Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

Казачинская, Елена Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека"

ИИ4613912

Казачинская Елена Ивановна

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

03.01.06 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Кольцово-2010

004613912

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный консультант Доктор биологических наук,

профессор Локтев Валерий Борисович

Официальные доктор медицинских наук,

оппоненты: профессор Кожевников Владимир Сергеевич

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

доктор медицинских наук,

профессор Бочаров Евгений Федорович

Ведущая организация НИИ молекулярной биологии и биофизики (НИИМББ) СО РАМН, г. Новосибирск

Защита состоится «_ 24__» декабря_2010 г. в_133_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Проблема быстрой и точной диагностики инфекционных болезней имеет чрезвычайно важное значение для современного общества. Многие инфекционные заболевания представляют угрозу для жизни и здоровья не только для конкретного индивидуума, но для всего общества. Быстрое и не контролируемое распространение инфекционных заболеваний может привести к развитию эпидемии или даже пандемии в течение весьма короткого периода времени. В последние годы вспышки короновирусной инфекции, птичьего гриппа, пандемического вируса гриппа H1N1 подтверждают крайне высокую значимость борьбы с инфекционными заболеваниями в современном мире (Кущ A.A. и др., 2008; Che X.Y. et al„ 2004; He Q. et al„ 2007).

Важнейшей составляющей борьбы с инфекционными заболеваниями является своевременная их диагностика. В настоящее время развиваются два основных подхода в диагностике инфекционных заболеваний. Генетическая диагностика, основанная на выявлении нуклеиновой кислоты возбудителя, и иммунодиагностика, базирующаяся на выявлении специфических антигенов и антител, являются взаимодополняющими методическими подходами. Следовательно, крайне важно развивать оба эти направления исследований. Сложность проблемы состоит в том, что в настоящее время известны тысячи опасных инфекционных заболеваний, которые могут поражать сельскохозяйственные растения, домашних животных и человека. Кроме того, постоянно возникают новые, неизвестные инфекционные заболевания. По данным Международного таксономического вирусологического комитета только в последние годы зарегистрировано несколько сотен вновь открытых вирусных агентов. Открытие каждого нового возбудителя требует разработки методов их диагностики, причем эпидемическая значимость некоторых из них требует проведения этих исследований в самые кратчайшие сроки. Проблема усложняется тем, что постоянно возникают лекарственно устойчивые варианты возбудителей, многие вирусные агенты чрезвычайно быстро изменяются. Высокая патогенность многих вирусов также чрезвычайно усложняет экспериментальные работы по созданию новых методов диагностики. Вследствие этого, необходимо постоянное развитие и совершенствование биотехнологической базы для точной и своевременной диагностики инфекционных заболеваний.

Для совершенствования диагностики инфекций используют два основных подхода. Это технологии получения моноклональных антител (МКА) и рекомбинантных антигенов. Гибридомная технология позволяет создавать уникальную биотехнологическую базу в виде препаратов МКА для исследования вирусных и бактериальных патогенов, опухолевых маркеров, гормонов, цитокинов, интерлейкинов, прионов, токсинов, аллергенов.

В настоящее время МКА применяются в повседневной практике научных лабораторий, активно используются для конструирования и производства высокоспецифичных тест-систем и все шире применяются в практической медицине. Использование рекомбинантных антигенов также позволяет совершенствовать иммунодиагностику. Важно заметить, оба этих подхода позволяют фактически прекратить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве тест систем. Другим важнейшим преимуществом данных технологий является возможность стандартизации качества новых иммунодиагностических систем и обеспечения производства иммунодиагностических тест-систем необходимыми биологическими компонентами (антителами и антигенами) в течение неопределенно длительного времени.

Характерной особенностью филовирусных инфекций является раннее появление вирусных антигенов в тканях, выделениях и сыворотке крови инфицированных животных и заболевших людей (Кизимов Н.В. и др., 1993; Мерзликин Н.В. и др., 1995; Rovve А.К., 1999; Чепурнова Т.С. и др., 2000). Эта особенность развития заболевания делает высокоэффективными методы иммунологической диагностики, основанные на раннем выявлении вирусных антигенов в биологических жидкостях человека и животных. Препараты очищенных МКА могут служить основой ИФА тест-системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике (Towner J.S. et al., 2004).

Вспышка 1999 г. в Волгоградской, Астраханской областях и Краснодарском крае лихорадки Западного Нила (JI3H), которая считалась эндемичной для тропических и субтропических стран, привлекла внимание к проблеме диагностики этой инфекции и потребовала быстрейшей ее разработки в нашей стране (Львов Д.К. и др., 2000). Тем более, что позднее появились сообщения о циркуляции вируса Западного Нила (ВЗН) в птицах, комарах и клещах от Белоруссии до Приморского края, в Закавказье, бассейне Каспийского моря, республиках средней Азии, в Сибири (Львов Д.К., 2000, Терновой В.А. и др., 2004; Терновой В.А. и др., 2006). ВЗН передается теплокровным (людям, лошадям, птицам) через укус комаров, клещей и москитов. В США зафиксированы случаи, когда ЛЗН развивалась у реципиентов после переливания крови (Harrington Т., 2003). ЛЗН особенно опасна для пожилых людей, у которых может развиться миокардит, менингит и менингоэнцефалит, что приводит к 10 %-ной летальности среди заболевших (Flatau E.et al., 1981). События 2010 г. на юге России, где снова возникла большая вспышка лихорадки Западного Нила, подтвердили значимость настоящего исследования и практическое использование разработанных тест-систем обеспечило необходимые условия для борьбы с этой инфекцией в России.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), вызываемая вирусом герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5) - широко распространенное заболевание повсеместно во всех географических зонах, странах и социально-экономических группах (Alford С.А. et al., 1981). Главной биологической особенностью ВГЧ-5 является его пожизненное персистирование в организме человека и реактивация при снижении иммунитета. Заражение происходит разными путями: воздушно - капельным и при тесном контакте (в том числе и половом) через биологические жидкости, трансплацентарно (от матери к плоду) и интранатально во время родов при прохождении плода через инфицированные родовые пути женщины, при кормлении ребенка грудным молоком (Alford С.А. et al., 1990). Подтверждены факты инфицирования людей при трансплантации органов (почек, печени и костного мозга) (Chou S., 1986; Meijer Е. et al., 2003; Razonable R.R., 2008). ВГЧ-5 вызывает генерализованную инфекцию у больных СПИД, что является причиной их гибели (Nigro G.et al., 1996). Сложность диагностики связана с проблемами персистирования этого вируса в клетках организма и необходимостью выявления вирусных антигенов именно в инфицированных клетках. В настоящее врем, за рубежом, присутствие на мембранах периферических лейкоцитов матриксного фосфопротеина рр65 и секреторного р72 ВГЧ-5 принято

считать одним из основных критериев острой ЦМВИ. Получение отечественной панели МКА, специфичных к белку рр65, помогло бы улучшить ситуацию с диагностированием острой ЦМВИ у инфицированных людей.

Цель работы: разработка биотехнологической базы для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа (цитомегаловирусом).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие чадачи:

1. Получить представительные коллекции гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), специфичные к белкам филовирусов Марбург и Эбола, вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5).

2. Исследовать иммунохимические свойства МКА к структурным белкам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 и оценить возможность их использования для конструирования иммунодиагностических тест-систем на основе МКА.

3. Сконструировать рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксных белков УР40 вирусов Марбург и Эбола и получить полноразмерные рекомбинантные белки.

4. Исследовать антигенную структуру природных и рекомбинантных белков вирусов Марбург и Эбола с помощью панелей противовирусных поликлональных антител и гибридомных МКА с целью оценки возможности использования рекомбинантных антигенов для разработки иммунодиагностических тест-систем.

5. С использованием полученных МКА и рекомбинантных антигенов сконструировать новое поколение иммуноферментных систем для детекции антигенов вирусов Эбола и Марбург в биологических пробах.

6. С использованием МКА, специфичных к белку Е вируса Западного Нила, сконструировать лабораторный вариант экспериментальной ИФА тест-системы для выявления вирусного антигена, оценить ее специфичность и чувствительность. Организовать коммерческий выпуск новой тест системы на основе МКА для широкого апробирования на практике.

7. Исследовать возможность использования МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, для диагностики острой и персистентной цитомегаловирусной инфекции на культурах клеток.

Научная новизиа

Получены оригинальные и представительные коллекции гибридных клеток -продуцентов МКА и панели очищенных МКА, специфичных к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5.

Исследование иммунохимических свойств панели гибридомных МКА показало, что они могут быть использованы для научных исследований и для конструирования нового поколения иммунодиагностических тест-систем на основе этих антител.

Получены оригинальные рекомбинантные белки - гликопротеин (ОР), нуклеопротеин (КР), УР40, УР35, УР24 вируса Марбург и белки ЫР, УР40, УР35 вируса Эбола. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков показало иммунохимическую полноценность препаратов, что позволяет использовать их при конструировании диагностических тест систем на филовирусные инфекции.

В результате проведенных исследований, с использованием оригинальных препаратов МКА, а также рекомбинантных антигенов филовирусов, сконструированы новые диагностические лабораторные тест-системы для выявления антигенов вирусов

Марбург и Эбола. Новизна и приоритет данной разработки подтверждена получением четырех патентов РФ (патенты № 2395575, № 2393220, № 2395576, № 2395577)

Исследование панели вируснейтрализуюших МКА к белку Е вируса Западного Нила (LEIV-VLG99-27889-human) позволило обнаружить два вида МКА (9Е2 и 5Н6), пригодных для конструирования иммуноферментной тест-системы для детекции антигена в биологических пробах.

Показана способность различных видов МКА, полученных к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, выявлять в иммуноблоттинге вирусный белок рр65. Иммуноцитохимическим методом показана способность МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65, выявлять вирусный белок рр65 в монослое клеток Vero, персистентно инфицированных цитомегаловирусом человека.

Практическая ценность работы

С использованием созданных панелей МКА, специфичных к различным вирусным патогенам, в том числе высокопатогенным вирусам Марбург и Эбола, и препаратов рекомбинантных белков, созданы новые лабораторные образцы иммунодиагностических наборов. Это наборы для выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7Н10; наборы для выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9; наборы для выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения); наборы для выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и ICI. Каждая из четырех разработанных конструкций тест-системы защищена патентом РФ (№ 2393220, № 2395575, № 2395576, № 2395577).

Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксные белки VP40 вирусов Марбург и Эбола, что позволяет нарабатывать соответствующие рекомбинантные белки филовирусов для практического использования, конструирования различных типов иммунобиологических препаратов. Данные белки могут также использоваться для конструирования вакцин, исследования иммунологии и патогенеза филовирусных инфекций. Важно отметить, что предложенный биотехнологический подход позволяет получать антигены филовирусов без использования лаборатории BSL-4 уровня и высокопатогенных вирусов Марбург и Эбола.

Практическая ценность оригинальной коллекции из 24 мышиных гибридом, секретирующих МКА к вирусу Западного Нила (российский штамм LEIV-VLG99-27889-liuman) состоит в том, что МКА, секретируемые этими клетками -продуцентами, обладают вируснейтрализующей активностью в отношении различных штаммов ВЗН. Это позволяет использовать данные МКА для конструирования нового поколения иммунотерапевтических препаратов для лечения лихорадки Западного Нила. Это возможность была продемонстрирована в создании нового метода генной терапии лихорадки Западного Нила с использованием гена МКА 9Е2 (Pereboev A.V. et al., 2008).

Разработанная лабораторная тест-система ИФА в формате "сэндвич" на основе пары МКА (9Е2 и 5Н6) позволила создать совместно с ЗАО "Вектор-Бест" экспериментальную тест-систему ИФА "ВектоНил-антиген" для выявления антигена вируса Западного Нила в полевых материалах и организовать ее производство. Данная система успешно производится более четырех лет и используется в практическом здравоохранении. В настоящее время на основе этих же МКА 9Е2, используемых в качестве "подложки" для антигена, ЗАО "Вектор-Бест" также выпускает тест-систему

ИФА для выявления специфических антител класса IgG против вируса Западного Нила ("ВектоНил-IgG") и тест-систему ИФА для определения индекса авидности антител класса IgG, специфичных к вирусу Западного Нила ("ВектоНил-IgG-авидность").

Получены 11 оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5. Очищенные МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, были успешно использованы для выявления вирусного белка рр65 - маркера острой цитомегаловирусной инфекции. Штамм гибридных клеток животного Mus Musculus L. 5F10, используемый для получения высокоспецифичных МКА 5F10, защищен патентом РФ № 2393219. Одноименные МКА могут стать основой для совершенствования диагностики этой инфекции у человека, что чрезвычайно важно в практическом здравоохранении.

Получение панелей МКА и набора рекомбинантных антигенов в рамках настоящей работы позволяет говорить, что удалось создать биотехнологическую базу для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа. Помимо использования этих иммунобиологических препаратов для разработки нового поколения иммунодиагностических тест-систем возможно их использование для исследовательских целей. Важно подчеркнуть, что рекомбинантные антигены и МКА представляют собой стандартные препараты, которые могут храниться очень долго. Плазмиды и гибридные клетки могут обеспечивать наработку этих биореагентов в необходимых количествах на протяжении неограниченного времени без использования патогенных и высокопатогенньгх вирусных агентов.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Марбург (штамм Popp) - к кофактору вирусной полимеразы (белку VP35) - 3 вида, к нуклеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопьг не определяются.

2. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Эбола-Заир (штамм Mayinga) - к белку VP35 (2 вида), к нуклеопротеину (9 видов мышиного происхождения и 1 вид крысиного происхождения), остальные 9 видов МКА специфичны к матриксному белку VP40.

3. Рекомбинантные белки GP, VP24, NP, VP40 и VP35 филовирусов, полученные в экспрессионной системе E.coli, сохранили антигенную структуру, характерную для аналогичных вирусных белков, и в связи с этим, они могут быть успешно использованы для иммунодиагностики филовирусных инфекций.

4. Способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7Н10.

5. Способ выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9, которые можно одновременно использовать как в качестве "захватывающих антиген", так и в качестве "индикаторных" антител.

6. Способ выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения).

7. Метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и ICI.

8. Панель из 15-ти МКА (мышиного происхождения), специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLG99-27889-hiiman). Гибридную клеточную линию 9Е2 и одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности против семи штаммов ВЗН. Возможность использования МКА 9Е2 и 5Н6 в тест-системе "ВектоНил-ангиген".

9. Коллекция из 11-ти оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типам способны высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток (в чувствительной L68 и персистентно инфекпированных Vero и RH).

Конкретное участие автора в получении результатов

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с д.б.н. Разумовым И.А., д.б.н. Локтевым В.Б., к.б.н. Качко A.B., н.с. Ивановой A.B., к.б.н. Субботиной Е.Л., к.б.н. Перебоевым A.B., д.б.н. Чепурновым A.A., к.б.н. Белановым Е.Ф., к.б.н. Терновым В.А., н.с. Сорокиным A.B., д.б.н. Нетесовым C.B., д.м.н. |Суслопаровым M.Â], зав. лаб. ЗАО "Вектор-Бест" Распопиным В.В.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Xth International Congress of Virology, Jerusalem 1996 г.; Russian-german colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. 1997 г.; 6th Biological Medical Defence Conference. München 1999 г.; Inauguration of the Swedish Containment Laboratories. Stocgolm 2000 г.; IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф 2001 г.; VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Московская обл., г. Пущино 2001 г.; Digest reports of the IV th ISTC scientific advisory committee seminar on "Basic science in ISTC activities", Novosibirsk, 2001 г.; II Научная конференция с международным участием. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск, 2002 г.; Всероссийская научно-практическая конференция "Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке", Томск, 2006 г.; XIV International Congress of Virology, 2008 г., Istanbul; Научная конференция "Медицинская геномика и протеомика", 2009 г., Новосибирск; Международная научно-практическая конференция "Современные проблемы инфекционной патологии человека", г. Минск, Республика Беларусь, 2009 г.

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ "Вектор" за период 1998-2010 гг. в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению "Изучение структурно - функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных". Исследования были поддержаны государственной программой "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", контракт № 43.035.11.1529 (рук. д.б.н. Чепурнов A.A.); проектом по государственному контракту № 02.512.11.2004 "Биосенсоры на базе полимерных микрочастиц - жидких микрочипов для иммунодетекции инфекционных заболеваний, в том числе и особо опасных вирусных инфекций" (рук. зав. лаб. ИХКГ СО РАН д.ф.-м.н., профессор Мальцев В.П.); проектом Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISNC № 2087 (рук. д.б.н..

профессор Локтев В.Б.); проектами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 97-04-49697-а (рук. д.б.н. Разумов И.А.), № 98-04-49439-а (рук. д.б.н., профессор Нетесов C.B.), № 01-04-49877-а (рук. к.б.н. Качко A.B.), № 01-04-48972-а (рук. д.б.н. Разумов И.А.); №09-0400450 а (рук. д.б.н., профессор Локтев В.Б.); грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ "Научная школа НШ-387.2008.4" (рук. д.б.н., профессор Нетесов C.B.); контрактами, выполняемыми в 2009 г. по заказу ФГУЗ РосНИИПЧИ "Микроб" и ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии в рамках ФЦП "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.): № б/ф/09 "Создание научно-технической основы для разработки новых методических и инструментальных подходов к индикации возбудителей особо опасных инфекций, с помощью высокочувствительных биосенсоров" (рук. к.б.н. Агафонов А.П.); № 127-Д/1 "Разработка методов получения антигенов и антител для использования в микроэррей технологии (рук. д.б.н., профессор Локтев В.Б.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 статей (в реферируемых журналах, входящих в список ВАК), 20 тезисов, получено 7 патентов РФ на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, главы материалы и методы, 3-х глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 338 стр., включает 28 таблиц и 53 рисунка. Список литературы состоит из 753 источников, включая 132 отечественных работ.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследований

В работе использовали вирус Марбург (ВМ) штамм Popp, концентрированный и очищенный методом ультрацентрифугирования плазмы крови инфицированных морских свинок (Букреев A.A. и др., 1995) и инактивированный в течение 24 ч при 810 °С добавлением 0,17 % димера этиленимина (ДЭИ) с дальнейшим прогреванием при 60 °С в течение 1 часа (Mitchel S. et al., 1984). Вирус Эбола-Заир (ВЭ) штамм Mayinga, был сконцентрирован и очищен из суспензии инфицированной культуры клеток Vero. ВЭ инактивировали кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5 % ß-меркапгоэтанола и 1 % додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60 °С в течение 1 часа (Чепурнов A.A. и др., 1994). Получение рекомбинантных (рек.) белков ВМ в результате экспрессии в прокариотической системе Е. coli полноразмерных генов VP35, VP24, GP, NP описано (Сорокин A.B. и др., 1999; Качко A.B. и др., 2001) и препараты предоставлены авторами.

Семь штаммов вируса Западного Нила (ВЗН): LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLGOO-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV-Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; EglOl, полученные из коллекции вирусных препаратов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, были пассированы на культуре клеток Vero и на новорожденных белых мышах заражением в мозг.

Сыворотка крови морских свинок, инфицированных ВЭ (референс-антисыворотка), получена из Белорусского НИИ ЭМ. Коммерческие препараты лошадиных IgG против инфекционных ВЭ и ВМ, очищенные спиртовым

фракционированием по Кону (Борисевич И.В. и др., 1996), получены из ВЦ НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад). Получение сывороток против ВЭ и ВМ проводили иммунизацией мышей BALB/c (массой 18-20 г), крыс Lou (массой 180-200 г) инактивированными вирусными препаратами. Сыворотка крови кроликов, специфичная к ВМ, получена при иммунизации животных инактивированным вирусным препаратом. В качестве референс-антисывороток против ВМ использовали полученную из Белорусского НИИ ЭМ сыворотку крови инфицированных морских свинок и сыворотку крови сотрудника ГНЦ ВБ "Вектор", переболевшего ГЛМ в результате случайного лабораторного заражения (Никифоров В.В. и др., 1994). Моносыворотки к отдельным рек. белкам филовирусов получали в результате 4-кратной (в течение месяца) иммунизации неинбредных мышей ICR в суммарной дозе

- 100 мкг/мышь. Поликлональные сыворотки к ВЗН получали иммунизацией неинбредных мышей ICR и мышей BALB/c инфекционным вирусом и инактивированным вирусным препаратом. Все манипуляции с животными проводили с применением анестезии, в соответствии с ветеринарным законодательством.

Использовали культуры клеток: мышиную P3.NS.1/1-Ag4,l (NS/1) и крысиную 210RC.Y3-Agl.2.3 миеломы (полученные из Онкологического центра РАМН) культивировали на среде DMEM(M) (производство ГНЦ ВБ "Вектор") с добавлением 10 % - 15 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Flow Laboratories, Англия), 150 мг L

- глутамина (ГНЦ ВБ "Вектор") и 80 мг сульфата гентамицина (КРКА, Словения) на 500 мл среды; Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), L-68 (диплоидные клетки легкого эмбриона человека), RH (клетки почки эмбриона человека) и 293 (клетки почки эмбриона человека) культивировали в среде DMEM(M) с 5 - 10 % ФБС. Иммунизацию мышей BALB/c - доноров иммунных спленоцитов проводили в течение двух недель по внутри лабораторной схеме (в общей дозе для ВМ

- 98 мкг/мышь, ВЭ - 120 мкг/мышь; рек. белка рр65 - 220 мкг/мышь). Иммунизацию мышей ВЗН проводили по разным схемам, с использованием, как инактивированного препарата, так и инфекционного вируса (Razumov I.A. et al., 2005). Слияние клеток (гибридизацию) проводили с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 1300-1600) по методу, предложенному M.L. Gefter и соавт. (1977). Использовали соотношение миеломных клеток NS/1 к иммунным спленоцитам 1/3. Гибридные клетки выращивали при 37 °С в атмосфере 7 %-го С02 и проводили селекцию в среде ГАТ с 10 M аминоптерина (чтобы подавить рост клеток NS/1), гипоксантина и тимидина, с добавлением 10 % оптимизированной для гибридом фетальной сыворотки (HyClone, США). Тестирование культуральной среды от гибридных клеток проводили методом твердофазного ИФА (ТИФА), используя полистирольные планшеты производства ВНИИ Медполимер (Москва) или Costar (США), проявление проводили с использованием субстрата ОФД (1 мг/мл о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буферном растворе (0,2 M лимонной кислоты, 0,5 M Na2HP03, pH 5,0) с 0,03 % Н202). Иммунохимическую реакцию останавливали добавлением 1 N соляной кислоты, оптическую плотность (ОП) субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре "Uniscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм. Клоны подвергали криоконсервации в среде DMEM(M) с добавлением 40 % ФБС и 10 % диметилсульфоксида. Наработку препаративных количеств МКА проводили in vivo.

Очистку МКА из асцитических жидкостей проводили осаждением балластных белков каприловой кислотой по методу H. Bazin и соавт. (1990) с последующей преципитацией IgG в 50 %-м растворе сульфата аммония на 0,05 M фосфатно-солевом буферном растворе. Определение концентрации белка в полученных препаратах выполняли с использованием набора "Protein Assay Kit" (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм. Класс и подкласс МКА

определяли методом иммунодиффузии по Уохтерлони с помощью набора мышиных моноспецифических антител (ICN, США) и методом ТИФА с использованием моноспецифических мышиных антител (AT) (Sigma, США). Определение константы аффинности МКА проводили, используя метод параллельного титрования AT известной начальной концентрации на сорбированном антигене в ТИФА (Берзовски Д. и др., 1989; Егоров A.M. и др., 1991). Биотинилирование очищенных МКА проводили по методу Е.А. Bayer и соавт. (1980), используя Biotin N-hydroxysuccinimide ester FW 341,4 (Sigma, США). Для проведения двухцентрового ИФА в формате "сэндвич" использовали высокосорбционные полистирольные планшеты (Testiks (США) или Nunc (Дания). В промежуточных этапах иммунохимической реакции лунки планшетов промывали трис-солевым буферным раствором с твином (ТСБ-Т, pH 7,4), содержащим 0,15 M NaCl, 0,02 M трис-HCl, 0,05 % твин-20. Проявление проводили с использованием жидкого субстрата ТМБ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), останавливали реакцию добавлением 1 N соляной кислоты, ОП субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре "Uniscan" при длине волны 450 нм.

Фрагменты генома ВЭ, кодирующие белки NP и VP40, получены в ОТ-ПЦР реакции с использованием следующих праймеров:

Для гена VP40: 5' - AAAAGGATCCATGAGGCGGGTTATATTGCCTAC - 3'

5' - AAAAAAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA - 3' Для гена NP: 5' - AAAAGGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCTGG - 3' 5' - AAAAAAGCTTTCACTGATGATGTTGCAGGATTG-3 ' Полноразмерные копии генов VP40 и NP ВЭ после гидролиза эндонуклеазами BamHI и HindIII клонированы в плазмиду pQE-30 (QIAGEN). Для сборки полноразмерной ДНК-копии гена белка VP40 ВМ использовали библиотеку клонов Е. coli (штамм JC5183), несущих рекомбинантные плазмиды pQE-31 со вставками ДНК-копий фрагментов геномной РНК ВМ (Bukreyev A. et al., 1995).

Очистку рек. белков из лизата Е. соН проводили аффинной хроматографией на Ni-хелатной смоле (что обеспечивалось наличием в их составе полигистидинового бежа 6xHis-tag), согласно протоколу фирмы-производителя (QIAGEN, Германия). Концентрацию белков измеряли при помощи набора "Bio-Rad Protein Assay Kit" в соответствии с рекомендациями производителя, используя в качестве стандарта овальбумин в 4 M мочевине. Электрофорез (ЭФ) вирусных препаратов, рек. белков и МКА проводили по методу, предложенному A.A. Остерманом (1981) в прерывистой буферной системе, с использованием 12-15 %-го полиакриламидного геля (ПААГ) с 0,1 % SDS в трис-глициновом буферном растворе в режиме 10 В/см. Окраску гелей проводили при помощи Кумасси G-250.

Иммуноблоттинг (ИБ) проводили после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) по методу H. Towbin и соавт. (1979) на аппарате Transphor ("LKB", Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025 M трис-HCl буферном растворе, содержащем 0,192 M глицина (pH 8,3) и 20 % этанола

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Применение МКА и рекомбинантных антигенов для разработки иммуноднагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола

Описанные в литературе МКА, полученные к инактивированному разными способами ВМ (штамм Musoke), имеют разный состав и разную специфику. Семнадцать видов МКА к GP, 4 к NP, 2 к VP30 и один вид МКА к белку VP40 ВМ, инактивированного у-облучением описано в работе (Hevey M. et al., 1997). Две гибридомы, продуцирующие МКА к структурному GP ВМ (штамм Popp),

инактивированному 0,05 % формалином, содержит коллекция (Ручко C.B. и др., 2001). МКА, специфичные к определенным эпитопам рек. NP ВМ (штамм Musoke), были использованы при конструировании ИФА тест-системы для установления быстрого диагноза ГЛМ (Saijo M. et al., 2005). Специфичные к ВЭ МКА получены, в основном, к рек. белкам GP и NP (Wilson J.A. et al., 2000; Niikura M. et aî., 2001; Takada A. et al., 2001; Yu J.S. et al., 2006; Shahhosseini S. et al., 2007).

Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусам Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ)

В результате 11-ти гибридизаций было получено более 2500 гибридных клеточных линии, растущих на селективной среде ГАТ. Выявление растущих гибридом осуществляли визуально, методом световой микроскопии. По результатам исследования в ТИФА ростовой среды от гибридом отбирали клеточные линии, продуцирующие специфичные МКА. С целью стабилизации культуральных свойств гибридом и секреции ими специфических IgG было проведено клонирование гибридных клеток методом предельных разведений. В результате отбора, после трехкратного тестирования были получены коллекции, состоящие из 20-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВМ (Казачинская Е.И., 2002) и 39-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВЭ. Клеточные линии были размножены, наработаны в культуральных сосудах и заморожены в жидком азоте (при минус 196 С).

Препараты очищенных МКА получали из культуральной среды гибридом и асцитических жидкостей мышей BALB/c и крыс Lou. Для характеризации МКА были определены: субклассы моноклональных IgG; белки вирусов, с которыми они взаимодействуют; титры специфического взаимодействия AT с вирусным препаратам; количественный уровень синтеза гибридомных IgG в организме животных; константы аффинности. Данные по иммунохимическим свойствам MICA, специфичных к ВЭ представлены в табл. I (первая коллекция) и табл. 2 (вторая коллекция).

Таблица 1

Свойства МКА (первая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№ п/ п Название гибридомы и МКА Класс IgG Белок-мишень в ИБ Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр. величины) Концентрация очищенных IgG (мг/мл) Константа аффинности К„ M"1

Культу-ральная среда Асцити- ческая жидкость Очищенный препарат МКА

1 10А8 IgG2b NP 900 218700 218700 7,2 1,4 хЮ8

2 1Е5 IgG2b NP 2700 218700 218700 6,3 2,5 хЮ8

3 4А8 IgG2b NP 8100 2187000 2187000 8,0 2,8 хЮ®

4 10В4 IgG2a NP 8100 2187000 2187000 9,0 2,5x10"

5 7Е1 IgG2a NP 300 24300 24300 3.1 2,5 хЮ8

6 6G8 IgG2a NP 300 8100 24300 6,8 0,7x108

7 4В9 IgG2b NP 8100 656100 656100 7,4 9,0x108

8 2Н9 IgGl NP 900 72900 72900 6,0 2,5 хЮ8

9 6А8 H.O. NP 900 27000 72900 4,3 2,9 хЮ8

10 9G11 IgG2a NP 8100 2187000 2187000 J 6,0 2,5 хЮ8

11 9А7 IeG2b NP 900 24300 24300 4,3 1,7 хЮ8

12 1С7 IgG2a VP35 8100 729000 2187000 7,8 3,1 хЮ8

13 6F7 IgG2a VP35 8100 656100 729000 8,3 2,8 x10s

14 7В11* H.O. NP н.о. 512000 512000 7,2 н.о.

Примечания: МКА 7В11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор A.B. Перебоев).

Таблица 2

Свойства МКА (вторая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№ Название Специ- Класс Белок- Титры МКА против ВЭ в ТИФА Концент-

гибридомы фич- IgG мишень (обр.величины) рация

XL' и МКА ность вИБ Куль- Асцити- Очищен- очищен-

п кАГ тураль- ная среда ческая жидкость ный препарат МКА ных IgG (мг/мл)

4А2 ВЭ-IS IgGl VP40 24300 6561000 6561000 7,7

: 5С10/Н5 ВЭ-IS IgGl VP40 8100 72900 24300 6,3

I 3F6/E9/H8 ВЭ-IS н.о. VP40 900 24300 24300 4,3

2Е12 ВЭ-IS IgG2a VP40 300 8100 8100 4,1

; 2G9/E12 ВЭ-IS н.о. VP40 900 24300 24300 2,5

, 2АЗ/С6 ВЭ-IS н.о. VP40 100 8100 н.о. 1,2

3E3/D8 ВЭ-IS н.о. VP40 100 2700 н.о. 0,5

: 4С4/Е11/G12 ВЭ-IS н.о. VP40 900 24300 8100 2,8

1 3C7/D9 ВЭ-IS IgGl VP40 300 24300 24300 6,5

0 1В2 ВЭ-IS IgGl NP 8100 6561000 2187000 8,9

1 1В1 ВЭ-IS н.о. NP 100 8100 н.о. н.о.

2 ЗВ12 ВЭ-IS н.о. VP40 100 8100 н.о. н.о.

3 4G8 ВЭ-IS н.о. VP40 300 8100 н.о. н.о.

4 2Н5 ВЭ-IS н.о. VP40 100 8100 н.о. н.о.

5 1С1 ВЭ-8МС I*G1 VP40 8100 6561000 6561000 14,5

6 1Е6/АЗ ВЭ-8МС IgGl VP40 8100 729000 729000 1,5

7 1В5 ВЭ-8МС IgG2a VP40 8100 218700 72900 5,7

8 3D9/C2 ВЭ-8МС IgM VP40 8100 729000 729000 7,0

9 3C12/G2 ВЭ-8МС IgG2a VP40 900 72900 72900 3,5

0 1G4 ВЭ-8МС н.о. VP40 300 н.о. н.о. н.о.

;1 2Н4 ВЭ-8МС н.о. VP40 100 н.о. н.о. н.о.

2 3F8 ВЭ-8МС н.о. н.о. 100 н.о. н.о. н.о.

:3 3F6 ВЭ-8МС н.о. VP40 100 н.о. н.о. н.о.

4 7D12 ВЭ-8МС н.о. и.о. 100 н.о. н.о. н.о.

5 6А12 ВЭ-8МС н.о. н.о. 100 н.о. н.о. н.о.

Примечания: и.о. - не определяли; ВЭ-IS - исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС - штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (Volchkov V.E. et al., 2000).

Все гибридомные 1сО по результатам типирования были отнесены к классу разных подклассов. Уровень синтеза моноклональных в организме мышей и крыс оценивали по концентрации белка в очищенных препаратах, которая составила от 0,5 до 14,5 мг/мл. Аффинность каждого МКА определяли методом ТИФА при параллельном титровании АТ (в одинаковой начальной концентрации 1 мг/мл) на инакгивированном АГ ВЭ. Константы аффинности для каждого МКА находятся в диапазоне от 0,7 до 3,1х108М"', а самое высокое сродство к вирусному антигену было определено для МКА 4В9 9,0хЮ8М' (см. табл. 1), специфичных к ИР. Методом ТИФА было проведено определение специфичности взаимодействия вирусного АГ с МКА, в виде культуральной и асцитической жидкости, а так же очищенных препаратов. Титры гибридомных АТ в асцитической жидкости находились в диапазоне разведений от 1/2700 до 1/6561000. В результате исследований методом ИБ было показано, что из 14

видов МКА первой коллекции - двенадцать специфичны к NP и два вида МКА к белку VP35 ВЭ (см. табл. 1). МКА, продуцируемые гибридомами второй коллекции, в основном специфичны к матриксному белку VP40 и 2 МКА специфичны kNP (см. табл. 2). Аффинность МКА второй коллекции не определяли в виду отсутствия достаточного количества инактивированного вирусного АГ.

Результаты по преобладанию в нашей коллекции МКА, специфичных к матриксному VP40 филовирусов, совпадают с данными авторов (Lucht А. et al., 2000), описавших коллекцию из 12 гибридных клеточных линий, девять из которых синтезируют МКА к VP40 инактивированного ВЭ-Заир.

Исследование специфичности полученных МКА указывают на возможность их использования как для анализа антигенной структуры филовирусных белков (Казачинская Е.И., 2002), так и для конструирования диагностических тест-систем для выявления антигенов ВМ и ВЭ.

Выявление шшунодоминантных белков вирусов Марбург и Эбола

Полученные гибридные клеточные линии продуцируют МКА, для которых белки-мишени определены: к белку VP35 - 7 линий, к VP40 - 20 линий и к NP - 16 линий (см. табл. 1, 2) и данные (Казачинская Е.И., 2002). Эти результаты показывают наличие антигенной структуры на внутренних белках VP35, VP40 и NP инактивированных вирионов ВМ и ВЭ. Вклад каждого белка в иммуногенность вирусного препарата по количеству полученных видов МКА оценить сложно, так как отбор положительных гибридом (продуцирующих МКА) проводили эмпирически, отбирая их в ТИФА по результатам сигнала ОП (>1,0) субстратно-индикаторной смеси в лунках с тестируемой кулмуральной средой от растущих гибридных клонов. Белок-мишень для полученных МКА можно определить, имея не менее 1 мл культуральной среды и достаточно АГ для переноса на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы протестировать большое количество гибридных клонов, но это рутиная и затратная процедура. Кроме того, для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов были использованы инактивированные вирусные АГ, что могло повлиять на антигенную структуру вирусных белков.

Исследование антигенного состава любого патогена необходимо для совершенствования дифференцирующей диагностики на специфические маркеры, а также для разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов. По литературным данным, основными белками филовирусов, вызывающими иммунный ответ организма, являются NP, VP40 и белок VP35. Это было выявлено методом ИБ при исследовании сывороток крови обезьян различных пород из возможного ареала распространения филовирусов и сывороток крови реконвалесцентов (Becker S. et al., 1992).

Исследование спектра AT, продуцируемых организмом в ответ на иммунизацию или инфицирование животных ВМ и ВЭ проводили методом ИБ. В инактивированных вирусных препаратах были выявлены вирусные белки-иммуногены, взаимодействующие с AT сывороток крови от иммунизированных и инфицированных животных (табл. 3). Это белки - GP, NP, VP40, VP35, VP30 и VP24, формирующие антигенную структуру филовирусного вириона и распознаваемые иммунной системой макроорганизма при инфицировании или иммунизации. Белки NP, VP40, VP35 ВМ выявлялись AT исследуемых сывороток в виде мажорных полос. Эти результаты свидетельствуют, что белки инактивированных вирусных АГ не теряют своих иммуногенных свойств, то есть сохраняются антигенные детерминанты. Особый интерес для данного исследования представляют результаты взаимодействия

белков инактивированных вирусов с АТ инфицированных морских свинок, с ^О лошадей и АТ сыворотки крови реконвалесцекта (Никифоров В.В. и др., 1994).

У морских свинок, переболевших экспериментальной ГЛМ, несмотря на одинаковую дозу заражения и одинаковое количество прошедших суток на день взятия крови, варьировал титр АТ и диапазон специфичности к вирусным белкам. Тем не менее, доминирующие полосы при ИБ соответствовали белкам - N1', УР40 и УР35 (табл. 3). В ТИФА был обнаружен титр 1/218700 для препарата лошадей. Особенность получения данных препаратов состоит в том, что лошади не восприимчивы к филовирусным инфекциям, но вырабатывают нейтрализующие АТ в титре 1/2048. По данным И.В. Борисевич и соавт. (2008) введение морским свинкам, полученного таким образом препарата, через 1 - 2 часов после заражения ВМ в дозе 20-50 ЛД50, защищало от гибели 88-100 % животных.

Таблица 3

Исследование спеюра филовирусных белков-иммуногенов и перекрестного взаимодействия поликлональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА

Источник антител Сутки взятия крови от начала иммунизации Иммуноген Титры антител в ИФА (обратные величины) Белки-иммуногены, выявляемые в ИБ на гомологичном инактивированном антигене

Антигены

инакт. ВМ инакт. ВЭ

1 2 3 4 5 6

мышь № 1 14 инакт. ВМ 8100 <100 ОТ, УР35, \Т40

мышь № 2 21 инакт. ВМ 24300 300 вР, ОТ, УР35, УР40,УР30,УР24

кролик нет данных инакт. ВМ 24300 <100 ОТ, УР40, УР35, УР30,УР24

лошади нет данных инф. ВМ 218700 <100 СР, ОТ, УР35, УР40,УР30

ЧС нет данных инф. ВМ 24300 900 ОР, ОТ, УР35, УР40,УР30,УР24

морская свинка нет данных инакт. ВМ 900 <100 ОТ, УР40, УР35

морская свинка* (6.4; 7.2) 14 инф. ВМ 200; 200 <100 ОТ

морская свинка* (2.2; 4.2;6,3) 14 инф. ВМ 6400; 6400; 12800 <100 вР, ОТ, УР40, УР35

морская свинка* (2.1;4.1;5.1; 6.1; 6.2) 14 инф. ВМ 1600; 800; 800; 400; 6400 <100 ОТ, УР40, УР35

морская свинка* (1.2;5.2) 14 инф. ВМ 400; 400 <100 ОТ, УР35

морская свинка* (1.3; 1.4) 14 инф. ВМ 400; 400 <100 ОТ, УР40

1 2 3 4 5 6

морская свинка* (3.1) 14 инф. ВМ 200 <100 УР40

мышь № 1 14 инакт. ВЭ-В 2700 72900 ОТ, УР40, УР35,УР30, УР24

мышь № 2 14 инакт. ВЭ-В 900 72900 ОТ, УР40, УР35,УР30, УР24

мышь № 3 14 инакт. ВЭ-В 300 81000 ЦвР, ОТ, Р40,УР35,УР30,УР24

мышь № 4 21 инакт. ВЭ-В 300 729000 Ь,ОР,ОТ,УР40,УР35, УР30.УР24

мышь № 5 14 инакт. ВЭ-В 300 2187000 Ь,СР,ОТ,УР40,УР35, УР30,УР24

мышь № 6 14 инакт. ВЭ-8МС <100 9000 ЦСР,ОТ,УР40,УР35, УР30,УР24

мышь № 7 14 инакт. ВЭ-8МС 300 243000 1.,ОР,ОТ,УР40,УР35, УР30,УР24

мышь № 8 14 инакт. ВЭ-8МС 300 72900 ЦСР,ОТ,УР40,УР35, УР30.УР24

мышь № 9 14 инакт. ВЭ-8МС 300 72900 Ь,ОР,ОТ,УР40,УР35, УР30,УР24

кролик нет данных инакт. ВЭ-В 2700 72900 ОТ, УР40, УР35,УР30, УР24

крыса 14 инакт. ВЭ-В 8100 72900 ОТ

1аО лошади 26-42 инф. ВЭ 24300 218700 ОТ, УР40, УР35

морская свинка нет данных инакт. ВЭ-В <100 900 ОТ

морская свинка нет данных инф.ВЭ <100 900 С,Р, от

контроли без антигена <100 <100 -

Примечание к табл. 3: инакт. — инактивированный вирусный препарат; ннф. -инфекционный вирус; - сыворотки крови от выживших морских свинок, инфицированных ВМ (условное обозначение каждого животного); ЧС - сыворотка реконвалесцента (человек переболел ГЛМ) (Никифоров В.В. и др., 1994); нормальные сыворотки крови - мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля; № 1 - 9 - сыворотки крови мышей, представляющие собой каждая пул сывороток крови от 3-х мышей - доноров иммунных спленоцитов, используемых для гибридизаций; ОТ, УР40, УР35 - жирным шрифтом выделены белки, образующие доминирующие полосы при ИБ.

Противовирусные АТ сыворотки крови реконвалесцента выявляют эти белки в вирусном препарате методом ИБ так же в виде мажорных полос (см. табл. 3, рис. 1), что говорит о том, что внутренние структурные белки ВМ, так же как и наружные, презентируются иммунной системе организма индивидуально, обладают высокой иммуногенностью как в нативном, так и в инактивированном состоянии. Титр антивирусных АТ в сыворотке крови реконвалесцента составлял 1/24300. Такой же уровень антител наблюдался в сыворотке крови мышей (№ 2), иммунизированных инактивированным ВМ.

Так же в табл. 3 представлены результаты специфического взаимодействия в ТИФА белков ВЭ с противовирусными АТ. Наиболее высокий титр АТ (1/2187000 и 1/729000) был выявлен в сыворотках крови мышей (от гибридизаций № 5 и № 4), иммунизированных инактивированным АГ ВЭ.

Рис. 1. Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург антителами сыворотки реконвалесцента.

1 - нормальная сыворотка крови человека в разведении 1/1000; 2 - сыворотка крови человека, переболевшего ГЛМ (Никифоров В .В. и др., 1994), в разведении 1/1000. Стрелками обозначено местоположение белков ВМ на нитроцеллюлозной мембране.

Несмотря на то что, ВМ и ВЭ являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют заметные отличия. На это обратили внимание K.M. Johnson и соавт. (1977), пытаясь сравнить впервые выделенный ВЭ с уже известным ВМ. Дальнейшие исследования филовирусов подтвердили их антигенные различия (Kiley М.Р.. 1988; Johnson E.D. et al., 1996). Но в работе S. Becker и соавт. (1992) отмечается, что при исследовании сывороток крови от людей, переболевших ГЛМ в 1967 г., регулярно наблюдалась кросс-реактивность с АГ ВЭ в реакции иммунофлюоресценции. Аминокислотная последовательность, определенная для NP ВМ и ВЭ, показывает высокую степень их гомологии 400 N-концевых а.о. (Sanchez А. et al., 1993), что позволяет предположить наличие антигенного перекреста. При сравнении аминокислотной последовательности белков VP35 ВЭ и ВМ также были обнаружены у них гомологичные участки (Bukreyev А. et al., 1993).

В исследовании было обнаружено, что в сыворотках крови животных ПАТ имеют перекрестную активность с гетерологичными антигенами в ТИФА (см. табл. 3). Методом ИБ ранее были показаны белки для перекрестных взаимодействий ПАТ мышей, иммунизированных ВЭ - это NP и VP35 ВМ (Казачинская Е.И., 2002). Возможно, что при инактивации вирионов открылись гомологичные последовательности а.о. филовирусных белков.

Для исключения неспецифического взаимодействия противовирусных АТ с гетерологичными вирусными белками использовали для исследования аффинно-очищенные рек. белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных филовирусных генов в клетках Е.соН.

Получение рекомбинаншных белков филовирусов в экспрессионной системе E.coli и исследование их свойств с помощью противовирусных антител

Для наработки и очистки филовирусов необходим 4 уровень биозащиты, персонал со специальной подготовкой и надежная инактивация вирусных препаратов. Есть данные, что рек. NP ВЭ и ВМ, экспрессированные в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в Е.соН, обладали ангигенностью и были использованы в ИФА в качестве АГ для обнаружения IgG в

GP KP

VP35 VIM О <<s~ VP30

VP24

сыворотках реконвалесцентов. Специфичность определения IgG была 100 %-ной, без ложноположительных результатов. Кроме того, было обнаружено, что рек. NP ВЭ, полученный на основе гена NP ВЭ-Заир, можно использовать для выявления IgG к другим штаммам ВЭ - Судан, Рестон и Берег Слоновой Кости (Saijo M.et al„ 2001). Рек. VP40 ВЭ использовали в качестве положительного контроля на АГ в лабораторной тест-системе (G. Kallstrom et al., 2005). Так же рек. VP40 ВЭ был использован в ИБ для точного определения специфичности МКА, полученных к инактивированному ВЭ-Заир (штамм Mayinga) (Luch А. et al., 2003).

Оценку степени чистоты рек. белков, полученных в настоящем исследовании оценивали по результатам ПААГ-ЭФ с SDS (рис. 2, 3, 4).

Рис. 2. Электрофореграмма. Анализ белков.

синтезирующихся под контролем рекомбинантной плазмиды pQE-VP35 вируса

Эбола в клетках E.coli. 1 - лизат E.coli - pQE; 2,3 - лизат E.coli - pQE-VP35 ВЭ; 4 - препарат очищенного рек. белка VP35 ВЭ; 5 - препарат инактивированного ВЭ (стрелкой показан вирусный белок VP35); обозначено местоположение маркеров молекулярной массы - 18, 29, 36, 43, 68, 97 и 116, соответственно.

рехоибннантиый белок VP40 ВМ

вирусный белок VP40BM

вирусный белок VP40 ВЭ рекоибинактный белок VP40 ВЭ

Рис. 3. Электрофореграмма вирусов Марбург и Эбола и очищенных рекомбинантных белков VP40. 1 - рек. белок VP40 ВМ (5 мкл); 2 - препарат инактивированного ВМ (10 мкл): 3 - препарат инактивированного ВЭ (10 мкл); 4 - рек. белок VP40 ВЭ (5 мкл); 5 - местоположение белковых маркеров молекулярной массы (Bio-Rad).

1 2

Рис. 4. Электрофореграмма вируса Эбола и очищенного рекомбинантного нуклеопротеина.

1. рек. белок ЫР ВЭ (5 мкл); 2 - препарат инактивированного ВЭ (10 мкл).

Были исследованы свойства рек. белков ВМ и ВЭ: антигенные - по выявлению специфических антивирусных АТ реконвалесцента и АТ иммунизированных животных; и иммуногенные - по взаимодействию АТ, полученных к рек. белкам, с вирусными АГ методами ТИФА и ИБ. Серопозитивная сыворотка крови рековалесцента оказалась ценным препаратом для исследования рек. белков, так как содержит противовирусные АТ, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции. Результаты тестирования, представленные в табл. 4 и табл. 5 демонстрируют, что рек. аналоги вирусных белков ОР, ОТ, УР35, УР40,УР24 ВМ и УР35, ОТ, УР40 ВЭ обладают иммуногенностью - вызывают синтез антител в организме иммунизированных беспородных мышей и выявляют в ТИФА антивирусные антитела, то есть обладают антигенными свойствами.

Таблица 4

Исследование антигенных и иммуногенных свойств реко.чбинантных белков вируса Марбург

№ п/ п ПАТ Взаимодействие ПАТ с ВМ и рекомбинантными белками в ИБ Титры рекомбинантных белков при специфическом взаимодействии с ПАТ (обратные величины) в ТИФА

ВМ рек вР рек МР рек УР 40 рек УР 35 рек \'Р 24 рек. вР рек. ЫР рек. \Т>40 рек. \'Р35 рек. УР24

1 чс (1/500) + - + + + + 800 12800 8100 8100 6400

2 ДО лошади (1/1500) + - + + + + 1600 72900 40500 13500 1600

3 МАС-ВМ №2 (1/1000) + + + + + + 900 24300 8100 8100 1600

4 МАС-рек. ОР (1/1000) + + - - - - 72900 <100 <100 <100 <100

5 МАС-рек. NP (1/5000) + - + - - - <100 218700 <100 <100 <100

6 МАС-рек. VP35 (1/5000) + - - - + - <100 <100 656100 <100 <100

7 МАС-рек. VP40 (1/ЮООО) + - - + - - <100 <100 <100 1087500 <100

8 МАС-рек. VP24 (1/5000) + - - - - + <100 <100 <100 <100 202400

Примечания: ПАТ - политональные антитела иммунных сывороток; г - рек. белок; ЧС - сыворотка крови человека, переболевшего ГЛМ (разведение): МАС-ВМ № 2 - пул сывороток от 3 мышей, иммунизированных АГ ВМ и используемых для гибридизации на 21-е сутки от начала иммунизации в разведении ; МАС-рек. - сыворотки крови мышей, иммунизированных рек. белками вР, ИР, УР40, \'Р35, УР24 ВМ.

Таблица 5

Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса

Эбола

Источник антител Титры специфических антител (обратные величины) и взаимодействие вИБ

Антигены (концентрация для ТИФА 1 мкг/мл)

Инактивиро-ванный ВЭ peK.VP35 рек.УР40 peK.NP pQE

ИФА ИБ ИФА ИБ ИФА ИБ ИФА ИБ ИФА ИБ

IgG лошади - ВЭ 656100 + 121500 + 656100 + 656100 + <100 -

МАС-ВЭ 218700 + 218700 + 218700 + 656100 + <100 -

АС крысы - ВЭ 218700 + 24300 + 218700 + 218700 + <100 -

АС кролика - ВЭ 218700 + 218700 + 218700 + 656100 + <100 -

MAC - рек. VP35 729000 + 729000 + <100 - <100 - <100 -

MAC - рек. VP40 656100 + <100 - 1968300 + <100 - <100 -

MAC - рек. NP -ВЭ 656100 + <100 - <100 - 1968300 + <100 -

отрицательные контроли** <100 - <100 - <100 - <100 - <100 -

Примечание: MAC - мышиные антисыворотки; pQE - лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков); * - проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических MAC в присутствии 1 %-го раствора лизата клеток E.coli 20 мин при 37 °С; ** - в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки крови лошади, мыши, крысы и кролика.

Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков для выявления специфических иммуноглобулинов класса /#(7 в сыворотках крови животных и человека

Описанные выше исследования рек. белков - вР, ИР, УР35, \Т40 и УР24 ВМ показали сходство их антигенных свойств с природными вирусными белками, что указывает на возможность использования данных препаратов в тест-системах для выявления специфических АТ.

Для анализа уровня АТ к каждому вирусному белку использовали в качестве АГ отдельные рек. белки. Это позволило определить уровень и спектр АТ к отдельным белкам ВМ (табл. 6). Наиболее высокая концентрация специфических АТ в сыворотке крови реконвалесцента была зарегистрирована к ИР (1/24300) и, по убывающей, к УР40 (1/8100) и к УР35 (1/2700). Уровень специфических АТ к ОР был ниже, чем к другим белкам и вообще не определялся в сыворотке крови, взятой у пациента через шесть лет после болезни. Такая же тенденция, по уровню АТ к индивидуальным белкам, была обнаружена и для АТ в сыворотках крови иммунизированных животных.

Таблица б

Использование рекомбинантных белков в качестве антигена в ТИФА для выявления Гев,

специфичных к вирусу Марбург

Источник антител Титры специфических IgG (обратные величины)

Антигены (концентрация нг/лунку)

вирус Марбург (200) peK.GP (200) pes.NP (200) рек.УР40 (200) peK.VP35 (200) рек. белки (400)*** pQE (400)

ЧС (1990 г.) 24300 900 24300 8100 2700 24300 <100

ЧС (1996 г.) 200 <100 400 400 <100 800 <100

IgG лошади 218700 13500 121500 40500 13500 364500 <100

МАС-ВМ № 1 8100 <100 2700 2700 <100 8100 <100

МАС-ВМ № 2 24300 900 24300 24300 8100 72900 <100

МАС-рек-GP* 8100 656100 <100 <100 <100 72900 <100

MAC-peK.NP* 72900 <100 72900 <100 <100 24300 <100

МАС-рек.УР35* 24300 <100 <100 <100 656100 218700 <100

МАС-рек.УР40* 72900 <100 <100 1968300 <100 218700 <100

отрицательные контроли** <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100

Примечание: ЧС - сыворотка крови человека, переболевшего ГЛМ (в скобках указана дата забора крови); MAC - мышиные антисыворотки; pQE - лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков);

* - проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических MAC в присутствии 1 %-го раствора лизата клеток E.coli 20 мин при 37 °С; ** - в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки крови человека (5 сывороток), лошади (1 сыворотка), мыши (5 сывороток); *** — смесь рек. белков GP, NP, VP35, VP40 по 100 нг/лунку каждого.

В случае применения в качестве АГ комбинации четырех рек. белков ВМ - GP, NP, VP35 и VP40, повышался уровень титров выявления специфических АТ исследуемых сывороток по сравнению с использованием инактивированного АГ ВМ.

Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург с помощью панели МКА

По исследованию рек. белков ВМ имеется два сообщения - об использовании рек. ОТ, экспрессированного в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе, и в виде С-концевых фрагментов в Е.соН, для выявления противовирусных АТ в сыворотках крови реконвалесцентов (Бауо М. е1 а1., 2001) и о получении МКА, специфичных к этому рек. белку и выявляющих вирусный АГ в реакции иммунофлюоресценции (Бауо М. еГ а1., 2005).

Для изучения рек. белков ОТ, УР35, УР40 ВМ, использовали панель гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Панель содержит - 3 вида МКА к ЫР, 3 вида МКА к белку УР35 и 9 видов МКА к УР40 (табл. 7). Для одного вида МКА ЗА5 белок-мишень в ИБ не определялся, хотя он имеет высокий титр в ТИФА, видимо эпитопы для этого вида МКА имеют конформационную структуру.

Таблица 7

Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Марбург

№ Назва- Иммуно- Вирусный Взаимо- Титры антител в ТИФА с вирусными

п/п ние ген белок- действие антигенами

МКА мишень с рек. и рекомбинантными аналогами

вИБ белком- аналогом вИБ вирус Марбург рек-NP -ВМ peK.VP40-ВМ рек.\'Р35-ВМ

1 3F9 ВМ УР35 + 656100 - - 729000

2 9D8 ВМ УР35 + 729000 - - 656100

3 8G3 ВМ УР35 - 218700 - - 72900

4 5G9 ВМ УР40 + 729000 - 72900 -

5 7Н10 ВМ УР40 + 729000 - 729000 -

6 9G6 ВМ УР40 + 218700 - 218700 -

7 6В7 ВМ УР40 + 656100 - 656100 -

8 1С12 ВМ УР40 + 24300 - 24300 -

9 10Е11 ВМ УР40 + 24300 - 24300 -

10 7D8 ВМ УР40 + 2187000 - 243000 -

11 5G8 ВМ УР40 + 656100 - 656100 -

12 7С4 ВМ УР40 + 2187000 - 729000 -

13 5F11 ВМ ЫР + 2187000 24300 - -

14 9С7 ВМ ЫР + 6561000 6561000 - -

15 5Н7 ВМ ЫР + 2187000 2187000 - -

16 ЗА5 ВМ ОТ(?) - 218700 - - -

Примечания: для иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов был использован инактивированный ВМ; ЫР (?) - белок - мишень не определяется этим видом МКА в ИБ и не взаимодействует с рек. белком, но по результатам КИФА имеет сродство к № ВМ (Казачинская Е.И., 2002); + есть реакция в данном методе; - нет реакции в данном методе; 100 нг/лунка - концентрация антигенов.

Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками ВМ оценивали в ТИФА и ИБ. Как видно из представленных данных (см. табл. 7), большинство МКА активно взаимодействовали с рек. белками - аналогами вирусных белков в ТИФА. Специфическое взаимодействие рек. белков с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 5-7. Так же было показано, что МКА, специфичные к ВМ, не имеют

перекрестного взаимодействия с рек. белками гетерологичного ВЭ в ИБ и ТИФА, в отличие от данных по перекрестному взаимодействию противовирусных ПАТ с гетерологичными вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).

$ I 2 з 4 F' 5 6 Рис. 5. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков

t > NP вируса Марбург с МКА, специфичными к

7 ' вирусному нуклеопротеину. Цельная мембрана,

f • содержащая:

I - лизат клеток 293 (отрицательный контроль); 2 - лизат клеток 293, инфицированных \TF7-3 — 116 (отрицательный контроль); 3 - инактивированный ВМ; 4 - рек. NP, экспрессированный в эукариотических клетках 293 (Качко A.B. и др., 2001); 5 - рек. NP, экспрессированный в прокариотических клетках E.coli (Качко A.B. и др., 2001); 6 - лизат клеток E.coli (отрицательный ъ+ЛшМЫЛЬи. ...I, ... . контроль); обработана смесью МКА 5F1, 5Н7 и

9С7 в разведении 1/1000 каждого.

— 200

12345678

рек VP40 аирусный UP40

Рнс. 6. Иммуноблоттинг рекомбинантного белка VP40 с МКА, специфичными к матриксному белку VP40 вируса Марбург. 1 - препарат ВМ, обработан МКА 7Н10 (положительный контроль); 2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8 (положительный контроль); 3 - рек. белок VP40, обработан МКА 7Н10; 4 - рек. белок VP40, обработан МКА 7D8; 5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль); б - препарат ВЭ, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); 7 - лизат E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль); 8 - лизат E.coli, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); МКА использовали в разведении 1/500.

Рис. 7. Иммуноблоттинг вирусных и 12 3 4 5 рекомбинантных белков УР35 вируса

Марбург с моноклональными антителами. 1 - препарат ВМ, стрелкой обозначен

_45 вирусный белок УР35; 2 - препарат ВЭ

(отрицательный контроль на антиген); 3 ^^ рек. . лизат Е.соИ. (отрицательный котроль вирусный бедок для рек белка); 4 - очищенный рек.

белок -^ в" УРЗЗ белок УР35 ВМ обозначен стрелкой;

УР35 __все полоски мебраны обработаны

^ препаратом очищенных МКА ЗЬ9 в разведении 1/500; 5 - значения молекулярной массы белковых маркеров.

Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола с помощью МКА

Рек. белки УР35, № и УР40 ВЭ были исследованы с помощью панели гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками УР35, ИР и УР40 ВЭ оценивали в ТИФА и ИБ (табл. 8).

Таблица 8

Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Эбола

№ Назва- Специ- Белок- Взаимо- Титры антител в ТИФА с вирусными

п/п ние фич- мишень действие с антигенами и

МКА ность рек. рекомбинатными аналогами

(вирус) белком-

аналогом вИБ вирус Эбола рек.УР35 -ВЭ peK.NP -ВЭ рекЛФДО-ВЭ

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 1С7 ВЭ-IS VP35 + 2187000 729000 <100 <100

2 6F7 ВЭ-IS VP35 + 729000 218700 <100 <100

3 1В2 ВЭ-IS NP + 2187000 <100 2187000 <100

4 7В11* ВЭ-IS NP + 512000 <100 656100 <100

5 1Е5 ВЭ-IS NP + 218700 <100 243000 <100

6 4В9 ВЭ-IS NP + 656100 <100 2187000 <100

7 9А7 ВЭ-IS NP + 24300 <100 72900 <100

8 4А8 ВЭ-IS NP + 2187000 <100 121500 <100

9 10В4 ВЭ-IS NP + 2187000 <100 729000 <100

10 6G8 ВЭ-IS NP + 24300 <100 243000 <100

11 6А8 ВЭ-IS NP + 72900 <100 40500 <100

12 10А8 ВЭ-IS NP + 218700 <100 218700 <100

13 ICI ВЭ-8МС VP40 + 6561000 <100 <100 6561000

14 4А2 ВЭ-IS VP40 + 6561000 <100 <100 6561000

15 1Е6 ВЭ-8МС VP40 + 72900 <100 <100 656100

16 3D9 ВЭ-8МС VP40 + 729000 <100 <100 218700

17 1В5 ВЭ-8МС VP40 + 72900 <100 <100 656100

18 5С10 ВЭ-IS VP40 + 24300 <100 <100 13500

19 2EI2 ВЭ-IS VP40 + 24300 <100 <100 24300

Примечания: ВЭ-IS - исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС - штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (Volchkov V.E. et al„ 2000). МКА 7В И * - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор гибридомы Перебоев A.B.); + есть реакции в данном методе; 100 иг/лунка -концентрация антигенов.

Специфическое взаимодействие рек. белков NP и VP40 ВЭ с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 8,9.

1 2 3 4 5 6 7 8

VP40

"И

Рис. 8. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному белку VP40 с рекомбинантным белком-аналогом вируса Эбола.

1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2; 2 -препарат ВЭ, обработан МКА ICI; 3 - рек. белок VP40, обработан МКА 4А2; 4 - рек. белок VP40, обработан МКА ICI; 5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А2 (отриц. контроль); б - препарат ВМ, обработан МКА ICI (отриц. контроль); 7 - лизат E.coli., обработан МКА 4А2 (отриц. контроль); 8 - лизат E.coli., обработан МКА 1С! (отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/10000).

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 9. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному нуклеопротеину вируса Эбола с рекомбинантным белком: 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2; 2 -препарат ВЭ, обработан МКА 7BI1; 3 - рек. NP, обработан МКА 1В2; 4 - рек. NP, обработан МКА 7В11; 5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2 (отриц. контроль); 6 -препарат ВМ, обработан МКА 7B1I (отриц. контроль); 7 - лизат E.coli, обработан МКА 1В2 в разведении 1/500 (отриц. контроль); 8 -лизат E.coli, обработан МКА 7В11 в разведении (отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/500).

Было выявлено, что МКА, специфичные к ВЭ, не имели перекрестного взаимодействия с рек. белками ВМ в ИБ и ТИФА, в отличие от перекрестного взаимодействия ПАТ с вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).

Так как вирусные белки, с которыми взаимодействовали АТ, выявляли методом ИБ, это позволо предположить, что данные эпитопы являются конформационно стабильными и, видимо, представлены "линейной" структурой как на вирусных белках, так и на их рек. аналогах. Для того чтобы выяснить, существуют ли подобные антигенные структуры на белках вириона исследовали взаимодействие МКА с инфекционным вирусным препаратом в ТИФА в условиях 4 уровня биозащиты (табл. 9).

Результаты проведенного анализа демонстрируют наличие исследуемых эпитопов на белках УР35 и ЫР очищенных вирионов ВЭ и сохранность этих эпитопов после инактивации. Высокая специфичность взаимодействия АТ иммунной сыворотки против рек.УР35 ВЭ с очищенными инфекционными вирионами, подчеркивает подобие эпитопов рек. белка и природного УР35 ВЭ.

Таблица 9

Взаимодействие МКА, специфичных к инактивированному вирусу Эбола с нативными

вирионными белками

Источник антител Титр антител

Очищенный ВЭ* (до инактивации) Инактивированный ВЭ**

МКА 1С7-VP35 н.о. 2187000

МКА 6F7 - VP35 н.о. 729000

Смесь МКА к VP35 (1C7+6F7) 1562500 312500

MAC - рек.УР35 3125000 729000

Смесь МКА к NP (10А8 + 4В9+10В4+1Е5+6А8) 3125000 3125000

МКА 10А8 н.о. 218700

4В9 н.о. 656100

10В4 н.о. 2187000

1Е5 н.о. 218700

6А8 н.о. 72900

Примечания: Данный эксперимент провел д.м.н. Чепурнов A.A. в условиях 4 уровня биозащиты; MAC - peK.VP35 - сыворотка крови мыши, иммунизированной рек. белком VP35 ВЭ; ВЭ* - инфекционный вирусный препарат; ВЭ** - вирусный АГ инакгивирован 1 %-ным раствором SDS; сорбция антигенов в концентрации 100 нг/лунку; н.о - не определяли.

До начала исследований всей панели МКА методом двухценгрового ИФА в формате "сэндвич" для выявления неконкурирующих за антигенные эпитопы МКА, пригодных для конструирования тест-ситемы по выявлению филовирусных АГ, пара МКА (4А8 и 6F7 из первой коллекции), были использованы при разработке метода экспресс-выявления антигена ВЭ (Чепурнов A.A. и др., 2007). Основой тест-системы служит нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными на нее МКА 4А8 (в концентрации 0,1 мг/мл) для захвата антигена. МКА 6F7, сорбционно связанные с коллоидным золотом, служили детектирующими. Было показано выявление АГ ВЭ на вторые сутки после инфицирования в сыворотке крови сотрудника, фатально заболевшего при лабораторной аварии. Чувствительность выявления вирусного АГ составила 3 нг/мл, при титре вирусемии в сыворотке крови 105 БОЕ/мл. Эти данные служат достаточным основанием использования МКА, которые строго специфичны к внутренним вирусным белкам NP, VP40 и VP35 ВЭ и не имеют перекрестной активности с гетерологичным АГ, для разработки ИФА тест-систем выявления АГ ВЭ.

Отбор парных МКА неконкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург и Эбола

Метод ИФА в формате "сэндвич" с ПАТ применяли при разработке лабораторных ИФА тест-систем для выявления ВМ в работах (Владыко A.C. и др., 1991; Кизимов Н.. В., 1993). В одной работе описаны МКА, специфичные к GP, которые были использованы в качестве "индикаторных" для выявления вирусного АГ (Ручко C.B. и др., 2001), а в другой (Saijo M. et al., 2005) для "захвата" АГ использовали МКА, специфичные к определенным перекрывающимся эпитопам (634647 а.о. и 643-695 а.о.) рек. NP ВМ.

При разработке первых лабораторных ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ применяли метод ИФА в формате "сэндвич" в основном с ПАТ разных видов животных (Мерзликин Н.В. и др., 1995; Ksiazek T.G. et al., 1992) или сочетано с МКА, специфичными к вирусному белку VP40 (Kallstrom G.et al., 2005) или рек. NP (Niikura

M. et al., 2001). В недавней работе зарубежных исследователей показано практическое применение двух видов MICA., специфичных к матриксному белку VP40, при исследовании проб сывороток крови, мочи, слюны и пота людей, собранных при вспышке ГЛЭ в Республике Конго в 2003 г. (Lucht A.et al., 2007). Принцип метода иммунофильтрации состоит в "сэндвиче" из МКА, один вид которых нанесен на матрицу колонки с открытым сужающимся дном, что обеспечивает хорошую промывку. Второй вид МКА, меченных биотином, реагирует с конъюгатом стрептовидина и пероксидазы. Иммунохимическую реакцию AT с АГ проявляют раствором ТМБ. Для учета ОП реакции используют портативный фотометр или учитывают результат визуально. Данный метод для выявления вирусного АГ пригоден для полевых испытаний без использования электричества и дорогого оборудования. Время проведения анализа составляет 30 минут. Чувствительность выявления нативного вирусного АГ составила 10 БОЕ/мл. Инактивация исследуемых проб с 1 % SDS, повышала чувствительность системы до 104 БОЕ/мл.

Создание представительной панели МКА, специфичных к трем филовирусным белкам - NP, VP40 и VP35, позволило нам использовать метод двухдентрового ИФА в формате "сэндвич" для выявления МКА, неконкурирующих за антигенные эпитопы, то есть способных эффективно "захватывать" вирусный или рек. АГ из исследуемой пробы.

МКА, имеющие высокий титр в ТИФА в виде культуральной жидкости от гибридных культур клеток, наработали in vivo. Асцитические жидкости очищали каприловой кислотой по методу H. Bazin и соавт. (1990) с последующим высаливанием 50 %-ным раствором сульфата аммония и оценивали степень чистоты полученных препаратов МКА в ЭФ. На рис. 10, для примера, представлены несколько из использованных в исследовании очишенных МКА. Данный метод позволяет получать очищенные МКА с четко выраженными на электрофореграмме тяжелыми (на уровне 50-55 кДа) и легкими (20-25 кДа) цепями IgG. Хорошая очистка МКА важна для исключения неспецифического фона при иммунохимических взаимодействиях, для сорбции на полистироловую поверхность планшетов большего количества IgG, несущих специфические паратопы для АГ и приготовления

Рис. 10. Электрофореграмма МКА, очищенных каприловой кислотой.

1 - белковые маркеры молекулярной массы (10 мкл), (Bio-Rad): 2,3.4 -препараты очищенных мышиных МКА 3F9, 7D8, 7Н10, специфичные к ВМ (по 1 мкл); 5,6,7 - препараты очищенных мышиных МКА ICI, 4А2, 1В2, специфичные к ВЭ (по 1 мкл). Стрелками обозначены цепи IgG.

Методом двухцентрового ИФА в формате "сэндвич" было исследовано 16 видов МКА, специфичных к белкам ВМ. На их основе было сформировано 224 сочетания пар МКА. Из 74 пар МКА, выявляющих инактивированный АГ ВМ (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0) - 15 пар МКА выявляли рек. белки: 11 пар выявляли рек. УР40 и 4 пары - рек.УР35 (табл. 10).

универсальных конъюгатов с ферментами. 1 2 3 4 5 6 7

^ цепь

iев

25"

депса£

цель

IgG

Так же был исследован 21 вид МКА, специфичных к белкам ВЭ - два к УР35; девять к УР40; десять к нуклеопротеину. Из них было сформировано 399 различных сочетаний пар МКА. Инактивированный антиген ВЭ удовлетворительно выявляли 115 пар МКА (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0), из них 29 пар МКА выявляли рек. белки: 17 пар выявляли рек.УР40 и 14 пар - рек.НР (см. табл. 10).

Интересен был факт выявления инактивированных АГ парами МКА, специфичных к разным вирусным белкам. Эти данные предполагают высокое белок -белковое взаимодействие вирусных протеинов в вирионе, несмотря на жесткую инактивацию. По литературным данным, при исследовании структуры филовирусов методом электронной микроскопии было зафиксировано, что ЫР и УР40 ВЭ-Заир тесно связаны в течение вирусного морфогенеза, что является важной деталью при постановке диагноза филовирусных заболеваний (веЛеЛ ТЛУ. е1 а1., 1995). При исследовании вклада филовирусных белков в формирование вирусоподобных частиц (УЬРв) было показано, что ЫР ВЭ самостоятельно, без помощи УР40, не выходит из клеток и поэтому была предположена важная связь между этими белками (Ыса1а 3. е( а1„ 2004).

Таблица 10

Данные по количеству пар МКА, исследованных в двухцентровом ИФА формата "сэндвич" для

выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола

Общее Количество Количество пар МКА. выявляющих АГ

количество исследо- инактиви- рек. белок рек. белок рек. белок рек.белок

исследован ванных рованный VP40BM VP35 ВМ VP40 ВЭ NP ВЭ

ных видов сочетаний вирусный (совпадаю- (совпадаю- (совпадаю- (совпадаю-

МКА пар АГ щих по щихпо щих по щих по

выявлению выявлению выявлению выявлению

АГВМ) АГВМ) АГ ВЭ) АГ ВЭ)

специфичных к 224 74 33(11) 5(4) -

вирусу Марбург

специфичных к 399 115 _ 51(17) 42 (14)

вирусу Эбола

Примечания: Из 16 видов МКА, специфичных к вирусу Марбург: 3 - к белку УР35; 9 - к белку УР40; 3 - к КР; 1 - № (?). Из 21 вида МКА, специфичных к вирусу Эбола: 2 - к белку УР35; 9 - к белку УР40; 10 - к ИР.

Использование рек. белков позволяет более точно определять чувствительность выявления индивидуальных АГ. Так, по литературным данным, очищенный АГ ВЭ выявляли парой МКА, специфичных к белку VP40, до концентрации 1-2 нг/мл, что соответствовало инфекционному титру 10М04 БОЕ/мл (Luch А. et al., 2003). При использовании МКА для "захвата" АГ была показана чувствительность выявления рек. VP40 ВЭ в концентрации 2 нг/100 мкл (Kaistrom G. et al., 2005) и рек. NP в концентрации 30 нг/100 мкл (Niikura М. et al., 2001).

В данном исследовании чувствительность выявления рек. АГ разными парами МКА находилась в диапазоне концентраций от 150 до 1 нг/мл. Были выбраны четыре пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенные вирусные АГ,

так и рек. белки с чувствительностью 1 нг/мл. Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ (рис. 11) и пара МКА 4А2 и ICI, специфичные к белку VP40 ВЭ (рис. 12). Для белка VP40 ВМ это пара МКА очищенных 7D8 и меченных биотином 7Н10 (рис. 13).

4 ................-.....................................-...........-...................—.......................................................................-..........-..................

2500 1250 625 .<12.5 156.25 "S.12 39.6 19.8 9.9 4.95 2,4" 1.2J Концентрация антигенов иг мл

Рнс. 11. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного нуклеопротеина

парой МКА 1В2 и 7В11*. Примечания: исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7BI1* -индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 9С7 и 5F11 *, специфичных к NP ВМ; концентрация МКА для "захвата" антигенов — 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Концентрация антигенов нг мл

Рис. 12. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 4А2 и ICI*. Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; ICI* -индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ; концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Рпс. 13. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 7D8 и 7Н10*.

Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7Н10* -индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 4А2 и ICI*, специфичные к белку VP40 ВЭа; концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве "захватывающих" АГ, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления АГ VP35 ВМ (рис. 14).

Рис. 14. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35 парой МКА 3F9 и

3F9*.

Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 3F9* -индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали захватывающие антиген МКА 1С7. специфичные к белку VP35 ВЭ; концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1мкг/мл.

В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (Hevey M. et al., 1997) и штамм Popp (Ручко C.B. и др., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9,

специфичные к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.

Выбранные пары МКА строго специфичны к внутренним структурным вирусным белкам NP, VP40 и VP35 филовирусов, не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными вирусными и рек. АГ. Кроме того, по результатам двухцентрового ИФА, все эти 7 видов МКА, специфичные к структурным внутренним филовирусным белкам NP, VP40 и VP35, конкурируют с IgG лошадей, иммунизированных инфекциоными вирусами, за антигенные эпитопы вирусных и рек. белков. В связи с этим, показана ценность препаратов МКА при использовании их в качестве диагностических реагентов для выявления маркеров филовирусов.

Исследование иммунохимических свойств рек. белков NP, VP40 и VP35, полученных в результате экспрессии полноразмерных генов NP, VP35 и VP40 в клетках E.coli методами ИФА и ИБ, показало, что они антигенно схожи с нативными вирусными АГ и могут быть успешно применены для конструирования иммунодиагностических тест-систем в качестве положительного контроля на антиген.

Применение МКА и антигенов в иммунодиагностике лихорадки

Западного Нила

В серодиагностике ЛЗН используют метод ИФА для выявления специфических AT (Распопин В.В. и др., 2007; Feinstein S. et al., 1985; Hogrefe W.R. et al„ 2004). Но выраженные перекрестные реакции между ВЗН и ВКЭ, ареалы которых в России перекрываются (Львов Д.К. и др., 2000; Терновой В. А. и др., 2004; Терновой В.А. и др., 2006), затрудняют его иммунохимическую диагностику (Распопин В.В. и др., 2007). Методы выявления вируса на культуре клеток москитов или Vero (Samina I. et al., 1986; Bernard K.A. et al., 2001; Nasci R.S. et al., 1999) или внутримозговым заражением новорожденных мышей (Львов Д.К., 2000; Samina I. et al., 1986), а так же ПЦР для выявления вирусной РНК (Львов Д.К., 2000; Терновой В.А. и др., 2004; Терновой В .А. и др., 2006; Lanciotti R.S. et al., 2000; Surtherland G.L. et al., 2007) требуют много времени и/или дороги.

Для наблюдения вирусной активности в естественных циклах передачи и предотвращения инфекции у людей A.R. Hunt и соавт. (2002) предлагают проводить выявление вирусного АГ методом ИФА в лабораториях, не имеющих оборудования для выполнения ПЦР. Для захвата антигена в этой системе использованы МКА, специфичные к южно-африканскому штамму ВЗН, полученные T.G. Besselaar и соавт. (1988), а для детекции - группоспецифические к флавивирусам МКА, конъюгированные с пероксидазой. Чувствительность выявления очищенного АГ ВЗН (штамм NY99) в этой системе составила 320 пг/мл, а в пуле лабораторно инфицированных москитов и мозговой суспензии мышей-сосунков 103-104 PFU/мл.

В России в настоящее время выпускается только одна коммерческая тест-система ИФА на основе ПАТ для выяатения АГ ВЗН (ЗАО ЭКОлаб, Московская область, г. Электрогорск).

Получение и характертация МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (LEI V— VL99-27889-Ituman)

Для получения гибридом, продуцирующих МКА специфичные к структурным белкам ВЗН, было проведено 3 гибридизации и в результате наблюдения в световой микроскоп было выявлено 853 лунки с гибридами, размножающимися на селективной среде ГАТ. Ростовая среда от 771 гибридной популяции была оценена в ТИФА и после 2-кратного тестирования было выявлено 119 позитивных популяций гибридом. Методом предельных разведений было проведено клонирование 75 гибридом. Заморожена позитивная популяция 32 гибридом. Выход позитивных клонов гибридом, после клонирования, составил 24 гибридомы. Позитивные клеточные

линии, по данным ТИФА, были размножены (1-3 клона) и заложены в жидкий азот на хранение.

Препаративные количества очищенных 15-ти видов МКА, полученные из асцитических жидкостей мышей с привитыми гибридомными клетками, тестировали методом ТИФА с использованием в качестве АГ очищенного ВЗН (штамм У1§99-27889). Результаты анализа представлены в табл. 11.

Таблица 11

Свойства МКА, специфичных к вирусу Западного Нила

№ п/п МКА Белок-мишень вИБ Субтип IgG Титр МКА в ТИФА Концентрация очищенных МКА (мг/мл)

В асцитных жидкостях В очищенных препаратах

1 9Е2 Е (53 кДа) IgGl >27000000 21870000 14,3

2 5Н6 н.о. IgGl 729000 656100 6,0

3 4D10 н.о. IgGl 243000 72900 7,0

4 7Е6 Е (53 кДа) IgG3 243000 243000 8,3

5 5F11 67 кДа IgG3 243000 243000 8,9

6 11G3 Е (53 кДа) IgG3 729000 810000 5,0

7 7В9 Е (53 кДа) IgG2b 729000 729000 6,3

8 ЗА9 Е (53 кДа) IgGl 72900 72900 4,5

9 5F7 н.о. IgGl 72900 24300 1,7

10 4F11 Е (53 кДа) IgG3 243000 243000 5,7

11 3F4 Е (53 кДа) IgG2b 656100 656100 6,5

12 IB7 Е (53 кДа) IgG3 656100 243000 4,5

13 2G12 Е (53 кДа) IgG3 24300 24300 2,5

14 7G9 Е (53 кДа) IgG3 >27000000 2430000 13,5

15 7В2 Е (53 кДа) IgGl 24300 24300 2,5

16 АС мыши* Е (53 кДа); 67 кДа все 729000 2430000 н.о.

17 АС здоровой мыши <100 <100 н.о.

Примечания: в качестве АГ в ТИФА использован очищенный препарат ВЗН (штамм 4^99-27889); * сыворотка крови мышей, клетки селезенки которых были взяты для гибридизации; н.о. - не определяется.

Все исследованные препараты содержали высокий уровень специфических МКА. Методом ИБ показана специфичность полученых МКА (рис. 15). Проведенные ранее исследования показали, что эти МКА позволяют нейтрализовать семь штаммов ВЗН (LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLG00-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV- Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; EglOl) на культуре клеток Vero (Razumov I.A., Kazachinskaia E.I. et al., 2005). Использование РНК из мышиных гибридом, продуцирующих самые активные МКА 9Е2, позволило создать нашим коллегам в США химерную конструкцию МКА MbmubflgGl человека, способную к протективному действию у мышей, зараженных американским штаммом NY-99 (Pereboev A. et al., 2008).

Рис. 15. Иммуноблоггинг. Исследование белков очищенного вируса Западного Нила (штамм Vlg99-27889) с применением: 1 - сыворотки крови мышей, иммунизированных инфекционным вирусом: 2, 3, 4 - сывороток крови мышей, иммуннизированных инактивированным вирусным препаратом, селезенки которых были взяты в гибридизацию; 5 - 10 - очищенных препарататов МКА 9Е2, 7G9, 11G3, 7F9 и 7В9, соответственно; 11, 12 - очищенных препаратов МКА 5Н6 и 4D10. Справа приведены обозначения молекулярной массы по маркерам (Life technology). Все антитела использовали в разведении (1/1000); стрелками показаны белки вирусного препарата.

Изучение антигенных свойств препаратов ВЗН с применением МКА

МКА были получены при иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов очищенным вирусным препаратом из мозговой ткани инфицированных ВЗН мышей-сосунков.

Приготовление очищенного АГ трудоемкий и затратный процесс, так на приготовление 1 мг АГ было использовано 40 животных. Чтобы исключить наработку вирусного препарата на инфицированных животных, для дальнейших исследований использовали концентрированный АГ из инфицированных клеток Vero. С монослоя инфицированных клеток Vero (до появления явного ЦПД вируса в виде лизиса инфицированных клеток) удаляли поддерживающую среду, а клеточный дебрис в небольшом объеме среды без сыворотки осаждали низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок клеток в объеме 1 мл среды без сыворотки обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 30 секунд на тающем льду. Лизат клеток освобождали от осадка клеточных мембран центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. К аликвотам полученного лизата клеток или очищенного вирусного препарата добавляли 50 % глицерина и 1 % Nonidet Р40. Супернатанты для учета инфекционного титра вируса на культуре клеток Vero получали центрифугированием (при 10000 об/мин, 4 °С) трехкратно замороженной и размороженной среды вместе с клетками, после наблюдаемого не менее 80 % ЦПД вируса на монослой зараженных клеток. Работа с инфекционным ВЗН проводилась в изолирующем боксе, так как он относится к агентам II группы патогенности по биобезопасности. Оценку эффективности взаимодействия МКА с белками очищенного и неочищенного АГ проводили методами ТИФА и ИБ. Результаты титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток Vero в ТИФА с МКА 9Е2 приведены на рис. 16.

I г 3 А 5 6 ; S » !3 НЕ

1 i i M 1 1 j-í

' i y 9 и , V.

Чг * * » i i i

-» j p I

S_^ * - я Ь i N - У 1 и

* 11

т V i

й ■ V f 11

¿ Г

=*=очпшеннн№янпггиВЗН (Волгоград

---2~889,).коиЦ£нграцдя Imtmjt.

-Ф-шш клеток Vero, инфицированных ВЗН (Епщет 1011.

очищенный антиген ВКЭ.

100 200 400 800 1600 .U00 0400 12800 2ÍCÍOO 51200 102400 204800

Рашедення вирусных препаратов

Рис. 16. Титрование вирусных препаратов в ТИФА с МКА 9Е2. Примечания: ВЗН - вирус Западного Нила;ВКЭ - вирус клещевого энцефалита; ВЯЭ -вирус японского энцефалита.

В лизате инфицированных клеток белок Е выявляется методом ИБ с МКА без фоновых полос, так же как и в очищенном вирусном препарате (рис. 17). МКА, специфичные к ВЗН не выявляли этот белок в препаратах ВКЭ и ВЯЭ.

Ьелок К

70 60 50 40

Рис. 17. Иммуноблоттинг препаратов вируса Западного Нила с МКА 9Е2. 1- очищенный, концентрированный вирусный препарат в градиентах 30 % глицерина — 40 % тартрата калия -натрия, приготовленный из гомогената мозга мышей, инфицированных ВЗН (штамм LEIV-VLG99-27889-human); 2 -лизат клеток Vero, инфицированных ВЗН (штамм EglOl); 3 - лизат неинфицированных клеток Vero', 4 -очищенный. концентрированный

препарат ВКЭ; 5 - очищенный, концентрированный препарат ВКЭ. Все полоски мембраны обработаны очищенными МКА 9Е2 в разведении (1/500).

Данные ИБ и данные титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток в ТИФА свидетельствуют о высокой специфичности МКА к белку Е и возможности использования неочищенного вирусного препарата в качестве положительного контроля на АГ. Высокий уровень урожая вируса при наработке на культуре клеток Vero позволяет не использовать инфицированных животных.

Выбор пар МКА для эффективного выявления антигена ВЗН

Оценку конкуренции МКА за эпитопы белка Е проводили в двухцентровом ИФА формата "сэндвич". На очищенные для "захвата" АГ МКА, сорбированные на полистироловую поверхность микропланшета наносили вирусный препарат и затем вторые МКА, меченные биотином (индикаторные). После отмывки выявляли связанную биотиновую метку конъюгатом стрептавидина с пероксидазой. Результаты представлены в табл. 12.

Таблица 12

Результаты оценки МКА, специфичных к разным эпитопам белка Е вируса Западного Нила методом двухцентрового ИФА в формате "сэндвич"

№ МКА захвата Индикаторные МКА, меченные биотином

9Е2 5Н6 4D10 7Е6 5F11 11G3 4F11 3F4 7G9

1 9Е2 0.23 3,83 0.56 0,84 0,66 0,06 0,78 0,60 2,51

2 5Н6 0,55 0,80 2,53 2,72 3,17 0,99 0,94 0,89 3,09

3 4D10 0,04 0,48 0,62 0,03 1.03 0,06 0,66 0,61 0,54

4 7Е6 0,01 3,57 0,65 0,19 0,86 0,04 0,79 0,67 3,20

5 5F11 0,05 0,43 0,70 0,01 0,97 0,03 0,51 0,64 0.45

6 11G3 0,01 0,43 0,84 0,05 1,45 0,04 0,62 0,52 0,38

7 7В9 0,01 0,29 0,94 0,01 1,64 0,02 0,44 0,51 0,27

8 ЗА9 0,01 0,41 1,64 0,09 3,30 0,05 0,79 0,49 0,33

9 5F7 0,09 0,24 1,19 0,06 2,60 0,03 0,42 0,70 0,47

10 4F11 0,08 0,19 1,53 0,09 2,80 0,07 0,38 0,53 0,31

11 3F4 0,09 0,27 1,33 0,09 2,63 0,07 0,43 0,53 0,33

12 1В7 0,10 0,09 0,43 0.09 0,62 0,05 0,39 0,54 0,21

13 2G12 0,08 0,08 0,52 0,09 0,62 0,05 0,39 0,54 0,21

14 7G9 0,06 0,99 1,04 0,24 1,62 0,02 0,52 0,57 0,81

15 7В2 0,07 0,11 0,71 0,05 1,19 0,05 0,48 0,52 0,29

16 АС мыши* 0,16 1,49 1,50 0,79 2,71 0.21 0,67 0,62 1,88

17 контроли <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1

Примечание: В качестве антигена использован лизат клеток Vero инфицированных ВЗН (штамм Египет-101); МКА для сорбции в ячейках планшета использовали в концентрации 10 мкг/мл; индикаторные MICA использовали в концентрации 1 мкг/мл; жирным шрифтом выделены результаты для неконкурирующих МКА, т.е. активно "захватывающих" АГ; АС мыши* - сыворотка крови мыши, иммунизированной инфекционным вирусом. В качестве отрицательных контролей использовали лизат неинфицированных клеток Vero и очищенные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов.

Выявлено несколько пар МКА, специфичных к удаленным друг от друга эпитопам и не конкурирующих между собой за места связывания с АГ: 9Е2+5Н6*; 9E2+7G9*; 5H6+7G9*; 5Н6+7Е6*; 7Е6+5Н6*; 7E6+7G9* (звездочками обозначены индикаторные антитела). По результатам титрования АГ разными парами МКА, наиболее перспективной для использования в иммунохимических тестах представлялась пара МКА 9Е2+5Н6*, которая и была использована в дальнейших экспериментах.

Иличунохимическое выявление вируса Западного Нила в биопробах С использованием пары МКА (9Е2 для захвата АГ и 5Н6, связанных с биотином для детекции и конъюгата стрептавидина с пероксидазой) исследован ряд вируссодержащих субстанций с целью оценки эффективности данных АТ для выявления АГ ВЗН. На рис. 18 представлены результаты выявления в двухцентровом ИФА очищенного антигена и лизата инфицированных клеток.

Разведения вирусных пр-зп аратов

Рис. 18. Результаты исследования серий двукратных разведений вирусных препаратов в двухцентровом ИФА с использованием пары МКА 9Е2 для захвата и 5Н6 для детекции.

Очищенный АГ ВЗН (с концентрацией по белку 1 мг/мл) эта система достоверно определяет в разведении 1/51200. Таким образом, лимит выявления АГ составляет I - 2 нг/мл. Выбранная пара МКА позволяет выявлять в ростовой среде инфицированных клеток Vero вирусный АГ семи исследованных штаммов ВЗН, выделенных от разных хозяев - людей, птиц и нескольких видов клещей в разное время (рис. 19).

ЕВ-IOI Нр-94 Vlg-27924 А-72

Vlg-2 7889

А-1640

Tur-2914

цостовля среда от клеток Vero

Рис. 19. Титрование антигена в вируссодержащей ростовой среде от инфицированных клеток Vero в двухцентровом ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*. Примечания: стрелками обозначен диапазон чувствительности ИФА при сравнении инфекционного титра вируса в супернатантах при параллельном их титровании на культуре клеток Vero. Разведение супернтанта (-3) соответствует в данном эксперименте 100 ТЦД50/100 мкл; Eg -101 - штамм Египет 101, выделен в 1951г. в Египте из сыворотки крови больного ребенка; Нр-94 - штамм Ast63-94-ticks, выделен в 1963 г. из клещей Hyalowma marginatum в дельте Волги (Астраханская область); Vlg-27924 -штамм LEIV-VLGOO-27924-human, выделен в 2000 г. в г. Волгограде из мозга человека 74 лет, погибшего от ЛЗН; А-72 - штамм LEIV-Az70-72-ticks, выделен в 1970 г. из клещей Ornithodoros capensis в Азербайджане; Vlg-27889 - штамм LEIV-VLG99-27889-human, выделен в 1999 г. в г. Волгограде из мозга человека 15 лет, погибшего от ЛЗН; А-1640 - штамм LEIV-Az67-1640-nuthatch, выделен в 1967 г. из мозга птицы Si На ечгораеа в Азербайджане; Тиг-2914- штамм LEIV-Tur73-2914-ticks, выделен в 1973 г. из клешей Hyalomma detritum в Туркмении.

Для оценки эффективности обнаружения АГ ВЗН в биопробах от животных была моделирована ЛЗН (штамм Египет-101) на белых беспородных мышах при внурибрюшинном заражении, как описано В.Б. Писаревым и соавт. (2007). Биологический материал забирали в разгар заболевания (активность резко снижена, шерсть взъерошена, живот асцитный, паралич задних конечностей). Животным под эфирным наркозом проводили декапитацию. Забор биологического материала проводили с соблюдением требований инструкций, разработанных для работы с вирусами II группы патогенности и правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Из крови получали сыворотку, а из органов готовили 10 %-е гомогенаты мозга, печени, селезенки, почек, легкого и сердца. В качестве положительного контроля на АГ использовали ростовую среду от инфицированных

Рис. 20. Выявление вирусного антигена в биологических пробах от инфицированных мышей методом двухцентрового ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*. 1 - супернатант от инфицированных клеток Vero (положительный контроль); 2-10 %-й гомогенат мозговой ткани; 3—10 %-й гомогенат печени; 4-10 %-й гомогенат легкого; 5-10 %-й гомогенат селезенки; 6-10 %-й гомогенат сердца; 7-10 %-й гомогенат почек; 8 - цельная сыворотка крови; 9 - ростовая среда от клеток Vero (отрицательный контроль).

По данным титрования было выявлено, что в цельной крови АГ практически не обнаруживается, а наибольшее его количество сконцентрировано в мозговой ткани и клетках печени. В клетках сердца, селезенки, почек и легкого мышей ВЗН так же продуктивно реплицируется, что говорит широком диапазоне его тропности.

На основании этих данных совместно с ЗАО "Вектор-Бест" была разработана экспериментальная тест-система "ВектоНил-антиген". Для "захвата" АГ использовались иммобилизованные высокоспецифичные МКА 9Е2, а в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Сотрудниками лаборатории ООИ ФГУЗ «ЦГиЭ в Волгоградской области» были проведены полевые испытания этой тест-системы. Результаты представлены в табл. 13. Было исследовано 264 пробы из внешней среды на наличие антигена АГ ВЗН, в том числе суспензии из органов 62-х птиц (видовой состав - грачи, вороны, дрозды), 114 комаров (рода Aedes, Culex, Anopheles); 36 клешей (виды H. Morginatiim и D. Retiailatum), органов 52-х мелких мышевидных грызунов. Положительный результат на АГ был получен в 15 пробах (5,6 %): комаров - 14 (12,2 %) и клещей - 1 (2,7 %). Комары рода Aedes и Culex пойманы в Камышинском районе Волгоградской области и г. Волгограде. Клещ Н. morginalum был снят с грача (Октябрьский район Волгоградской области).

Таблица 13

Результаты полевого испытания ИФА тест-системы "ВектоНил-антиген"

Пробы Количество исследованных проб Результаты, полученные при использовании тест-системы "ВекторНил-антиген"

Положительных Отрицательных

Суспензии из органов птиц (грачи, вороны, дрозды) 62 0 62

Суспензии из комаров родов Aedes, Culex, Anopheles 114 14 100

Суспензии из органов мелких мышевидных грызунов 52 0 52

Суспензии из клещей H.morginatum, D.reticulatum 36 1 35

Всего 264 15 249

Примечания: для конструирования диагностической ИФА тест-системы"ВектоНил-антиген" для "захвата" антигена использовали очищенные МКА 9Е2; в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Биологические образцы были собраны в очагах инфекции ЛЗН в Волгоградской области сотрудниками ООО ФГУЗ "ЦТ и Э в Волгоградской области".

Таким образом, разработанная на основе двух видов МКА, тест-система "ВектоНил-антиген", может применяться при проведении эпидемиологических исследований на присутствие AT ВЗН в биологических образцах, собранных в природе.

Применение моноклональных антител в диагностике цитомегалопнрусной инфекции

Получение коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5, ЦМВ)

Очищенные частицы ЦМВ содержат от 30 до 40 полипептидов с молекулярной массой в диапазоне 20 - 300 кДа (Landolfo S. et al., 2003). В матриксном (тегументном) слое вириона расположены, предположительно, 25 белков (Gibson W., 1996). В связи с этим, провести отбор гибридом, продуцирующих МКА к белку рр65, при иммунизации животных нативным АГ, достаточно проблематично.

Для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов целенаправленно был использован рек. белок рр65, полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli (Суслопаров И.М. и др., 2005). Исследование антигенных и иммуногенных свойств рек. белка рр65 не проводили, в связи с очевидностью этих характеристик. Ранее было описано применение кроличьих ПАТ, полученных к рек. белку рр65 для выявления продуктивной ЦМВИ в тканях (взятых в результате операции аортокоронарного шунтирования сердца) пациентов (Суслопаров М.А. и др., 2005). Кроме того, для формирования отечественной стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих AT к ЦМВ человека, были использованы рек. белки -рр150, р52 и белок рр65 (Ивченко С.Н., 2008).

В результате слияния и клонирования получены, тестированы и заложены на хранение в Банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор" (в жидком азоте) 11 гибридных клеточных линий, стабильно продуцирующих МКА, специфичных к рек. белку рр65. Характертация МКА, специфичных крекомбинантному белкурр65 ЦМВ Характеризацию АТ проводили методом ТИФА с использованием рек. белка и нативного вирусного АГ, полученного в виде лизата инфицированных клеток Vero. Определяли класс IgG, концентрацию АТ в очищенных препаратах и титры специфического взаимодействия с АГ. Результаты представлены в табл. 14.

Таблица 14

Характеристика МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ

№ п/п Название гибридомы и МКА Класс IgG Титры МКА в ТИФА (обратные величины) к антигенам* Концентрация зчищенных МКА (мг/мл) Иммуноблоттинг с использованием антигенов**

Рекомбинантному Нативному Рекомби-нантного Нативного

1 5F10 IgGl 1968000 25600 10,3 + +

2 1F9/H11 IgGl 1968000 12800 8,7 + +

3 1F9/E8 IgGl 1968000 12800 7,25 + +

4 VA IgGl 218700 12800 7,0 + +

5 I/G IgGl 24300 3200 5,3 + +

6 I/C5 IgGl 24300 1600 4,0 + +

7 I/H IgGl 24300 3200 4,7 + +

8 I/B10 IgGl 24300 3200 6,0 + +

9 I/D4 IgGl 24300 3200 4,5 + +

10 II/H10 IeGl 1968000 12800 7,6 + +

И и/си IgGl 1968000 12800 8,1 + +

Примечание: * В ТИФА для сенсибилизации планшетов использовали рек. рр65 с концентрацией 1 мкг/мл, а нативный АГ (лизат инфицированных клеток Vero) в разведении 1/20. ** В ИБ рекомбинантный и нативный белки использовали в объемах по 10 и 20 мкл на дорожку, соответственно.

Все гибридные клетки продуцировали МКА класса lgG¡ . взаимодействовали в ТИФА с рек. белком в диапазоне разведений от 1/24300 до 1/1968000, а с нативным вирусным белком в диапазоне от 1/1600 до 1/25600 и выявляли оба белка в ИБ. Наибольшую активность при взаимодействовии с вирусным белком рр65 в ТИФА проявляли МКА 5F10.

Выявление вирусного белка рр65 в клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека

Для исследований ЦМВ человека используют, главным образом, диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, так они переживают продуктивную инфекцию с характерным для этого вируса цитопатическим эффектом - округление, увеличение размеров, многоядерность (Федорова Н.Е. и др., 2005; Эмралидзе Л.К. и др., 2005). Было показано, что ЦМВ человека стимулирует клетки Vero к вступлению в фазу митоза. Инфицированные клетки Vero могут нормально завершать цикл деления, так как прирост числа клеток в этой популяции обычно не ниже уровня контрольных незараженных клеток. С помощью МКА показана экспрессия сверхраннего белка р72 ЦМВ в инфицированных клетках этого вида (Макарова Н.Е., 1995).

Для оценки продуктивной ЦМВИ исследовали уровень синтеза белка рр65 в нескольких культурах клеток - L-68, Vero, RH и 293. Характерное ЦПД вируса (набухание и лизис) наблюдалось только на чувствительной культуре клеток L-68, остальные инфицированные культуры не отличались визуально от контрольных незараженных клеток. На рис. 21 приведены результаты ПААГ-ЭФ лизатов инфицированных клеток перечисленных выше культур.

рр65

П 66

Рис. 21. Результаты электрофоретического анализа белковых препаратов. 1 - очищенный рек. белок рр65 (10 мкл); 2-5 - лизаты клеток Vero, RH, L68 и 293, инфицированных ЦМВ (по 20 мкл на дорожку);

6 - препарат очищенных МКА 5F10 (1 мкл),

7 - белковые маркеры молекулярной массы (Bio-Rad).

Визуально белок рр65 в большом количестве присутствует во всех вирусных препаратах. Однако этот белок сложно отличить от сходного с ним по молекулярной массе бычьего сывороточного альбумина (БСА, 66 кДа), содержащегося в ростовой среде от инфицированных клеток. Отмывание клеточного монослоя при получении лизатов не обеспечивает полного избавления от этого белка. В связи с этим, далее наличие специфического АГ в лизатах. оценивали методом ИБ. На рисунке 22 видно, что очищенные МКА 5F10 активно выявляют нативный вирусный белок рр65 в препаратах, полученных при инфицировании ЦМВ разных культур клеток - Vero, RH и L-68.

3 4

HjKKfjíS ->

Piic. 22. Результаты иммуноблоттинга белков ЦМВ в лизатах инфицированных

клеток с применением МКА 5F10, специфичных к рекомбинантному белку рр65.

1,2,3 - Лизаты инфицированных ЦМВ клеток Vero, RH и L 68, соответственно (по 20 мкл на дорожку).

4 - Очищенный рек. белок рр65 (10 мкл) (положительный контроль).

5 - Лизат клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2 типа (отрицательный контроль).

6 - Значения молекулярной массы белковых маркеров. МКА 5F10 использованы в разведении 1/500.

Растворы меркаптоэтанола и SDS, использующиеся при выполнении процедуры ЭФ могут вызывать нарушение структуры вирусных белков. Для оценки эффективности взаимодействия полученных МКА с нативными вирусными белками, выращивали инфицированную культуру клеток Vero в лунках 96-луночного

культурального планшета и спустя 7 суток клетки фиксировали на поверхности планшета этанолом. Инфицированные клетки обрабатывали очищенными МКА и антивидовыми антителами, меченными пероксидазой. Окрашивание проводили с использованием субстрата на основе 3-агшпо-9-еЙ1у1сагЬаго1е. Результаты иммуношггохимического анализа приведены на рис. 23.

Рпс. 23. Выявление белка рр65 в инфицированных клетках Vero иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием МКА 5F10.

a. Неинфицированная культура клеток Vero (отрицательный контроль).

b. Неинфицированная культура клеток Vero, обработанная МКА 5F10 (отрицательный контроль).

c. Инфицированная ЦМВ культура клеток Vero, последовательно обработанная МКА 5F10 и конъюгатом антивидовых антител с пероксидазой.

Видно, что МКА 5F10, специфичные к рек. белку рр65, интенсивно окрашивают нативный вирусный белок рр65 в виде мелких и крупных конгламератов в персистентно инфицированных клетках Vero.

Результаты исследования в ТИФА серий двукратных разведений герпесвирусных АГ показали, что применение МКА 5F10 позволяет определять рек. белок рр65 в концентрации 2,5 нг/мл (рис. 24).

—♦~рек.ррб5

5000 2500 1250 625 312,5 156,25 78,12 39.6 19.8 9.9 4.9 2.45 концентрация антигенов нгмл

Рис. 24. Результаты ТИФА серии двукратных разведений антигенов герпесвирусов. Примечания: ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа (Суслопаров М.А. и др., 2004); рек.^ - рек. белок gG ВПГ-2 (Суслопаров М.А., 2009); МКА 5Р10 использованы в концентрации 2 мкг/мл.

Вирусный АГ, приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, выявляемся на порядок хуже, что пропорционально относительно небольшой доле целевого белка в общем массиве лизатных протеинов. В качестве отрицательных контролей в этих экспериментах использовали нативный ВПГ-2 (Суслопаров М.А. и др., 2004), так же приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, и рек. белок gG вируса ВПГ-2 (Суслопаров М.А., 2009), который является типоспецифическим маркером для этого вируса. Исследованные МКА не вступали в перекрестные реакции ни с тем, ни с другим контрольным образцом, что свидетельствует об их типовой специфичности.

Проведенные эксперименты показали, что полученные МКА обладают высокой специфичностью и активностью, позволяющей эффективно применять их для ранней диагностики ЦМВИ.

К сожалению, отсутствие животной модели для ВГЧ-5 (ЦМВ) не позволяет исследовать протективное или лечебное действие полученных МКА. Но получение МКА может иметь потенциальное терапевтическое значение. Так как в настоящее время нет препаратов широкого антивирусного действия, идет активное исследование препаратов и подходов к лечению ЦМВИ. На том факте, что основной белок тегумента рр65 может самостоятельно доставляться из инфицированных клеток в ядра соседних клеток (Schmolke S. et al., 1995; Ряскина С.С. и др., 2006), может быть сконцентрирован подход антивирусной терапии против ЦМВИ. Есть данные о том, что рр65 оказывает негативное влияние на развитие интерферонового сигнала на начальных стадиях инфицирования после проникновения вируса в клетку, до начала синтеза остальных вирусных белков (Browne Е. et al., 2003). Показан вакцинный потенциал белков ВГЧ-5, синтезированных альфавирусными репликонами, несущими гены белков IE1, gB и рр65 (Reap Е.А. et al., 2007; Schleiss M.R., 2008).

ВЫВОДЫ

1. Создана оригинальная панель моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусу Марбург (штамм Popp). Получены очищенные препараты, специфичные к внутренним структурным белкам вириона - к кофактору вирусной полимеразы (белку VP35) - 3 вида, к нукдеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопы не определяются.

2. Создана оригинальная панель МКА, специфичных к вирусу Эбола-Заир (штамм Mayinga). Получены очищенные препараты, специфичные к белку VP35 (2 вида), к нукдеопротеину (10 видов), к матриксному белку VP40 - 9 видов.

3. Показано, что рекомбинантные белки GP, VP24, NP, VP40 и VP35 филовирусов сохранили антигенную структуру, характерную для аналогичных вирусных белков, и в связи с этим, они могут быть успешно использованы для иммунодиагностики филовирусных инфекций.

4. Установлено, что использование комбинации рекомбинантных белков GP, NP, VP35 и VP40 в качестве антигена повышает чувствительность твердофазного иммуноферментного анализа по сравнению с применением в качестве антигена инактивированного очищенного вируса Марбург.

5. Показано, что полученные МКА и рекомбинантные белки NP, VP40 и VP35 могут быть успешно использованы для совершенствования иммунодиагностики заболеваний, вызываемых вирусами Марбург и Эбола. Это позволило:

- предложить новый способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7Н10.

- разработать новый способ выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9, которые можно одновременно использовать как в качестве "захватывающих антиген", так и в качестве "индикаторных" антител.

- создать оригинальный способ выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения).

- разработать метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и ICI.

6. Создана оригинальная панель из 15-ти очищенных препаратов МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLG99-27889-human). Сконструирована лабораторная тест-система ИФА на основе двух типов МКА 9Е2 и 5Н6, для выявления антигена вируса Западного Нила. Гибридная клеточная линия 9Е2, продуцирующая одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности (против семи штаммов ВЗН), защищена патентом РФ № 2265658.

7. На основе лабораторной тест-системы ИФА совместно ЗАО "Вектор-Бест" разработана и начато производство экспериментальной тест-системы "ВектоНил-антиген". Показано ее высокая эффективность для эпидемиологического исследования циркуляции вируса Западного Нила в природных очагах этой инфекции.

8. Создана оригинальная коллекция из 11 мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (цитомегаловируса человека). Показана способность МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65, высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разумов И.А., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Казачинская Е.И. Моноклональные

антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. // Вопросы вирусологии. - 1998. - № 6. - С. 274-279.

2. Сорокин A.B., Казачинская E.H., Качко A.B., Иванова A.B., Букреев A.A.,

Разумов И.А. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. // Вопросы вирусологии. - 1999. - № 5. - С. 206-213.

3. Казачинская Е.И., Перебоев A.B., Чепурнов A.A., Беланов Е.Ф., Разумов И.А.

Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург. // Вопросы вирусологии. - 2000. - № 3. - С. 40-44.

4. Разумов И.А., Беланов Е.Ф., Бормотов Н.И., Казачинская Е.И. Выявление противовирусной активности моноклональных антител, специфичных к белкам вируса Марбург. // Вопросы вирусологии. - 2001. - № 1. - С. 33-37.

5. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Нетесов C.B., Чепурнов A.A.,

Разумов И.А. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. // Вопросы вирусологии. - 2001. - № 5. - С. 25-31.

6. Качко A.B., Чеусова Т.Б., Сорокин A.B., Казачинская Е.И., Чешенко И.О.,

Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Иванова A.B., Разумов И.А, Рябчикова Е.И., Нетесов С.В. Сравнительное изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург. // Молекулярная биология. - 2001. - № 3. - С. 1-8.

7. Sorokin A.V., Kazachinskaya E.I., Ivanova A.V., Kachko A.V., Netesov S.V., Bukreev A.A., Loktev V.B., Razumov I.A. Mapping of two dominant sites of VP35 Marburg virus. // Viral Immunology. - 2002. - Vol. 15. - № 3. - P. 481-92.

8. Cheusova Т., Kachko A., Kazachinskaya E., Chechenko I., Razumov I., Netesov S.,

Ryabchikova E. Studies of the expression of Marburg virus recombinant nucleoprotein. // Ultrastructual Microskopy. - 2002. - № 4. - P. 26-27.

9. Рудзевич Т.Н., Терновой B.A., Казачинская Е.И., Разумов И.А., Чепурнов

A.A., Локтев В.Б., Нетесов С.В. Выявление антигенных детерминант на N -конце белка VP35 вируса Эбола с помощью коротких рекомбинантных фрагментов этого белка. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2003. - № 2. - С.38-41.

10. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Temovoi V.A., Protopopova E.V., Galkina I.V., Gromashevskii V.L., Prilipov A.G., Kachko A.V., Ivanova A.V., L'Vov D.K., Loktev VB. Neutralizing monoclonal antibodies against Russian strain of the west nile virus. // Viral Immunol. - 2005. - Vol. 18. - № 3. - P. 558-68.

11. Распопин B.B., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Протопопова Е.В., Локтев

B.Б., Топычканова Н.Г., Жуков В.А., Жукова Н.Г., Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Смердова М.А., Гришаев М.П. Индекс авидности специфических IgG в диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 4 - С. 29-32.

12. Pereboev А., Borisevich V., Tsuladzea G., Shakhmatov M.l, Hudman D., Kazachinskaia E., Razumov I., Svyatchenko V., Loktev V., Yamshchikov V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. // Antiviral Research. - 2008. - Vol. 77. - № 1. - P. 6-13?

13. Казачинская Е.И., Иванова A.B., Сорокин A.B., Качко A.A., Субботина Е.Л., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Медицинская иммунология. - 2010,-№3.-Том 12.-С. 177-190.

Патенты

1. Сорокин A.B., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Качко A.B., Иванова A.B., Мишин В.П., Букреев A.A., Локтев В.Б., Нетесов С.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQ_f35M, кодирующая гибридный полипептид D5M, обладающий антигенными и иммуногенными свойсвами белка VP35 вируса Марбург, способ ее получения, и штамм бактерий Esherichia coli сверхпродуцент рекомбинантного полипептида ß5M. // Патент РФ № 21445665, приоритет изобретения от 12.11.1998. Опубликован 20.01.2000 в БИ №2.

2. Казачинская Е.И., Алексеенко Т.П., Разумов И.А. Протопопова Е.В. Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus inusailiis L. НИИМБ-280 (9Е2) - продуцент моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила. // Патент РФ № 2265658, приоритет изобретения от 09.01.2004. Опубликован 10.12.2005 в БИ№ 34.

3. Казачннская Е.И., Сорокин A.B., Иванова A.B., Качко A.B., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 3F9 - продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления белка VP35 вируса Марбург и моноклональные антитела 3F9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток. // Патент РФ № 2393220, приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.

4. Казачннская Е.И., Сорокин A.B., Иванова A.B., Качко A.A., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Марбург (штамм Popp) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Popp). // Патент РФ № 2395575, приоритет изобретения от от 15.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.

5. Казачннская Е.И., Перебоев A.B., Иванова A.B., Качко A.A., Субботина Е.Л., Чепурнов A.A., Разумов И.А., Локтев В.Б. / Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1В2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата "сэндвич" для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395576, приоритет изобретения от от 16.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ №21.

6. Казачннская Е.И., Иванова A.B., Качко A.A., Субботина Е.Л., Чепурнов A.A., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты) и набор для иммуноферментной системы формата "сэндвич" для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2395577, приоритет изобретения от от 18.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.

7. Казачннская Е.И., Суслопаров М.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 5F10 - продуцент моноклональных антител, используемых для выявления белка рр65 цитомегаловируса человека. // Патент РФ № 2393219, приоритет изобретения от от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.

Публикации в материалах конференций

1. Razumov I.A., Belanov E.F., Bukreev A.A., Kazachinskaia E.I., Bormotov N.I. Properties and protective capacity of monoclonal antibodies to Marburg virus. // Xth international congress of virology, Jerusalem, Israel. - 1996. - Abstract Book. -PW60-45. - P. 260.

2. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Belanov E.F., Chepumov A.A. Mabs to filoviruses: properties, antigenic specificity, and their utility in detecting filoviral antigens. // Russian - German colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. - 1997. - Abstract Book. - P. 13.

3. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Belanov E.F., Kachko A.V., Sorokin A.V. Monoclonal antibodies against Filoviruses. // 6th Biological Medical Defence Conference, München. - 1999.

4. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Belanov E.F., Kachko A.V., Sorokin A.V. Monoclonal antibodies against Filoviruses: Characterization of viral and recombinant proteins. // Inauguration of the Swedish Containment Laboratories, Stocgolm. - 2000.

5. Разумов И.А., Казачинская Е.И., Беланов Е.Ф., Качко А.В., Сорокин А.В. Использование моноклоиальных антител и рекомбинантных белков для создания новых систем для выявления вируса Марбург. // IX МеждунароЛЕгая конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф. - 2001. - Сборник тезисов. - С. 130.

6. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Перебоев А.В., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: свойства и использование для выявления вирусных антигенов. / IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф. - 2001. Сборник тезисов. - С. 133.

7. Разумов И.А., Казачинская Е.И., Беланов Е.Ф., Качко А.В. Использование моноклоиальных антител и рекомбинантных белков для выявления вируса Марбург. // VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. - С. 142.

8. Качко А.В., Сорокин А.В., Казачинская Е.И., Иванова А.В., Беланов Е.Ф., Разумов И.А., Букреев А.А., Collins Р., Нетесов С.В. Минирепликонная система на основе генома вируса Марбург. // VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментатьных исследований для инвестиций, г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. - С. 140.

9. Razumov I.A., Sorokin A.V., Kazachinskaia E.I., Ivanova A.V., Kachko A.V., Netesov S.V., Bukreyev A.A., Loktev V.B. Mapping of Two Dominant Sites of VP35 of Marburg Virus. // In "The world of microbes. XIIth International Congress of Virology, 27 July - 01 August, Paris. - 2002. - Abstract Book. - P. 460.

10. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Protopopova E.V., Galkina I.V., Gromashevskii V.L., Prilipov A.G., L'vov D.K., Loktev V.B. Neutralizing Monoclonal Antibodies Against European Strain of the West Nile Virus. // In Seventh International Symposium on Positive Strand RNA viruses, May 27 - June 01, 2004. - San Francisco. - Abstract Book. - P. 102

11. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Protopopova E.V., Galkina I.V., Gromashevskii V.L., Prilipov A.G., L'vov D.K., Loktev V.B. Neutralizing Monoclonal Antibodies Against European Strain of the West Nile Virus. // Health Canada Science Forum, October 18-19,2004. Ottawa, Ontario.

12. Распопин B.B. Разумов И.А., Казачинская Е.И., Протопопова E.B., Локтев В.Б., Жуков В.А., Смердова М.А., Гришаев М.П. Изменение авидности вирусспецифических IgG человека при лихорадке Западного Нила. Оценка возможности использования индекса авидности IgG для диагностики. // Всероссийская научно-практическая конференция "Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциям в XXI веке", г. Томск, 14-15 февраля 2006 г. - Тезисы докладов. - С. 114-115.

13. Распопин В.В., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Жуков В.А., Смердова М.А., Гришаев М.П. Использование теста на авидность IgG для дифференцировки заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // Всероссийская научно-практическая конференция "Современная ситуация и перспективы борьбы с

клещевыми инфекциями в XXI веке", Томск, 14-15 февраля 2006 г. - Тезисы докладов.- С. 112-113.

14. Распопин В.В. Смердова М.А., Гришаев М.П. Топычканова Н.Г., Разумов И.А., Казачинская Е.И., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Жукова Н.Г., Леонова Т.Н. Индекс авшшости специфических IgG в дифференциальной диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // III Российская научная конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", г. Новосибирск 27-29 сентября, 2006 г. - Тезисы докладов. - С. 210211.

15. Распопин В.В., Шварева O.A., Шумакевич Г.В., Казачинская Е.И., Протопопова Е.В., Разумов И.А., Локтев В.Б., Гришаев М.П. Мониторинг вируса Западного Нила в Волгоградской области в 2006 г. // Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии (ДЖИП) 2007. - № 11. - С. 145.

16. Pereboev A., Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D„ Kazachinskaia E., Razumov I., Svyatchenko V., Yamshchikov V., Loktev V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. // XIV International Congress of Virology, 10-15 August 2008, Istanbul. - Abstract Book. - P. 24-25.

17. Казачинская Е.И., Разумов И.А., Локтев В.Б. Использование моноклональных антител для выявления вируса Западного Нила в DAS-ELISA. // Всероссийская конференция "Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология" посвященная 80-летию 48 Центрального научно-исследовательского института Министерства обороны РФ 20-21 ноября 2008 г.

18. Перебоев A.B., Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D„ Казачинская Е.И., Разумов И.А., Святченко В.А., Ямщиков В.А., Локтев В.Б. Генная терапия флавивирусных инфекций на примере лихорадки Западного Нила. // Научная конференция "Медицинская геномика и протеомика", Новосибирск, ИХБФМ СО РАН, 9-13 сентября 2009, г. Новосибирск. - Тезисы докладов. - С. 30.

19. Казачинская Е.И., Иванова A.B., Сорокин A.B., Качко A.A., Субботина Е.Л., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Международная научно-практическая конференция "Современные проблемы инфекционной патологии человека", г. Минск, 2009. - Сборник научных трудов. - С. 277-280.

20. Казачинская Е.И., |Суслопаров М./С| Локтев В.Б. Получение моноклональных антител, специфичных к иммунодоминантному району рекомбинантного белка рр65 цитомегаловируса человека. // Международная научно-практическая конференция "Современные проблемы инфекционной патологии человека", г. Минск, 2009. - Сборник научных трудов. - С. 275-277.

Список использованных сокращений АГ - антиген AT - антитела

а.о. - аминокислотное основание

АС - антисыворотка

БОЕ - бляшкообразующие единицы

ВЭ - вирус Эбола

ВМ - вирус Марбург

ВЗН - вирус Западного Нила

ВГЧ-5 - вирус герпеса человека 5 типа (цитомегаловирус человека) ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ВЦ НИИМ МО РФ - Вирусологический Центр НИИ микробиологии Министерства

Обороны РФ (г. Сергиев Посад)

ГЛЭ - геморрагическая лихорадка Эбола

ГЛМ - геморрагическая лихорадка Марбург

ИФА - иммуноферментный анализ

ИБ - иммунобдоттинг

ИХКГ СО РАН - Институт Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения

Российской Академии Наук

КИФА - конкурентный ИФА

ЛЗН - лихорадка Западного Нила

МКА - моноклональные антитела

ОП - оптическая плотность

ОФД - орто-фенилендиамин

ПАТ - поликлональные антитела

ПААГ - полиакриламидный гель

ПААГ-ЭФ - электрофорез в ПААГ

рук. - руководитель

НИИ ЭМ — НИИ эпидемиологии и микробиологии (Беларусь, г. Минск);

рек. белок - рекомбинантный белок

ТИФА - твердофазный ИФА

ТСБ - трис-солевой буферный раствор

ТСБ-Т - трис-солевой буферный раствор с твином

ТМБ - тетраметилбензидин

ФГУЗ РосНИИПЧИ "Микроб" - Федеральное государственное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦПД - цитопатическое действие

IgG - иммуноглобулин класса G

IgM- иммуноглобулин класса М

GP - гликопротеин (основой структурный белок оболочки филовируса)

NP - нуклеопротеин (основой структурный белок нуклеокапсида филовируса)

SDS - додецилсульфат натрия

RH- клетки почки эмбриона человека

L-68 - диплоидные клетки легкого эмбриона человека

Vero - клетки почки африканской зеленой мартышки

VP40 - матриксный белок филовируса

VP35 - структурный белок филовируса (кофактор вирусной полимеразы) VP24 - белок оболочки филовируса

vTF7-3 - вирус осповакцины, экспрессируюший РНК-полимеразу фага Т7

Благодарности

Автор выражает благодарность всем коллегам за поддержку данной работы и за сотрудничество: научному консультанту д.б.н., профессору Локтеву В.Б., д.б.н. Разумову И.А., к.б.н. Качко A.B., н.с. Ивановой A.B., к.б.н. Субботиной Е.Л., д.б.н., профессору Нетесову C.B., к.б.н. Перебоеву A.B., н.с. Сорокину A.B., зав. лаб. ЗАО "Вектор-Бест" Распопину В.В., ст. лаборанту ЗАО "Векгор-Бест" Алексеенко Т.П.

За предоставленные для исследования препараты: д.б.н. Чепурнову A.A. за инактивированный вирус Эбола и сыворотку крови иммунизированного кролика, к.б.н. Беланову Е.Ф. за инактивированный вирус Марбург; к.б.н. Терновому В.А. за рекомбинантный белок VP35 вируса Эбола; к.б.н. Протопоповой Е.В. за инактивированные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов; д.м.н. |Суслопарову М.л] за нативные герпесвирусы (5 и 2 типов), рекомбинантный белок рр65 ВГЧ-5 и рекомбинантный белок gG ВПГ-2; зав. лаб. вирусологии флавивирусов к.б.н. Святченко В.А. и с.н.с. Киселеву H.H. за ценную консультативную помощь при работе с инфекционными вирусами; ведущего инженера Соколову H.A. за помощь при очистке вируса Западного Нила; ст. лаборанта Черникову Л.А. за техническую помощь; ст. лаборанта Чичакову Г.Н. за работу с животными.

Казачинская Елена Ивановна

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекции человека

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 15.10.2010 Формат 60x84 1/16 Объем 3,25 п.л. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №18 Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Казачинская, Елена Ивановна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.18

1.1. Иммунодиагностика инфекционных заболеваний.

1.2. Технология получения гибридомных клеток - продуцентов моноклональных антител (МКА).

1.3. Применение МКА для изучения и выявления патогенов разной природы.

1.4. Характеристика исследуемых вирусов и вызываемых ими заболеваний у людей, методов выявления, коллекций специфических МКА.

1.4.1. Филовирусы Марбург и Эбола.

1.4.2. Флавивирус Западного'Нила.

1.4.3. Вирус герпеса человека 5 типа (цитомегаловирус человека).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека"

Актуальность исследования

Важнейшей составляющей борьбы с инфекционными заболеваниями является своевременная их диагностика. В настоящее время развиваются два основных подхода в диагностике инфекционных заболеваний. Генетическая диагностика, основанная на выявлении нуклеиновой кислоты возбудителя, и иммунодиагностика, базирующаяся на выявлении специфических антигенов и антител, являются взаимодополняющими методическими подходами. Следовательно, крайне важно развивать оба эти направления исследований. Сложность проблемы состоит в том, что в настоящее время известны тысячи опасных инфекционных заболеваний, которые могут поражать сельскохозяйственные растения, домашних животных и человека. Кроме того, постоянно возникают новые, неизвестные инфекционные заболевания. По данным Международного таксономического вирусологического комитета только в последние годы зарегистрировано несколько сотен вновь открытых вирусных агентов. Открытие каждого нового возбудителя требует разработки методов их диагностики, причем эпидемическая значимость некоторых из них требует проведения этих исследований в самые кратчайшие сроки. Проблема усложняется тем, что постоянно возникают лекарственно устойчивые варианты возбудителей, многие агенты чрезвычайно быстро изменяются. Высокая патогенность многих вирусов также чрезвычайно усложняет экспериментальные работы по созданию новых методов диагностики. Вследствие этого, необходимо постоянное развитие и совершенствование биотехнологической базы для точной и своевременной диагностики инфекционных заболеваний.

Для совершенствования иммунодиагностики инфекций используют два основных подхода. Это технологии получения моноклональных антител (МКА) и рекомбинантных антигенов. Гибридомная технология позволяет создать уникальную биотехнологическую базу в виде препаратов МКА для исследования вирусных и бактериальных патогенов, опухолевых маркеров, гормонов, цитокинов, интерлейкинов, прионов, токсинов, аллергенов.

Важно заметить, что обе эти технологии позволяют фактически прекратить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве тест систем. Другим важнейшим преимуществом данных технологий является стандартизация качества новых иммунодиагностических систем и обеспечение производства иммунодиагностических тест систем необходимыми биологическими компонентами (антителами и антигенами) в течение неопределенно длительного времени.

Высокопатогенные филовирусы Марбург и Эбола чрезвычайно опасны для человека и общества, так как могут использоваться с террористическими целями. Эпидемическая важность этих агентов основана на их способности распространяться через прямой контакт с биологическими жидкостями и воздушно-капельным путем (Пьянков О.В. и др., 1993; Луб М.Ю. и др., 1995; Johson Е. et al., 1995). В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем для быстрого выявления антител и антигенов филовирусов. Характерной особенностью филовирусных инфекций является раннее появление вирусных антигенов в тканях, выделениях и сыворотке крови инфицированных животных и заболевших людей (Кизимов Н.В. и др., 1993; Мерзликин Н.В. и др., 1995; Rowe А.К., 1999; Чепурнова Т.С. и др., 2000). Эта особенность развития заболевания делает высокоэффективными методы иммунологической диагностики, основанные на раннем выявлении вирусных антигенов в биологических жидкостях человека и животных. Препараты очищенных МКА могут служить основой ИФА тест-системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике (Towner J.S. et al., 2004).

Вспышка 1999 г. в Волгоградской, Астраханской областях и Краснодарском крае лихорадки Западного Нила (ЛЗН), которая считалась эндемичной для тропических и субтропических стран, привлекла внимание к проблеме диагностики этой инфекции и потребовала быстрейшей ее разработки в нашей стране (Львов Д.К. и др., 2000). Тем более, чго позднее появились сообщения о циркуляции вируса Западного Нила (ВЗН) в птицах, комарах и клещах от Белоруссии до Приморского края, в Закавказье, бассейне Каспийского моря, республиках средней Азии, в Сибири (Львов Д.К., 2000; Терновой В.А. и др., 2004; Терновой В.А. и др., 2006). ВЗН передается теплокровным (людям, лошадям, птицам) через укус комаров, клещей и москитов. В США зафиксированы случаи, когда ЛЗН развивалась у 9 реципиентов после переливания крови (Harrington Т., 2003). J13H особенно опасна для пожилых людей, у которых может развиться миокардит, менингит и менингоэнцефалит, что приводит к 10 %-ной летальности среди заболевших (Flatau Е. et al., 1981). События 2010 г. на юге России, где снова возникла большая вспышка лихорадки Западного Нила, подтвердили значимость настоящего исследования и практическое использование разработанных тест систем обеспечило необходимые условия для борьбы с этой инфекцией в России.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), вызываемая вирусом герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5) - широко распространенное заболевание повсеместно во всех географических зонах, странах и социально-экономических группах (Alford С.А. et al., 1981). Главной биологической особенностью ВГЧ-5 является его пожизненное персистирование в организме человека и реактивация при снижении иммунитета. Заражение происходит разными путями: воздушно - капельным и при тесном контакте (в том числе и половом) через биологические жидкости, трансплацентарно (от матери к плоду) и интранатально во время родов при прохождении плода через инфицированные родовые пути женщины, при кормлении ребенка грудным молоком (Alford С.А. et al., 1990). Подтверждены факты инфицирования людей при трансплантации органов (почек, печени и костного мозга) (Chou S., 1986; Meijer E.et al., 2003; Razonable R.R., 2008). ВГЧ-5 вызывает генерализованную инфекцию у больных СПИД, что является причиной их гибели (Nigro G. et al., 1996). Сложность диагностики связана с проблемами персистирования этого вируса в клетках организма и необходимостью выявления вирусных антигенов именно в инфицированных клетках. В настоящее время за рубежом присутствие на мембранах периферических лейкоцитов матрикспого фосфопротеина рр65 и секреторного р72 ВГЧ-5 принято считать одним из основных критериев острой ЦМВИ. Получение отечественной панели МКА, специфичных к белку рр65, помогло бы улучшить ситуацию с диагностированием острой ЦМВИ у инфицированных людей. Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Получить представительные коллекции гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), специфичные к белкам филовирусов Марбург и Эбола, вируса

Западного Нила (ВЗН) и вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5).

2. Исследовать иммунохимические свойства МКА, специфичных к структурным белкам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 и оценить возможность их использования для конструирования иммунодиагностических тест систем. 3. Сконструировать рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксных белков УР40 вирусов Марбург и Эбола и получить полноразмерные рекомбинантные белки.

Научная новизна

Получены оригинальные и представительные коллекции гибридных клеток -продуцентов МКА и панели МКА, специфичных к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5.

Исследование иммунохимических свойств панели гибридомных МКА показало, что они могут быть использованы для научных исследований и для конструирования нового поколения иммунодиагностических тест систем на основе этих антител.

Получены оригинальные рекомбинантные белки гликопротеин (СР), нуклеопротеин (ЫР), УР40, УР35, УР24 вируса Марбург и белки ИР, УР40, УР35 вируса Эбола. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков показало иммунохимическую полноценность препаратов, что позволяет использовать их при конструировании диагностических тест систем на филовирусные инфекции.

В результате проведенных исследований, с использованием оригинальных препаратов МКА, а также рекомбинантных антигенов филовирусов, сконструированы новые

11 диагностические лабораторные тест системы для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола. Новизна и приоритет данной разработки подтверждена получением четырех патентов РФ (патенты № 2395575, № 2393220, № 2395576, № 2395577)

Исследование панели вируснейтрализующих МКА, специфичных к белку Е вируса Западного Нила (LEIV-VLG99-27889-human), позволило обнаружить два вида MICA (9Е2 и 5Н6), пригодных для конструирования иммуноферментной тест системы для детекции антигена в биологических пробах.

Практическая ценность работы

С использованием созданных панелей моноклональных антител, специфичных к различным вирусным патогенам, в том числе высокопатогенным вирусам Марбург и Эбола, и препаратов рекомбинантных белков созданы новые лабораторные образцы иммунодиагностических наборов. Это наборы для выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА (7D8 и

7Н10); наборы для выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9; наборы для выявления нуклеопротеина вируса

Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения); наборы для выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА

4А2 и ICI). Каждая из четырех разработанных конструкций тест-системы защищена патентом РФ (№ 2393220, № 2395575, № 2395576, № 2395577).

Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксных белков VP40 вирусов Марбург и Эбола, что позволяет нарабатывать соответствующие рекомбинантные антигены филовирусов для практического использования, конструирования различных типов иммунобиологических препаратов. Данные белки могут также использоваться для конструирования вакцин, исследования иммунологии и патогенеза филовирусных инфекций. Важно отметить, что предложенный биотехнологический подход позволяет получать антигены филовирусов без использования лаборатории BSL-4 уровня и высокопатогенных вирусов Марбург и Эбола.

Практическая ценность оригинальной коллекции из 24 мышиных гибридом, секретирующих МКА к вирусу Западного Нила (российский штамм LEIV-VLG99-27889

12 human) состоит в том, что МКА, секретируемые этими клетками - продуцентами, обладают вируснейтрализующей активностью в отношении различных штаммов ВЗН. Это позволяет использовать данные МКА для конструирования нового поколения иммунотерапевтических препаратов для лечения лихорадки Западного Нила. Это возможность была продемонстрирована в создании нового метода генной терапии лихорадки Западного Нила с использованием гена МКА 9Е2 (Pereboev A.V. et al., 2007).

Разработанная лабораторная тест-система ИФА в формате "сэндвич" на основе пары МКА (9Е2 и 5Н6) позволила создать экспериментальную тест-систему ИФА "ВектоНил-антиген" для выявления антигена вируса Западного Нила в полевых материалах (ЗАО "Вектор-Бест" совместно с ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор") и организовать ее производство. Данная система успешно производится более четырех лет и используется в практическом здравоохранении. В настоящее время на основе этих же МКА 9Е2, используемых в качестве "подложки" для антигена, ЗАО "Вектор-Бест" также выпускает тест-систему ИФА для выявления специфических антител класса IgG против вируса Западного Нила ("ВектоНил-IgG") и тест-систему ИФА для определения индекса авидности антител класса IgG, специфичных к вирусу Западного Нила (ВектоНил-^С-авидность").

Получение панелей МКА и набора рекомбинантных антигенов в рамках настоящей работы позволяет говорить, что удалось создать биотехнологическую базу для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа. Помимо использования этих иммунобиологических препаратов для разработки нового поколения иммунодиагностических тест систем возможно их использование для исследовательских целей. Важно подчеркнуть, что рекомбинантные антигены и МКА представляют собой стандартные препараты, которые могут храниться очень долго. Плазмиды и гибридные клетки могут обеспечивать наработку этих биореагентов в необходимых количествах на протяжении неограниченного времени без использования патогенных и высокопатогенных вирусных агентов.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

4 Способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7Н10.

7. Метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и ICI.

8. Панель из 15-ти МКА (мышиного происхождения), специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLG99-27889-human). Гибридную клеточную линию 9Е2 и одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности против семи штаммов ВЗН. Возможность использования МКА 9Е2 и 5Н6 в тест системе "ВектоНил-антиген".

9. Коллекция из 11 -ти оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65, способны высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток (в чувствительной L68 и персистентно инфекцированных Vero и RH).

Конкретное участие автора в получении результатов

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с д.б.н. И.А. Разумовым, д.б.н. В.Б. Локтевым, к.б.н. A.B. Качко, н.с. A.B. Ивановой, к.б.н. E.J1. Субботиной, к.б.н. A.B. Перебоевым, д.б.н. A.A. Чепурновым, к.б.н. Е.Ф. Белановым, к.б.н. В.А. Терновым, н.с. A.B. Сорокиным, д.б.н. C.B.

Нетесовым, д.м.н. [Суслопаровым М.А.|, зав. лаб. ЗАО "Вектор-Бест" В.В. Распопиным. Апробация работы

Махериалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Xlh International Congress of Virology, Jerusalem 1996 г.; Russian-german colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. 1997 г.; 6th Biological Medical Defence Conference. München 1999 г.; Inauguration of the Swedish Containment Laboratories. Stocgolm 2000 г.; IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф 2001 г.; VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Московская обл., г. Пущино 2001 г.; Digest reports of the IV th ISTC scientific advisory committee seminar on "Basic science in ISTC activities", Novosibirsk, 2001 г.; II Научная конференция с международным участием. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск, 2002 г.; Всероссийская научно-практическая конференция "Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке", Томск, 2006 г.; XIV International Congress of Virology, 2008 г., Istanbul; Научная конференция "Медицинская геномика и протеомика", 2009 г., Новосибирск; Международная научно-практическая конференция "Современные проблемы инфекционной патологии человека", г. Минск, Республика Беларусь, 2009 г. Связь выполненной работы с планами научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ "Вектор" за период 1998-2010 гг. в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению "Изучение структурно функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных". Исследования были поддержаны государственной программой

Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", контракт № 43.035.11.1529 рук. д.б.н. A.A. Чепурнов); проектом по государственному контракту № 02.512.11.2004

Биосенсоры на базе полимерных микрочастиц - жидких микрочипов для иммунодетекции инфекционных заболеваний, в том числе и особо опасных вирусных инфекций" (рук. зав. лаб. ИХКГ СО РАН д.ф.-м.н., профессор В.П. Мальцев); проектом Международного научнотехнического центра (МНТЦ) ISNC № 2087 (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); проектами

Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 97-04-49697-а (рук. д.б.н. И.А. Разумов), № 98-04-49439-а (рук. д.б.н., профессор C.B. Нетесов), № 01-04-49877-а (рук. к.б.н. A.B. Качко), № 01-04-48972-а (рук. д.б.н. И.А. Разумов); №09-0400450 а (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ "Научная школа НШ-387.2008.4" (рук. д.б.н., профессор C.B. Нетесов); контрактами, выполняемыми в 2009 г. по заказу ФГУЗ РосНИИПЧИ "Микроб" и ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии в рамках ФЦП "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.): № 6/ф/09 "Создание научно-технической основы для разработки новых методических и инструментальных подходов к индикации возбудителей особо опасных инфекций, с помощью высокочувствительных биосенсоров" (рук. к.б.н. А.Г1. Агафонов); № 127-Д/1 "Разработка методов получения антигенов и антител для использования в микроэррей технологии (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 статей (в реферируемых журналах, входящих в список ВАК), 20 тезисов, получено 7 патентов РФ на изобретение. Структура работы

Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, главы материалы и методы, 3-х глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 338 стр., включая 28 таблиц и 53 рисунка. Список литературы состоит из 753 источников, включая 132 отечественных работ. Благодарности

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Казачинская, Елена Ивановна

выводы

1. Создана оригинальная панель моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусу Марбург (штамм Popp). Получены очищенные препараты, специфичные к внутренним структурным белкам вириона - к кофактору вирусной полимеразы (белку VP35) - 3 вида, к нуклеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопы не определяются.

2. Создана оригинальная панель МКА, специфичных к вирусу Эбола-Заир (штамм Mayinga). Получены очищенные препараты, специфичные к белку VP35 (2 вида), к нуклеопротеину (10 видов), к матриксному белку VP40 - 9 видов.

Это позволило:

- разработать метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1.

6. Создана оригинальная панель из 15-ти очищенных препаратов МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-YLG99-27889-human).

237

Сконструирована лабораторная тест-система ИФА на основе двух типов МКА 9Е2 и 5Н6, для выявления антигена вируса Западного Нила. Гибридная клеточная линия 9Е2, продуцирующая одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности (против семи штаммов ВЗН), защищена патентом РФ № 2265658.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Целью настоящего изучения было исследование иммунохимических свойств рекомбинантных филовирусных белков и моноклональных антител, специфичных к особо опасным вирусам Марбург и Эбола, природно-очаговому вирусу Западного Нила и цитомегаловирусу (имеющему отношение к репродуктивному здоровью человека), на возможность конструирования на их основе диагностических тест-систем для выявления вирусных антигенов.

Исследование антигенного состава любого патогена необходимо для разработки дифференцирующей диагностики на специфические маркеры, а также для разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов. В связи с этим, на первом этапе работы методами ТИФА и иммуноблоттинга с помощью поликлональных антител человека, переболевшего лихорадкой Марбург и животных, иммунизированных инактивированными и инфекционными препаратами вирусов Марбург и Эбола были выявлены иммунодоминантные белки вирусов Марбург и Эбола, это внутренние структурные белки вириона - нуклеопротеин (ЫР), матриксный УР40 и кофактор вирусной полимеразы (белок УР35). Было обнаружено, что поликлональные антитела инфицированных и иммунизированных животных, а так же антитела реконвалесцента имеют перекрестную активность с гетерологичными антигенами в ТИФА. Возможно, что при инактивации вирионов открылись гомологичные аминокислотные последовательности филовирусных белков. Поэтому для исключения неспецифического взаимодействия противовирусных антител с гетерологичными вирусными белками далее в исследовании мы использовали аффинно-очищенные рекомбинантные филовирусные белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных генов в клетках Е.соИ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Казачинская, Елена Ивановна, Кольцово

1. Агафонов А.П. Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург. / Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Кольцово. Кольцово, 1996 - 21 с.

2. Агафонова O.A., Вязунов С.А., Жуков В.А. и др. О взаимосвязи уровня специфических антител с исходом заболевания у обезьян Cercopithecus aethiops при экспериментальной инфекции вирусом Марбург. // Вопросы вирусол. 1997. - № 3. - С. 109111.

3. Андерсон Р., Мэй Р. Инфекционные болезни человека. Динамика и контроль. // М.: Мир, 2004. С. 779.

4. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л. и др. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholera 0139. // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 79-84.

5. Алямовская Г.А., Кешищан Е.С., Адуева С.М. и др. Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста. // Вопросы вирусол.- 2005. -№ 1. С. 14-19.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. // Ленинград: Государственное издательство медицинской литературы, 1962.- 180 с.

7. Бажутин Н.Б., Беланов Е.Ф., Спиридонов В.А. и др. Влияние способов экспериментального заражения вирусом Марбург на особенности протекания болезни у зеленых мартышек. // Вопросы вирусол. № 3. - 1992. - С. 153-156.

8. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К, Каспаров A.A., Гребешок В.Н. Герпес. Этиология, диагностика, лечение. // М.: Медицина, 1986. 267 с.

9. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген антитело. // Иммунология (под ред У.Пол). М: Мир, 1989. - Том 3. - С. 5-89.

10. Борисевич И.В., Михайлов В.В., Краснянский Б.П. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулинов против лихорадки Эбола. // Вопросы вирусол. 1996. - № 6. - С. 270-273.

11. Борисевич И.В., Потрываева Н.В., Мельников С.А. и др. Получение иммуноглобулина к вирусу Марбург на основе сыворотки крови лошадей. // Вопросы вирус. 2008.- №1. - С. 39-41.

12. Букреев A.A., Скрипченко A.A., Гусев Ю.М. и др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург. // Вопросы вирусол. 1995. - № 4. - С. 161-165.

13. Вершигора А.Е. Общая иммунология. // Киев: 1990. 735 с.

14. Виноград И.А., Белецкая Г.В., Чумаченко С.С. Экологические аспекты изучения арбовирусов в Украинской ССР. // Экология вирусов и очаги арбовирусных инфекций. Москва, 1989.-С. 21-27.

15. Виноградская Г.Р., Новикова Л.Н., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. // Вопросы вирусол. 1994. - № 4. -С. 171-174.

16. Владыко A.C., Чепурнов A.A. Быстрова С.И. и др. Выявление антигена вируса Марбург методом твердофазного иммуноферментного анализа. // Вопросы вирусол. 1991. -№ 5. - С. 419-421.

17. Врублевская В.В., Мусиенко B.C., Скарга Ю.Ю., Моренков О.С. Иммунологическая характеристика гликопротеина D вируса болезни Ауески. // Вопросы вирусол. 2007. - № 3. -С. 33-37.

18. Гражданцева A.A., Кочнева Г.Н., Сиволобова Г.Ф. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. // Иммунология. 1998. - № 4. - С. 20-23.

19. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. // Новости "Вектор-Бест" № 2, 1996. http://www;vector-best.ru/publ/index.php?page=nvb

20. Гончар Н.И., Пшеничнов В.А., Походяев В.А. и др. Чувствительность к вирусу Марбург различных экспериментальных животных. // Вопросы вирусол. 1991. - № 5. - С. 435-437.

21. Громашевский B.JL, Скворцова Т.М., Никифоров Л.П., Курбанов М. Изоляция некоторых арбовирусов на территории Туркмении и Азербайджана. // Экология вирусов. Москва, 1975. Выпуск 3. С. 91-94.

22. Дадаева A.A., Сизикова Л.П., Жуков В.А., Чепурнов A.A. Динамика иммунологических показателей у морских свинок при введении различных препаратов вируса Эбола. // Вопросы вирусол. 1998, - № 4. - С.163-169.

23. Дебабов Д.В. Гетерологичная секреция в системе Escherichia coli. II Мол. Биология. -1994.-№3.-С. 496-505.

24. Деев С.М., Поляновский О.Л. Моноклональные антитела для диагностики и терапии. // Биотехнология. № 2. - 2008. - С. 3-13.

25. Доклад ВОЗ № 784. Применение синтетических антигенов для диагностики инфекционных болезней. //-Женева, 1991. Том. 1. - 235 с.

26. Дрыга С.А, Святченко В.А., Микрюкова Т.П. и др. Получение и исследование рекомбинантных штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, экспрессирующих ген preS2-S гепатита В. // Вопросы вирусол. 1996. - № 3. - С. 100-102.

27. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высшая школа, 1991. - 287 с.

28. Захарова Т.Л.,Заднова С.П., Ливанова Л.Ф. и др. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у холерных вибрионов. // Биотехнология. 2007. - № 2 - С. 88-96.

29. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики. // Вопросы вирусол. 2005. - № 3. - С. 26-32.

30. Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И. и др. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2004. -№ 8. - С. 37-39.

31. Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И. и др. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. // Сибирский медицинский журнал. 2005. - № 2. - Том 20 - С. 53-55.

32. Ивченко С.Н. Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека. // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Кольцово. 2008. -24 с.

33. Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Стрельцова М.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам. // Вопросы вирусол. 1991. - №2. - С. 421-423.

34. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Кашенцева ЕА. Индукция вирусом Марбург медиаторов иммунитета в культуре мононуклеаров человека. // Вопросы вирусол. 1998. - № 4. - С. 169-173.

35. Казачинская Е.И., Перебоев A.B., Чепурнов A.A. и др. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург. // Вопросы вирусол. 2000. - № 3. - С. 40-44.

36. Казачинская Е.И. Получение и применение моноклональных антител для изучения белков вирусов Марбург и Эбола. // Автореф. дисс. канд. наук. Кольцово. 2002. - 26 с.

37. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н. и др. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. // Вопросы вирусол. 2001. - № 5. - С. 25-31.

38. Кандрушина М.П., Гришаев М.П., Загоруйко Т.Ю. Новая иммуноферментная тест-система для дифференциальной диагностики генитального герпеса. // Новости "Вектор-Бест" № 4(34). Декабрь 2004. http://www.vector-best.ru/publ/index.php?page=nvb

39. Канев А.Н., Бондарчук В.Б., Матвеев Л.Э. и др. Получение и отбор моноклональных антител для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотках крови. // Вопросы вирусол. 2002. - № 1. - С. 15-21.

40. Качко A.B., Чеусова Т.Б., Сорокин A.B., Казачинская Е.И. и др. Сравнительное изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург. // Мол. Биология. 2001. - № 3 - С. 492-499.

41. Кизимов Н.В. Луб М.Ю., Черный Н.Б. и др. Использование иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антигена вируса Марбург. // Межведомственная конференция "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций". Кольцово, 7-8 апреля 1993. С. 54

42. Кистенева Л.Б., Мартынов К.А., Хижнякова Т.М. и др. Цитомегаловирусная инфекция у беременных. Диагностика, трактовка результатов обследования. // Вопросы вирусол. -2003,-№6.-С. 4-8.

43. Коровина Н.А, Заплатников А.Л., Чебуркин A.B. Пособие для врачей. // М: Медицина, 1999. С. 27-32.

44. Краснянский В.П., Михайлов В.В., Борисевич И.В. и др. Получение гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса Эбола. // Вопросы вирусол. 1994. - № 2. - С. 91-92.

45. Краснова Е.М., Львов Д.К., Жуков А.Н. и др. Эпидемиологический мониторинг лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. // Вопросы вирусол. 2001. - № 4 - С. 27-31.

46. Костюков М.А., Гордеева З.Е., Бухачев В.П. и др. Rana ridibunda, один из хозяев кровососущих комаров в Таджикистане, как резервуар вируса Западного Нила. // Мед. паразитол. 1985. - № 3 - С. 49-53.

47. Котелкин А.Т. Поиск и изучение иммунологических маркеров Opisthorchis Felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики опистархоза. / Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. -2000. 20 с.

48. Котов А.Н. / Культивирование клеток на микроносителях в качестве субстрата для накопления вируса Эбола. / Автореф. дисс.канд.биол.наук. Кольцово. 1996. - 30 с.

49. Кущ A.A., Климов P.P., Масалова О.В. и др. Получение и свойства моноклональных антител к высокопатогенному штамму вируса гриппа птиц A(H5N1), выделенного на территории Российской Федерации. // Вопросы вирусол. 2008. - № 5. - С. 9-14.

50. Кэтти Д. Антитела. Методы: в 2-х томах. / М.: Мир, 1991. 287 с.

51. Ларичев В.Ф., Манзенюк И.Н., Найденова Е.В. и др. ИФА и ПЦР- тест-системы, предназначенные для детекции вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. // Вопросы вирусол. 2007. - № 4 - С. 43-46.

52. Лебеденко E.H., Баландин Т.Г., Эдельвейс Э.Ф. и др. Визуализация раковых клеток с помощью флуоресцентного белка EGFP-барназа. // ДАН (Биохимия, Биофизика, Молекулярная биология). 2007. - Т. 414. - С. 408-411.

53. Леннет Э., Н.Шмидт. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. // М.: Медицина, 1974. - С. 44 - 95.

54. Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклональных антител. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. 1993. - 60 с.

55. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г.и др. Клинико-вирусологические характеристики заболевания морских свинок, аэрогенно инфицированных вирусом Марбург. //Вопросы вирусол. 1995. -№ 3. - С. 119-121.

56. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянков О.В. и др. Некоторые патогенетические характеристики заболевания обезьян, аэрогенно инфицированных вирусом Марбург. // Вопросы вирусол. 1995. -№ 4. - С. 158-161.

57. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. // М.: Медицина, 1989.-335 с.

58. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила. // Вопросы вирусол. 2000. - № 2. - С. 4-9.

59. Ляпина О. В., Громашевский В.Л., Прилипов А.Г. Организация генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 UZ) и его филогенетические взаимоотношения с представителями рода Flavivirus. // Вопросы вирусол. 2006. - № 4. - С. 35-39.

60. Макарова Н.Е., Кущ A.A., Иванова Л.А. и др. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток. // Вопросы вирусол. 1996. - № 1. - С. 28-32.

61. Макарова Н.Е. Получение моноклональных антител к цитомегаловирусу человека и их применение для изучения цитомегаловирусной инфекции. / Автореф. дисс. канд. наук. -Москва, 1995. 25 с.

62. Маренникова С.С., Жукова O.A., Нагиева Ф.Г. и др. Разработка и применение тест-систнмы ИФА для выявления и видовой идентификациивируса оспы обезьян. // Микробиология, эпидемиология, иммунобиология. 1991. - № 2. - С. 60-63.

63. Масалова О.В., Вишневская Т.В., Шкурко Т.В. и др. Сравнительный анализ соге-белка вируса гепатита С в образцах плазмы и сыворотки крови ВГС-инфицированных доноров и больных гепатитом С. // Вопросы вирусол. 2007. - № 4. - С. 11-17.

64. Мейхи Б. Вирусология. Методы. // Москва: Мир, 1988. 344 с.

65. Мелехова Н.Ю., Иванян A.M., Осадчев В.Б. и др. Лечение цитомегаловирусной инфекции. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2006. - № 3. - С. 56-59.

66. Мерзликин Н.В. Иммуноферментные тест-системы для изучения лихорадки Эбола. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. 1995. - 28 с.

67. Мерзликин Н.В., Чепурнов A.A., Истомина H.H. и др. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола. // Вопросы вирусол. -1995.-№ 1,-С. 31-35.

68. Мертвецов Н.П., Беклемишев А.Б. Савич И.М. Современные подходы "к конструированию молекулярных вакцин. // Новосибирск: Наука, 1987. 208 с.

69. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. // Вестник Российской Академии Наук. 2003. - Том. 73. - С. 412-423.

70. Морозова В.В. Получение и характеризация рекомбинатных антител человека против ортопоксвирусов. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. 2005. - 20 с.

71. Никифоров В.В., Туровской Ю.И, Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. // Микробиология. 1994. - № 3. - С. 104-110.

72. Новохатский A.C. Моноклональные антитела к антигенным детерминатнам возбудителей инфекционных заболеваний. // Итоги науки и техники, 1984. Том 17. - 139 с.

73. Онищенко Г.Г., Пальцев М.А., Зверев В.В. и др. Биологическая безопасность. // М.: Медицина, 2006. 304 с.

74. Остерман A.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. // Москва, 1981. С. 37-64.

75. Писарев В.Б., Бутенко A.M., Петров В.А. и др. Морфологические и иммунологические изменения в ткани легких, миокарда и почек при экспериментальной лихорадке Западного Нила. // Вопросы вирусол. 2005. - № 2. - С. 37-38.

76. Писарев В.Б., Львов Д.К., Смирнов A.B. и др. Морфологические изменения в продолговатом мозге мышей при экспериментальном заражении вирусом Западного Нила (штамм 986). // Вопросы вирусол. 2007. - № 3 - С. 23-25.

77. Порываева В.А, Аборнева И.В., Бормотов Н.И. и др. Получение и характеризация панели моноклональных антител, специфичных к антигенам Toxoplasma gondii. // Мол. генетика микробиология и вирусология. 2003. - № 4. - С. 20-24.

78. Походаев В.А., Гончар Н.И., Пшеничнов В.А. Экспериментальное изучение контактной передачи вируса Марбург. // Вопросы вирусол. 1991. - № 6. - С. 506-508.

79. Покровский В.И, Пак С.Г., Брико Н.И. // Инфекционные болезни и эпидемиология. / М.: Медицина, 2002. 383 с.

80. Прайс-лист "Вектор-Бест". http://www.medinst.ru/VectorBest.htm

81. Прайс-лист МБС. http://21540.ru.all-biz.info/cat.php

82. Протопопова Е.В. Поиск и выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. 1998.-26 с.

83. Плясунов И.В,, Суслопаров М.А., Суслопаров И.М. и др. Получение рекомбинантного антигена р 100 герпесвируса человека 6-го типа. // Биотехнология. 2004. - № 6 - С. 83-88.

84. Разумов И.А. Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека. // Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово. 2009. - 50 с.

85. Разумов И.А., Васильева М.А., Серова O.A. и др. Изучение нейтрализующей активности и перекрестного реагирования моноклональных антител к вирусу эктромелии с патогенными для человека ортопоксвирусами. // Вестник РАМ. 2004. - Том 8. - С. 19-22.

86. Разумов И.А., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. // Вопросы вирусол. -1998. -№ 6.-С. 274-279.

87. Распопин В.В., Разумов И.А., Казачинская Е.И. и др. Индекс авидности специфических IgG в диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. - № 4. - С. 29-32.

88. Ручко C.B., Лебедев В.Н., Пащенко Ю.И. и др. Получение и изучение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурному гликопротеину вируса Марбург. // Вопросы вирусол. 2001. - № 6. - С. 21-24.

89. Рябчикова Е.И. Морфофункциональные аспекты патогенеза филовирусных геморрагических лихорадок. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово. 1997. - 37 с.

90. Редакционная заметка. Рекомбинантные белки, синтезированные в бактериях: применение в диагностике вирусных заболеваний. // Вопросы вирусол. 1989. - № 6 - С. 765-767.

91. Ройт И. Иммунология. // М.: Мир, 2000. 581 с.

92. Ряскина С.С., Бояркин A.B., Быстревская В.Б. Экспрессия вирусных антигенов в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотропным штаммами цитомегаловируса человека. // Вопросы вирусол. 2006. - № 1. - С. 15-19.

93. Скрипченко A.A., Шестопалов A.M., Ярославцева О.Я. Сравнительное изучение взаимодействия вируса Марбург с макрофагами различных видов животных in vitro. // Вопросы вирусол. 1991. - № 6. - С. 503-506.

94. Скрипченко A.A., Рябчикова Е.И., Воронцова JI.A. и др. Вирус Марбург и мононуклеарные фагоциты: изучение взаимодействия. // Вопросы вирусол. 1994. - № 5. -С.214-218.

95. Сорокин A.B., Казачинская Е.И., Качко A.B. и др. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. // Вопросы вирусол. 1999. - № 5. - С. 206-213.

96. Стрельцова М.А. Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. 1998. - 30 с.

97. Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург. / Вопросы вирусол. 1991. - № 5. - С. 437-438.

98. Суслопаров И.М., Плясунов И.В., Сафронов П.Ф. и др. Разработка и получение рекомбинантного антигена gD вируса простого герпеса 1-го типа (HSV-1). // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001. - № 2. - С. 34-37.

99. Суслопаров И.М., Суслопаров М.А., Жукова A.B. и др. Конструирование рекомбинантного антигена gE вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая и исследование его иммунохимических свойств. // Биотехнология. 2004.- № 4. - С. 83-89.

100. Суслопаров М.А., Суслопаров И.М., Плясунов И.В. и др. Конструирование рекомбинантных антигенов вируса Эпштейна-Барра и исследование их иммунохимических свойств. // Биотехнология. 2004. - № 5. - С. 87-94.

101. Суслопаров М.А., Суслопаров И.М., Махова Н.М. и др. Исследование маркеров герпесвирусных инфекций при ишемической болезни сердца. // Молекулярная генетика и вирусология. 2005. - № 4 - С. 36-40.

102. Суслопаров И.М., Суслопаров М.А., Ивченко С.Н. и др. Конструирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловируса человека и исследование егоиммунохимических свойств. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2005. -№ 4. С. 36-40.

103. Суслопаров М.А. Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генеищеских маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека. // Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово. 2009. - 57 с.

104. Терновой В.А., Протопопова Е.В., Сурмач С.Г и др. Генотипирование вируса Западного Нила, выявленного у птиц на юге Приморского края в течение 2002-2004 гг. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006. - № 4. - С. 30-34.

105. Тишкевич О.А., Шахгильдян В.И., Морозова С.В. и др. Системный цитомегаловирусный васкулит ВИЧ-инфицированного больного. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2001. - № 1 - С. 31 -36.

106. Ш.Турьянов М.Х., Царегородцев А.Д., Лобзин Ю.В. Инфекционные болезни. / М: ГЭОТАР Медицина, 1998. 319 с.

107. Федорова В.А., Самелия З.Г., Девдариани З.Л., Шведун Г.П. Моноклональные антитела для изучения антигенов белкового происхождения для серотипирования Yersinia pseudotuberculosis. // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 2001. - № 3. - С. 28-35.

108. Федорова В.А., Адуева С.М.Б., Меджидова М.Г. Подавление цитомегаловирусной инфекции в клеточной системе аминокислотными производными фуллерена. // Вопросы вирусол. 2002. - № 1 - С. 30-34.

109. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова О.Н. и др. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей. // Вопросы вирусол. 2005. - № 1 - С. 9-14.

110. Федюк Н.В. Выявление антигенов вируса иммунодефицита человека 1- и 2-го типов. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Кольцово. 1997.-20 с.

111. Федякина И.Т., Бурцева Е.И., Исаева Е.И. и др. Получение и свойства моноклональных антител к высокопатогенному штамму вируса гриппа птиц A(H5N1), выделенного на территории Российской Федерации. // Вопросы вирусол. 2008. - № 5 - С. 9-14.

112. Фримель X. Основы иммунологии. // М.: Мир, 1986. 251 с.

113. Фримель Г. Иммунологические методы. // М.: "Медицина", 1987. 472 с.

114. Чепурнова Т.С., Писанко В.А., Бакулина Л.Ф. и др. Определение содержания вируса Марбург в крови и выделениях экспериментально инфицированных животных. // Вопросы вирусол. 2000. - № 2. - С. 18-20.

115. Чепурнов A.A., Чернухин И.В., Терновой В.А. и др. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. / Вопросы вирусол. 1995. - № 6. - С. 257-260.

116. Чепурнов A.A. Федосова Н.И, Егоричева И.Н. и др. Разработка метода экспресс-выявления антител и антигена вируса Эбола. // Вопросы вирусол. 2007. - № 3. - С. 41-43.

117. Чепурнов A.A., Кудоярова-Зубовичине Н.М., Дедкова Л.М. Разработка методов получения специфических иммуноглобулинов для экстренной профилактики лихорадки Эбола и изучение их свойств. // Вестник РАМЫ. 1998. - № 4 - С. 24-29.

118. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. // Вопросы вирусол. 1994. - № 6 - С. 254-257.

119. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Чепурнова Т.С, Воробьева М.С. Получение кроличьих антисывороток к вирусу Эбола. // Вопросы вирусол. 1994. - № 6. - С. 286-288.

120. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. -2001. -№ 1. С. 36-40.

121. Шевченко Л.А., Бичуль O.K., Мишанькин Б.Н. сАМР-связывающий белок возбудителя чумы: изучение свойств с помощью полученных к нему моноклональных антител. // Биотехнология. 1996. - № 4 - С. 42-46.

122. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А. и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Вопросы вирусол. 1998. - №2. - С. 91-95.

123. Шувалова Е.П., Антонов М.М., Беляева Т.В. и др. Тропические болезни. // М.: Медицина, 1999. 656 с.

124. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. // М.: Медицина, 1995. 543 с.

125. Эмралидзе J1.K., Ведунова C.JL, Мальцева Н.Н. и др. Иммуноферментная тест-система для выявления низкоавидных IgG-антител к цитомегаловирусу человека ("ЦМВ-диагност"). // Вопросы вирусол. 2005. - № 6. - С. 41-44.

126. Abebe М., Kumar V., Rajan S. et al. Detection of recombinant Alt al in a two-site, IgM based, sandwich ELISA opens up possibilities of developing alternative assays for the allergen. // Immunol. Methods. 2006. - Vol. 312. - № 1. - P. 111-117.

127. Acosta C., Baluja I., Amores I. et al. Monoclonal antibodies against hepatitis В s antigen: production, characterization, and use for diagnosis. // Hybridoma. 2000. - Vol. 19. - № 3. - P. 259-262.

128. Adam E., Nasz I., Lengyel A. et al. Detection of adenovirus hexon using monoclonal antibodies for antigen capture in ELISA. // Acta Microbiol Hung. 1986. - Vol. 33. № 4. - P. 317324.

129. Adams S.C., Broom A.K., Sammels L.M. et al. Glycosylation and antigenic variation among ICunjin virus isolates. // Virology. 1995. - Vol. 206. № 1. - P. 49-56.

130. Albrecht Т., Nachtigal M., St Jeor S.C. et al. Induction of cellular DNA synthesis and increased mitotic activity in Syrian hamster embryo cells abortively infected with human cytomegalovirus. // Gen Virol. 1976. - Vol. 30. - № 2. - P. 167-177.

131. Alford C.A., Pass R.F. Epidemiology of chronic congenital and perinatal infections of man. // Clin Perinatol. 1981. - Vol. 8. - № 3. - P. 397-414.

132. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F. et al. Congenital and perinatal cytomegalovirus infections. //Rev.lnfect. Dis. 1990. -Vol. 12,- №7.-P. 745-753.

133. Alvarez C.P., Lasala F., Carrillo J. et al. C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans. // Virology. 2002. - Vol. 76. - № 13. - P. 68416844.

134. Aman M., Bosio C.M., Panchal R.G. et al. Molecular mechanisms of filovirus cellular trafficking. // Microbes Infect. 2003. - Vol. 5. - № 7. - P. 639-649.

135. Anderson J.F., AndreadisT.G., Vossbrinck C.R. et al. Isolation of West Nile Virus from Mosquitoes, Crows, and a Cooper's Hawk in Connecticut. // Science. 1999. - Vol. 286 - № 5448. - P. 2331 -2333.

136. Aoyagi K., Ohue C., Iida K. et al. Development of a simple and highly sensitive enzyme immunoassay for hepatitis C virus core antigen. // Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37. - № 6. - P. 1802-1808.

137. Arilla M.C., Gonzälez-Rioja R., Ibarrola I. et al. A sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay to quantify Parietaria judaica major allergens, Par j 1 and Par j 2. // Clin Exp Allergy. 2006. - Vol. 36. - № 1. - P. 87-93.

138. Baccard-Longere M., Freymuth F., Cointe D. et al. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immunoglobulin G avidity. // Clin Diagn Lab Immunol. 2001. - Vol. 8. - № 2. - P. 429-431.

139. Baize S., Leroy E.M., Georges-Courbot M.C. et al. Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients. //Nat Med. 1999. - Vol. 5. - № 4. - P. 423-426.

140. Baize S., Leroy E.M., Mavoungou E. et al. Apoptosis in fatal Ebola infection. Does the virus toll the bell for immune system? // Apoptosis. 2000. - Vol. 5. - № 1. - P. 5-7.

141. Bakonyi T., Ivanics E., Erdelyi K. et al. Lineage 1 and 2 strains of encephalitic West Nile virus, central Europe. // Emerg Infect Dis. 2006. - Vol. 12. -№ 4. - P. 618-623.

142. Baldanti F., Lilleri D., Gerna G. Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients. // Clin Virol. -2008. -Vol. 41. № 3. - P. 237-241.

143. Ball H.J., Mackie D.P., Finlay D. et al. An antigen capture ELISA test using monoclonal antibodies for the detection of Mycoplasma californicum in milk. // Vet Immunol Immunopathol. -1990. Vol. 25. - № 3. - P. 269-278.

144. Barbi M., Binda S., Caroppo S. et al. A wider role for congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss. // Pediatr Infect Dis. 2003. - Vol. 22. - № 1. - P. 39-42.

145. Baron R.C., McCormick J.B., Zubeir O.A. Ebola virus disease in southern Sudan. Hospital dissemination and intrafamilial spread. //Bull WHO. 1983. - Vol. 61. - № 6. - P. 997-1003.

146. Baskerville A., Bowen E.T., Platt G.S. et al. The pathology of experimental Ebola virus infection in monkeys.//Pathol. 1978. -Vol. 125. -№3.~ P. 131-138.

147. Basler C.F., Wang X., Muhlberger E. et al. The Ebola virus VP35 protein function as a type I interferon antagonist. // Simposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany. 2000. Abstract. P. 17.

148. Bausch D.G., Feldmann Ii., Geisbert T.W. Outbreaks of filovirus hemorrhagic fever: time to refocus on the patient. // Infect Dis. 2007. - Vol. 196. - № 2. - P. 136-141.

149. Bavari S., Bosio C.M., Wiegand E. et al. Lipid raft microdomains: a gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. // Exp.Med. 2002. - Vol. 195. - № 5.-P. 593-602.

150. Bayer E.A., Wilchek M. The use of the avidin-biotin complex as a tool in molecular biology. // Methods Biochem.Anal. 1980. - № 26. - P. 1-45.

151. Bazin H., Malache I.M., Nisol F. et al. Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies. // Ed. H. Bazin. CRC Press, Florida. - 1990. - P. 165-201.

152. Beasley D.W., Barrett A.D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. // Virol. 2002. - Vol. 76. - № 24. - P. 13097-13100.

153. Becker S., Feldmann H., Will C. et al. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? // Med Microbiol Immunol. 1992. - Vol. 181. - № 1. - P. 43-55.

154. Becker S., Huppertz S., Klenlc H.D. et al. The nucleoprotein of Marburg virus is posphorylated. // Gen.Virol. 1994. - Vol. 75. - № 4. - P. 809-818.

155. Becker Y. Retrovirus and filovirus «immunosuppressive motif» and the evolution of virus pathogenicity in HIV-1, HIV-2, and Ebola viruses. // Virus Genes. 1995. - Vol. 11. - № 2-3. - P. 191-195.

156. Bente D.,.Gren J., Strong J.E., Feldmann H. Disease modeling for Ebola and Marburg viruses. // Dis.Model.Mech. 2009. - Vol.2. - № 1-2. - P. 12-17.

157. Bernard K.A., Maffei J.G., Jones S.A. West Nile infection in birds and mosquitoes, New York State, 2000. // Emerg.Infect.Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P. 679-685.

158. Berthet F.X., Zeller H.G., Drouet M.T. et al. Extensive nucleotide changes and deletions within the envelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses. // Gen.Virol. 1997. -Vol. 78. - № 9. - P. 2293-2297.

159. Besselaar T.G., Blackburn N.K. Antigenic analyses of West Nile virus strain using monoclonal antibodies. // Arch Virol. 1988. - Vol. 99. - № 1-2. - P. 75-88.

160. Bevan I.S., Daw R.A., Day P.J. et al. Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population. // Br. J. Hematol. 1991. - Vol. 78. - № 1. -P. 94-99.

161. Bhardwaj S., Holbrook M., Shope R.E. et al. Biophysical characterization and vector-specific antagonist activity of domain III of the tick-borne flavivirus envelope protein. // Virol. 2001. -Vol. 75. - № 8. - P. 4002-4007.

162. Biggerstaff B.J., Petersen L.R. Estimated risk of transmission of the West Nile virus through blood transfusion in the US, 2002. // Transfusion. 2003. - Vol. 43. - № 8. - P. 1007-1017.

163. Blackburn N.K., Besselaar T.G., Schoub B.D. et al. Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using the urea denaturation test for measuring antibody avidity. // Med.Virol. 1991. - Vol. 33. - № 1. - P. 6-9.

164. Boeckh M., Huang M., Ferrenberg J. et al. Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - № 3. -P. 1142-1148.

165. Boeckh M., Boivin G. Quantitation of Cytomegalovirus: Methodologic Aspects and Clinical Applications. // Clin.Microbial. reviews. 1998. - Vol. 11. - № 3. - P. 533-554.

166. Bogen S.A., Sompuram S.R. Recent trends and advances in immunodiagnostics of solid tumors. // BioDrugs. 2004. - Vol.18. - № 6. - P. 98-114.

167. Bosio C.M., Aman M.J., Grogan C. et al. Ebola and Marburg viruses replicate in monocyte-derived dendritic cells without inducing the production of cytokines and full maturation. // Infect. Dis.-2003. Vol. 188. -№ 11.-P. 1630-1638.

168. Bowen R.A., Nemeth N.M. Experimental infections with West Nile virus. // Curr.Opin.Infect.Dis. 2007. - Vol. 20. - № 3. - P. 293-297.

169. Bowen E.T., Lloyd G., Plarris W.J. et al. Viral haemorrhagic Fever in southern Sudan and northern Zaire. Preliminary studies on the aetiological agent. / Lancet. 1977. - Vol. 1. - № 8011. -P. 571-573.

170. Bray M., Hatfill S., Hensley L. et al. Haematological, biochemical and coagulation changes in mice, guinea-pigs and monkeys infected with a mouse-adapted variant of Ebola Zaire virus. // Comp.Pathol. 2001. - Vol. 125. - № 4. - P. 243-253.

171. Briese T., Jia X.Y., Huang C. et al. Identification of Kunji/West-Nile-like flavivirus in brains of patients with New York encephalitis. // Lancet. 1999. - Vol. 354. - № 9186 - P. 1261-1262.

172. Brinton MA. Host factors involved in West Nile virus replication. // Ann N Y Acad Sei. -2001. -№951.-P. 207-219.

173. Britt W.J., Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology. 1996. - Vol. 39.-№ 5-6.-P. 401-412.

174. Britton W.J., Hellqvist L., Garsia R.J. et al. Dominant cell wall proteins of Mycobacterium leprae recognized by monoclonal antibodies. // Clin.Exp.Immunol. 1987. - Vol. 67. - № 1. - 3142.

175. Browne E.P., Shenk T. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc Natl Acad Sei USA. 2003. - Vol. 100. - № 20. -P. 11439-11444.

176. Bukreyev A.A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. / Naturwissenschaften. 1999. - № 86. - P. 8-17.

177. Bukreyev A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M. et al. The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. Homology between Mar burg and Ebola viruses. // FEBS Lett. 1993. - Vol. 322. -№ l.-P. 41-46.

178. Bukreyev A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M. et al. The complete nucleotide sequence of the Popp (1967) strain of Marburg virus: a comparison with the Musoke (1980) strain. // Arch Virol. -1995. Vol. 140. -№9.-P. 1589-1600.

179. Bukreyev A.A., Rollin P.E., Tate M.K. et al. Successful topical respiratory tract immunization of primates against Ebola virus. // Virol. 2007. - Vol. 81. - № 12. - P. 6379-6388.

180. Burke D.S., Monath T.P. // Filds Virology, 4th Ed. Philadelphia. 2001. Eds Knipe D.M., Howley P.M.

181. Bunning M.L., Bowen R.A., Cropp C.B. et al. Experimental infection of horses with West Nile virus. // Emerg.Infect.Dis. 2002. - Vol. 8. - № 4. - P. 380-386.

182. Burkhalter K.L., Lindsay R., Anderson R. et al. Evaluation of commercial assays for detecting West Nile virus antigen. //Am Mosq.Control. Assoc. 2006. - Vol. 22. - № I. - P. 6469.

183. Bussow K., Cahill D., Nietfeld W. et al. A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed Cdna Library. // Nucleic Acids Res. -1998. Vol. 26. - № 21. - P. 5007-5008.

184. Butler J.E., Peterman J.H., Suter M. et al. The immunochemistry of solid-phase sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. / Fed Proc. 1987. - Vol. 46. - № 8. - P. 2548-2556.

185. Caceda E.R., Kochel T.J. / Application of modified shell vial culture procedure for arbovirus detection. // PLoS One. 2007. - Vol. 2. - № 10. - P. el034.

186. Cammack N., Gould E.A. Antigenic analysis of yellow fever virus glycoproteins: use of monoclonal antibodies in enzyme-linked'immunosorbent assays. // Virol Methods. 1986. - Vol. 13.-№ 2.-P. 135-142.

187. Cano- H., Candela M.J., Lozano M.L. et al. Application of a new enzyme-linked immunosorbent assay for detection of total hepatitis C virus core antigen in blood donors. // Transfus. Med. 2003. - Vol. 13. - № 5. - P. 259-266.

188. CDC report. USA, Atlanta. 1999. - Vol.48. - P. 944-955.

189. CDC report. Update: detection of West Nile virus in blood donations. USA, Atlanta. 2003. Vol. 52. - P. 916-919.

190. CDC report. West Nile virus activity USA, Atlanta. - January 1 - December 31, 2005. -Vol. 54.-P. 1253-1256.

191. CDC report. Update: outbreak of Ebola viral hemorrhagic fever Zaire, 1995. / Morb Mortal Wkly Rep. 1995. - Vol. 44. - P. 468-475.

192. Cervino C., Weber E., ICnopp D. et al. Comparison of hybridoma screening methods for the efficient detection of high-affinity hapten-specific monoclonal antibodies. // Immunol. Methods. -2008.-Vol. 329.-№ 1-2.-P. 184-193.

193. Ceccaldi P.E., Lucas M., Despres P. New insights on the neuropathology of West Nile virus. // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - Vol. 233. - № 1. - P. 1-6.

194. Chan S.Y., Speck R.F., Goldsmith M.A. Distinct mechanisms of entry by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. // Virol. 2000. - Vol. 74. - № 10. - P. 4933-4937.

195. Chang G.J., Kuno G., Purdy D.E. et al. Recent advancement in flavivirus vaccine development. // Expert Rev Vaccines. 2004. - Vol. 3. - № 2. - P. 199-220.

196. Chanteau S., Rasolofo V., Rasolonavalona T. et al. 45/47 kilodalton (APA) antigen capture and antibody detection assays for the diagnosis of tuberculosis. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis, -2000. Vol. 4. - № 4. - P. 377-383.

197. Chappell K.J., Stoermer M.J., Fairlie D.P. et al. West Nile Virus NS2B/NS3 protease as an antiviral target. // Curr. Med. Chem. 2008. - Vol. 15. - № 27. - P. 2771-2784.

198. Chee M.S., Bankier A.T., Beck S., et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. // Curr Top Microbiol Immunol. 1990. - № 154.-P. 125-169.

199. Chen D.H., Jiang H., Lee M., et al. Three-dimensional visualization of tegument/capsid interactions in the intact human cytomegalovirus. // Virology. — 1999. Vol. 260. - № 1. — P. 1016.

200. Chen C.C., Li W.Y., Zhang C.J. et al. Preparation and characterization of a monoclonal antibody against human SOCS3. // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2007. - Vol. 27. - № 11. -P. 1778-1780.

201. Chen W.J. Serological and virological diagnosis for dengue infection. // Gaoxiong Yi Xue Ke Xue ZaZhi. 1989. - Vol. 5. - № l.-P. 66-71.

202. Chen Z.C., Yang J.J., Liu R. et al. Preparation and identification of monoclonal antibody against Homo sapiens hemoglobin alpha 2 (HBA2). // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. -2007. Vol. 15. -№4.-P. 823-826.

203. Chiao D.J., Wey J.J., Tang S.S. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for detection of botulinum neurotoxin type A. // Hybridoma. 2008. - Vol. 27. - № 1. - 43-47.

204. Chou S. Acquisition of donor strains of cytomegalovirus by renal-transplant recipients. // N Engl J. Med. 1986. - Vol. 314. -№22. - P. 1418-1423.

205. Chu J.H., Chiang C.C., Ng M.L. Immunization of flavivirus West Nile recombinant envelope domain III protein induced specific immune response and protection against West Nile virus infection. // Immunol. 2007. - Vol. 178. - № 5. - P. 2699-2705.

206. Chu J.J., Rajamanonmani R., Li J. et al. Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain III from the envelope glycoprotein. // Gen Virol. 2005. - Vol. 86. - № 2. -P. 405-412.

207. Chu J.J., Ng M.L. Interaction of West Nile virus with alpha v beta 3 integrin mediates virus entry into cells. // Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - № 52. P. 54533-54541.

208. Chua K.B. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for early diagnosis of acute dengue virus infection. // Singapore Med J. 2007. - Vol. 48. - № 7. -P. 669-673.

209. Chua K.E., Ramos J.D., Cheong N. Production of monoclonal antibody by DNA immunization with electroporation. // Methods Mol Biol. 2008. - № 423. - P. 509-520.

210. Chung K.M., Liszewski M.K., Nybakken G. et al. West Nile virus nonstructural protein NS1 inhibits complement activation by binding the regulatory protein factor H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - Vol. 103. -№50. - P. 19111-19116.

211. Clayton A.L., Albert Z.I., Chantler S.M. The selection and performance of monoclonal and polyclonal anti-respiratory syncytial virus (RS) antibodies in capture ELISAs for antigen detection. // Virol Methods. 1987. - Vol. 17. - № 3-4. - P. 247-261.

212. Collins J.K., Butcher A.C., Teramoto Y.A. et al. Rapid detection of bovine herpesvirus type 1 antigens in nasal swab specimens with an antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. // Clin Microbiol. 1985. - Vol. 21. - № 3. - P. 375-380.

213. Collins J.K., Ayers V.K., Carman J. Evaluation of an antigen-capture ELISA for the detection of bovine herpesvirus type 1 shedding from feedlot cattle. // Vet. Microbiol. 1988. -Vol. 16.-№ 2.-P. 101-107.

214. Connolly B.M., Steele K.E., Davis K.J. et al. Pathogenesis of experimental Ebola virus infection in guinea pigs.//J. Infect. Dis. 1999.-Vol. 179.- № 1. - P. 203-217.

215. Cornel A.J., Jupp P.G., Blackburn N.K. Environmental temperature on the vector competence of Culex univittatus (Diptera: Culicidae) for West Nile virus. // Med Entomol. -1993. Vol. 30. - № 2. -P. 449-456.

216. Kovacs A.A., Churchill M.A., Wood D., Mascola L., Zaia J.A. Molecular and epidemiologic evaluations of a cluster of cases of Menetrier's disease associated with cytomegalovirus. // Pediatr Infect Dis J. 1993. - Vol. 12. - № 12. - P. 1011-1014.

217. Craighead J.E., Kanich R.E., Almeida J.D. Nonviral microbodies with viral antigenicity produced in cytomegalovirus-infected cells. // Virol. 1972. - Vol. 10. - № 4. - P. 766-775.

218. Cretich M., Damin F., Pirri G. et al. Protein and peptide arrays: Recent trends and new directions. // Biomolecular Engineering. 2006. - Vol. 23. — P. 77-88.

219. Crouch C.F., Raybould T.J., Acres S.D. Monoclonal antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine enteric coronavirus. // Clin. Microbiol. 1984. -Vol. 19. -№ 3. — P. 388-393.

220. Cui X., Meza B.P., Adler S.P. et al. Cytomegalovirus vaccines fail to induce epithelial entry neutralizing antibodies comparable to natural infection. // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - № 45. -5760-6.

221. Czerny C.P., Meyer H., Mahnel H. Establishment of an ELISA for the detection of orthopox viruses based on neutralizing monoclonal and polyclonal antibodies. // Zentralbl Veterinarmed B. 1989. - Vol. 36. - № 7. - P. 537-546.

222. Czerny C.P., Eichhorn W. Characterization of monoclonal and polyclonal antibodies to bovine enteric coronavirus: establishment of an efficient ELISA for antigen detection in feces. // Vet. Microbiol. 1989.-Vol. 20.-№2.-P. 111-122.

223. Czerny C.P., Mahnel H. Structural and functional analysis of orthopoxvirus epitopes with neutralizing monoclonal antibodies. // Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - № 10. - P. 2341-2352.

224. Czerny C.P., Johann S., Holzle L. et al. Epitope detection in the envelope of intracellular naked orthopox viruses and identification of encoding genes. // Virology. 1994. - Vol. 200. - № 2.-P. 764-777.

225. Czerny C.P., Wagner K., Gessler K. et al. A monoclonal blocking-ELISA for detection of orthopoxvirus antibodies in feline sera. // Vet. Microbiol. 1996. - Vol. 52. - № 3-4. - P. 185-200.

226. Czerny C.P., Waldmann R., Biittner M. Recent developments in the diagnosis of parapoxviruses. // Tierarztl Prax. 1994. - Vol. 22. - № 3. - P. 230-233.

227. Darman J., Backovic S., Dike S. et al. Viral-induced spinal motor neuron death is non-cell-autonomous and involves glutamate excitotoxicity. // Neurosci. 2004. - Vol. 24. - № 34. - P. 7566-7575.

228. Despres P., Dietrich J., Girard M. et al. Recombinant baculoviruses expressing yellow fever virus E and NS1 proteins elicit protective immunity in mice. // Gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - № 11.-P. 2811-2816.

229. Dessen A, Volchkov V, Dolnilc O et al. Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus. // EMBO. 2000. - Vol. 19. - № 16. - P. 4228-4236.

230. Deyev S.M., Polanovsky O.L. Expression of chimeric immunoglobulin genes in mammalian cells. // Methods Mol. Boil. 1995. - № 51. - P. 251-263.

231. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N. et al. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. //Nat Biotechnol. 2003. - Vol. 21. - № 12. - P. 1486-1492.

232. Dhinakar R.G., Sivakumar S., Matheswaran K. et al. Detection of egg drop syndrome virus antigen or genome by enzyme-linked immunosorbent assay or polymerase chain reaction. // Avian Pathol. 2003. - Vol. 32. - № 5. - P. 545-550.

233. Diamond M.S., Shrestha B., Mehlhop E. et al. Innate and adaptive immune responses determine protection against disseminated infection by West Nile encephalitis virus. // Viral. Immunol. 2003. - Vol. 16. - № 3. - P. 259-278.

234. Distefano A.L., Alonso A., Martin F. et al. Human cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. // BMC Pediatr. 2004. - 10.1186/1471-2431. - P. 4-11.

235. Dmitriev D.A., Massino Y.S., Segal O.L. Kinetic analysis of interactions between bispecific monoclonal antibodies and immobilized antigens using a resonant mirror biosensor. // Immunol. Methods. 2003. - Vol. 280. - № 1-2. - P. 183-202.

236. Doljak B., Obermajer N., Jamnik P. et al. Monoclonal antibody to cytokeratin VKIALEVEIATY sequence motif reduces plasminogen activation in breast tumour cells. // Cancer Lett. 2008. - Vol. 267. - № 1. - P. 75-84.

237. Domen R.E., Nelson K. A. Results of a survey of infectious disease testing practices by organ procurement organizations in the United States. // Transplantation. 1997. - Vol. 63. - № 12. - P. 1790-1794.

238. Du Clos T.W., Rubin R.L., Tan E.M. Monoclonal antibody for DNA measurement in biological fluids. // Immunol Methods. 1986. - Vol. 88. - № 2. - P. 185-192.

239. Duan T., Wang X.F., Xiao S.Y. et al. Recombinant human IgG antibodies against human cytomegalovirus. // Biomed Environ Sci. 2008. - Vol. 21. - № 5. - P. 372-380.

240. Eckert D., Kim P. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. // Annu Rev Biochem. -2001. -№70.-P. 777-810.

241. Edmondson M.A., Givens M.D., Walz P.H. et al. Comparison of tests for detection of bovine viral diarrhea virus in diagnostic samples. // Vet Diagn Invest. 2007. - Vol. 19. - № 4. — P. 376381.

242. Egbe-Nwiyi T.N , Antia R.E. Use of monoclonal antibodies for detecting T brucei brucei infection in splenectomised dogs. // Small Anim Pract. 1995. - Vol. 36. - № 5. - P. 229-232.

243. Ellis A.E., Mead D.G., Allison A.B. et al. Pathology and epidemiology of natural West Nile viral infection of raptors in Georgia. // Wildl Dis. 2007. - Vol. 43. - № 2. - 214-223.

244. Ellis D.S., Simpson I.H., Francis D.P. et al. Ultrastructure of Ebola virus particles in human liver. // Clin. Pathol. 1978. - Vol. 31. - № 3. - P. 201-208.

245. Elliott L.H., Kiley M.P., McCormick J.B. Descriptive analysis of Ebola virus protein. // Virology. 1985.-Vol. 147. -№ 1. - P. 169-176.

246. Elliott L.H., McCormick J.B., Johnson K.M. Inactivation of Lassa, Marburg, and Ebola viruses by gamma irradiation. // Clin Microbiol. 1982. - Vol. 16. - № 4. - P. 704-708.

247. Enders G., Knotek F. Rubella IgG total antibody avidity and IgG subclass-specific antibody avidity assay and their role in the differentiation between primary rubella and rubella reinfection. // Infection. 1989. - Vol. 17. - № 4. - P. 218-226.

248. Fanquet C. Taxonomy and classification. // General. Encyclopedia of Virology. 1994. / EdsWebster RG, Granoff A. - London. - Vol. 3. - P. 1396-1410.

249. Feinstein S., Akov Y., Lachmi B.E. et al. Determination of human IgG and IgM class antibodies to West Nile virus by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). // Med Virol. -1985. Vol. 17. -№ l.-P. 63-72.

250. Feldmann H., Killey M. Classification, structure, and replication of filoviruses. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - № 235. - P. 1-21.

251. Feldmann H., Will C., Schikore M. et al. Glycosylation and oligomcrization of the spike protein of Marburg virus. //Virology. 1991. - Vol. 182. -№ l.-P. 353-356.

252. Feldmann Ii., Nichol S.T., Klenk H.D. et al. Characterization of filoviruses based on differences in structure and antigenicity of the virion glycoprotein. // Virology. 1994. - Vol. 199: №2.-P. 469-473.

253. Feldmann H., Slenczka W., Klenk H.D. Emerging and reemerging of filoviruses. // Arch. Virol. Supp. 1996.-№ 11.-P. 77-100.

254. Feldmann H., Feldmann H., Klenk H.-D. Molecular biology and evolution of filoviruses. // Arch. Virol. 1993. - Vol. 7 (suppl):81-100.

255. Feng X., Xu R., Gao Y. et al. Generation and identification of natural monoclonal antibodies against low-density lipoprotein. // Hybridoma. 2008. - Vol. 27. - № 1. - P. 54-58.

256. Fenner B.J., Du Q., Goh W. et al. Detection of betanodavirus in juvenile barramundi, Lates calcarifer (Bloch), by antigen capture ELISA. // Fish Dis. 2006. - Vol. 29. - № 7. - P. 423-432.

257. Fisher H.S., Platt G.S., Neild G.H. et al. Simpson DI. Pathophysiology of shockand hemorrhage in a fulminating viral infection (Ebola). // Infect Dis. 1985. - Vol. 152. - № 5. - P. 887-894.

258. Fisher Hoch H.S., Brammer T.L., Trappier S.G. et al. Pathogenic potential of filoviruses: role of geographic origin of primate host and virus strain. // Infect. Dis. - 1992. — Vol. 166. - № 4. - 753-763.

259. Flatau E., Kohn D., Daher O. et al. Nile fever encephalitis. // Israel Med. Sei. 1981. - Vol. 17. -№ 11.-P. 1057-1063.

260. Fonseca B.A., Pincus S., Shope R.E. et al. Recombinant vaccinia viruses co-expressing dengue-1 glycoproteins prM and E induce neutralizing antibodies in mice. // Vaccine. 1994. -Vol. 12. -№3.-P. 279-285.

261. Fortunato E.A., Spector D.H. Regulation of human cytomegalovirus gene expression. // Adv. Virus Res. 1999. - № 54. - P. 61-128.

262. Frank R. The SPOT- synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports -principles and applications. // Immunol. Meth. 2002. - Vol. 267. - № 1. - P. 13-26.

263. Francisci D., Tosti A., Baldelli F. et al. The pp65 antigenaemia test as a predictor of cytomegalovirus-induced end-organ disease in patients with AIDS. // AIDS. 1997. - Vol. 11. -№ 11.-P. 1341-1345.

264. Fujita S., Hashimoto T. Detection of serum Candida antigens by enzyme-linked immunosorbent assay and a latex agglutination test with anti-Candida albicans and anti-Candida krusei antibodies. // Clin Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 12. - P. 3132-3137.

265. Funaro A., Gribaudo G., Luganini A. et al. Generation of potent neutralizing human monoclonal antibodies against cytomegalovirus infection from immune В cells. // BMC Biotechnol. 2008. - 10.1186/1472-6750-8-85.

266. Gach J.S., Quendler H., Weik R. et al. Partial humanization and characterization of an antiidiotypic antibody against monoclonal antibody 2F5, a potential HIV vaccine? // AIDS Res Hum Retroviruses. 2007. - Vol. 23. -№ 11.-P. 1405-1415.

267. Gao Q., Tharavanij S., Khusmith S. et al. Two-site pan-species monoclonal antibody ELISA for detection of blood stage malaria antigen. // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1992. -Vol. 23. -№4.-P. 740-744.

268. Garcia-Tapia D., Loiacono C.M., Kleiboeker S.B. Replication of West Nile virus in equine peripheral blood mononuclear cells. // Vet. Immunol Immunopathol. 2006. - Vol. 110. - № 3-4. - P. 229-244.

269. Gassmann C., Bauer G. Avidity determination of IgG directed against tick-borne encephalitis virus improves detection of current infections. // Med Virol. 1997. - Vol. 51. - № 3. -P. 242-251.

270. Gavrovic-Jankulovie M., Spasic M., Cirkovic Velickovic T. et al. Quantification of the thaumatin-like kiwi allergen by a monoclonal antibody-based ELISA. // Мої Nutr Food Res. .2008. Vol. 52. - № 6. - P. 701-707.

271. Gaytant M.A., Steegers E.A., Semmekrot B.A. et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome. // Obstet. Gynecol. Surv. 2002. - Vol. 57. - № 4. - P. 245-256.

272. Gea-Banacloche J., Johnson R.T., Bagic A. et al. West Nile virus: pathogenesis and therapeutic options. // Ann Intern Med. 2004. - Vol. 140. - № 7. - P. 545-553.

273. Gear J.H. Hemorrhagic fevers, with special reference to recent outbreaks in southern Africa. //Rev. Infect. Dis. 1979.-Vol. l.-№4.-P. 571-591.

274. Gefter M.L., Margulies D.H., Scharff M.D. A simple method for polyethylene glycol promoted hybridization of mouse myeloma cells. // Somat Cell Genet. 1977. - Vol. 3. - № 2. - P. 231-236.

275. Geibert T.W., Jahrling P.B. Differentiation of filoviruses by electron microscopy. // Virus Res. 1995. - Vol. 39. -№2-3.-P. 129-150.

276. Geisbert T.W., Hensley L.E., Larsen T. et al. Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques: evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection. // Am J. Pathol. 2003. - Vol. 163. - № 6. - P. 2347-2370.

277. Geisbert T.W., Daddario-Dicaprio K.M., Lewis M.G. et al. Vesicular stomatitis virus-based ebola vaccine is well-tolerated and protects immunocompromised nonhuman primates. // PLoS Pathog. 2008. - Vol. 4. - № 11. - el000225.

278. George S., Lesbordes J.L., Georges-Gourbot M. Fatal hepatitis from West Nile virus. // Ann. Inst.Pasteur Virol. 1987. - Vol.138. - P. 237-244.

279. Georges-Courbot M.C., Lu C.Y., Lansoud-Soukate J. et al. Isolation and partial molecular characterisation of a strain of Ebola virus during a recent epidemic of viral haemorrhagic fever in Gabon. // Lancet. 1997. - Vol. 349. - № 9046. - P. 181-184.

280. Gibson W. Structural and nonstructural proteins of strain Colburn cytomegalovirus. // Virology. -1981.- Vol. 111. № 2. - P. 516-537.

281. Gibson W. Structure and assembly of the virion. // Intervirology. 1996. - Vol. 39. - № 5-6. -P. 389-400.

282. Gleaves C.A, Hursh D.A., Meyers J.D. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by centrifugation culture with a nonhuman cell line. // Clin Microbiol. 1992. - Vol. 30.-№4.-P. 1045-1048.

283. Glinka E.M., Edelweiss E.F., Deyev S.M. Eukaryotic expression vectors and immunoconjugates for cancer therapy. // Biochemistry (Mosc). 2006. - Vol. 71. - № 6. - P. -597-606.

284. Gomes-Solecki M.J., Savitt A.G., Rowehl R. et al. LcrV capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Yersinia pestis from human samples. // Clin Diagn Lab Immunol. 2005. - Vol. 12. - № 2. - P. 339-346.

285. Gonzalez JP, Nakoune E, Slenczka W et al. Ebola and Marburg virus antibody prevalence in selected populations of the Central African Republic. // Microbes Infect. 2000. - Vol. 2. - № 1. -P. 39-44.

286. Gould E.A., Buckley A., Higgs S. et al. Antigenicity of flaviviruses. // Arch. Virol. 1990. -Suppl. 1. - P. 137-152.

287. Gould L.Ii., Sui J., Foellmer H. et al. Protective and therapeutic capacity of human single-chain Fv-Fc fusion proteins against West Nile virus. // Virol. 2005. - Vol. 79. - № 23. - P. 14606-14613.

288. Greiser-Wilke I.M., Moennig V., Kaaden O.R. et al. Detection of alphaviruses in a genus-specific antigen capture enzyme immunoassay using monoclonal antibodies. // Clin Microbiol. -1991,-Vol. 29.-№ l.-P. 131-137.

289. Gretch D.R., Kari B., Rasmussen L. et al. Identification and characterization of three distinct families of glycoprotein complexes in the envelopes of human cytomegalovirus. // Virol. 1988. -Vol. 62. -№3.-P. 875-881.

290. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis. // Antiviral. Res. 2003. -Vol. 57. -№ 1-2.-P. 129-146.

291. Godhardt J.A., Beheler K., O'Connor M.J. et al. Evaluation of antigen-capture ELISA and innunohistochemical methods for avian surveillance of West Nile virus. // Vet. Diann. Invest. -2006. Vol. 18. -№ l.-P. 85-89.

292. Guarner J., Shieh W.J., Hunter S. et al. Clinicopathologic study and laboratory diagnosis of 23 cases with West Nile virus encephalomyelitis. // Hum. Pathol. 2004. - Vol. 35. - № 8. - P. 983-990.

293. Gupta Y., Joshi Y.K., Tandon B.N. An enzyme-linked immunoassay for the possible detection of non-A, non-B viral antigen in patients with epidemic viral hepatitis. // Liver. 1988. -Vol. 8. - № 2. — P. 111-115.

294. Haas R., Maas I., Muller I. et al. Marburg virus disease. // Berlin. 1971. - P.136-143.

295. Hall R.A., Khromykh A.A. West Nile virus vaccines. // Expert Opin Biol. Ther. 2004. -Vol. 4. -№ 8.-P. 1295-1305.

296. Hall R.A., Burgess G.W., Kay B.H. et al. Monoclonal antibodies to Kunjin and Kokobera viruses. // Immunol Cell Biol. 1991. - Vol. 69. - № 1. - P. - 47-49.

297. Hayes C.G., Burans J.P., Ksiazek T.G. et al. Outbreak of fatal illness amoug captive macaques in the Pilippines caused by an Ebola-related filovirus. // Am J. Trop Med Hyg. 1992. -Vol. 46. -№6.-P. 664-671.

298. Harris E., Holden K.L., Edgil-D. et al. Molecular biology of flaviviruses. //Novartis Found Symp. 2006. - № 277. - P. 23-39.

299. Harrington T., Kuehnert M.J., Kamel H. et al. West Nile virus infection transmitted by blood transfusion. // Transfusion. 2003. - Vol. 43. - № 8. - P. 1018-1022.

300. Hartlieb B., Muziol T., Weissenhorn W., Becker S. Crystal structure of the C-terminal domain of Ebola virus VP30 reveals a role in transcription and nucleocapsid association. // Proc Natl Acad Sei USA. 2007. - Vol. 104. - № 2. - P. 624-629.

301. Hartlieb B., Muziol T., Weissenhorn W. et al. Crystal structure of the C-terminal domain of Ebola virus VP30 reveals a role in transcription and nucleocapsid association. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. - Vol. 104. - № 2. - P. 624-629.

302. Hayes E.B., Sejvar J.J., Zalci S.R. et al. Virology, Pathology and clinical manifestations of West Nile virus disease. // Emerging Infections Diseases. 2005. - Vol. 11. - № 8. - P. 1-8.

303. Hayes C.G. West Nile fever. The Arboviruses: Epidemiology and Ecology. // Ed. Monath TP. Boca Raton. - 1989. - Vol. 5. - P. 59-69.

304. Heinz F.X., Colltt N.S., Purcell R.H. et al. Virus taxonomy; 7th International Committee for Taxonomy of viruses. // Eds. Regenmortel MH et al. SanDiego. 2000. - P. 859-878.

305. He Q., Velumani S., Du Q. et al. Detection of H5 avian influenza viruses by antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay using H5-specific monoclonal antibody. // Clin Vaccine Immunol. 2007. - Vol. 14. - № 5. - P. 617-623.

306. Heller M., Berthold E., Pfutzner H. et al. Antigen capture ELISA using a monoclonal antibody for the detection of Mycoplasma bovis in milk. // Vet. Microbiol. 1993. - Vol. 37. - № 1-2.-P. 127-133.

307. Heo S.A., Nannapaneni R., Story R.P. et al. Characterization of new hybridoma clones producing monoclonal antibodies reactive against both live and heat-killed Listeria monocytogenes. // Food Sci. 2007. - Vol. 72. - № 1. - P. 8-15.

308. Herzog D.P. Emerging trends in lab automation and instrumentation. // IVDT. 2006. - № 5. -P. 44-47.

309. Hevey M., Negley D., Geisbert J. et al. Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein. // Virology. 1997. - Vol. 239. - № 1. - P. 206-216.

310. Hevey M., Negley D., Schmaljohn A. Characterization of monoclonal antibodies to Marburg virus (strain Musoke) glycoprotein and identification of two protective epitopes. // Virology.2003. Vol. 314. - № 1. - P. 350-357.

311. Ho M. Cytomegalovirus: Biology and Infection, 2nd ed. //New York: Plenum. 1991.

312. Holzmann H., Vorobyova M.S., Ladyzhenskaya I.P. et al. Molecular epidemiology of tickborne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. // Vaccine. 1992. - Vol. 10. - № 5. - P. 345-349.

313. Hoogenboom H.R. Selecting and screening recombinant antibody libraries. // Nat Biotechnol. 2005. - Vol. 23. - № 9. - P. 1105-1116.

314. Holliger P., Hudson P.J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. // Nat Biotechnol. 2005. - Vol. 23. - № 9. - P. 1126-1136.

315. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of viral proteins. // Virol. 1974. - Vol. 14. - № 1. - P. 8-19.

316. Horacek J., Brucek P., Otova B. Detection of nuclear cytomegalovirus antigen in cell culture as compared to classical virus isolation. // Acta Virol. 1991. - Vol. 35. - № 2. - P. 187-189.

317. Hljzanek I., Dostalova V., Korec E. et al. Monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen: production and characterization. // Folia Biol (Praha). 1986. - Vol. 32. - № 3. - P. 167177.

318. Huang Y., Xu L., Sun Y. et al. The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein. // Mol Cell. -2002. Vol. 10. -№2.-P. 307-316.

319. Hundekar S.L., Thakare J.P., Gokhale M.D. et al. Development of monoclonal antibody based antigen capture ELISA to detect chikungunya virus antigen in mosquitoes. // Indian J. Med Res. 2002. - № 115. - P. 144-148.

320. Hunt A.F., Allen D.L., Brown R.L. et al. Comparative trial of six methods for the detection of CMV antibody in blood donors. // Clin Pathol. 1984. - Vol. 37. - № 1. - 95-97.

321. Hunt A.R., Hall R.A., Kerst A.J. et al. Detection of West Nile virus antigen in mosquitoes and avian tissues by a monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay. // Clin Microbiol. 2002. - Vol. 40. - № 6. - P. 2023-2030.

322. Ichihashi Y., Takahashi T., Oie M. Identification of a vaccinia virus penetration protein. // Virology. 1994. - Vol. 202. - № 2. - P. 834-843.

323. Ichihashi Y., Oie M. Epitope mosaic on the surface proteins of orthopoxviruses. // Virology. 1988.-Vol. 163. -№1. -P. 133-144.

324. Igarashi A, Tanaka M, Morita K et al. Detection of west Nile and Japanese encephalitis viral genome sequences in cerebrospinal fluid from acute encephalitis cases in Karachi, Pakistan. // Microbiol Immunol. 1994. - Vol. 38. - № 10. - P. 827-830.

325. Ignat'ev G.M., Agafonov A.P., Strelsova M.A. et al. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys. // Biotechnology. 1996. - № 44. - P. 111118.

326. Ikegami T., Niikura M., Saijo M. et al. Antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of Reston Ebola virus nucleoprotein. // Clin Diagn Lab Immunol. — 2003. -Vol. 10.-№ 4.-P. 552-557.

327. Ilkal M.A., Prasanna Y., Jacob P.G. et al. Experimental studies on the susceptibility of domestic pigs to West Nile virus followed by Japanese encephalitis virus infection and vice versa. //Acta Virol. 1994. - Vol. 38. -№3.-P. 157-161.

328. Inouye S., Hasegawa A., Matsuno S. et al. Changes in antibody avidity after virus infections: detection by an immunosorbent assay in which a mild protein-denaturing agent is employed. // Clin Microbiol. 1984. - Vol. 20. - № 3. - P. 525-529.

329. Ito H., Watanabe S., Talcada A. et al. Ebola virus glycoprotein: proteolytic processing, acylation, cell tropism, and detection of neutralizing antibodies. // Virol. 2001. - Vol. 75. - № 3. -P. 1576-1580.

330. Jahan M., Nabassum S., Islam M.N. Comparison of CMV pp65 antigen and IgM antibody detection for early recognition of CMV primary infection and reactivation. // Mymensing Med J. -2008.-Vol. 17.-№ 1,-P. 28-31.

331. Jährling P.B., Geisbert T.W., Jaax N.K. et al. Experimental infection of cynomolgus macaques with Ebola-Reston filoviruses from the 1989-1990 epizootic. // Arch Virol Suppl. -1996. № 11.-P. 115-134.

332. Jährling P.B., Geisbert T.W., Geisbert J.B. et al. Evaluation of immune globulin and recombinant interferon-alpha 2b for treatment of experimental Ebola virus infections. // Infect Dis. 1999. - Vol. 179. - № 1. - P. 224-234.

333. Jährling P.B., Geisbert T.W., Dalgard D.W. et al. Preliminary report: Isolation of Ebola virus from monkeys imported to USA. // Lancet. 1990. - № 335. - P. 502-505.

334. Jasenosky L.D., Neumann G., Lukashevich I. et al. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer. // Virol. 2001. - Vol. 75. - № 11. - P. 52055214.

335. Jones T.C. The value of animal models. // Am J. Pathol. 1980. - Vol. 101. - № 3. - P. 3-9.

336. Johann S., Czerny C.P. A rapid antigen capture ELISA for the detection of orthopox viruses. // Zentralbl Veterinarmed B. 1993. - Vol. 40. - № 8. - P. 569-581.

337. Johnson E., Jaax N., White J. et al. Lethal experimental infection of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. // Int J. Exp Pathol. 1995. - Vol. 76. - № 4. - P. 227-236.

338. Johnson K.M., Lange J.V., Webb P.A. et al. Isolation and partial characterisation of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. // Lancet. 1977. - № 1. - P. 569-571.

339. Johnson E.D., Johnson B.K., Silverstein D. et al. Characterization of new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya.//Arch Virol Suppl. 1996.-№ 11.-P. 101-114.

340. Johnson B.K., Lange J.V., Webb P.A. et al. Isolation and partial characterization of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. // Lancet. 1977. -№ 1. - P. 569-571.

341. Johnson R., Bell P., Harty R.N. Effect of Ebola virus proteins GP, NP and VP35 on VP40 VLP morphology. //Virol. 2006. - 10.1186/1743-422X-3-31.

342. Johnson R., McCarthy S.E., Godlewski P.J., Harty R.N. Ebola virus VP35-VP40 interaction is sufficient for packaging 3E-5E minigenome RNA into virus-like particles. // Virol. 2006. -Vol. 80. -№ 11.-P. 5135-5144.

343. Joshi A.M., Walimbe A.M., Banerjee K. Potency testing of inactivated tissue culture vaccine against Japanese encephalitis using antigen capture ELISA. // Acta Virol. 1997. - Vol. 41. - № 3. -P. 157-159.

344. Jupp P.G., Mcintosh B.M. Quantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) pipiens fatigans Wiedemann with West Nile and Sindbis viruses. // Med Entomol. 1970. -Vol. 7.-№3.-P. 353-356.

345. Juronen E.I., Viikmaa M.H., Mikelsaar A.V. Rapid, simple and sensitive antigen capture ELISA for the quantitation of myoglobin using monoclonal antibodies. // Immunol Methods. -1988.-Vol. 111. № 1. — P. 109-115.

346. Kaistrom G., Warfield K.L., Swenson D.L. et al. Analysis of Ebola virus and VLP release using an immunocapture assay. // Virological Methods. 2005. - Vol. 127. - № 1. - P. 1-9.

347. Kapoor H., Signs K., Somsel P. et al. Persistence of West Nile Virus (WNV) IgM antibodies in cerebrospinal fluid from patients with CNS disease. // Clin Virol. 2004. - Vol. 31. - № 4. - P. 289-291.

348. Karabatsos N. International Catalogue of Arboviruses including Certain other viruses of Vertebrates. // San-Antonio, 1985.

349. Kari В., Goertz R., Gehrz R. Characterization of cytomegalovirus glycoproteins in a family of complexes designated gC-II with murine monoclonal antibodies. // Arch Virol. 1990. - Vol. 112.-№ 1-2.-P. 55-65.

350. Kartalov E.P. High-throughput multi-antigen microfluidic fluorescence immunoassays. // BioTechnique. 2006. - Vol. 40. - № 1. - P. 85-90.

351. Kawasaki E., Eisenbarth G.S. High-throughput radioassays for autoantibodies to recombinant autoantigens. // Frontiers in Bioscience. 2000. - Vol. 5. - P. 181-190.

352. Kenny G.E., Dunsmoor C.L. Principles, problems, and strategies in the use of antigenic mixtures for the enzyme-linked immunosorbent assay. // Clin Microbiol. 1983. - Vol. 17. - № 4. -P. 655-665.

353. Kennett R.H., McKearn T.G., Bechtol K.B. Monoclonal antibodies hybridomas: a new dimension in biological analyses. // M.: Медицина, 1983. Перевод с англ. под редакцией Петрова Р.В. 416 с.

354. Kerr S., Ball H.J., Mackie D.P. et al. Diagnostic application of monoclonal antibodies to outer membrane protein for rapid detection of Salmonella. // Appl Bacteriol. 1992. - Vol. 72. -№4.-P. 302-308.

355. Kido K., Edakuni K., Morinaga O. et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for aconitine-type alkaloids using an anti-aconitine monoclonal antibody. // Anal Chim Acta. 2008. -Vol. 616.-№ l.-P. 109-114.

356. Kiley M.P., Cox N.J., Elliot L.H. et al. Physicochemical properties of Marburg virus: evidence for three virus strains and their relationship to Ebola virus. // Gen Virol. 1988. - Vol. 69. -№ 8.-P. 1557-1567.

357. Kiley M.P., Bowen E.T., Eddy G.A. et al. Filoviridae: taxonomic home for Marburg and Ebola viruses? // Intervirology. 1982. - Vol. 18. - № 1-2. - P. 24-32.

358. Kimura-Kuroda J., Yasui K. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. // Gen Virol. 1986. -Vol. 67. - № 12. - P. 2663-2672.

359. Kitamoto N., Kobayashi Т., Kato Y. et al. Preparation of monoclonal antibodies cross-reactive with orthopoxviruses and their application for direct immunofluorescence test. // Microbiol Immunol. -2005. Vol. 49. - № 3. - P. 219-225.

360. Kitamoto N., Goto E., Tanimoto S. et al. Cross-reactivity between cowpox and vaccinia viruses with monoclonal antibodies. Brief report. // Arch Virol. 1984. - Vol. 82. - № 1-2. - P. 129-136.

361. Kitamoto N., Tanimoto S., Hiroi K. et al. Polypeptide analysis with monoclonal antibodies of A type inclusion bodies induced by cowpox virus. // Arch Virol. 1986. - Vol. 89. - № 1-4. - P. 15-28.

362. Kitamoto N., Tanimoto S., Hiroi K. et al. Monoclonal antibodies to cowpox virus: polypeptide analysis of several major antigens. // Gen Virol. 1987. - Vol. 68. - № 1. - P. 239246.

363. Knowles D.P. Jr, Gorham J.R. Advances in the diagnosis of some parasitic diseases by monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assays. // Rev Sci Tech. 1993. - Vol. 12. №2. - P. 425-433.

364. Kramer L.D., Bernard K.A. West Nile virus infection in birds and mammals. // Ann N Y Acad Sci. -2001. -№951.-P. 84-93.

365. Krishhan V.V., Khan I.H., Luciw P.A. Multiplexed microbead immunoassays by flow cytometry for molecular profiling: Basic concepts and proteomics applications. // Crit Rev Biotechnol. 2009. - Vol. 29. - № 1. - P. 29-43.

366. Ksiazek T.G., West C.P., Rollin P.E. et al. ELISA for the detection of antibodies to Ebola viruses. // Infect Dis. 1999. - Vol. 179. - № 1. - P. 192-198.

367. Ksiazek T.G., Rollin P.E., Jahring P.B. et al. Enzyme immunosorbent assay for Ebola virus in tissues og infected primates. // Clinical Microbiology. 1992. - Vol. 30. - № 4. - P. 947-950.

368. Kodihalli S., Sivanandan V., Nagaraja K.V. et al. Antigen-capture enzyme immunoassay for detection of avian influenza virus in turkeys. // Am J. Vet Res. 1993. - Vol. 54. - № 9. - P. 13851390.

369. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975. - P. 256, 495.

370. Komar N., Langevin S., Hinten S. et al. Experimental infection of North American birds with the New York 1999 strain of West Nile virus. // Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9. - № 3. -P. 311-322.

371. Koprowski H., Gerhard W., Croce C.M. Production of antibodies against influenza virus by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells. // Proc Natl Acad Sei USA. 1977. - Vol. 74. - № 7. - P. 2985-2988.

372. Kovacs A.A., Churchill M.A., Wood D. et al. Molecular and epidemiologic evaluations of a cluster of cases of Menetrier's disease associated with cytomegalovirus. // Pediatr Infect Dis J. -1993. Vol. 12. -№ 12. - P. 1011-1014.

373. Kumar S., Tuteja U., Batra H.V. Generation and characterization of murine monoclonal antibodies to genus-specific 31-kilodalton recombinant cell surface protein of Brucella abortus. // Hybridoma. 2007. - Vol. 26. - № 4. - P. 211-216.

374. Kumar A., Singh S., Salhan S. et al. Evaluation of a developed species-specific monoclonal antibody for detecting Chlamydia trachomatis infections in endocervical specimens from female patients. // Hybridoma. 2007. - Vol. 26. - № 5. - P. 333-337.

375. Kumarasamy V., Chua S.K., Hassan Z. et al. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for early diagnosis of acute dengue virus infection. // Singapore Med J. 2007. - Vol. 48. - № 7. - P. 669-673.

376. Kimura-Kuroda J., Yasui K. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. // Gen Virol. 1986. - Vol. 67. - № 12. - P. 2663-2672.

377. Kuno G., Gubler D.J. et al. Santiago de Weil N.S. Antigen capture ELISA for the identification of dengue viruses. // Virol Methods. 1985. - Vol. 12. - № 1-2. - P. 93-103.

378. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya ICR. Phylogeny of genus Flavivirus. // Virol. 1998. - Vol. 72. -№ l.-P. 73-83.

379. Kuzuhara T., Kise D., Shirakawa Y. et al. Generation of mouse monoclonal antibody against (-)-epigallocatechin gallate. // Biol Pharm Bull. 2008. - Vol. 31. - № 5. - P. 816-819.

380. Lai C.F., Gong S.C., Esteban M. The purified 14-kilodalton envelope protein of vaccinia virus produced in Escherichia coli induces virus immunity in animals. // Virol. 1991. - Vol. 65. -№ 10. - P. 5631-5635.

381. Landry M.L., Ferguson D. Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia assay with culture methods and correlation with clinical disease. // Clin Microbiol. 1993. - Vol. 31. -№ 11.-P. 2851-2856.

382. Landolfo S., Gariglio M., Gribaudo G. et al. The human cytomegalovirus. // Pharmacol Ther. 2003. - Vol. 98. - № 3. p. 269-297.

383. Lazzarotto T., Ripalti A., Bergamini G. et al. Development of a New Cytomegalovirus (CMV) Immunoglobulin M (IgM) Immunoblot for Detection of CMV-Specific IgM. // Clin Microbiol. Nov. 1998.-Vol. 36.-№ 11. -P. 3337-3341.

384. Lazzarotto T., Varani S., Guerra B. et al. Prenatal indicators of congenital cytomegalovirus infection. // Pediatr. 2000. - Vol. 137. - № 1. - P. 90-95.

385. Le Guenno B., Formenty P., Wyers M. et al. Isolation and partial characterisation of a new strain of Ebola virus. //Lancet. 1995. - Vol. 345. -№ 8960.-P. 1271-1274.

386. Leake C.J., Ussery M.A., Nisalak A. et al. Virus isolations from mosquitoes collected during the 1982 Japanese encephalitis epidemic in northern Thailand. // Trans R Soc Trop Med Hyg. -1986. Vol. 80. - № 5. - P. 831-837.

387. Lee J.Y., Irmiere A., Gibson W. Primate cytomegalovirus assembly: Evidence that DNA packaging occurs subsequent to B capsid assembly. // Virology. — 1988. № 167. - P. 87-96.

388. Lee D.H., Mathew J., Pfahler W. et al. Individual donor nucleic acid amplification testing for detection of West Nile virus. // Clin Microbiol. 2005. - Vol. 43. - № 10. - P. 5111-5116.

389. Lee B.W., Bey R.F., Baarsch M.J. et al. ELISA method for detection ofinfluenza A infection in swine. // Vet Diagn Invest. 1993. - Vol. 5. - № 4. - P. 510-515.

390. LeGoff J., Mayaud P., Gresenguet G. et al. ANRS 12-12 Study Group. Performance of HerpeSelect and Kalon assays in detection of antibodies to herpes simplex virus type 2. // Clin Microbiol. 2008. - Vol. 46. - № 6. - P. 1914-1918.

391. Lechtzier V., Hutoran M., Levy T. et al. Sodium dodecyl sulphate treated proteins as ligands in ELISA. // Immunol. Meth. - 2002. - Vol. 270. - № 1. - P. 19-26.

392. Leis A.A., Stokic D.S. Neuromuscular Manifestations of Human West Nile Virus Infection. // Curr Treat Options Neurol. 2005. - Vol. 7. - № 1. - P. 15-22.

393. Leroy E.M., Epelboin A., Mondonge V. et al. Human ebola outbreak resulting from direct exposure to fruit bats in luebo, democratic republic of congo, 2007. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2009. - Vol. 9. - № 6. - P. 723-728.

394. Li Y.Q., Yang J., Zhang L. et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against M2 protein of avian influenza virus. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2008. -Vol. 24. -№5.-P. 475-478.

395. Li L., Barrett A.D., Beasley D.W. Differential expression of domain III neutralizing epitopes on the envelope proteins of West Nile virus strains. // Virology. 2005. - Vol. 335. - № 1. - P. 99105.

396. Li F.Q., Yang A.L., Miao J.W. et al. Preparation and characterization of the monoclonal antibody against human sperm protein 17. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2006. -Vol. 22. -№5.-P. 638-640.

397. Li Y., Ning Y.S., Wang Y.D. et al. Prodaction of mouse monoclonal antibodies against Helicobacter pylori Catalase and mapping the antigenic epitope by phage display library. // Vaccine. 2007. - Vol. 26. - № 9. - P. 1263-1269.

398. Licata J., Johnson R.F., Han Z. et al. Contribution of ebola virus glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles. // Virol. 2004. - Vol. 78. - № 14. - P. 73447351.

399. Lieberman M.M., Clements D.E., Ogata S. et al. Preparation and immunogenic properties of a recombinant West Nile subunit vaccine. // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - № 3. - P. 414-423.

400. Liu M.K., Pearson T.W. Detection of circulating trypanosomal antigens by double antibody ELISA using antibodies to procyclic trypanosomes. // Parasitology. 1987. - Vol. 95. - № 2. - P. 277-290.

401. Liu W., Wang Y.T., Tian D.S. et al. Detection of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp by means of monoclonal antibodies (MAbs) specific to an envelope protein (28 kDa). // Dis Aquat Organ. 2002. - Vol. 49. - № 1. - p. 11-18.

402. Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V. et al. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death. // Cell. -1996. Vol. 87. - № 3. - P. 565-576.

403. Lim P.K., Mak J.W., Yong H.S. Detection of circulating plasmodial antigens in human sera by sandwich ELISA with monoclonal antibodies. // Southeast Asian J. Trop Med Public Health. -1992. Vol. 23. - № 4. - P. 735-739.

404. Lotfering B., Modrof J., Moritz C. et al. Phosphorylation of Marburg virus structural proteins. // Symposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany. 2000. Abstract. P. 9.

405. Lu Z., Roche M.I., Hui J.H. et al. Generation and characterization of hybridoma antibodies for immunotherapy of tularemia. // Immunol Lett. 2007. - Vol. 112. - № 2. - P. 92-103.

406. Lucht A., Formenty P., Feldmann H. et al. et al. Development of an immunofiltration-based antigen-detection assay for rapid diagnosis of Ebola virus infection. // Infect Dis. 2007. - Vol. 196. - №2.-P. 184-192.

407. Lucht A., Otterbein C., Moller P. et al. Prodution of monoclonal antibodies to Ebola-Zaire virus. // Symposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany 2000. 1-4 October. - P. 5.

408. Luch A., Grunov R., Moller P. et al. Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus. // Virological Methods. 2003. - № 111. - P. 21-28.

409. Luch A., Grunov R., Otterbein C. et al. Production of monoclonal antibolies and development of an antigen capture ELISA directed against envelope glycoprotein GP of Ebola virus. // Med Microbiol Immunol. 2004. - № 193. - P. 181-187.

410. Lupton H.W., Lambert R.D., Bumgardner D.L. et al. Inactivated vaccine for Ebola virus efficacious in guinea pig model. // Lancet. 1980. - № 2. - P. 1294-1295.

411. Mackay A.J., Roy A., Yates M.M. et al. West Nile virus detection in mosquitoes in East Baton Rouge Parish, Louisiana, from November 2002 to oktober 2004. // Am Mosq Control Assoc. 2007. - Vol. 24. - № 1. - P. 28-35.

412. Maleewong W., Intapan P.M., Wongkham C. et al. Detection of Paragonimus heterotremus in experimentally infected cat feces by antigen capture-ELISA and by DNA hybridization. / Parasitol. 1997. - Vol. 83. - № 6. - P. 1075-1078.

413. Malinger G., Lev D., Zahalka N. et al. Fetal cytomegalovirus infection of the brain: the spectrum of sonographic findings. // AJNR Am J. Neuroradiol. 2003. - Vol. 24. - № 1. - P. 2832.

414. Marennikova S.S., Nagieva F.G., Matsevich G.R. et al. Monoclonal antibodies to monkey pox virus: preparation and application. // Acta Virol. 1988. - Vol. 32. - № 1. - P. 19-26.

415. Marsh S., Kaplan M., Asano Y. et al. Development and application of IiIiV-6 antigen capture assay for the detection of HHV-6 infections. // Virol Methods. 1996. - Vol. 61. - № 1-2. -P. 103-112.

416. Martin D.A., Biggerstaff B.J., Allen B. et al. Use of immunoglobulin m cross-reactions in differential diagnosis of human flaviviral encephalitis infections in the United States. // Clin Diagn Lab Immunol. 2002. - Vol. 9. - № 3. - P. 544-549.

417. Martin D.A., Muth D.A., Brown T. et al. Standardization of immunoglobulin M capture enzyme-linked immunosorbent assays for routine diagnosis of arboviral infections. // J. Clin Microbiol. 2000. - Vol. 38.-№5. p. 1823-1826.

418. Maruyama T., Rodriguez L.L., Jahrling P.B. et al. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. // Virology. 1999. - Vol. 73. - №7. - P. 60246030.

419. Mason PW, Shustov AV, Frolov I. Production and characterization of vaccines based on flaviviruses defective in replication. // Virology. 2006. - Vol. 351. - № 2. - P. 432-443.

420. Mathiot C.C., Georges A.J., Deubel V. Comparative analysis of West Nile virus strains isolated from human and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles. // Res Virol. 1990. - Vol. 141. - № 5. - P. 533-543.

421. Matheus S., Deparis X., Labeau B. et al. Discrimination between primary and secondary dengue virus infection by an immunoglobulin G avidity test using a single acute-phase serum sample. // Clin Microbiol. 2005. - Vol. 43. - № 6. - P. 2793-2797.

422. McCormick J.K., Bauer S.P., Elliott L.H. et al. Biologic Differences between strains of Ebola virus from Zaire and Sudan. // Infect Dis. 1983. - Vol. 147. - № 2. - P. 264-267.

423. McGavran M.H., Smith M.G. Ultrastructural, cytochemical, and microchemical observations on cytomegalovirus (salivary gland virus) infection of human cells in tissue culture. // Exp Mol Pathol. 1965. -№76.-P. 1-10.

424. McKeating J.A., Stagno S., Stirk P.R. et al. Detection of cytomegalovirus in urine samples by enzyme-linked immunosorbent assay. // Med Virol. 1985. - Vol. 16. - № 4. - P. 367-373.

425. Meijer E., Boland G.J., Verdonck L.F. Prevention of cytomegalovirus disease in recipients of allogeneic stem cell transplants. // Clin Microbiol Rev. 2003. - Vol. 16. - № 4. - P. 647-657.

426. Meng S., Li X., Yin H., Li D.F. Establishment of detection test for hepatitis C virus antigen. // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. -2001,- Vol. 15. № 3. - P. 287-290.

427. Meyer J.D., Ljungman P., Fisher L.D. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. // Infect Dis. 1990. - Vol. 162. - P. 373-380.

428. Meyer H., Osterrieder N., Czerny C.P. Identification of binding sites for neutralizing monoclonal antibodies on the 14-kDa fusion protein of orthopox viruses. // Virology. 1994. -Vol. 200. -№2.-P. 778-783.

429. Mi J.B., Yan J., Ding X.J. et al, Production and characterization of monoclonal antibody against recombinant human erythropoietin. // Biomed Environ Sci. 2007. - Vol. 20. - № 3. - P. 84-88.

430. Minke J.M., Siger L., Karaca K. et al. Recombinant canarypoxvirus vaccine carrying the prM/E genes of West Nile virus protects horses against a West Nile virus-mosquito challenge. // Arch Virol Suppl. 2004. - № 18. - P. 221-230.

431. Miranda M.E., Ksiazek T.G., Retuya T.J. et al. Epidemiology of Ebola (subtype Reston) virus in the Philippines, 1996.//Infect Dis. 1999.-Vol. 179.- № l.-P. 115-119.

432. Mitchel SW, McCormick J.B. Phisicochemical inactivation of Lassa, Ebola and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses. // Clin Microbiol. 1984. - Vol. 20. - № 3. - P. 486-489.

433. Moi M.L., Lim C.K., Takasaki T., Kurane I. Involvement of the Fc{gamma} receptor IIA cytoplasmic domain in antibody dependent enhancement of dengue virus infection. // Gen Virol. — 2009,- Vol. 91.-№ l.-P. 103-111.

434. Mocarski E., Courcelle C.T. Cytomegalovirus and their replication. // In* book: Fields Virology Ed. by Knipe D, Howley P. -2001. P. 2629-2673.

435. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication. // In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman B, Whitley RJ, Lopez C. New York. 1993. - P. 173-226.

436. Mocarski E.S., Liu A.C., Spaete R.R. Structure and variability of the a sequence in the genome of human cytomegalovirus (Towne strain). // Gen Virol. 1987. - № 8. - P. 2223-2230.

437. Mocarski E.S. Cytomegalovirus biology and replication. In: Roizman B, Whitley R, Lopez C, eds. The Human Herpesviruses. // New York: Raven Press. 1993. - P. 173-226.

438. Monath T Prospects for development of a vaccine against the West Nile virus. // Ann N Y Acad Sci. -2001. -№951.-P. 1-12.

439. Monath T.P. Ecology of Marburg and Ebola viruses: speculations and direction for future research. // Infect Dis. 1999. - № 179. - P. 127-138.

440. Monath T.P., Nystrom R.R. Detection of yellow fever virus in serum by enzyme immunoaasay. //Am J. Trop Med Hyg. 1984.-Vol. 33.-№l.-P. 151-157.

441. Monath T.P., Tsai T.F. Flaviviruses. / Clinical Virology. Eds.Richman DD et al. New York. 1977.- P. 1133-1186.

442. Mourton C., Bearzotti M., Piechaczyk M. et al. Antigen-capture ELISA for viral haemorrhagic septicaemia virus serotype I. // Virol Methods. 1990. - Vol. 29. - № 3. - P. 325333.

443. Moore J.P., Sattentau Q.J., Clapham P.R. Enhancement of soluble CD4-mediated HIV neutralization and gp 120 binding by CD4 autoantibodies and monoclonal antibodies. // AIDS Res Hum Retroviruses. 1990.-Vol. 6.-№ ll.-P. 1273-1279.

444. Moore J.P., McCutchan F.E., Poon S.W. et al. Exploration of antigenic variation in gpl20 from clades A through F of human immunodeficiency virus type 1 by using monoclonal antibodies. // Virol. 1994. - Vol. 68. - № 12. - P. 8350-8364.

445. Morens D.M., Larsen L.K., Halstead S.B. Study of the distribution of antibody dependent enhancement determinants on dengue 2 isolates using dengue 2-derived monoclonal antibodies. // Med Virol. 1987. - Vol. 22. -№2.-P. 163-167.

446. Morrey J.D., Taro B.S., Siddharthan V. et al. Efficacy of orally administered T-705 pyrazine analog on lethal West Nile infection in rodents. // Antiviral Res. 2008. - Vol. 80. - № 3. - P. 377-379.

447. Morvan J., Besselaar T., Fontenille D. et al. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978.//Res Virol. 1990.-Vol. 141. -№ 6. - P. 667-676.

448. Mourton C., Romestand B., de Kinkelin P. et al. Highly sensitive immunoassay for direct diagnosis of viral hemorrhagic septicemia which uses antinucleocapsid monoclonal antibodies. // Clin Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 9. - P. 2338-2345.

449. Mulvaney S.P., Cole C.L., Kniller M.D. et al. Rapid, femtomolar bioassays in complex matrices combining microfluidics and magnetoelectronics. // Biosens Bioelectron. 2007. - Vol. 23. -№2.-P. 191-200.

450. Murphy F.A., van der Groen G., Whitfield S.G. et al. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy. In: Pattyn SR (ed) Ebola virus haemorrhagic fever. // Elsevier North-Holland. -1978. -Amsterdam. P. 61-68.

451. Murphy F.A., Simpson D.I., Whitfield S.G. et al. Marburg virus infection in monkeys. Ultrastructural studies. // Lab Invest. 1971. - Vol. 24. - № 4. - P. 279-291.

452. Nasci R.S., White D.J., Stirling H. et al. West Nile virus isolates from mosquitoes in New York and New Jersey, 1999. // Emerg Infect Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P. 626-630.

453. Ndayimirije N., Kindhauser M.K. Marburg hemorrhagic fever in Angola—fighting fear and a lethal pathogen. //N Engl J. Med. -2005. Vol. 352.-№ 21. - P. 2155-2157.

454. Nemeth N., Gould D., Bowen R. et al. Natural and experimental West Nile virus infection in five raptor species. // Wildl Dis. 2006. - Vol. 42. - № 1. - P. 1-13.

455. Nichols B.J., Kenworthy A.K., Polishchuk R.S. et al. Rapid cycling of lipid rait markers between the cell surface and Golgi complex. // Cell Biol. 2001. - Vol. 153. - № 3. - P. 529-541.

456. Niikura M., Ikegami T., Saijo M. et al. Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. // Clinical Microbiol. -2001. Vol. 39. - № 9. - P. 3267-3271.

457. Nigro G., Krzysztofiak A., Gattinara G. Rapid progression of HIV disease in children with cytomegalovirus DNAemia. // AIDS. 1996. - Vol. 10. - № 10. - P. 1127-1133.

458. Nikulina V.A., Kizim E.A., Massino Y.S. et al. Synergistic effects in antigen capture ELISA using three monoclonal antibodies directed at different epitopes of the same antigen. // Clin Chim Acta. 2000. - Vol. 299. - № 1-2. - P. 25-44.

459. Ning B.F., Zhu H.M., Zhou X. et al. Prokaryotic expression, purification of prM of JEV and preparation of monoclonal antibody. // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. -2008. Vol. 22. - № 1. - P. 65-67.

460. Nissinen A.E., Makela S.M., Vuoristo J.T. et al. Immunological detection of in vitro formed phosphatidylethanol~an alcohol biomarker-with monoclonal antibodies. // Alcohol Clin Exp Res. 2008. - Vol. 32. - № 6. - P. 921-928.

461. Noda T., Sagara H, Suzuki E et al. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP. // Virol. 2002. - Vol. 76. - № 10. - P. 4855-4865.

462. Noda T., Watanabe S., Sagara H. et al. Mapping of the VP40-binding regions of the nucleoprotein of Ebola virus. // Virol. 2007. - Vol. 81. - № 7. - P. 3554-3562.

463. Novotny J., Rigoutsos I., Coleman D. et al. In silico structural and functional analysis of the human cytomegalovirus (HIIV5) genome. // Mol Biol. 2001. - Vol. 310. - № 5. - P. 1151-1166.

464. Nybakken G.E., Oliphant T., Johnson S. et al. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody. //Nature. 2005. - Vol. 437. - № 7059. - P. 764-769.

465. Obert G., Beyer C. An enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies for the detection of respiratory syncytial virus in clinical specimens. // Arch Virol. — 1988. Vol. 100. -№ 1-2.-P. 7-49.

466. Oh W.K., Song J. Hsp70 functions as a negative regulator of West Nile virus capsid protein through direct interaction. // Biochem Biophys Res Commun. 2006. - Vol. 347. - № 4. - P. 9941000.

467. Oie M., Ichihashi Y. Modification of vaccinia virus penetration proteins analyzed by monoclonal antibodies. // Virology. 1987. - Vol. 157. - № 2. - P. 449-459.

468. Omidfar K., Kashanian S., Paknejad M. et al. Production and characterization of monoclonal antibody against human serum albumin. // Hybridoma. 2007. - Vol. 26. - № 4. - P. 217-222.

469. Okware S.I., Omaswa F.G., Zaramba S. et al. An outbreak of Ebola in Uganda. // Trop Med Int Health. 2002. - Vol. 7. -№ 12.-P. 1068-1075.

470. Onyango C.O., Opolca M.L., Ksiazek T.G. et al. Laboratory diagnosis of Ebola hemorrhagic fever during an outbreak in Yambio, Sudan, 2004. // Infect Dis. 2007. - Vol. 196. - № 2. - P. 193-198.

471. Oladepo D.K., Klapper P.E., Marsden H.S. Peptide based enzyme-linked immunoassays for detection of anti-HSV-2 IgG in human sera. // Virol Methods. 2000. - Vol. 87. - № 1-2. - P. 6370.

472. Oliphant T., Engle M., Nybakken G.E. et al. Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. // Nat Med. 2005. - Vol. 11. - № 5. -P. 522-530.

473. Pantier R., Hannoun C., Dudar J. et al. Isolation of the West Nile virus in a Camargue horse stricken with encephalomyelitis. // Press med. 1966. - Vol. 74. - P. 2495.

474. Parida M., Posadas G., Inoue S. et al. Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. // Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42. -№ l.-P. 257-263.

475. Pass R.F., Britt W.J., Stagno S. Cytomegalovirus. // In: Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET, eds. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. Washington, DC: APHA. 1995. - P. 253-271.

476. Pattyn S., van der Groen G., Courteille G. et al. Isolation of Marburg-like virus from a case of haemorrhagic fever in Zaire. // Lancet. 1977. № l.-P. 573-574.

477. Pawlotsky J.M. Use and interpretation of hepatitis C virus diagnostic assays. // Clin Liver Dis. -2003. -№ 7.-P. 27-37.

478. Peiris J.S.M., Amerasighe F.P. West Nile frver. // Handbook of Zoonoses. 1994. Ed. Beran J. Boca Raton, Sect B. - P. 139-148.

479. Peiris J.S., Porterfield J.S., Roehrig J.T. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. // Gen Virol. 1982. - Vol. 58. - № 2. - P. 283-289.

480. Pereboev A., Borisevich V., Tsuladzea G., et al., Kazachinskaia E. et al. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. // Antivirol Research. 2008. - Vol. 77. - № l.-P. 6-13.

481. Perelman A., Stern J. Acute pancreatitis in West Nile Fever. // Am J. Trop Med Hyg. 1974. -Vol. 23.-№6.-P. 1150-1152.

482. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E. et al. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // Fields Virology. 1996.-Vol. 39. - P. 1161-1176.

483. Petersen L.R., Roehrig J.T. West Nile virus: a reemerging global pathogen. // Emerg Infect Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P. 611-614.

484. Phelan M.L., Nock S. Generation of bioreagents for protein chips. // Proteomics. 2003. -Vol. 3.-№ 11.-P. 2123-2134.

485. Pletnev A.G., Karganova G.G., Dzhivanyan T.I. et al. Chimeric Langat/Dengue viruses protect mice from heterologous challenge with the highly virulent strains of tick-borne encephalitis virus. // Virology. 2000. - Vol. 274. - № 1. - P. 26-31.

486. Plummer G. Cytomegaloviruses of man and animals. // Prog Med Virol. 1973. - № 15. - P. 92-125.

487. Popow-Kraupp T., Kunz C. Detection of cytomegalovirus in clinical specimens by virus isolation and by a monoclonal antibody against the early nuclear antigen. // Med Virol. 1988. -Vol. 24. -№3. -P. 275-282.

488. Porterfield J.S. Encephalitis viruses and related viruses causing hemorrhagic disease. // Encyclopedia of Virology. 1994. Eds Webster RG, Granoff A. - Vol. 1. - P. 361-367.

489. Prehaud C., Hellebrand E., Coudrier D.et al. Recombinant Ebola virus nucleoprotein and glycoprotein (Gabon 94 strain) provide new tools for the detection of human infections. // Gen Virol. 1998. Vol. 79. - № 11. - P. 2565-2572.

490. Pringle Cr. The order Mononegavirales. // Arch Virol. 1991. - № 117. - P. 137-140.

491. Pujol F.H., Rodriguez I., Liprandi F. Production and characterization of monoclonal antibodies directed against the hepatitis B surface antigen. // Acta Cient Venez. 1992. - Vol. 43. - № 4. - P. 235-239.

492. Pujol F.H., Rodriguez I, Devesa M et al. A double sandwich monoclonal enzyme immunoassay for detection of hepatitis B surface antigen. // Immunoassay. 1993. - Vol. 14. - № 1-2.-P. 21-31.

493. Pupo-Antunez M., Rodriguez R., Alvarez M. et al. Development of a monoclonal antibody specific to a recombinant envelope protein from dengue virus type 4 expressed in Pichia pastoris. //Hybridoma.-2001. Vol. 20. - № l.-P. 35-41.

494. Rao R.S., Visuri S.R., McBride M.T. et al. Comparison of multiplexed techniques for detection of bacterial and viral proteins. // Proteome Res. 2004. - Vol. 3. - № 4. - P. 736-742.

495. Razonable R.R. Cytomegalovirus infection after liver transplantation: current concepts and challenges. // World J. Gastroenterol. 2008. - Vol. 14. - № 31. - P. 4849-4860.

496. Razumov I.A., Kazachinskaia E.I., Ternovoi V.A. et al. Neutralizing monoclonal antibodies aganst Russian strain of the West Nile virus. // Viral Immunology. 2005. - Vol. 18. - № 3. - P. 558-568.

497. Rawlinson W.D., Zeng F., Farrell H.E. et al. The murine cytomegalovirus (MCMV) homolog of the HCMV phosphotransferase (UL97(pk)) gene. // Virology. 1997. - Vol. 233. - № 2.-P. 358-363.

498. Reap E.A., Morris J., Dryga S.A. et al. Development and preclinical evaluation- of an alphavirus replicon particle vaccine for cytomegalovirus. // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - № 42. -P. 7441-7449.

499. Regnery R.L., Johnson K.M., Kiley M.P. Virion nucleic acid of Ebola virus. // Virol. 1980. - № 36. - P. 465-469.

500. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C. et al. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. // Nature. 1995. - Vol. 375. - № 6529. - P. 291-298.

501. Revello M.G., Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus, and newborn infant. // Clin Microbiol Rev. 2002. - Vol. 15. - № 4. - P. 680715.

502. Rios M., Daniel S., Dayton A.I. et al. In vitro evaluation of the protective role of human antibodies to West Nile virus (WNV) produced during natural WNV infection. // Infect Dis. -2008. Vol. 198. № 9. - P. 1300-1308.

503. Rios M., Zhang M.J., Grinev A. et al. Monocytes-macrophages are a potential target in human infection with West Nile virus through blood transfusion. // Transfusion. 2006. - Vol. 46. -№4. - P. 659-667.

504. Robertson W.R., Lambert A., Loveridge N. The role of modern bioassays in clinical endocrinology. / Clinical Endocrinology. 1987. - Vol. 27. - № 2. - P. 259-278.

505. Roizman B., Carmichael L.E., Deinhardt F. et al. Herpesviridae. Definition, provisional nomenclature, and taxonomy. The Herpesvirus Study Group, the International Committee on Taxonomy of Viruses. // Intervirology. 1981. - № 16. - P. 201-217.

506. Roehring J., Mathews J., Trent D. Identification of epitopes on the glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies. // Virology. 1983. - Vol. 128. - № 1. - P. 118-126.

507. Roehrig J.T., Nash D., Maldin B. et al. Persistence of virus-reactive serum immunoglobulin m antibody in confirmed west nile virus encephalitis cases. // Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9. -№ 3. - P. 376-379.

508. Roizman B., Sear A.E. Herpes simplex viruses and their replication. // In book: Virology, Ed. by Fielda BN, Knipe DM, Chanock RM E et al. // New York. 1990. - P. 1795-1841.

509. Rondini S., Pingle M.R., Das S. et al. Development of multiplex PCR-ligase detection reaction assay for detection of West Nile virus. // Clin Microbiol. 2008. - Vol. 46. - № 7. - P. 2269-2279.

510. Rodrigues JA, Höfling JF, Azevedo RA et al. Production of monoclonal antibodies for detection of a secreted aspartyl proteinase from Candida spp. in biologic specimens. // I-Iybridoma. 2007. - Vol. 26. - № 4. - P. 201-210.

511. Ryabchikova E., Strelets L., Kolesnikova L. et al. Respiratory Marburg virus infection in guinea pigs. // Arch Virol. 1996. - Vol. 141. - № 11. - P. 2177-2190.

512. Roehrig J.T., Nash D., Maldin B. et al. Persistence of virus-reactive serum immunoglobulin m antibody in confirmed west nile virus encephalitis cases. // Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9. -№ 3. - P. 376-379.

513. Sagedal S., Nordal K.P., Hartmann A. et al. A prospective study of the natural course of cytomegalovirus infection and disease in renal allograft recipients. // Transplantation. 2000. -Vol. 70. № 8.-P. 1166-1174.

514. Saijo M., Niikura M., Maeda A. et al. Characterization of monoclonal antibodies to Marburg virus nucleoprotein (NP) that can be used for NP-capture enzyme linked immunosorbent assay. //Med Virol. - 2005. - Vol. 76.-№ 1.-P. 111-118.

515. Saijo M., Ogino T., Taguchi F. et al. Recombinant nucleocapsid protein-based IgG enzyme-linked immunosorbent assay for the serological diagnosis of SARS. // Virol Methods. 2005. -Vol. 125. -№2.-P. 181-186.

516. Saij o M., Tang Q., Shimayi B. et al. Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of crimean-congo hemorrhagic fever using a novel monoclonal antibody. // Med Virol. 2005. - Vol. 77. - № 1. - P. 83-88.

517. Saijo M, Niikura M, Morikawa S et al. Enzyme-linked immunosorbent asseys for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins. // Clin Microbiol. -2001. Vol. 39. - № l.-P. 1-7.

518. Salah F., Demerdash Z., Shaker Z. et al. A monoclonal antibody against Schistosoma haematobium soluble egg antigen: efficacy for diagnosis and monitoring of cure of S. haematobium infection. // Parasitol Res. 2000. - Vol. 86. - № 1. - P. 74-80.

519. Samina I, Margalit J, Peleg J. Isolation of viruses from mosquitoes of the Negev, Israel. // Trans R Soc Trap Med Hyg. 1986. - Vol. 80. - № 3. - P. 471-472.

520. Samina I., Margalit J., Peleg J. Isolation of viruses from mosquitoes of the Negev, Israel. // Trans R Soc Trap Med Hyg. 1986. - Vol. 80. - № 3. - P. 471-472.

521. Samuel M.A., Diamond M.S. Alpha/beta interferon protects against lethal West Nile virus infection by restricting cellular tropism and enhancing neuronal survival. // Virol. 2005. - Vol. 79.-№21.-P. 13350-13361.

522. Sanger F., Donelson A.R., Coulson H.K. et al. Use of DNA polymerase I primed by a synthetic oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in phage fl DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - Vol. 70. - № 4. - P. 1209 - 1213.

523. Sanger F., Nicklen S and Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - № 12. - P. 5463 - 5467.

524. Sanchez A., Killey M.P., Holloway B.P. et al. Sequence analysis of the Ebola virus genom: organization, genetic elemets, and comparison with the genom of Marburg virus. // Virus Res. -1993.-№29.-P. 215-240.

525. Sanchez A., Trappier S.G., Many B.W. et al. The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two readieng frames and are expressed through transcriptional editing. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - № 93. - P. 3602-3607.

526. Sanchez A., Geisbert T.W., Feldmann H. Marburg and Ebola viruses. In Fields Virology 5th edn, (ed. Knipe DM, Howley PM, editors). 2007. - Vol. l.-P. 1409-1448.

527. Sandvik T., Krogsrud J. Evaluation of an antigen-capture ELISA for detection of bovine viral diarrhea virus in cattle blood samples. // Vet Diagn Invest. 1995. - Vol. 7. - № l.-P. 6571.

528. Sánchez M.D., Pierson T.C., McAllister D. et al. Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus. // Virology. 2005. - Vol. 336. - № 1. - P. 70-82.

529. Sanchez A., Killey M.P., Holloway B.P. et al. Sequence analysis of the Ebola virus genom: organization, genetic elemets, and comparison with the genom of Marburg virus. // Virus Res. -1993. -№29.-P. 215-240.

530. Sansonno D., Lauletta G., Dammacco F. Detection and quantitation of HCV core protein in single hepatocytes by means of laser capture microdissection and enzyme-linked immunosorbent assay. // Viral Hepat. 2004. - Vol. 11. - № 1. - P. 27-32.

531. Sanna P.P., Williamson R.A., De Logu A. et al. Directed selection of recombinant human monoclonal antibodies to herpes simplex virus glycoproteins from phage display libraries. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - Vol. 92. - № 14. - P. 6439-6443.

532. Sarov I., Abady I. The morphogenesis of human cytomegalovirus. Isolation and polypeptide characterization of cytomegalovirions and dense bodies. // Virology. 1975. - № 66. - P. 464473.

533. Science Daily, 9 января, 2005. // Ebola virus: from Wildlife to dogs.

534. Sciense News, Aug.31, 2005. Poaching, logging and outbreaks of Ebola threaten central African gorillas and chimpanzees.

535. Scianimanico S., Schoehn G., Timmins J. et al. Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein. // EMBO. 2000. - Vol. 19. - № 24. - P. 6732-6741.

536. Scherret J.H., Poidinger M., Mackenzie J.S. et al. The relationships between West Nile and ICunjin viruses. / Emerg Infect Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P. 697-705.

537. Scheppo-Bergling J. Diffusion influenced binary reactive processes in membranes involving identical particles: a Monte Carlo study. // Biophys Chem. 1995. - Vol. 56. - № 3. - P. 227-239.

538. Schafer P., Tenschert W., Cremaschi L. et al. Area under the viraemia curve versus absolute viral load: utility for predicting symptomatic cytomegalovirus infections in kidney transplant patients. // Med. Virol. 2001. - № 65. - P. 85-89.

539. Schepp-Berglind J., Luo M., Wang D. et al. Complex adenovirus-mediated expression of West Nile virus С, PreM, E, and NS1 proteins induces both humoral and cellular immune responses. // Clin Vaccine Immunol. 2007. - Vol. 14. - № 9. - P. 1117-1126.

540. Schirm J., Timmerije W., van der Bij W. et al. Rapid detection of infectious cytomegalovirus in blood with the aid of monoclonal antibodies. // Med Virol. 1987. - Vol. 23. - № 1. - P. 31-40.285

541. Schlesinger J.J., Foltzer M., Chapman S. The Fc portion of antibody to yellow fever virus NS1 is a determinant of protection against YF encephalitis in mice. // Virology. 1993. - Vol. 192. -№ l.-P. 132-141.

542. Schleiss M.R. Comparison of vaccine strategies against congenital CMV infection in the guinea pig model. // Clin Virol. 2008. - Vol. 41. - № 3. - P. 224-230.

543. Schnittler H.J., Maimer F., Drenckhahn D. et al. Replication of Marburg virus in human endothelial cells. A possible mechanism for development of viral hemorrhagic disease. // Clin Invest. 1993. -№91.-P. 1301-1309.

544. Schnittler H.J., Mahner F., Drenckhahn D. et al. Replication of Marburg virus in human endothelial cells. Apossible mechanism for the development of viral hemorragic disease. // Clin Invest. 1993. - Vol. 91. - № 4. - P. 1301-1309.

545. Schmaljolm C., Cui Y., Kerby S. et al. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. //Virology. 1999.-Vol. 258.-№ l.-P. 189-200.

546. Schmidt J.R., Elmansoury H.K. Natural and experimental infection of egyptian equines with West Nile virus. // Ann Trop Med Parasitol. 1963. - № 57. - P. 415-427.

547. Scott G.M., Ng H.L., Morton C.J. et al. Murine cytomegalovirus resistant to antivirals has genetic correlates with human cytomegalovirus. // Gen Virol. 2005, - Vol. 86. - № 8. - P. 21412151.

548. Sehr P., Zumbach K., Pawlita M. A generic capture ELISA for recombinant proteins fused to glutathione S-transferase: validation for HPV serology. // Immunol. Meth. 2001. - Vol. 253. P. 153-162.

549. Sellrie F., Schenk J.A., Behrsing O. et al. Cloning and characterization of a single chain antibody to glucose oxidase from a murine hybridoma. // J. Biochem Мої Biol. 2007. - Vol. 40. -№6.-P. 875-880.

550. Seme K., Poljak M., Babic D.Z. et al. The role of core antigen detection in management of hepatitis C: a critical review. // Clin Virol. 2005. - Vol. 32. - № 2. - P. 92-101.

551. Seong S.Y., Choi C.Y. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application. // Proteomics. 2003. - Vol. 3. - № 11. - P. 2176-2189.

552. Shah RA, Joseph MC, Butchaiah G et al. Detection of rinderpest virus using N-protein monoclonal antibodies. // Trop Anim Health Prod. 2004. - Vol. 36. - № 1. - P. 11-25.

553. Shahhosseini S., Das D., Qiu X. et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against different epitopes of Ebola virus antigens. // J. Virol Methods. 2007. - Vol. 143. -№ l.-P. 29-37.

554. Shannon A.D., Richards S.G.,. Kirkland P.D. et al. An antigen-capture ELISA detects pestivirus antigens in blood and tissues of immunotolerant carrier cattle. // Virol Methods. 1991. -Vol. 34.-№ l.-P. 1-12.

555. Shen C., Chang S., Yang S. et al. Cytomegalovirus is present in semen from a population of men seeking fertility evaluation. // Infectious Diseases. 1994. - Vol. 169. - № 1. - P. 222-223.

556. Shi C., Wei Q., Gin K.Y., Lam T.J. Production and characterization of monoclonal antibodies to a grouper iridovirus. // Virol Methods. 2003. - Vol. 107. - № 2. - P. 147-154.

557. Shich JR, Chi SC. Production of monoclonal antibodies against grouper nervous necrosis virus (GNNV) and development of an antigen capture ELISA. // Dis Aquat Organ. 2005. - Vol. 63. -№1.-P. 53-60.

558. Shim WB, Choi JG, Kim JY et al. Production of monoclonal antibody against Listeria monocytogenes and its application to immunochromatography strip test. // Microbiol Biotechnol. -2007. Vol. 17. -№7.-P. 1152-1161.

559. Shyu H.F., Chiao D.J., Liu H.W. et al. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for detection of ricin. // Hybrid Hybridomics. 2002. - Vol. 21. - № 1. - P. 69-73.

560. Siegert R., Shu H.L., Slenczka W. et al. On the etiology of an unknown human infection originating from monkeys. // Dtsch Med Wochenschr. 1967. - Vol. 92. - № 51. - P. 2341-2343.

561. Siegert R., Shu H.L., Slenzcka W. et al. Zur Aetiologie einer unbekannet, von Affen ausgegangenen menschlichen Infektionskrankheit. // Dtssch Med Wochensch. 1972. - № 92. -P. 2341-2343.

562. Stephens J.C., Larkins A., James R.F., Rathbone B.J. Production of a monoclonal antibody against the 128 kDa (CagA) protein of Helicobacter pylori. // Immunol Methods. 1996. - Vol. 190. -№2.-P. 163-169.

563. Simpson D.I., Zlotnik I., Rutter D.A. Vervet monkey disease. Experiment infection of guinea pigs and monkeys with the causative agent. // Br J. Exp Pathol. 1968. - Vol. 49. - № 5. - P. 458464.

564. Simons K., Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2000. -Vol. 1. -№ l.-P. 31-9.

565. Stewart B.J., Houghton R.L., Morrow W.J.W. et al. Desing considerations for immunodiagnostics. // IVDT. 2006. - № 4. - P. 40-51.

566. Sinzger C., Jahn G. Human cytomegalovirus cell tropism and pathogenesis. // Intervirology. -№39.-P. 302-319.

567. Singh B.K., Ahuja S., Gulati B.R. Development of a neutralizing monoclonal antibody-based blocking ELISA for detection of equine herpesvirus 1 antibodies. // Vet Res Commun. 2004. -Vol. 28. - № 5. - P. 437-446.

568. Sithiprasasna R., Strickman D., Innis B.L. et al. ELISA for detecting dengue and Japanese encephalitis viral antigen in mosquitoes. // Ann Trop Med Parasitol. 1994. - Vol. 88. - № 4. - P. 397-404.

569. Smiley ML, Mar EC, Huang ES. Cytomegalovirus infection and viral-induced transformation of human endothelial cells. // Med Virol. 1988. - Vol. 25. - № 2. - P. 213-226.

570. Smith J.D., de Harven E. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in WI-38 cells. II. An ultrastructural study of viral penetration. // Virol. 1974. - Vol. 14. - № 4. - P. 945-956.

571. Smith D.H., Johnson B.K., Isaacson M. et al. Marburg virus disease in Kenya. // Lancet. -1982. -№ l.-P. 816-820.

572. Smith C.E., Simpson D.I., Bowen E.T. Fatal human disease form vervet monkeys. // Lancet. 1967. -№2.-P. 1119-1121.

573. Smithburn K., Huges T.P., Burke A.W. et al. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda. // Am J. Trop. Med. 1940. - Vol. 20. - P. 471-492.

574. Spaete R.R., Gehrz R.C., Landini M.P. Human cytomegalovirus structural proteins. // Gen Virol. 1994. - Vol. 75. - № 12. - P. 3287-3308.

575. Spaete R.R., Mocarski E.S. The alpha sequence of the cytomegalovirus genome functions as a cleavage/packaging signal for herpes simplex virus defective genomes. // Virol. 1985. - Vol. 54.-№3.-P. 817-824.

576. Spaete R.R., Gehrz R.C., Landini M.P. Human cytomegalovirus structural proteins. // Gen Virol. 1994. - Vol. 75. - № 12. - P. 3287-3308.

577. Splettstoesser W.D., Rahalison L., Grunow R. et al. / Evaluation of a standardized F1 capsular antigen capture ELISA test kit for the rapid diagnosis of plague. / FEMS Immunol Med Microbiol. 2004. - Vol. 41. - № 2. - P. 149-155.

578. Staczek J. Animal cytomegaloviruses. // Microbiol Rev. 1990. - № 54. - P. 247-265.

579. Stewart B.J., Houghton R.L., Morrow W.J.W. et al. Desing considerations for immunodiagnostics. // IVDT. 2006. - № 4. - P. 40-41.

580. Stibbs H.H. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for Giardia lamblia antigen in human stool. // Clin Microbiol. 1989. - Vol. 27. - № 11. - P. 2582-2588.

581. Stirk P.R., Griffiths P.D. Use of monoclonal antibodies for the diagnosis of cytomegalovirus infection by the detection of early antigen fluorescent foci (DEAFF) in cell culture. // Med Virol. -1987. Vol. 21. - № 4. - P. 329-337.

582. Surtherland G.L., Nasci R.S. Detection of West Nile virus in large pools of mosquitoes. // J. Am Mosq Control Assos. 2007. - Vol. 23. - № 4. - P. 389-395.

583. Suter M., Butler J.E., Peterman J.H. The immunochemistry of sandwich ELISAs~III. The stoichiometry and efficacy of the protein-avidin-biotin capture (PABC) system. // Mol Immunol. -1989. Vol. 26. - № 3. - P. 221-230.

584. Suter M., Butler J.E. The immunochemistry of sandwich ELISAs. II. A novel system prevents the denaturation of capture antibodies. // Immunol Lett. 1986. - Vol. 13. - № 6. - P. 313-316.

585. Sutherland G.L., Nasci R.S. Detection of West Nile virus in large pools of mosquitoes. // J. Am Mosq Control Assoc. 2007. - Vol. 23. - № 4. - P. 389-395.

586. Swanepoel R., Leman P.A., Burt F.J. et al. Experimental inoculation of plants and animals with Ebola virus. // J. Emerg Infect Dis. 1996. - Vol. 2. - № 4. - P. 321-325.

587. Swenson D., Warfield K.L., Larsen T. et al. Monovalent virus-like particle vaccine protects guinea pigs and nonhuman primates aganst infection with multiple Marburg viruses. // Expert Rev Vaccines. 2008. - Vol. 7. - № 4. - P. 417-429.

588. Swenson D., Wang D., Luo M. et al. Complete protection of nonhuman primates against multistrain Ebola and Marburg virus infections. // Clin Vaccine Immunol. 2008. - Vol. 15. - № 3.-P. 460-467.

589. Tahori A.S., Sterk V.V., Goldblum N. Studies on the dynamics of experimental transmission of West Nile virus by Culex molestus. // Am J. Trop Med Hyg. 1955. - Vol. 4. - № 6. - P. 1015-1027.

590. Takada A., Watanabe S., Ito H. et al. Ebola virus glycoproteins. / Simposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany. 2000. - Abstract. - P. 14.

591. Takada A., Watanabe S., Okazaki K. et al. Infectivity-Enhancing Antibodies to Ebola virus glycoprotein. // J. Virology. 2001. - Vol. 75. - № 5. - P. 2324-2330.

592. Tang Y., Ismail M.M., Saif Y.M. Development of antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay and RT-PCR for detection of turkey astroviruses. // Avian Dis. 2005. -Vol. 49. -№ 2. -P. 182-188.

593. Tanikawa T., Kurohane K., Imai Y. Production and characterization of IgA monoclonal antibody against ovalbumin. // Hybridoma. 2007. - Vol. 26. - № 5. - P. 328-332.

594. Tardei G., Ruta S., Chitu V. et al. Evaluation of immunoglobulin M (IgM) and IgG enzyme immunoassays in serologic diagnosis of West Nile Virus infection. // Clin Microbiol. 2000. -Vol. 38. -№6. - P. 2232-2239.

595. Taylor D.W., Voller A. The development and validation of a simple antigen detection ELISA for Plasmodium falciparum malaria. // Trans R Soc Trop Med Hyg. 1993. - Vol. 87. - № l.-P. 29-31.

596. Taylor C., Simmons R., Smith I. Development of immunoglobulin M capture enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate human flavivirus infections occurring in Australia. // Clin Diagn Lab Immunol. 2005. - Vol. 12. - № 3. p. 371-374.

597. Theiler R.N., Compton T. Characterization of the signal peptide processing and membrane association of human cytomegalovirus glycoprotein O. // Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - № 42. -P. 39226-39231.

598. Thiele G.M., Bicak M.S., Young A. et al. Rapid detection of cytomegalovirus by tissue culture, centrifugation, and immunofluorescence with a monoclonal antibody to an early nuclear antigen. // Virol Methods. 1987. - Vol. 16. - № 4. - P. 327-338.

599. Throsby M., Geuijen C., Goudsmit J. et al. Isolation and characterization of human monoclonal antibodies from individuals infected with West Nile Virus. // Virol. 2006. - Vol. 80. - № 14. - P. 6982-6992.

600. Tilson M.D., Ozsvath K.J., Hirose H. et al. A novel hypothesis to explain the hemorrhagic and connective tissue manifestations of Ebola virus infection. 11 Clinical immunology and immunopathology. 1996. - Vol. 81. - № 3. - P. 303-306.

601. Timmins J., Scianimanico S., Schoehn G. et al. Vesicular release of Ebola Virus matrix protein VP40. // Virology. 2001. - Vol. 283. - № 1. -P. 1-6.

602. Toedter G., Pearlman S., Hofheinz D. et al. Development of a monoclonal antibody-based p24 capsid antigen detection assay for HTLV-I, HTLV-II, and STLV-I infection. // AIDS Res Hum Retroviruses. 1992. - Vol. 8. - № 4. - P. 527-532.

603. Tomizuka K., Yoshida H., Uejima H. et al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. // Nat Genet. 1997. - Vol. 16. - № 2. - P. 133-143.

604. Topilko A., Michelson S. Morphological and cytochemical analysis of human cytomegalovirus inoculum: correlation of free particles in inoculum with counterparts in infected cells. // Res Virol. 1994. - Vol. 145. - № 2. - P. 65-73.

605. Towbin H., Staekelin T., Gordon J. Electrohporetic transfer of proteins from Polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc Natl Acad Sei USA. 1979. - Vol. 76. - № 9. - P. 4350-4354.

606. Towner J.S., Sealy T.K., Khristova M.L. et al. Newly discovered ebola virus associated with -hemorrhagic fever outbreak in Uganda. // PLoS Pathog. 2008. - Vol. 4. - № 11. - P. el000212.

607. Towner J.S., Rollin P.E., Bausch D.G. et al. Rapid diagnosis of Ebola fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome. // Virol. 2004. - Vol 78. - № 8. - P. 4330-4341.

608. Towner J.S., Khristova M.L., Sealy T.K. et al. Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. // Virol. 2006. - Vol. 80. - № 13. - P. 64976516.

609. Towner J.S., Pourrut X., Albarino C.G. et al. Marburg virus infection detected in a common African bat. // PLoS One. 2007. - Vol. 2. - № 1. - P. e764.

610. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C. et al. West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania. // Lancet. 1998. - Vol. 352. - № 9130. - P. 767-771.

611. Turell M.J., Bressler D.S., Rossi C.A. Short report: lack of virus replication in arthropods after intrathoracic inoculation of Ebola Reston virus. // American J. Trop Med Hyg. 1996. - № 55. - P.89-90.

612. Tuteja U., Kumar S., Shukla J. et al. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. // Med Microbiol. 2007. - Vol. 56. - № 10. - P. 1340-1345.

613. Urdaneta H., Rangel A., Martins M.S. et al. Entamoeba histolytica: fecal antigen capture immunoassay for the diagnosis of enteric amebiasis by a monoclonal antibody. // Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1996.-Vol. 38. - № 1.-P. 39-44.

614. Van der Groen G., Elliot L.H. Use of betapropionolactone inactivated Ebola, Marburg and Lassa intracellular antigens in immunofluorescent antibody assay. // Ann Soc Belg Med Trop. -1982. Vol. 62. - № 1. - P. 49-54.

615. Velumani S., Du Q., Fenner B.J. et al. Development of an antigen-capture ELISA for detection of H7 subtype avian influenza from experimentally infected chickens. // Virol Methods. 2008. - Vol. 147. - № 2. - P. 219-225.

616. Vinayak V.K., Dutt P., Mehta S. Uses and limitations of monoclonal antibodies to Giardia lamblia-specific 66-kDa copro-antigen in copro-immunodiagnosis of giardiasis. // FEMS Immunol Med Microbiol. 1993. - Vol. 6. - № 1. - P. 37-44.

617. Volchkov V.E., Chepurnov A.A., Volchkova V.A. et al. Molecular characterization of guinea pig adapted variants of Ebola virus. // Virology. - 2000. - Vol. 277. -№ 1. - P.147-155.

618. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Muhlberger E. et al. Expression strategy of the Ebola virus GP gene: implication of the transcriptional RNA editing. // Marburg. 2000. - Symposium on Marburg and Ebola viruses. - Abstract. - P. 4.

619. Volchkov V.E., Becker S., Volchkova V.A. et al. GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases. // Virology. 1995. - Vol. 214 -№ 2. - P. 421-430.

620. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. // FEBS Lett. -1992. Vol. 305.-№ 3. - P. 181-184.

621. Volchkov V.E., Feldmann H., Volchkova V.A. et al. Processing of the Ebola virus glycoprotein convertase fürin. // Proc Natl Acad Sei USA. 1998. - Vol. 95. - № 10. - P. 57625767.

622. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Slenczka W. et al. Release of viral glycoproteins during Ebola virus infection.//Virology. 1998. - Vol. 245.-№ l.-P. 110-119.

623. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. // FEBS Lett. -1992.-Vol. 305. -№3. P. 181-184.

624. Wang D., Hevey M., Juompan L.Y. et al. Complex adenovirus-vectored vaccine protects guinea pigs from three strains of Marburg virus challenges. // Virology. 2006. - Vol. 353. - № 2. - P. 324-332.

625. Wang T., Town T., Alexopoulou L. et al. Toll-like receptor 3 mediates West Nile virus entry into the brain causing lethal encephalitis. // Nat Med. 2004. - Vol. 10. - № 12. - P. 1366-1373.

626. Wang T., Anderson J.F., Magnarelli L.A. et al. Immunization of mice against West Nile virus with,recombinant envelope protein. // Immunol. 2001. - Vol. 167. - № 9. - P. 5273-5277.

627. Wang T., Magnarelli L.A., Anderson J.F. et al. A recombinant envelope protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for West Nile virus serodiagnosis. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2002. - Vol. 2. - № 2. - P. 105-109.

628. Wang J., Lin Z., Qiao C.X. et al. Characterization of a novel anti-DR5 monoclonal antibody WD1 with the potential to induce tumor cell apoptosis. // Cell Mol Immunol. 2008. - Vol. 5. - № l.-P. 55-60.

629. Wang T., Magnarelli L.A., Anderson J.F. et al. A recombinant envelope protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for West Nile virus serodiagnosis. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2002. - Vol. 2. - № 2. - P. 105-109.

630. Wang W., Yang J.J., Liu L. et al. Generation and characterization of monoclonal antibody against HSD11B1. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2008. - Vol. 24. - № 1. - P. 38-40.

631. Warfield K.L., Posten N.A., Swenson D.L. et al. Filovirus-like particles produced in insect cells: immunogenicity and protection in rodents. // Infect Dis. 2007. - Vol. 196. - № 2. - P. 421429.

632. Warfield K.L., Swenson D.L., Olinger G.G. et al. Ebola virus-like particle-based vaccine protects nonhuman primates against lethal Ebola virus challenge. // Infect Dis. 2007. - Vol. 196. - № 2. - P. 430-437.

633. Warfield K.L., Alves D.A., Bradfute S.B. et al. Development of a model for marburgvirus based on severe-combined immunodeficiency mice. // Virol. 2007. - № 4. - P. 108-112.

634. Watanabe S., Nöda T., Kawaoka Y. Functional mapping of nucleoprotein of Ebola virus. // Virol. -2006. Vol. 80. -№ 8.-P. 3743-3751.

635. Weber B., Fall E.M., Berger A., Doerr H.W. Screening of blood donors for human cytomegalovirus (HCMV) IgG antibody with an enzyme immunoassay using recombinant antigens.//Clin Virol. 1999. - Vol. 14. -№3.-P. 173-181.

636. Webley S.D., Francis R.J., Pedley R.B. et al. Measurement of the critical DNA lesions produced by antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in vitro, in vivo and in clinical material. // Br J. Cancer. 2001. - Vol. 84. - № 12. - P. 1671-1676.

637. Weidmann M., Mühiberger E., Hufert F.T. Rapid detection protocol for filoviruses. // Clin Virol. 2004. - Vol. 30. - № 1. - P. 94-9.

638. Weissenhorn W., Carfi A., Lee K.H. et al. Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain. // Mol Cell. 1998. - Vol. 2. -№5.-P. 605-616.

639. West K., Bogdan J., Hamel A. et al. A comparison of diagnostic methods for the detection of bovine respiratory syncytial virus in experimental clinical specimens. // Can J. Vet Res. 1998. -Vol. 62. - № 4. - P. 245-250.

640. WHO report 2007. // Outbreak news. Marburg haemorrhagic fever, Uganda.

641. WHO Report 1978. International Commission to Sudan. Ebola hemorrhagic fever in Sudan. // № 56. P. 247-270.

642. WHO Report, 29 January 2009. // Ebola Reston virus detected pigs in the Philippines.

643. WHO repots 1995-2007 of Ebola haemorragic fever.

644. Will C., Muhlberger E., Linder D. et al. Marburg virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein. // Virol. 1993. - № 67. - P. 1203-1210.

645. Wilson J.A., Hevey M., Bakken R. et al. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. // Science. 2000. - Vol. 287. - № 5458. - P. 1664-1666.

646. Williamson RA, Lazzarotto T, Sanna PP et al. Use of recombinant human antibody fragments for detection of cytomegalovirus antigenemia. // Clin Microbiol. 1997. - Vol. 35. -№ 8. - P. 2047-2050.

647. Wilson J.A., Hart M.K. Protection from Ebola virus mediated by cytotoxic T lymphocytes specific for the viral nucleoprotein. // Virol. 2001. - Vol. 75. - № 6. - P. 2660-2664.

648. Wirgart B.Z., Grillner L. Early detection of cytomegalovirus in cell culture by a monoclonal antibody. //Virol Methods. 1986. - Vol. 14. - № 1. - P. 65-69.

649. Wolf D.G., Spector S.A. Early diagnosis of human cytomegalovirus disease in transplant recipients by DNA amplification in plasma. // Transplantation. 1993. - Vol. 56. - № 2. - P. 330o o .j

650. Woolf N.K., Jaquish D.V., Koelirn F.J. Transplacental murine cytomegalovirus infection in the brain of SCID mice. // Virol. 2007. - 10.1186/1743-422X-4-26.

651. Wright H.T.Jr., Goodheart C.R., Lielausis A. Human cytomegalovirus. Morphology by negative staining. // Virology. 1964. - № 23. - P. 419-424.

652. Wu A.M., Senter P.D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. //NatBiotechnol. -2005.- Vol. 23.-№ 9.-P. 1137-1146.

653. Xu G., Weber P., Hu Q. et al. / A simple sandwich ELISA (WELYSSA) for the detection of lyssavirus nucleocapsid in rabies suspected specimens using mouse monoclonal antibodies. / Biologicals. 2007. - Vol. 35. - № 4. - P. 297-302.

654. Xu G.L., Yan J.X., Larrous F. et al. Application of McAbs against rabies nucleocapsid in diagnosis of rabies street virus. // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2005. - Vol. 26. - № 2. -P.113-115.

655. Yan K.T., Ellis W.A., Montgomery J.M. et al. Development of an immunomagnetic antigen capture system for detecting leptospires in bovine urine. // Res Vet Sei. 1998. - Vol. 64. - № 2. — P. 119-124.

656. Yang Z., Delgado R., Xu. L et al. Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins. // Science. 1998. - № 279. - P. 1034-1037.

657. Yang M., Berhane Y., Salo T. et al. Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza virus nucleoprotein. // Virol Methods. 2008. - Vol. 147. - № 2. - P. 265274.

658. Yang J., Wang H., Jiang Y. et al. Development of an enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) method for carbofuran residues. // Molecules. 2008. - Vol. 13. - № 4. - P. 871-881.

659. Yue Y., Barry P.A. Rhesus cytomegalovirus a nonhuman primate model for the study of human cytomegalovirus. // Adv Virus Res. 2008. - № 72. - P. 207-226.

660. Yucel F., Manav A., Ba§alp A. Production and characterization of monoclonal antibodies against hepatitis B viruses and application of a quick sandwich ELISA. // Hybrid Hybridomics. -2003. Vol. 22. - № 3. - P. 173-7.

661. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes. // Nat Biotechnol. -1998. Vol. 16. -№ 13.-P. 1361-4.

662. Zhai J., Palacios G., Towner J.S. et al. Rapid molecular strategy for filovirus detection and characterization. // Clin Microbiol. 2007. - Vol. 45. - № 1. - P. 224-226.

663. Zhao Z.J., Liu X.M. Preparation of monoclonal antibody and development of enzyme-linked immunosorbent assay specific for Escherichia coli 0157 in foods. // Biomed Environ Sci. 2005. -Vol. 18. -№ 4. -P. 254-259.

664. Zhou G.Z., Gui L., Li Z.Q. et al. Generation and characterization of monoclonal antibodies against the flounder Paralichthys olivaceus rhabdovirus. // Virol Methods. 2008. - Vol. 148. - № 1-2.-P. 205-210.

665. Zhu X., Xu L., Lou Y. et al. Preparation of specific monoclonal antibodies (MAbs) against heavy metals: MAbs that recognize chelated cadmium ions. // Agric Food Chem. 2007. - Vol. 55. -№ 19.-P. 7648-7653.

666. Zweygberg Wirgart B., Landqvist M., Hokeberg I. et al. Early detection of cytomegalovirus in cell culture by a new monoclonal antibody, CCH2. // Virol Methods. 1990. - Vol. 27. - № 2. -P. 211-219.m1. РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ1. U9)

Информация о работе

Казачинская, Елена Ивановна
доктора биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы