольно инфицированных вирусом Эбола. // Межведомственная конференция "Изучение и профилактика особоопасных вирусных инфекций" 1993. Кольцово

23. Разумов И.А., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. //Вопросы вирусологии. 1998. Т. 43. № 6. С. 274-279.

24. Разумов И.А., Казачинская Е.И., Чепурнов A.A. Исследование исходного штамма вируса Эбола-Заир и штамма, адаптированного к морским свинкам с помощью МКА // Вопросы вирусологии. 2010. Т. принята в печать

25. Субботина E.JI., Качко A.B., Чепурнов A.A. Свойства белков вируса Эбола. // Вопросы вирусологии. 2006. Т. 51. № 6. С. 4-10.

26. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И., Чепурнова Т.С., Волчков В.Е., Истомина H.H., Кузьмин В.А., Воробьева М.С. Получение очищенного вируса Эбола. // Вопросы вирусологии . 1994. С. 254-257.

27. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Чепурнова Т.С., Воробьева М.С. Получение кроличьих антисывороток к вирусу Эбола. // Вопросы вирусологии. 1994. Т. 6. С. 286-288.

28. Чепурнова Т.С., Писанко В.А., Бакулина Л.Ф., Жуков В.А., Чепурнов A.A. Определение содержания вируса Марбург в крови и выделениях экспериментально инфицированных животных. // Вопросы вирусологии. 2000. Т. 45. № 2. С. 18-20.

29. Чумаков М.П., Беляева А.П., Мартьянова Л.И. Выделение и изучение штаммов возбудителя зоонозной церкопитековой гемморагической лихорадки. // 15-я научная сессия : Материалы. 1968. Москва Т. 3. С. 86-88.

30. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1994.

31. Ebola haemorrhagic fever in Zaire, 1976 // Bull. World Health Organ. 1978. V. 56. No. 2. P. 271-293.

32. Electronic Citation.Ebola Virus: From Wildlife To Dogs. 2005. // http://www. sciencedaily. com/releases/2005/06/050608065550. htm. Institut De Recherche Pour Le Développement. ScienceDaily.

33. Aman M.J., Bosio C.M., Panchal R.G., Burnett J.C., Schmaljohn A., Bavari S. Molecular mechanisms of filovirus cellular trafficking // Microbes. Infect. 2003. V. 5. No. 7. P. 639-649.

34. Ascenzi P., Bocedi A., Heptonstall J., Capobianchi M.R., Di Caro A., Mastrangelo E., Bolognesi M., Ippolito G. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family // Mol. Aspects Med. 2008. V. 29. No. 3. P. 151-185.

35. Baron R.C., McCormick J.B., Zubeir O.A. Ebola virus disease in southern Sudan: hospital dissemination and intrafamilial spread // Bull. World Health Organ. 1983. V. 61. No. 6. P. 997-1003.

36. Bayer E.A., Wilchek M. The use of the avidin-biotin complex as a tool in molecular biology // Methods Biochem. Anal. 1980. V. 26. P. 1-45.

37. Bazin H., Malache I.M., Nisol F., Delaunay T. In: Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies. / Florida: CRC Press, 1990. P. 165-201.

38. Becker S., Feldmann H., Will C., Slenczka W. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? // Med. Microbiol. Immunol. 1992. V. 181. No. l.P. 43-55.

39. Becker S., Huppertz S., Klenk H.D., Feldmann H. The nucleoprotein of Marburg virus is phosphorylated // J. Gen. Virol. 1994. V. 75 ( Pt 4). P. 809818.

40. Becker S., Rinne C., Hofsass U., Klenk H.D., Muhlberger E. Interactions of Marburg virus nucleocapsid proteins // Virology. 1998. V. 249. No. 2. P. 406-417.

41. Beer B., Kurth R., Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses //Naturwissenschaften. 1999. V. 86. No. l.P. 8-17.

42. Belasco J.G., Brawerman G. In: Control of Messenger RNA Stability / Eds. Belasco J.G., Brawerman G. San Diego: Academic Press, 1993. P. 10531057.

43. Bente D., Gren J., Strong J.E., Feldmann H. Disease modeling for Ebola and Marburg viruses // Dis. Model. Mech. 2009. V. 2. No. 1-2. P. 12-17.

44. Biek R., Walsh P.D., Leroy E.M., Real L.A. Recent common ancestry of Ebola Zaire virus found in a bat reservoir // PLoS. Pathog. 2006. V. 2. No. 10. P. e90

45. Bowen E.T., Lloyd G., Harris W.J., Platt G.S., Baskerville A., Vella E.E. Viral haemorrhagic fever in southern Sudan and northern Zaire. Preliminary studies on the aetiological agent // Lancet. 1977. V. 1. No. 8011. P. 571-573.

46. Bray M. The role of the Type I interferon response in the resistance of mice to filovirus infection // J. Gen. Virol. 2001. V. 82. No. Pt 6. P. 1365-1373.

47. Bray M., Murphy F.A. Filovirus research: knowledge expands to meet a growing threat // J. Infect Dis. 2007. V. 196 Suppl 2. P. S438-S443

48. Bukreyev A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M., Dryga S.A., Netesov S.V. The complete nucleotide sequence of the Popp (1967) strain of Marburg virus: a comparison with the Musoke (1980) strain // Arch. Virol. 1995. V. 140. No. 9. P. 1589-1600.

49. Bukreyev A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. Homology between Marburg and Ebola viruses // FEBS Lett. 1993. V. 322. No. 1. P. 41-46.

50. Chen H., Bjerknes M., Kumar R., Jay E. Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli mRNAs // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. No. 23. P. 4953-4957.

51. Cretich M., Damin F., Pirri G., Chiari M. Protein and peptide arrays: recent trends and new directions // Biomol. Eng. 2006. V. 23. No. 2-3. P. 77-88.

52. Curran J., Kolakofsky D. Replication of paramyxoviruses // Adv. Vims Res. 1999. V. 54. P. 403-422.

53. Dalgard D.W., Hardy R.J., Pearson S.L., Pucak G.J., Quander R.V., Zack P.M., Peters C.J., Jährling P.B. Combined simian hemorrhagic fever and Ebola virus infection in cynomolgus monkeys // Lab Anim Sei. 1992. V. 42. No. 2. P. 152-157.

54. Dessen A., Volchkov V., Dolnik O., Klenk H.D., Weissenhorn W. Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus // EMBO J. 2000. V. 19. No. 16. P. 4228-4236.

55. Elliott L.H., Kiley M.P., McCormick J.B. Descriptive analysis of Ebola virus proteins//Virology. 1985. V. 147. No. l.P. 169-176.

56. Elliott L.H., McCormick J.B., Johnson K.M. Inactivation of Lassa, Marburg, and Ebola viruses by gamma irradiation // J. Clin. Microbiol. 1982. V. 16. No. 4. P. 704-708.

57. Feldmann H., Kiley M.P. Classification, structure, and replication of filoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. V. 235. P. 1-21.

58. Feldmann H., Klenk H.D. Marburg and Ebola viruses // Adv. Virus Res. 1996. V. 47. P. 1-52.

59. Feldmann H., Klenk H.D., Sanchez A. Molecular biology and evolution of filoviruses // Arch. Virol. Suppl. 1993. V. 7. P. 81-100.

60. Feldmann H., Muhlberger E., Randolf A., Will C., Kiley M.P., Sanchez A., Klenk H.D. Marburg virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle // Virus Res. 1992. V. 24. No. 1. P. 1-19.

61. Feldmann H., Will C., Schikore M., Slenczka W., Klenk H.D. Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus // Virology. 1991. V. 182. No. 1. P. 353-356.

62. Frank R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications // J. Immunol. Methods. 2002. V. 267. No. l.P. 13-26.

63. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.J. Virus maturation by budding // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. No. 4. P. 1171-1190.

64. Gear J.H. Hemorrhagic fevers, with special reference to recent outbreaks in southern Africa // Rev. Infect. Dis. 1979. V. 1. No. 4. P. 571-591.

65. Geisbert T.W., Jahrling P.B. Differentiation of filoviruses by electron microscopy // Virus Res. 1995. V. 39. No. 2-3. P. 129-150.

66. Geisse S., Gram H., Kleuser B., Kocher H.P. Eukaryotic expression systems: a comparison // Protein Expr. Purif. 1996. V. 8. No. 3. P. 271-282.

67. Gold L. Expression of heterologous proteins in Escherichia coli // Methods Enzymol. 1990. V. 185. P. 11-14.

68. Haas R., Maas I., Muller I. In: Marburg virus disease / Eds. Haas R., Maas I., Muller I. Berlin: Springer-Verlag, 1971. P. 136-143.

69. Hasan N., Szybalski W. Construction of laclts and laclqts expression plasmids and evaluation of the thermosensitive lac repressor // Gene. 1995. V. 163. No. l.P. 35-40.

70. Hevey M., Negley D., Geisbert J., Jährling P., Schmaljohn A. Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein expressed by baculovirus recombinants //Virology. 1997. V. 239. No. 1. P. 206-216.

71. Huang Y., Xu L., Sun Y., Nabel G.J. The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein // Mol. Cell. 2002. V. 10. No. 2. P. 307-316.

72. Jährling P.B., Geisbert T.W., Dalgard D.W., Johnson E.D., Ksiazek T.G., Hall W.C., Peters C.J. Preliminary report: isolation of Ebola virus from monkeys imported to USA // Lancet. 1990. V. 335. No. 8688. P. 502-505.

73. Virulence of Ebola-related Reston virus for experimentally inoculated cynomolgus monkeys. Berlin, Germany. 1990. P. W52-1 VIII-th International Congress of Virology.

74. Jährling P.B., Geisbert T.W., Jaax N.K., Hanes M.A., Ksiazek T.G., Peters C.J. Experimental infection of cynomolgus macaques with Ebola-Reston filoviruses from the 1989-1990 U.S. epizootic // Arch. Virol. Suppl. 1996. V. 11. P. 115-134.

75. Jasenosky L.D., Neumann G., Lukashevich I., Kawaoka Y. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer // J. Virol. 2001. V. 75. No. 11. P. 5205-5214.

76. Johnson E., Jaax N., White J., Jährling P. Lethal experimental infections of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus // Int. J. Exp. Pathol. 1995. V. 76. No. 4. P. 227-236.

77. Johnson R.F., Bell P., Harty R.N. Effect of Ebola virus proteins GP, NP and VP35 on VP40 VLP morphology // Virol. J. 2006. V. 3. P. 31

78. Johnson R.F., McCarthy S.E., Godlewski P.J., Harty R.N. Ebola virus VP35-VP40 interaction is sufficient for packaging 3E-5E minigenome RNA into virus-like particles // J. Virol. 2006. V. 80. No. 11. P. 5135-5144.

79. Kallstrom G., Warfield K.L., Swenson D.L., Mort S., Panchal R.G., Ruthel G., Bavari S., Aman M.J. Analysis of Ebola virus and VLP release using an immunocapture assay // J. Virol. Methods. 2005. V. 127. No. 1. P. 1-9.

80. Kartalov E.P., Zhong J.F., Scherer A., Quake S.R., Taylor C.R., Anderson W.F. High-throughput multi-antigen microfluidic fluorescence immunoassays //Biotechniques. 2006. V. 40. No. 1. P. 85-90.

81. Kolesnikova L., Bamberg S., Berghofer B., Becker S. The matrix protein of Marburg virus is transported to the plasma membrane along cellular membranes: exploiting the retrograde late endosomal pathway // J. Virol. 2004. V. 78. No. 5. P. 2382-2393.

82. Ksiazek T.G., Rollin P.E., Jährling P.B., Johnson E., Dalgard D.W., Peters C.J. Enzyme immunosorbent assay for Ebola virus antigens in tissues of infected primates // J. Clin. Microbiol. 1992. V. 30. No. 4. P. 947-950.

83. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. No. 5259. P. 680-685.

84. Lahm S.A., Kombila M., Swanepoel R., Barnes R.F. Morbidity and mortality of wild animals in relation to outbreaks of Ebola haemorrhagic fever in

85. Gabon, 1994-2003 // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2007. V. 101. No. 1. P. 6478.

86. Lai C.F., Gong S.C., Esteban M. The purified 14-kilodalton envelope protein of vaccinia virus produced in Escherichia coli induces virus immunity in animals//J. Virol. 1991. V. 65. No. 10. P. 5631-5635.

87. Le Guenno B., Formenty P., Wyers M., Gounon P., Walker F., Boesch C. Isolation and partial characterisation of a new strain of Ebola virus // Lancet. 1995. V. 345. No. 8960. P. 1271-1274.

88. Leroy E.M., Kumulungui B., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba P., Delicat A., Paweska J.T., Gonzalez J.P., Swanepoel R. Fruit bats as reservoirs of Ebola virus // Nature. 2005. V. 438. No. 7068. P. 575-576.

89. Leroy E.M., Souquiere S., Rouquet P., Drevet D. Re-emergence of ebola haemorrhagic fever in Gabon // Lancet. 2002. V. 359. No. 9307. P. 712

90. Licata J.M., Johnson R.F., Han Z., Harty R.N. Contribution of ebola vims glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles // J. Virol. 2004. V. 78. No. 14. P. 7344-7351.

91. Phosphorylation of Marburg virus structural proteins. Marburg, Germany.2000. Symposium on Marburg and Ebola viruses.

92. Lowry O.H., ROSEBROUGH N.J, FARR A.L, RANDALL R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. No. l.P. 265-275.

93. Lucht A, Grunow R, Moller P, Feldmann H, Becker S. Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus // J. Virol. Methods. 2003. V. 111. No. 1. P. 21-28.

94. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. No. 3. P. 512-538.

95. Mitchell S.W, McCormick J.B. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses // J. Clin. Microbiol. 1984. V. 20. No. 3. P. 486-489.

96. Monath T.P. Ecology of Marburg and Ebola viruses: speculations and directions for future research // J. Infect Dis. 1999. V. 179 Suppl l.P. S127-S138

97. Muhlberger E, Sanchez A, Randolf A, Will C, Kiley M.P, Klenk H.D, Feldmann H. The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: homologies with paramyxoviruses and rhabdoviruses // Virology. 1992. V. 187. No. 2. P. 534-547.

98. Muhlberger E., Trommer S., Funke C., Volchkov V., Klenk H.D., Becker S. Termini of all mRNA species of Marburg virus: sequence and secondary structure // Virology. 1996. V. 223. No. 2. P. 376-380.

99. Muhlberger E., Weik M., Volchkov V.E., Klenk H.D., Becker S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems // J. Virol. 1999. V. 73. No. 3. P. 2333-2342.

100. Murphy F.A., van der Groen G., Whitfield S.G., Lance J.V. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy. // In: Ebola virus haemorrhagic fever. / Ed. Pattyn S.R. Amsterdam: Elsevier North-Holland, 1978. P. 61-68.

101. Ning B.F., Zhu H.M., Zhou X.J., Cao Y., Zhou A.G. Prokaryotic expression, purification of prM of JEV and preparation of monoclonal antibody. // Zhonghua Shi Yan. He. Lin. Chuang. Bing. Du Xue. Za Zhi. 2008. V. 22. No. 1. P. 65-67.

102. Nöda T., Sagara H., Suzuki E., Takada A., Kida H., Kawaoka Y. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP // J. Virol. 2002. V. 76. No. 10. P. 4855-4865.

103. Nöda T., Watanabe S., Sagara H., Kawaoka Y. Mapping of the VP40-binding regions of the nucleoprotein of Ebola virus // J. Virol. 2007. V. 81. No. 7. P. 3554-3562.

104. Okware S.I., Omaswa F.G., Zaramba S., Opio A., Lutwama J.J., Kamugisha J., Rwaguma E.B., Kagwa P., Lamunu M. An outbreak of Ebola in Uganda // Trop. Med. Int. Health. 2002. V. 7. No. 12. P. 1068-1075.

105. Pattyn S., van der G.G., Courteille G., Jacob W., Piot P. Isolation of Marburg-like virus from a case of haemorrhagic fever in Zaire // Lancet. 1977. V. 1. No. 8011. P. 573-574.

106. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // In: Fields Virology. / Ed. Fields B.N. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. P. 1161-1176.

107. Pringle C.R. The order Mononegavirales // Arch. Virol. 1991. V. 117. No. 1-2. P. 137-140.

108. Regnery R.L., Johnson K.M., Kiley M.P. Virion nucleic acid of Ebola virus // J. Virol. 1980. V. 36. No. 2. P. 465-469.

109. Ruigrok R.W., Schoehn G., Dessen A., Forest E., Volchkov V., Dolnik O., Klenk H.D., Weissenhorn W. Structural characterization and membrane binding properties of the matrix protein VP40 of Ebola virus // J. Mol. Biol. 2000. V. 300. No. l.P. 103-112.

110. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimaloligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of

111. DNA //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. No. 21. P. 8543-8551.128

112. Sambrook J., Fritisch T.E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

113. Sanchez A., Khan A.S., Zaki S.R., Nabel G.J., Ksiazek T.G., Peters

114. C.J. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // Ed. Fields B.N. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2001. P. 1279-1304.

115. Sanchez A., Kiley M.P., Holloway B.P., Auperin D.D. Sequence analysis of the Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of Marburg virus // Virus Res. 1993. V. 29. No. 3. P. 215-240.

116. Sanchez A., Kiley M.P., Holloway B.P., McCormick J.B., Auperin

117. D.D. The nucleoprotein gene of Ebola virus: cloning, sequencing, and in vitro expression //Virology. 1989. V. 170. No. 1. P. 81-91.

118. Sehr P., Zumbach K., Pawlita M. A generic capture ELISA for recombinant proteins fused to glutathione S-transferase: validation for HPV serology // J. Immunol. Methods. 2001. V. 253. No. 1-2. P. 153-162.

119. Seong S.Y., Choi C.Y. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application // Proteomics. 2003. V. 3. No. 11. P. 21762189.

120. Siegert R, Shu H.L, Slenczka W, Peters D, Muller G. On the etiology of an unknown human infection originating from monkeys. // Dtsch. Med. Wochenschr. 1967. V. 92. No. 51. P. 2341-2343.

121. Smith D.H., Johnson B.K, Isaacson M, Swanapoel R, Johnson K.M., Killey M, Bagshawe A, Siongok T, Keruga W.K. Marburg-virus disease in Kenya//Lancet. 1982. V. 1. No. 8276. P. 816-820.

122. Sorokin A.V., Kazachinskaia E.I, Ivanova A.V, Kachko A.V, Netesov S.V., Bukreyev A.A., Loktev V.B, Razumov I.A. Mapping of two dominant sites of VP35 of Marburg virus // Viral Immunol. 2002. V. 15. No. 3. P. 481-492.

123. Stewart B.J, Houghton R.L, Morrow W.J.W, Raychaudhuri S. Design considerations for immunodiagnostics. // IVD Technology. 2006. V. 12. P. 47-53.

124. Subbotina E, Dadaeva A, Kachko A, Chepurnov A. Genetic factors of Ebola virus virulence in guinea pigs // Virus Res. 2010. V. 153. No. 1. P. 121133.

125. Swanepoel R, Leman P.A., Burt F.J, Zachariades N.A, Braack L.E, Ksiazek T.G, Rollin P.E., Zaki S.R, Peters C.J. Experimental inoculation of plants and animals with Ebola virus // Emerg Infect Dis. 1996. V. 2. No. 4. P. 321-325.

126. Theriault S, Groseth A, Neumann G, Kawaoka Y, Feldmann H. Rescue of Ebola virus from cDNA using heterologous support proteins // Virus Res. 2004. V. 106. No. 1. P. 43-50.

127. Timmins J., Scianimanico S., Schoehn G., Weissenhorn W. Vesicular release of ebola virus matrix protein VP40 // Virology. 2001. V. 283. No. 1. P. 1-6.

128. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. V. 76. No. 9. P. 4350-4354.

129. Towner J.S., Pourrut X., Albarino C.G., Nkogue C.N., Bird B.H., Grard G., Ksiazek T.G., Gonzalez J.P., Nichol S.T., Leroy E.M. Marburg virus infection detected in a common African bat // PLoS. One. 2007. V. 2. No. 1. P. e764

130. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses // FEBS Lett. 1992. V. 305. No. 3. P. 181-184.

131. Volchkov V.E., Chepurnov A.A., Volchkova V.A., Ternovoj V.A., Klenk H.D. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus // Virology. 2000. V. 277. No. 1. P. 147-155.

132. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Chepurnov A.A., Blinov V.M., Dolnik O., Netesov S.V., Feldmann H. Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus // J. Gen. Virol. 1999. V. 80 ( Pt 2). P. 355-362.

133. Expression strategy of the Ebola virus GP gene: implication of the transcriptional RNA editing. Marburg, Germany.2000. P. 4 Symposium on Marburg and Ebola viruses.

134. Warfield K.L., Swenson D.L., Olinger G.G., Kaiina W.V., Aman M.J., Bavari S. Ebola virus-like particle-based vaccine protects nonhuman primates against lethal Ebola virus challenge // J. Infect Dis. 2007. V. 196 Suppl 2. P. S430-S437

135. Watanabe S., Nöda T., Kawaoka Y. Functional mapping of the nucleoprotein of Ebola virus // J. Virol. 2006. V. 80. No. 8. P. 3743-3751.

136. Watanabe S., Watanabe T., Nöda T., Takada A., Feldmann H., Jasenosky L.D., Kawaoka Y. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics // J. Virol. 2004. V. 78. No. 2. P. 999-1005.

Информация о работе

Иванова, Алла Владимировна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы